CN107614007A

CN107614007A - 改进的尿酸酶序列和治疗方法

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Publication number: CN107614007A
Application number: CN201680027432.9A
Authority: CN
Inventors: M.巴卡; A.C.尼博格
Original assignee: MedImmune Vaccines Inc
Current assignee: MedImmune LLC; MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2036-05-13
Also published as: AU2016265677A1; EP3294322A4; SG10201910522TA; BR112017024212A2; MY190411A; CO2017012454A2; US20210254024A1; HK1252542A1; JP2021184733A; US20190048327A1; WO2016187026A1; RU2017143580A; KR20180002828A; EP3294322A1; RU2752497C2; CL2017002774A1; US11098289B2; MX2017014547A; AU2016265677B2; CN107614007B

Abstract

描述了具有有益作用的改进的尿酸酶序列和治疗患有高尿酸血症的患者的方法。

Description

改进的尿酸酶序列和治疗方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2015年5月15日提交的美国临时专利申请号62/162,280的权益，该临时专利申请通过引用结合在此。

以电子方式提交的材料通过引用结合

通过引用以其全文结合在此的是与此同时提交并且如下识别的电脑可读核苷酸/氨基酸序列表：2016年5月12日创建的名为“UCASE-100WO1SequenceListing.TXT”的一个103，701个字节的ASCII(文本)文件。

背景技术

功能性尿酸酶可以在广泛范围的生物体，如古细菌、细菌和真核生物中发现。然而，在人和一些灵长类动物中，不表达尿酸酶。在人中尿酸酶表达的缺乏导致了较高的全身尿酸水平，并且在一些情况下导致高尿酸血症病症，如痛风和肿瘤溶解综合征。

痛风影响超过800万美国人，并且是被定义为血清尿酸水平超过体液中的尿酸溶解度的一种痛苦的和使人衰弱的炎症性关节炎。由痛风引起的损伤可导致慢性疼痛、在工作和家庭中的功能障碍、以及健康相关的生活质量受损(参见例如，韦特海默(Wertheimer)等人，当前治疗研究：临床与实验(Curr Ther Res Clin Exp.)75：1-4(2013))。

肿瘤溶解综合征(TLS)通常发生在具有体积大的快速增殖和治疗反应性肿瘤的患者中。TLS是在大量癌细胞被迅速杀灭并释放导致全身尿酸急剧增加的分解产物时发生的抗癌治疗的潜在致死性并发症。

存在用于控制高尿酸血症的各种作用机制，如黄嘌呤氧化酶(将黄嘌呤转化为尿酸的酶)的抑制剂，排尿酸药物(抑制URAT1的分子)和尿酸酶治疗。

存在两种临床上批准的尿酸酶，知 (聚乙二醇重组尿酸酶(pegloticase))是经批准用于治疗常规疗法难治的成人患者的慢性痛风的聚乙二醇化尿酸酶。是高聚乙二醇化(约440kDa PEG/四聚体)的猪和狒狒尿酸酶序列的嵌合蛋白。是通过静脉内(IV)输注在2小时内给予的。在3期临床试验期间，26％的患者经历了输注反应，并且6.5％的患者具有表征为过敏性反应的反应(巴拉夫(Baraf)等人，关节炎研究与治疗(Arthritis Res Ther.)，15(5)：R137(2013)和斯特兰德(Strand)等人，风湿病学杂志(J Rheumatol.)，39(7)：1450-1457(2012))。含有针对过敏性反应和输液反应的黑框警告(参见处方信息)。结果，患者通常在IV输注之前用抗组胺剂或皮质类固醇预先治疗，且然后在输注后监测。预先治疗、IV输注和输注后监测在IV诊所需要大约6-8小时。

(拉布立酶)是被指示用于初始管理患有白血病、淋巴瘤和实体瘤恶性肿瘤的儿童和成人患者的血浆尿酸水平的修饰的重组黄曲霉尿酸酶，这些患者接受预期导致肿瘤溶解和血浆尿酸随后升高的抗癌治疗。在人中具有16-21小时的半衰期，并且必须经由IV输注每天给药。与类似，也具有针对过敏性反应和溶血(特别是在患有G6PD缺乏症患者中)。给药频率(每日)、给予途径(IV)、免疫原性和成本使不太可能成为用于慢性痛风治疗的选择。

鉴于以上情况，本领域中需要开发用于治疗高尿酸血症的更安全、更方便和更低免疫原性的选择。在此描述的本发明满足了这一需求。

概述

为了克服现有技术治疗的显著和已知的副作用，已经评估了多种尿酸酶序列的潜力，并且已经进行了这些序列的具体和有意义的改进，以便获得比现有疗法更安全、更低免疫原性以及更方便的改进的尿酸酶。

在一些方面，在此涵盖许多不同的尿酸酶序列。尿酸酶可以包含与SEQ ID NO：1-34中的任一个至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，其中该序列不是SEQ ID NO：27-33中的任一个。

在一些实施例中，该尿酸酶与SEQ ID NO：1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致或与SEQ ID NO：2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。

在一些实施例中，该尿酸酶是与SEQ ID NO：1-34中的任一个相差从约1至约35个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸)的序列。例如，该尿酸酶可以与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2相差从约1至约35个氨基酸。

在一些方面，该尿酸酶是与SEQ ID NO：1-34中的任一个相差从约1至约14个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸)的序列。例如，该尿酸酶可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相差从约1至约14个氨基酸。在某些方面，该尿酸酶是SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2。在某些实施例中，该尿酸酶是SEQ ID NO：3-26或34中的任一个。

根据描述，还提供了用于高尿酸血症、痛风(包括各种形式的痛风)和肿瘤溶解综合征的治疗方法。

另外的目的和优点将在随后的说明中部分阐述，并且部分目的和优点在说明中将是显而易见的，或可以通过实践来领会。这些目的和优点将通过附加权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。

应了解，上文的一般说明与下文的详细说明均仅是例示性和解释性的，而并非为权利要求的限制。

附图结合在本说明书中并构成本说明书的一部分，其阐明一个(若干)实施例并且与说明一起用于解释在此所述的原则。

附图简要说明

图1描绘存在于表达各种尿酸酶的大肠杆菌细胞的细胞溶解产物中的可溶性(S)和不溶性(P)蛋白质的SDS-PAGE分析。

图2A-2B描绘热泉异常球菌(Deinococcus geothermalis)尿酸酶(图2A)和耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)尿酸酶的差示扫描量热法稳定性(图2B)。

图3是描绘在各种底物(UA)浓度下尿酸酶活性测定的结果的线形图。实线描绘米曼氏(Michaelis-Menten)动力学拟合。

图4是描绘M21细胞与固定的纤连蛋白Fab9mCys或尿酸酶变体的粘附的线形图。

图5是描绘在各种底物(UA)浓度下尿酸酶活性测定的结果的线形图。实线和虚线描绘米曼氏动力学拟合。

图6是描绘与在高加索人群体中发现的HLA-DRB1频率相比，研究(供体)群体中的HLA-DRB1频率的条形图。

图7A-7C提供用于离体免疫原性评估的个体供体数据。图7A是描绘与KLH(阳性对照)相比，缓冲液(阴性对照)的刺激指数的散点图。图7B是描绘与所测试的尿酸酶相比，缓冲液(阴性对照)的刺激指数的散点图。图7C是描绘缓冲液、KLH和尿酸酶的平均刺激指数(SI)的条形图。

图8A-8B描绘各种N-末端尿酸酶截短的分析。图8A是与SGD尿酸酶相比，3种N-末端截短的尿酸酶变体(V1、V2和V3)的SDS-PAGE分析。图8B是描绘在各种底物(UA)浓度下尿酸酶活性测定的结果的线形图。实线描绘米曼氏动力学拟合。

图9A-9B是描绘在各种底物(UA)浓度下尿酸酶活性测定的结果的线形图。实线描绘米曼氏动力学拟合。图9A描绘对于二-Cys和三-Cys尿酸酶(无PEG)，在DTT存在下进行的尿酸酶活性测定的结果。图9B描绘二-聚乙二醇化和三-聚乙二醇化尿酸酶的尿酸酶活性测定的结果。

图10A-10D描绘二聚乙二醇化尿酸酶的分析。图10A示出球形节杆菌尿酸酶(PDB登录代码：2YZB)的四聚体晶体结构内的三维溶剂可及位点。图10B是非聚乙二醇化和二聚乙二醇化尿酸酶的SDS-PAGE分析。图10C是纯化的二聚乙二醇化尿酸酶的逆相色谱分析。图10D是描绘在各种底物(UA)浓度下尿酸酶活性测定的结果的线形图。实线和虚线描绘米曼氏动力学拟合。

图11A-11B是描绘聚乙二醇化尿酸酶的药物代谢动力学数据的图。图11A描绘二聚乙二醇化和三聚乙二醇化尿酸酶的大鼠药物代谢动力学数据。图11B描绘二聚乙二醇化尿酸酶的狗药物代谢动力学数据。

图12A-12C描绘二聚乙二醇化尿酸酶活性和稳定性的离体人基于血清的分析。图12A示出在37℃下在50％人血清中二聚乙二醇化尿酸酶活性与的比较。图12B描绘已经在人血清中在37℃下孵育不同时间长度的二聚乙二醇化尿酸酶的活性。图12C描绘响应于UA的重复剂量的二聚乙二醇化尿酸酶的活性。

图13描绘在各种孵育时间聚乙二醇化效率的RP-HPLC分析。使用RP-HPLC来测量PEG共轭，其产生对应于具有不同共轭程度的物种的良好分辨的峰。

图14A-14B描绘证明试剂浓度对从10分钟至2小时的时间点的总聚乙二醇化效率的影响的反应表面图。图14A示出如从RP-HPLC测定痕迹直接获得的基于“完全聚乙二醇化亚基”(即每个单体的3个官能化共轭位点中的3个)的分析的数据。图14B示出当基于等式(1)计算总体衍生化时的数据分析。

发明详细描述

尿酸氧化酶(尿酸酶EC 1.7.3.3，uox)是由四个相同的34KDa亚基组成的同源四聚体酶。该酶负责开始一系列将尿酸转化为更易溶和容易排泄的产物尿囊素的反应的初始步骤。简言之，尿酸酶催化尿酸(UA)与O₂和H₂O的反应以形成5-羟基-异尿酸酯(HIU)和H₂O₂的释放。HIU是经历非酶水解成2-氧代-4-羟基-4-羧基-5-脲基咪唑啉(OHCU)且然后自发地脱羧基化以形成外消旋尿囊素的不稳定产物。在含有功能性尿酸酶的物种中，表达两种额外的酶(HIU水解酶和OHCU脱羧酶)，这两种额外的酶更快地催化这些反应以产生(s)-尿囊素。功能性.尿酸酶可以在广泛范围的生物体：古细菌、细菌和真核生物中发现。然而，在人和一些灵长类动物中，不表达尿酸酶。缺乏尿酸酶表达归因于三种遗传突变：密码子33处的无义突变(影响猩猩、大猩猩、黑猩猩和人)、密码子187处的另一无义突变(影响黑猩猩和人)以及内含子2中的剪接受体位点处的突变(影响黑猩猩和人)。已经提出了许多假设来解释尿酸酶活性的进化消除和UA水平的相应增加。这些包括以下观念：UA水平的增加(强效抗氧化剂和氧自由基清除剂)导致氧自由基相关疾病(癌症)减少和寿命增加。此外，UA在结构上类似于神经兴奋剂如咖啡因和可可碱的事实已经导致增加的UA水平可能导致智力/认知跳跃的推测。最后，已经提出，尿酸的增加导致且帮助维持人科所需的血压水平，同时消耗非常低的盐素食(1-2百万年以前)。不管可能产生的进化优点，在人中尿酸酶表达的缺乏导致了更高的全身UA水平，并且在一些情况下导致高尿酸血症病症，如痛风和肿瘤溶解综合征。

痛风影响超过800万美国人，并且是被定义为血清UA水平超过体液中的UA溶解度的一种痛苦的和使人衰弱的炎症性关节炎。高于6.8mg/dL的血清UA水平可导致组织中的UA结晶形成，从而引起急性炎性反应。在纤维组织中沉积UA晶体的急性痛风性关节炎发作(爆发)和慢性炎症是痛苦的和使人衰弱的。由痛风引起的损伤可导致慢性疼痛、在工作和家庭中的功能障碍、以及健康相关的生活质量受损(韦特海默等人，同上)。

肿瘤溶解综合征(TLS)通常发生在具有体积大的快速增殖和治疗反应性肿瘤的患者中。TLS是在大量癌细胞被迅速杀灭并释放分解产物时发生的抗癌治疗的潜在致死性并发症。核酸嘌呤被代谢为UA，从而导致全身UA的急剧增加。在严重情况下，UA晶体在肾小管中形成，从而引起UA肾病(急性肾衰竭)。已经跨广泛范围的肿瘤类型报道了TLS(池田(Ikeda)等人，药物、疾病和程序(Drugs，Diseases&Procedures)，医景网(Medscape)(2014年12月3日))。

存在用于控制高尿酸血症的各种作用机制。自20世纪60年代以来，已在临床上开处方了黄嘌呤氧化酶(将黄嘌呤转化为UA的酶)的抑制剂。这些中最常见的别嘌呤醇在美国被超过200万痛风患者使用。然而，许多患者继续具有高于可接受的UA水平，从而表明高尿酸血症不仅仅是UA产生问题。最近的研究表明，患者的UA水平也可以通过抑制URAT1(一种负责UA再循环的酶)来控制。排尿酸药物(抑制URAT1的分子)作用于肾中的近端小管，在这些近端小管中它们干扰UA从肾吸收回到血液中。排尿酸药物如苯溴马隆和雷西纳德促进UA的排泄。最后，已经表明，尿酸酶治疗通过将UA氧化成更易溶的产物尿囊素来迅速降低外周血流中的UA水平。存在两种临床上批准的尿酸酶，和

(聚乙二醇重组尿酸酶(pegloticase))是经批准用于治疗常规疗法难治的成人患者的慢性痛风的聚乙二醇化尿酸酶。是高聚乙二醇化(约440kDaPEG/四聚体)的猪和狒狒尿酸酶序列的嵌合蛋白。是通过静脉内(IV)输注在2小时内给予的。在3期临床试验期间，26％的患者经历了输注反应，并且6.5％的患者具有表征为过敏性反应的反应(巴拉夫(Baraf)等人，关节炎研究与治疗(Arthritis Res Ther.)，15(5)：R137(2013)和斯特兰德(Strand)等人，风湿病学杂志(J Rheumatol.)，39(7)：1450-1457(2012))。含有针对过敏性反应和输液反应的黑框警告(参见处方信息)。结果，患者通常在IV输注之前用抗组胺剂或皮质类固醇预先治疗，且然后在输注后监测。预先治疗、IV输注和输注后监测在IV诊所需要约6-8小时。治疗频率是每两周一次。在3期临床试验中，高百分比的患者发展抗药物抗体(约92％)，并且大约40％的患者经历阳性主要终点(UA水平降低到6mg/dl以下持续6个月)。尽管输注反应、抗药物反应和不方便的给药方案，已经在临床试验和病例研究中观察到显著结果，从而证明了痛风石的减少或消退(尿酸晶体沉积物)。在多次治疗之前和之后，患有痛风石性痛风(手或脚)的患者的数码照片已经证明了尿酸酶在消退痛风石和UA负担中的潜力。

鉴于以上情况，本领域中需要开发与目前可获得的尿酸酶相比更安全、更方便和更低免疫原性的改进的尿酸酶。在此描述的本发明满足了这一需求。

I.改进的尿酸酶序列

在一些方面，在此涵盖许多不同的尿酸酶序列。在此所述的尿酸酶可以包含与SEQID NO：1-34中的任一个至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，其中该序列不是SEQ ID NO：27-33中的任一个。在一个实施例中，该尿酸酶具有SEQ ID NO：1-26或34中的任一个的氨基酸序列。在另一个实施例中，该尿酸酶包含与SEQ ID NO：1-34中的任一个至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，其中该尿酸酶序列不是天然存在的尿酸酶序列。

在一些方面，该尿酸酶是与SEQ ID NO：1-34中的任一个相差从约1至约14个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸)的序列。例如，该尿酸酶可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2相差从约1至约14个氨基酸。在某些方面，该尿酸酶是SEQ IDNO 1或SEQ ID NO：2。在某些实施例中，该尿酸酶是SEQ ID NO：3-26或34中的任一个。该尿酸酶可以因在氨基酸序列中包含添加、缺失或取代而与SEQ ID NO：1-34中的任一个“不同”。用于制备氨基酸添加、缺失和取代的方法是本领域中熟知的。

在一些实施例中，该尿酸酶包含在N-末端和/或C-末端处的截短，其中该截短的尿酸酶保留酶活性。在一个实施例中，从约1-15(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)个氨基酸被从N-末端截短。在另一个实施例中，从约1-20(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸被从C-末端截短。在另一个实施例中，从约1-15(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)个氨基酸被从N-末端截短，并且从约1-20(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸被从C-末端截短。在一个实施例中，该尿酸酶是SEQ ID NO：27-34中的任一个的尿酸酶，其中如上所述，该尿酸酶包含在N-末端和/或C-末端处的截短，其中该截短的尿酸酶保留酶活性。在另一实施例中，上述截短的尿酸酶含有从约1至约14(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)个额外的氨基酸变化(例如，添加、缺失或取代)。用于测定尿酸酶的酶活性的方法是本领域中已知的(例如，产物形成和底物消减测定)，并且本领域中已知的任何合适的方法可以用于测量在此所述的尿酸酶的酶活性。

在一些实施例中，该尿酸酶与SEQ ID NO：27-33至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在一些方面，该尿酸酶与SEQ ID NO：27-33中的任一个相差从约1至约35个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸)。

在一个实施例中，该尿酸酶与NCBI登录号D0VWQ1、WP_011525965、WP_010887803、WP_013581210.1、WP_011682147、WP_013569963或ADG06709至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在一些方面，该尿酸酶与NCBI登录号D0VWQ1、WP_011525965、WP_010887803、WP_013581210.1、WP_011682147、WP_013569963或ADG06709中的任一个相差从约1至约35个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸)。

在一些实施例中，该尿酸酶与SEQ ID NO：27约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在一些方面，该尿酸酶与SEQ ID NO：27相差从约1至约35个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸)。

在一些实施例中，该尿酸酶与SEQ ID NO：28至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在一些方面，该尿酸酶与SEQ ID NO：28相差从约1至约35个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸)。

在本领域中众所周知的是，所表达的蛋白质的加工可以导致N-末端甲硫氨酸残基的裂解(一种可在原核宿主和真核宿主两者中发生的共翻译修饰)(谢尔曼(Sherman)等人，生物分析(Bioessays)，3：27-31(1985))。这种由甲硫氨酸氨基肽酶促实现的加工取决于与氨基末端相邻的氨基酸残基的身份。当第二个残基是甘氨酸或具有小侧链的氨基酸如丙氨酸时，蛋白质被有效地从蛋白质中除去(伊雷尔(Hirel)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，86：8247-8251(1989)和黄(Huang)等人，生物化学(Biochemistry)，26：8242-8246(1987))。然而，当具有较大侧链的氨基酸为相邻残基时，N-末端甲硫氨酸不会裂解。当第二残基是中等大小的氨基酸如苏氨酸或天冬酰胺时，可能发生不同程度的裂解(伊雷尔等人，同上)。因此，在一些实施例中，尿酸酶的位置1处的甲硫氨酸被裂解，以使得尿酸酶的加工形式在位置1处不含有甲硫氨酸。在另一个实施例中，尿酸酶在位置1处保留甲硫氨酸。为了防止位置1处的甲硫氨酸的裂解，尿酸酶可以包含N-末端甲硫氨酸之后的一个或多个氨基酸取代或缺失。此类取代或缺失将被设计成产生在序列内的第二位置处的大氨基酸。大氨基酸的实例是谷氨酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸和精氨酸。例如，在一些方面，尿酸酶在位置2处可不包含苏氨酸，并且位置2被缺失或取代，其中编号是相对于SEQ ID NO：27。在一些实施例中，已经将尿酸酶序列修饰为在位置2处包含丙氨酸或其他小氨基酸(即，紧邻N-末端甲硫氨酸的氨基酸)。小氨基酸的实例是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸和半胱氨酸，但优选这些中的最小者(甘氨酸和丙氨酸)以限制部分加工的可能性(伊雷尔等人，同上)。

在一些实施例中，为了延长蛋白质的半衰期和/或减轻免疫原性，将尿酸酶序列与合成或生物合成聚合物共轭或重组融合。可以用于本发明的示例性聚合物是聚乙二醇(PEG)、磷酰胆碱的聚合物(参见例如，美国专利申请公开2013/0034517)、重复肽如“PAS”或“X-TEN”序列的聚合物(参见例如，Schlapschy等人，蛋白质工程、设计与选择(ProteinEng.Des.Sel.)26：489-501(2013)；舍伦贝格尔等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，27：1186-1190(2009)；和波杜斯特(Podust)等人，蛋白质工程、设计与选择，26：743-753(2013))，或基于碳水化合物的聚合物如肝素前体(heparosan)(参见例如，国际专利申请公开WO 2014/060397)或羟乙基淀粉(参见例如，EP 2270036)。在其他实施例中，尿酸酶序列可以与通过降低肾清除率而延长循环半衰期的多肽重组融合。此类融合配偶体是本领域中众所周知的，并且包括以pH依赖性方式直接结合新生儿Fc受体(FcRn)的试剂(例如，免疫球蛋白或血清白蛋白的Fc区)，或者可替代地结合至天然存在的FcRn-结合部分(例如，结合血清白蛋白的多肽)。在另一个实施例中，尿酸酶序列可以与源自人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽片段的一个或多个重复序列共轭或重组融合(参见例如，美国专利6,225,449)。

在一些实施例中，合成或生物合成聚合物与尿酸酶的N-末端和/或C-末端共轭，以便延长蛋白质的半衰期和/或减轻免疫原性。

在一些实施例中，对尿酸酶序列进行修饰以产生用于共轭的1-6(例如，1、2、3、4、5或6)个表面可及位点。例如，在一些实施例中，尿酸酶序列被修饰成含有1、2、3、4、5或6个表面可及的半胱氨酸残基，聚合物(例如PEG)可以与这些半胱氨酸残基共轭。在一些实施例中，不含任何半胱氨酸或仅含有少量半胱氨酸的天然存在的尿酸酶序列提供有益的起始序列，以使得半胱氨酸可以被插入到适当的表面可及的位置中。在其他实施例中，尿酸酶序列被修饰成含有1、2、3、4、5或6个表面可及的非天然存在的氨基酸，聚合物可以与这些氨基酸共轭。

在一些实施例中，天然存在的尿酸酶序列被修饰成用替代氨基酸使一些或所有现有半胱氨酸突变(通过缺失和/或取代)。在一些实施例中，在所希望的位置处引入新的半胱氨酸(通过添加和/或取代)，以实现能够改变药物代谢动力学行为的聚合物或多肽的位点特异性共轭。在一个实施例中，通过感兴趣的尿酸酶与其他尿酸酶序列的比对来指导用于Cys取代的适当氨基酸的选择，以便确定跨所有尿酸酶的等效位置处的天然氨基酸多样性。然后基于其在其他尿酸酶内的感兴趣的位置处的流行选择非半胱氨酸氨基酸。在另一个实施例中，通过分析该特定尿酸酶的晶体结构来指导用于Cys取代的适当氨基酸的选择，以便确定哪些氨基酸残基是表面可及的。然后选择一个或多个表面可及的氨基酸并将其修饰成半胱氨酸。

在一些情况下，最终修饰的尿酸酶序列中的这些半胱氨酸位于表面可及位置中，这样使得这些半胱氨酸可以被聚乙二醇化。

在一些实施例中，尿酸酶包含从约1至约6个半胱氨酸，特别是约1、2、3、4、5或6个半胱氨酸。在一个实施例中，尿酸酶包含约2个半胱氨酸。

在某些实施例中，尿酸酶包含附接至该一个或多个半胱氨酸残基的PEG部分。对半胱氨酸残基的数量和放置的控制允许对PEG附接位点的数目、以及所得轭合物的最佳性质(包括生物物理属性和酶活性)的控制。

聚乙二醇(PEG)是具有结构H-(O-CH₂-CH₂)_n-OH的聚醚化合物。最通常用于蛋白质共轭的PEG试剂是具有结构CH₃-O-(CH₂-CH₂-O)_n-X的单甲氧基聚(乙二醇)衍生物，其中×含有线性接头和反应性官能团(线性PEG)。在某些情况下，×可以含有支化元件，这样使得PEG试剂含有一个反应性官能团和多于一个PEG聚合物链(支化PEG)或多于一个反应性官能团和PEG聚合物链(叉状PEG)。PEG试剂可以包含约5、10、20、40、60和80kDa的总PEG聚合物。

在一些实施例中，硫醇反应性PEG可以用于与至少一个半胱氨酸上的硫醇基团反应。例如，可以使用PEG-马来酰亚胺，以及PEG-邻吡啶基二硫化物、PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺。在其他实施例中，硫醇反应性PEG可以具有带有单个硫醇反应性部分的直链或支链结构，或者可以具有每个PEG分子具有两个或更多个反应性基团的叉状结构。

因此，本领域中已知多种方法，并且可以使用本领域中已知的任何合适的方法来PEG化尿酸酶中的一个或多个半胱氨酸。

在一些实施例中，尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：11C、33C、119C和142C，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：27。

在一个实施例中，尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：11C、33C、119C、120C、142C、196C、238C、286C和289C，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：27。

作为细胞粘附受体的主要家族，已知整联蛋白在细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用中起关键作用。连蛋白内的三肽Arg-Gly-Asp(RGD)已显示通过整联蛋白结合介导细胞粘附。已经特异性地产生了含有RGD基序的合成肽以便通过整联蛋白依赖性内吞作用作为潜在癌症治疗剂靶向α(v)-整联蛋白用于内化。推定地，整联蛋白结合基序(RGD)对于预期在外周血流中起作用的治疗剂可能是有问题的。因此，在本发明的某些方面，尿酸酶不包含RGD序列。

用于使氨基酸突变的方法是本领域中熟知的，并且此类方法可以用于将一个或多个RGD氨基酸突变成任何其他天然存在的氨基酸。在一个实施例中，RGD基序中的精氨酸被突变为丝氨酸，这样使得尿酸酶含有SGD而不是RGD。在另一个实施例中，RGD基序中的精氨酸、甘氨酸和/或天冬氨酸被突变为任何其他天然存在的氨基酸，这样使得尿酸酶不含RGD基序。在一个实施例中，使用本领域中已知的方法对许多尿酸酶氨基酸序列进行比对，以便确定存在RGD基序的氨基酸位置处的最高度保守的残基，并且RGD基序中存在的一个或多个氨基酸被突变为在该特定氨基酸位置处最保守的氨基酸残基。例如，如果RGD基序的G和D是高度保守的，则只有R将被突变为在该特定位置处最高度保守的氨基酸残基(例如丝氨酸)。

用于制备编码在此披露的尿酸酶氨基酸序列的核苷酸序列的方法是本领域中熟知的，这样使得本领域的普通技术人员能够容易地制备编码在此披露的尿酸酶氨基酸序列的核酸序列。因此，在一个实施例中，本发明包括一种编码在此披露的尿酸酶氨基酸序列的核酸序列。适合的表达载体是本领域中已知的和可获得的，这样使得本发明还涵盖一种包含编码在此披露的尿酸酶氨基酸序列的核酸序列的载体。在又一个实施例中，本发明涵盖一种包含表达载体的细胞系。该细胞系可以是真核细胞系或原核细胞系。在优选的实施例中，该细胞系是原核细胞系，如大肠杆菌、棒状杆菌或荧光假单胞菌。在另一个实施例中，该细胞系是真核细胞系，如酿酒酵母、昆虫细胞等。也可以使用哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在一个实施例中，本发明涵盖一种包含在此所述的尿酸酶的组合物。在一个方面，该组合物中的尿酸酶形成四聚体。在一些方面，该组合物中存在的至少93％(例如，93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)的尿酸酶单体是单聚乙二醇化的(例如，每个单体上存在一个PEG部分)。在一些方面，该组合物中存在的至少93％(例如，93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)的尿酸酶单体是二聚乙二醇化的(例如，每个单体上存在两个PEG部分)。在一些方面，该组合物中存在的至少93％(例如，93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)的尿酸酶单体是三聚乙二醇化的(例如，每个单体上存在三个PEG部分)。

在另一个实施例中，本发明涵盖一种用于测定低聚蛋白质(如在此所述的尿酸酶蛋白的四聚体)的PEG化效率的统计模型。本发明还提供一种用于从自引起非共价相关亚基解离的容易获取的测定中获得的数据导出低聚蛋白质的总体官能化的统计量度，如在此的实例14中所述。

在另一个实施例中，本发明涵盖一种基于多项分布的统计方法，该统计方法允许当蛋白质的大小和性质或轭合物的生物物理性质不允许在天然条件下进行分析时计算低聚蛋白质的总体蛋白质共轭。

II.治疗方法

在一些方面，本发明涵盖一种治疗高尿酸血症患者的方法，该方法包括给予在此所述的任何尿酸酶，且由此降低尿酸和/或UA晶体负担的水平。患者可能具有任何数量的导致高尿酸血症的病症。例如，患者可能患有痛风，如但不限于慢性难治性痛风、痛风石性痛风和/或高UA负担。作为另一个实例，患者可能患有肿瘤溶解综合征或处于肿瘤溶解综合征的风险。

在该方法的一些方面，尿酸酶可以皮下给予。在其他方面，尿酸酶可以静脉内或肌内给予。

对于某些治疗方法，患者可以在治疗前具有高于6.8mg/dL的血清UA水平，并且在治疗后具有低于6.8mg/dL的血清UA水平。

在一些实施例中，该尿酸酶或治疗方法不与过敏性反应相关。在一个实施例中，该尿酸酶或治疗方法是非免疫原性的。

实例

实例1.尿酸酶的选择

对来自可公开获得的数据库的超过200种尿酸酶序列，包括哺乳动物、植物、微生物等尿酸酶进行比对。使用包括(但不限于)以下各项的专用标准选择具有可在这些数据库中获得的序列的候选尿酸酶：有利的生物学特性(如在大肠杆菌中表达、中性pH溶解度、中性pH活性)、与其他序列的低序列一致性或相似性(多样性)、低内源性Cys含量、以及具有表明其尿酸酶将具有有利性质的令人感兴趣的性质的生物体(极端微生物、嗜热菌、嗜酸菌等)。

在此过程之后，选择以下7种候选序列用于进一步研究：球形节杆菌尿酸酶(SEQID NO：27)、热泉异常球菌尿酸酶(SEQ ID NO：28)、耐辐射异常球菌尿酸酶(SEQ ID NO：29)、唐德短链小球菌尿酸酶(SEQ ID NO：30)、寻常土杆菌尿酸酶(SEQ ID NO：31)、Terriglobus saanensis尿酸酶(SEQ ID NO：32)和托斯卡纳凯皮迪亚菌尿酸酶(SEQ IDNO：33)。另外，作为第8序列，还从许多尿酸酶序列的比对设计了共有尿酸酶序列。共有序列由SEQ ID NO：34表示。如以下表2中所示，在所选择的8种序列之间存在显著量的多样性。

表2：尿酸酶序列一致性比较

实例2.筛选范例

使用初始筛选范例来鉴定用于进一步优化的候选物。将实例1中描述的8种尿酸酶序列用氨基末端His标签克隆并在大肠杆菌中表达。评估每种尿酸酶构建体的表达水平且具体地说可溶性表达。将表达大肠杆菌的尿酸酶裂解，并将可溶性材料与不溶性(颗粒)材料分离。通过SDS-PAGE分离溶解产物，并通过考马斯蓝染色可视化蛋白质。如图1中所示，大多数尿酸酶在不溶性(P)材料中以高水平存在。猪-狒狒嵌合体似乎几乎完全在颗粒(P)(不溶性)级分(图1，泳道9)中表达。细胞溶质可溶性(S)表达被认为是有利的性质。然后通过Ni-亲和色谱法从大肠杆菌细胞溶解产物纯化8种尿酸酶。通过测量280nm处的吸光度来测定蛋白质产率。通过质谱法验证蛋白质大小，并通过尺寸排阻色谱法和光散射检测确认四聚体形成(参见以下表3)。

表3：质谱和SEC-LS分析

基于不利的表达、溶解度或纯化产率，从进一步评价中排除三种尿酸酶，即寻常土杆菌、托斯卡纳凯皮迪亚菌和唐德短链小球菌。

进行差示扫描量热法(DSC)测量以评估热稳定性(参见以下表4)。对于每种尿酸酶观察到两种转变。Terriglobus saanensis和耐辐射异常球菌尿酸酶表现出低于所需的热转变(TM1)，并且因此这两种尿酸酶从候选者池中排除。图2A和2B示出DSC结果(热泉异常球菌尿酸酶(图2A)和耐辐射异常球菌尿酸酶(图2B))的两个实例)。

表4：差示扫描量热法稳定性

就pH 9.0和7.4下的产物形成(H₂O₂)而言评价了五种尿酸酶(SEQ ID NO：27、28、29、32和34)的中性pH溶解度特征和活性。在产物形成测定中，尿囊素形成与H₂O₂形成成比例，其与比色辣根过氧化物酶催化的比色反应相关。过氧化氢的出现可以通过540nm处的吸光度的增加来测量。就尿酸酶活性而言，产物形成测定与底物消减测定成比例。然而，产物形成测定不允许随时间推移持续监测酶活性。对于评估动力学参数如Vmax和Km，底物消减测定要好得多。

底物消减(UA)是用于评估尿酸酶活性的另一种常见方法。在底物消减测定中，将尿酸酶、UA和磷酸盐缓冲液在所规定的温度(通常30℃)下孵育1小时。然后将尿酸酶稀释至1μg/mL，并与0.1M磷酸盐缓冲液(PB)(pH 7.4)中的UA(400μM 1∶1.6稀释至23.8μM)的曲线组合。在一些测定中，将1mM DTT添加至测定中。分子装置读取器温度被设定至30℃。每20秒捕获292nm处的吸光度测量值持续10分钟的时间段。通过SoftMax Pro软件计算UA降解率。计算这些尿酸酶的Vmax和Km(参见以下表5)。数据在图3中示出。每个曲线表示4320个特异性活性数据点。

表5：Vmax、Km和kcat/Km

尿酸酶	缓冲液	pH	Vmax	Km
					Krystexxa	PB	7.4	5.88	116.3
球形节杆菌	PB	7.4	10.80	109.7
					热泉异常球菌	PB	7.4	5.75	55.73
Terrigiobus saanensis	PB	7.4	5.48	76.18
					共有序列	PB	7.4	4.09	31.76
耐辐射异常球菌	PB	7.4	5.20	83.06

基于动力学参数，选择了两种尿酸酶用于进一步研究，热泉异常球菌(其相对于具有提高2倍的Vmax(10.8对5.7))，和球形节杆菌(其相对于具有好2倍的Km(55.7对116.3))。两种尿酸酶均相对于具有好约2倍的kcat/Km。最后，尽管共有尿酸酶表现出有利的动力学，但共有序列与球形节杆菌61.7％一致，而热泉异常球菌和球形节杆菌彼此仅41.2％一致，从而表明这两者之间的更大多样性。高度多样性被认为是有利的，并且因此，选择了热泉异常球菌尿酸酶和球形节杆菌尿酸酶用于进一步研究。

实例3.剂量建模表明kcat是最重要的动力学参数

痛风和肿瘤溶解综合征患者典型地具有饱和水平的UA(＞6.8mg/dl，408μM)。因此，假设Vmax(kcat)是治疗性尿酸酶的最重要的动力学参数。基于kcat(球形节杆菌)或Km(热泉异常球菌)的提高产生了剂量模型。虽然建模预测提高的km(热泉异常球菌)将不提供在给药量或频率方面的优点，但该建模预测，提高的kcat(球形节杆菌)将在给药量和频率方面提供优点。因此，剂量建模的结果表明，kcat是治疗性尿酸酶的最重要的动力学参数。

实例4.基于重叠肽分析的免疫原性

由于免疫原性已被证明是目前可用的尿酸酶的临床中的问题，所以通过EpiScreen^TM分析针对推定T细胞免疫原性对球形节杆菌尿酸酶和热泉异常球菌尿酸酶两者进行了筛选。使用重叠肽针对CD4+T细胞表位的存在对两种尿酸酶的序列进行了分析(EpiScreen^TM T细胞表位作图分析)。针对筛选的54名健康供体的组对总计93种跨越尿酸酶球形节杆菌的序列的重叠15聚体肽和94种跨越尿酸酶热泉异常球菌的序列的重叠15聚体肽进行了测试以表示HLA-DRB1单倍型的横截面。使用³H胸苷掺入增殖测定测量针对各个肽的CD4+T细胞应答，并且结果用于编制两种尿酸酶序列的T细胞表位图。如果3个或更多个供体样品在测定中引发大于2.00的CD4刺激指数得分，则考虑推定T细胞表位。在球形节杆菌序列中鉴定了总计5个推定T细胞表位。在这种情况下，没有肽在大于4个供体样品中引发T细胞应答(＜10％)。此外，每个阳性肽的刺激指数量值相对较低，从而表明这些肽可能不是强T细胞表位。热泉异常球菌的重叠肽T细胞分析表明存在六个推定表位。这些肽中的一些在大于10％的筛选的供体中引发阳性T细胞应答，并且应答的量值(刺激指数)更大。

基于这些结果和球形节杆菌的提高的Vmax，确定进一步优化该序列。

实例5.球形节杆菌尿酸酶的序列进化

A.初始序列进化

SEQ ID NO：22被修饰为添加N-末端His标签和短接头，并且截短C末端11个氨基酸以便消除C末端Cys，从而产生SEQ ID NO：21。

B.将RGD改变为SGD

作为细胞粘附受体的主要家族，已知整联蛋白在细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用中起关键作用。纤连蛋白内的三肽RGD已显示通过RGD基序介导细胞粘附。推定地，整联蛋白结合基序(RGD)对于预期在外周血流中起作用的治疗剂可能是有问题的。SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22两者均含有RGD基序。进行M21肿瘤细胞粘附测定以确定RGD是否是表面可及的。使用M21细胞，因为它们表达α_vβ₃和α_vβ₅整联蛋白。将含RGD的纤连蛋白底物、PBS(阴性对照)或测试物品在PBS中以0-100ug/ml涂覆在ELISA板上过夜。将荧光标记(钙黄绿素-AM)的M21细胞在37℃下在涂覆的板上孵育1小时。洗去未结合的细胞，并且通过总荧光测量结合的细胞。Fab9mCys是在CDR-H3环内含有RGD的IgG，并且与纤连蛋白一起用作阳性对照。结果示于图4中，从而说明含有球形节杆菌尿酸酶的RGD结合M21细胞。这些数据表明，球形节杆菌尿酸酶中的RGD是表面可及的。

使用大于200种比对的尿酸酶的数据库，确定RGD基序中的甘氨酸(G)和天冬氨酸(D)在所比对的尿酸酶中是高度保守的残基。然而，精氨酸(R)不是高度保守的位置，并且在该位置处的共有残基是丝氨酸(S)。因此，使用定点诱变来用S置换RGD基序中的R，从而使RGD成为SGD。这种修饰除去潜在的整联蛋白结合基序，从而产生具有SEQ ID NO：20的尿酸酶，其中如所示的序列的N-末端上的His和接头标签是任选的。

C.评价SGD修饰

将RGD至SGD突变针对其对表达、溶解度、纯化产率等的影响进行了评价。尽管SGD突变似乎已经使可溶性表达降低了一点，但可以优化培养条件以提高可溶性表达。

RGD至SGD突变显示整联蛋白结合测定中的显著降低(参见图4)。评价了两种尿酸酶在pH 7.4下的活性。SGD突变似乎具有可比较的活性(参见图5)。

实例6.评估修饰的球形节杆菌尿酸酶的免疫原性

A.LONZA免疫原性测定

尽管球形节杆菌尿酸酶(SEQ ID NO：22)基于EpiScreen测定具有5个推定T细胞表位，但是这些中没有一个在大于10％的供体样品中引发强应答。此外，已知重叠的合成肽T细胞表位测定可过度预测MHC-2类表位。这可能是由于以下事实：不是所有潜在的肽变体都将存在于蛋白质治疗剂的内源性内体降解过程中。结果，将经修饰的球形节杆菌(SEQ IDNO：18)在免疫原性测定中作为全蛋白进行筛选。测定是用于评估“免疫原性风险”的人PBMC T细胞免疫原性测定。虽然该测定不一定能够预测临床免疫原性，但它可以用于基于反应者的数量和总体应答量值(刺激指数)来鉴定“高风险”和“低风险”蛋白质。在该测定中，来自202名正常供体的PBMC样品用于筛选相对于阴性对照(缓冲液)和阳性对照(KLH)的尿酸酶候选物的T细胞免疫原性。在此，202名供体被选择来表示高加索人群体中的HLA-DRB1频率(参见图6)。将来自冷冻储备液的PBMC解冻并以每孔3×10⁵个细胞的密度添加至96孔板。将测试物品以30ug/ml(缓冲液、KLH、SEQ ID NO：18)添加至培养基。每种测试条件以一式8份(n＝8)进行。将PBMC孵育7天。在第7天，将PBMC针对表面CD3⁺和CD4⁺标志物进行标记。通过流式细胞术鉴定增殖CD4⁺ T细胞。刺激指数(SI)值描述了抗原处理的孔对未处理的孔中增殖CD3⁺CD4⁺ T细胞的比例。SI值＞2被认为是阳性的，其由p-值＜0.05支持。还通过计算整个群体的T细胞应答的量值来确定群体免疫原性分析。

结果如下：阴性对照-0/202供体样品(0％)应答，其中平均群体SI＝1.0；尿酸酶候选物-1/202供体样品(0.5％)应答，其中平均群体SI＝1.03；阳性对照-181/202供体(91％)应答，其中平均SI＝4.2。图7A-7C中示出了个体供体数据。图7A示出缓冲液(阴性对照)刺激指数是1.0，并且KLH(阳性对照)具有91％应答(SI＞2)。KLH平均总SI＝4.2。图7B示出与缓冲液对照相比的尿酸酶候选物。该测定中的4％或更低的应答率被认为是“低风险”，并且其他潜在临床化合物的历史筛选产生了在20％-25％免疫原性范围内的应答率。图7C示出缓冲液刺激指数是1.0，KLH刺激指数是4.2，并且尿酸酶候选物刺激指数是1.03。尽管该测定不一定能够预测临床免疫原性，但它可以用于评估免疫原性的风险，并且这些数据表明，所评价的尿酸酶对于临床免疫原性是“低风险”。考虑到所测试的尿酸酶蛋白质序列是微生物来源的(球形节杆菌)，这是非常出人意料的发现。

实例7.His标签除去

将N-末端His标签添加至尿酸酶序列的N-末端，以便提供纯化所产生的尿酸酶蛋白质的有效方法(即，Ni-亲和纯化)。尽管His标签在发现过程中提供了优点，特别是在纯化领域中，但希望在制备药物产品之前除去His标签。

实例8.优化N-末端

众所周知，当蛋白质在大肠杆菌中表达时，N-末端甲硫氨酸可以通过Met氨基肽酶除去，这取决于甲硫氨酸后的第二残基。如果较小的残基处于第二位置，则典型地发生裂解。如果体积大的残基处于第二位置，则不发生裂解。然而，如果第二残基既不是体积大的也不特别小，则Met氨基肽酶可起到裂解一些但并非所有Met的作用，从而产生非均匀药物物质。产生了三种N-末端变体并针对表达、溶解度、甲硫氨酸裂解和活性进行分析以便确定最佳N-末端序列。

该过程的起始序列是SEQ ID NO：12，并且产生了三种变体。SEQ ID NO：13(变体1)具有Thr2的缺失。SEQ ID NO：14(变体2)具有Thr2-Ala5的缺失，并且预期N-末端Met将被保留。SEQ ID NO：15(变体3)具有Thr2-Thr9的缺失，并且预期N-末端Met将被加工。

将三种N-末端尿酸酶变体克隆，在大肠杆菌中表达并纯化。每个构建体在类似于His标记的构建体的可溶性级分中表达。由于缺乏His标签，为这些构建体制定出纯化程序。简言之，这包括Q离子交换色谱法步骤(缓冲液A：PBS，pH 7.8，5mM DTT；缓冲液B：10×PBS，pH 7.2)，然后进行尺寸排阻色谱法(SEC)。将来自SEC的级分在SDS-PAGE上运行，并通过考马斯蓝色染色可视化蛋白质。将含有高水平尿酸酶的级分合以用于进一步分析。图8A示出相对于His标记的构建体(标记为SGD)来自纯化制剂的考马斯蓝染色的SDS-PAGE。变体1和变体3被发现加工(除去)N-末端甲硫氨酸，而变体2被发现保留N-末端甲硫氨酸。所有加工似乎是均匀的。

图8B示出V1、V2和V3的活性。变体1和变体2具有比变体3相当更好的活性。选择变体1用于进一步开发。

实例9.特异性聚乙二醇化

用聚乙二醇(PEG)修饰治疗性蛋白质可作为随机附接至所选择的蛋白质残基(例如赖氨酸侧链)或者对于独特预定位点具有位点特异性地进行。后一种方法具有以下优点：共轭化学可以更好地控制且一致地制造，从而产生具有确定的生物活性的高度均匀的聚乙二醇化产物。在用于位点特异性附接的方法中，最广泛使用的方法是与未配对的半胱氨酸残基偶联，并且这通常涉及将一个或多个游离半胱氨酸残基引入蛋白质序列中。可以仔细地选择Cys引入的位点，以避免在用PEG修饰后对共轭产物的生物活性或生物物理性质的任何负面影响。

SEQ ID NO：27中描述的球形节杆菌尿酸酶序列特别适用于基于半胱氨酸的位点特异性修饰，因为它仅含有一个天然C-末端Cys残基。C-末端区域被截短(SEQ ID NO：18和20)，因此蛋白质不含Cys。因此，通过Cys反应性试剂对该蛋白质的修饰容易被局限于已经引入了Cys残基的位点。为了选择球形节杆菌尿酸酶序列中Cys残基引入的潜在位点，考虑了以下标准

i.位点必须在蛋白质的溶剂暴露的表面上，以确保与硫代反应性PEG试剂的有效反应；

ii位点不可靠近酶活性位点，以避免影响活性的风险；并且

iii.位点不可彼此靠近，以使得一个位点的聚乙二醇化不会在空间上阻碍其他位点的聚乙二醇化。

此外，鉴于尿酸酶的四聚体性质，应在ii和iii.的情况下理想地考虑亚基中和亚基间的距离。

为了计算与这些考虑相关的参数，使用了球形节杆菌尿酸酶的三维结构。已经报道了有限数量的不同尿酸酶结构，并且这些中的一种是结合至尿酸底物(PDB登录代码：2YZB)的球形节杆菌尿酸酶的晶体结构(参见图10A)。该结构的原子坐标用于计算以下参数集：

i.这种尿酸酶内的每个氨基酸残基的溶剂可及区域表面积和

ii该尿酸底物的每个侧链C原子与C5原子之间的原子距离(C-C5距离)。

为了鉴定球形节杆菌尿酸酶内的用于用半胱氨酸取代的优选位置，初始设定以下标准。首先，残基被鉴定为总溶剂可及表面积＞并且其C-C5距离＞(即，到结合至尿酸酶四聚体的4个尿酸分子中的每个C5)。第二，作为进一步的限制，对于任何给定的尿酸酶残基，这些标准必须在所有四个亚基中满足。在每个尿酸酶亚基中的287个氨基酸残基中，仅9个满足这些标准。这些是Thr11；Asn33；Asn119；Asp120；Ser142；Glu196；Pro238；Glu286和Arg289。然后通过计算跨四聚体结构的这组残基内的C原子对之间的原子距离的矩阵来考虑第三个标准(参见表6)。从此分析中，选择了Thr11、Asn33、Glu196和Asn119作为用于用半胱氨酸取代的优选残基，因为它们的跨四聚体的C原子被良好地分离(对于所有对都是＞ )。

以下表6是示出尿酸酶结构2YZB中所选择的C原子之间的原子距离的矩阵。亚基通过字母表示，即-A、-B、-C、-D。由于四聚体的高度对称性质，所以以下的距离集合足以表征跨四聚体的所有距离对(实例：T11-A到T11-B距离等于T11-C到T11-D；T11-A到T11-C等于T11-B到T11-D；T11-A到T11-D等于T11-B到T11-C)。

表6：示出原子距离的矩阵

实例10.用于位点特异性聚乙二醇化的尿酸酶的含半胱氨酸变体

产生了每个尿酸酶单体1、2、3和4个Cys残基的许多不同组合。在聚乙二醇化之前和之后分析这些的表达、溶解度、纯度和活性。由于Cys的溶剂暴露性质，这些构建体倾向于聚集(二硫键)，除非它们被保持在还原条件下。这需要在纯化和测定程序期间存在还原剂(DTT或其他)。一旦Cys已被聚乙二醇化，则不再需要还原剂。所有测试的含Cys构建体的排列可以在聚乙二醇化之前和之后表达、纯化并表现出良好的活性。

图10A示出球形节杆菌尿酸酶(PDB登录代码：2YZB)的四聚体晶体结构内的三维溶剂可及位点。(1)示出了四聚体酶的每个尿酸酶单体亚基，并且鉴定了针对用半胱氨酸取代选择的残基(T11、N33、S142)。这些侧链是高度表面暴露的，彼此远离，并且远离四聚体内的每个活性位点。氟含有两个Cys的变体(T11C、N33C(SEQ ID NO：17)和T11C、N33C、S142C(SEQID NO：16))的表达、溶解度、纯度和活性进行分析。图9A示出非Cys(SEQ ID NO：20)、二-Cys(T11C、N33C)(SEQ ID NO：17)和三-Cys(T11C、N33C和S142C)(SEQ ID NO：16)尿酸酶活性。所有测定都在DTT存在下运行，以消除二硫键键合的可能性。

实例11.优化聚乙二醇化

通过尿酸酶长期抑制UA需要以某种方式修饰分子以延长半衰期。未聚乙二醇化且不含轭合物半衰期延长性质的可商购的拉布立酶在人中具有16-21小时的半衰期，从而需要每日IV剂量用于肿瘤溶解综合征(翁(Ueng)等人，2005)。已经采用聚乙二醇化来在临床前延长许多尿酸酶的半衰期。是一种超聚乙二醇化的尿酸酶，其含有与活性四聚体的表面共轭的大约44×10kDa PEG分子(每个四聚体大约440kDa的总PEG)。基于文献，在的早期开发期间，假设PEG将有效地掩盖作为外来蛋白质的尿酸酶，并使其免疫原性降低(赫什菲尔德(Hershfield)等人，2010PNAS)。进行临床前研究以使尿酸酶的表面上的PEG的量最大化，同时保留酶活性。据发现每个四聚体44×10kDa PEG是可以与尿酸酶共轭并保留酶活性的PEG的最大量。通过随机聚乙二醇化伯胺实现PEG共轭。来自试验的临床数据表明，大约90％的患者发展抗药物反应(利普斯基(Lipsky)等人2014关节炎研究与治疗(Arthritis Research&therapy))。大部分的抗药物反应似乎是针对PEG而不是蛋白质。最令人注目的是以下事实：来自发展抗药物(PEG)反应的患者的抗体结合至非尿酸酶聚乙二醇化蛋白质，从而表明该反应是针对PEG而不是蛋白质或蛋白质-PEG界面。在这些试验之前，常识是聚乙二醇化治疗剂的PEG基序不太可能是免疫原性的。绝大多数聚乙二醇化治疗剂仅含有足够的PEG以延长半衰期，而不是像一样“超聚乙二醇化”。一种假设是，上的PEG的量已经导致与药物相关的抗-PEG免疫原性。四聚体是约136kDa，大约440kDa的PEG与表面共轭。这产生大约576kDa分子，这是聚乙二醇化治疗剂的史无前例的大小。因此，如实例10中所述，对位点特异性PEG化的有限数目的Cys残基进行工程化。

最初使用His标签产生具有两个(二-cys)或三个(三-Cys)半胱氨酸的尿酸酶以便于纯化。图9A示出，这些二-cys和三-cys尿酸酶保留尿酸酶酶活性。

通过改变时间、pH、磷酸盐浓度、NaCl、蛋白质、PEG和TCEP来优化二聚乙二醇化反应条件。更高的PEG浓度显示可提高聚乙二醇化效率，并且更高的TCEP浓度稍微降低聚乙二醇化效率。其他变量对聚乙二醇化效率几乎没有影响。以下表7示出进行测试以优化聚乙二醇化并实现最佳条件的变量。

表7：聚乙二醇化的优化

图9B示出二聚乙二醇化和三聚乙二醇化的尿酸酶保留尿酸酶酶活性。

通过SDS-PAGE分析二聚乙二醇化材料(图10B)证实大部分蛋白质与PEG均匀共轭。二聚乙二醇化材料的逆相色谱分析表明，92.6％是二聚乙二醇化的，观察到4.4％单聚乙二醇化和少量的过度聚乙二醇化的材料(大约3％)(图10C)。PEG化似乎没有影响酶活性。与非聚乙二醇化酶相比，二聚乙二醇化材料显示相似的UA氧化率(图10D)。获得三聚乙二醇化材料的可比较的结果(数据未示出)。这些分析方法破坏了尿酸酶的四级结构，但是作为同四聚体，二-PEG尿酸酶的主要天然状态产物将预期具有8×10kDa PEG链，而三-PEG尿酸酶具有12×10kDa PEG链。

基于所鉴定的优化的聚乙二醇化条件(参见表7)，产生、纯化并针对聚乙二醇化效率和酶活性对非his标记的-PEG和三PEG尿酸酶进行了分析。在体内PK研究中进一步分析了这些聚乙二醇化分子。

实例12.用于二-PEG和三-PEG-尿酸酶的体内PK

在大鼠研究中评价了两种聚乙二醇化尿酸酶(二-PEG T11C、N33C以及三-PEGT11C、N33C和S142C)。选择了一项大鼠研究，因为在大鼠中优先测试聚乙二醇化尿酸酶的PK(张(Zhang)等人，2012国际药剂学杂志(International Journal of Pharmaceutics))。在该测定中使用SEQ ID NO：16和17。在大鼠中测定二-聚乙二醇化尿酸酶和三-聚乙二醇化尿酸酶两者的体内药物代谢动力学。将每组中的4只大鼠以5mg/kgIV给药，并且在(第-1天)、注射后0.5、2、4、8、24、48、72、96和144小时终点时收集10种样品。在血清分离管中收集全血并冷冻。分析血清的残余尿酸酶活性，并且将数据拟合至滴定曲线。进入大鼠的尿酸酶(剂量前)和从血清测量的尿酸酶(剂量后)的酶特异性活性是可比较的，从而表明在体内研究期间保留活性。图11A示出二聚乙二醇化尿酸酶和三聚乙二醇化尿酸酶具有比非聚乙二醇化尿酸酶基本上更长的半衰期。此研究中非聚乙二醇化尿酸酶具有2-3小时的半衰期(图11A，三角形)。二聚乙二醇化尿酸酶和三聚乙二醇化尿酸酶两者均显示单相分布。每种尿酸酶的半衰期、分布体积(Vd)和清除率在以下表8中示出。变异系数被表示为括号内的百分比。

表8：二聚乙二醇化和三聚乙二醇化尿酸酶的大鼠PK

表8中所示的结果表明，二-PEG和三-PEG显示非常相似的药物代谢动力学概况，具有三-PEG优于二-PEG的轻微优点。然而，关于制造和分析，认为二-PEG稍微更令人希望，并且因此选择二-PEG T11C、N33C用于进一步测试。由于具有比基本上更少的PEG，所以二聚乙二醇化尿酸酶从免疫原性的观点来看可能是有利的。

在同一大鼠PK研究中还评价了的药物代谢动力学行为。与二聚乙二醇尿酸酶和三聚乙二醇化尿酸酶不同，未表现出单相消除，而是复杂的概况，其中在前2小时内快速消除，随后是更渐进的消除概况(图11A，正方形)。消除概况与二聚乙二醇化尿酸酶和三聚乙二醇化尿酸酶的消除概况明显不同。

在犬科动物中研究了SC给予的二聚乙二醇化尿酸酶的PK。选择犬科动物研究是因为对于在犬科动物中测试聚乙二醇化尿酸酶的PK存在优先级(聚乙二醇重组尿酸酶/FDA BLA号125293，第2.6.5.4.1节)。将犬科动物以3和10mg/kgSC给药，并且在各时间点收集血清或血液样品，并分析尿酸酶(PK)或尿酸(PD)。进入犬科动物的尿酸酶(剂量前)和从血清测量的尿酸酶(剂量后)的酶特异性活性是可比较的，从而表明在体内研究期间保留活性。图11B证明经由SC给予途径递送至犬科动物的二聚乙二醇化尿酸酶对于3mg/kg(n＝3)具有1.81±0.31天的半衰期，并且对于10mg/kg(n＝3)具有1.82±0.22天的半衰期。观察到UA水平的显著降低(大约85％)，并且似乎与血清尿酸酶水平成比例(图11B)。随着尿酸酶水平消减，血液UA水平恢复正常。

实例13.活性和稳定性的离体评价

在37℃下在50％人血清(全血是大约50％血清)中评价二-PEG尿酸酶(SEQ ID NO：1)活性，以模拟复杂体内基质环境和温度。测定如下进行：将UA、磷酸盐缓冲液和血清温至37℃。所有反应步骤均在37℃下进行。将尿酸酶在血清中稀释至8ug/mL持续20-30分钟以消减人血清样品中的内源性尿酸。然后加入相等体积的磷酸盐缓冲液中的UA滴定，并且使用50％高氯酸在第0、第1、第2、第4或第6分钟终止反应。已经显示高氯酸沉淀蛋白质但不沉淀UA(佐久间(Sakuma)等人，1987临床化学(Clinical Chemistry)和斯托韦(Stove)等人，2007临床化学)。将沉淀物沉淀并将100uL上清液转移至UV板。在292nM处测量吸光度。通过使用SoftMax Pro软件绘制在每个UA浓度下的4个时间点的斜率来计算速率。图12A示出在37℃下在50％人血清中二聚乙二醇化尿酸酶活性与的比较。

还进行了基于人血清的稳定性测定。将二聚乙二醇化尿酸酶在37℃下在50％人血清中孵育0、0.5、1、2、4或24小时，且然后测定活性。二-PEG尿酸酶在每个点保留活性，从而表明蛋白质在50％人血清中稳定至少24小时，并保留其UA氧化酶活性。图12B示出来自血清稳定性实验的结果。

最后，在37℃下用UA的重复剂量(再装料)探究二聚乙二醇化尿酸酶的活性。简言之，将UA(100μM)和二-PEG尿酸酶(1μg/ml)在37℃下在100μL体积(UV透明96孔板)中合并。监测292nm处的吸光度10分钟。向100μL孔中加入2.5μL的2000uM UA(“再装料”)，并再监测292nm处的吸光度10分钟。重复该过程，并且每次“再装料”的活性(UA消减的斜率)保持相对恒定。图12C示出来自此研究的结果。

实例14.PEG共轭效率测定

当多个共轭位点存在于生物分子中时，共轭反应常常导致以不同程度的官能化和/或不同的修饰位点为特征的产物的非均匀混合物。第一代非特异性偶联化学如靶向赖氨酸残基的ε-氨基的蛋白质共轭通常是这种情况。然而，即使当选择位点特异性共轭方法时，例如在经常使用的靶向工程化半胱氨酸残基的方法中，反应也可能并不进行至完全，例如由于空间限制。这同样导致具有不同程度的衍生化的共轭蛋白质的分布。因为生物活性可随着修饰程度显著变化，所以最终产物需要在修饰方面进行充分表征，以确保明确定义的和一致制造的生物轭合物。

可以使用几种分析方法来表征生物轭合物的总体衍生化，包括质谱法或基于HPLC的方法。然而，对于涉及聚合物如聚(乙二醇)(PEG)与蛋白质的附接的重要类别的生物共轭，这些技术中的大多数对于含有多个附接的聚合物的轭合物而言变得具有挑战性。由于聚合物和蛋白质的大小和电荷分布以及PEG的多分散性，基于电喷雾电离(ESI)的质谱方法通常是不可行的，并且MALDI MS通常导致宽的连续质谱。对于较小的聚乙二醇化蛋白质和/或在少量共轭位点(N＜3)的情况下，在天然条件下(基于尺寸排阻或离子交换)的基于HPLC的技术仍然可以提供足够的分辨率来区分各个物种。然而，在具有多个共轭位点的较大蛋白质的情况下，这些技术通常是不可行或不能充分分辨的。高度水合的PEG聚合物对蛋白质轭合物赋予较大流体动力学半径，这阻止具有足够分辨率的基于SEC的分离，并且表面电荷的屏蔽减弱与IEX树脂的静电相互作用。在这种情况下，逆相(RP)HPLC通常是用于精确反应监测和产物表征的首选方法。然而，在低聚蛋白质的情况下，该技术通常导致亚基的解离并且仅提供单体单元的描述，这提供对分子官能化的部分理解，该部分理解对于过程优化努力而言可能是误导的。为了准确量化用于过程优化和产物表征的低聚生物治疗剂的真实共轭状态，必须获得对单体水平下的修饰程度与所得到的四级水平下的总体衍生化之间的关系的理解。

实验设计：

从NOF获得马来酰亚胺官能化的PEG-10(10kDa，Sunbright MA-100)。所有缓冲组分和试剂均购自西格玛公司(Sigma)(圣路易斯(St Louis)，密苏里州(MO))或艾万拓性能材料公司(Avantor Performance Materials)(森特瓦利(Center Valley)，宾夕法尼亚州(PA))。三-cys尿酸酶的聚乙二醇化反应在pH 7.0的磷酸钠缓冲液中进行。通过加入DTT至10mM的最终浓度在选定时间点后淬灭聚乙二醇化反应，并用安捷伦HPLC1200系统使用来自YMC美国公司(YMC America)的YMC-Pack蛋白质-RP柱(250×2.0mm，S-5μm)通过分析型逆相高效液相色谱RP HPLC(RP-HPLC)进行分析。流动相A是在水中的0.1％TFA，并且流动相B由在乙腈中的0.1％TFA组成。以0.4ml/分钟的流速用不断增加的流动相B的线性梯度洗脱样品。通过280nm处的UV吸光度来监测洗脱曲线。

采用两步Box-Behnken设计，目的是使蛋白质聚乙二醇化最大化。对于每个四聚体分别含有8或12个共轭位点的二-cys和三-cys尿酸酶，蛋白质(1-3mg/ml)、PEG-10(0.5-1mM)和还原剂TCEP(0-0.5mM)的浓度变化，而pH、盐和磷酸盐缓冲液离子浓度保持在固定值。在从10分钟至4小时范围内的选定时间点后分析数据。所有二阶效应以及时间被处理为分类变量，从而在每种蛋白质变体的第1轮和60次额外的实验中产生用于每种蛋白质变体的筛选研究的64个实验设计以用于第二轮优化研究。使用软件JMP10进行数据分析。

统计模型：

产生了用于从引起非共价缔合的亚基解离的容易可及的测定(如逆相(RP)HPLC)获得的数据导出低聚蛋白质的总体衍生化的统计量度。对于含有n个亚基的蛋白质(或生物分子)，其在每个亚基中具有m个潜在的共轭位点。使p_i(其中i＝0、...、m)是具有i个共轭位点的亚基的实验观察到的比例，则可以使用以下多项概率表来总结观察具有j个总共轭位点的低聚蛋白质的T概率q_j。

表9

其中k_i(i＝0、...、m)是具有恰好i个共轭位点的亚基的数目，并且这些亚基的总体具有总计j个共轭位点并且分子的平均总体衍生化然后容易地写为：

衍生化_总体＝1q₁+2q₂+…+jq_j+…+n×m×q_n×m (等式1)

将该值标准化至可用共轭位点的总数(n×m)得到共轭效率。

对于二聚体、三聚体和四聚体蛋白质的生物化学和药学上重要的类别，计算在下文详述。

表10：对于每个亚基具有m＝2或3个共轭位点的二聚体蛋白质(n＝2)的总体衍生化的计算

1.将每个亚基的实验观察到的共轭如下输入到Excel中的表中：

p0、p1、...p3：具有0、1、...3个共轭分子的亚基的实验观察到的比例。对于每个亚基m＝2个共轭位点，完整字段A2、B2、C2；对于每个亚基3个共轭位点，完整字段A2、B2、C2、D2。

*：E2＝和校验＝和(A2：D2)。总比例需要合计达1的值，例如100％。

2.多项概率和总体衍生化的计算

如下建立Excel表：

如果蛋白质具有每个亚基仅m＝2个共轭位点，则将不填充字段B15和B16。

**：字段B17(和校验)需要是＝1

***：(nxm)，共轭位点的总数，需要在此以数字形式输入。

表11：对于每个亚基具有m＝2或3个共轭位点的三聚体蛋白质(n＝3)的总体衍生化的计算

1.将每个亚基的实验观察到的共轭如下输入到Excel中的表中：

2.多项概率和总体衍生化的计算

如下建立Excel表：

如果蛋白质具有每个亚基仅m＝2个共轭位点，则将不填充字段B17-B19。

**：字段B20(和校验)和需要是＝1

***：(nxm)，共轭位点的总数，需要在此以数字形式输入。

表12：对于每个亚基具有m＝2或3个共轭位点的四聚体蛋白质(n＝4)的总体衍生化的计算

1.将每个亚基的实验观察到的共轭如下输入到Excel中的表中：

2.多项概率和总体衍生化的计算

如下建立Excel表：

如果蛋白质具有每个亚基仅m＝2个共轭位点，则将不填充字段B19-B22。

**：字段B23(和校验)和需要是＝1

***：(nxm)，共轭位点的总数，需要在此以数字形式输入。

以上数据描述一种用于从自引起非共价相关亚基解离的容易获取的测定中获得的数据导出低聚蛋白质的总体官能化的统计量度。上述数据说明使用均聚四聚体尿酸酶蛋白与聚(乙二醇)(PEG)的共轭作为模型系统的这种方法。用PEG共价修饰治疗性蛋白质现在已成为增加体内半衰期、降低免疫原性、提高溶解度和降低蛋白水解降解易感性的完善建立的方法。然而，该方法同样适用于在固定数目的共轭位点处产生部分官能化的低聚物的其他生物共轭过程。

在此研究的四聚体尿酸酶蛋白(n＝4)具有＞100kDa的总质量。通过工程化允许用马来酰亚胺官能化的PEG进行聚乙二醇化的游离半胱氨酸残基来引入固定数目的共轭位点。以下论述集中于每个亚基具有m＝3个共轭位点的蛋白质变体，从而对于四聚体产生总数12个可能的共轭位点。如上所述，由于蛋白质的大小和共轭位点的数目，表征具有足够分辨率的生物轭合物产物的所有分析工具都是基于将非共价结合的低聚物解离成单个亚基的技术。图13说明使用RP HPLC的随时间推移的反应分析，其产生对应于具有不同共轭程度的物种的良好分辨的峰，这些峰可以通过积分容易地定量。因此，测定输出是具有不同官能化程度的单体的相对量：含有0、1、2或3个附接的PEG链的亚基的比例p0、p1、p2、p3。从这些值，根据上述多项概率表，对具有0、1、2、3、...12个附接的PEG链的四聚体蛋白质，个体概率q0、q1、q2、q3、....q12被计算为：

对于这个实例，等式1然后变成：

衍生化_总体＝1q₁+2q₂+3q₃+...+12q₁₂。

表13举例说明了该分析，并且列出入从RP HPLC分析得到的不同聚乙二醇化亚基的相对量，连同从等式(1)计算的计算的总体衍生化以及聚乙二醇化效率。

表13：图13中所示的实验的数据分析。

*该蛋白质具有总计12个可能的共轭位点。

数据说明，所计算的总体衍生化是允许立即计量总体蛋白质修饰的过程开发者的有价值的工具。例如，在10分钟时间点后，所选择的反应条件产生28.9％的具有3个(3个中的)官能化共轭位点的亚基。然而，考虑到剩余的亚基是部分共轭的(15.9％具有1个PEG链，53.9％具有2个PEG链)并将这些数据按照等式1提供到多项式分布中立即意识到，该蛋白质的平均总体衍生化确实是12个共轭位点中的8.4个，达到70.1％。

为了进一步说明考虑用于过程优化的分子的总体衍生化的值，该值被用作实验设计(DOE)方法的反应参数，目的是优化产生最大蛋白质聚乙二醇化的反应条件。当选择单个亚基的共轭的实验输出时，将这些结果与数据分析进行比较。如实验章节中所描述，采用Box-Behnken设计。图14A和图14B举例说明证明试剂浓度对从10分钟至2小时的时间点的总聚乙二醇化效率的影响的第一轮研究的反应表面图。图14A示出如从RP HPLC测定痕迹直接获得的基于“完全聚乙二醇化亚基”(即每个单体的3个官能化共轭位点中的3个)的分析的数据，而图14B示出当基于等式(1)计算总体衍生化时的数据分析。两个图均显示聚乙二醇化效率随着PEG浓度的增加而增加。然而，对于两种分析方式，结论是不同的：例如，如果共轭效率＞90％是目标，则基于图14A的分析可导致过程开发者与基于总体衍生化的分析相比加入高至少2倍浓度的PEG并且孵育更长的反应时间(图14B)。这种明显差异变得更加明显，每个亚基存在更多的共轭位点。仅选择每个亚基的最大共轭作为反应参数而不是总体计算的衍生化不能提供低聚分子的官能化的真实图像并且可能是误导性的。考虑到PEG和其他共轭试剂的高成本，基于总体衍生化的过程优化可以导致显著商品成本(以及时间)节省。

该实例提供一种基于多项分布的适用统计方法，该统计方法允许当蛋白质的大小和性质或轭合物的生物物理性质不允许在天然条件下进行分析时计算低聚蛋白质的总体蛋白质共轭。根据等式(1)计算的总体分子衍生化的定量描述将支持过程优化努力以及用于监管备案的轭合物的准确表征，并且希望有助于将新颖生物轭合物成功地转化至临床。

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等效内容

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践这些实施例。前述说明和实例详述了某些实施例，并且描述了诸位发明人所期望的最佳模式。然而，将了解到，无论前述内容以文本形式表现得如何详细，实施例仍可以以多种方式实践，并且应根据随附权利要求书和它的任何等效物来解释。

如在此使用，术语约是指数值，包括例如整数、分数和百分比，无论是否明确指示。术语约通常是指本领域的普通技术人员将认为等效于所列举的值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所列举范围的+/-5％-10％)。当诸如至少和约的术语在数值或范围列表之前时，这些术语修饰列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包括四舍五入成最接近有效数字的数值。

Claims

1.一种尿酸酶，该尿酸酶包含与SEQ ID NO：1-34中的任一个至少约90％一致的氨基酸序列，其中该序列不是SEQ ID NO：27-33中的任一个。

2.如权利要求1所述的尿酸酶，其中该尿酸酶与SEQ ID NO：1至少约90％一致。

3.如权利要求1所述的尿酸酶，其中该尿酸酶与SEQ ID NO：1至少约95％一致。

4.如权利要求1-3中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶在位置2处不包含T，并且位置2被缺失或取代，其中该编号是相对于SEQ ID NO：27。

5.如权利要求1-4中任一项所述的尿酸酶，其中相对于SEQ ID NO：27的位置2是A。

6.如权利要求1-5中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶包含从约1至约6个半胱氨酸。

7.如权利要求1-6中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：11C、33C、119C和142C，其中该位置编号是相对于SEQ ID NO：27。

8.如权利要求1-7中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：11C、33C、119C、120C、142C、196C、238C、286C和289C，其中该位置编号是相对于SEQ ID NO：27。

9.如权利要求1-8中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶包含两个半胱氨酸。

10.如权利要求1-9中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶在该一个或多个半胱氨酸残基处是聚义二醇化的。

11.如权利要求1-10中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶不包含RGD基序。

12.如权利要求1-10中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶包含RGD基序，并且其中该R已被突变为S。

13.如权利要求1-12中任一项所述的尿酸酶，其中该尿酸酶包含与SEQ ID NO：1-34中的任一个相差从约1至约35个氨基酸的序列。

14.如权利要求13所述的尿酸酶，其中该尿酸酶与SEQ ID NO：1相差从约1至约14个氨基酸。

15.如权利要求1所述的尿酸酶，其中该尿酸酶是SEQ ID NO 1。

16.如权利要求1所述的尿酸酶，其中该尿酸酶是SEQ ID NO：2。

17.一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码如权利要求1-16中任一项所述的尿酸酶。

18.一种载体，该载体包含如权利要求17所述的核苷酸序列。

19.一种细胞系，该细胞系包含如权利要求18所述的载体。

20.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-16中任一项所述的尿酸酶。

21.如权利要求20所述的组合物，其中该尿酸酶在该组合物中形成四聚体。

22.如权利要求21所述的组合物，其中在每个四聚体内的这些尿酸酶单体中的至少95％是二聚乙二醇化的。

23.一种降低高尿酸血症患者中的尿酸水平和/或尿酸盐晶体负担的方法，该方法包括给予如权利要求20-22中任一项所述的组合物。

24.如权利要求23所述的方法，其中该患者患有痛风。

25.如权利要求24所述的方法，其中该患者患有慢性难治性痛风和/或痛风石性痛风。

26.如权利要求23所述的方法，其中该患者患有肿瘤溶解综合征。

27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中该尿酸酶是皮下给予的。

28.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中该尿酸酶是静脉内给予的。

29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中该患者在治疗前具有高于6.8mg/dL的血清尿酸盐水平并且在治疗后具有低于6.8mg/dL的水平。

30.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其中该方法不与免疫原性相关。

31.如权利要求23-30中任一项所述的方法，其中该方法不与过敏性反应相关。