TW202146648A

TW202146648A - 人類α-半乳糖苷酶變異體

Info

Publication number: TW202146648A
Application number: TW110107124A
Authority: TW
Inventors: 威廉Ｃ哈洛斯; 尼基戴拉斯; 朱鈺; 朱迪ＶＡ維杜雅; 靜斌莊; 安托涅特塞羅; 瑞秋Ｃ波森; 大衛Ｗ霍曼; 穆萊Ｈ阿拉尤伊斯梅里; 強納森弗魯姆; 亞當Ｐ西爾弗曼; 克里斯汀Ｊ瓦列烏; 查魯Ｓ雷迪; 克里麥克勞斯基
Original assignee: 美商克迪科思股份有限公司
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-12-16
Also published as: JP2023516301A; BR112022016990A2; KR20220146601A; PE20230487A1; EP4110926A2; CA3173294A1; CO2022012809A2; IL295818A; WO2021173928A3; AR121457A1; CN116096898A; AU2021228689A1; US20210269787A1; ECSP22075305A; CL2022002330A1; MX2022010663A; WO2021173928A2

Abstract

本發明提供經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽及其組合物。該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽已經最佳化以得到經改善之熱穩定性、血清穩定性、經改善之細胞吸收、在酸性(pH ＜ 4)條件及鹼性(pH ＞ 7)條件二者下之穩定性、經降低之免疫原性以及經改善之自細胞進行的球形三醯神經醯胺移除。本發明亦關於包含該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽之該等組合物用於治療目的之用途。

Description

人類α-半乳糖苷酶變異體

本申請案主張2020年2月28日申請之美國臨時申請案序列號62/982,949之優先權，該案出於所有目的特此以全文引用之方式併入。發明領域

本發明提供經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽及其組合物。該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽已經最佳化以得到經改善之熱穩定性、血清穩定性、經降低之免疫原性、經改善之細胞吸收及在酸性(pH ＜ 4)條件及鹼性(pH ＞ 7)條件二者下之穩定性以及經改善之自細胞進行的球形三醯神經醯胺(globotriaosylceramide)清除。本發明亦關於包含該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽之該等組合物用於治療目的之用途。序列表、表格或電腦程式之引用

序列表之正式複本係以ASCII格式化正文檔案形式經由EFS-Web與說明書並行地提交，其中檔案名稱為「CX7-203WO2_ST25.txt」，創建日期為2021年2月22日，且大小為4.43兆位元組。經由EFS-Web申請之序列表為說明書之一部分且以全文引用之方式併入本文中。

發明背景

人類α半乳糖苷酶(「GLA」；EC 3.2.1.22)為負責自醣脂及醣蛋白中水解末端α半乳糖苷基部分之溶酶體醣蛋白。其作用於一定範圍之人類組織中存在之許多受質上。法布瑞氏病(Fabry disease) (亦稱為彌漫性軀幹血管角化瘤(angiokeratoma corporis diffusum)、安德森-法布瑞氏病(Anderson-Fabry disease)、遺傳性異位脂質代謝障礙(hereditary dystopic lipidosis)、α-半乳糖苷酶A缺乏症、GLA缺乏症以及神經醯胺三己糖苷酶缺乏症(ceramide trihexosidase deficiency))為由α-半乳糖苷酶A活性缺乏或不存在造成之X性聯先天性醣神經鞘脂質代謝缺陷。受法布瑞氏病影響之患者在血漿以及血管、組織及器官細胞溶酶體中積聚球形三醯神經醯胺(在本文中稱為「Gb₃ 」及「Gb3」)及相關醣神經鞘脂質(參見例如Nance等人, Arch. Neurol., 63:453-457 [2006])。隨著患者年齡增長，血管由於此等脂質之積聚而逐漸地變窄，從而導致流向組織之血流及對組織之營養減少，尤其在皮膚、腎、心臟、腦及神經系統中如此。因此，法布瑞氏病為顯現為腎衰竭、心臟疾病(cardiac disease)、腦血管疾病、小纖維周邊神經病變及皮膚病變以及其他病症之全身性病症(參見例如Schiffmann, Pharm. Ther., 122:65-77 [2009])。受影響患者展現諸如手足疼痛、其皮膚上成群之深紅小斑點、出汗能力減弱、角膜混濁、胃腸問題、耳鳴及聽力喪失之症狀。潛在地危及生命之併發症包括進行性腎損傷、心臟病發作及中風。估計40,000-60,000位男性中有1位受此疾病影響，但女性中亦存在此疾病。實際上，患有法布瑞氏病之異型接合婦女經受嚴重危及生命之病況，該等病況包括神經系統異常、慢性疼痛、疲勞、高血壓、心臟病(heart disease)、腎衰竭及中風，因此需要醫學治療(參見例如Want等人, Genet. Med., 13:457-484 [2011])。法布瑞氏病之病徵可在自嬰兒期起之任何時間開始出現，其中病徵通常開始在4歲與8歲之間顯現，但一些患者展現較輕度之遲發型疾病。治療一般為支持性的且法布瑞氏病不可治癒，因此仍需要安全且有效之治療。

發明概要

本發明提供經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽及其組合物。該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽已經最佳化以得到經改善之熱穩定性、血清穩定性、經降低之免疫原性、經改善之細胞吸收及在酸性(pH ＜ 4)條件及鹼性(pH ＞ 7)條件二者下之穩定性以及經改善之自細胞進行的球形三醯神經醯胺清除。本發明亦關於包含該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽之該等組合物用於治療目的之用途。

本發明提供重組α半乳糖苷酶A及/或生物活性重組α半乳糖苷酶A片段，其包含與SEQ ID NO: 8包含至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。本發明提供重組α半乳糖苷酶A及/或生物活性重組α半乳糖苷酶A片段，其包含與SEQ ID NO: 8包含至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：44、44/217、44/217/316、44/217/322、44/217/322/337、44/247、44/247/302、44/247/302/322、44/247/322、44/247/337、44/247/362、44/302、44/337、44/373、217/322、217/373、247/322、247/362、302/322/362/373、302/337、316、316/337、322、322/337、362/373以及373，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：44L、44L/217F、44L/217F/316L、44L/217F/322M、44L/217F/322M/337A、44L/247N、44L/247N/302Q、44L/247N/302Q/322M、44L/247N/322M、44L/247N/337A、44L/247N/362K、44L/302Q、44L/337A、44L/373R、217F/322M、217F/373R、247N/322M、247N/362K、302Q/322M/362K/373R、302Q/337A、316L、316L/337A、322M、322M/337A、362K/373R以及373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：R44L、R44L/R217F、R44L/R217F/D316L、R44L/R217F/I322M、R44L/R217F/I322M/P337A、R44L/D247N、R44L/D247N/K302Q、R44L/D247N/K302Q/I322M、R44L/D247N/I322M、R44L/D247N/P337A、R44L/D247N/Q362K、R44L/K302Q、R44L/P337A、R44L/K373R、R217F/I322M、R217F/K373R、D247N/I322M、D247N/Q362K、K302Q/I322M/Q362K/K373R、K302Q/P337A、D316L、D316L/P337A、I322M、I322M/P337A、Q362K/K373R以及K373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10/39/44/47/92/166/206/217/247/261/271/302/316/322/337/362/368/373/392、44/217/316、44/217/322/337、166/362、217/373以及362/373，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10T/39M/44L/47S/92Y/166S/206K/217F/247N/261A/271H/302Q/316L/322M/337A/362K/368W/373R/392M、44L/217F/316L、44L/217F/322M/337A、166A/362K、217F/373R以及362K/373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/R217F/D247N/G261A/A271H/K302Q/D316L/I322M/P337A/Q362K/A368W/K373R/T392M、R44L/R217F/D316L、R44L/R217F/I322M/P337A、P166A/Q362K、R217F/K373R以及Q362K/K373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：7、7/48/68、7/48/68/120/282/299、7/48/130/282、7/48/180、7/68/130/282/365、7/68/180、7/88/120/305/365、7/120、7/130、7/282、7/305、7/305/365、7/365、39、47、47/87/95/96/158/162、47/95、47/273、47/343、48、48/68、48/180/282、48/282、48/282/305、67/180、68、68/299/300、71、87/91/95/96/158/162、87/91/95/96/206/343、87/96/155/273/343、88、91/95、91/95/96、92、93、96、96/273、96/312/343、120、120/299/305、151、158、158/162/273、162、162/273、162/343、166、178、180、181、206、217、271、273、273/343、282、282/365、293/391、299/300、299/300/305/365、300、301、305、305/365、314、333、336、337、343、345、363、365、370、389、393、394、396/398、397以及398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：7L、7L/48D/68E、7L/48D/68E/120H/282N/299R、7L/48D/130E/282N、7L/48D/180G、7L/68E/130E/282N/365V、7L/68E/180G、7L/88A/120H/305G/365V、7L/120H、7L/130E、7L/282N、7L/305G、7L/305G/365V、7L/365V、39V、47D、47D/87K/95E/96L/158R/162H、47D/95E、47D/273P、47D/343G、47V、48D、48D/68E、48D/180G/282N、48D/282N、48D/282N/305G、67T/180G、68E、68E/299R/300I、71P、87K/91Q/95E/96L/158A/162K、87K/91Q/95E/96L/206S/343G、87K/96I/155N/273P/343G、88A、91Q/95E、91Q/95E/96L、92F、92T、93I、96L、96L/273P、96L/312Q/343G、120H、120H/299R/305G、151L、158A、158A/162K/273G、158R、162H/343D、162K、162K/273P、162S、166K、178G、178S、180G、180L、180T、180V、181A、206K、206S、217K、271R、273P、273P/343G、282N、282N/365V、293P/391A、299R/300I、299R/300I/305G/365V、300I、301M、305G、305G/365V、314A、333F、333G、336V、337R、343D、343G、345A、345Q、363Q、365A、365Q、365V、370G、389K、393V、394K、396G/398T、397A、398A、398P、398S以及398V，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：R7L、R7L/E48D/Q68E、R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R、R7L/E48D/D130E/D282N、R7L/E48D/F180G、R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V、R7L/Q68E/F180G、R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V、R7L/Y120H、R7L/D130E、R7L/D282N、R7L/N305G、R7L/N305G/F365V、R7L/F365V、E39V、T47D、T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H、T47D/S95E、T47D/S273P、T47D/K343G、T47V、E48D、E48D/Q68E、E48D/F180G/D282N、E48D/D282N、E48D/D282N/N305G、P67T/F180G、Q68E、Q68E/Q299R/L300I、S71P、R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K、R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G、R87K/K96I/H155N/S273P/K343G、Q88A、N91Q/S95E、N91Q/S95E/K96L、H92F、H92T、V93I、K96L、K96L/S273P、K96L/P312Q/K343G、Y120H、Y120H/Q299R/N305G、D151L、L158A、L158A/R162K/S273G、L158R、R162H/K343D、R162K、R162K/S273P、R162S、P166K、W178G、W178S、F180G、F180L、F180T、F180V、Q181A、A206K、A206S、R217K、A271R、S273P、S273P/K343G、D282N、D282N/F365V、L293P/Q391A、Q299R/L300I、Q299R/L300I/N305G/F365V、L300I、R301M、N305G、N305G/F365V、S314A、S333F、S333G、I336V、P337R、K343D、K343G、V345A、V345Q、L363Q、F365A、F365Q、F365V、S370G、T389K、S393V、L394K、D396G/L398T、L397A、L398A、L398P、L398S以及L398V，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 158具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：24/202、39/47、39/47/217、39/151、39/282/337/398、39/337/343/398、39/393/398、47/130、47/151、47/343/345/393、48、48/68、48/68/217/333/391/393、48/68/333、48/217、48/333、48/345/393、48/393、59/143、68、68/345、130、130/158、130/158/393、130/345/393、143/271、143/333、143/387、151、151/158/217/343/345/393、151/206/282/337/343/345/398、151/282/393、151/345/393/398、151/393、158、158/393、202、206、206/217、217、217/333、217/337/345/398、271、282/393、333、333/345、337/343/345/398、343、343/345/393/398、393以及393/398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 158具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：24S/202N、39V/47D、39V/47V/217K、39V/151L、39V/282N/337R/398A、39V/337R/343G/398A、39V/393V/398A、47V/130E、47V/151L、47V/343D/345Q/393V、48D、48D/68E、48D/68E/217K/333F/391A/393V、48D/68E/333F、48D/217K、48D/333F、48D/333G、48D/345Q/393V、48D/393V、59A/143S、68E、68E/345Q、130E、130E/158R、130E/158R/393V、130E/345Q/393V、143S/271N、143S/333N、143S/387N、151L、151L/158R/217K/343G/345Q/393V、151L/206S/282N/337R/343D/345Q/398A、151L/282N/393V、151L/345Q/393V/398A、151L/393V、158R、158R/393V、202N、206S、206S/217K、217K、217K/333F、217K/333G、217K/337R/345Q/398A、271N、282N/393V、333F/345Q、333G、333N、337R/343G/345Q/398A、343D、343D/345Q/393V/398A、393V以及393V/398A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：D24S/D202N、E39V/T47D、E39V/T47V/R217K、E39V/D151L、E39V/D282N/P337R/L398A、E39V/P337R/K343G/L398A、E39V/S393V/L398A、T47V/D130E、T47V/D151L、T47V/K343D/V345Q/S393V、E48D、E48D/Q68E、E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V、E48D/Q68E/S333F、E48D/R217K、E48D/S333F、E48D/S333G、E48D/V345Q/S393V、E48D/S393V、C59A/C143S、Q68E、Q68E/V345Q、D130E、D130E/L158R、D130E/L158R/S393V、D130E/V345Q/S393V、C143S/A271N、C143S/S333N、C143S/E387N、D151L、D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V、D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/L398A、D151L/D282N/S393V、D151L/V345Q/S393V/L398A、D151L/S393V、L158R、L158R/S393V、D202N、A206S、A206S/R217K、R217K、R217K/S333F、R217K/S333G、R217K/P337R/V345Q/L398A、A271N、D282N/S393V、S333F/V345Q、S333G、S333N、P337R/K343G/V345Q/L398A、K343D、K343D/V345Q/S393V/L398A、S393V以及S393V/L398A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 372具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、10/39/44/322、10/39/92/206/217/271、10/39/92/247、10/39/92/247/271/316、10/44、10/44/47/92/247、10/44/47/261/302/322/368、10/44/92/316/322、10/44/261/302/316、10/44/302/337/368、10/47/217/247/316/392、10/47/217/322、10/47/271、10/92、10/92/206/217/247、10/92/206/247/316/322/392、10/92/206/247/322/368、10/92/217/261/302/337、10/206/217/271、10/206/247、10/206/261/271/316、10/261、10/271/302、10/302、10/302/316、10/302/322/337、10/316/322、10/337/392、10/368、39/44/92/162/247/302/316/322、39/44/92/217/322、39/44/92/247/271/302、39/47/92/247/302/316/322、39/47/217/247/368、39/47/247、39/92/247/302/316/337/368、39/92/316/322、39/247/271、39/247/271/316、39/322、44/47/92/206/217/316/322、44/47/92/247/261/271/316/337/368、44/47/206/217/247/271/322、44/47/247/322/368、44/47/302/316/322、44/92/206/247/368、44/206/337、44/247/261/302/316、44/247/261/302/316/322、47/92/247/271、47/217/302、47/247、47/247/271、89/217/247/261/302/316、92/217/271、92/247、92/247/271/322、92/247/302/322/337、92/271/337、92/302、92/316、206/217/271/392、217/247/316/322/337/368、247、247/271、247/302、271、271/302/322、271/316/322、302/322/368以及368，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 372加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 372具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10P、10P/39E/44R/322I、10P/39E/92H/206A/217R/271A、10P/39E/92H/247D、10P/39E/92H/247D/271A/316D、10P/44R、10P/44R/47T/92H/247D、10P/44R/47T/261G/302K/322I/368A、10P/44R/92H/316D/322I、10P/44R/261G/302K/316D、10P/44R/302K/337P/368A、10P/47T/217R/247D/316D/392T、10P/47T/217R/322I、10P/47T/271A、10P/92H、10P/92H/206A/217R/247D、10P/92H/206A/247D/316D/322I/392T、10P/92H/206A/247D/322I/368A、10P/92H/217R/261G/302K/337P、10P/206A/217R/271A、10P/206A/247D、10P/206A/261G/271A/316D、10P/261G、10P/271A/302K、10P/302K、10P/302K/316D、10P/302K/322I/337P、10P/316D/322I、10P/337P/392T、10P/368A、39E/44R/92H/162M/247D/302K/316D/322I、39E/44R/92H/217R/322I、39E/44R/92H/247D/271A/302K、39E/47T/92H/247D/302K/316D/322I、39E/47T/217R/247D/368A、39E/47T/247D、39E/92H/247D/302K/316D/337P/368A、39E/92H/316D/322I、39E/247D/271A、39E/247D/271A/316D、39E/322I、44R/47T/92H/206A/217R/316D/322I、44R/47T/92H/247D/261G/271A/316D/337P/368A、44R/47T/206A/217R/247D/271A/322I、44R/47T/247D/322I/368A、44R/47T/302K/316D/322I、44R/92H/206A/247D/368A、44R/206A/337P、44R/247D/261G/302K/316D、44R/247D/261G/302K/316D/322I、47T/92H/247D/271A、47T/217R/302K、47T/247D、47T/247D/271A、89I/217R/247D/261G/302K/316D、92H/217R/271A、92H/247D、92H/247D/271A/322I、92H/247D/302K/322I/337P、92H/271A/337P、92H/302K、92H/316D、206A/217R/271A/392T、217R/247D/316D/322I/337P/368A、247D、247D/271A、247D/302K、271A、271A/302K/322I、271A/316D/322I、302K/322I/368A以及368A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 372加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 372具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：T10P、T10P/M39E/L44R/M322I、T10P/M39E/Y92H/K206A/F217R/H271A、T10P/M39E/Y92H/N247D、T10P/M39E/Y92H/N247D/H271A/L316D、T10P/L44R、T10P/L44R/S47T/Y92H/N247D、T10P/L44R/S47T/A261G/Q302K/M322I/W368A、T10P/L44R/Y92H/L316D/M322I、T10P/L44R/A261G/Q302K/L316D、T10P/L44R/Q302K/A337P/W368A、T10P/S47T/F217R/N247D/L316D/M392T、T10P/S47T/F217R/M322I、T10P/S47T/H271A、T10P/Y92H、T10P/Y92H/K206A/F217R/N247D、T10P/Y92H/K206A/N247D/L316D/M322I/M392T、T10P/Y92H/K206A/N247D/M322I/W368A、T10P/Y92H/F217R/A261G/Q302K/A337P、T10P/K206A/F217R/H271A、T10P/K206A/N247D、T10P/K206A/A261G/H271A/L316D、T10P/A261G、T10P/H271A/Q302K、T10P/Q302K、T10P/Q302K/L316D、T10P/Q302K/M322I/A337P、T10P/L316D/M322I、T10P/A337P/M392T、T10P/W368A、M39E/L44R/Y92H/R162M/N247D/Q302K/L316D/M322I、M39E/L44R/Y92H/F217R/M322I、M39E/L44R/Y92H/N247D/H271A/Q302K、M39E/S47T/Y92H/N247D/Q302K/L316D/M322I、M39E/S47T/F217R/N247D/W368A、M39E/S47T/N247D、M39E/Y92H/N247D/Q302K/L316D/A337P/W368A、M39E/Y92H/L316D/M322I、M39E/N247D/H271A、M39E/N247D/H271A/L316D、M39E/M322I、L44R/S47T/Y92H/K206A/F217R/L316D/M322I、L44R/S47T/Y92H/N247D/A261G/H271A/L316D/A337P/W368A、L44R/S47T/K206A/F217R/N247D/H271A/M322I、L44R/S47T/N247D/M322I/W368A、L44R/S47T/Q302K/L316D/M322I、L44R/Y92H/K206A/N247D/W368A、L44R/K206A/A337P、L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D、L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D/M322I、S47T/Y92H/N247D/H271A、S47T/F217R/Q302K、S47T/N247D、S47T/N247D/H271A、L89I/F217R/N247D/A261G/Q302K/L316D、Y92H/F217R/H271A、Y92H/N247D、Y92H/N247D/H271A/M322I、Y92H/N247D/Q302K/M322I/A337P、Y92H/H271A/A337P、Y92H/Q302K、Y92H/L316D、K206A/F217R/H271A/M392T、F217R/N247D/L316D/M322I/A337P/W368A、N247D、N247D/H271A、N247D/Q302K、H271A、H271A/Q302K/M322I、H271A/L316D/M322I、Q302K/M322I/W368A以及W368A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 372加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10/36/92/166/247/261/316/392、10/39、10/39/44/47/92/206/217、10/39/44/47/316、10/39/44/47/337、10/39/44/92/166/261/316/322、10/39/44/92/166/302/322、10/39/44/92/166/392、10/39/44/92/217/302/322、10/39/44/92/302/322、10/39/44/166/261/271/316/322、10/39/44/392、10/39/47/92/337、10/39/92/131/166/271/316/322、10/39/92/166/217/247/271、10/39/92/217/316、10/44/47/166/261/271、10/44/47/166/271/322/368、10/44/47/217/271/316/322、10/44/92、10/44/92/217/247/271/302/316/392、10/44/166/302、10/44/206/316/322、10/47/92/166/271/316/337、10/47/92/271/302、10/47/92/316/322/392、10/47/166/271、10/47/166/316、10/92/166、10/92/166/217/247/261/271、10/92/166/261/271/392、10/92/166/261/316/322/337、10/92/166/337/368、10/92/302/337、10/92/316/322、10/206、10/206/247/261、10/217/322、10/261、10/261/337/392、10/316/392、10/368、39/44/47/92/166/206/392、39/44/47/92/206/247/261、39/44/47/92/206/392、39/44/47/206/337/368/392、39/44/92/166/247/261/302/337、39/44/166/271、39/44/166/271/337/368/392、39/47/92/316/322、39/47/92/392、39/47/166/217/261/392、39/47/217/247/368、39/47/247、39/92/166/217/392、39/92/261/302、39/166/217/261/316/368、39/322、39/392、44/47、44/47/92/217/271、44/47/92/217/316/322/392、44/47/92/392、44/47/166、44/47/166/271、44/47/247/271/392、44/316/322/392、44/337、47/166/206/217/247/337、47/166/217/271/337、47/206、47/217/247/261、47/271、52/217/302/316、92/166/206/271/316、92/166/217/261/271/392、92/166/217/316/337/392、92/166/247、92/166/316、92/206/322、92/217、92/217/271/337、92/261/271、92/271、166/217/316/322/337、166/247/271/316、166/316/322/337、206/217、217/392、247/316、316/322/368以及316/337/392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10T/36M/92Y/166S/247N/261A/316L/392M、10T/39M、10T/39M/44L/47S/92Y/206K/217F、10T/39M/44L/47S/316L、10T/39M/44L/47S/337A、10T/39M/44L/92Y/166S/261A/316L/322M、10T/39M/44L/92Y/166S/302Q/322M、10T/39M/44L/92Y/166S/392M、10T/39M/44L/92Y/217F/302Q/322M、10T/39M/44L/92Y/302Q/322M、10T/39M/44L/166S/261A/271H/316L/322M、10T/39M/44L/392M、10T/39M/47S/92Y/337A、10T/39M/92Y/131G/166S/271H/316L/322M、10T/39M/92Y/166S/217F/247N/271H、10T/39M/92Y/217F/316L、10T/44L/47S/166S/261A/271H、10T/44L/47S/166S/271H/322M/368W、10T/44L/47S/217F/271H/316L/322M、10T/44L/92Y、10T/44L/92Y/217F/247N/271H/302Q/316L/392M、10T/44L/166S/302Q、10T/44L/206K/316L/322M、10T/47S/92Y/166S/271H/316L/337A、10T/47S/92Y/271H/302Q、10T/47S/92Y/316L/322M/392M、10T/47S/166S/271H、10T/47S/166S/316L、10T/92Y/166S、10T/92Y/166S/217F/247N/261A/271H、10T/92Y/166S/261A/271H/392M、10T/92Y/166S/261A/316L/322M/337A、10T/92Y/166S/337A/368W、10T/92Y/302Q/337A、10T/92Y/316L/322M、10T/206K、10T/206K/247N/261A、10T/217F/322M、10T/261A、10T/261A/337A/392M、10T/316L/392M、10T/368W、39M/44L/47S/92Y/166S/206K/392M、39M/44L/47S/92Y/206K/247N/261A、39M/44L/47S/92Y/206K/392M、39M/44L/47S/206K/337A/368W/392M、39M/44L/92Y/166S/247N/261A/302Q/337A、39M/44L/166S/271H、39M/44L/166S/271H/337A/368W/392M、39M/47S/92Y/316L/322M、39M/47S/92Y/392M、39M/47S/166S/217F/261A/392M、39M/47S/217F/247N/368W、39M/47S/247N、39M/92Y/166S/217F/392M、39M/92Y/261A/302Q、39M/166S/217F/261A/316L/368W、39M/322M、39M/392M、44L/47S、44L/47S/92Y/217F/271H、44L/47S/92Y/217F/316L/322M/392M、44L/47S/92Y/392M、44L/47S/166S、44L/47S/166S/271H、44L/47S/247N/271H/392M、44L/316L/322M/392M、44L/337A、47S/166S/206K/217F/247N/337A、47S/166S/217F/271H/337A、47S/206K、47S/217F/247N/261A、47S/271H、52N/217F/302Q/316L、92Y/166S/206K/271H/316L、92Y/166S/217F/261A/271H/392M、92Y/166S/217F/316L/337A/392M、92Y/166S/247N、92Y/166S/316L、92Y/206K/322M、92Y/217F、92Y/217F/271H/337A、92Y/261A/271H、92Y/271H、166S/217F/316L/322M/337A、166S/247N/271H/316L、166S/316L/322M/337A、206K/217F、217F/392M、247N/316L、316L/322M/368W以及316L/337A/392M，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10T/K36M/H92Y/P166S/D247N/G261A/D316L/T392M、P10T/E39M、P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/R217F、P10T/E39M/R44L/T47S/D316L、P10T/E39M/R44L/T47S/P337A、P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M、P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/K302Q/I322M、P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/T392M、P10T/E39M/R44L/H92Y/R217F/K302Q/I322M、P10T/E39M/R44L/H92Y/K302Q/I322M、P10T/E39M/R44L/P166S/G261A/A271H/D316L/I322M、P10T/E39M/R44L/T392M、P10T/E39M/T47S/H92Y/P337A、P10T/E39M/H92Y/W131G/P166S/A271H/D316L/I322M、P10T/E39M/H92Y/P166S/R217F/D247N/A271H、P10T/E39M/H92Y/R217F/D316L、P10T/R44L/T47S/P166S/G261A/A271H、P10T/R44L/T47S/P166S/A271H/I322M/A368W、P10T/R44L/T47S/R217F/A271H/D316L/I322M、P10T/R44L/H92Y、P10T/R44L/H92Y/R217F/D247N/A271H/K302Q/D316L/T392M、P10T/R44L/P166S/K302Q、P10T/R44L/A206K/D316L/I322M、P10T/T47S/H92Y/P166S/A271H/D316L/P337A、P10T/T47S/H92Y/A271H/K302Q、P10T/T47S/H92Y/D316L/I322M/T392M、P10T/T47S/P166S/A271H、P10T/T47S/P166S/D316L、P10T/H92Y/P166S、P10T/H92Y/P166S/R217F/D247N/G261A/A271H、P10T/H92Y/P166S/G261A/A271H/T392M、P10T/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M/P337A、P10T/H92Y/P166S/P337A/A368W、P10T/H92Y/K302Q/P337A、P10T/H92Y/D316L/I322M、P10T/A206K、P10T/A206K/D247N/G261A、P10T/R217F/I322M、P10T/G261A、P10T/G261A/P337A/T392M、P10T/D316L/T392M、P10T/A368W、E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/T392M、E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/D247N/G261A、E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/T392M、E39M/R44L/T47S/A206K/P337A/A368W/T392M、E39M/R44L/H92Y/P166S/D247N/G261A/K302Q/P337A、E39M/R44L/P166S/A271H、E39M/R44L/P166S/A271H/P337A/A368W/T392M、E39M/T47S/H92Y/D316L/I322M、E39M/T47S/H92Y/T392M、E39M/T47S/P166S/R217F/G261A/T392M、E39M/T47S/R217F/D247N/A368W、E39M/T47S/D247N、E39M/H92Y/P166S/R217F/T392M、E39M/H92Y/G261A/K302Q、E39M/P166S/R217F/G261A/D316L/A368W、E39M/I322M、E39M/T392M、R44L/T47S、R44L/T47S/H92Y/R217F/A271H、R44L/T47S/H92Y/R217F/D316L/I322M/T392M、R44L/T47S/H92Y/T392M、R44L/T47S/P166S、R44L/T47S/P166S/A271H、R44L/T47S/D247N/A271H/T392M、R44L/D316L/I322M/T392M、R44L/P337A、T47S/P166S/A206K/R217F/D247N/P337A、T47S/P166S/R217F/A271H/P337A、T47S/A206K、T47S/R217F/D247N/G261A、T47S/A271H、D52N/R217F/K302Q/D316L、H92Y/P166S/A206K/A271H/D316L、H92Y/P166S/R217F/G261A/A271H/T392M、H92Y/P166S/R217F/D316L/P337A/T392M、H92Y/P166S/D247N、H92Y/P166S/D316L、H92Y/A206K/I322M、H92Y/R217F、H92Y/R217F/A271H/P337A、H92Y/G261A/A271H、H92Y/A271H、P166S/R217F/D316L/I322M/P337A、P166S/D247N/A271H/D316L、P166S/D316L/I322M/P337A、A206K/R217F、R217F/T392M、D247N/D316L、D316L/I322M/A368W以及D316L/P337A/T392M，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 704具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：2、4、5、24/59、24/143/144、24/143/202/333、24/143/202/352/390/391、24/143/333/352/387/390/391、24/143/390/391、24/202、24/202/271、24/202/333/352、24/271/352、24/352/387/390/391、24/387/391、31、40、59、59/143、59/143/202、59/143/202/271/333、59/143/271、59/143/333、59/202、59/202/333、59/271/387/390、73、76、80、83、84、91/215/361、122、123、143、143/202、143/271、143/271/352/390、143/333、143/333/387/390、143/387/391、147、155、164、165、179、186、202、202/333、210、215/218、218、218/361、218/361/398、218/398、246、254/398、271、271/333、271/333/390/391、271/333/391、271/352/391、273、275、277、278、280、281、283、284、287、300、303、304、325、331、332、333/352、333/390/391、333/391、334、335、336、338、339、340、341、343、359、360、361、362、367、369、371、373、375、377、382、382/398、385、387/391、390以及398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 704加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 704具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：2S、4L、5M、5V、24S/59A、24S/143S/144N、24S/143S/202N/333N、24S/143S/202N/352N/390N/391N、24S/143S/333N/352N/387N/390T/391N、24S/143S/390T/391N、24S/202N、24S/202N/271N、24S/202N/333N/352N、24S/271N/352N、24S/352N/387N/390N/391N、24S/387N/391N、31F、31H、31L、31T、31W、40Q、59A、59A/143S、59A/143S/271N、59A/202N、59T、59T/143S/202N、59T/143S/333N、59T/202N/333N、59V/143S/202N/271N/333N、59V/271N/387N/390T、73A、76A、76F、76M、76S、80T、83R、83S、84G、84K、84R、91S/215S/361T、122E、122N、122S、123Q、123R、123S、123T、143S、143S/202N、143S/271N、143S/271N/352N/390N、143S/333N、143S/333N/387N/390T、143S/387N/391N、147L、147S、155A、155D、155F、155L、155R、155T、164E、165I、179H、179L、179R、179W、186E、186F、186M、186P、186R、186S、186Y、202N、202N/333N、210I、215S/218Y、218Y、218Y/361T、218Y/361T/398F、218Y/398F、246Y、254T/398F、271N、271N/333N、271N/333N/390N/391N、271N/333N/391N、271N/352N/391N、273L、275A、275G、277Q、277V、278N、278R、278S、280G、281I、281M、283L、283P、283T、283V、284A、284E、284G、284L、284M、284R、284S、287R、300F、303A、303C、303W、304T、304V、304W、325A、331M、332G、332H、333N/352N、333N/390N/391N、333N/390S/391N、333N/391N、334C、334V、335A、335L、336F、336G、336S、336T、338L、339G、339N、339Q、339V、340H、340I、340K、340M、340P、340W、341F、341M、343L、343R、343S、343W、359F、359L、359R、360H、360V、361T、361V、362H、367A、367D、367L、367M、369D、371G、373L、373S、375L、375Q、377Q、382I、382I/398F、385R、387N/391N、390S以及398F，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 704加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 704具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：D2S、G4L、L5M、L5V、D24S/C59A、D24S/C143S/D144N、D24S/C143S/D202N/G333N、D24S/C143S/D202N/F352N/M390N/Q391N、D24S/C143S/G333N/F352N/E387N/M390T/Q391N、D24S/C143S/M390T/Q391N、D24S/D202N、D24S/D202N/A271N、D24S/D202N/G333N/F352N、D24S/A271N/F352N、D24S/F352N/E387N/M390N/Q391N、D24S/E387N/Q391N、S31F、S31H、S31L、S31T、S31W、E40Q、C59A、C59A/C143S、C59A/C143S/A271N、C59A/D202N、C59T、C59T/C143S/D202N、C59T/C143S/G333N、C59T/D202N/G333N、C59V/C143S/D202N/A271N/G333N、C59V/A271N/E387N/M390T、G73A、Q76A、Q76F、Q76M、Q76S、Q80T、P83R、P83S、H84G、H84K、H84R、N91S/T215S/R361T、D122E、D122N、D122S、I123Q、I123R、I123S、I123T、C143S、C143S/D202N、C143S/A271N、C143S/A271N/F352N/M390N、C143S/G333N、C143S/G333N/E387N/M390T、C143S/E387N/Q391N、E147L、E147S、H155A、H155D、H155F、H155L、H155R、H155T、G164E、R165I、P179H、P179L、P179R、P179W、T186E、T186F、T186M、T186P、T186R、T186S、T186Y、D202N、D202N/G333N、S210I、T215S/N218Y、N218Y、N218Y/R361T、N218Y/R361T/L398F、N218Y/L398F、W246Y、A254T/L398F、A271N、A271N/G333N、A271N/G333N/M390N/Q391N、A271N/G333N/Q391N、A271N/F352N/Q391N、S273L、Q275A、Q275G、K277Q、K277V、A278N、A278R、A278S、L280G、Q281I、Q281M、K283L、K283P、K283T、K283V、D284A、D284E、D284G、D284L、D284M、D284R、D284S、A287R、L300F、G303A、G303C、G303W、D304T、D304V、D304W、R325A、P331M、R332G、R332H、G333N/F352N、G333N/M390N/Q391N、G333N/M390S/Q391N、G333N/Q391N、Y334C、Y334V、T335A、T335L、I336F、I336G、I336S、I336T、V338L、A339G、A339N、A339Q、A339V、S340H、S340I、S340K、S340M、S340P、S340W、L341F、L341M、K343L、K343R、K343S、K343W、V359F、V359L、V359R、K360H、K360V、R361T、R361V、K362H、E367A、E367D、E367L、E367M、T369D、R371G、R373L、R373S、H375L、H375Q、N377Q、V382I、V382I/L398F、Q385R、E387N/Q391N、M390S以及L398F，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 704加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、39、44、47、92、166、206、217、247、261、271、302、316、322、337、368以及392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10A、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I、10K、10L、10M、10N、10Q、10R、10S、10T、10V、10W、10Y、39A、39C、39D、39F、39G、39H、39I、39K、39L、39M、39N、39P、39Q、39R、39S、39T、39V、39W、39Y、44A、44C、44D、44E、44F、44G、44H、44I、44K、44L、44N、44P、44Q、44S、44T、44V、44W、44Y、47A、47C、47D、47E、47F、47G、47H、47I、47K、47L、47M、47N、47P、47Q、47R、47S、47V、47W、47Y、92A、92C、92D、92E、92F、92G、92I、92K、92L、92M、92N、92P、92Q、92R、92S、92T、92V、92W、92Y、166A、166C、166D、166E、166F、166G、166H、166I、166K、166L、166M、166N、166Q、166R、166S、166T、166V、166W、166Y、206C、206D、206E、206F、206G、206H、206I、206K、206L、206M、206N、206P、206Q、206R、206S、206T、206V、206W、206Y、217A、217C、217D、217E、217F、217G、217H、217I、217K、217L、217M、217N、217P、217Q、217S、217T、217V、217W、217Y、247A、247C、247E、247F、247G、247H、247I、247K、247L、247M、247N、247P、247Q、247R、247S、247T、247V、247W、247Y、261A、261C、261D、261E、261F、261H、261I、261K、261L、261M、261N、261P、261Q、261R、261S、261T、261V、261W、261Y、271C、271D、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、302A、302C、302D、302E、302F、302G、302H、302I、302L、302M、302N、302P、302Q、302R、302S、302T、302V、302W、302Y、316A、316C、316E、316F、316G、316H、316I、316K、316L、316M、316N、316P、316Q、316R、316S、316T、316V、316W、316Y、322A、322C、322D、322E、322F、322G、322H、322K、322L、322M、322N、322P、322Q、322R、322S、322T、322V、322W、322Y、337A、337C、337D、337E、337F、337G、337H、337I、337K、337L、337M、337N、337Q、337R、337S、337T、337V、337W、337Y、368C、368D、368E、368F、368G、368H、368I、368K、368L、368M、368N、368P、368Q、368R、368S、368T、368V、368W、368Y、392A、392C、392D、392E、392F、392G、392H、392I、392K、392L、392M、392N、392P、392Q、392R、392S、392V、392W以及392Y，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10A、P10C、P10D、P10E、P10F、P10G、P10H、P10I、P10K、P10L、P10M、P10N、P10Q、P10R、P10S、P10T、P10V、P10W、P10Y、E39A、E39C、E39D、E39F、E39G、E39H、E39I、E39K、E39L、E39M、E39N、E39P、E39Q、E39R、E39S、E39T、E39V、E39W、E39Y、R44A、R44C、R44D、R44E、R44F、R44G、R44H、R44I、R44K、R44L、R44N、R44P、R44Q、R44S、R44T、R44V、R44W、R44Y、T47A、T47C、T47D、T47E、T47F、T47G、T47H、T47I、T47K、T47L、T47M、T47N、T47P、T47Q、T47R、T47S、T47V、T47W、T47Y、H92A、H92C、H92D、H92E、H92F、H92G、H92I、H92K、H92L、H92M、H92N、H92P、H92Q、H92R、H92S、H92T、H92V、H92W、H92Y、P166A、P166C、P166D、P166E、P166F、P166G、P166H、P166I、P166K、P166L、P166M、P166N、P166Q、P166R、P166S、P166T、P166V、P166W、P166Y、A206C、A206D、A206E、A206F、A206G、A206H、A206I、A206K、A206L、A206M、A206N、A206P、A206Q、A206R、A206S、A206T、A206V、A206W、A206Y、R217A、R217C、R217D、R217E、R217F、R217G、R217H、R217I、R217K、R217L、R217M、R217N、R217P、R217Q、R217S、R217T、R217V、R217W、R217Y、D247A、D247C、D247E、D247F、D247G、D247H、D247I、D247K、D247L、D247M、D247N、D247P、D247Q、D247R、D247S、D247T、D247V、D247W、D247Y、G261A、G261C、G261D、G261E、G261F、G261H、G261I、G261K、G261L、G261M、G261N、G261P、G261Q、G261R、G261S、G261T、G261V、G261W、G261Y、A271C、A271D、A271E、A271F、A271G、A271H、A271I、A271K、A271L、A271M、A271N、A271P、A271Q、A271R、A271S、A271T、A271V、A271W、A271Y、K302A、K302C、K302D、K302E、K302F、K302G、K302H、K302I、K302L、K302M、K302N、K302P、K302Q、K302R、K302S、K302T、K302V、K302W、K302Y、D316A、D316C、D316E、D316F、D316G、D316H、D316I、D316K、D316L、D316M、D316N、D316P、D316Q、D316R、D316S、D316T、D316V、D316W、D316Y、I322A、I322C、I322D、I322E、I322F、I322G、I322H、I322K、I322L、I322M、I322N、I322P、I322Q、I322R、I322S、I322T、I322V、I322W、I322Y、P337A、P337C、P337D、P337E、P337F、P337G、P337H、P337I、P337K、P337L、P337M、P337N、P337Q、P337R、P337S、P337T、P337V、P337W、P337Y、A368C、A368D、A368E、A368F、A368G、A368H、A368I、A368K、A368L、A368M、A368N、A368P、A368Q、A368R、A368S、A368T、A368V、A368W、A368Y、T392A、T392C、T392D、T392E、T392F、T392G、T392H、T392I、T392K、T392L、T392M、T392N、T392P、T392Q、T392R、T392S、T392V、T392W以及T392Y，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 1022具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、10/392、31、31/39/44/166/302、31/47、31/283/284、39、39/44、39/44/47、39/44/47/261/283/284、39/44/283、39/44/339、39/47/261、39/92、39/206、39/284、44、44/284/302、84、84/92、84/284/302/392、84/316、84/368/392、92、92/206/217、92/206/275、92/206/284、92/206/302/368、92/271、92/271/277、92/275/284、92/283、92/283/392、92/284、92/302、92/316、92/368、155、155/217、155/368、166、166/283/284、166/302、206、206/217、206/334、261、261/283、271、271/368、275、283、283/284、283/392、284、302、316、334、339、368、368/392以及392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 1022加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 1022具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10G、P10G/T392D、S31T、S31T/E39V/R44V/P166D/K302Y、S31T/T47R、S31T/K283L/D284A、E39L、E39L/H92V、E39L/A206E、E39L/D284S、E39V/R44V、E39V/R44V/T47R、E39V/R44V/T47R/G261S/K283L/D284A、E39V/R44V/K283T、E39V/R44V/A339N、E39V/T47R/G261S、R44V、R44V/D284E/K302Y、H84K、H84K/H92V、H84K/D284S/K302L/T392A、H84K/D316H、H84K/A368E/T392A、H92Q、H92T、H92T/A206E/R217N、H92T/A206E/K302T/A368E、H92T/A271K、H92T/A271K/K277R、H92T/K283P、H92T/K283V/T392W、H92T/D284M、H92T/K302L、H92T/A368E、H92V、H92V/A206E/D284S、H92V/A206Y/Q275A、H92V/Q275A/D284S、H92V/D284S、H92V/K302L、H92V/D316H、H155F、H155F/R217I、H155F/A368E、P166D、P166D/K283L/D284A、P166D/K302Y、A206E、A206E/R217N、A206I、A206Q、A206T/Y334C、A206Y、G261S、G261S/K283L、A271K、A271K/A368E、Q275A、K283L、K283P/T392W、K283T、K283T/D284E、D284E、D284M、D284S、K302L、K302Y、D316H、Y334C、A339N、A368E、A368E/T392W、T392A、T392D以及T392W，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 1022加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 1022具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10G、10G/392D、31T、31T/39V/44V/166D/302Y、31T/47R、31T/283L/284A、39L、39L/92V、39L/206E、39L/284S、39V/44V、39V/44V/47R、39V/44V/47R/261S/283L/284A、39V/44V/283T、39V/44V/339N、39V/47R/261S、44V、44V/284E/302Y、84K、84K/92V、84K/284S/302L/392A、84K/316H、84K/368E/392A、92Q、92T、92T/206E/217N、92T/206E/302T/368E、92T/271K、92T/271K/277R、92T/283P、92T/283V/392W、92T/284M、92T/302L、92T/368E、92V、92V/206E/284S、92V/206Y/275A、92V/275A/284S、92V/284S、92V/302L、92V/316H、155F、155F/217I、155F/368E、166D、166D/283L/284A、166D/302Y、206E、206E/217N、206I、206Q、206T/334C、206Y、261S、261S/283L、271K、271K/368E、275A、283L、283P/392W、283T、283T/284E、284E、284M、284S、302L、302Y、316H、334C、339N、368E、368E/392W、392A、392D以及392W，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 1022加以編號。

在一些實施例中，本發明之α半乳糖苷酶A在如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中所提供之至少一個位置中包含至少一個突變，其中位置係參考SEQ ID NO: 2或如該等表中指示之另一參考序列加以編號。在一些額外實施例中，重組α半乳糖苷酶A係衍生自人類α半乳糖苷酶A。在一些另外實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含SEQ ID NO: 8、58、158、372、374、704及/或1022之多肽序列。

在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具熱穩定性。在一些額外實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具在pH 7下之穩定性。在又一些額外實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具在pH 4下之穩定性。在再一些另外實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具在pH 7下之穩定性且更具在pH 4下之穩定性。在再額外實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更穩定地暴露於血清。在一些另外實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具溶酶體穩定性。在又一些額外實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更易於被細胞吸收。在一些另外實施例中，重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更能自細胞耗乏球形三醯神經醯胺。在又一些額外實施例中，相較於SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022而言，重組α半乳糖苷酶A展現經改善之於細胞中之吸收。在一些另外實施例中，重組α半乳糖苷酶A之免疫原性低於具有SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A之免疫原性。在一些另外實施例中，重組α半乳糖苷酶A展現相較於參考序列而言選自以下之至少一種經改善特性：i)經增強之催化活性；ii)經提高之耐pH 7性；iii)經提高之耐pH 4性；iv)經提高之耐血清性；v)經改善之於細胞中之吸收；vi)經降低之免疫原性；或vii)經增加之自細胞進行的球形三醯神經醯胺耗乏；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)或vii)中任一者之組合。在一些實施例中，參考序列為SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022。在一些另外實施例中，重組α半乳糖苷酶A被純化。

本發明亦提供編碼至少一種如本文(例如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中)所提供之重組α半乳糖苷酶A之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸序列係選自DNA、RNA以及mRNA。在一些實施例中，重組多核苷酸序列經密碼子最佳化。

本發明亦提供包含編碼至少一種如本文(例如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1)所提供之重組α半乳糖苷酶A之重組多核苷酸序列的表現載體。在一些實施例中，重組多核苷酸序列可操作地連接至控制序列。在一些額外實施例中，控制序列為啟動子。在一些另外實施例中，啟動子為異源啟動子。在一些實施例中，表現載體進一步包含如本文所提供之信號序列。

本發明亦提供包含至少一種如本文所提供之表現載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含有包含編碼至少一種如本文(例如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1)所提供之重組α半乳糖苷酶A之重組多核苷酸序列的表現載體。在一些實施例中，宿主細胞係選自真核生物以及原核生物。在一些實施例中，宿主細胞為真核的。在一些額外實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。

本發明亦提供產生α半乳糖苷酶A變異體之方法，該等方法包含在由重組多核苷酸編碼之α半乳糖苷酶A被產生之條件下培養本文所提供之宿主細胞。在一些實施例中，該等方法進一步包含回收α半乳糖苷酶A之步驟。在一些另外實施例中，該等方法進一步包含純化α半乳糖苷酶A之步驟。本發明亦提供包含至少一種如本文(例如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1)所提供之重組α半乳糖苷酶A之組合物。在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物。在一些實施例中，本發明提供包含至少一種本文所提供之重組多核苷酸之醫藥組合物。在一些額外實施例中，本發明提供用於治療法布瑞氏病之醫藥組合物，該等醫藥組合物包含本文所提供之酶組合物。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。在一些額外實施例中，醫藥組合物適用於非經腸注射或輸注至人類。

本發明亦提供用於治療及/或預防個體之法布瑞氏病之症狀的方法，該等方法包含提供患有法布瑞氏病之個體，及提供至少一種包含至少一種如本文(例如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1)所提供之重組α半乳糖苷酶A之醫藥組合物組合物，以及向個體投與醫藥組合物。在一些實施例中，個體之法布瑞氏病之症狀經改善。在一些額外實施例中，已投與本發明之醫藥組合物之個體能夠食用一膳食，該膳食之脂肪含量限制低於展現法布瑞氏病之症狀之個體所要求的膳食的脂肪含量限制。在一些實施例中，個體為嬰兒或兒童，而在一些替代實施例中，個體為成年人或青少年。

本發明亦提供本文所提供之組合物之用途。

較佳實施例之詳細說明

本發明提供經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽及其組合物。該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽已經最佳化以得到經改善之熱穩定性、血清穩定性、經改善之細胞吸收及在酸性(pH ＜ 4)條件及鹼性(pH ＞ 7)條件二者下之穩定性、經降低之免疫原性以及經改善之自細胞進行的球形三醯神經醯胺清除。本發明亦關於包含該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽之該等組合物用於治療目的之用途。在一些實施例中，經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽已經最佳化以得到經改善之細胞吸收，同時維持穩定性。本發明亦關於包含該等經工程處理之人類α-半乳糖苷酶多肽之該等組合物用於治療目的之用途。

在一些情況下，用於治療法布瑞氏病之酶替代療法(例如FABRAZYME^® 阿加糖酶β；Genzyme)經考慮用於合格個體。當前所用之酶替代療法為野生型人類GLA之以重組方式表現之形式。已知靜脈內投與之GLA循環，經由受體介導之胞吞作用被吸收至細胞中，該受體主要為甘露糖6-磷酸受體(M6PR)，且行進至目標器官之胞內體/溶酶體，在該等胞內體/溶酶體中其清除所積聚之Gb3。此等藥物不完全緩解患者症狀，此係因為神經性病變疼痛及短暫性腦缺血繼續以經降低速率發生。另外，相較於高度血管化且富含M6PR之肝而言，大部分目標器官對GLA之吸收較差，且酶在血液及溶酶體pH下不穩定。因此，可用治療仍存在問題。另外，患者可發展免疫反應(靶向所投與藥物之IgG及IgE抗體)，且遭受重度過敏性(allergic/anaphylactic)反應、重度輸注反應及甚至死亡。本發明意欲提供相較於當前可用治療而言更穩定且有效、但具有經減少之副作用及經改善之成效之適用於治療法布瑞氏病的酶。實際上，本發明意欲提供具有經提高之於血液(pH 7.4)中之穩定性之重組GLA酶，該於血液(pH 7.4)中之穩定性係在酶被引入血流中時遇到。另外，酶具有經提高之在溶酶體pH (pH 4.3)下之穩定性，該溶酶體為在療法期間酶具有活性之位置。因此，使用採用多樣酶變異體庫之高通量篩檢進行之人類HEK293T細胞中以重組方式表現之人類GLA的定向演化以提供具有經維持之穩定性特性、經改善之球形三醯神經醯胺清除及細胞吸收的新穎GLA變異體。在一些實施例中，GLA變異體展現經降低之免疫原性。縮寫以及定義：

除非另外定義，否則本文所使用之所有技術以及科學術語皆一般具有與一般熟習本發明所涉及技術者通常所理解之含義相同之含義。一般而言，本文所使用之命名法以及下文所描述之細胞培養實驗步驟、分子遺傳學、微生物學、生物化學、有機化學、分析化學及核酸化學為此項技術中熟知且通常採用之命名法、細胞培養實驗步驟、分子遺傳學、微生物學、生物化學、有機化學、分析化學及核酸化學。該等技術為熟知的且在熟習此項技術者熟知之諸多文本以及參考作品中得到描述。標準技術或其改良形式係用於化學合成以及化學分析。本文，亦即上文及下文二者所提及之所有專利、專利申請案、文章以及公開案皆特此以引用之方式明確地併入本文中。

儘管與本文所描述之方法以及材料類似或等效之任何合適方法以及材料均可用於實踐本發明，但本文描述一些方法以及材料。應理解，本發明不限於所描述之特定方法、方案以及試劑，此係因為此等方法、方案以及試劑可能會視熟習此項技術者使用其之情形而變化。因此，下文緊接著定義之術語係藉由參考本申請案整體而得到更完全地描述。本文，亦即上文及下文二者所提及之所有專利、專利申請案、文章以及公開案皆特此以引用之方式明確地併入本文中。

此外，除非上下文另外清楚地指示，否則如本文所使用之單數「一(a/an)」以及「該」包括多個提及物。

數值範圍包括界定該範圍之數值。因此，本文所揭露之每個數值範圍均意欲涵蓋落入該較寬數值範圍內之每個較窄數值範圍，如同該等較窄數值範圍在本文中全部被明確地書寫一般。亦預期本文所揭露之每個最大(或最小)數值限制包括每個較低(或較高)數值限制，如同該等較低(或較高)數值限制在本文中被明確地書寫一般。

術語「約」意謂特定值之可接受誤差。在一些情況下，「約」意謂在既定值範圍之0.05%、0.5%、1.0%或2.0%內。在一些情況下，「約」意謂在既定值之1、2、3或4個標準差內。

此外，本文所提供之標題並非對本發明之各種態樣或實施例之限制，該等態樣或實施例可藉由參考本申請案整體而得出。因此，下文緊接著定義之術語係藉由參考本申請案整體而得到更完全地定義。儘管如此，為促進對本發明之理解，多個術語在下文中被定義。

除非另外指示，否則對應地，核酸在5'至3'方位上自左至右書寫；胺基酸序列在胺基至羧基方位上自左至右書寫。

如本文所使用之術語「包含」以及其同源詞係在其包括性意義上(亦即等效於術語「包括」以及其對應同源詞)使用。

如本文所使用之「EC」編號係指國際生物化學與分子生物學聯盟命名委員會(the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，NC-IUBMB)之酶命名法。IUBMB生物化學分類為基於酶所催化之化學反應之酶的數值分類系統。

如本文所使用之「ATCC」係指其生物庫集合包括基因以及菌株之美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)。

如本文所使用之「NCBI」係指國家生物資訊中心(National Center for Biological Information)以及其中所提供之序列資料庫。

「蛋白質」、「多肽」以及「肽」在本文中可互換地用於指代藉由醯胺鍵共價連接之至少二種胺基酸之聚合物，無關於長度或轉譯後修飾(例如醣基化或磷酸化)。

「胺基酸」在本文中係藉由其通常已知之三字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號來提及。同樣，核苷酸可藉由其通常可接受之單字母密碼來提及。用於經基因編碼之胺基酸之縮寫為習知的且如下：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺酸(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩胺酸(Glu或E)、麩醯胺酸(Gln或Q)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)以及纈胺酸(Val或V)。當使用三字母縮寫時，除非前面特定地存在「L」或「D」或自使用該縮寫之上下文明顯可見，否則胺基酸可在α-碳(C_α )周圍呈L組態或D組態。舉例而言，鑒於在不指定α-碳周圍之組態之情況下「Ala」指示丙胺酸，「D-Ala」及「L-Ala」分別表示D-丙胺酸及L-丙胺酸。當多肽序列呈現為一串單字母縮寫或三字母縮寫(或其混合形式)時，根據常用慣例，序列在胺基(N)至羧基(C)方向呈現。

用於基因編碼核苷之縮寫為習知的且如下：腺苷(A)；鳥苷(G)；胞苷(C)；胸苷(T)；以及尿苷(U)。除非特定地敍述，否則縮寫核苷可為核糖核苷或2'-去氧核糖核苷。在個別基礎上或在聚合基礎上，核苷可被規定為核糖核苷或2'-去氧核糖核苷。當核酸序列呈現為一串單字母縮寫時，根據常用慣例，序列在5'至3'方向呈現，且磷酸不被指示。

術語「經工程處理之」、「重組」、「非天然存在之」以及「變異」在關於細胞、多核苷酸或多肽使用時係指已以不另外存在於自然界中之方式經修飾或與其相同、但由合成物質產生或衍生及/或藉由使用重組技術進行操縱來產生或衍生的物質或對應於該物質的天然或自然形式的物質。

如本文所使用之「UTR」係指mRNA多核苷酸之非轉譯區。在一些實施例中，「5'非轉譯區」或「5'UTR」稱為「前導序列」或「前導RNA」。此mRNA區直接位於起始密碼子上游。在一些實施例中，「3'非轉譯區」或「3'UTR」為直接位於終止密碼子下游之mRNA區。在各種生物(例如原核生物、真核生物以及病毒)中，此二個區均對轉譯調節及胞內遷移至關重要。

如本文所使用之「野生型」、「WT」以及「天然存在之」係指在自然界中發現之形式。舉例而言，野生型多肽或多核苷酸序列為可與自然界中之源分離且尚未藉由人類操縱加以有意修飾之生物中存在的序列。

如本文所使用之「編碼序列」係指編碼蛋白質之胺基酸序列之核酸(例如基因)的一部分。

術語「序列一致性百分比(%)」在本文中用於指多核苷酸以及多肽中之比較結果，且係藉由比較比較窗口上之二個經最佳比對序列來測定，其中相較於參考序列而言，比較窗口中之多核苷酸或多肽序列之部分可包含添加或缺失(亦即間隙)以用於二個序列的最佳比對。該百分比可藉由以下來計算：測定相同核酸鹼基或胺基酸殘基出現在二個序列中所在位置數以產生匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗口中之總位置數且將結果乘以100以產生序列一致性百分比。可替代地，該百分比可藉由以下來計算：測定相同核酸鹼基或胺基酸殘基出現在二個序列中或核酸鹼基或胺基酸殘基與間隙比對所在位置數以產生匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗口中之總位置數且將結果乘以100以產生序列一致性百分比。熟習此項技術者瞭解，存在許多可用於比對二個序列之已確立演算法。用於比較之最佳序列比對可例如藉由Smith及Waterman之局部同源性演算法(Smith及Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981])、藉由Needleman及Wunsch之同源性比對演算法(Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970])、藉由Pearson及Lipman之類似性搜索方法(Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988])、藉由此等演算法之電腦化實施方案(例如GCG Wisconsin套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)或藉由如此項技術中已知之視覺檢查來進行。適用於測定序列一致性及序列類似性百分比之演算法之實例包括但不限於Altschul等人所描述之BLAST以及BLAST 2.0演算法(分別參見Altschul等人, J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990]；以及Altschul等人, 1977, Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977])。用於執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)網站公開獲得。此演算法涉及首先藉由識別查詢序列中之具有長度W之短字語來識別高評分序列對(HSP)，該等短字語當與資料庫序列中具有相同長度之字語比對時匹配或滿足某一正值臨限分數T。T稱為鄰域字語分數臨限值(參見Altschul等人，同前文獻)。此等初始鄰域字語命中充當用於啟動搜索之種子以尋找含有其之較長HSP。隨後，字語命中沿各序列在二個方向上延伸，直至累積比對分數可增加。對於核苷酸序列，累積分數係使用參數M (一對匹配殘基之獎勵分數；始終＞ 0)以及N (錯配殘基之懲罰分數；始終＜ 0)來計算。對於胺基酸序列，使用評分矩陣以計算累積分數。當以下情況時，字語命中在各方向上之延伸中斷：累積比對分數自其達成之最大值降低數量X；累積分數由於一或多個負評分殘基比對之累加而變成零或低於零；或到達任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T以及X測定比對之敏感度以及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用以下作為預設值：11之字長(W)，10之期望值(E)，M = 5，N = -4以及二股之比較結果。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用以下作為預設值：3之字長(W)、10之期望值(E)以及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989])。例示性序列比對以及序列一致性%測定可採用使用所提供之預設參數之GCG Wisconsin套裝軟體(Accelrys, Madison WI)中之BESTFIT或GAP程式。

如本文所使用之「參考序列」係指用作序列比較之基礎之經界定序列。參考序列可為例如全長基因或多肽序列之鏈段之較大序列子集。一般而言，參考序列之長度為至少20個核苷酸或胺基酸殘基，長度為至少25個殘基，長度為至少50個殘基，長度為至少100個殘基，或為核酸或多肽之全長。由於二個多核苷酸或多肽可各自(1)包含在二個序列之間類似之序列(亦即完整序列之一部分)以及(2)可進一步包含在二個序列之間相異之序列，故二個(或更多個)多核苷酸或多肽之間的序列比較通常藉由比較「比較窗口」上之二個多核苷酸或多肽之序列以識別且比較具有序列類似性之局部區域來執行。在一些實施例中，「參考序列」可基於一級胺基酸序列，其中參考序列為在一級序列中可具有一或多個變化之序列。「比較窗口」係指具有至少約20個鄰接核苷酸位置或胺基酸殘基之概念性鏈段，其中可將序列與具有至少20個鄰接核苷酸或胺基酸之參考序列進行比較，且其中相較於參考序列(其不包含添加或缺失)而言，比較窗口中之序列之部分可包含20%或更少添加或缺失(亦即間隙)以用於二個序列的最佳比對。比較窗口可長於20個鄰接殘基，且任擇地包括30、40、50、100個或更長窗口。

「對應於」、「參考」或「相對於……而言」在既定胺基酸或多核苷酸序列編號之情形下使用時係指當將既定胺基酸或多核苷酸序列與參考序列進行比較時規定參考序列之殘基編號。換言之，既定聚合物之殘基編號或殘基位置係關於參考序列而非藉由既定胺基酸或多核苷酸序列內殘基之實際數值位置來指定。舉例而言，諸如經工程處理之GLA之胺基酸序列之既定胺基酸序列可藉由引入間隙以使二個序列之間的殘基匹配最佳化來與參考序列比對。在此等情況下，儘管存在間隙，但既定胺基酸或多核苷酸序列中之殘基編號係關於已與其比對之參考序列來進行。

如本文所使用之「胺基酸差異」及「殘基差異」係指多肽序列之一位置處之胺基酸殘基相對於參考序列中對應位置處之胺基酸殘基而言的差異。具有胺基酸差異之位置在本文中一般稱為「Xn」，其中n係指作為殘基差異基礎之參考序列中之對應位置。舉例而言，「相較於SEQ ID NO: 8而言之位置X44處之殘基差異」係指對應於SEQ ID NO: 8之位置44之多肽位置處的胺基酸殘基差異。因此，若具有SEQ ID NO: 8之參考多肽在位置44處具有精胺酸，則「相較於SEQ ID NO: 8而言之位置X44處之殘基差異」係指對應於SEQ ID NO: 8之位置44之多肽位置處除精胺酸以外之任何殘基的胺基酸取代。在本文中之大部分情況下，一位置處之特定胺基酸殘基差異指示為「XnY」，其中「Xn」規定如上文所描述之對應位置，且「Y」為在經工程處理之多肽中發現之胺基酸(亦即與參考多肽中之殘基不同之殘基)之單字母識別符。在一些情況下(例如如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1以及13-1中所示)，本揭露內容亦提供由習知記號「AnB」表示之特定胺基酸差異，其中A為參考序列中之殘基之單字母識別符，「n」為參考序列中之殘基位置數，且B為經工程處理之多肽之序列中的殘基取代的單字母識別符。在一些情況下，本揭露內容之多肽可包括由其中存在相對於參考序列而言之殘基差異之規定位置清單指示的相對於參考序列而言之一或多個胺基酸殘基差異。在一些實施例中，在超過一個胺基酸可用於多肽之特定殘基位置中之情況下，可使用之各種胺基酸殘基係藉由「/」間隔開(例如X247D/X247N或X247D/N)。在一些實施例中，酶變異體包含超過一個取代。此等取代係藉由斜線間隔開以易於讀取(例如D24S/D202N)。本申請案包括包含一或多個胺基酸差異之經工程處理之多肽序列，該一或多個胺基酸差異包括守恆胺基酸取代及非守恆胺基酸取代中之任一者/或二者。

如本文所使用之「突變」係指多肽及多核苷酸序列之取代、插入、缺失以及其他修飾。預期本發明不限於任何特定類型之突變。

「守恆胺基酸取代」係指用具有類似側鏈之不同殘基進行之殘基取代，且因此通常涉及用相同或類似經界定類別之胺基酸內之胺基酸進行的多肽中的胺基酸取代。作為實例而非限制，對應地，具有脂族側鏈之胺基酸可經另一脂族胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸以及異白胺酸)取代；具有羥基側鏈之胺基酸經另一具有羥基側鏈之胺基酸(例如絲胺酸以及蘇胺酸)取代；具有芳族側鏈之胺基酸經另一具有芳族側鏈之胺基酸(例如苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸以及組胺酸)取代；具有鹼性側鏈之胺基酸經另一具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸以及精胺酸)取代；具有酸性側鏈之胺基酸經另一具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)取代；且/或疏水性或親水性胺基酸經另一疏水性或親水性胺基酸置換。

「非守恆取代」係指用具有顯著地不同之側鏈特性之胺基酸進行之多肽中的胺基酸取代。非守恆取代可使用經界定群組之間而非之內的胺基酸且影響(a)取代(例如脯胺酸取代甘胺酸)區域中之肽骨幹結構、(b)電荷或疏水性或(c)側鏈主體。作為實例而非限制，例示性非守恆取代可為經鹼性或脂族胺基酸取代之酸性胺基酸；經小胺基酸取代之芳族胺基酸；以及經疏水性胺基酸取代之親水性胺基酸。

如本文所使用之「缺失」係指藉由自參考多肽移除一或多個胺基酸進行之對多肽之修飾。缺失可包含移除1或多個胺基酸、2個或更多個胺基酸、5個或更多個胺基酸、10個或更多個胺基酸、15個或更多個胺基酸或20個或更多個胺基酸，至多構成參考酶之胺基酸總數之10%或至多構成參考酶之胺基酸總數之20%，同時保留酶活性且/或保留經工程處理之酶的經改善特性。缺失可針對多肽之內部部分及/或末端部分。在各種實施例中，缺失可包含連續鏈段或可為非連續的。

如本文所使用之「插入」係指藉由自參考多肽添加一或多個胺基酸進行之對多肽之修飾。插入可在多肽之內部部分中，或到達羧基或胺基端。如本文所使用之插入包括如此項技術中已知之融合蛋白。插入可為胺基酸之鄰接鏈段或藉由天然存在之多肽中之胺基酸中的一或多者間隔開。

「功能片段」或「生物活性片段」在本文中可互換地用於指具有一或多個胺基端及/或羧基端缺失及/或內部缺失，但其中剩餘胺基酸序列與同其進行比較之序列中之對應位置相同的多肽(例如本發明之全長經工程處理之GLA)，且其保留了全長多肽之實質上所有活性。

如本文所使用之「經分離多肽」係指與天然地伴隨其之其他污染物(例如蛋白質、脂質以及多核苷酸)實質上分離之多肽。該術語涵蓋已自其天然存在之環境或表現系統(例如宿主細胞或活體外合成)移除或純化之多肽。重組GLA多肽可存在於細胞內，存在於細胞培養基中，或以諸如溶解物或經分離製備物之各種形式製備。因此，在一些實施例中，重組GLA多肽可為經分離多肽。

如本文所使用之「實質上純之多肽」係指其中多肽物種為所存在之主要物種之組合物(亦即基於莫耳濃度或重量計，該多肽物種比組合物中之任何其他個別巨分子物種更豐富)，且當目標物種包含至少約50莫耳%或重量%所存在之巨分子物種時一般為實質上經純化之組合物。一般而言，實質上純之GLA組合物包含約60莫耳%或重量%或更多、約70莫耳%或重量%或更多、約80莫耳%或重量%或更多、約90莫耳%或重量%或更多、約95莫耳%或重量%或更多以及約98莫耳%或重量%或更多存在於組合物中之所有巨分子物種。在一些實施例中，目標物種經純化至基本均質性(亦即組合物中之污染物物種無法藉由習知偵測方法來偵測)，其中組合物基本上由單一巨分子物種組成。溶劑物種、小分子(＜ 500道爾頓)以及元素離子物種不被視為巨分子物種。在一些實施例中，經分離重組GLA多肽為實質上純之多肽組合物。

如本文所使用之「經改善酶特性」係指經工程處理之GLA多肽相較於參考GLA多肽及/或野生型GLA多肽或另一經工程處理之GLA多肽而言展現任何酶特性改善。經改善特性包括但不限於諸如以下之特性：經增加之基因表現、經增加之蛋白質產生、經提高之熱活性、經提高之熱穩定性、經提高之在各種pH位準下之活性、經提高之穩定性、經提高之酶活性、經提高之受質特異性或親和力、經提高之比活性、經提高之抗受質及/或產物抑制性、經提高之化學穩定性、經改善之化學選擇性、經改善之溶劑穩定性、經提高之耐酸性、中性或鹼性pH性、經提高之蛋白水解活性耐受性(亦即經降低之對蛋白水解之敏感度)、經減少之聚集、經提高之溶解度、經降低之免疫原性、經改善之轉譯後修飾(例如醣基化)、經更改之溫度分佈、經增加之細胞吸收、經提高之溶酶體穩定性、經提高之耗乏Gb3細胞之能力、經增加之自產生GLA細胞之分泌等。

如本文所使用之「經提高之酶活性」及「經增強之催化活性」係指相較於參考GLA酶而言經工程處理之GLA多肽之經改善特性，該經改善特性可由比活性(例如所產生之產物/時間/蛋白質重量)提高或受質向產物之轉化% (例如在規定時間段內使用規定量之GLA進行之初始量受質向產物的轉化%)增加來表示。

例示性用於測定酶活性之方法係在實例中提供。包括K_m 、V_max 或k_cat 經典酶特性之與酶活性相關之任何特性可能會受影響，其變化可引起酶活性提高。酶活性改善可為對應野生型酶之酶活性之約1.1倍至高達衍生GLA多肽之天然存在之GLA或另一經工程處理之GLA的酶活性的2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多倍。

在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽之k_cat 為至少0.1/秒、至少0.5/秒、至少1.0/秒、至少5.0/秒、至少10.0/秒且在一些較佳實施例中大於10.0/秒。在一些實施例中，K_m 係在約1 µM至約5 mM範圍內；在約5 µM至約2 mM範圍內；在約10 µM至約2 mM範圍內；或在約10 µM至約1 mM範圍內。在一些特定實施例中，經工程處理之GLA酶在暴露於某些條件之後展現在參考GLA酶(例如野生型GLA或任何其他參考GLA，諸如SEQ ID NO: 8)之酶活性之1.5至10倍、1.5至25倍、1.5至50倍、1.5至100倍或更多倍範圍內的經改善之酶活性。GLA活性可藉由此項技術中已知之任何合適方法(例如標準分析，諸如監測反應物或產物之分光光度特性變化)來量測。在一些實施例中，所產生之產物之量可藉由直接與UV吸光度或螢光偵測組合或接鄰苯二甲醛(OPA)衍生化之後的高效液相層析(HPLC)分離來量測。在一些實施例中，所產生之產物之量可藉由在4-甲基香豆素基-α-D-半乳哌喃糖苷(4-MUGal)分子水解之後監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來量測。如本文進一步詳細描述，酶活性之比較係使用經界定之酶製備物、經界定之在一組條件下之分析以及一或多種經界定之受質來進行。一般而言，當溶解物被比較時，測定所分析之細胞的數目及蛋白質的量，以及使用相同的表現系統及相同的宿主細胞以將由宿主細胞產生且存在於溶解物中之酶之量的變化減至最少。

如本文所使用之術語「經改善之耐酸性pH性」意指相較於參考GLA或另一酶而言本發明之重組GLA將具有經提高之穩定性(在暴露於酸性pH達規定時間段(1小時至24小時)之後較高之在約pH 4.8下之保留活性)。

如本文所使用之術語「經改善之細胞吸收」意指相較於參考GLA (包括野生型GLA)或另一酶而言本文所提供之重組GLA展現經提高之進入細胞之胞吞作用。在一些實施例中，細胞為經培養法布瑞氏病患者纖維母細胞(相較於參考GLA或另一酶而言，在經規定時間段與經培養細胞一起培育之後較高之保留胞內活性)。在一些額外實施例中，相較於參考GLA (包括野生型GLA)或另一酶而言，本文所提供之重組GLA展現經特定時間段與經培養細胞之較高之保留胞內活性。在一些額外實施例中，時間段為約4小時，而在一些其他實施例中，時間段為少於4小時(例如1、2或3小時)，且在一些替代實施例中，時間段為超過4小時(例如5、6、7、8小時或更多個小時)。

如本文所使用之「生理pH」意謂一般在個體(例如人類)血液中發現之pH範圍。

術語「鹼性pH」(例如關於經改善之對鹼性pH條件之穩定性或經提高之耐鹼性pH性使用)意謂約7至11之pH範圍。

術語「酸性pH」(例如關於經改善之對酸性pH條件之穩定性或經提高之耐酸性pH性使用)意謂約1.5至4.5之pH範圍。

如本文所使用之「轉化」係指一或多種受質向一或多種對應產物之酶轉化(或生物變換)。「轉化%」係指在規定條件下在一段時間內轉化成產物之受質之%。因此，GLA多肽之「酶活性」或「活性」可表示為在特定時間段內受質向產物之「轉化%」。

在核酸雜交中，如本文所使用之「雜交嚴格度」與諸如洗滌條件之雜交條件有關。一般而言，雜交反應係在較低嚴格度之條件下執行，之後為變化但較高嚴格度之洗滌。術語「中度嚴格雜交」係指准許目標DNA結合與目標DNA具有約60%一致性、較佳約75%一致性、約85%一致性、與目標多核苷酸具有大於約90%一致性之互補核酸的條件。例示性中度嚴格條件為等效於以下之條件：在42℃下在50%甲醯胺、5 ×鄧哈特氏溶液(Denhart's solution)、5 × SSPE、0.2% SDS中之雜交，之後為在42℃下在0.2 × SSPE、0.2% SDS中之洗滌。「高嚴格度雜交」一般指如在溶液條件下針對經界定多核苷酸序列所測定離熱熔融溫度T_m 約10℃或更少之條件。在一些實施例中，高嚴格度條件係指准許在65℃下在0.018 M NaCl中形成穩定雜交體之僅彼等核酸序列雜交的條件(亦即如本文所考慮，若雜交體在65℃下在0.018 M NaCl中不穩定，則其將在高嚴格度條件下不穩定)。高嚴格度條件可例如由以下提供：在等效於在42℃下50%甲醯胺、5 ×鄧哈特氏溶液、5 × SSPE、0.2% SDS之條件中之雜交，之後為在65℃下在0.1 × SSPE以及0.1% SDS中之洗滌。另一高嚴格度條件為在等效於在65℃下在含有0.1% (w:v) SDS之5 × SSC中之雜交之條件中的雜交以及在65℃下在含有0.1% SDS之0.1 × SSC中的洗滌。其他高嚴格度雜交條件以及中度嚴格條件描述於上文所引用之參考文獻中。

如本文所使用之「經密碼子最佳化」係指編碼蛋白質之多核苷酸之密碼子變化，該等變化使得經編碼蛋白質在感興趣之生物及/或細胞中更有效地表現。儘管由於大部分胺基酸由稱為「同義碼」或「同義」密碼子之數個密碼子表示，故遺傳密碼被簡併，但眾所周知，特定生物之密碼子使用為非隨機的且偏向特定密碼子三重峰。關於既定基因、具有共同功能或祖性起源之基因、相對於低複本數蛋白質而言之經高度表現之蛋白質以及生物基因組之聚合蛋白編碼區，此密碼子使用偏好可為較高的。在一些實施例中，編碼GLA酶之多核苷酸可經密碼子最佳化以用於由經選擇用於表現之一或多個宿主生物及/或一或多個細胞類型進行的最佳產生，說明GC含量、隱藏剪接位點、轉錄終止信號、可能會影響RNA穩定性之模體及核酸二級結構以及感興趣之任何其他因素。

如本文所使用之「控制序列」係指包括本申請案之多核苷酸及/或多肽之表現所需或對其有利的所有組分。對於編碼多肽之核酸序列，各控制序列可為自然的或外來的。該等控制序列包括但不限於前導序列、多腺苷酸化序列、原肽序列、啟動序列、信號肽序列、起始序列以及轉錄終止子。在最低限度下，控制序列包括啟動子以及轉錄及轉譯停止信號。控制序列可出於引入特定限制位點，促進控制序列與編碼多肽之核酸序列之編碼區接合之目的而具備連接子。

如本文所使用之「可操作地連接」係指其中控制序列適當地置放於相對於感興趣之多核苷酸之位置處(亦即在函數關係中)以使得控制序列導引或調節感興趣之多核苷酸及/或多肽之表現的組態。

如本文所使用之「啟動序列」係指由宿主細胞辨識以用於感興趣之多核苷酸之表現的核酸序列，諸如編碼序列。啟動序列含有介導感興趣之多核苷酸之表現的轉錄控制序列。啟動子可為包括突變啟動子、經截短啟動子以及雜交啟動子之在所選宿主細胞中顯示轉錄活性之任何核酸序列，且可自對於宿主細胞而言同源或異源之編碼胞外或胞內多肽之基因獲得。

如本文所使用之「合適反應條件」係指在其下本申請案之GLA多肽能夠將受質轉化成所需產物化合物之於酶轉化反應溶液中之彼等條件(例如酶負載量、溫度、pH、緩衝劑、共溶劑等之範圍)，例示性「合適反應條件」係在本申請案中提供且由實例例示。「酶負載量」係指在反應開始時反應混合物中之組分之濃度或量。「受質」在酶轉化反應過程之情形下係指GLA多肽所作用之化合物或分子。「產物」在酶轉化過程之情形下係指由GLA多肽對受質之作用產生之化合物或分子。

如本文所使用之術語「培養」係指在任何合適條件下(例如使用液體、凝膠或固體培養基)生長微生物、哺乳動物或其他合適細胞之群體。

重組多肽可使用此項技術已知之任何合適方法產生。編碼感興趣之野生型多肽之基因可在諸如質體之載體中經選殖，且在諸如大腸桿菌(E. coli )、釀酒酵母菌(S. cerevisiae )或哺乳動物細胞株(例如HEK或CHO細胞)等之所需宿主中經表現。重組多肽變異體可藉由此項技術中已知之各種方法生成。實際上，存在廣泛多種之為熟習此項技術者熟知之不同突變誘發技術。另外，突變誘發套組亦可獲自許多商業分子生物學供應商。用於在經界定胺基酸處進行特定取代(定點)、在基因局部化區中進行特定或隨機突變(區域特異性)或在整個基因上進行隨機突變誘發(例如飽和突變誘發)之方法為可獲得的。用於生成酶變異體之諸多合適方法為此項技術中之人員已知，其包括但不限於使用PCR進行之單股DNA或雙股DNA之定點突變誘發、卡匣突變誘發、基因合成、易錯PCR、改組以及化學飽和突變誘發或此項技術中已知之任何其他合適方法。用於DNA以及蛋白質工程處理之方法之非限制性實例係在以下專利中提供：美國專利第6,117,679號；美國專利第6,420,175號；美國專利第6,376,246號；美國專利第6,586,182號；美國專利第7,747,391號；美國專利第7,747,393號；美國專利第7,783,428號；以及美國專利第8,383,346號。在變異體被產生之後，其之任何所需特性(例如高或經提高之活性、或低或經降低之活性、經提高之熱活性、經提高之熱穩定性及/或酸性pH穩定性等)可經篩檢。在一些實施例中，「重組GLA多肽」(在本文中亦稱為「經工程處理之GLA多肽」、「變異GLA酶」以及「GLA變異體」)可用。

如本文所使用之「載體」為用於將DNA序列引入細胞中之DNA構築體。在一些實施例中，載體為可操作地連接至合適控制序列之表現載體，其能夠實現於DNA序列中經編碼之多肽之合適宿主中的表現。在一些實施例中，「表現載體」具有可操作地連接至DNA序列之啟動序列(例如轉殖基因)以驅動宿主細胞中之表現，且在一些實施例中，亦包含轉錄終止序列。

如本文所使用之術語「基因療法載體」係指適用於將多核苷酸序列遞送至細胞之媒劑或載劑。在一些實施例中，載體囊封基因(例如治療性基因)或多核苷酸序列以用於遞送至細胞或組織，該等載體包括但不限於腺病毒(AV)載體、腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒(LV)載體以及非病毒載體，諸如脂質體。預期本發明不限於任何特定基因療法載體，此係因為適用於既定環境之任何媒劑均可用。基因療法載體可經設計以將基因遞送至特定物種或宿主，或可具更一般適用性。

如本文所使用之術語「表現」包括參與多肽產生之任何步驟，該步驟包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、轉譯以及轉譯後修飾。在一些實施例中，該術語亦涵蓋多肽自細胞之分泌。

如本文所使用之術語「產生」係指由細胞進行之蛋白質及/或其他化合物產生。預期該術語涵蓋參與多肽產生之任何步驟，該步驟包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、轉譯以及轉譯後修飾。在一些實施例中，該術語亦涵蓋多肽自細胞之分泌。

如本文所使用之胺基酸或核苷酸序列(例如啟動序列、信號肽、終止序列等)對於可與其操作地連接之另一序列而言為「重組」或「異源」的，此係在二個序列在本質上不相關之情況下如此。

如本文所使用之術語「宿主細胞」以及「宿主菌株」係指適用於包含本文所提供之DNA (例如編碼GLA變異體之多核苷酸)之表現載體的宿主。在一些實施例中，宿主細胞為已經使用如此項技術中已知之重組DNA技術構築之載體轉型或轉染的原核細胞或真核細胞。

術語「類似物」意謂與參考多肽具有超過70%序列一致性、但少於100%序列一致性(例如超過75%、78%、80%、83%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性)之多肽。在一些實施例中，「類似物」意謂含有一或多個包括但不限於高精胺酸、鳥胺酸及正纈胺酸之非天然存在之胺基酸殘基以及天然存在之胺基酸的多肽。在一些實施例中，類似物亦包括一或多個D-胺基酸殘基以及於二個或更多個胺基酸殘基之間的非肽鍵。

如本文所使用之術語「治療性」係指投與至顯示病理徵象或症狀之個體之具有有益或合乎需要之醫學作用的化合物。

如本文所使用之術語「醫藥組合物」係指適用於哺乳動物個體(例如人類)中之醫藥用途之組合物，其包含醫藥學上有效量之本發明所涵蓋之經工程處理之GLA多肽以及可接受之載劑。

如本文所使用之術語「基因療法」係指將一或多個基因、多去氧核糖核苷酸或多核苷酸序列與基因療法載體一起遞送至細胞或組織以修飾彼等細胞或組織來治療或預防疾病。基因療法可包括用造成疾病之經突變基因之健康複本置換經突變基因，或使不恰當地運作之經突變基因失活或將其「敲除」。在一些實施例中，基因療法係用於治療患者之疾病。

如本文所使用之術語「mRNA療法」係指將mRNA多核糖核苷酸序列遞送至細胞或組織以修飾彼等細胞或組織來治療或預防疾病。在一些實施例中，用於遞送至細胞或組織之mRNA多核苷酸序列例如但不限於在脂質體中經調配。在一些實施例中，mRNA療法係用於治療患者之疾病。

如本文所使用之術語「細胞療法」係指將已經外源性修飾之活細胞遞送至患者以提供遺失基因來治療或預防疾病。隨後，將經修飾細胞再引入身體中。

如本文所使用之術語「有效量」意謂足以產生所需結果之量。一般熟習此項技術者可藉由使用常規實驗來測定有效量。

術語「經分離」以及「經純化」在本文中用於指分子(例如經分離核酸、多肽等)或自與其天然地相關之至少一種其他組分移除之其他組分。術語「經純化」不要求絕對純度，相反地，其意欲為相對定義。

如本文所使用之術語「個體」涵蓋諸如人類、非人類靈長類動物、家畜、伴生動物以及實驗室動物(例如嚙齒動物及兔類動物)之哺乳動物。預期該術語涵蓋雌性以及雄性。

如本文所使用之術語「患者」意謂經疾病評估、經疾病治療或歷經疾病之任何個體。

術語「嬰兒」係指在出生之後第一個月至約一(1)歲之時段內之兒童。如本文所使用之術語「新生兒」係指自出生至生命第28天之時段內之兒童。術語「早產嬰兒」係指在妊娠第二十整週之後但在足月之前出生、出生時體重一般為~500至~2499公克之嬰兒。「極低出生體重嬰兒」為出生時體重低於1500 g之嬰兒。

如本文所使用之術語「兒童」係指尚未達到同意治療或研究程序之法定年齡之人。在一些實施例中，該術語係指介於出生時間與青春期之間的人。

如本文所使用之術語「成年人」係指已達到相關轄區之法定年齡(例如在美國為18歲)之人。在一些實施例中，該術語係指任何生長完全之成熟生物。在一些實施例中，術語「青少年」係指低於18歲但已達到性成熟之人。

如本文所使用之「組合物」以及「調配物」涵蓋意欲用於任何合適用途之包含至少一種本發明之經工程處理之GLA的產物(例如醫藥組合物、膳食/營養補充劑、饋料等)。

如本文所使用之術語「投與(administration/administering)」組合物意謂向個體(例如向遭受法布瑞氏病影響之人)提供本發明之組合物。

如本文所使用之術語「載劑」在關於醫藥組合物使用時意謂標準醫藥載劑、緩衝劑以及賦形劑(諸如穩定劑、防腐劑以及佐劑)中之任一者。

如本文所使用之術語「醫藥學上可接受之」意謂可投與至個體而不造成任何非所需生物作用或以有害方式與其中所含有、且具有所需生物活性之組分中之任一者相互作用的物質。

如本文所使用之術語「賦形劑」係指除活性醫藥成分(API；例如本發明之經工程處理之GLA多肽)以外之任何醫藥學上可接受之添加劑、載劑、稀釋劑、佐劑或其他成分。賦形劑通常出於調配及/或投與目的而包括在內。

如本文所使用之術語「治療有效量」在關於疾病/病況之症狀使用時係指改善、減弱或消除疾病/病況之一或多種症狀或預防一或多種症狀或延遲其發作的化合物(例如經工程處理之GLA多肽)的量及/或濃度。

如本文所使用之術語「治療有效量」在關於疾病/病況使用時係指改善、減弱或消除疾病/病況之組合物(例如經工程處理之GLA多肽)的量及/或濃度。在一些實施例中，該術語係關於引發研究人員、醫師、獸醫或其他臨床醫師所尋求之組織、系統或動物個體之生物(例如醫學)反應的組合物的量使用。

預期術語「治療(treating/treat/treatment)」涵蓋預防性(例如防治性)治療以及緩解性治療。經工程處理之GLA 表現及活性：

酵母菌密碼子最佳化之成熟人類GLA之分泌表現係使用合成小鼠IG信號肽來達成。殖株係在HEK293T細胞中由pCDNA3.1(+)載體表現。此途徑提供在螢光受質4-甲基香豆素基α-D-半乳哌喃糖苷(4-MuGal)上具有可量測活性之上清液。

在一些實施例中，為了識別相較於SEQ ID NO: 8而言伴隨類似穩定性及經改善之細胞吸收之突變多樣性，構築組合庫，生成衍生自SEQ ID NO: 8之GLA變異體。在未經攻擊條件(未培育，pH 4.6)中或在低pH (3.9-4.2)、中性pH (7.0-7.6)或人類血清(生理pH 7.1-8.2)環境中培育一小時之後篩檢等效體積之上清液。具有歸因於經增加之GLA表現或經提高之GLA比活性之活性的GLA變異體係基於其相對於親本GLA之改善倍數來加以識別。具有經提高之穩定性之GLA變異體係藉由將在經攻擊條件下觀測到之改善倍數除以在未經攻擊條件下觀測到之改善倍數來加以識別。此途徑基於經增加之表現減少針對選擇變異體之偏好，但不改變在pH極值下之比活性。綜合活性分數(所有三個條件之改善倍數之乘積)及穩定性(穩定性分數之乘積)係用於對經改善之變異體中的突變進行分級以包括於後續GLA庫中。在額外實施例中，使用實例中所描述之額外方法及序列。經工程處理之 GLA ：

在一些實施例中，展現經改善特性之經工程處理之GLA與SEQ ID NO: 2、8、48、158、372、374、704及/或1022具有至少約85%、至少約88%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%胺基酸序列一致性，及在一或多個胺基酸位置處具有相較於SEQ ID NO: 2、8、48、158、372、374、704及/或1022而言(諸如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、20或更多個胺基酸位置處具有相較於SEQ ID NO: 2、8、48、158、372、374、704及/或1022或與SEQ ID NO: 2、8、48、158、372、374、704及/或1022具有至少85%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高胺基酸序列一致性之序列而言)的胺基酸殘基差異。在一些實施例中，在一或多個位置處相較於SEQ ID NO: 5而言之殘基差異包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個守恆胺基酸取代。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽為表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中所列之多肽。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽包含SEQ ID NO: 2、8、48、158、372、374、704及/或1022。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：7、7/48/68、7/48/68/120/282/299、7/48/130/282、7/48/180、7/68/130/282/365、7/68/180、7/88/120/305/365、7/120、7/130、7/282、7/305、7/305/365、7/365、39、47、47/87/95/96/158/162、47/95、47/273、47/343、48、48/68、48/180/282、48/282、48/282/305、67/180、68、68/299/300、71、87/91/95/96/158/162、87/91/95/96/206/343、87/96/155/273/343、88、91/95、91/95/96、92、93、96、96/273、96/312/343、120、120/299/305、151、158、158/162/273、162、162/273、162/343、166、178、180、181、206、217、271、273、273/343、282、282/365、293/391、299/300、299/300/305/365、300、301、305、305/365、314、333、336、337、343、345、363、365、370、389、393、394、396/398、397以及398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：7L、7L/48D/68E、7L/48D/68E/120H/282N/299R、7L/48D/130E/282N、7L/48D/180G、7L/68E/130E/282N/365V、7L/68E/180G、7L/88A/120H/305G/365V、7L/120H、7L/130E、7L/282N、7L/305G、7L/305G/365V、7L/365V、39V、47D、47D/87K/95E/96L/158R/162H、47D/95E、47D/273P、47D/343G、47V、48D、48D/68E、48D/180G/282N、48D/282N、48D/282N/305G、67T/180G、68E、68E/299R/300I、71P、87K/91Q/95E/96L/158A/162K、87K/91Q/95E/96L/206S/343G、87K/96I/155N/273P/343G、88A、91Q/95E、91Q/95E/96L、92F、92T、93I、96L、96L/273P、96L/312Q/343G、120H、120H/299R/305G、151L、158A、158A/162K/273G、158R、162H/343D、162K、162K/273P、162S、166K、178G、178S、180G、180L、180T、180V、181A、206K、206S、217K、271R、273P、273P/343G、282N、282N/365V、293P/391A、299R/300I、299R/300I/305G/365V、300I、301M、305G、305G/365V、314A、333F、333G、336V、337R、343D、343G、345A、345Q、363Q、365A、365Q、365V、370G、389K、393V、394K、396G/398T、397A、398A、398P、398S以及398V，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。

在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：R7L、R7L/E48D/Q68E、R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R、R7L/E48D/D130E/D282N、R7L/E48D/F180G、R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V、R7L/Q68E/F180G、R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V、R7L/Y120H、R7L/D130E、R7L/D282N、R7L/N305G、R7L/N305G/F365V、R7L/F365V、E39V、T47D、T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H、T47D/S95E、T47D/S273P、T47D/K343G、T47V、E48D、E48D/Q68E、E48D/F180G/D282N、E48D/D282N、E48D/D282N/N305G、P67T/F180G、Q68E、Q68E/Q299R/L300I、S71P、R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K、R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G、R87K/K96I/H155N/S273P/K343G、Q88A、N91Q/S95E、N91Q/S95E/K96L、H92F、H92T、V93I、K96L、K96L/S273P、K96L/P312Q/K343G、Y120H、Y120H/Q299R/N305G、D151L、L158A、L158A/R162K/S273G、L158R、R162H/K343D、R162K、R162K/S273P、R162S、P166K、W178G、W178S、F180G、F180L、F180T、F180V、Q181A、A206K、A206S、R217K、A271R、S273P、S273P/K343G、D282N、D282N/F365V、L293P/Q391A、Q299R/L300I、Q299R/L300I/N305G/F365V、L300I、R301M、N305G、N305G/F365V、S314A、S333F、S333G、I336V、P337R、K343D、K343G、V345A、V345Q、L363Q、F365A、F365Q、F365V、S370G、T389K、S393V、L394K、D396G/L398T、L397A、L398A、L398P、L398S以及L398V，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。

本發明亦提供重組α半乳糖苷酶A，其中其包含與SEQ ID NO: 158具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：24/202、39/47、39/47/217、39/151、39/282/337/398、39/337/343/398、39/393/398、47/130、47/151、47/343/345/393、48、48/68、48/68/217/333/391/393、48/68/333、48/217、48/333、48/345/393、48/393、59/143、68、68/345、130、130/158、130/158/393、130/345/393、143/271、143/333、143/387、151、151/158/217/343/345/393、151/206/282/337/343/345/398、151/282/393、151/345/393/398、151/393、158、158/393、202、206、206/217、217、217/333、217/337/345/398、271、282/393、333、333/345、337/343/345/398、343、343/345/393/398、393以及393/398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 158具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：24S/202N、39V/47D、39V/47V/217K、39V/151L、39V/282N/337R/398A、39V/337R/343G/398A、39V/393V/398A、47V/130E、47V/151L、47V/343D/345Q/393V、48D、48D/68E、48D/68E/217K/333F/391A/393V、48D/68E/333F、48D/217K、48D/333F、48D/333G、48D/345Q/393V、48D/393V、59A/143S、68E、68E/345Q、130E、130E/158R、130E/158R/393V、130E/345Q/393V、143S/271N、143S/333N、143S/387N、151L、151L/158R/217K/343G/345Q/393V、151L/206S/282N/337R/343D/345Q/398A、151L/282N/393V、151L/345Q/393V/398A、151L/393V、158R、158R/393V、202N、206S、206S/217K、217K、217K/333F、217K/333G、217K/337R/345Q/398A、271N、282N/393V、333F/345Q、333G、333N、337R/343G/345Q/398A、343D、343D/345Q/393V/398A、393V以及393V/398A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 158具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：D24S/D202N、E39V/T47D、E39V/T47V/R217K、E39V/D151L、E39V/D282N/P337R/L398A、E39V/P337R/K343G/L398A、E39V/S393V/L398A、T47V/D130E、T47V/D151L、T47V/K343D/V345Q/S393V、E48D、E48D/Q68E、E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V、E48D/Q68E/S333F、E48D/R217K、E48D/S333F、E48D/S333G、E48D/V345Q/S393V、E48D/S393V、C59A/C143S、Q68E、Q68E/V345Q、D130E、D130E/L158R、D130E/L158R/S393V、D130E/V345Q/S393V、C143S/A271N、C143S/S333N、C143S/E387N、D151L、D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V、D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/L398A、D151L/D282N/S393V、D151L/V345Q/S393V/L398A、D151L/S393V、L158R、L158R/S393V、D202N、A206S、A206S/R217K、R217K、R217K/S333F、R217K/S333G、R217K/P337R/V345Q/L398A、A271N、D282N/S393V、S333F/V345Q、S333G、S333N、P337R/K343G/V345Q/L398A、K343D、K343D/V345Q/S393V/L398A、S393V以及S393V/L398A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。

在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A多肽序列與經偶數編號序列SEQ ID NO: 4-1864具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。

在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽包含本發明所涵蓋之經工程處理之GLA多肽的功能片段。功能片段具有衍生其之經工程處理之GLA多肽(亦即親本經工程處理之GLA)之活性的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。功能片段包含經工程處理之GLA之親本序列之至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及甚至99%。在一些實施例中，功能片段經截短少於5個、少於10個、少於15個、少於10個、少於25個、少於30個、少於35個、少於40個、少於45個及少於50個胺基酸。編碼經工程處理之多肽之多核苷酸、表現載體以及宿主細胞 ：

本發明提供編碼本文所描述之經工程處理之GLA多肽之多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸可操作地連接至控制基因表現之一或多個異源或同源調節序列以產生能夠表現多肽之重組多核苷酸。含有編碼經工程處理之GLA多肽之異源多核苷酸的表現構築體可被引入適當宿主細胞中以表現對應GLA多肽。

如熟習此項技術者顯而易知，蛋白質序列之可獲得性以及對應於各種胺基酸之密碼子之知識提供對所有能夠編碼本發明多肽之多核苷酸的描述。其中相同胺基酸係由替代或同義密碼子編碼之遺傳密碼之簡併允許製造極大量核酸，所有核酸皆編碼經工程處理之GLA多肽。因此，具有特定胺基酸序列之知識之熟習此項技術者可藉由僅以不改變蛋白質之胺基酸序列之方式修飾一或多個密碼子之序列來製造任何數目個不同核酸。在此方面，本發明藉由基於可能性密碼子選項來選擇組合以特定地考慮可被製造之編碼本文所描述之多肽之多核苷酸的每一個可能性變異，且所有該等變異皆將被視為針對本文所描述之任何多肽加以特定地揭露，包括表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中所提供之變異體。

在各種實施例中，密碼子經較佳地選擇以適應其中產生蛋白質之宿主細胞。舉例而言，用於細菌中之較佳密碼子係用於細菌中之表現。因此，編碼經工程處理之GLA多肽之經密碼子最佳化之多核苷酸在約40%、50%、60%、70%、80%或大於90%之全長編碼區之密碼子位置處含有較佳密碼子。在一些實施例中，本發明提供其中密碼子經最佳化以用於人類細胞或組織中之表現的重組多核苷酸序列。

在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 1具有至少約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 1具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 7具有至少約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 7具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，重組多核苷酸序列與經奇數編號序列SEQ ID NO: 3-1863具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。

在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：44、44/217、44/217/316、44/217/322、44/217/322/337、44/247、44/247/302、44/247/302/322、44/247/322、44/247/337、44/247/362、44/302、44/337、44/373、217/322、217/373、247/322、247/362、302/322/362/373、302/337、316、316/337、322、322/337、362/373以及373，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：44L、44L/217F、44L/217F/316L、44L/217F/322M、44L/217F/322M/337A、44L/247N、44L/247N/302Q、44L/247N/302Q/322M、44L/247N/322M、44L/247N/337A、44L/247N/362K、44L/302Q、44L/337A、44L/373R、217F/322M、217F/373R、247N/322M、247N/362K、302Q/322M/362K/373R、302Q/337A、316L、316L/337A、322M、322M/337A、362K/373R以及373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：R44L、R44L/R217F、R44L/R217F/D316L、R44L/R217F/I322M、R44L/R217F/I322M/P337A、R44L/D247N、R44L/D247N/K302Q、R44L/D247N/K302Q/I322M、R44L/D247N/I322M、R44L/D247N/P337A、R44L/D247N/Q362K、R44L/K302Q、R44L/P337A、R44L/K373R、R217F/I322M、R217F/K373R、D247N/I322M、D247N/Q362K、K302Q/I322M/Q362K/K373R、K302Q/P337A、D316L、D316L/P337A、I322M、I322M/P337A、Q362K/K373R以及K373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。

在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10/39/44/47/92/166/206/217/247/261/271/302/316/322/337/362/368/373/392、44/217/316、44/217/322/337、166/362、217/373以及362/373，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10T/39M/44L/47S/92Y/166S/206K/217F/247N/261A/271H/302Q/316L/322M/337A/362K/368W/373R/392M、44L/217F/316L、44L/217F/322M/337A、166A/362K、217F/373R以及362K/373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/R217F/D247N/G261A/A271H/K302Q/D316L/I322M/P337A/Q362K/A368W/K373R/T392M、R44L/R217F/D316L、R44L/R217F/I322M/P337A、P166A/Q362K、R217F/K373R以及Q362K/K373R，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 8加以編號。

在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 57具有至少約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 57具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸編碼重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：7、7/48/68、7/48/68/120/282/299、7/48/130/282、7/48/180、7/68/130/282/365、7/68/180、7/88/120/305/365、7/120、7/130、7/282、7/305、7/305/365、7/365、39、47、47/87/95/96/158/162、47/95、47/273、47/343、48、48/68、48/180/282、48/282、48/282/305、67/180、68、68/299/300、71、87/91/95/96/158/162、87/91/95/96/206/343、87/96/155/273/343、88、91/95、91/95/96、92、93、96、96/273、96/312/343、120、120/299/305、151、158、158/162/273、162、162/273、162/343、166、178、180、181、206、217、271、273、273/343、282、282/365、293/391、299/300、299/300/305/365、300、301、305、305/365、314、333、336、337、343、345、363、365、370、389、393、394、396/398、397以及398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：7L、7L/48D/68E、7L/48D/68E/120H/282N/299R、7L/48D/130E/282N、7L/48D/180G、7L/68E/130E/282N/365V、7L/68E/180G、7L/88A/120H/305G/365V、7L/120H、7L/130E、7L/282N、7L/305G、7L/305G/365V、7L/365V、39V、47D、47D/87K/95E/96L/158R/162H、47D/95E、47D/273P、47D/343G、47V、48D、48D/68E、48D/180G/282N、48D/282N、48D/282N/305G、67T/180G、68E、68E/299R/300I、71P、87K/91Q/95E/96L/158A/162K、87K/91Q/95E/96L/206S/343G、87K/96I/155N/273P/343G、88A、91Q/95E、91Q/95E/96L、92F、92T、93I、96L、96L/273P、96L/312Q/343G、120H、120H/299R/305G、151L、158A、158A/162K/273G、158R、162H/343D、162K、162K/273P、162S、166K、178G、178S、180G、180L、180T、180V、181A、206K、206S、217K、271R、273P、273P/343G、282N、282N/365V、293P/391A、299R/300I、299R/300I/305G/365V、300I、301M、305G、305G/365V、314A、333F、333G、336V、337R、343D、343G、345A、345Q、363Q、365A、365Q、365V、370G、389K、393V、394K、396G/398T、397A、398A、398P、398S以及398V，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：R7L、R7L/E48D/Q68E、R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R、R7L/E48D/D130E/D282N、R7L/E48D/F180G、R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V、R7L/Q68E/F180G、R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V、R7L/Y120H、R7L/D130E、R7L/D282N、R7L/N305G、R7L/N305G/F365V、R7L/F365V、E39V、T47D、T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H、T47D/S95E、T47D/S273P、T47D/K343G、T47V、E48D、E48D/Q68E、E48D/F180G/D282N、E48D/D282N、E48D/D282N/N305G、P67T/F180G、Q68E、Q68E/Q299R/L300I、S71P、R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K、R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G、R87K/K96I/H155N/S273P/K343G、Q88A、N91Q/S95E、N91Q/S95E/K96L、H92F、H92T、V93I、K96L、K96L/S273P、K96L/P312Q/K343G、Y120H、Y120H/Q299R/N305G、D151L、L158A、L158A/R162K/S273G、L158R、R162H/K343D、R162K、R162K/S273P、R162S、P166K、W178G、W178S、F180G、F180L、F180T、F180V、Q181A、A206K、A206S、R217K、A271R、S273P、S273P/K343G、D282N、D282N/F365V、L293P/Q391A、Q299R/L300I、Q299R/L300I/N305G/F365V、L300I、R301M、N305G、N305G/F365V、S314A、S333F、S333G、I336V、P337R、K343D、K343G、V345A、V345Q、L363Q、F365A、F365Q、F365V、S370G、T389K、S393V、L394K、D396G/L398T、L397A、L398A、L398P、L398S以及L398V，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 58加以編號。

在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 157具有至少約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 157具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸編碼重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 158具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：24/202、39/47、39/47/217、39/151、39/282/337/398、39/337/343/398、39/393/398、47/130、47/151、47/343/345/393、48、48/68、48/68/217/333/391/393、48/68/333、48/217、48/333、48/345/393、48/393、59/143、68、68/345、130、130/158、130/158/393、130/345/393、143/271、143/333、143/387、151、151/158/217/343/345/393、151/206/282/337/343/345/398、151/282/393、151/345/393/398、151/393、158、158/393、202、206、206/217、217、217/333、217/337/345/398、271、282/393、333、333/345、337/343/345/398、343、343/345/393/398、393以及393/398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 158具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：24S/202N、39V/47D、39V/47V/217K、39V/151L、39V/282N/337R/398A、39V/337R/343G/398A、39V/393V/398A、47V/130E、47V/151L、47V/343D/345Q/393V、48D、48D/68E、48D/68E/217K/333F/391A/393V、48D/68E/333F、48D/217K、48D/333F、48D/333G、48D/345Q/393V、48D/393V、59A/143S、68E、68E/345Q、130E、130E/158R、130E/158R/393V、130E/345Q/393V、143S/271N、143S/333N、143S/387N、151L、151L/158R/217K/343G/345Q/393V、151L/206S/282N/337R/343D/345Q/398A、151L/282N/393V、151L/345Q/393V/398A、151L/393V、158R、158R/393V、202N、206S、206S/217K、217K、217K/333F、217K/333G、217K/337R/345Q/398A、271N、282N/393V、333F/345Q、333G、333N、337R/343G/345Q/398A、343D、343D/345Q/393V/398A、393V以及393V/398A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：D24S/D202N、E39V/T47D、E39V/T47V/R217K、E39V/D151L、E39V/D282N/P337R/L398A、E39V/P337R/K343G/L398A、E39V/S393V/L398A、T47V/D130E、T47V/D151L、T47V/K343D/V345Q/S393V、E48D、E48D/Q68E、E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V、E48D/Q68E/S333F、E48D/R217K、E48D/S333F、E48D/S333G、E48D/V345Q/S393V、E48D/S393V、C59A/C143S、Q68E、Q68E/V345Q、D130E、D130E/L158R、D130E/L158R/S393V、D130E/V345Q/S393V、C143S/A271N、C143S/S333N、C143S/E387N、D151L、D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V、D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/L398A、D151L/D282N/S393V、D151L/V345Q/S393V/L398A、D151L/S393V、L158R、L158R/S393V、D202N、A206S、A206S/R217K、R217K、R217K/S333F、R217K/S333G、R217K/P337R/V345Q/L398A、A271N、D282N/S393V、S333F/V345Q、S333G、S333N、P337R/K343G/V345Q/L398A、K343D、K343D/V345Q/S393V/L398A、S393V以及S393V/L398A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 158加以編號。

在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 371具有至少約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 371具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸編碼重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 372具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、10/39/44/322、10/39/92/206/217/271、10/39/92/247、10/39/92/247/271/316、10/44、10/44/47/92/247、10/44/47/261/302/322/368、10/44/92/316/322、10/44/261/302/316、10/44/302/337/368、10/47/217/247/316/392、10/47/217/322、10/47/271、10/92、10/92/206/217/247、10/92/206/247/316/322/392、10/92/206/247/322/368、10/92/217/261/302/337、10/206/217/271、10/206/247、10/206/261/271/316、10/261、10/271/302、10/302、10/302/316、10/302/322/337、10/316/322、10/337/392、10/368、39/44/92/162/247/302/316/322、39/44/92/217/322、39/44/92/247/271/302、39/47/92/247/302/316/322、39/47/217/247/368、39/47/247、39/92/247/302/316/337/368、39/92/316/322、39/247/271、39/247/271/316、39/322、44/47/92/206/217/316/322、44/47/92/247/261/271/316/337/368、44/47/206/217/247/271/322、44/47/247/322/368、44/47/302/316/322、44/92/206/247/368、44/206/337、44/247/261/302/316、44/247/261/302/316/322、47/92/247/271、47/217/302、47/247、47/247/271、89/217/247/261/302/316、92/217/271、92/247、92/247/271/322、92/247/302/322/337、92/271/337、92/302、92/316、206/217/271/392、217/247/316/322/337/368、247、247/271、247/302、271、271/302/322、271/316/322、302/322/368以及368，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 372加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 372具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10P、10P/39E/44R/322I、10P/39E/92H/206A/217R/271A、10P/39E/92H/247D、10P/39E/92H/247D/271A/316D、10P/44R、10P/44R/47T/92H/247D、10P/44R/47T/261G/302K/322I/368A、10P/44R/92H/316D/322I、10P/44R/261G/302K/316D、10P/44R/302K/337P/368A、10P/47T/217R/247D/316D/392T、10P/47T/217R/322I、10P/47T/271A、10P/92H、10P/92H/206A/217R/247D、10P/92H/206A/247D/316D/322I/392T、10P/92H/206A/247D/322I/368A、10P/92H/217R/261G/302K/337P、10P/206A/217R/271A、10P/206A/247D、10P/206A/261G/271A/316D、10P/261G、10P/271A/302K、10P/302K、10P/302K/316D、10P/302K/322I/337P、10P/316D/322I、10P/337P/392T、10P/368A、39E/44R/92H/162M/247D/302K/316D/322I、39E/44R/92H/217R/322I、39E/44R/92H/247D/271A/302K、39E/47T/92H/247D/302K/316D/322I、39E/47T/217R/247D/368A、39E/47T/247D、39E/92H/247D/302K/316D/337P/368A、39E/92H/316D/322I、39E/247D/271A、39E/247D/271A/316D、39E/322I、44R/47T/92H/206A/217R/316D/322I、44R/47T/92H/247D/261G/271A/316D/337P/368A、44R/47T/206A/217R/247D/271A/322I、44R/47T/247D/322I/368A、44R/47T/302K/316D/322I、44R/92H/206A/247D/368A、44R/206A/337P、44R/247D/261G/302K/316D、44R/247D/261G/302K/316D/322I、47T/92H/247D/271A、47T/217R/302K、47T/247D、47T/247D/271A、89I/217R/247D/261G/302K/316D、92H/217R/271A、92H/247D、92H/247D/271A/322I、92H/247D/302K/322I/337P、92H/271A/337P、92H/302K、92H/316D、206A/217R/271A/392T、217R/247D/316D/322I/337P/368A、247D、247D/271A、247D/302K、271A、271A/302K/322I、271A/316D/322I、302K/322I/368A以及368A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 372加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 372具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：T10P、T10P/M39E/L44R/M322I、T10P/M39E/Y92H/K206A/F217R/H271A、T10P/M39E/Y92H/N247D、T10P/M39E/Y92H/N247D/H271A/L316D、T10P/L44R、T10P/L44R/S47T/Y92H/N247D、T10P/L44R/S47T/A261G/Q302K/M322I/W368A、T10P/L44R/Y92H/L316D/M322I、T10P/L44R/A261G/Q302K/L316D、T10P/L44R/Q302K/A337P/W368A、T10P/S47T/F217R/N247D/L316D/M392T、T10P/S47T/F217R/M322I、T10P/S47T/H271A、T10P/Y92H、T10P/Y92H/K206A/F217R/N247D、T10P/Y92H/K206A/N247D/L316D/M322I/M392T、T10P/Y92H/K206A/N247D/M322I/W368A、T10P/Y92H/F217R/A261G/Q302K/A337P、T10P/K206A/F217R/H271A、T10P/K206A/N247D、T10P/K206A/A261G/H271A/L316D、T10P/A261G、T10P/H271A/Q302K、T10P/Q302K、T10P/Q302K/L316D、T10P/Q302K/M322I/A337P、T10P/L316D/M322I、T10P/A337P/M392T、T10P/W368A、M39E/L44R/Y92H/R162M/N247D/Q302K/L316D/M322I、M39E/L44R/Y92H/F217R/M322I、M39E/L44R/Y92H/N247D/H271A/Q302K、M39E/S47T/Y92H/N247D/Q302K/L316D/M322I、M39E/S47T/F217R/N247D/W368A、M39E/S47T/N247D、M39E/Y92H/N247D/Q302K/L316D/A337P/W368A、M39E/Y92H/L316D/M322I、M39E/N247D/H271A、M39E/N247D/H271A/L316D、M39E/M322I、L44R/S47T/Y92H/K206A/F217R/L316D/M322I、L44R/S47T/Y92H/N247D/A261G/H271A/L316D/A337P/W368A、L44R/S47T/K206A/F217R/N247D/H271A/M322I、L44R/S47T/N247D/M322I/W368A、L44R/S47T/Q302K/L316D/M322I、L44R/Y92H/K206A/N247D/W368A、L44R/K206A/A337P、L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D、L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D/M322I、S47T/Y92H/N247D/H271A、S47T/F217R/Q302K、S47T/N247D、S47T/N247D/H271A、L89I/F217R/N247D/A261G/Q302K/L316D、Y92H/F217R/H271A、Y92H/N247D、Y92H/N247D/H271A/M322I、Y92H/N247D/Q302K/M322I/A337P、Y92H/H271A/A337P、Y92H/Q302K、Y92H/L316D、K206A/F217R/H271A/M392T、F217R/N247D/L316D/M322I/A337P/W368A、N247D、N247D/H271A、N247D/Q302K、H271A、H271A/Q302K/M322I、H271A/L316D/M322I、Q302K/M322I/W368A以及W368A，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 372加以編號。

在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 373具有至少約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 373具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之重組多核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸編碼重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10/36/92/166/247/261/316/392、10/39、10/39/44/47/92/206/217、10/39/44/47/316、10/39/44/47/337、10/39/44/92/166/261/316/322、10/39/44/92/166/302/322、10/39/44/92/166/392、10/39/44/92/217/302/322、10/39/44/92/302/322、10/39/44/166/261/271/316/322、10/39/44/392、10/39/47/92/337、10/39/92/131/166/271/316/322、10/39/92/166/217/247/271、10/39/92/217/316、10/44/47/166/261/271、10/44/47/166/271/322/368、10/44/47/217/271/316/322、10/44/92、10/44/92/217/247/271/302/316/392、10/44/166/302、10/44/206/316/322、10/47/92/166/271/316/337、10/47/92/271/302、10/47/92/316/322/392、10/47/166/271、10/47/166/316、10/92/166、10/92/166/217/247/261/271、10/92/166/261/271/392、10/92/166/261/316/322/337、10/92/166/337/368、10/92/302/337、10/92/316/322、10/206、10/206/247/261、10/217/322、10/261、10/261/337/392、10/316/392、10/368、39/44/47/92/166/206/392、39/44/47/92/206/247/261、39/44/47/92/206/392、39/44/47/206/337/368/392、39/44/92/166/247/261/302/337、39/44/166/271、39/44/166/271/337/368/392、39/47/92/316/322、39/47/92/392、39/47/166/217/261/392、39/47/217/247/368、39/47/247、39/92/166/217/392、39/92/261/302、39/166/217/261/316/368、39/322、39/392、44/47、44/47/92/217/271、44/47/92/217/316/322/392、44/47/92/392、44/47/166、44/47/166/271、44/47/247/271/392、44/316/322/392、44/337、47/166/206/217/247/337、47/166/217/271/337、47/206、47/217/247/261、47/271、52/217/302/316、92/166/206/271/316、92/166/217/261/271/392、92/166/217/316/337/392、92/166/247、92/166/316、92/206/322、92/217、92/217/271/337、92/261/271、92/271、166/217/316/322/337、166/247/271/316、166/316/322/337、206/217、217/392、247/316、316/322/368以及316/337/392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10T/36M/92Y/166S/247N/261A/316L/392M、10T/39M、10T/39M/44L/47S/92Y/206K/217F、10T/39M/44L/47S/316L、10T/39M/44L/47S/337A、10T/39M/44L/92Y/166S/261A/316L/322M、10T/39M/44L/92Y/166S/302Q/322M、10T/39M/44L/92Y/166S/392M、10T/39M/44L/92Y/217F/302Q/322M、10T/39M/44L/92Y/302Q/322M、10T/39M/44L/166S/261A/271H/316L/322M、10T/39M/44L/392M、10T/39M/47S/92Y/337A、10T/39M/92Y/131G/166S/271H/316L/322M、10T/39M/92Y/166S/217F/247N/271H、10T/39M/92Y/217F/316L、10T/44L/47S/166S/261A/271H、10T/44L/47S/166S/271H/322M/368W、10T/44L/47S/217F/271H/316L/322M、10T/44L/92Y、10T/44L/92Y/217F/247N/271H/302Q/316L/392M、10T/44L/166S/302Q、10T/44L/206K/316L/322M、10T/47S/92Y/166S/271H/316L/337A、10T/47S/92Y/271H/302Q、10T/47S/92Y/316L/322M/392M、10T/47S/166S/271H、10T/47S/166S/316L、10T/92Y/166S、10T/92Y/166S/217F/247N/261A/271H、10T/92Y/166S/261A/271H/392M、10T/92Y/166S/261A/316L/322M/337A、10T/92Y/166S/337A/368W、10T/92Y/302Q/337A、10T/92Y/316L/322M、10T/206K、10T/206K/247N/261A、10T/217F/322M、10T/261A、10T/261A/337A/392M、10T/316L/392M、10T/368W、39M/44L/47S/92Y/166S/206K/392M、39M/44L/47S/92Y/206K/247N/261A、39M/44L/47S/92Y/206K/392M、39M/44L/47S/206K/337A/368W/392M、39M/44L/92Y/166S/247N/261A/302Q/337A、39M/44L/166S/271H、39M/44L/166S/271H/337A/368W/392M、39M/47S/92Y/316L/322M、39M/47S/92Y/392M、39M/47S/166S/217F/261A/392M、39M/47S/217F/247N/368W、39M/47S/247N、39M/92Y/166S/217F/392M、39M/92Y/261A/302Q、39M/166S/217F/261A/316L/368W、39M/322M、39M/392M、44L/47S、44L/47S/92Y/217F/271H、44L/47S/92Y/217F/316L/322M/392M、44L/47S/92Y/392M、44L/47S/166S、44L/47S/166S/271H、44L/47S/247N/271H/392M、44L/316L/322M/392M、44L/337A、47S/166S/206K/217F/247N/337A、47S/166S/217F/271H/337A、47S/206K、47S/217F/247N/261A、47S/271H、52N/217F/302Q/316L、92Y/166S/206K/271H/316L、92Y/166S/217F/261A/271H/392M、92Y/166S/217F/316L/337A/392M、92Y/166S/247N、92Y/166S/316L、92Y/206K/322M、92Y/217F、92Y/217F/271H/337A、92Y/261A/271H、92Y/271H、166S/217F/316L/322M/337A、166S/247N/271H/316L、166S/316L/322M/337A、206K/217F、217F/392M、247N/316L、316L/322M/368W以及316L/337A/392M，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10T/K36M/H92Y/P166S/D247N/G261A/D316L/T392M、P10T/E39M、P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/R217F、P10T/E39M/R44L/T47S/D316L、P10T/E39M/R44L/T47S/P337A、P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M、P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/K302Q/I322M、P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/T392M、P10T/E39M/R44L/H92Y/R217F/K302Q/I322M、P10T/E39M/R44L/H92Y/K302Q/I322M、P10T/E39M/R44L/P166S/G261A/A271H/D316L/I322M、P10T/E39M/R44L/T392M、P10T/E39M/T47S/H92Y/P337A、P10T/E39M/H92Y/W131G/P166S/A271H/D316L/I322M、P10T/E39M/H92Y/P166S/R217F/D247N/A271H、P10T/E39M/H92Y/R217F/D316L、P10T/R44L/T47S/P166S/G261A/A271H、P10T/R44L/T47S/P166S/A271H/I322M/A368W、P10T/R44L/T47S/R217F/A271H/D316L/I322M、P10T/R44L/H92Y、P10T/R44L/H92Y/R217F/D247N/A271H/K302Q/D316L/T392M、P10T/R44L/P166S/K302Q、P10T/R44L/A206K/D316L/I322M、P10T/T47S/H92Y/P166S/A271H/D316L/P337A、P10T/T47S/H92Y/A271H/K302Q、P10T/T47S/H92Y/D316L/I322M/T392M、P10T/T47S/P166S/A271H、P10T/T47S/P166S/D316L、P10T/H92Y/P166S、P10T/H92Y/P166S/R217F/D247N/G261A/A271H、P10T/H92Y/P166S/G261A/A271H/T392M、P10T/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M/P337A、P10T/H92Y/P166S/P337A/A368W、P10T/H92Y/K302Q/P337A、P10T/H92Y/D316L/I322M、P10T/A206K、P10T/A206K/D247N/G261A、P10T/R217F/I322M、P10T/G261A、P10T/G261A/P337A/T392M、P10T/D316L/T392M、P10T/A368W、E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/T392M、E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/D247N/G261A、E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/T392M、E39M/R44L/T47S/A206K/P337A/A368W/T392M、E39M/R44L/H92Y/P166S/D247N/G261A/K302Q/P337A、E39M/R44L/P166S/A271H、E39M/R44L/P166S/A271H/P337A/A368W/T392M、E39M/T47S/H92Y/D316L/I322M、E39M/T47S/H92Y/T392M、E39M/T47S/P166S/R217F/G261A/T392M、E39M/T47S/R217F/D247N/A368W、E39M/T47S/D247N、E39M/H92Y/P166S/R217F/T392M、E39M/H92Y/G261A/K302Q、E39M/P166S/R217F/G261A/D316L/A368W、E39M/I322M、E39M/T392M、R44L/T47S、R44L/T47S/H92Y/R217F/A271H、R44L/T47S/H92Y/R217F/D316L/I322M/T392M、R44L/T47S/H92Y/T392M、R44L/T47S/P166S、R44L/T47S/P166S/A271H、R44L/T47S/D247N/A271H/T392M、R44L/D316L/I322M/T392M、R44L/P337A、T47S/P166S/A206K/R217F/D247N/P337A、T47S/P166S/R217F/A271H/P337A、T47S/A206K、T47S/R217F/D247N/G261A、T47S/A271H、D52N/R217F/K302Q/D316L、H92Y/P166S/A206K/A271H/D316L、H92Y/P166S/R217F/G261A/A271H/T392M、H92Y/P166S/R217F/D316L/P337A/T392M、H92Y/P166S/D247N、H92Y/P166S/D316L、H92Y/A206K/I322M、H92Y/R217F、H92Y/R217F/A271H/P337A、H92Y/G261A/A271H、H92Y/A271H、P166S/R217F/D316L/I322M/P337A、P166S/D247N/A271H/D316L、P166S/D316L/I322M/P337A、A206K/R217F、R217F/T392M、D247N/D316L、D316L/I322M/A368W以及D316L/P337A/T392M，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。

在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 704具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：2、4、5、24/59、24/143/144、24/143/202/333、24/143/202/352/390/391、24/143/333/352/387/390/391、24/143/390/391、24/202、24/202/271、24/202/333/352、24/271/352、24/352/387/390/391、24/387/391、31、40、59、59/143、59/143/202、59/143/202/271/333、59/143/271、59/143/333、59/202、59/202/333、59/271/387/390、73、76、80、83、84、91/215/361、122、123、143、143/202、143/271、143/271/352/390、143/333、143/333/387/390、143/387/391、147、155、164、165、179、186、202、202/333、210、215/218、218、218/361、218/361/398、218/398、246、254/398、271、271/333、271/333/390/391、271/333/391、271/352/391、273、275、277、278、280、281、283、284、287、300、303、304、325、331、332、333/352、333/390/391、333/391、334、335、336、338、339、340、341、343、359、360、361、362、367、369、371、373、375、377、382、382/398、385、387/391、390以及398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 704加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 704具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：2S、4L、5M、5V、24S/59A、24S/143S/144N、24S/143S/202N/333N、24S/143S/202N/352N/390N/391N、24S/143S/333N/352N/387N/390T/391N、24S/143S/390T/391N、24S/202N、24S/202N/271N、24S/202N/333N/352N、24S/271N/352N、24S/352N/387N/390N/391N、24S/387N/391N、31F、31H、31L、31T、31W、40Q、59A、59A/143S、59A/143S/271N、59A/202N、59T、59T/143S/202N、59T/143S/333N、59T/202N/333N、59V/143S/202N/271N/333N、59V/271N/387N/390T、73A、76A、76F、76M、76S、80T、83R、83S、84G、84K、84R、91S/215S/361T、122E、122N、122S、123Q、123R、123S、123T、143S、143S/202N、143S/271N、143S/271N/352N/390N、143S/333N、143S/333N/387N/390T、143S/387N/391N、147L、147S、155A、155D、155F、155L、155R、155T、164E、165I、179H、179L、179R、179W、186E、186F、186M、186P、186R、186S、186Y、202N、202N/333N、210I、215S/218Y、218Y、218Y/361T、218Y/361T/398F、218Y/398F、246Y、254T/398F、271N、271N/333N、271N/333N/390N/391N、271N/333N/391N、271N/352N/391N、273L、275A、275G、277Q、277V、278N、278R、278S、280G、281I、281M、283L、283P、283T、283V、284A、284E、284G、284L、284M、284R、284S、287R、300F、303A、303C、303W、304T、304V、304W、325A、331M、332G、332H、333N/352N、333N/390N/391N、333N/390S/391N、333N/391N、334C、334V、335A、335L、336F、336G、336S、336T、338L、339G、339N、339Q、339V、340H、340I、340K、340M、340P、340W、341F、341M、343L、343R、343S、343W、359F、359L、359R、360H、360V、361T、361V、362H、367A、367D、367L、367M、369D、371G、373L、373S、375L、375Q、377Q、382I、382I/398F、385R、387N/391N、390S以及398F，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 704加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 704具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：D2S、G4L、L5M、L5V、D24S/C59A、D24S/C143S/D144N、D24S/C143S/D202N/G333N、D24S/C143S/D202N/F352N/M390N/Q391N、D24S/C143S/G333N/F352N/E387N/M390T/Q391N、D24S/C143S/M390T/Q391N、D24S/D202N、D24S/D202N/A271N、D24S/D202N/G333N/F352N、D24S/A271N/F352N、D24S/F352N/E387N/M390N/Q391N、D24S/E387N/Q391N、S31F、S31H、S31L、S31T、S31W、E40Q、C59A、C59A/C143S、C59A/C143S/A271N、C59A/D202N、C59T、C59T/C143S/D202N、C59T/C143S/G333N、C59T/D202N/G333N、C59V/C143S/D202N/A271N/G333N、C59V/A271N/E387N/M390T、G73A、Q76A、Q76F、Q76M、Q76S、Q80T、P83R、P83S、H84G、H84K、H84R、N91S/T215S/R361T、D122E、D122N、D122S、I123Q、I123R、I123S、I123T、C143S、C143S/D202N、C143S/A271N、C143S/A271N/F352N/M390N、C143S/G333N、C143S/G333N/E387N/M390T、C143S/E387N/Q391N、E147L、E147S、H155A、H155D、H155F、H155L、H155R、H155T、G164E、R165I、P179H、P179L、P179R、P179W、T186E、T186F、T186M、T186P、T186R、T186S、T186Y、D202N、D202N/G333N、S210I、T215S/N218Y、N218Y、N218Y/R361T、N218Y/R361T/L398F、N218Y/L398F、W246Y、A254T/L398F、A271N、A271N/G333N、A271N/G333N/M390N/Q391N、A271N/G333N/Q391N、A271N/F352N/Q391N、S273L、Q275A、Q275G、K277Q、K277V、A278N、A278R、A278S、L280G、Q281I、Q281M、K283L、K283P、K283T、K283V、D284A、D284E、D284G、D284L、D284M、D284R、D284S、A287R、L300F、G303A、G303C、G303W、D304T、D304V、D304W、R325A、P331M、R332G、R332H、G333N/F352N、G333N/M390N/Q391N、G333N/M390S/Q391N、G333N/Q391N、Y334C、Y334V、T335A、T335L、I336F、I336G、I336S、I336T、V338L、A339G、A339N、A339Q、A339V、S340H、S340I、S340K、S340M、S340P、S340W、L341F、L341M、K343L、K343R、K343S、K343W、V359F、V359L、V359R、K360H、K360V、R361T、R361V、K362H、E367A、E367D、E367L、E367M、T369D、R371G、R373L、R373S、H375L、H375Q、N377Q、V382I、V382I/L398F、Q385R、E387N/Q391N、M390S以及L398F，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 704加以編號。

在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、39、44、47、92、166、206、217、247、261、271、302、316、322、337、368以及392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10A、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I、10K、10L、10M、10N、10Q、10R、10S、10T、10V、10W、10Y、39A、39C、39D、39F、39G、39H、39I、39K、39L、39M、39N、39P、39Q、39R、39S、39T、39V、39W、39Y、44A、44C、44D、44E、44F、44G、44H、44I、44K、44L、44N、44P、44Q、44S、44T、44V、44W、44Y、47A、47C、47D、47E、47F、47G、47H、47I、47K、47L、47M、47N、47P、47Q、47R、47S、47V、47W、47Y、92A、92C、92D、92E、92F、92G、92I、92K、92L、92M、92N、92P、92Q、92R、92S、92T、92V、92W、92Y、166A、166C、166D、166E、166F、166G、166H、166I、166K、166L、166M、166N、166Q、166R、166S、166T、166V、166W、166Y、206C、206D、206E、206F、206G、206H、206I、206K、206L、206M、206N、206P、206Q、206R、206S、206T、206V、206W、206Y、217A、217C、217D、217E、217F、217G、217H、217I、217K、217L、217M、217N、217P、217Q、217S、217T、217V、217W、217Y、247A、247C、247E、247F、247G、247H、247I、247K、247L、247M、247N、247P、247Q、247R、247S、247T、247V、247W、247Y、261A、261C、261D、261E、261F、261H、261I、261K、261L、261M、261N、261P、261Q、261R、261S、261T、261V、261W、261Y、271C、271D、271E、271F、271G、271H、271I、271K、271L、271M、271N、271P、271Q、271R、271S、271T、271V、271W、271Y、302A、302C、302D、302E、302F、302G、302H、302I、302L、302M、302N、302P、302Q、302R、302S、302T、302V、302W、302Y、316A、316C、316E、316F、316G、316H、316I、316K、316L、316M、316N、316P、316Q、316R、316S、316T、316V、316W、316Y、322A、322C、322D、322E、322F、322G、322H、322K、322L、322M、322N、322P、322Q、322R、322S、322T、322V、322W、322Y、337A、337C、337D、337E、337F、337G、337H、337I、337K、337L、337M、337N、337Q、337R、337S、337T、337V、337W、337Y、368C、368D、368E、368F、368G、368H、368I、368K、368L、368M、368N、368P、368Q、368R、368S、368T、368V、368W、368Y、392A、392C、392D、392E、392F、392G、392H、392I、392K、392L、392M、392N、392P、392Q、392R、392S、392V、392W以及392Y，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 374具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10A、P10C、P10D、P10E、P10F、P10G、P10H、P10I、P10K、P10L、P10M、P10N、P10Q、P10R、P10S、P10T、P10V、P10W、P10Y、E39A、E39C、E39D、E39F、E39G、E39H、E39I、E39K、E39L、E39M、E39N、E39P、E39Q、E39R、E39S、E39T、E39V、E39W、E39Y、R44A、R44C、R44D、R44E、R44F、R44G、R44H、R44I、R44K、R44L、R44N、R44P、R44Q、R44S、R44T、R44V、R44W、R44Y、T47A、T47C、T47D、T47E、T47F、T47G、T47H、T47I、T47K、T47L、T47M、T47N、T47P、T47Q、T47R、T47S、T47V、T47W、T47Y、H92A、H92C、H92D、H92E、H92F、H92G、H92I、H92K、H92L、H92M、H92N、H92P、H92Q、H92R、H92S、H92T、H92V、H92W、H92Y、P166A、P166C、P166D、P166E、P166F、P166G、P166H、P166I、P166K、P166L、P166M、P166N、P166Q、P166R、P166S、P166T、P166V、P166W、P166Y、A206C、A206D、A206E、A206F、A206G、A206H、A206I、A206K、A206L、A206M、A206N、A206P、A206Q、A206R、A206S、A206T、A206V、A206W、A206Y、R217A、R217C、R217D、R217E、R217F、R217G、R217H、R217I、R217K、R217L、R217M、R217N、R217P、R217Q、R217S、R217T、R217V、R217W、R217Y、D247A、D247C、D247E、D247F、D247G、D247H、D247I、D247K、D247L、D247M、D247N、D247P、D247Q、D247R、D247S、D247T、D247V、D247W、D247Y、G261A、G261C、G261D、G261E、G261F、G261H、G261I、G261K、G261L、G261M、G261N、G261P、G261Q、G261R、G261S、G261T、G261V、G261W、G261Y、A271C、A271D、A271E、A271F、A271G、A271H、A271I、A271K、A271L、A271M、A271N、A271P、A271Q、A271R、A271S、A271T、A271V、A271W、A271Y、K302A、K302C、K302D、K302E、K302F、K302G、K302H、K302I、K302L、K302M、K302N、K302P、K302Q、K302R、K302S、K302T、K302V、K302W、K302Y、D316A、D316C、D316E、D316F、D316G、D316H、D316I、D316K、D316L、D316M、D316N、D316P、D316Q、D316R、D316S、D316T、D316V、D316W、D316Y、I322A、I322C、I322D、I322E、I322F、I322G、I322H、I322K、I322L、I322M、I322N、I322P、I322Q、I322R、I322S、I322T、I322V、I322W、I322Y、P337A、P337C、P337D、P337E、P337F、P337G、P337H、P337I、P337K、P337L、P337M、P337N、P337Q、P337R、P337S、P337T、P337V、P337W、P337Y、A368C、A368D、A368E、A368F、A368G、A368H、A368I、A368K、A368L、A368M、A368N、A368P、A368Q、A368R、A368S、A368T、A368V、A368W、A368Y、T392A、T392C、T392D、T392E、T392F、T392G、T392H、T392I、T392K、T392L、T392M、T392N、T392P、T392Q、T392R、T392S、T392V、T392W以及T392Y，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。

在一些實施例中，多核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 1022具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段的重組α半乳糖苷酶A，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、10/392、31、31/39/44/166/302、31/47、31/283/284、39、39/44、39/44/47、39/44/47/261/283/284、39/44/283、39/44/339、39/47/261、39/92、39/206、39/284、44、44/284/302、84、84/92、84/284/302/392、84/316、84/368/392、92、92/206/217、92/206/275、92/206/284、92/206/302/368、92/271、92/271/277、92/275/284、92/283、92/283/392、92/284、92/302、92/316、92/368、155、155/217、155/368、166、166/283/284、166/302、206、206/217、206/334、261、261/283、271、271/368、275、283、283/284、283/392、284、302、316、334、339、368、368/392以及392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 1022加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 1022具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：P10G、P10G/T392D、S31T、S31T/E39V/R44V/P166D/K302Y、S31T/T47R、S31T/K283L/D284A、E39L、E39L/H92V、E39L/A206E、E39L/D284S、E39V/R44V、E39V/R44V/T47R、E39V/R44V/T47R/G261S/K283L/D284A、E39V/R44V/K283T、E39V/R44V/A339N、E39V/T47R/G261S、R44V、R44V/D284E/K302Y、H84K、H84K/H92V、H84K/D284S/K302L/T392A、H84K/D316H、H84K/A368E/T392A、H92Q、H92T、H92T/A206E/R217N、H92T/A206E/K302T/A368E、H92T/A271K、H92T/A271K/K277R、H92T/K283P、H92T/K283V/T392W、H92T/D284M、H92T/K302L、H92T/A368E、H92V、H92V/A206E/D284S、H92V/A206Y/Q275A、H92V/Q275A/D284S、H92V/D284S、H92V/K302L、H92V/D316H、H155F、H155F/R217I、H155F/A368E、P166D、P166D/K283L/D284A、P166D/K302Y、A206E、A206E/R217N、A206I、A206Q、A206T/Y334C、A206Y、G261S、G261S/K283L、A271K、A271K/A368E、Q275A、K283L、K283P/T392W、K283T、K283T/D284E、D284E、D284M、D284S、K302L、K302Y、D316H、Y334C、A339N、A368E、A368E/T392W、T392A、T392D以及T392W，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 1022加以編號。在一些實施例中，重組α半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 1022具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之多肽序列或其功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10G、10G/392D、31T、31T/39V/44V/166D/302Y、31T/47R、31T/283L/284A、39L、39L/92V、39L/206E、39L/284S、39V/44V、39V/44V/47R、39V/44V/47R/261S/283L/284A、39V/44V/283T、39V/44V/339N、39V/47R/261S、44V、44V/284E/302Y、84K、84K/92V、84K/284S/302L/392A、84K/316H、84K/368E/392A、92Q、92T、92T/206E/217N、92T/206E/302T/368E、92T/271K、92T/271K/277R、92T/283P、92T/283V/392W、92T/284M、92T/302L、92T/368E、92V、92V/206E/284S、92V/206Y/275A、92V/275A/284S、92V/284S、92V/302L、92V/316H、155F、155F/217I、155F/368E、166D、166D/283L/284A、166D/302Y、206E、206E/217N、206I、206Q、206T/334C、206Y、261S、261S/283L、271K、271K/368E、275A、283L、283P/392W、283T、283T/284E、284E、284M、284S、302L、302Y、316H、334C、339N、368E、368E/392W、392A、392D以及392W，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 1022加以編號。

在一些實施例中，如上文所描述，多核苷酸編碼具有GLA活性及本文所揭露之特性的經工程處理之多肽，其中多肽包含與參考序列(例如SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704以及1022)具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列或如本文中各表中之任一者中所揭露之任何變異體的胺基酸序列，且包含相較於具有SEQ ID NO: 8之參考多肽或如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中所揭露之任何變異體之胺基酸序列而言的一或多個殘基差異(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸殘基位置)。在一些實施例中，多核苷酸編碼具有GLA活性及本文所揭露之特性的經工程處理之多肽，其中多肽包含與參考序列SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列，且當與具有SEQ ID NO: 8、58、158、372、374、704及/或1022之多肽進行最佳比對時在選自表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中所提供之殘基位置的殘基位置處包含相較於SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022而言的一或多個殘基差異。

在一些實施例中，編碼經工程處理之GLA多肽之多核苷酸包含SEQ ID NO: 8、58、158、372、374、704及/或1022之多核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸能夠在高度嚴格條件下雜交至參考多核苷酸序列。在一些實施例中，參考序列係選自SEQ ID NO: 1、7、57、157、275、371、373及/或1019或其互補序列或編碼本文所提供之變異GLA多肽中之任一者的多核苷酸序列。在一些實施例中，能夠在高度嚴格條件下進行雜交之多核苷酸編碼包含在選自如表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中所闡述之任何位置之殘基位置處具有相較於SEQ ID NO: 2、8、58、158、372、374、704及/或1022而言之一或多個殘基差異的胺基酸序列的GLA多肽。

在一些實施例中，編碼本文所提供之經工程處理之GLA多肽中之任一者的經分離多核苷酸係以各種方式經操縱以提供多肽表現。在一些實施例中，編碼多肽之多核苷酸係以表現載體形式提供，其中一或多個控制序列係存在以調節多核苷酸及/或多肽之表現。經分離多核苷酸在其插入載體中之前的操縱可視表現載體而為合乎需要或必需的。利用重組DNA方法修飾多核苷酸以及核酸序列之技術為此項技術中眾所周知的。

在一些實施例中，除其他序列以外，控制序列亦包括啟動子、Kozak序列、前導序列、多腺苷酸化序列、原肽序列、信號肽序列、用於基因療法保持之以DNA為主之調節元件以及轉錄終止子。如此項技術中已知，合適啟動子可基於所用宿主細胞來加以選擇。例示性用於絲狀真菌宿主細胞之啟動子包括自用於米麴菌(Aspergillus oryzae ) TAKA澱粉酶、米黑根毛黴(Rhizomucor miehei )天冬胺酸蛋白酶、黑麴菌(Aspergillus niger )中性α-澱粉酶、黑麴菌酸性穩定α-澱粉酶、黑麴菌或泡盛麴菌(Aspergillus awamori )葡萄糖澱粉酶(glaA)、米黑根毛黴脂肪酶、米麴菌鹼性蛋白酶、米麴菌丙醣磷酸異構酶、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans )乙醯胺酶以及錘形黴菌(Fusarium oxysporum )胰蛋白酶樣蛋白酶之基因獲得之啟動子(參見例如WO 96/00787)以及NA2-tpi啟動子(來自用於黑麴菌中性α-澱粉酶以及米麴菌丙醣磷酸異構酶之基因之啟動子雜交體)以及其突變、經截短及雜交啟動子。例示性酵母菌細胞啟動子可來自用於以下之基因可來自用於以下之基因：釀酒酵母菌烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母菌半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母菌醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH2/GAP)以及釀酒酵母菌3-磷酸甘油酯激酶。其他可用於酵母菌宿主細胞之啟動子為此項技術中已知的(參見例如Romanos等人, Yeast 8:423-488 [1992])。例示性用於哺乳動物細胞中之啟動子包括但不限於來自巨細胞病毒(CMV)之啟動子、與CMV強化子融合之雞β-肌動蛋白啟動子、來自猴空泡病毒40 (SV40)之啟動子、來自智人磷酸甘油酯激酶、β肌動蛋白、伸長因子-1a或甘油醛-3-磷酸去氫酶之啟動子或來自雞(Gallus gallus ) β-肌動蛋白之啟動子。

在一些實施例中，控制序列為合適轉錄終止序列，該合適轉錄終止序列為由宿主細胞辨識之用於終止轉錄之序列。終止序列可操作地連接至編碼多肽之核酸序列之3'端。在所選宿主細胞中具有功能之任何終止子均可用於本發明中。舉例而言，例示性用於絲狀真菌宿主細胞之轉錄終止子可自用於以下之基因獲得：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、小巢狀麴菌鄰胺基苯甲酸合成酶、黑麴菌α-葡萄糖苷酶以及錘形黴菌胰蛋白酶樣蛋白酶。例示性用於酵母菌宿主細胞之終止子可自用於以下之基因獲得：釀酒酵母菌烯醇酶、釀酒酵母菌細胞色素C (CYC1)以及釀酒酵母菌甘油醛-3-磷酸去氫酶。其他可用於酵母菌宿主細胞之終止子為此項技術中已知的(參見例如Romanos等人，同前文獻)。例示性用於哺乳動物細胞之終止子包括但不限於來自巨細胞病毒(CMV)之終止子、來自猴空泡病毒40 (SV40)之終止子、來自智人生長激素hGH之終止子、來自牛生長激素BGH之終止子以及來自人類或兔β球蛋白之終止子。

在一些實施例中，控制序列為合適前導序列，亦即5'-帽修飾、5' UTR等。在一些實施例中，此等調節序列元件介導與參與mRNA運輸及轉譯之分子之結合，抑制5'-核酸外切降解且賦予抗去帽性。前導序列可操作地連接至編碼多肽之核酸序列之5'端。在所選宿主細胞中具有功能之任何前導序列均可被使用。例示性用於絲狀真菌宿主細胞之前導序列係自用於米麴菌TAKA澱粉酶以及小巢狀麴菌丙醣磷酸異構酶之基因獲得。適用於酵母菌宿主細胞之前導序列包括但不限於自用於以下之基因獲得之前導序列：釀酒酵母菌烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母菌3-磷酸甘油酯激酶、釀酒酵母菌α-因子以及釀酒酵母菌醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH2/GAP)。適用於哺乳動物宿主細胞之前導序列包括但不限於存在於正痘病毒mRNA中之5'-UTR元件。

在一些實施例中，控制序列包含3'非轉譯核酸區以及多腺苷酸化尾核酸序列、可操作地連接至編碼蛋白質之核酸序列之3'端的介導與參與mRNA運輸及轉譯之蛋白質之結合以及mRNA半衰期的序列。在所選宿主細胞中具有功能之任何多腺苷酸化序列以及3' UTR均可用於本發明中。例示性用於絲狀真菌宿主細胞之多腺苷酸化序列包括但不限於來自用於以下之基因之多腺苷酸化序列：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、小巢狀麴菌鄰胺基苯甲酸合成酶、錘形黴菌胰蛋白酶樣蛋白酶以及黑麴菌α-葡萄糖苷酶。可用於酵母菌宿主細胞之多腺苷酸化序列亦為此項技術中已知的(參見例如Guo及Sherman, Mol. Cell. Biol., 15:5983-5990 [1995])。可用於哺乳動物宿主細胞之多腺苷酸化以及3' UTR序列包括但不限於具有數個提高mRNA穩定性且增加mRNA轉譯之序列元件的α-血球蛋白mRNA及β-血球蛋白mRNA的3'-UTR。

在一些實施例中，控制序列為編碼連接至多肽胺基端之胺基酸序列且將經編碼多肽導引至細胞分泌路徑中之信號肽編碼區。核酸序列之編碼序列之5'端可固有地含有在具有編碼經分泌多肽之編碼區之鏈段的轉譯閱讀框架中天然地連接的信號肽編碼區。可替代地，編碼序列之5'端可含有對於編碼序列而言外來之信號肽編碼區。將經表現多肽導引至所選宿主細胞之分泌路徑中之任何信號肽編碼區均可用於本文所提供之經工程處理之GLA多肽的表現。有效之用於絲狀真菌宿主細胞之信號肽編碼區包括但不限於自用於以下之基因獲得之信號肽編碼區：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌中性澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、米黑根毛黴天冬胺酸蛋白酶、特異腐質黴(Humicola insolens )纖維素酶以及柔毛腐質黴(Humicola lanuginosa )脂肪酶。可用於酵母菌宿主細胞之信號肽包括但不限於來自用於釀酒酵母菌α-因子以及釀酒酵母菌轉化酶之基因之信號肽。可用於哺乳動物宿主細胞之信號肽包括但不限於來自用於免疫球蛋白γ (IgG)之基因之信號肽。

在一些實施例中，控制序列為編碼位於多肽胺基端處之胺基酸序列之原肽編碼區。在一些情況下，所得多肽稱為「酶原(proenzyme)」、「原多肽」或「酶原(zymogen)」。原多肽可藉由自原多肽催化或自催化裂解原肽而轉化成成熟活性多肽。

在另一態樣中，本發明亦提供包含編碼經工程處理之GLA多肽之多核苷酸以及一或多個表現調節區(諸如啟動子及終止子)、複製起源等的重組表現載體，此係視其中將引入其之宿主類型而定。在一些實施例中，上文所描述之各種核酸序列以及控制序列連接在一起以產生包括一或多個適宜限制位點以允許在該等位點處插入或取代編碼變異GLA多肽之核酸序列的重組表現載體。可替代地，本發明之一或多個多核苷酸序列係藉由將多核苷酸序列或包含多核苷酸序列之核酸構築體插入用於表現之適當載體中而經表現。在產生表現載體中，編碼序列位於載體中以使得編碼序列與用於表現之適當控制序列可操作地連接。

重組表現載體可為可適宜地經受重組DNA程序且可引起變異GLA多核苷酸序列之表現的任何載體(例如質體或病毒，其包括但不限於腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、慢病毒(LV)以及非病毒載體(諸如脂質體))。載體之選擇將通常視載體與其中引入載體之宿主細胞之相容性而定。載體可為線性或封閉式圓形質體。

在一些實施例中，表現載體為自主複製載體(亦即以染色體外實體形式存在之載體，其複製與染色體複製無關，諸如質體、染色體外元件、微型染色體或人工染色體)。載體可含有用於確保自我複製之任何構件。在一些替代實施例中，載體可為當被引入宿主細胞中時與其中其已被整合之一或多個染色體一起整合至基因組中且進行複製的載體。此外，可使用單一載體或質體或一起含有要被引入宿主細胞之基因組中之總DNA的二個或更多個載體或質體或一轉位子。

在一些實施例中，表現載體較佳含有准許易於選擇經轉型細胞之一或多個可選標記。「可選標記」為基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、對營養缺陷型之原營養性及其類似者。適用於酵母菌宿主細胞之標記包括但不限於ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1以及URA3。用於絲狀真菌宿主細胞中之可選標記包括但不限於amdS (乙醯胺酶)、argB (鳥胺酸胺甲醯基轉移酶)、bar (草銨膦乙醯基轉移酶)、hph (潮黴素磷酸轉移酶)、niaD (硝酸還原酶)、pyrG (血苷-5'-磷酸去羧酶)、sC (硫酸腺苷酸轉移酶)及trpC (鄰胺基苯甲酸合成酶)以及其等效物。在另一態樣中，本發明提供包含編碼至少一種本申請案之經工程處理之GLA多肽之多核苷酸的宿主細胞，多核苷酸可操作地連接至一或多個控制序列以在宿主細胞中表現一或多種經工程處理之GLA酶。用於表現由本發明之表現載體編碼之多肽之宿主細胞為此項技術中眾所周知的且包括但不限於真菌細胞，諸如酵母菌細胞(例如釀酒酵母菌及巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris ) [例如ATCC寄存編號201178])；昆蟲細胞(例如果蠅S2細胞及夜蛾Sf9細胞)、植物細胞、動物細胞(例如CHO、CHO-K1、COS及BHK)以及人類細胞(例如HEK293T、人類纖維母細胞、THP-1、Jurkat及Bowes黑色素瘤細胞株)。

因此，在另一態樣中，本發明提供用於產生經工程處理之GLA多肽之方法，其中該等方法包含在適用於多肽表現之條件下培養能夠表現編碼經工程處理之GLA多肽之多核苷酸的宿主細胞。在一些實施例中，該等方法進一步包含分離且/或純化如本文所描述之GLA多肽之步驟。

適用於上文所描述之宿主細胞之培養基以及生長條件為此項技術中眾所周知的。用於GLA多肽表現之多核苷酸可藉由此項技術中已知之各種方法引入細胞中。技術尤其包括電穿孔、基因槍粒子撞擊、脂質體介導之轉染、氯化鈣轉染以及原生質體融合。

具有本文所揭露之特性之經工程處理之GLA可藉由使編碼天然存在或經工程處理之GLA多肽之多核苷酸經受此項技術中已知且如本文所描述之突變誘發及/或定向演化方法來獲得。例示性定向演化技術為突變誘發及/或DNA改組(參見例如Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767以及美國專利6,537,746)。可使用之其他定向演化程序尤其包括交錯延伸方法(StEP)、活體外重組(參見例如Zhao等人, Nat. Biotechnol., 16:258-261 [1998])、突變誘發PCR (參見例如Caldwell等人, PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994])以及卡匣突變誘發(參見例如Black等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996])。

舉例而言，突變誘發以及定向演化方法可易於應用於多核苷酸以生成可經表現、篩檢以及分析之變異體庫。突變誘發及定向演化方法為此項技術中眾所周知的(參見例如美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號、第5,837,458號、第5,928,905號、第6,096,548號、第6,117,679號、第6,132,970號、第6,165,793號、第6,180,406號、第6,251,674號、第6,277,638號、第6,287,861號、第6,287,862號、第6,291,242號、第6,297,053號、第6,303,344號、第6,309,883號、第6,319,713號、第6,319,714號、第6,323,030號、第6,326,204號、第6,335,160號、第6,335,198號、第6,344,356號、第6,352,859號、第6,355,484號、第6,358,740號、第6,358,742號、第6,365,377號、第6,365,408號、第6,368,861號、第6,372,497號、第6,376,246號、第6,379,964號、第6,387,702號、第6,391,552號、第6,391,640號、第6,395,547號、第6,406,855號、第6,406,910號、第6,413,745號、第6,413,774號、第6,420,175號、第6,423,542號、第6,426,224號、第6,436,675號、第6,444,468號、第6,455,253號、第6,479,652號、第6,482,647號、第6,489,146號、第6,506,602號、第6,506,603號、第6,519,065號、第6,521,453號、第6,528,311號、第6,537,746號、第6,573,098號、第6,576,467號、第6,579,678號、第6,586,182號、第6,602,986號、第6,613,514號、第6,653,072號、第6,716,631號、第6,946,296號、第6,961,664號、第6,995,017號、第7,024,312號、第7,058,515號、第7,105,297號、第7,148,054號、第7,288,375號、第7,421,347號、第7,430,477號、第7,534,564號、第7,620,500號、第7,620,502號、第7,629,170號、第7,702,464號、第7,747,391號、第7,747,393號、第7,751,986號、第7,776,598號、第7,783,428號、第7,795,030號、第7,853,410號、第7,868,138號、第7,873,499號、第7,904,249號、第7,957,912號、第8,383,346號、第8,504,498號、第8,849,575號、第8,876,066號、第8,768,871號、第9,593,326號以及所有相關非美國對應專利；Ling等人, Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]；Dale等人, Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]；Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]；Botstein等人, Science, 229:1193-1201 [1985]；Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]；Kramer等人, Cell, 38:879-887 [1984]；Wells等人, Gene, 34:315-323 [1985]；Minshull等人, Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]；Christians等人, Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]；Crameri等人, Nature, 391:288-291 [1998]；Crameri,等人, Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]；Zhang等人, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]；Crameri等人, Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]；Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]；Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]；美國專利申請公開案第2008/0220990號、第US 2009/0312196號、第US2014/0005057號、第US2014/0214391號、第US2014/0221216號；第US2015/0050658號、第US2015/0133307號、第US2015/0134315號以及所有相關非美國對應專利；WO 95/22625、WO 97/0078、WO 97/35966、WO 98/27230、WO 00/42651、WO 01/75767以及WO 2009/152336；以上所有案及文獻皆以引用之方式併入本文中)。

在一些實施例中，在突變誘發處理之後獲得之酶變異體係藉由使酶變異體經受經界定溫度(或其他分析條件)且量測在熱處理或其他分析條件之後保留之酶活性之量來加以篩檢。隨後，將含有編碼GLA多肽之多核苷酸之DNA與宿主細胞分離，進行定序以識別核苷酸序列變化(若存在)，且用於在不同或相同宿主細胞中表現酶。量測表現庫之酶活性可使用此項技術中已知之任何合適方法(例如標準生物化學技術，諸如HPLC分析)來執行。

對於具有已知序列之經工程處理之多肽，編碼酶之多核苷酸可根據已知合成方法藉由標準固相方法來製備。在一些實施例中，具有至多約100個鹼基之片段可經個別地合成，隨後連接(例如藉由酶或化學接合方法或聚合酶介導之方法)以形成任何所需連續序列。舉例而言，本文所揭露之多核苷酸以及寡核苷酸可藉由使用經典胺基磷酸酯方法進行化學合成(參見例如Beaucage等人, Tetra. Lett., 22:1859-69 [1981]；以及Matthes等人, EMBO J., 3:801-05 [1984])來製備，如同通常在自動化合成方法中實踐一般。根據胺基磷酸酯方法，寡核苷酸經合成(例如在自動DNA合成儀中)，經純化，經黏合，經接合以及在適當載體中經選殖。

因此，在一些實施例中，用於製備經工程處理之GLA多肽之方法可包含：(a)合成編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含選自表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及/或13-1中所提供之任何變異體之胺基酸序列的胺基酸序列以及SEQ ID NO: 8、58、158、372、374、704及/或1022，及(b)表現由多核苷酸編碼之GLA多肽。在該方法之一些實施例中，由多核苷酸編碼之胺基酸序列可任擇地具有一個或若干個(例如至多3、4、5個或至多10個)胺基酸殘基突變(例如缺失、插入及/或取代)。在一些實施例中，胺基酸序列任擇地具有1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-15、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45或1-50個胺基酸殘基突變(例如缺失、插入及/或取代)。在一些實施例中，胺基酸序列任擇地具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45或50個胺基酸殘基突變(例如缺失、插入及/或取代)。在一些實施例中，胺基酸序列任擇地具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24或25個胺基酸殘基突變(例如缺失、插入及/或取代)。在一些實施例中，取代可為守恆或非守恆取代。

經表現之經工程處理之GLA多肽之任何所需經改善特性(例如活性、選擇性、穩定性、酸性耐受性、蛋白酶敏感度等)可使用包括但不限於本文所描述之分析以及條件之此項技術中已知的任何合適分析來加以評估。

在一些實施例中，在宿主細胞中經表現之經工程處理之GLA多肽中之任一者係使用用於蛋白質純化之熟知技術中之任一種或多種自細胞及/或培養基回收，該等技術尤其包括溶菌酶處理、音波處理、過濾、鹽析、超離心以及層析。

用於分離GLA多肽之層析技術尤其包括逆相層析高效液相層析、離子交換層析、疏水相互作用層析、凝膠電泳以及親和力層析。用於純化特定酶之條件部分視諸如淨電荷、疏水性、親水性、分子量、分子形狀等之因素而定且將為熟習此項技術者顯而易知。在一些實施例中，親和力技術可用於分離經改良之變異GLA酶。在利用親和力層析純化之一些實施例中，特異性結合變異GLA多肽之任何抗體均可用。在利用親和力層析純化之一些實施例中，共價連接至GLA之結合至聚醣之蛋白質可用。在利用親和力層析純化之再其他實施例中，結合至GLA活性位點之任何小分子均可用。對於抗體生產，包括但不限於兔、小鼠、大鼠等之各種宿主動物係藉由注射GLA多肽(例如GLA變異體)或其片段而經免疫。在一些實施例中，GLA多肽或片段係藉助於側鏈官能基或連接至側鏈官能基之連接子來連接至諸如BSA之合適載劑。

在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽係藉由包含以下之方法在宿主細胞中產生：在有助於產生經工程處理之GLA多肽之條件下培養包含編碼如本文所描述之經工程處理之GLA多肽之多核苷酸序列的宿主細胞(例如釀酒酵母菌、胡蘿蔔(Daucus carota )、菸草(Nicotiana tabacum )、智人(例如HEK293T)或灰倉鼠(Cricetulus griseus ) (例如CHO))，且自細胞及/或培養基回收經工程處理之GLA多肽。

在一些實施例中，本發明涵蓋產生經工程處理之GLA多肽之方法，其包含在用於允許產生經工程處理之GLA多肽之合適培養條件下培養包含編碼經工程處理之GLA多肽之多核苷酸序列的重組真核細胞，該多核苷酸序列與參考序列(例如SEQ ID NO: 8、58、158、372、374、704及/或1022)具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且當與SEQ ID NO: 8、58、158、372、374、704及/或1022之胺基酸序列進行最佳比對時具有相較於選自表2-1、5-1、6-1、7-1、8-1、9-1、11-1、12-1及13-1中所提供之序列之SEQ ID NO: 8、58、158、372、374、704及/或1022及/或其組合而言的一或多個胺基酸殘基差異，且任擇地自培養物及/或經培養細胞回收經工程處理之GLA多肽。

在一些實施例中，一旦自重組宿主細胞或細胞培養基回收經工程處理之GLA多肽，則藉由此項技術中已知之一或多種任何合適方法將其進一步純化。在一些額外實施例中，適當時，經純化GLA多肽與其他成分以及化合物組合以得到用於不同應用以及用途之包含經工程處理之GLA多肽的組合物以及調配物(例如醫藥組合物)。在一些額外實施例中，經純化之經工程處理之GLA多肽或經調配之經工程處理之GLA多肽經凍乾。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽直接在身體(亦即諸如人類或另一動物之身體內之細胞)內產生且不經純化。然而，在一些替代實施例中，經工程處理之GLA多肽在身體(亦即諸如人類或另一動物之身體內之細胞)內產生且使用此項技術中已知之方法自身體收集。在一些額外實施例中，此等所收集之經工程處理之GLA多肽經純化。在又一些另外實施例中，此等所收集及/或經純化之經工程處理之多肽被引入另一動物(例如人類或另一動物)中或被再引入原先產生所收集及/或經純化之經工程處理之GLA多肽的身體中。組合物：

本發明提供包括但不限於下文所描述之組合物及格式之各種組合物及格式。在一些實施例中，本發明提供適用於諸如膳食/營養補充劑之醫藥組合物以及其他組合物中之經工程處理之GLA多肽。

視投與模式而定，包含治療有效量之本發明之經工程處理之GLA的此等組合物係呈固體、半固體或液體形式。在一些實施例中，組合物包括諸如稀釋劑、緩衝劑、賦形劑、鹽、乳化劑、防腐劑、穩定劑、填充劑以及其他成分之其他醫藥學上可接受之組分。用於調配以及投與之技術細節為此項技術中眾所周知的且在文獻中得到描述。在一些實施例中，此等組合物在作為基因療法引入之後直接在人體中產生。

在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽經調配用於醫藥組合物中。用於遞送經工程處理之GLA多肽之任何合適格式可用於本發明中，其包括但不限於丸劑、錠劑、凝膠錠、膠囊、口含錠、糖衣藥丸、散劑、軟凝膠、溶膠-凝膠、凝膠、乳液、植入物、貼片、噴霧劑、軟膏、擦劑、乳膏、糊劑、凍膠、塗料、氣霧劑、口香糖、緩和劑、棒、溶液、懸浮液(包括但不限於以油為主之懸浮液、水中油型乳液等)、漿液、糖漿、受控釋放型調配物、栓劑等。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽係以適用於注射或輸注之格式(亦即在可注射調配物中)提供。在一些實施例中，用於經工程處理之GLA多肽之多核苷酸序列係以適用於注射之格式提供。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽係在諸如溶膠-凝膠(包括以二氧化矽為主之(例如氧矽烷)溶膠-凝膠)之生物相容性基質中提供。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽經囊封。在一些替代實施例中，經工程處理之GLA多肽經囊封於奈米結構(例如奈米管、奈米小管、奈米膠囊或微膠囊、微球、脂質體等)中。實際上，預期本發明不限於任何特定遞送調配物及/或遞送手段。預期經工程處理之GLA多肽係藉由此項技術中已知之任何合適手段來投與，該等合適手段包括但不限於非經腸、經口、局部、經皮、鼻內、眼內、鞘內、經由植入物等。

在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽係藉由醣基化、化學交聯試劑、聚乙二醇化(亦即經聚乙二醇[PEG]或經活化PEG等修飾)或其他化合物經化學修飾(參見例如Ikeda, Amino Acids 29:283-287 [2005]；美國專利第7,531,341號、第7,534,595號、第7,560,263號以及第7,53,653號；美國專利申請公開案第2013/0039898號、第2012/0177722號等)。實際上，預期本發明不限於任何特定遞送方法及/或機制。

在一些額外實施例中，經工程處理之GLA多肽經提供以用於經由基因療法遞送至細胞或組織，其包括病毒遞送載體，該等病毒遞送載體包括但不限於腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、慢病毒(LV)或非病毒載體(例如脂質體)。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽係在經囊封遞送媒劑(例如脂質體)中調配多核糖核苷酸序列之後提供以用於經由mRNA療法遞送至細胞或組織。在一些額外實施例中，經工程處理之GLA多肽經提供以用於經由細胞療法遞送至細胞或組織，其中編碼經工程處理之GLA多肽之多核苷酸序列被引入外源細胞中且彼細胞(或彼等細胞)被引入接受者(例如展現法布瑞氏病或處於罹患法布瑞氏病之風險下的患者)中。

在一些額外實施例中，經工程處理之GLA多肽係在包含基質穩定之酶晶體的調配物中提供。在一些實施例中，調配物包含經交聯結晶體工程處理之GLA酶以及具有黏附至酶晶體之反應性部分的聚合物。本發明亦提供於聚合物中之經工程處理之GLA多肽。

在一些實施例中，包含本發明之經工程處理之GLA多肽之組合物包括一或多種常用載劑化合物，該一或多種常用載劑化合物包括但不限於糖(例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇及/或山梨糖醇)、澱粉(例如玉米、小麥、稻米、馬鈴薯或其他植物澱粉)、纖維素(例如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉)、膠(例如阿拉伯膠、黃蓍膠、瓜爾膠等)及/或蛋白質(例如明膠、膠原蛋白等)。

在一些實施例中，本發明提供適用於降低諸如血液、腦脊髓液等之流體中之醣脂濃度的經工程處理之GLA多肽。所投與之一或多種經工程處理之GLA多肽之劑量係視個體之病況或疾病、一般條件以及此項技術者已知之其他因素而定。在一些實施例中，組合物意欲用於單次或多次投與。在一些實施例中，經考慮，投與至患有法布瑞氏病之人類之一或多種組合物中之一或多種經工程處理之GLA多肽的濃度足以有效地治療及/或改善疾病(例如法布瑞氏病)。在一些實施例中，經工程處理之GLA多肽與其他醫藥及/或膳食組合物組合投與。實驗

包括實驗以及所達成結果之以下實例僅出於例示之目的提供且不解釋為限制本發明。在以下實驗揭露內容中，以下縮寫適用：ppm (百萬分率)；M (莫耳濃度)；mM (毫莫耳濃度)；uM及µM (微莫耳濃度)；nM (奈莫耳濃度)；mol (莫耳)；gm及g (公克)；mg (毫克)；ug及µg (微克)；L及l (公升)；ml及mL (毫升)；cm (公分)；mm (毫米)；um及µm (微米)；sec. (秒)；min (分鐘)；h及hr (小時)；U (單位)；MW (分子量)；rpm (轉/分鐘)；℃ (攝氏度)；SEM (平均值之標準誤差)；IV (靜脈內)；CDS (編碼序列)；DNA (去氧核糖核酸)；RNA (核糖核酸)；大腸桿菌W3110 (常用實驗室大腸桿菌菌株，可獲自大腸桿菌遺傳庫存中心[Coli Genetic Stock Center，CGSC], New Haven, CT)；NHP (非人類靈長類動物)；HPLC (高壓液相層析)；MWCO (分子量截斷)；SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)；PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)；DPBS (杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate buffered saline))；PES (聚醚碸)；CFSE (羧基螢光素丁二醯亞胺基酯)；IPTG (異丙基β-D-1-硫代半乳哌喃糖苷)；PMBS (硫酸多黏菌素B)；NADPH (菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)；GIDH (麩胺酸去氫酶)；FIOPC (相對於陽性對照之改善倍數)；PBMC (周邊血液單核細胞)；LB (魯利亞培養液(Luria broth))；MeOH (甲醇)；C_max (給藥間隔期間之最大藥物濃度)；RFU (相對螢光單位)；AUC_0-t (曲線下面積，至最後一次可量測濃度)；CL (清除率)；Vz (末期期間之表觀分佈體積)；TI (測試物)；Athens Research (Athens Research Technology, Athens, GA)；ProSpec (ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ)；Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)；Ram Scientific (Ram Scientific公司, Yonkers, NY)；Pall公司(Pall公司, Pt. Washington, NY)；Millipore (Millipore公司, Billerica MA)；Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI)；PerkinElmer (PerkinElmer, Waltham, MA)；Molecular Devices (Molecular Devices有限責任公司, Sunnyvale, CA)；Kuhner (Adolf Kuhner, AG, Basel, Switzerland)；Axygen (Axygen公司, Union City, CA)；Toronto Research Chemicals (Toronto Research Chemicals公司, Toronto, Ontario, Canada)；Cambridge Isotope Laboratories (Cambridge Isotope Laboratories公司, Tewksbury, MA)；Applied Biosystems (Applied Biosystems, 屬於Life Technologies公司, Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies公司, Santa Clara, CA)；Thermo Scientific (屬於ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)；Gibco (ThermoFisher Scientific)；Pierce (Pierce Biotechnology (現屬於Thermo Fisher Scientific), Rockford, IL)；ThermoFisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)；Corning (Corning公司, Palo Alto, CA)；XenoTech (Sekisui XenoTech有限責任公司, Kansas City, KS)；科里爾醫學研究所(Coriell Institute for Medical Research) (科里爾醫學研究所, Camden, NJ)；VWR (VWR International, Radnor, PA)；Jackson (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)；Megazyme (Megazyme International, Wicklow, Ireland)；Enzo (Enzo Life Sciences公司, Farmingdale, NY)；GE Healthcare (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ)；LI-COR (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE)；Amicus (Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ)；Phenomenex (Phenomenex公司, Torrance, CA)；Optimal (Optimal Biotech Group, Belmont, CA)；以及Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。

以下多核苷酸以及多肽序列可用於本發明中。在一些情況下(如下文所示)，多核苷酸序列之後為經編碼多肽。全長人類GLA cDNA之多核苷酸序列(SEQ ID NO.1)： ATGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACATCTGGGCTGCGCGCTTGCGCTTCGCTTCCTGGCCCTCGTTTCCTGGGACATCCCTGGGGCTAGAGCACTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGAAAAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTTTAG (SEQ ID NO:1) 全長人類GLA之多肽序列： MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO: 2) 成熟酵母菌密碼子最佳化(yCDS)之人類GLA之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGAAGTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGAAGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:3) 成熟人類GLA (自然hCDS)之多核苷酸序列： CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGAAAAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:4) 成熟人類GLA之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:5) pCK110900i大腸桿菌表現載體之多核苷酸序列： TCGAGTTAATTAAGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACGGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAATCTAGAGGCCAGCCTGGCCATAAGGAGATATACATATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTCTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAGCGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGTTTTTTTGCACACCATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTACAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGTAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGGGCCAAACTGGCCACCATCACCATCACCATTAGGGAAGAGCAGATGGGCAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTTGAATTCTACGTAAAAAGCCGCCGATACATCGGCTGCTTTTTTTTTGATAGAGGTTCAAACTTGTGGTATAATGAAATAAGATCACTCCGGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAGTTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAACTGCAGGAGCTCAAACAGCAGCCTGTATTCAGGCTGCTTTTTTCGTTTTGGTCTGCGCGTAATCTCTTGCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGCGGTTTTTCGAAGGTTCTCTGAGCTACCAACTCTTTGAACCGAGGTAACTGGCTTGGAGGAGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTCAGTTTAGCCTTAACCGGCGCATGACTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGTGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGTGCATACAGTCCAGCTTGGAGCGAACTGCCTACCCGGAACTGAGTGTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATAACAGCGGAATGACACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCCGCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCACTGATTTGAGCGTCAGATTTCGTGATGCTTGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCTCTCACTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTAAGCCATTTCCGCTCGCCGCAGTCGAACGACCGAGCGTAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAATATATCCTGTATCACATATTCTGCTGACGCACCGGTGCAGCCTTTTTTCTCCTGCCACATGAAGCACTTCACTGACACCCTCATCAGTGAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTAGGCCTATGGCCTTTTTTTTTTGTGGGAAACCTTTCGCGGTATGGTATTAAAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTTCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGACATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTTAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGGTACCCGATAAAAGCGGCTTCCTGACAGGAGGCCGTTTTGTTTC (SEQ ID NO:6) pYT-72Bgl分泌型酵母菌表現載體之多核苷酸序列： 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(SEQ ID NO:7) 變異體73號yCDS之多核苷酸序列： 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(SEQ ID NO:8) 變異體73號之多核苷酸序列： 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(SEQ ID NO:9) 變異體73號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:10) 變異體218號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATAACTGGACATCTAGGCTAAAAAGTCACATTAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:11) 變異體218號hCDS之多核苷酸序列： CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGGCGAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATTATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATAACTGGACTTCAAGGTTAAAAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:12) 變異體218號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAIINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:13) 變異體326號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACGGATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAGATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATTAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:14) 變異體326號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAERMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLSGDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQLGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:15) 變異體206號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATAATTGGACCTCTAGGCTAAGAAGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:16) 變異體206號hCDS之多核苷酸序列： CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGGCGAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATAACTGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:17) 變異體206號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYNWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:18) 變異體205號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATGATTGGGACTCTAGGCTAAGAAGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:19) 變異體205號hCDS之多核苷酸序列： CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGGCGAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATGATTGGGATTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO: 20) 變異體205號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYDWDSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO: 21) 變異體76號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGAGGTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGAAGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO: 22) 變異體76號hCDS之多核苷酸序列： CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTGGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGCGTAGTATAAAGAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATGTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTGGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCCTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTAATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTTAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGCTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGGCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAGGAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACATAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCAGATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO: 23) 變異體76號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWRSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO: 24) Mfα信號肽之多核苷酸序列： ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCT (SEQ ID NO: 25) Mfα信號肽之多肽序列： MRFPSIFTAVLFAASSALA (SEQ ID NO: 26) MMO435之多核苷酸序列： ttaactatatcgtaatacacaggatccaccATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG (SEQ ID NO: 27) MMO439之多核苷酸序列： AGTAGGTGTACGGGCTAACCCGTTATCCAAAGCTAATGCGGAGGATGC (SEQ ID NO: 28) MMO514之多核苷酸序列： TTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTTTGGATAACGGGTTAGCCCG (SEQ ID NO: 29) MMO481之多核苷酸序列： GAGCTAAAAGTACAGTGGGAACAAAGTCGAGGTCGACTTATAACAAATCTTTCAAAGACA (SEQ ID NO: 30) 合成哺乳動物信號肽之多核苷酸序列： ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 31) LAKE Fw之多核苷酸序列： CGATCGAAGCTTCGCCACCA (SEQ ID NO: 32) Br逆向物之多核苷酸序列： CTTGCCAATCCATTGTCCAGGGAGTGGACACCAGTCGTTA (SEQ ID NO: 33) Br Fw之多核苷酸序列： TAACGACTGGTGTCCACTCCCTGGACAATGGATTGGCAAG (SEQ ID NO: 34) hGLA Rv之多核苷酸序列： CGATCGGCGGCCGCTCAAAGTAAGTCTTTTAATGACA (SEQ ID NO: 35) SP-GLA (yCDS)之多核苷酸序列： ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTTTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGAAGTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGAAGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO: 36) MF前導子-GLA (yCDS)之多核苷酸序列： ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTTAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGGATAAAAGATTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGAAGTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGAAGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO: 37) MF前導子之多肽序列： MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR (SEQ ID NO: 38) 變異體395號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACGGATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACCATGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAGATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATTAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO: 39) 變異體395號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAERMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANHVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLSGDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQLGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO: 40) 變異體402號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACGGATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGCCGATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAGATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATTAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO: 41) 變異體402號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAERMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRPIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLSGDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQLGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO: 42) 變異體625號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACGGATGGTAACCGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACCATGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGCCGATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTGCGATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAGATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATTAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAACCTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO: 43) 變異體625號之多肽序列： LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAERMVTEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANHVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRPIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRAISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLSGDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQLGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQTSLKDLL (SEQ ID NO: 44) 變異體648號yCDS之多核苷酸序列： TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTCCGATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCGAAGAGATGGCTGAACGGATGGTAACCGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACCATGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGCCGATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGGCCCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTGCGATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAGATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGACAATTGGGTTTCTATAACGCAACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATTAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAACCTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO: 45) 變異體648號之多肽序列： LDNGLARTPPMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFEEMAERMVTEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANHVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRPIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAGPLFMSNDLRAISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLSGDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQLGFYNATSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQTSLKDLL (SEQ ID NO: 46)實例1 GLA 基因採集以及表現載體構築

編碼WT人類GLA序列(SEQ ID NO: 2)之合成基因(SEQ ID NO: 1)及衍生變異體(SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6)經構築，如先前所描述(參見例如美國專利申請公開案第2017/0360900 A1號)。為了在哺乳動物細胞中進行分泌表現以及短暫轉染，如下生成包含與編碼不同GLA變異體之合成基因融合的編碼合成小鼠IG信號肽之多核苷酸的嵌合GLA表現構築體。使用寡核苷酸BamHI-pcDNA-GLA-F (SEQ ID NO: 63)及XhoI-pcDNA-GLA-R (SEQ ID NO: 64)以擴增編碼信號肽之片段以及GLA變異體之成熟形式的編碼序列。PCR產物接合至BamHI/XhoI線性化哺乳動物表現載體pcDNA3.1(+) (Invitrogen)或含有CMV啟動子及BGH-pA (牛生長激素多腺苷酸化)序列之載體。使用熟習此項技術者一般已知之定向演化技術以在此質體構築體內生成衍生自SEQ ID NO: 8之基因變異體(參見例如美國專利第8,383,346號及WO2010/144103)。實例2 高通量 生長以及分析 GLA 以 及GLA 變異體之 高通量(HTP) 生長

使用用LIPOFECTAMINE^® 3000試劑(ThermoFisher Scientific)進行之脂質體轉染方法使HEK 293T細胞經編碼與野生型GLA或GLA變異體融合之合成小鼠IG信號肽的pcDNA 3.1(+)載體或含有CMV啟動子及BGH-pA之載體轉染。在生長培養基(具有10%胎牛血清之DMEM [二者均來自Corning])中培養HEK 293T細胞。轉染之前24小時，將細胞以10⁵ 個細胞/孔/250 µL之密度接種至含生長培養基之NUNC^® Edge 2.0 96孔盤(ThermoFisher Scientific)，且在培育箱中在37℃、5% CO₂ 下培育。將細胞在37℃及5% CO₂ 下培育24-72小時，以允許GLA變異體之表現以及分泌。將來自HEK293T轉染之條件培養基(50-100 µL)轉移至Corning 96孔固體黑色盤(Corning)中以進行活性及/或穩定性分析。上清液之HTP 分析

GLA變異體活性係藉由量測4-甲基香豆素基α-D-半乳哌喃糖苷(MUGal)之水解來測定。使如上文所描述產生之50 µL HEK 293T條件培養基與50 µL含1 mM MUGal之McIlvaine緩衝液(McIlvaine, J. Biol. Chem., 49:183-186 [1921]) pH 4.8在96孔黑色不透明底微量滴定盤中混合以進行未經攻擊分析。將反應物短暫地混合且在37℃下培育30-180分鐘，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。此分析之結果呈現於表2-1中。經酸預處理之上清液之HTP 分析

用酸性緩衝液攻擊GLA變異體以模擬變異體可能在溶酶體內遇到之pH極值。首先，將50 µL HEK 293T條件培養基以及50 μL McIlvaine緩衝液(pH 3.3-4.3)添加至96孔圓底微量滴定盤的孔中。將盤用PlateLoc^® 熱微定量盤式密封機(Agilent)密封，且在37℃下培育1-2 h。使50 µL經酸性pH攻擊之樣品與50 µL含1 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.4混合以進行pH 4攻擊分析。將反應物短暫地混合且在37℃下培育30-180分鐘，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。此分析之結果呈現於表2-1中。經鹼預處理之上清液之HTP 分析

用鹼性(中性)緩衝液攻擊GLA變異體以模擬變異體在投與至患者之後在血液中遇到之pH。首先，將50 µL GLA變異體HEK 293T條件培養基以及50 μL McIlvaine緩衝液(pH 7.0-8.2)添加至96孔圓底微量滴定盤的孔中。將盤密封且在37℃下培育1-18 h。使50 µL經鹼性pH攻擊之樣品與50 µL含1 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.4混合以進行pH 7攻擊分析。將反應物短暫地混合且在37℃下培育30-180分鐘，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。此分析之結果呈現於表2-1中。

表 2-1. 在未攻擊 ( 未經攻擊 ) 或在所指示 pH 下之攻擊之後相對於 SEQ ID NO: 8 而言之 GLA 變異體的活性 ¹
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 8 而言 )	未經攻擊 FIOPC	pH 4 攻擊 FIOPC	pH 7 攻擊 FIOPC
7/8		++	++	++
9/10	R44L/D247N/P337A	++	++++
11/12	R44L/K302Q	++	++++	+
13/14	R44L/D247N/K302Q	++	++++
15/16	R217F/K373R		++++	+
17/18	I322M/P337A	++++	++++	++
19/20	R44L/D247N/K302Q/I322M	++	++++
21/22	K302Q/I322M/Q362K/K373R	+++	++++	+
23/24	I322M	+++	+++	++
25/26	K302Q/P337A	++	+++	+
27/28	R44L/R217F/I322M	+++	+++	++
29/30	R44L/D247N/I322M	++	+++
31/32	R44L/P337A	++	+++	+
33/34	R44L/K373R	++	+++	+
35/36	R44L/D247N	+++	+++	++
37/38	R217F/I322M	+++	+++	+
39/40	R44L/R217F/D316L	++	+++	+
41/42	D247N/Q362K	++	+++
43/44	R44L/R217F	+++	+++	++
45/46	K373R	++	++	+
47/48	D247N/I322M	++	++
49/50	R44L	++	++	+
51/52	D316L	++	++	+
53/54	R44L/D247N/Q362K	++	++
55/56	D316L/P337A	++	++
57/58	Q362K/K373R	++	+
59/60	R44L/R217F/I322M/P337A		+
¹ 經提高之活性位準係相對於具有SEQ ID NO: 8之參考多肽而言加以測定，且定義如下：「+」＞ 0.75；「++」＞ 0.9；「+++」＞ 1.1；以及「++++」＞ 1.2。

實例3 GLA 變異體之產生 HEK293T 細胞中GLA 之產生

哺乳動物細胞中GLA變異體之分泌表現係藉由HEK293、HEK293T或Expi293細胞之短暫轉染來執行。如實例1中所描述，使細胞經與N端合成哺乳動物信號肽融合之GLA變異體(SEQ ID NO: 3、4、9、12、17、20、23以及41)轉染且次選殖至哺乳動物表現載體pLEV113中。使用熟習此項技術者已知之標準技術使HEK293細胞經質體DNA轉染且在懸浮液中生長4天。收集上清液且儲存於4℃下直至進行分析為止。實例4 GLA 變異體之純化 自哺乳動物細胞上清液純化GLA 變異體

如文獻(Yasuda等人, Prot. Exp. Pur,. 37:499-506 [2004])中所描述，自哺乳動物培養物上清液純化WT GLA (SEQ ID NO: 2)。所有其他GLA變異體如下經純化。基本上如此項技術(參見Yasuda等人, Prot. Exp. Pur,. 37:499-506 [2004])中已知，自哺乳動物培養物上清液純化GLA變異體。伴刀豆球蛋白A樹脂(Sigma Aldrich)係經0.1 M乙酸鈉、0.1 M NaCl、1 mM MgCl₂ 、CaCl₂ 以及MnCl₂ 、pH 6.0 (伴刀豆球蛋白A結合緩衝液)平衡。上清液係經0.2 µm瓶頂式過濾器無菌過濾，之後其被負載至管柱上。在負載之後，管柱經10個管柱體積之伴刀豆球蛋白A結合緩衝液洗滌，且經結合蛋白質經補充有0.9 M甲基-α-D-甘露哌喃糖苷以及0.9 M甲基-α-D-葡萄哌喃糖苷之伴刀豆球蛋白A結合緩衝液溶離。使經溶離蛋白質濃縮，且使用Amicon^® Ultra 15 mL過濾單元用30 kDa分子量截斷膜(Millipore)將緩衝液更換為儲存緩衝液(20 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、185 µM TWEEN^® -20非離子清潔劑，pH 6.0)。儲存緩衝液中之GLA經由ANOTOP^® 0.2 µm針筒過濾器(Whatman)無菌過濾且儲存於-80℃下。基於BCA定量，純化得到2.4-50 μg經純化蛋白質/ml培養物上清液。藉由BCA 蛋白質分析進行之蛋白質定量

使用二辛可寧酸(BCA)蛋白質分析(Sigma Aldrich)以定量經純化GLA。在微量滴定盤中，使伴隨適當稀釋之25 µL蛋白質標準品以及經純化GLA與200 µL含有50份BCA試劑A以及1份BCA試劑B之工作試劑混合。將盤在盤振盪器上充分混合30秒且在37℃下培育30分鐘。在盤冷卻至室溫之後，使用盤讀取器量測在562 nm處之樣品吸光度。實例5 GLA 變異體之活體外表徵 HEK 293T 細胞中經表現之GLA 變異體之熱穩定性

使GLA變異體暴露於各種溫度攻擊以評估酶之總穩定性。首先，將50 µL含經純化HEK 293T表現型GLA以及GLA變異體之1×PBS pH 6.2添加至96孔PCR盤(Biorad，HSP-9601)之孔中。使用熱循環儀之梯度程式將盤密封且在30-50℃下培育1 h。使25 µL經攻擊上清液與25 µL含1 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.4混合以進行分析。將反應物短暫地混合且在37℃下培育60分鐘，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。藉由將經攻擊樣品之活性除以未經攻擊樣品之活性來計算在30℃至50℃範圍內之溫度下進行之1 h培育的殘餘活性%，其中對於各變異體，在規定溫度下，「未經攻擊」為在0時量測之水解，且「經攻擊」為在1小時量測之水解。此分析之結果示於表5-1中。圖1提供顯示在各種溫度下培育1小時之後GLA變異體之殘餘活性之圖。HEK 293T 細胞中經表現之GLA 變異體之血清穩定性

為了評估在存在血液之情況下變異體之相對穩定性，使樣品暴露於血清。首先，將100 µL含7.5 μg/mL經純化GLA變異體之1×PBS pH 6.2及90 μL人類血清添加至COSTAR^® 96孔圓底盤(Corning)之孔中。將盤密封且在37℃下培育0-24 h。使50 µL經攻擊上清液與50 µL含1 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.4混合以進行分析。將反應物短暫地混合且在37℃下培育90分鐘，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。藉由將經攻擊樣品之活性除以未經攻擊樣品之活性來計算24 h之後血清中之殘餘活性%，其中對於各變異體，「未經攻擊」為在0時量測之水解，且「經攻擊」為在規定時間點量測之水解。結果示於表5.1中。圖2提供顯示在經人類血清攻擊0-24小時之後GLA變異體之殘餘活性之圖。HEK 293T 細胞中經表現之 GLA 變異體之溶酶體穩定性

為了評估在存在溶酶體蛋白酶及其他溶酶體組分之情況下變異體之相對穩定性，如本文所描述，遵循具有一些修改之製造商說明書，使GLA變異體暴露於人類溶酶體溶解物(XenoTech，編號H0610.L)。簡言之，將GLA變異體稀釋至適當濃度範圍(0.0625-0.0078125 mM)，且在COSTAR^® 96孔圓底盤(編號3798，Corning)中使10 μL稀釋液與10 μL含人類溶酶體溶解物之1:20稀釋液之2×分解代謝緩衝液(XenoTech，編號K5200)組合。將盤密封且在37℃下培育0-24 h。使50 µL經攻擊上清液與50 µL含1 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.4混合以進行分析。將反應物短暫地混合且在37℃下培育90分鐘，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。藉由將經攻擊樣品之活性除以未經攻擊樣品之活性來計算24 h之後溶酶體提取物中之殘餘活性%，其中對於各變異體，「未經攻擊」為在0時量測之水解，且「經攻擊」為在4小時及24小時量測之水解。結果提供於表5.1中。圖3提供顯示在經人類溶酶體提取物攻擊0至24小時之後GLA變異體之殘餘活性之圖。HEK293T 細胞中經表現之經純化GLA 變異體於法布瑞氏病纖維母細胞中之細胞吸收

測定相較於參考酶(WT GLA [SEQ ID NO: 2])而言之GLA變異體之細胞吸收以評估經培養細胞吞噬變異體之總能力。將法布瑞氏病纖維母細胞(GMO2775，科里爾醫學研究所)接種至含有最低必需培養基(MEM；Gibco編號11095-080，補充有1%非必需胺基酸(NEAA；Gibco編號11140-050)以及15%胎牛血清(Corning編號35-016-CV))之12孔培養皿(VWR，編號10861-698)中且使其生長以匯合(在37℃、5% CO₂ 下2-3天)。達到匯合之後，將經補充之MEM藉由無菌真空來移除且用1 mL/孔之無血清MEM + 1% NEAA置換。將如實例4中所描述經純化之酶以10 μg GLA/mL添加至細胞中且使其在37℃、5% CO₂ 下培育4小時。將無血清培養基藉由無菌真空來抽吸，將細胞短暫地用1 mL 1×PBS/孔洗滌，且將PBS藉由無菌真空來抽吸。隨後，使細胞經200 μL/孔之0.25%胰蛋白酶-EDTA (VWR編號02-0154-0100)胰蛋白酶化且在室溫下培育~5分鐘以自盤取出黏附細胞且降解剩餘胞外GLA。接著，將500 μL無血清MEM添加至各孔中，且將樣品轉移至1.5 mL微量離心管中。將樣品在8000 RPM下離心5分鐘以集結細胞。將培養基用1000 μL吸管輕輕地抽吸。使細胞集結粒再懸浮於500 μL 1×PBS中，在8000 RPM下再集結5 min，且輕輕地移除PBS。隨後，將100 μL溶解緩衝液(稀釋於1×PBS中之0.2% TRITON X-100™非離子界面活性劑(Sigma編號93443))添加至各樣品中，之後音波處理1-2分鐘，且在4℃下在12,000-14,000 RPM下離心10分鐘。將上清液轉移至無菌PCR管中以進行蛋白質及活性分析。使10 µL細胞溶解物樣品與50 μL含2.5 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.6混合以進行活性分析。將反應盤密封且在37℃下培育60分鐘，之後用140 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2/孔淬滅反應物。MUGal水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以測定。對於蛋白質定量，遵循具有以下修改之製造商說明書(Pierce，編號23225)進行BCA分析：使10 μL細胞溶解物樣品與190 μL BCA工作試劑混合，且將盤密封且在37℃下培育60分鐘。使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測吸光度(562 nm)來分析樣品。由BSA標準曲線計算蛋白質濃度。藉由首先由經酶處理之樣品之酶螢光減去未經處理細胞之背景非酶螢光且隨後以各孔中之蛋白質濃度標準化來計算各GLA變異體之細胞吸收。藉由將經標準化GLA變異體胞內活性除以對照(WT)之對應活性來計算細胞吸收FIOPC。圖4提供相較於野生型(SEQ ID NO: 2)而言在37℃下培育4小時之後表示為相對活性之經培養法布瑞氏病患者纖維母細胞中之經純化GLA變異體之細胞吸收圖。

表 5-1. 在 HEK293T 細胞中產生之 GLA 變異體之相對活性以及細胞吸收 ¹
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 8 而言 )	在 24 h 之溶酶體穩定性殘餘活性 %	在 37 ℃下 (1 h) 之殘餘活性 %	在 50 ℃下 ( 1 h ) 之殘餘活性 %	在 24 h 之血清穩定性殘餘活性 %
1/2	P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/R217F/D247N/G261A/A271H/K302Q/D316L/I322M/P337A/Q362K/A368W/K373R/T392M		+	+
7/8		+++	++++	+++	+++
15/16	R217F/K373R	+++	++++	++++
57/58	Q362K/K373R	+++	++++	++++	+
59/60	R44L/R217F/I322M/P337A	+++	++++	++++
39/40	R44L/R217F/D316L	+++	++++	++++
61/62	P166A/Q362K	+++	++++	++++	+++
¹ 在35℃及50℃下之殘餘活性百分比(%)以及溶酶體及血清穩定性殘餘活性百分比(%)係相對於各個別變異體而言加以測定，且定義如下：「+」＞ 50%；「++」＞ 60%；「+++」＞ 80%；以及「++++」＞ 95%。各變異體在1小時之殘餘活性係相對於其在0時之活性而言加以測定。

法布瑞氏病纖維母細胞溶解物中之GLA 活性之HTP 分析

使在HTP中產生之GLA變異體經攻擊以被吸收至細胞中且經24至96小時保留活性。塗鋪法布瑞氏病纖維母細胞(GMO2775，科里爾醫學研究所)且使其經24-72小時生長以匯合。達到匯合之後，使用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除培養基。將來自如上文所描述經短暫轉染之HEK293T細胞之條件培養基添加至法布瑞氏病纖維母細胞中，且使細胞與GLA變異體一起在37℃、5% CO₂ 下培育2-4小時。用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除含GLA條件培養基。隨後，使細胞經150 μL 1 × DPBS/孔短暫地洗滌，且用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除DPBS。接著，將200 μL完全生長培養基添加至各孔中，且使盤返回至培育箱24-72小時。在培育結束時，用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除完全生長培養基。使細胞經150 μL 1 × DPBS/孔洗滌，且用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除DPBS。細胞係經由添加補充有0.2% TRITON X-100™非離子界面活性劑(Sigma編號93443)之50 μL McIlvaine緩衝液pH 4.4且在室溫下攪動30分鐘來溶解。活性係藉由添加50 µL含1.5 mM MuGal之McIlvaine緩衝液pH 4.4來加以評估。將盤密封且在37℃下培育360分鐘且在400 rpm下攪動，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用SPECTRAMAX^® M2微定量盤式讀取器，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。藉由將經標準化GLA變異體胞內活性除以參考序列之對應活性來計算細胞吸收FIOPC。法布瑞氏病纖維母細胞中GLA 誘導之球形三醯神經醯胺耗乏之HTP 分析

使在HTP中產生之GLA變異體經攻擊以被吸收至細胞中且減少球形三醯神經醯胺之細胞負載量。塗鋪法布瑞氏病纖維母細胞(GMO2775，科里爾醫學研究所)且使其經24-72小時生長以匯合。達到匯合之後，藉由自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除培養基。將由如上文所描述經短暫轉染之HEK293T細胞產生之條件培養基添加至纖維母細胞中，且使其在37℃、5% CO₂ 下培育2-4小時。用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除含GLA條件培養基。隨後，使細胞經150 μL 1 × DPBS/孔短暫地洗滌，且用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除DPBS。接著，將200 μL完全生長培養基添加至各孔中，且使盤返回至培育箱24-72小時。在培育結束時，用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除完全生長培養基。隨後，使細胞經150 μL 1 × DPBS/孔洗滌，且用自動化BioMek i5液體搬運用機器人移除DPBS。在室溫下將球形三醯神經醯胺提取至補充有10 ng/mL N-十七醯基-神經醯胺三己糖苷之200 μL甲醇中30分鐘且輕輕地攪動。經由堆疊至圓底96孔盤中之Millipore疏水性過濾器過濾甲醇提取物。基本上如此項技術中已知，藉由LC-MS/MS定量細胞球形三醯神經醯胺(參見Provencal等人, Bioanal., 8:1793-1807 [2016])。測定各細胞樣品之峰值積分總和，且藉由將經標準化GLA變異體球形三醯神經醯胺含量變化除以參考序列球形三醯神經醯胺含量變化來計算球形三醯神經醯胺FIOPC。實例6 衍生自SEQ ID NO: 58 之GLA 變異體

在此實例中，所進行之用於評估法布瑞氏病纖維母細胞中之GLA變異體之活性及藉由GLA變異體進行之Gb3清除的實驗得到描述。在此實例中，SEQ ID NO: 58用作參考序列(亦即相對於SEQ ID NO: 58而言之變異體中之胺基酸差異得到指示，且相對於所獲得之針對SEQ ID NO: 58之結果而言的分析結果得到報導)。在此等實驗中，如實例5中所描述，測試在無預培育之情況下GLA變異體之MU-Gal活性。亦如實例5中所描述，測試變異體在法布瑞氏病纖維母細胞中之Gb3耗乏。

表 6-1. GLA 變異體在未經攻擊條件中及在於法布瑞氏病纖維母細胞中之 Gb3 耗乏中之相對效能 ( 相對於 SEQ ID NO: 58 而言 )¹
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 58 而言 )	未經攻擊 FIOPC	於法布瑞氏病纖維母細胞中之 Gb3 耗乏
67/68	R7L/Y120H	+	+
69/70	R7L/F365V	+
71/72	R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V	++
73/74	R7L/N305G	++	+
75/76	Q88A	++
77/78	D282N	++	+
79/80	Q299R/L300I	++
81/82	Y120H	++
83/84	R7L	+++	+
85/86	R7L/N305G/F365V	+++
87/88	Y120H/Q299R/N305G	+++
89/90	R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R	+++	++
91/92	E48D	+++	++
93/94	Q68E	+++	++
95/96	R7L/D130E	+++	++
97/98	P67T/F180G	+++
99/100	R7L/E48D/F180G	+++
101/102	F365V	+++
103/104	L300I	+++	++
105/106	R7L/E48D/Q68E	+++	++
107/108	E48D/F180G/D282N	+++
109/110	F180G	+++
111/112	Q299R/L300I/N305G/F365V	+++
113/114	D282N/F365V	++++
115/116	E48D/D282N/N305G	++++	+
117/118	R7L/Q68E/F180G	++++
119/120	N305G	++++	++
121/122	Q68E/Q299R/L300I	++++	++
123/124	R7L/E48D/D130E/D282N	++++	++
125/126	E48D/Q68E	++++	+++
127/128	N305G/F365V	++++
129/130	R7L/D282N	++++	+
131/132	R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V	++++	++
133/134	E48D/D282N	++++	++
135/136	A206S	++
137/138	K343D		+++
139/140	K343G	++	++
141/142	K96L	++	+++
143/144	K96L/P312Q/K343G	++
145/146	K96L/S273P	+	+++
147/148	L158A/R162K/S273G		++
149/150	L158R	+
151/152	N91Q/S95E		+++
153/154	N91Q/S95E/K96L		+++
155/156	R162H/K343D	+
157/158	R162K	++	+++
159/160	R162K/S273P	+	+++
161/162	R162S	++	+++
163/164	R87K/K96I/H155N/S273P/K343G		++
165/166	R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G	+
167/168	R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K		+++
169/170	S273P		+++
171/172	S273P/K343G	++
173/174	T47D	++	++
175/176	T47D/K343G	+	++
177/178	T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H		++
179/180	T47D/S273P	++	+++
181/182	T47D/S95E		+++
183/184	W178G	+
185/186	T389K	+
187/188	F180T	+++
189/190	F365A	++++
191/192	F180V	++++
193/194	L158A	+
195/196	F180L	+
197/198	S370G	++
199/200	L398S	+++
201/202	L397A	++
203/204	A206K	++++
205/206	P166K	+++
207/208	A271R	+
209/210	D396G/L398T	++
211/212	W178S	+	+
213/214	S314A	+	+
215/216	S71P	++	+
217/218	L394K		+
219/220	Q181A	+	+
221/222	V345A	++	+
223/224	V93I		+
225/226	F365Q	++	+
227/228	I336V	++	+
229/230	H92F	+	+
231/232	L398V	+++	+
233/234	L398P	+++	++
235/236	R301M	++++	++
237/238	P337R	++	++
239/240	S333G	+++	++
241/242	L363Q	++++	++
243/244	T47V		++
245/246	H92T	++++	++
247/248	S393V	+	++
249/250	D151L		++
251/252	S333F	++++	++
253/254	L293P/Q391A	++	++
255/256	V345Q	+	++
257/258	E39V		++
259/260	R217K	++	++
261/262	L398A		+++
¹ 所有活性皆相對於具有SEQ ID NO: 58之參考多肽而言加以測定。經提高之活性位準定義如下：「+」= 0.9至1.1；「++」＞ 1.1；「+++」＞ 1.5；以及「++++」＞ 2。

實例7 衍生自SEQ ID NO: 158 之GLA 變異體

在此實例中，所進行之用於評估GLA變異體之活性、在pH 7.4下之穩定性及在法布瑞氏病纖維母細胞中之胞內活性的實驗得到描述。在此實例中，參考序列為SEQ ID NO: 158 (亦即相對於SEQ ID NO: 158而言之變異體中之胺基酸差異得到指示，且相對於針對SEQ ID NO: 158之結果而言的分析結果得到報導)。如實例5中所描述，測試在無預培育(未經攻擊)之情況下以及在pH 7.4預培育之後變異體之GLA MU-Gal活性。亦如實例5中所描述，測試在與GLA變異體一起培育之法布瑞氏病纖維母細胞溶解之後變異體之MU-Gal活性。

表 7-1. GLA 變異體之相對效能 ( 相對於 SEQ ID NO: 158 而言 )
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 158 而言 )	未經攻擊 FIOPC	溶解物 FIOPC	在 pH 7.4 預培育之後的穩定性 FIOPC
263/264	E48D	++	+	++++
265/266	E48D/Q68E	+		++++
267/268	E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V	+		++++
269/270	E48D/Q68E/S333F	+		++++
271/272	E48D/R217K	+	+	++++
273/274	E48D/S333F			++++
275/276	E48D/S333G	+	+	++++
277/278	E48D/S393V	+	+	+++
279/280	E48D/V345Q/S393V			+++
281/282	Q68E	+		+++
283/284	Q68E/V345Q	++	++	++++
285/286	R217K/S333F	+	+	+++
287/288	R217K/S333G	+	+	++++
289/290	S333F/V345Q	+	++	++
291/292	S333G	++	++	++++
293/294	D130E		+
295/296	D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/L398A	++	+
297/298	D130E/V345Q/S393V		+
299/300	E39V/P337R/K343G/L398A	+
301/302	T47V/D151L	+	+
303/304	T47V/D130E	+	+
305/306	T47V/K343D/V345Q/S393V	+	+
307/308	A206S/R217K	+
309/310	P337R/K343G/V345Q/L398A	+
311/312	D282N/S393V	+
313/314	K343D	+	+
315/316	K343D/V345Q/S393V/L398A	+
317/318	E39V/T47V/R217K	+
319/320	A206S	+
321/322	S393V/L398A	+
323/324	E39V/D282N/P337R/L398A	+	+
325/326	D151L	+
327/328	S393V	+	+
329/330	R217K/P337R/V345Q/L398A	+	+
331/332	D151L/D282N/S393V	+		+
333/334	E39V/S393V/L398A	+		+
335/336	L158R			+
337/338	D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V	+	++	+
339/340	D130E/L158R		+	+
341/342	D151L/S393V		+	+
343/344	R217K	+	+	+
345/346	D130E/L158R/S393V	+	++	+++
347/348	E39V/D151L	+		+++
349/350	D151L/V345Q/S393V/L398A	+	++	+++
351/352	E39V/T47D	++	+	++++
353/354	L158R/S393V	++	+	++++
355/356	C59A/C143S			+
357/358	A271N		++
359/360	D202N			++++
361/362	D24S/D202N	+
363/364	S333N	+
365/366	C143S/S333N	+
367/368	C143S/A271N	++		+++
369/370	C143S/E387N	++		++
¹ 所有活性皆相對於具有SEQ ID NO: 158之參考多肽而言加以測定。經提高之活性位準定義如下：「+」= 0.9至1.1；「++」＞ 1.1；「+++」＞ 1.5；以及「++++」＞ 2.5。

實例8 衍生自SEQ ID NO: 372 之GLA 變異體

在此實例中，所進行之用於評估GLA變異體之活性、在pH 7.4下之穩定性、Gb3清除及在法布瑞氏病纖維母細胞中之胞內活性的實驗得到描述。在此實例中，參考序列為SEQ ID NO: 372 (亦即相對於SEQ ID NO: 372而言之變異體中之胺基酸差異得到指示，且相對於針對SEQ ID NO: 372之結果而言的分析結果得到報導)。如實例5中所描述，測試在無預培育(「未經攻擊」)之情況下以及在pH 7.4預培育之後此等變異體之MU-Gal活性。亦如實例5中所描述，測試變異體在與GLA變異體一起培育之法布瑞氏病纖維母細胞中之MU-Gal活性(「溶解物FIOPC」)。亦如實例5中所描述，測試變異體在與GLA變異體一起培育之法布瑞氏病纖維母細胞中之Gb3耗乏(「Gb3 FIOPC」)。

表 8-1. GLA 變異體之相對效能 ( 相對於 SEQ ID NO: 372 而言 )
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 372 而言 )	未經攻擊 FIOPC	在 pH 7.4 預培育之後的穩定性 FIOPC	溶解物 FIOPC	Gb3 FIOPC
375/376	F217R/N247D/L316D/M322I/A337P/W368A	+	++++
377/378	H271A	+			+
379/380	H271A/L316D/M322I	+++	++
381/382	H271A/Q302K/M322I	+++	++++	++
383/384	K206A/F217R/H271A/M392T	++	++++	+++	+
385/386	L44R/K206A/A337P	+++	+++	++++	++
387/388	L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D	++		++
389/390	L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D/M322I	++	+	+
391/392	L44R/S47T/K206A/F217R/N247D/H271A/M322I	+	++++	++++
393/394	L44R/S47T/N247D/M322I/W368A	+++	++++	++
395/396	L44R/S47T/Q302K/L316D/M322I	+++	++++	+++
397/398	L44R/S47T/Y92H/K206A/F217R/L316D/M322I	++++	++++	++++
399/400	L44R/S47T/Y92H/N247D/A261G/H271A/L316D/A337P/W368A	++	+	+
401/402	L44R/Y92H/K206A/N247D/W368A	++	+	+++	++
403/404	L89I/F217R/N247D/A261G/Q302K/L316D	++	+
405/406	M39E/L44R/Y92H/F217R/M322I	+++	+	+++
407/408	M39E/L44R/Y92H/N247D/H271A/Q302K	++		++	+
409/410	M39E/L44R/Y92H/R162M/N247D/Q302K/L316D/M322I	++	+	++
411/412	M39E/M322I	+++	+	++
413/414	M39E/N247D/H271A	+	+	+	+
415/416	M39E/N247D/H271A/L316D	+++	+++
417/418	M39E/S47T/F217R/N247D/W368A	++++	++++
419/420	M39E/S47T/N247D	+++	+	+
421/422	M39E/S47T/Y92H/N247D/Q302K/L316D/M322I	+	+++	+
423/424	M39E/Y92H/L316D/M322I	+	+	++	+
425/426	M39E/Y92H/N247D/Q302K/L316D/A337P/W368A	++++	++++	+
427/428	N247D	+	++++	+
433/434	N247D/H271A	+++	++	+
435/436	N247D/Q302K	++	++++	++	+
437/438	Q302K/M322I/W368A	++	+	+
439/440	S47T/F217R/Q302K	+++	+++	+++
441/442	S47T/N247D	++	++++	+
443/444	S47T/N247D/H271A	+++	++++	++
445/446	S47T/Y92H/N247D/H271A	++	++	+	+
447/448	T10P	++	++	++	++
449/450	T10P/A261G	+	+	++
451/452	T10P/A337P/M392T	++	++	+	++
453/454	T10P/H271A/Q302K	+++	++++	++	+
455/456	T10P/K206A/A261G/H271A/L316D	+	+	++
457/458	T10P/K206A/F217R/H271A	++	++++	++++
459/460	T10P/K206A/N247D	++++	++++	++++
461/462	T10P/L316D/M322I	+++	++++	++	+
463/464	T10P/L44R	+++	+	+++	++
465/466	T10P/L44R/A261G/Q302K/L316D	++		++	+
467/468	T10P/L44R/Q302K/A337P/W368A	++++	++++	++++
469/470	T10P/L44R/S47T/A261G/Q302K/M322I/W368A	+++	+	+++
471/472	T10P/L44R/S47T/Y92H/N247D	+	+++	+++
473/474	T10P/L44R/Y92H/L316D/M322I	++++	+++	+++
475/476	T10P/M39E/L44R/M322I	+++		+++	+
477/478	T10P/M39E/Y92H/K206A/F217R/H271A	++	+++	+++
479/480	T10P/M39E/Y92H/N247D	+++	+++	+
481/482	T10P/M39E/Y92H/N247D/H271A/L316D	+	+++
483/484	T10P/Q302K	++	+	+++	+++
485/486	T10P/Q302K/L316D	++	+++	++	+
487/488	T10P/Q302K/M322I/A337P	+++	++++	+++	++
489/490	T10P/S47T/F217R/M322I	+	+++	++	+
491/492	T10P/S47T/F217R/N247D/L316D/M392T	+++	++++	+
493/494	T10P/S47T/H271A	+++	++	++
495/496	T10P/W368A	+++	++	+
497/498	T10P/Y92H	+	+	++
499/500	T10P/Y92H/F217R/A261G/Q302K/A337P	++	+	++
501/502	T10P/Y92H/K206A/F217R/N247D	+	++++	+++	+
503/504	T10P/Y92H/K206A/N247D/L316D/M322I/M392T	+	++++	++
505/506	T10P/Y92H/K206A/N247D/M322I/W368A	+	++++	+++	++
507/508	W368A	+		+
509/510	Y92H/F217R/H271A	++	+	+
511/512	Y92H/H271A/A337P	++	+	+
513/514	Y92H/L316D	+++	+		+
515/516	Y92H/N247D	+++	++	++
517/518	Y92H/N247D/H271A/M322I	++	++	+	+
519/520	Y92H/N247D/Q302K/M322I/A337P	+	+++	+
521/522	Y92H/Q302K	++		++	+
¹ 所有活性皆相對於具有SEQ ID NO: 372之參考多肽而言加以測定。經提高之活性位準定義如下：「+」= 0.9至1.1；「++」＞ 1.1；「+++」＞ 1.5；以及「++++」＞ 2。

實例9 衍生自SEQ ID NO: 374 之GLA 變異體

在此實例中，所進行之用於藉由分析在一系列或獨立攻擊之後的酶活性來測定GLA變異體活性的實驗得到描述。如實例5中所描述，測試在無預培育之後以及在pH 7.4預培育之後此等變異體之GLA MU-Gal活性。亦如實例5中所描述，測試在與變異體一起培育之法布瑞氏病纖維母細胞溶解之後變異體之MU-Gal活性。亦如實例5中所描述，測試變異體在培育之後在法布瑞氏病纖維母細胞中之Gb3耗乏。

表 9-1. GLA 變異體之相對效能 ( 相對於 SEQ ID NO: 374 而言 )¹
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 374 而言 )	未經攻擊 FIOPC	穩定性 FIOPC	溶解物 FIOPC	Gb3 耗乏 FIOPC
523/524	P10T/E39M/R44L/T47S/P337A	+
525/526	P10T/R44L/H92Y	++
527/528	R44L/T47S/P166S	+
529/530	A206K/R217F	++
531/532	E39M/T47S/H92Y/T392M		+
533/534	P10T/E39M/H92Y/W131G/P166S/A271H/D316L/I322M	+		+
535/536	E39M/T47S/R217F/D247N/A368W				+
537/538	H92Y/P166S/D247N				+
539/540	H92Y/R217F				+
541/542	P10T/A206K				++
543/544	P10T/D316L/T392M				++
545/546	P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M				+
547/548	P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/K302Q/I322M				+
549/550	P10T/E39M/R44L/H92Y/R217F/K302Q/I322M				+
551/552	P10T/E39M/R44L/T47S/D316L				+
553/554	P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/R217F				++
555/556	P10T/H92Y/K302Q/P337A				+
557/558	P10T/R44L/H92Y/R217F/D247N/A271H/K302Q/D316L/T392M				+
559/560	P10T/R44L/T47S/P166S/A271H/I322M/A368W				++
561/562	P10T/R44L/T47S/R217F/A271H/D316L/I322M				+
563/564	R44L/T47S/H92Y/T392M				+
565/566	T47S/A271H				++
567/568	T47S/P166S/A206K/R217F/D247N/P337A				+
569/570	E39M/R44L/P166S/A271H/P337A/A368W/T392M				+
571/572	E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/T392M				+
573/574	H92Y/A206K/I322M				+
575/576	P10T/E39M/R44L/H92Y/K302Q/I322M				+
577/578	P10T/E39M/R44L/T392M				+
579/580	R44L/T47S				+
581/582	D247N/D316L				+
583/584	D316L/P337A/T392M				+
585/586	D52N/R217F/K302Q/D316L				+
587/588	H92Y/P166S/A206K/A271H/D316L				+
589/590	P10T/G261A/P337A/T392M				+
591/592	P10T/K36M/H92Y/P166S/D247N/G261A/D316L/T392M				++
593/594	H92Y/R217F/A271H/P337A				++
595/596	P10T/A368W				+
597/598	P10T/E39M/H92Y/P166S/R217F/D247N/A271H				+
599/600	P10T/R44L/T47S/P166S/G261A/A271H				+
601/602	R44L/D316L/I322M/T392M				++
603/604	E39M/R44L/T47S/A206K/P337A/A368W/T392M	+			++
605/606	P10T/R44L/A206K/D316L/I322M	+			+
607/608	E39M/R44L/P166S/A271H	++			++
609/610	E39M/T47S/D247N	++			+
611/612	P10T/A206K/D247N/G261A	+++			++
613/614	P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/T392M	+			++
615/616	P10T/R44L/P166S/K302Q	+++			++
617/618	P10T/T47S/H92Y/A271H/K302Q	+			+
619/620	R44L/T47S/P166S/A271H	++			++
621/622	E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/D247N/G261A	+++	+++		++
623/624	E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/T392M	+++	++++		+++
625/626	P10T/E39M/T47S/H92Y/P337A	++	+++		+
627/628	P10T/H92Y/P166S/R217F/D247N/G261A/A271H			++	+
629/630	P10T/T47S/P166S/D316L			+	++
631/632	P10T/T47S/H92Y/D316L/I322M/T392M			++	++
633/634	R217F/T392M			++	+
635/636	E39M/P166S/R217F/G261A/D316L/A368W			+++	+++
637/638	E39M/T47S/P166S/R217F/G261A/T392M			++	++
639/640	P10T/E39M/H92Y/R217F/D316L			+++	++
641/642	D316L/I322M/A368W	+		+++	++
643/644	H92Y/P166S/D316L	+		+++	+++
645/646	H92Y/P166S/R217F/D316L/P337A/T392M	+		+++	+++
647/648	H92Y/P166S/R217F/G261A/A271H/T392M	+++		+++	+++
649/650	P10T/H92Y/D316L/I322M	+++		++++	+++
651/652	P10T/H92Y/P166S	+		++	+++
653/654	P10T/H92Y/P166S/P337A/A368W	+		++	++
655/656	P10T/R217F/I322M	+		+++	+++
657/658	P10T/T47S/H92Y/P166S/A271H/D316L/P337A	+		+++	++
659/660	P10T/T47S/P166S/A271H	++		++	++
661/662	P166S/D247N/A271H/D316L	+		++	+
663/664	P166S/D316L/I322M/P337A	+		+	+
665/666	P166S/R217F/D316L/I322M/P337A	+		+++	++
667/668	R44L/T47S/D247N/A271H/T392M	+++		+++	++
669/670	T47S/A206K	+++		+	+++
671/672	T47S/P166S/R217F/A271H/P337A	+		+	+++
673/674	R44L/T47S/H92Y/R217F/A271H	++		+++	+++
675/676	H92Y/G261A/A271H		+++	++	++
677/678	P10T/E39M/R44L/P166S/G261A/A271H/D316L/I322M		+	++	+++
679/680	P10T/H92Y/P166S/G261A/A271H/T392M		+++	+	+++
681/682	T47S/R217F/D247N/G261A		+	+++	+
683/684	E39M/H92Y/G261A/K302Q	+++	++++	+	+
685/686	E39M/H92Y/P166S/R217F/T392M	+++	+++	+++	++
687/688	E39M/I322M	+++	+++	++	++
689/690	E39M/R44L/H92Y/P166S/D247N/G261A/K302Q/P337A	+++	++++	+	+
691/692	E39M/T392M	+	+++	++	+
693/694	E39M/T47S/H92Y/D316L/I322M	+	+++	+	+
695/696	H92Y/A271H	+++	++++	++++	+++
697/698	P10T/E39M	+++	+++	++++	+++
699/700	P10T/G261A	++	++++	+++	++
701/702	P10T/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M/P337A	++	+++	+++	+++
429/430	R44L/P337A	+	+	+	+++
431/432	R44L/T47S/H92Y/R217F/D316L/I322M/T392M	+++	++	+++	+++
¹ 所有活性皆相對於具有SEQ ID NO: 374之參考多肽而言加以測定。經提高之活性位準定義如下：「+」= 0.75-0.9；「++」＞ 0.9；「+++」＞ 1.1；以及「++++」＞ 2。

實例10 GLA 變異體之活體內表徵

就GLA變異體針對所積聚之Gb3之活性而言對其進行活體內表徵。使用法布瑞氏病小鼠(5月齡雌性；Jackson，存料編號3535)以及年齡/性別匹配之具有相同遺傳背景之野生型小鼠。經由尾部靜脈向小鼠投與Codexis酶變異體之單次IV注射(1.0 mg/kg)。在經排程時間點(注射後1週及2週)使用CO₂ 麻醉處死動物，且將疾病相關組織(例如心臟及腎)解剖成二個部分(一個部分用於酶活性分析，另一部分用於Gb3定量)，在乾冰上冷凍，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。在玻璃均質機中使用馬達驅動之經TEFLON^® 塗佈之研杵在溶解緩衝液(稀釋於1×PBS中之0.2% TRITON X-100™非離子界面活性劑(Sigma編號93443))中以20×體積(w/v)均質化小鼠組織以進行酶分析。對溶解物進行音波處理，在4℃下在14,000 rpm下離心15 min，且使用上清液進行酶分析。藉由在存在0.1 M N-乙醯半乳胺糖(亦即α-半乳糖苷酶B之特定抑制劑)之情況下使用5 mM 4-甲基香豆素基-α-D-半乳哌喃糖苷pH 4.4進行標準螢光分析來量測α-Gal A活性。使用BCA蛋白質分析套組(Pierce，編號23225)來量測蛋白質濃度。以蛋白質濃度標準化活性且表示為nmol/mg蛋白質/小時。如先前所描述(參見Durant等人, J. Lipid Res., 52:1742-6 [2011])，藉由質譜法量測Gb3濃度。簡言之，在玻璃均質機中在冰冷20×體積之超純水中均質化小鼠組織，且使對應於200 μg總蛋白質之溶解物經受醣神經鞘脂質提取、皂化及後續藉由質譜法進行之Gb₃ 分析。Gb₃ 濃度表示為ng/mg蛋白質。圖5提供顯示治療後1週、2週及4週法布瑞氏病小鼠模型中心臟中之活體內酶活性的圖。圖6.提供相較於未經治療動物而言之治療後1週及2週法布瑞氏病小鼠模型中心臟組織中之Gb3降解圖。實例11 衍生自SEQ ID NO: 704 之GLA 變異體

在此實例中，所進行之用於評估GLA變異體之活性、血清穩定性、在法布瑞氏病纖維母細胞中之胞內活性及法布瑞氏病纖維母細胞中藉由GLA變異體進行之Gb3清除的實驗得到描述。在此等實驗中，如實例5中所描述，測試相對於SEQ ID NO: 704 (SEQ ID NO: 704為來自SEQ ID NO: 703之胺基酸序列，SEQ ID NO: 703為酵母菌密碼子最佳化之SEQ ID NO: 275的哺乳動物密碼子最佳化之型式)而言在無預培育之情況下、在血清培育之後GLA變異體在法布瑞氏病纖維母細胞溶解物中之MU-Gal活性。亦如實例5中所描述，測試變異體在法布瑞氏病纖維母細胞中之Gb3耗乏。

表 11-1. GLA 變異體之相對效能 ( 相對於 SEQ ID NO: 704 而言 )¹
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 704 而言 )	未經攻擊 FIOPC	穩定性 FIOPC	溶解物 FIOPC	Gb3 耗乏 FIOPC
705/706	A254T/L398F			++
707/708	A271N	+	+
709/710	A271N/F352N/Q391N	++	+++
711/712	A271N/G333N	+++	++
713/714	A271N/G333N/M390N/Q391N	++	+
715/716	A271N/G333N/Q391N	++	+
717/718	A278N			++	+
719/720	A278R	++	++
721/722	A278S	+++	+++	++	++
723/724	A287R	+	+	+++
725/726	A339G	++	+	+++	+
727/728	A339N	+++	+++	+++
729/730	A339Q	+++	+++	+++
731/732	A339V	++	+	++	++
733/734	C143S	+++	+++	+++	++
735/736	C143S/A271N	++	+++	+
737/738	C143S/A271N/F352N/M390N	+++	+++
739/740	C143S/D202N	++	+++	+	+
741/742	C143S/E387N/Q391N	++	++
743/744	C143S/G333N	++	++
745/746	C143S/G333N/E387N/M390T	+++	+++		+
747/748	C59A	+++	+++	+++	++
749/750	C59A/C143S	+++	+++	+++	++
751/752	C59A/C143S/A271N	+	++
753/754	C59A/D202N	++	+++	++	++
755/756	C59T	+			++
757/758	C59T/C143S/D202N	+++	+++	+	++
759/760	C59T/C143S/G333N	++
761/762	C59T/D202N/G333N	++			+
763/764	C59V/A271N/E387N/M390T	+++
765/766	C59V/C143S/D202N/A271N/G333N	++
767/768	D122E	++	+++	+
769/770	D122N	++	++	+
771/772	D122S	+		++
773/774	D202N	+	++
775/776	D202N/G333N	+			++
777/778	D24S/A271N/F352N	++
779/780	D24S/C143S/D144N	++			+
781/782	D24S/C143S/D202N/F352N/M390N/Q391N	++	++
783/784	D24S/C143S/D202N/G333N	++			+
785/786	D24S/C143S/G333N/F352N/E387N/M390T/Q391N	+++
787/788	D24S/C143S/M390T/Q391N	+			++
789/790	D24S/C59A	++			++
791/792	D24S/D202N	++	++		++
793/794	D24S/D202N/A271N	++	++
795/796	D24S/D202N/G333N/F352N	+
797/798	D24S/E387N/Q391N	++	+
799/800	D24S/F352N/E387N/M390N/Q391N	+++	++
801/802	D284A	++	++	+++
803/804	D284E	+++	+++	+++
805/806	D284G	+		+++	+
807/808	D284L			+++	+
809/810	D284M	++	++	+++
811/812	D284R	++	+	+++
813/814	D284S	++	++	++++
815/816	D2S	++			+++
817/818	D304T	++	++		+++
819/820	D304V	+			+++
821/822	D304W			++	+++
823/824	E147L	++
825/826	E147S	++	++
827/828	E367A	+++	+++
829/830	E367D	++	++	+	+
831/832	E367L	++	+++	+++	+
833/834	E367M	++	+	+++
835/836	E387N/Q391N	+++	+++
837/838	E40Q	+		++
839/840	G164E	++
841/842	G303A	++	++	+
843/844	G303C	++	+	++
845/846	G303W	+++	+++	+++
847/848	G333N/F352N	++
849/850	G333N/M390N/Q391N	+++	+++
851/852	G333N/M390S/Q391N	+++	+
853/854	G333N/Q391N	+++	++		+
855/856	G4L	+			++
857/858	G73A				++
859/860	H155A	+++	+++	+
861/862	H155D	+++	+++
863/864	H155F	+++	++	+++	+++
865/866	H155L	++			+++
867/868	H155R	++	+++
869/870	H155T	++	+++	+
871/872	H375L	++	++		++
873/874	H375Q	++	+++
875/876	H84G	++	++	+	++
877/878	H84K	+++	+++	+++	+++
879/880	H84R	+		+++
881/882	I123Q	++	+++	++
883/884	I123R	++	+	+++
885/886	I123S	+		++	+
887/888	I123T	++	++	++
889/890	I336F	++	++	++
891/892	I336G				++
893/894	I336S			+	++
895/896	I336T	++	++	++	++
897/898	K277Q				+++
899/900	K277V			++	+++
901/902	K283L	++	+	+++
903/904	K283P	++	+++	+++
905/906	K283T	+	+	+++	++
907/908	K283V	+	+	+++
909/910	K343L	++	++	++	++
911/912	K343R	+++	+++	+++
913/914	K343S	++	++	+
915/916	K343W			++
917/918	K360H	++	++	+	+
919/920	K360V				++
921/922	K362H	++	+++
923/924	L280G				++
925/926	L300F	++	+	+++
927/928	L341F	++	+	++	++
929/930	L341M	++	++	++
931/932	L398F	++	++	+++
933/934	L5M	+	++
935/936	L5V	+++	+++	++
937/938	M390S	++	++
939/940	N218Y	++	+	+++
941/942	N218Y/L398F	+++	+	+++
943/944	N218Y/R361T	++		+++
945/946	N218Y/R361T/L398F	++	+	+++
947/948	N377Q	++
949/950	N91S/T215S/R361T	++		++
951/952	P179H	+++	+++		+++
953/954	P179L				++
955/956	P179R	+++	+++
957/958	P179W	++
959/960	P331M	++	+
961/962	P83R				+++
963/964	P83S				+++
965/966	Q275A	+++	+++	+++	+++
967/968	Q275G	+	++	++
969/970	Q281I				++
971/972	Q281M				++
973/974	Q385R	+	+	+++
975/976	Q76A	+		++
977/978	Q76F	+		+++
979/980	Q76M	++	+++	++
981/982	Q76S			+++
983/984	Q80T	++	+++	++
985/986	R165I	++
987/988	R325A	++
989/990	R332G	++
991/992	R332H	+++
993/994	R361T	++	++	+++
995/996	R361V	++	+++	+++	+++
997/998	R371G	+++	+++	+++
999/1000	R373L	+++	+++	+
1001/1002	R373S	+++	++	++
1003/1004	S210I				+++
1005/1006	S273L	+		+++
1007/1008	S31F	++	+	++
1009/1010	S31H	++	+++	+	++
1011/1012	S31L	++	+++	+++
1013/1014	S31T	++	++	+++
1015/1016	S31W				++
1017/1018	S340H	+++	+++	++	++
1019/1020	S340I	+++	+++	+++
1021/1022	S340K	+++	+++	+++	+++
1023/1024	S340M	+++	+++	+++
1025/1026	S340P	++	++	+++
1027/1028	S340W	++	++	+++
1029/1030	T186E	++	++
1031/1032	T186F	++	++
1033/1034	T186M	+++	++
1035/1036	T186P	++
1037/1038	T186R	++	+
1039/1040	T186S	+++	++
1041/1042	T186Y	++	+++
1043/1044	T215S/N218Y	++	+	+++
1045/1046	T335A	+	+	++	++
1047/1048	T335L	++	+	++
1049/1050	T369D	+++	+++	+++
1051/1052	V338L	++	++	++
1053/1054	V359F	++	++	++
1055/1056	V359L	+++	+++	++
1057/1058	V359R	++	++	++
1059/1060	V382I			+++
1061/1062	V382I/L398F	++	++	+++
1063/1064	W246Y	++	++	++	++
1065/1066	Y334C	++	++	+++	++
1067/1068	Y334V	+++	+++	+++	+
¹ 所有活性皆相對於具有SEQ ID NO: 704之參考多肽而言加以測定。經提高之活性位準定義如下：「+」= 0.75-0.9；「++」＞ 0.9；「+++」＞ 1.1；以及「++++」＞ 2。

實例12 衍生自SEQ ID NO: 374 之GLA 變異體

在此實例中，所進行之用於評估GLA變異體之活性、血清穩定性、在法布瑞氏病纖維母細胞中之胞內活性及法布瑞氏病纖維母細胞中藉由GLA變異體進行之Gb3清除的實驗得到描述。在此等實驗中，如實例5中所描述，測試在無預培育之情況下、在血清培育之後GLA變異體在法布瑞氏病纖維母細胞溶解物中之MU-Gal活性。亦如實例5中所描述，測試變異體在法布瑞氏病纖維母細胞中之Gb3耗乏。

表 12-1. GLA 變異體之相對效能 ( 相對於 SEQ ID NO: 374 而言 )¹
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 374 而言 )	未經攻擊 FIOPC	穩定性 FIOPC	溶解物 FIOPC	Gb3 耗乏 FIOPC
1069/1070	A206C	+	+	+	+++
1071/1072	A206D	+	+	+	+
1073/1074	A206E	+++	+++	++	+++
1075/1076	A206F	++	++	+	+++
1077/1078	A206G	+++	++	+	++
1079/1080	A206H	+++	+++	++	++
1081/1082	A206I	++	+++	+++	++++
1083/1084	A206K	++	++	+	++++
1085/1086	A206L	++	++	+	++
1087/1088	A206M	++	+++++	+++	+++
1089/1090	A206N	++	++	++	+
1091/1092	A206P	+	+	-	+++
1093/1094	A206Q	++	++	+++	++++
1095/1096	A206R	++	+++	+++	+
1097/1098	A206S	-	-	-	+
1099/1100	A206T	+++	+++	+++	++
1101/1102	A206V	++	+++	+++	+++
1103/1104	A206W	+	+	+	+++
1105/1106	A206Y	++	++	++	++++
1107/1108	A271C	+	+	+	+
1109/1110	A271D	++	++	+	++
1111/1112	A271E	+++	++++	++	+
1113/1114	A271F	+	+	+	+
1115/1116	A271G	++	+	++	+
1117/1118	A271H	+	+	+	+
1119/1120	A271I	+	+	+	++++
1121/1122	A271K	+++	++++	++++	+
1123/1124	A271L	+	+	++	+
1125/1126	A271M	+	+	+	+
1127/1128	A271N	++++	++++	++	+
1129/1130	A271P	+	+	-	++++
1131/1132	A271Q	+	+	+	+
1133/1134	A271R	+++	++++	++++	+
1135/1136	A271S	++++	+++++	+	+
1137/1138	A271T	++	++++	+	-
1139/1140	A271V	+++	++	++	+
1141/1142	A271W	+	+	++++	++
1143/1144	A271Y	+	-	-	-
1145/1146	A368C	+++	++++	+++	+
1147/1148	A368D	+++	++++	++++	+
1149/1150	A368E	+++	+++	++	+++
1151/1152	A368F	+++	++	++	+
1153/1154	A368G	+	++++	+	-
1155/1156	A368H	+++	++	+++	+
1157/1158	A368I	++	+++	+++	+
1159/1160	A368K	+	+	+	+
1161/1162	A368L	++	+	+	+
1163/1164	A368M	++++	++++	+++	+
1165/1166	A368N	+++	+++	++	+
1167/1168	A368P	++	+++	+++	+
1169/1170	A368Q	+	++	+++	++
1171/1172	A368R	++	++	++	+
1173/1174	A368S	++	++	+	+
1175/1176	A368T	+++	+	+	+
1177/1178	A368V	+	+	+	+
1179/1180	A368W	++	+++	+++	+
1181/1182	A368Y	+++	+++	++++	+
1183/1184	D247A	+	++	+	+
1185/1186	D247C	+	+	+	-
1187/1188	D247E	+	+	++	+
1189/1190	D247F	+	-	+	+
1191/1192	D247G	+	++++	+	++
1193/1194	D247H	+	++++	+	+++
1195/1196	D247I	+	-	+	+
1197/1198	D247K	-	-	+	-
1199/1200	D247L	+	+	+	+
1201/1202	D247M	+	+	+++	+
1203/1204	D247N	++	++	+	++
1205/1206	D247P	+	+	+	++
1207/1208	D247Q	+	+	+	+
1209/1210	D247R	+	-	+	-
1211/1212	D247S	++	+++	+	+
1213/1214	D247T	+	+	++	++
1215/1216	D247V	+	-	+	-
1217/1218	D247W	+	+++	+	+
1219/1220	D247Y	+	+	+	+
1221/1222	D316A	+	+	+++	+
1223/1224	D316C	+	+	+	+++
1225/1226	D316E	++	+	++	++
1227/1228	D316F	+	+	++	+
1229/1230	D316G	+++	++++	++	+
1231/1232	D316H	+++	+++++	++++	+++
1233/1234	D316I	++	+	+++	+
1235/1236	D316K	++	++	+++	+
1237/1238	D316L	++	+++++	++	+
1239/1240	D316M	+	+	++	++
1241/1242	D316N	+++	+++	+++	++
1243/1244	D316P	+	+	+	+
1245/1246	D316Q	+	+	+	+
1247/1248	D316R	++	+++	+++	+
1249/1250	D316S	++	+++	+++	+
1251/1252	D316T	+	+++	++++	+
1253/1254	D316V	+	+	++	+
1255/1256	D316W	+	+	++	+
1257/1258	D316Y	++	+++	+++	+
1259/1260	E39A	+	+	+++	+
1261/1262	E39C	+	+	+	++
1263/1264	E39D	-	-	-	-
1265/1266	E39F	+	+	+	++++
1267/1268	E39G	-	-	-	+
1269/1270	E39H	++	++	++	+++
1271/1272	E39I	+	+	++	+
1273/1274	E39K	++	++	++++	+++
1275/1276	E39L	++	+++	+++	++++
1277/1278	E39M	++	+++	+	+++
1279/1280	E39N	+	+	+	+++
1281/1282	E39P	-	-	+	+
1283/1284	E39Q	+	+	++	++++
1285/1286	E39R	-	-	-	+
1287/1288	E39S	+	+	+	+++
1289/1290	E39T	+	+	++	++++
1291/1292	E39V	++	++	+	++++
1293/1294	E39W	+	+	+++	+++
1295/1296	E39Y	++	+++	++	+
1297/1298	G261A	++++	++++	+++++	+
1299/1300	G261C	++	+	+	+
1301/1302	G261D	-	-	-	-
1303/1304	G261E	-	+	-	+
1305/1306	G261F	-	-	+	+
1307/1308	G261H	-	-	+	-
1309/1310	G261I	-	-	+	-
1311/1312	G261K	-	-	-	-
1313/1314	G261L	-	-	+	-
1315/1316	G261M	-	-	+	-
1317/1318	G261N	-	-	-	-
1319/1320	G261P	+	-	+	+
1321/1322	G261Q	-	-	+	-
1323/1324	G261R	-	+	-	-
1325/1326	G261S	++++	++++	++++	+
1327/1328	G261T	++	-	+	-
1329/1330	G261V	+	-	+	+
1331/1332	G261W	-	-	+	-
1333/1334	G261Y	-	-	-	+
1335/1336	H92A	+	+	+++	+
1337/1338	H92C	+	+	+	+
1339/1340	H92D	+	+	+	+
1341/1342	H92E	+	+	+++	++
1343/1344	H92F	+++	+++	+++	+
1345/1346	H92G	+	+	+	+
1347/1348	H92I	++	+	+	+
1349/1350	H92K	+++	+++	+++	+
1351/1352	H92L	++	+++	+++	+
1353/1354	H92M	+	+	+	+
1355/1356	H92N	+	+	+	++
1357/1358	H92P	-	-	-	-
1359/1360	H92Q	++	++	++	++++
1361/1362	H92R	++	++	+	+++
1363/1364	H92S	++	+++	+++	+
1365/1366	H92T	++++	+++++	++++	+
1367/1368	H92V	+++	+++++	+++	++++
1369/1370	H92W	++	++	++	+++
1371/1372	H92Y	++	++	+++	++
1373/1374	I322A	+	+	+	+
1375/1376	I322C	+	+	+	+
1377/1378	I322D	-	-	-	+
1379/1380	I322E	+	+	+	+
1381/1382	I322F	+	+	++	+
1383/1384	I322G	+	-	+	-
1385/1386	I322H	-	-	+	-
1387/1388	I322K	+	+	+	-
1389/1390	I322L	+	++	++	+
1391/1392	I322M	+	+++	++++	+
1393/1394	I322N	-	+	+	-
1395/1396	I322P	-	-	+	+
1397/1398	I322Q	+	+	+	+
1399/1400	I322R	-	-	+	-
1401/1402	I322S	+	-	+	++
1403/1404	I322T	+	+	+	++
1405/1406	I322V	+	+	+	+
1407/1408	I322W	+	+	+	-
1409/1410	I322Y	+	+	+	-
1411/1412	K302A	+	+	+	+
1413/1414	K302C	+++	+++	+++	+
1415/1416	K302D	+	+	+	+
1417/1418	K302E	+	+	+	+
1419/1420	K302F	++	+++	+++	+
1421/1422	K302G	+++	++++	++	+
1423/1424	K302H	++++	++++	++++	+
1425/1426	K302I	+	+	++	+
1427/1428	K302L	+++	+++++	++++	++++
1429/1430	K302M	++	++++	+++	+
1431/1432	K302N	+	+	+	+
1433/1434	K302P	+	+	+	+
1435/1436	K302Q	++	+	++	++
1437/1438	K302R	+	+	++	+
1439/1440	K302S	++	+	+	+
1441/1442	K302T	+++	++++	++++	++
1443/1444	K302V	++	+++	++	+
1445/1446	K302W	+	+++++	+++	+
1447/1448	K302Y	+++	+++	++++	+
1449/1450	P10A	++	+	+	++
1451/1452	P10C	+	++	+	-
1453/1454	P10D	+	-	+	+
1455/1456	P10E	+	-	+	+
1457/1458	P10F	-	+	-	-
1459/1460	P10G	+++	++++	+++	+++
1461/1462	P10H	+	-	+	+
1463/1464	P10I	+	+	+	++++
1465/1466	P10K	+	-	+	+
1467/1468	P10L	-	-	-	-
1469/1470	P10M	++	-	+	+++
1471/1472	P10N	+	-	+	+
1473/1474	P10Q	+	+	+	+++
1475/1476	P10R	+	+	+	++++
1477/1478	P10S	+	+	+	+++
1479/1480	P10T	+	++	++	+
1481/1482	P10V	+	+	+	+
1483/1484	P10W	-	-	-	-
1485/1486	P10Y	-	-	-	++
1487/1488	P166A	++	+	++	+
1489/1490	P166C	+	-	+	+
1491/1492	P166D	++++	++++	+++	+
1493/1494	P166E	++	++	+	++
1495/1496	P166F	+	+	+	+
1497/1498	P166G	-	-	-	-
1499/1500	P166H	+	+	++	+
1501/1502	P166I	+	-	+	+
1503/1504	P166K	++	+	+	++
1505/1506	P166L	+	+	+	++++
1507/1508	P166M	+	+	+	+
1509/1510	P166N	+	+	+	++++
1511/1512	P166Q	-	-	-	-
1513/1514	P166R	+	+	++	+++
1515/1516	P166S	+	+	+	+++
1517/1518	P166T	+	+	+	+++
1519/1520	P166V	-	-	-	-
1521/1522	P166W	-	-	-	+
1523/1524	P166Y	++	+	++	+
1525/1526	P337A	+	+	+	+
1527/1528	P337C	+	+	+	+++
1529/1530	P337D	++	++++	++	-
1531/1532	P337E	+	+	+	-
1533/1534	P337F	++	+++++	++++	++++
1535/1536	P337G	+	+	+	+
1537/1538	P337H	++	+++	+	++
1539/1540	P337I	++	+	++++	+
1541/1542	P337K	+	++	++	+
1543/1544	P337L	++	+	++	+
1545/1546	P337M	+	+	+	+++
1547/1548	P337N	++	++	+	+
1549/1550	P337Q	+	++	+	+
1551/1552	P337R	++	+++	+++	+
1553/1554	P337S	+++	+++++	++++	+
1555/1556	P337T	+	++	++	+
1557/1558	P337V	+	+	+	+
1559/1560	P337W	+	+	+++++	++
1561/1562	P337Y	+++	+	+++	-
1563/1564	R217A	++	+++	++	+
1565/1566	R217C	+	+	+	++++
1567/1568	R217D	+	++	+	++++
1569/1570	R217E	+++	+++	+++	+
1571/1572	R217F	++	+	+++	+++
1573/1574	R217G	+++	+++	+++	+
1575/1576	R217H	++	++	+	+++
1577/1578	R217I	+++	+++	+++	+++
1579/1580	R217K	++	++	+	++++
1581/1582	R217L	+	+	+	++
1583/1584	R217M	+	+	+	++
1585/1586	R217N	+++	+++	++	+++
1587/1588	R217P	++	+	+	+++
1589/1590	R217Q	++	++	++	+
1591/1592	R217S	+++	+++	+++	+++
1593/1594	R217T	+	-	+	+++
1595/1596	R217V	++	++	+	++
1597/1598	R217W	+++	+	++++	++
1599/1600	R217Y	+	+	++	+
1601/1602	R44A	++	+	+	+
1603/1604	R44C	++	+++	+	+
1605/1606	R44D	+	-	+	+
1607/1608	R44E	++	+	+	+
1609/1610	R44F	+++	+++	++	+
1611/1612	R44G	+	+	+	+
1613/1614	R44H	+	+	+	++
1615/1616	R44I	+++	+++	+	++
1617/1618	R44K	+++	+++	++	+
1619/1620	R44L	+	+	+	+++
1621/1622	R44N	+	++	++	+
1623/1624	R44P	-	-	+	+
1625/1626	R44Q	+++	++++	+++	+
1627/1628	R44S	++	++	++	++++
1629/1630	R44T	+	+	+	++++
1631/1632	R44V	+++	+++	++++	+
1633/1634	R44W	+	+	+	+
1635/1636	R44Y	+	+	+	++++
1637/1638	T392A	++	++	++	++++
1639/1640	T392C	+	+	+	+++
1641/1642	T392D	+++	++++	+++	++
1643/1644	T392E	+++	+++++	++++	++++
1645/1646	T392F	+	+	+	++
1647/1648	T392G	+	++	+	++
1649/1650	T392H	++	+++	++	+
1651/1652	T392I	+	+	+++	+
1653/1654	T392K	++	+++	+	+++
1655/1656	T392L	++	++	+	+++
1657/1658	T392M	+	++	+	+++
1659/1660	T392N	++	+++	++++	+
1661/1662	T392P	+++	+++	++	+++
1663/1664	T392Q	++	+	+	+++
1665/1666	T392R	++	+++	+	++
1667/1668	T392S	++	+++	+++	++++
1669/1670	T392V	++	+++	++	++
1671/1672	T392W	+	+	+++	++++
1673/1674	T392Y	+	+	+	+
1675/1676	T47A	++	+++	+++	+
1677/1678	T47C	+	+	+	-
1679/1680	T47D	+	+	+	+
1681/1682	T47E	+	+	+	+++
1683/1684	T47F	+	+	+	+++
1685/1686	T47G	+	+	+	+++
1687/1688	T47H	++	+	+++	+
1689/1690	T47I	++	+	++	++
1691/1692	T47K	+	++	+++	+
1693/1694	T47L	+	+	+	+
1695/1696	T47M	+	+	+++	+
1697/1698	T47N	++	++	++	+++
1699/1700	T47P	-	-	-	++
1701/1702	T47Q	+	+	+	++++
1703/1704	T47R	+++	++++	++++	+
1705/1706	T47S	+	+	+	++
1707/1708	T47V	++	+++	++++	+
1709/1710	T47W	+	+	+	+
1711/1712	T47Y	+	+	++	+++
¹ 所有活性皆相對於具有SEQ ID NO: 374之參考多肽而言加以測定。經提高之活性位準定義如下：「-」＜ 0.1；「+」為0.1-0.9；「++」＞ 0.9；「+++」＞ 1.1；「++++」＞ 1.5；以及「+++++」＞ 2.5。

實例13 衍生自SEQ ID NO: 1022 之GLA 變異體

在此實例中，所進行之用於評估活性、血清穩定性及在法布瑞氏病纖維母細胞中之胞內活性的實驗得到描述。在此等實驗中，如實例5中所描述，測試在無預培育之情況下、在血清培育之後GLA變異體在法布瑞氏病纖維母細胞溶解物中之MU-Gal活性。

表 13-1. GLA 變異體之相對效能 ( 相對於 SEQ ID NO: 1022 而言 )¹
SEQ ID NO: (nt/aa)	胺基酸差異 ( 相對於 SEQ ID NO: 1022 而言 )	未經攻擊 FIOPC	穩定性 FIOPC	溶解物 FIOPC
1713/1714	D284S	+++	+++	++++
1715/1716	H92T/A368E	+++	++++	++++
1717/1718	K283T	+++	+++	++++
1719/1720	K283T/D284E	++	+	++++
1721/1722	D284M	+	++	+++
1723/1724	H92T	+++	+++	+++
1725/1726	H92Q	+++	+++	+++
1727/1728	S31T/T47R	++	+	+++
1729/1730	E39V/R44V/T47R/G261S/K283L/D284A	+	+	+++
1731/1732	E39L/D284S	++	+++	+++
1733/1734	A206I	+++	+++	+++
1735/1736	E39V/R44V/K283T	+++	+++	+++
1737/1738	H92V/Q275A/D284S	+	+	+++
1739/1740	H92T/K283P	+++	+++	+++
1741/1742	H92T/D284M	++	+	+++
1743/1744	H155F	+++	++	+++
1745/1746	K302L	+++	+++	+++
1747/1748	G261S	+++	+++	+++
1749/1750	A271K/A368E	+++	+++	+++
1751/1752	H84K/H92V	+++	+++	+++
1753/1754	H92T/A271K	+++	+++	+++
1755/1756	H92V/A206E/D284S	+++	+++	+++
1757/1758	G261S/K283L	+	+	+++
1759/1760	S31T	+	+	+++
1761/1762	H84K/D284S/K302L/T392A	++	++	+++
1763/1764	E39V/R44V/T47R	+++	++	+++
1765/1766	H84K/A368E/T392A	++	+++	+++
1767/1768	D316H	+++	+++	+++
1769/1770	S31T/K283L/D284A			+++
1771/1772	A271K	++	+++	+++
1773/1774	A368E/T392W	+++	+++	+++
1775/1776	R44V	+++	++	+++
1777/1778	A206Q	++	++	+++
1779/1780	E39L	+++	++	++
1781/1782	H84K/D316H	++	+	++
1783/1784	H92T/K283V/T392W	++	+	++
1785/1786	K283L	+	+	++
1787/1788	P166D/K283L/D284A			++
1789/1790	S31T/E39V/R44V/P166D/K302Y	+		++
1791/1792	A339N	+++	+++	++
1793/1794	Y334C	+	+	++
1795/1796	E39L/H92V	+	+	++
1797/1798	H155F/A368E	++	++	++
1799/1800	H92V	+++	+++	++
1801/1802	H92V/D284S	+	+	++
1803/1804	D284E	++	++	++
1805/1806	T392W	++	+	++
1807/1808	H92V/D316H	+++	+++	++
1809/1810	K283P/T392W	+	+	++
1811/1812	A206T/Y334C	+		++
1813/1814	A368E	+++	++	++
1815/1816	E39V/T47R/G261S			++
1817/1818	Q275A	+++	++	++
1819/1820	H92V/A206Y/Q275A	+++	++	++
1821/1822	P10G	+++		+
1823/1824	H92T/A206E/R217N	+++	+++	+
1825/1826	T392A	+++	+++	+
1827/1828	T392D	++	+	+
1829/1830	E39V/R44V/A339N	+++	++	+
1831/1832	E39V/R44V	+++	+++	+
1833/1834	A206Y	++	+++	+
1835/1836	H92T/A271K/K277R	++	+	+
1837/1838	H92T/A206E/K302T/A368E	+++	+	+
1839/1840	A206E	++	+	+
1841/1842	H84K	++	++	+
1843/1844	P166D	+++	+	+
1845/1846	A206E/R217N	++	++	+
1847/1848	H155F/R217I	++	+	+
1849/1850	P10G/T392D	++		+
1851/1852	E39L/A206E	++	++	+
1853/1854	K302Y	+++	+++	+
1855/1856	H92V/K302L	++	+	+
1857/1858	H92T/K302L	++	+	+
1859/1860	P166D/K302Y	++
1861/1862	R44V/D284E/K302Y	++	+
1863/1864	P166D/K283T	+		+
¹ 所有活性皆相對於具有SEQ ID NO: 1022之參考多肽而言加以測定。經提高之活性位準定義如下：「+」= 0.5-0.9；「++」＞ 0.9；「+++」＞ 1.1；以及「++++」＞ 2。

在懸浮培養物中產生之經純化GLA 變異體之血清穩定性

為了評估在存在血液之情況下變異體之相對穩定性，使樣品暴露於血清。首先，將100 µL含7.5 μg/mL經純化GLA變異體之1×PBS pH 6.2及90 μL人類血清添加至COSTAR^® 96孔圓底盤(Corning)之孔中。將盤密封且在37℃下培育0-24 h。使50 µL經攻擊上清液與50 µL含1 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.4混合以進行分析。將反應物短暫地混合且在37℃下培育90分鐘，之後用100 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2淬滅。水解係使用ENVISION^® 微定量盤式讀取器(PerkinElmer)，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以分析。藉由將經攻擊樣品之活性除以未經攻擊樣品之活性來計算24 h之後血清中之殘餘活性%，其中對於各變異體，「未經攻擊」為在0時量測之水解，且「經攻擊」為在規定時間點量測之水解。圖7提供顯示在經人類血清攻擊0-24小時之後GLA變異體之殘餘活性之圖。在懸浮培養物中產生之經純化GLA 變異體於法布瑞氏病纖維母細胞中之細胞吸收

測定相較於參考酶(WT GLA [SEQ ID NO: 2])而言之GLA變異體之細胞吸收以評估經培養細胞吞噬變異體之總能力。將法布瑞氏病纖維母細胞(GMO2775，科里爾醫學研究所)接種至含有最低必需培養基(MEM；Gibco編號11095-080，補充有1%非必需胺基酸(NEAA；Gibco編號11140-050)以及15%胎牛血清[Corning編號35-016-CV])之96孔培養皿(VWR，編號10861-698)中且使其生長以匯合(在37℃、5% CO₂ 下1-3天)。達到匯合之後，將經補充之MEM藉由無菌真空來移除且用1 mL/孔之無血清MEM + 1% NEAA置換。在220 nM至2 nM之劑量反應中將如實例4中所描述經純化之酶添加至細胞中且使其在37℃、5% CO₂ 下培育4小時。使細胞經100 µL無菌1×PBS/孔洗滌二次，且藉由無菌真空抽吸PBS。隨後，在含有最低必需培養基(MEM；Gibco編號11095-080，補充有1%非必需胺基酸(NEAA；Gibco編號11140-050)以及15%胎牛血清[Corning編號35-016-CV])之中培育細胞，且使其在37℃、5% CO₂ 下培育3天。3天之後，使細胞經100 µL無菌1×PBS/孔洗滌二次，且藉由無菌真空抽吸PBS。隨後，將25 μL溶解緩衝液(稀釋於1×PBS中之0.2% TRITON X-100™非離子界面活性劑[Sigma編號93443])添加至各樣品中，之後音波處理1-2分鐘，且在4℃下在12,000-14,000 RPM下離心10分鐘。使25 µL細胞溶解物樣品與25 μL含2.5 mM MUGal之McIlvaine緩衝液pH 4.6混合以進行活性分析。將反應盤密封且在37℃下培育60分鐘，之後用150 μL 0.5 M碳酸鈉pH 10.2/孔淬滅反應物。MUGal水解係使用ENVISION^® 微定量盤式讀取器(PerkinElmer)，監測螢光(激發355 nm，發射460 nm)來加以測定。圖8提供在37℃下培育4小時且清洗3天之後經培養法布瑞氏病患者纖維母細胞中之經純化GLA變異體之細胞吸收圖。實例14 GLA 變異體之活體內表徵

在此實例中，使用動物模型進行之用於表徵一些GLA變異體之實驗得到描述。用於評估小鼠中之藥物動力學概況之研究設計概述提供於表14-1中。研究係在單個階段中進行且包括36隻雄性C57Bl/6小鼠(20-25 g)。在實驗之前使動物適應至少三天。所有動物皆經由尾部靜脈接受1 mg/kg WT GLA (SEQ ID NO: 2)或GLA變異體之單次IV注射。基於在給藥日獲取之體重計算個別劑量。

表 14-1. 研究設計概述
群組編號 / 酶 SEQ ID NO:	小鼠數目	CDX 變異體 (mg/kg)	劑量體積 (mL)	給藥後血液收集時間點
1/ SEQ ID NO: 2	6	1	0.2	5、20、40以及240分鐘
2/ SEQ ID NO: 4	6	1	0.2
3/ SEQ ID NO: 58	6	1	0.2
4/ SEQ ID NO: 2	6	1	0.2	10、30、60以及360分鐘
5/ SEQ ID NO: 4	6	1	0.2
6/ SEQ ID NO: 58	6	1	0.2

在預定時間點，將約150 µL全血自六隻小鼠/測試物(根據表14-1，對於各時間點，在二組6隻小鼠之間交替)收集至經肝素化毛細管中，立即處理以獲得血漿，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。如實例5中所描述，使用標準螢光MuGal分析來量測血漿GLA活性。總體而言，GLA變異體展現相較於SEQ ID NO: 2而言優良之血漿藥物動力學概況，其中後者具有伴隨約10 min之經估計半衰期(t_1/2 )之最快清除。相比而言，GLA變異體之t_1/2 高約10倍。資料提供於表14-2中。

表 14-2. 在小鼠中 IV 投與之後 GLA 變異體之 PK 參數
酶 (SEQ ID NO:)	半衰期 ( 小時 )	C_max (µg/mL)	AUC_0-t *(µgh/mL)**	CL (L/h/kg)	Vz (L/kg)
SEQ ID NO: 2	0.15	4.96	1.26	0.792	0.170
SEQ ID NO: 4	1.58	13.3	12.37	0.076	0.174
SEQ ID NO: 58	1.70	26.6	18.25	0.051	0.125

除上文所描述之小鼠研究之外，亦進行用於測定健康大鼠中之一些GLA變異體之藥物動力學的實驗。簡要研究設計示於表14-3中。第一研究係在3個階段中進行且包括21隻大鼠。在實驗之前使動物適應至少三天。所有動物皆經由頸靜脈套管接受WT GLA (SEQ ID NO: 2)或GLA變異體之IV注射。基於在給藥日獲取之體重計算個別劑量。

表 14-3. 研究設計概述
群組編號 / 酶 SEQ ID NO:	大鼠數目	CDX 變異體 (mg/kg)	劑量體積 (mL/kg)	血液收集時間點
1/ SEQ ID NO: 2	3	1	0.5	5、10、20、30、60分鐘；4以及8小時
2/ SEQ ID NO: 6	3	1	0.5
3/ SEQ ID NO: 16	3	1	0.5
4/ SEQ ID NO: 58	3	1	0.5
5/ SEQ ID NO: 60	3	1	0.5
6/ SEQ ID NO: 40	3	1	0.5
7/ SEQ ID NO: 62	3	1	0.5

在表14-3中所示之預定時間點將血液(約0.25 mL)自各大鼠收集至EDTA分離管中，立即處理以獲得血漿，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。如實例5中所描述，使用標準螢光MuGal分析來量測血漿GLA活性。當與SEQ ID NO: 2相比時，所有GLA變異體皆展現經改善之PK特性。所有PK參數之資料提供於表14-4中。

表 14-4. 在大鼠中 IV 投與之後 GLA 變異體之 PK 參數
酶 (SEQ ID NO:)	半衰期 ( 小時 )	C_max (µRFU/mL)	AUC_0-t *(RFUh/mL)**	AUC_0-inf (RFU* 小時 / 毫升 )	CL (mL/h/kg/RFU/ng)	Vz (mL/kg/RFU/ng)
SEQ ID NO: 2	0.29	27928	25119	30043	33.29	177.7
SEQ ID NO: 6	4.03	31448	151918	204505	4.89	28.5
SEQ ID NO: 16	1.90	29612	103002	108390	9.23	25.3
SEQ ID NO: 58	2.36	28501	80216	88512	11.3	38.5
SEQ ID NO: 60	2.24	32473	79210	86890	11.5	37.2
SEQ ID NO: 40	2.03	28158	60334	64303	15.6	45.5
SEQ ID NO: 62	2.11	32811	104884	113191	8.83	26.9

大鼠PK研究2號之簡要研究設計提供於表14-5中。研究係在1個階段中進行且包括18隻大鼠。在實驗之前使動物適應至少三天。所有動物皆經由頸靜脈套管接受WT GLA (SEQ ID NO: 2)或GLA變異體之IV注射。基於在給藥日獲取之體重計算個別劑量。

表 14-5. 研究設計概述
群組編號 / 酶 SEQ ID NO:	大鼠數目	CDX 變異體 (mg/kg)	劑量體積 (mL/kg)	血液收集時間點
1/ SEQ ID NO: 2	3	1	0.5	5、10、20、30、60分鐘；4以及8小時
3/ SEQ ID NO: 4	3	1	0.5
4/ SEQ ID NO: 6	3	1	0.5
5/ SEQ ID NO: 8	3	1	0.5
6/ SEQ ID NO: 58

在表14-5中所示之預定時間點將血液(約0.25 mL)收集至EDTA分離管中，立即處理以獲得血漿，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。如實例5中所描述，使用標準螢光MuGal分析來量測血漿GLA活性。當與SEQ ID NO: 2相比時，所有劑量之GLA變異體皆產生經改善之PK特性。所有PK參數之資料提供於表14-6中。

表 14-6. 在大鼠中 IV 投與之後 GLA 變異體之 PK 參數
酶 (SEQ ID NO:)	半衰期 ( 小時 )	C_max (µRFU/mL)	*AUC_0-t (RFUh/mL)**	CL (mL/h/kg/RFU/ng)	Vz (mL/kg/RFU/ng)
SEQ ID NO: 2	0.23	21119	14268	70.1	23.6
SEQ ID NO: 4	4.24	23545	96634	7.47	45.7
SEQ ID NO: 6	2.94	21708	72432	11.68	49.5
SEQ ID NO: 8	3.43	23922	86509	9.34	46.2
SEQ ID NO: 58	2.02	23055	55193	16.96	49.3

除上文所描述之小鼠及大鼠研究之外，亦在靈長類動物模型中進行實驗。簡要研究設計示於表14-7中。研究係在1個階段中進行且包括12隻雄性食蟹獼猴(2-3 kg)。動物係源自測試設施群落且被視為原生蛋白質。所有動物皆接受WT GLA (SEQ ID NO: 2)或GLA變異體之IV注射。基於在給藥日獲取之體重計算個別劑量。

表 14-7. 研究設計概述
群組編號 / 酶 SEQ ID NO:	猴數目	CDX 變異體 (mg/kg)	劑量體積 (mL/kg)	血液收集時間點
1/ SEQ ID NO: 2	4	1	1	15、30、45、60、90分鐘；2、4、6、8、12、24以及48小時
2/ SEQ ID NO: 4	4	1	1
3/ SEQ ID NO: 58	4	1	1

在表14-7中所示之預定時間點將血液(約0.5 mL)收集至EDTA分離管中，立即處理以獲得血漿，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。如實例5中所描述，使用標準螢光MuGal分析來量測血漿GLA活性。當與SEQ ID NO: 2相比時，所有劑量之GLA變異體皆產生經改善之PK特性。所有PK參數之資料提供於表14-8中。

表 14-8. 在食蟹獼猴中 IV 投與之後 GLA 變異體之 PK 參數
酶 (SEQ ID NO:)	半衰期 ( 小時 )	C_max (µg/mL)	AUC_0-t ( *µg h/mL)**	CL (L/h/kg)	Vz (L/kg)
SEQ ID NO: 2	0.19	21.9	10.2	0.15	0.04
SEQ ID NO: 4	5.2	33.5	108	0.009	0.07
SEQ ID NO: 58	1.32	26.5	35.2	0.03	0.05

猴中第二PK研究之簡要研究設計示於表14-9中。研究係在1個階段中進行且包括12隻食蟹獼猴(3隻動物/組)。動物係源自測試設施群落且被視為GLA原生蛋白質。所有動物皆接受WT GLA (SEQ ID NO: 2)或GLA變異體之IV注射。基於在給藥日獲取之體重計算個別劑量。在以下時間點採集血液樣品：給藥前(至多3小時)、給藥後1、5、15、30分鐘；1、2、4、8、12以及24小時。

表 14-9. 研究設計概述
酶 (SEQ ID NO:)	投與途徑	TI 劑量位準 (mg/kg)	TI 濃度 (mg/mL)	TI 劑量體積 (mL/kg)
SEQ ID NO: 2	IV	1	1	1
SEQ ID NO: 158
SEQ ID NO: 704
SEQ ID NO: 1022

在表14-7中所示之預定時間點將血液(約1 mL)收集至EDTA分離管中，立即處理以獲得血漿，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。如實例5中所描述，使用標準螢光MuGal分析來量測血漿GLA活性。當與SEQ ID NO: 2相比時，所有劑量之GLA變異體皆產生經改善之PK特性。所有PK參數之資料提供於表14-10中。

表 14-10. 在猴中 IV 投與之後 GLA 變異體之 PK 參數
酶 (SEQ ID NO:)	半衰期 ( 小時 )	C_max (µg/mL)	AUC_0-t ( *µg h/mL)**	CL (L/h/kg)	Vz (L/kg)
SEQ ID NO: 2	0.23	19.7	5.63	0.185	0.061
SEQ ID NO: 158	1.96	33.2	19.8	0.051	0.144
SEQ ID NO: 704	2.46	24.5	14.8	0.074	0.266
SEQ ID NO: 1022	3.60	24.9	14.1	0.071	0.370

法布瑞氏病基因剔除小鼠中相較於 rhGLA 而言之 GLA 變異體之功效

使用法布瑞氏病小鼠(5月齡雌性；Jackson，存料編號3535)以及年齡/性別匹配之具有相同遺傳背景之野生型小鼠以評估相較於WT GLA (SEQ ID NO: 2)而言之六個GLA變異體(SEQ ID NO: 4、58、158、704、1022以及1864)的功效。一週一次向小鼠投與酶變異體(0.1、0.3或1.0 mg/kg，經由尾部靜脈注射)，持續4週(n = 5隻/組)。最後一次注射之後7天，對動物進行麻醉以執行心臟穿刺來在K3 EDTA管中進行血液收集，且隨後將其安樂死。用冷生理食鹽水執行通過心臟之全身灌注以自組織移除污染血液。將疾病相關組織(例如心臟及腎)解剖成二個部分(一個部分用於酶活性分析，另一部分用於Gb3及溶酶體Gb3定量)，在乾冰上冷凍，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。立即處理血液以獲得血漿，且儲存於-80℃下直至進行分析為止。如實例5中所描述，使用標準螢光MuGal分析來量測血漿及組織GLA活性。使用實例10中提及之方法評估血漿及組織Gb3及溶酶體Gb3含量，且如實例10中所描述均質化組織。在一些情況下，在法布瑞氏病小鼠模型中，除SEQ ID NO: 1864之外，所有GLA變異體皆比SEQ ID NO: 2更有效。

圖9以及圖10分別提供顯示最後一次治療之後7天法布瑞氏病小鼠模型中之心臟及腎中之活體內酶活性的圖。在圖9中，資料表示為平均值± SEM。使用用鄧尼特氏後實驗(Dunnett's post-test)進行之雙程ANOVA以比較結果與SEQ ID NO: 2之結果；「」，p ＜ 0.0001，相對於SEQ ID NO: 2而言之非有利之顯著改善未在此圖中示出。在圖10中，資料表示為平均值± SEM。使用用鄧尼特氏後實驗進行之雙程ANOVA以比較結果與SEQ ID NO: 2之結果；「*」p ＜ 0.05；「**」p ＜ 0.005；以及「」，p ＜ 0.0001，相對於SEQ ID NO: 2而言之非有利之顯著改善未在此圖中示出。圖11以及圖12分別提供心臟及腎組織中之Gb3降解圖。在圖11中，資料表示為平均值± SEM。使用用鄧尼特氏後實驗進行之雙程ANOVA以比較結果與SEQ ID NO: 2之結果；對於SEQ ID NO: 158以及1022，在0.1 mg/kg劑量下，「*」，p ＜ 0.05；以及對於SEQ ID NO: 158，在0.3 mg/kg劑量下，「」，p ＜ 0.0001；對於SEQ ID NO: 58、704、1022以及1864，「**」，p ＜ 0.005。在圖12中，資料表示為平均值± SEM。使用用鄧尼特氏後實驗進行之雙程ANOVA以比較結果與SEQ ID NO: 2之結果；對於SEQ ID NO: 4、58、158、704以及1022，在0.1 mg/kg劑量下，「」，p ＜ 0.0001；以及對於SEQ ID NO: 158，在0.3 mg/kg劑量下，「」，p ＜ 0.0001；對於SEQ ID NO: 4、58、704以及1022，「**」，p ＜ 0.005。圖13以及圖14分別提供心臟及腎組織中之溶酶體Gb3降解圖。在圖13中，資料表示為平均值± SEM。使用用鄧尼特氏後實驗進行之雙程ANOVA以比較結果與SEQ ID NO: 2之結果。在圖14中，資料表示為平均值± SEM。使用用鄧尼特氏後實驗進行之雙程ANOVA以比較結果與SEQ ID NO: 2之結果；對於SEQ ID NO: 4、58、158，在0.1 mg/kg劑量下，「**」，p ＜ 0.005；對於SEQ ID NO: 704，「*」，p ＜ 0.05。

儘管本發明已參考特定實施例加以描述，但各種改變可被作出且等效方案可經取代以適應特定情形、材料、物質組成、方法、一或多個方法步驟，藉此在不脫離所主張內容之範疇之情況下達成本發明的效益。

在美國出於所有目的，本揭露內容中所引用之每一個公開案以及專利文獻均以引用之方式併入本文中，如同各該公開案或文獻經特定地且個別地指示以引用之方式併入本文中一般。公開案以及專利文獻之引用意欲為以下指示：任何該文獻不為相關先前技術，且不構成承認該文獻之內容或日期。

(無)

圖1提供顯示在30-50℃溫度下培育1小時之後GLA變異體之相對活性之圖。

圖2提供顯示在37℃下經人類血清攻擊0-24小時之後GLA變異體之相對活性之圖。

圖3提供顯示在37℃下經人類溶酶體提取物攻擊0-24小時之後GLA變異體之相對活性之圖。

圖4提供顯示相較於野生型而言在37℃下與經培養法布瑞氏病患者纖維母細胞一起培育4小時之後表示為相對活性之不同經純化GLA變異體之細胞吸收的圖。

圖5提供顯示相較於SEQ ID NO: 2而言在投與後1、2及4週時法布瑞氏病小鼠心臟中之GLA變異體之活性的圖。

圖6提供顯示在投與後1及2週時經GLA變異體治療之法布瑞氏病小鼠心臟中之殘餘Gb₃ 的圖。

圖7提供顯示在經人類血清攻擊0-24小時之後GLA變異體之殘餘活性之圖。

圖8提供顯示在37℃下培育4小時且清洗3天之後經培養法布瑞氏病患者纖維母細胞中之經純化GLA變異體之細胞吸收的圖。

圖9提供顯示在最後一次治療之後7天法布瑞氏病小鼠模型中之心臟中之活體內酶活性的圖。

圖10提供顯示在最後一次治療之後7天法布瑞氏病小鼠模型中之腎中之活體內酶活性的圖。

圖11提供顯示心臟組織中之Gb3降解之圖。

圖12提供顯示腎組織中之Gb3降解之圖。

圖13提供顯示心臟組織中之溶酶體Gb3降解之圖。

圖14提供顯示腎組織中之溶酶體Gb3降解之圖。

(無)

Claims

一種重組α半乳糖苷酶A及/或生物活性重組α半乳糖苷酶A片段，其包含與SEQ ID NO: 374、704及/或1022包含至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之一胺基酸序列。
如請求項1之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之一多肽序列或其一功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：2、4、5、24/59、24/143/144、24/143/202/333、24/143/202/352/390/391、24/143/333/352/387/390/391、24/143/390/391、24/202、24/202/271、24/202/333/352、24/271/352、24/352/387/390/391、24/387/391、31、40、59、59/143、59/143/202、59/143/202/271/333、59/143/271、59/143/333、59/202、59/202/333、59/271/387/390、73、76、80、83、84、91/215/361、122、123、143、143/202、143/271、143/271/352/390、143/333、143/333/387/390、143/387/391、147、155、164、165、179、186、202、202/333、210、215/218、218、218/361、218/361/398、218/398、246、254/398、271、271/333、271/333/390/391、271/333/391、271/352/391、273、275、277、278、280、281、283、284、287、300、303、304、325、331、332、333/352、333/390/391、333/391、334、335、336、338、339、340、341、343、359、360、361、362、367、369、371、373、375、377、382、382/398、385、387/391、390以及398，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 704加以編號。
如請求項1之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶包含與SEQ ID NO: 8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之一多肽序列或其一功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、39、44、47、92、166、206、217、247、261、271、302、316、322、337、368以及392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 374加以編號。
如請求項1之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶包含與SEQ ID NO: 58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之一多肽序列或其一功能片段，且其中該重組α半乳糖苷酶A在選自以下之一或多個位置處包含至少一個取代或取代集：10、10/392、31、31/39/44/166/302、31/47、31/283/284、39、39/44、39/44/47、39/44/47/261/283/284、39/44/283、39/44/339、39/47/261、39/92、39/206、39/284、44、44/284/302、84、84/92、84/284/302/392、84/316、84/368/392、92、92/206/217、92/206/275、92/206/284、92/206/302/368、92/271、92/271/277、92/275/284、92/283、92/283/392、92/284、92/302、92/316、92/368、155、155/217、155/368、166、166/283/284、166/302、206、206/217、206/334、261、261/283、271、271/368、275、283、283/284、283/392、284、302、316、334、339、368、368/392以及392，其中該多肽序列之胺基酸位置係參考SEQ ID NO: 1022加以編號。
如請求項1之重組α半乳糖苷酶A，其中該α半乳糖苷酶A在至少一個位置中包含至少一個突變，如表11.1、12.1及/或13.1中所提供者。
如請求項1至5中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A衍生自一人類α半乳糖苷酶A。
一種重組α半乳糖苷酶A，其包含SEQ ID NO: 374、704及/或1022之多肽序列。
如請求項1至7中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具熱穩定性。
如請求項1至8中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具在pH 7下之穩定性。
如請求項1至9中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具在pH 4下之穩定性。
如請求項1至10中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更穩定地暴露於血清。
如請求項1至11中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更具溶酶體穩定性。
如請求項1至12中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更易於被細胞吸收。
如請求項1至13中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A比具有SEQ ID NO: 2、374、704及/或1022之α半乳糖苷酶A更能自細胞耗乏球形三醯神經醯胺(globotriaosylceramide)。
如請求項1至14中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A被純化。
如請求項1至15中任一項之重組α半乳糖苷酶A，其中該重組α半乳糖苷酶A展現相較於一參考序列而言選自以下之至少一種經改善特性：i)經增強之催化活性；ii)經提高之耐pH 7性；iii)經提高之耐pH 4性；iv)經提高之耐血清性；v)經增加之於細胞中之吸收；vi)經增加之自細胞進行的球形三醯神經醯胺耗乏；vii)經降低之免疫原性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)及/或vii)中任一者之一組合。
如請求項16之重組α半乳糖苷酶A，其中該參考序列係選自SEQ ID NO: 374、704及/或1022。
一種組合物，其包含至少一種如請求項1至17中任一項之重組α半乳糖苷酶A。
一種重組多核苷酸序列，其編碼至少一種如請求項1至18中任一項之重組α半乳糖苷酶A。
如請求項19之重組多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列係選自DNA、RNA以及mRNA。
如請求項20之重組多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列經密碼子最佳化。
一種表現載體，其包含如請求項19、20及/或21之重組多核苷酸序列。
如請求項22之表現載體，其中該重組多核苷酸序列可操作地連接至一或多個控制序列。
如請求項23之表現載體，其中該控制序列為一啟動子。
如請求項24之表現載體，其中該啟動子為一異源啟動子。
一種宿主細胞，其包含如請求項22至25中任一項之表現載體。
如請求項26之宿主細胞，其中該宿主細胞係選自真核生物以及原核生物。
如請求項26及/或27之宿主細胞，其中該宿主細胞為一哺乳動物細胞。
一種產生一α半乳糖苷酶A變異體之方法，其包含培養如請求項26至28中任一項之宿主細胞，且該細胞係培養在由其重組多核苷酸編碼之α半乳糖苷酶A被產生之條件下。
如請求項29之方法，其進一步包含回收該α半乳糖苷酶A之步驟。
如請求項30之方法，其進一步包含純化該α半乳糖苷酶A之步驟。
一種用於治療法布瑞氏病(Fabry disease)之醫藥組合物，其包含如請求項18之組合物。
如請求項32之醫藥組合物，其進一步包含一醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。
如請求項32及/或33之醫藥組合物，其中該組合物適用於非經腸注射或輸注至一人類。
一種醫藥組合物，其包含如請求項19至21中任一項之重組多核苷酸。
一種用於治療及/或預防一個體之法布瑞氏病之症狀的方法，其包含提供患有法布瑞氏病之一個體，以及向該個體提供如請求項32至35中任一項之醫藥組合物。
如請求項36之方法，其中該法布瑞氏病之症狀被改善。
如請求項36及/或37之方法，其中該個體能夠食用一膳食，該膳食之脂肪含量限制低於展現該法布瑞氏病之症狀之個體所要求的膳食的脂肪含量限制。
如請求項36至38中任一項之方法，其中該個體為一嬰兒或兒童。
如請求項36至39中任一項之方法，其中該個體為一成年人或青少年。
一種如請求項18以及32至35中任一項之組合物之用途。