WO2021068925A1 - 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法 - Google Patents

改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021068925A1
WO2021068925A1 PCT/CN2020/120133 CN2020120133W WO2021068925A1 WO 2021068925 A1 WO2021068925 A1 WO 2021068925A1 CN 2020120133 W CN2020120133 W CN 2020120133W WO 2021068925 A1 WO2021068925 A1 WO 2021068925A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
seq
uricase
variant
sequence
Prior art date
Application number
PCT/CN2020/120133
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
黄国锋
赵朋
陈思
李铁
李瑞胜
张静
周岳华
刘洪川
姚盛
Original Assignee
上海君实生物医药科技股份有限公司
苏州君盟生物医药科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 上海君实生物医药科技股份有限公司, 苏州君盟生物医药科技有限公司 filed Critical 上海君实生物医药科技股份有限公司
Priority to JP2022521317A priority Critical patent/JP2022553648A/ja
Priority to KR1020227015028A priority patent/KR20220078647A/ko
Priority to US17/767,718 priority patent/US20230073183A1/en
Priority to AU2020362820A priority patent/AU2020362820A1/en
Priority to BR112022005757A priority patent/BR112022005757A2/pt
Priority to EP20874785.7A priority patent/EP4043559A1/en
Priority to CA3153029A priority patent/CA3153029A1/en
Priority to CN202080070950.5A priority patent/CN114502728A/zh
Publication of WO2021068925A1 publication Critical patent/WO2021068925A1/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

提供了改进的尿酸酶及其治疗高尿酸血症的方法以及包含该尿酸酶的药物组合物。该改进的尿酸酶包含与SEQ ID NO:1具有至少约90%的一致性的氨基酸序列，且所述序列不是SEQ ID NO:1。

Description

改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法 技术领域
本发明涉及改进的尿酸酶和/或PEG-尿酸酶，及其用于治疗高尿酸血症的方法。
背景技术
痛风和高尿酸血症是目前危害人类健康的常见疾病，据统计高尿酸血症的发病率已经达到了人群的10％。痛风是由于血尿酸水平过高而造成尿酸盐结晶在关节中沉淀而导致的一种急性关节炎。一方面，是随着人们饮食和生活习惯的变化，高蛋白和高嘌呤食物的摄取增加，痛风患者的数量逐年增加；另一方面，某些恶性肿瘤，特别是白血病和淋巴瘤患者放化疗之后，在短期内将有大量的尿酸沉积于肾脏而引起的剂型肾功能衰竭。近几十年来，有很多科学家致力于将其他种属来源的尿酸酶用于人类高尿酸血症相关疾病的治疗。但是，异种蛋白应用于人体内最大的问题之一就是蛋白的免疫原性引起的抗蛋白反应和变态性反应。后来科学家采用乙二醇(PEG)对蛋白进行共价修饰，证明能够降低蛋白免疫原性，增加蛋白溶解度并延长蛋白的半衰期。
目前临床上批准的尿酸酶类药物有两种，其一是Krystexxa，另一个是Elitek。Krystexxa(聚乙二醇重组尿酸酶(pegloticase))是经批准的用于治疗常规疗法难治的成人患者的慢性痛风的聚乙二醇化尿酸酶，其是高聚乙二醇化的猪和狒狒尿酸酶序列的嵌合蛋白，可通过静脉内注射在2小时内给药完毕。Krystexxa含有针对过敏性反应和输液反应的黑框警告。而Elitek(拉布立酶)是被指示用于初始管理患有白血病、淋巴瘤和实体瘤恶性肿瘤的儿童和成人患者的血浆尿酸水平的修饰的重组黄曲霉尿酸酶，这些患者接受预期导致肿瘤溶解和血浆尿酸随后升高的抗癌治疗。但是Elitek在体内具有16-21小时的半衰期，并且必须经由静脉输注每天给药。同样的，Elitek也具有针对过敏性反应和溶血的黑框警告。
鉴于以上情况，本领域迫切需要开发用于治疗高尿酸血症的更安全、更方便、且具有更低免疫原性的药物。
发明内容
为了克服现有技术中尿酸酶类药物已知的副作用，获得更加安全、方便和具有更低免疫原性的尿酸酶类药物，进行本发明所述技术方案的研究。
本发明一方面提供了改进的尿酸酶序列，所述的尿酸酶包含与SEQ ID NO：1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的氨基酸序列，且所述序列不是SEQ ID NO：1。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差约1个至约22个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸)。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差22个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差21个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差20个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差19个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差18个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差17个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差16个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差15个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差14个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差13个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差12个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差11个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差10个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差9个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差8个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差7个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差6个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差5个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差4个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差3个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差2个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶与SEQ ID NO：1相差1个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶可以因在氨基酸序列中包含添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基而与SEQ ID NO：1不同。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶为在N-末端和/或C-末端处被截短的SEQ ID NO:1的片段，其中本发明所述片段保留了酶活性。
在一些实施方式中，本发明所述SEQ ID NO:1的片段为N-末端截短了1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)的片段。
在一些优选的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了17个氨基酸的序列。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短约1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)，并且替换成约1-8个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8)的序列。
在一些优选的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了17个氨基酸，并且替换成约1-8个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8)的序列。
在一些优选的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了17个氨基酸，并且替换成8个氨基酸的序列。
在一些具体的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了17个氨基酸(MTATAETSTGTKVVLGQ)，并且替换成MTNIILGK或MANIILGK氨基酸的序列。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶为在SEQ ID NO：1的C-末端截短约1-5个氨基酸(例如，约1、2、3、4或5)的序列。
在一些优选的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的C-末端截短了5个氨基酸的序列。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N末端截短了约1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)，且C-末端截短了约1-5个氨基酸(例如，约1、2、3、4或5)的序列。
在一些具体的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N末端截短了17个氨基酸，且C-末端截短了5个氨基酸的序列。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了约1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)，并替换成约1-8个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8)，且C-末端截短了约1-5个氨基酸(例如，约1、2、3、4或5)的序列。
在一些优选的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了17个氨基酸，并替换成8个氨基酸，且C-末端截短了5个氨基酸的序列。
在一些具体的实施方式中，本发明所述尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了17个氨基酸(MTATAETSTGTKVVLGQ)，并替换成M(T/A)NIILGK氨基酸，且 C-末端截短了5个氨基酸的序列。
在另一个实施方式中，所述的截短的尿酸酶含有约1至约13个额外的氨基酸变化(例如添加、缺失或取代)。
在一些实施方式中，为了延长蛋白质的半衰期和/或减轻免疫原性，将尿酸酶序列与合成或生物合成聚合物融合表达或共价连接。可用于本发明的示例性聚合物是聚乙二醇(PEG)、磷酰胆碱聚合物、重复肽或“X-TEN”序列的聚合物、或基于碳水化合物的聚合物如羟乙基淀粉。
在一些实施方式中，合成或生物合成聚合物与尿酸酶的N-末端和/或C-末端融合表达，以便延长蛋白质的半衰期和/或减轻免疫原性。
在一些实施方式中，对尿酸酶序列进行修饰以产生用于共价连接的1-6(例如，1、2、3、4、5或6)个表面可及位点。例如，在一些实施方式中，尿酸酶序列被修饰成含有1、2、3、4、5或6个表面可及的半胱氨酸残基，聚合物(如PEG)可以与这些半胱氨酸残基共价连接。
在一些实施方式中，通过添加、缺失和/或取代使天然存在的尿酸酶序列在所希望的位置处引入新的半胱氨酸，以形成能够改变药物代谢动力学行为的聚合物或多肽的位点特异性共价连接。
在一些实施方式中，通过分析尿酸酶的晶体结构来指导用于Cys取代的适当氨基酸的选择，以便确定哪些氨基酸残基是表面可及的。然后选择一个或多个表面可及的氨基酸将其修饰成半胱氨酸。
在一些实施方式中，最终修饰的尿酸酶序列中的这些半胱氨酸位于表面可及位置中，这样使得这些半胱氨酸可以被聚乙二醇化。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶包含约1至约7个半胱氨酸残基，特别是约1、2、3、4、5、6或7个半胱氨酸残基。在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶包含约2个半胱氨酸残基。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶包含附接至一个或多个半胱氨酸残基的PEG部分。对半胱氨酸残基的数量和位置的控制允许通过对PEG附接位点的数目、以及轭合物的最佳性质(包括生物物理属性和酶活性)来控制。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：35、194，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：35、194，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：3。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：35、 82、142、194、216、287和288，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下位置中的至少一个中包含半胱氨酸：35、82、142、194、216、287和288，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：3。在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下两个位置中包含半胱氨酸：142和216，35和288，35和142，216和288，35和194，或82和287，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：3。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下两个位置中包含半胱氨酸：142和216，35和288，35和142，216和288，35和194，或82和287，并在第205和/或第208位存在取代突变，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：3。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下两个位置中包含半胱氨酸：142和216，35和288，35和142，216和288，35和194，或82和287，并在第205位存在S205D或S205E取代突变，和/或在208位存在G208R、G208K或G208S的取代突变，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：3。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶在以下两个位置中包含半胱氨酸：142和216，35和288，35和142，216和288，35和194，或82和287，并存在S205D和/或G208R的取代突变，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：3。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、4、5、6、7或8所示。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第142位和第216位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第288位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第142位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第216位和第288位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第194位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第82位和第287位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第142位和第216位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第288位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第142位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第216位和第288位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第194位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第82位和第287位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
本发明第二方面提供了一种包含本发明所述的尿酸酶的药物组合物，以及利用本发明所述组合物降低哺乳动物体液中尿酸水平的方法。作为一种优选的实施方式，所述药物组合物包括上述提到的任一PEG-尿酸酶和药学上可接受的载体。
本发明第三个方面提供了一种降低哺乳动物体液和组织中尿酸水平的方法。作为一种优选的实施方式，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的PEG-尿酸酶，所述有效量为可有效降低尿酸水平的量。
附图说明
图1：各种尿酸酶的酶比活性对比。
图2：各种尿酸酶的热稳定性实验。
图3：各种尿酸酶热稳定性研究。3a：蛋白分子4℃PR-HPLC分析；3b：蛋白分子4℃SEC-HPLC分析。
图4：PEG化修饰的尿酸酶酶活动力学研究评估。
图5：PEG化修饰的尿酸酶热稳定性评估。
图6：PEG化修饰的尿酸酶体内药效评估。
具体实施方式
本发明涉及改进的尿酸酶序列，在此涵盖了许多不同的尿酸酶序列。所述的尿酸酶可以包含与SEQ ID NO：1至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，其中本发明所述尿酸酶的序列不是SEQ ID NO：1。本发明也提供了上述改进的尿酸酶的PEG化物，以及上述PEG-尿酸酶的药物组合物。这些改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶：
(1)提高了蛋白的热稳定性、溶解性和酶活；
(2)避免了分子间的高聚化；
(3)PEG覆盖可能存在的抗原表位，降低存在的免疫原性，增加在血液中的半衰期；
(4)比野生型尿酸酶具有相似或更高的酶活性。
术语
为了更易于理解本发明，下文具体定义某些科技术语。除非本文中别处另有明确说明，否则本文所用的科技术语皆具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所了解的含义。
尿酸氧化酶(尿酸酶)
尿酸氧化酶(尿酸酶)是一类酶，这类酶催化尿酸氧化，氧化产物是更易于溶解的尿囊素。尿囊素属于嘌呤类代谢物，更易于排泄。其是由四个相同的34KDa亚基组成的同源四聚体酶，该酶作为开始一系列反应的起始物，将尿酸转化为更易溶解和更易排泄的产物(尿囊素)，即尿酸酶催化尿酸(UA)与O 2和H 2O反应而形成5-羟基-异尿酸酯(HIU)和H 2O 2的释放。HIU是一种经历非酶水解生成2-氧代-4-羟基-5-脲基咪唑(OHCU)且随后自发的脱羧基从而形成外消旋尿囊素的不稳定的产物。在含有功能性尿酸酶的物种中表达两种额外的酶(HIU水解酶和OHCU脱羧酶)，这两种额外的酶能更快的催化这些反应从而产生(s)-尿囊素。功能性尿酸酶在很多种生物体中发现，比如古细菌、细菌和真核生物。但是，在人和一些灵长类动物中并不表达尿酸酶。这是由于在密码子33处、密码子187处出现了无义突变，以及在内含子2中的剪接受体位点处的突变造成的。总之，在人体中尿酸酶表达的缺乏导致了高的全身UA水平，且在一些情况下导致高尿酸血症，如痛风和肿瘤溶解综合征的发生。据保守估计，中国现有的高尿酸血症患者达到了1.2亿，高尿酸血症已成为继高血压、高血糖、高血脂之后的第四高。痛风的定义是血清UA水平超过体液中的UA溶解度的一种炎症性关节炎，高于6.8mg/dL的血清UA水平可导致组织中UA结晶形成，从而引起急性炎性反应。痛风导致慢性疼痛、在工作和家庭生活中的功能障碍、以及健康相关的生活质量受损等。肿瘤溶解综合征(TLS)是指肿瘤细胞短期内大量溶解释放细胞内代谢产物，引起以高尿酸血症、高血钾、高血磷、低血钙和急性肾 衰竭为主要表现的一组临床综合征。
聚乙二醇(PEG)
其是具有结构H-(O-CH 2-CH 2) n-OH的聚醚化合物。最通常用于蛋白质共价连接的PEG试剂是具有结构CH 3-O-(CH 2-CH 2-O) n-X的单甲氧基聚(乙二醇)衍生物，其中X含有线性接头和反应性官能团(线性PEG)，n为110-18200的整数。在某些情况下，X可以含有支化元件，这样使得PEG试剂含有一个反应性官能团和多于一个PEG聚合物链(支化PEG)或多于一个反应性官能团和PEG聚合物链(叉状PEG)。PEG试剂可以包含约5、10、20、40、60和80KDa的总PEG聚合物。
在一些实施例中，硫醇反应性PEG可以用于与至少一个半胱氨酸上的硫醇基团反应。例如，可以使用PEG-马来酰亚胺，以及PEG-邻吡啶基二硫化物，PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺。在其他实施方式中，硫醇反应性PEG可以是带有单个硫醇反应性部分的直链或支链结构，或者可以是每个PEG分子带有两个或两个以上反应性基团的叉状结构。
本领域已知多种方法可以PEG化尿酸酶中的一个或多个半胱氨酸。本发明均可采用。
“有效量”包括足以改善或预防医学病症的症状或体征的量。有效量还意指足以允许或便于诊断的量。特定患者或兽医对象的有效量可根据例如待治疗的病况、患者的总体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重程度等因素而变化。有效量可以是避免明显副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。结果可导致诊断测量或参数改进至少5％、通常为至少10％、更常为至少20％、最常为至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、最优选至少60％、理想为至少70％、更理想为至少80％、最理想为至少90％，其中100％定义为正常受试者显示的诊断参数(参见例如Maynard等(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，Boca Raton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good ClinicalPractice，Urch Publ.，London，UK)。
“一致性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。两个序列间的一致性百分比是两个序列共有的匹配位置或相同位置数除以所比较的位置数×100的函数。例如，如果在对序列进行最佳比对时两个序列10个位置中有6个匹配或相同，则两个序列是60％的一致性。一般在比对两个序列时进行比较以得到最大百分比一致性。
本文所使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”一般目标区末端或以外的序列信息必须是可得的，使得可设计寡核苷酸引物；这些引物可与待扩增模板的相反链的序列相同或相似。2个引物的5’端核苷酸可与扩增材料的末端一致。可采用PCR扩增特定的RNA序列、来自全基因组DNA的特定DNA序列和自细胞总RNA、噬菌体或质粒序列转录的cDNA等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp Quant.Biol.51:263；Erlich主编 (1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y)。本文所用的PCR被视为是一个(但不是唯一的)用于扩增核酸试验样品的核酸聚合酶反应方法的实例，该方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶以扩增或产生特定的核酸片段。
改进的尿酸酶
本发明总的来讲涉及改进的尿酸酶，及PEG-尿酸酶及其用于治疗哺乳动物高尿酸血症的用途。更具体而言，本发明提供了与SEQ ID NO：1具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的尿酸酶氨基酸序列，且所述序列不是SEQ ID NO：1，以及PEG-尿酸酶及其用途。
本发明提供的尿酸酶与SEQ ID NO：1相差从约1个至约20个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)，即与SEQ ID NO:具有约1到约20个氨基酸不同。
在一个或多个实施方式中，本发明提供的尿酸酶可以因在氨基酸序列中包含添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基(如1-20个)而与SEQ ID NO：1不同。用于在氨基酸序列中引入氨基酸添加、缺失和取代的方法是本领域已知的。例如，在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶的序列为在SEQ ID NO：1的N-末端和/或C-末端处被截短的序列，其中该截短的尿酸酶保留了酶活性。在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了约1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)的序列；在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了约1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)，且替换成约1-8个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8)的序列；在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的C-末端截短了约1-5个氨基酸(例如，约1、2、3、4或5)的序列；在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N末端截短了约1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)，且C-末端截短了约5个氨基酸(例如，约1、2、3、4或5)的序列；在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶的序列为SEQ ID NO：1的N-末端截短了约1-17个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17)，并替换成约1-8个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8)，且C-末端截短了约5个氨基酸(例如，约1、2、3、4或5)的序列。在一些实施方案中，N末端截短后被氨基酸序列MTNIILGK或其片段所替换；在一些实施方案中，该MTNIILGK序列中的第2个氨基酸残基T可任选地被其它氨基酸残基取代，如被丙氨酸或与丙氨酸同属于非极性氨基酸的其它氨基酸， 如脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸取代。
在某些实施方案中，本发明提供的尿酸酶的序列为在SEQ ID NO:1的第175、178和258位置的至少一个位置上具有取代突变的序列。优选地，第175位上取代后的氨基酸残基为脯氨酸或与脯氨酸同属于非极性氨基酸的其它氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；优选地，第178位取代后的氨基酸残基是谷氨酸或与谷氨酸同属于极性带电荷的其它氨基酸，如天冬氨酸；优选地，第258位上取代后的氨基酸残基是丝氨酸或与丝氨酸同属于极性不带电荷的其它氨基酸，如谷氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等。优选地，所述氨基酸取代至少包括第175位和第178位的氨基酸取代，任选还包括第258位上的氨基酸取代。更优选地，本发明的尿酸酶的序列为SEQ ID NO:1的序列中第175位为P、且第178位为E，任选地第258位为S的序列；进一步优选地或任选地，该尿酸酶的N末端和/或C末端还具有前文任一方式所述的截短和/或替换。优选地，本发明也包括与具有此处所述取代突变的尿酸酶序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的氨基酸序列，且此类序列上至少第175、178和258位上的氨基酸残基为本发明所述的突变后残基，如分别为P、E和S。在一些实施方案中，本发明提供的尿酸酶的序列进一步或独立地在SEQ ID NO:1第205位和/或第208位存在取代突变。在一些实施方案中，本发明的尿酸酶的序列为在SEQ ID NO:1的第205和208位置的至少一个位置上具有取代突变的序列。优选地，第205位上取代后的氨基酸残基为天冬氨酸或与天冬氨酸同属于极性带负电荷氨基酸的谷氨酸；第208位上取代后的氨基酸残基为精氨酸或与精氨酸同属于极性带正电荷氨基酸的赖氨酸或组氨酸。
在某些实施方式中，为了延长蛋白质的半衰期和/或减轻免疫原性，本发明将本文任一实施方案所述的尿酸酶序列与合成或生物合成聚合物共价连接或重组表达，可用于本发明的示例性聚合物是聚乙二醇(PEG)、磷酰胆碱聚合物、重复肽或“X-TEN”序列的聚合物、或基于碳水化合物的聚合物如羟乙基淀粉。在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶序列进行修饰以产生用于共价连接的1-6(例如，1、2、3、4、5或6)个表面可及位点；例如，在一些实施方式中，尿酸酶序列被修饰成含有1、2、3、4、5或6个表面可及的半胱氨酸残基，聚合物(如PEG)可以与这些半胱氨酸残基共价连接；在某些实施方式中，本发明提供的尿酸酶在以下位置中的至少一个包含半胱氨酸：35、82、142、194、216、287和288，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1。在某些实施方案中，本发明提供的尿酸酶在以下位置中的两个包含半胱氨酸：35、82、142、194、216、287和288，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。优选地，本发明提供的尿酸酶在以下两个位置中包含半胱氨酸：142和216，35和288，35和142，216和288，35和194， 或82和287，尤其优选在选自35、142、194、216和288中的任意两个位置上包含半胱氨酸。在一些实施方案中，所述具有半胱氨酸突变的尿酸酶是在SEQ ID NO:1的基础上在以下位置中的至少一个包含半胱氨酸的尿酸酶：35、82、142、194、216、287和288，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1。在优选的实施方案中，这类尿酸酶序列为在SEQ ID NO:1的C末端截短了5个以内的氨基酸残基的序列的基础上在前述一个或多个位置上具有半胱氨酸突变的尿酸酶。在一些实施方案中，这类尿酸酶序列除引入上述半胱氨酸突变外，还在第205位和/或第208位存在前文任一实施方案所述的取代突变，优选的取代突变为S205D和/或G208R。在一些实施方案中，这类尿酸酶的序列为SEQ ID NO:1的C末端截短了5个以内的氨基酸残基的序列，引入前文任一实施方案所述半胱氨酸突变(尤其是在选自35、142、194、216和288中的任意两个位置上包含半胱氨酸)，且在第205位和/或第208位存在前文任一实施方案所述的取代突变(优选为S205D和/或G208R)的序列。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第142位和第216位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第288位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第142位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第216位和第288位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第194位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第82位和第287位的氨基酸残基均为C。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第142位和第216位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第288位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第142位的氨基酸残基均为C，第205位氨基 酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第216位和第288位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第194位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
在一些实施方式中，本发明所述尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第82位和第287位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
其中，SEQ ID NO：1为野生型微球菌属尿酸酶的序列，其是NCBI登陆号为D0VWQ1.1的尿酸酶。
用于测定尿酸酶的酶活性的方法是本领域已知的，并且本领域中已知的任何合适的方法均可用于测量本发明所述的尿酸酶的酶活性。
疾病及其治疗或预防
本发明还提供了用本发明的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶治疗或预防哺乳动物体液或组织中高尿酸血症的方法。该方法通常包括给与需要的对象治疗或预防有效量的本发明任一实施方式所述的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶，或含有所述改进尿酸酶或PEG-尿酸酶的药物组合物。可根据实际情况选择合适的给药方式，包括但不限于口服、静脉内、皮下、肌内、动脉内、通过吸入、气雾剂递送。
受试者通常患有与尿酸升高相关的疾病，即受益于尿酸的降低的疾病。通常，与尿酸升高相关的疾病，包括高尿酸血症，比如痛风和肿瘤溶解综合征。
药盒
本发明还提供呈药盒形式的包括本发明的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶的药盒。本发明的药盒包括一种或多种组分，包括但不限于本文所述的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶以及一种或多种其它组分，包括但不限于本文所述药学上可接受的载体。可将所述的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶配成组合物或在药物组合物中与药学上可接受的载体组合。
在一个实施方式中，药盒包括在一个容器(例如无菌玻璃或塑料小瓶)中的本发明的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶或其药物组合物。
药盒可包括药品说明书，其包括有关药盒中的药物组合物和剂型的信息。这类信息一 般帮助患者和医师有效安全地使用所附药物组合物和剂型。例如，药品说明书中可提供有关本发明的联合药物的下列信息：药代动力学、药效学、临床研究、效果参数、适应证和用法、禁忌证、警告事项、预防措施、不良反应、过量使用、适当剂量和给药、供应规格、合适的贮存条件、参考、生产商/批发商信息和专利信息。
药物组合物及剂量
本发明也包括含有本文所述任一改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶的药物组合物。本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的任一改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
为了制备本发明的任一改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶的药物组合物或无菌组合物，可将该抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。
可将本发明的药物组合物制备成本领域周知的各种合适的给药剂型，包括但不限于冻干粉、膏剂、水溶液计或混悬剂等。可通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备以下形式的治疗剂和诊断剂的剂型：例如冻干粉、膏剂、水溶液剂或混悬剂(参见例如Hardman等(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，NY；Avis等(主编)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。
应用
本发明提供本文任一实施方式所述的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶在治疗或预防与尿酸升高的疾病中的应用。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗或预防与尿酸升高相关的疾病的任一实施方式所述的改进的尿酸酶或PEG-尿酸酶。
缩略语
贯穿于本发明的说明书及实施例中，使用以下缩略语：
IPTG  异丙基硫代半乳糖苷
Tm值  熔解温度
DTT  二硫苏糖醇
本发明通过以下实施例进一步阐述，但所述实施例不应被解释为限制本发明。整个申请中引用的所有参考文献的内容通过引用的方式明确并入本文。
实施例
提供以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。
实施例1：尿酸酶的制备
尿酸酶表达载体的构建
合成尿酸酶核苷酸序列(苏州金唯智生物科技科技有限公司)并构建到PET28a表达载体上。该构建目的基因的5'酶切位点是NcoI，3'酶切位点是XhoI。
以AG-2C13分子构建为例，密码子优化后核苷酸序列为：
Figure PCTCN2020120133-appb-000001
Figure PCTCN2020120133-appb-000002
尿酸酶的表达：
通过大肠杆菌BL21(DE3)(Merck)转化实验，并在LB/Kana平板上挑取转化后单克隆菌落。使含有尿酸酶表达载体的大肠杆菌在5ml的LB液体培养基(含有50um/ml的卡那霉素)中37℃培养过夜，将上述种子液接种到含有200ml LB培养基的摇瓶中，接种比例为3％，37摄氏度培养。当菌体生长至OD 600为0.6-0.8后，培养温度降至25摄氏度。加入IPTG使其终浓度为0.3mM诱导表达目标尿酸酶蛋白。
尿酸酶的纯化：
菌体用高压匀浆法或者超声波法破碎，经过离心处理后，用阴离子交换的方法进行进一步纯化，得到纯度>95％的蛋白，进行后续的表征分析。通过DNA测序，获得蛋白酶的氨基酸序列。
以AG-00为例，验证其与优化后DNA序列一致，氨基酸序列为SEQ ID NO：1，如下所示：
Figure PCTCN2020120133-appb-000003
对照尿酸酶的合成
采用与以上相似的方法合成对照尿酸酶MEDI4945，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。MEDI4945是国际申请号为PCT/US2016/032415中公开的尿酸酶，其氨基酸序列如下所示：
Figure PCTCN2020120133-appb-000004
实施例2：微球菌属尿酸酶序列进化
A.优化C-末端
将SEQ ID NO：1截短C-末端5个氨基酸，以便消除C-末端Cys，从而产生SEQ ID NO：3。即通过与实施例1相似的方法，设计DNA特异性引物，以AG-00序列为模板，通过PCR扩增删除其C末端的第298-302位氨基酸，并将构建产物进行DNA测序验证，得到的分子命名为：AG-00-1，序列如下所示：
Figure PCTCN2020120133-appb-000005
B.N-末端氨基酸替换
使用大于15种比对的尿酸酶数据库，发现SEQ ID NO：1中的第1-17位与同种属尿酸酶不是高度保守的，因此，通过与实施例1相似的方法，设计特异性引物，以AG-00为模板，通过PCR扩增用氨基酸序列(MTNIILGK)替换AG-00尿酸酶分子的第1-17位氨基酸，并将构建产物进行DNA测序进行验证，产生SEQ ID NO：4，分子命名为：AG-00-2，序列如下所示：
Figure PCTCN2020120133-appb-000006
C.定点突变
通过与实施例1相同的方法，在AG-00序列的基础上，设计DNA特异性引物，通过搭桥PCR技术将第258位谷氨酰胺(Q)突变为丝氨酸(S)，并将构建产物进行DNA测序验证，产生SEQ ID NO：5，命名为AG-01，序列如下所示：
Figure PCTCN2020120133-appb-000007
采用相似的方法，将第175位谷氨酰胺(Q)突变为脯氨酸(P)，178位苏氨酸(T)突变为谷氨酸(E)，并将构建产物进行DNA测序验证，产生SEQ ID NO：6，命名为AG-02，序列如下所示：
Figure PCTCN2020120133-appb-000008
采用相似的方法，将第175位谷氨酰胺(Q)突变为脯氨酸(P)、第178位苏氨酸(T)突变为谷氨酸(E)和第258位谷氨酰胺(Q)突变为丝氨酸(S)，并将构建产物进行DNA测序验证，产生SEQ ID NO：7，命名为AG-05，序列如下所示：
Figure PCTCN2020120133-appb-000009
D.优化N-末端
已知，当蛋白质在大肠杆菌中表达时，N-末端甲硫氨酸可以通过Met氨基肽酶除去，这取决于甲硫氨酸后的第二个氨基酸残基的大小，如果第二位是较小的残基则发生典型的裂解，如果第二位是体积较大的残基，则不发生裂解，或者如果第二位的残基既不是体积大的也不是特别小的，则Met氨基肽酶可裂解部分，从而产生不均一性。因此，为了消除原核生物表达导致的第一位氨基酸的不完全剪切，将SEQ ID NO：4的氨基酸序列中第二位苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，产生SEQ ID NO：8，命名为AG-00-2A。
Figure PCTCN2020120133-appb-000010
E.评估修饰的微球菌属尿酸酶的酶活性
使用Tris-HCl缓冲体系(pH 8.5)，先加入0.25mL尿酸溶液和0.375mL Tris-HCl缓冲液于试管中，于37℃水浴中保温10min，加入0.125ml适当稀释的上述尿酸酶溶液(0.004mg/mL)到试管中，准确反应10min后，加入0.05mL 20％KOH终止反应。测定剩余尿酸在292nm处吸光值，评价经修饰的微球菌属尿酸酶的酶活性，结果如图1所示，可见引入点突变并未影响尿酸酶的酶活性。
尿酸氧化酶活性定义为：在37℃、pH8.5下，每分钟催化1umol尿酸分解所需要的酶量定义为1个酶活力单位。
F.评估修饰的微球菌属尿酸酶的热稳定
将经修饰的上述尿酸酶分子在50℃，60℃，70℃条件下水浴放置30分钟。37℃条件 下，平衡20分钟，然后加入20ul的0.004mg/ml尿酸酶溶液后立即使用酶标仪进行读数，反应10分钟。测尿酸酶剩余酶活，结果以吸光度差值反应。以4℃放置尿酸酶酶活作归一化处理，结果如图2所示。测活体系：50ul浓度800uM的尿酸，30ul缓冲液。
AG-00在60℃热处理半小时后，酶活保持47％，而AG-01、AG-02和AG-05在相同条件下处理，酶活保持率分别为60％，75％和78％。在70℃条件下处理，AG-00酶活保持为6％，尿酸酶AG-01、AG-02和AG-05的酶活保持率分别为17％，20％和15％。可见，点突变的引入提高了酶活热稳定性。
G.评估修饰的微球菌属尿酸酶的Tm值
使用蛋白质Thermo Shift检测试剂盒评估蛋白分子的Tm值。用缓冲液(Na 2HPO 42.34g/L；NaH 2PO 4·H 2O 0.48g/L；蔗糖75.31g/L；Tween80 0.2g/L；pH 7.6±2)将上述尿酸酶稀释至0.5715mg/mL；将试剂盒中1000×荧光染料用超纯水稀释为8×荧光染料；取70μL的0.5715mg/mL尿酸酶与10μL的8×荧光染料在1.5mL EP管中混合均匀并分装至8联PCR管或96孔PCR板中，分装体积为30μL，共分装2个孔。另有空白对照样品由70μL制剂缓冲液与10μL的8×荧光染料混合而成，并分装至8联PCR管或96孔PCR板中，分装体积为30μL，共分装2个孔。另有系统空白对照由70μL超纯水、10μL的8×荧光染料混合而成，分装至8联PCR管或96孔PCR板中，分装体积为30μL，共分装2个孔。
Figure PCTCN2020120133-appb-000011
结果如下表1示。
可见，AG-01、AG-02和AG-05和AG-00-2的Tm D值(第一个蛋白变性的温度)均高于野生型尿酸酶分子AG-00和对照MEDI4945。可见，点突变的引入提高了尿酸酶的热稳定性。
表1
Figure PCTCN2020120133-appb-000012
Figure PCTCN2020120133-appb-000013
实施例3：特异性PEG化
聚乙二醇(PEG)修饰的治疗性蛋白质可随机附接至所选择的蛋白质残基(比如赖氨酸侧链)或者对于特点位点具有特异性。而对于特定位点特异性的PEG化可以更好的控制并产生具有确定的生物活性的高度均匀的聚乙二醇化产物。在用于位点特异性附接的方法中，最广泛使用的是与未配对的半胱氨酸残基进行偶联，而这需要在蛋白质序列中引入一个或多个游离的半胱氨酸残基。而经C-末端截短的AG-00-1分子序列(SEQ ID NO：3)中不含有半胱氨酸，因此可通过氨基酸突变来引入半胱氨酸。
Cys突变引入
为了选择AG-00-1序列中Cys残基引入的潜在位点，考虑以下几个因素：
(1)位点必须远离酶活性位点，以避免影响活性的风险；
(2)位点彼此不可靠近，以避免空间位阻使相邻Cys难以PEG化；
(3)位点必须位于蛋白表面，以确保与硫醇反应性PEG试剂能发生有效的反应；
(4)位点必须不在结构区或保守区。
经过分析，发现满足以上要求的位点包括：A35、F82、S142、T194、E216、G287、和S288，因此，选择以上几个位点作为Cys突变的位点。
采用与实施例1相似的方法引入Cys突变，制备如下分子：AG-2C12、AG-2C13、AG-2C16、AG-2C17、AG-1C13-1、AG-2C01、AG-2C05-1、AG-2C01-1和AG-2C12-1。
蛋白稳定性研究
各种改进尿酸酶在磷酸盐缓冲液中，pH7.0，1mM DTT，4℃条件下放置，使用SEC-HPLC和RP-HPLC比较各蛋白放置稳定性，结果如图3a和3b所示。
RP-HPLC(图3a)结果显示：AG-2C13，AG-2C13-1，AG-2C12，AG-2C01-2纯度较好。SEC-HPLC(图3b)结果显示：AG-2C13，AG-2C17，AG-2C12，AG-2C01-2纯度较好。综合SEC-HPLC和RP-HPLC的结果，以AG-2C13，AG-2C12，AG-2C01-2分子作为优选。
尿酸酶PEG修饰方法：
向2mg的尿酸酶(100mM PBS缓冲液，pH＝7.0，150mM NaCl)中依次加入TCEP.HCl(0.5mg，三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、M-MAL-PEG-10K(27.5mg，马来酰亚胺聚乙二醇，分子量10000Da)，室温反应2小时。反应液使用离子交换层析纯化即可得到聚乙二醇化的尿酸酶。
尿酸酶活性测定方法：使用磷酸盐缓冲体系(pH 7.3)。活性测定体系参考上述方法(实施例2)，测定剩余尿酸在292nm处吸光值。
将上述选择的Cys突变位点进行两两组合后进行PEG化修饰及尿酸酶活性评估。结果见表2。
表2
分子名称 位点突变 单亚基个数 酶活保持 修饰后酶活U/mg
AG-2C12 S142C/E216C 2 98％ 2.0
AG-2C13 A35C/S288C 2 90％ 1.95
AG-2C16 A35C/S142C 2 98％ 1.69
AG-2C17 E216C/S288C 2 90％ 1.85
AG-2C13-1 A35C/S288C 2 113％ 2.33
AG-2C01-2 A35C/T194C 2 99％ 1.55
AG-2C05-1 F82C/G287C 2 44％ 0.67
AG-2C01-1 A35C/T194C 2 92％ 1.43
AG-2C12-1 S142C/E216C 2 102％ 1.65
*注：与AG-2C13、AG-2C01-2和AG-2C12相比，AG-2C13-1、AG-2C01-1和AG-2C12-1还分别包括以下突变：S205D和G208R。
表2所列的分子中引入的两个半胱氨酸都能很好的被PEG修饰，证明该引入位点暴露在分子表面。并且尿酸酶的单个亚基被mPEG双修饰后，酶活保持率从44％到113％不等。此外，在205和208位上引入突变能进一步提高酶活。
实施例4：PEG化修饰的尿酸酶活性评估
A.PEG化尿激酶的酶活动力学研究
使用Tris-HCl缓冲体系(pH 8.5)，尿酸酶工作溶液的母液为2mM尿酸，4℃保存。酶活性测定过程：
设置温度37度，
底物(尿酸)浓度梯度：600微摩尔、500微摩尔、400微摩尔、200微摩尔、100微摩尔、50微摩尔、25微摩尔、12.5微摩尔；
先加入50ul上述尿酸溶液和30ul上述Tris-HCl缓冲液于96孔板，37℃保温20min，然后快速加入20ul适当稀释的尿酸酶溶液(0.004mg/mL)到96孔板。设置程序：反应10min，每间隔20s读取数据一次，启动反应。结果如图4和表3所示。
结果显示，尿酸酶分子的最大反应速率依次为AG-2C01-2-PEG、AG-2C12-PEG、AG-2C13-PEG和MEDI4945。
表3
分子名称 Km Vmax Kcat
AG-2C01-2-PEG 451.4 13.84 5.4
AG-2C12-PEG 355.5 13.24 5.3
AG-2C13-PEG 167.7 9.4 3.6
MEDI4945 101.5 6.8 2.6
注：Km：米氏常数；Vmax：最大反应速率；Kcat：转化数，指单个酶分子在一秒内转化底物的数量。
B.PEG修饰的尿激酶的加速稳定性评估(37℃)
将PEG修饰的尿酸酶放置在37℃恒温箱中，缓冲体系为磷酸缓冲液体系，pH7.0。SEC-HPLC结果如图5所示。可见，在37℃条件下，AG-2C01-2-PEG的稳定性优于AG-2C12-PEG和AG-2C13-PEG。
实施例6：体内药效学研究
通过单次静脉注射(i.v.)给药的方式，在腹腔注射(i.p.)外源性尿酸诱导的高尿酸血症小鼠模型上评价受试物对血清尿酸水平的影响。把120只正常小鼠(ICR-male)随机分成6组，每组20只。第1组、第2组分别作空白对照和溶剂对照给予溶剂，第3组作为阳性对照给予MEDI4945 0.1mg/kg，第4、5、6组作为治疗组分别给予0.1mg/kg剂量的AG-2C13-PEG、AG-2C01-2-PEG以及AG-2C12-PEG。于给药后次日，除空白对照组外，其余各组实验小鼠均腹腔注射尿酸造模(250mg/kg，10ml/kg)，每组1～10号动物采集造模后30min和3h血样，11～20号动物采集1.5h和6h血样。
结果如图6所示。0.1mg/kg剂量的AG-2C13-PEG、AG-2C01-2-PEG以及AG-2C12-PEG 治疗组动物血清尿酸水平在造模后0.5h～6h各个时间点均显著低于溶剂对照组(p<0.01)，于造模后0.5h～1.5h，3个治疗组的动物血清尿酸水平均低于检测下限(AG-2C13-PEG组除外，在1.5h时为8.35μmol/l)。在所测剂量下(0.1mg/kg)，单次注射给予AG-2C13-PEG、AG-2C01-2-PEG和AG-2C12-PEG后，在腹腔注射外源性尿酸诱导的ICR小鼠高尿酸血症模型上对血清尿酸水平有显著降低作用。在此剂量下，尿激酶AG-2C13-PEG、AG-2C01-2-PEG以及AG-2C12-PEG在造模后各时间点效果无明显差异，但在3h后药效均优于MEDI4945。

Claims (15)

  1. 一种尿酸酶，包含与SEQ ID NO：1具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性的氨基酸序列，且所述序列不是SEQ ID NO：1。
  2. 如权利要求1所述的尿酸酶，其特征在于，与SEQ ID NO:1的序列相比，所述尿酸酶的氨基酸序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的添加、缺失或取代。
  3. 如权利要求2所述的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶为在N-末端和/或C-末端处被截短的SEQ ID NO:1的片段，其中该片段保留了酶活性；
    优选地，所述截短为N末端17个以内的氨基酸残基的截短，和/或C末端5个以内的氨基酸残基的截短；任选地，N末端截短后，添加了8个以内的氨基酸残基。
  4. 如权利要求3所述的尿酸酶，其特征在于，
    所述截短为N末端截短了17个氨基酸，即MTATAETSTGTKVVLGQ；
    所述添加为添加了MTNIILGK或MANIILGK的氨基酸序列；和/或
    所述截短为C末端截短了5个氨基酸，即IAGFC。
  5. 如权利要求1所述的尿酸酶，其特征在于，与SEQ ID NO:1相比，所述尿酸酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1第175、178和258位置的至少一个位置上具有取代突变；
    优选地，第175位上取代后的氨基酸残基为脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸；
    优选地，第178位上取代后的氨基酸残基是谷氨酸或天冬氨酸；
    优选地，第258位上取代后的氨基酸残基是丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
  6. 如权利要求1-5中任一项所述的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶序列中经突变引入1-6个表面可及的半胱氨酸残基，并任选的在第205和/或第208位存在取代突变，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1或3。
  7. 如权利要求6所述的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶在以下位置中的1-6个包含半胱氨酸残基：35、82、142、194、216、287和288，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1或3；
    优选地，所述尿酸酶在以下位置中的两个包含半胱氨酸残基：35、82、142、194、216、287和288，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1或3；
    更优选地，所述尿酸酶在以下两个位置中包含半胱氨酸残基：142和216，35和288， 35和142，216和288，35和194，或82和287，其中位置编号是相对于SEQ ID NO：1或3。
  8. 如权利要求1所述的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、4、5、6、7或8所示；或其氨基酸序列为在SEQ ID NO:3的序列的以下两个位置中包含半胱氨酸的氨基酸序列：142和216，35和288，35和142，216和288，35和194，或82和287，并任选地在SEQ ID NO:3第205位和/或第208位存在取代突变，优选地，所述取代突变为SEQ ID NO:3第205位的S被取代成D或E、第208位的G被取代成R、K或S。
  9. 如权利要求8所述的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的氨基酸序列为在SEQ ID NO:3的序列的以下两个位置中包含半胱氨酸的氨基酸序列：142和216，35和288，35和142，216和288，35和194，或82和287，并任选地包含S205D和/或G208R的取代突变。
  10. 如权利要求9所述的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的氨基酸序列：
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第142位和第216位的氨基酸残基均为C；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第288位的氨基酸残基均为C；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第142位的氨基酸残基均为C；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第216位和第288位的氨基酸残基均为C；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第194位的氨基酸残基均为C；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第82位和第287位的氨基酸残基均为C；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第142位和第216位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第288位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第142位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第216位和第288 位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第35位和第194位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R；或
    为SEQ ID NO:3的变体，其中，与SEQ ID NO:3相比，所述变体第82位和第287位的氨基酸残基均为C，第205位氨基酸残基为D，第208位氨基酸残基为R。
  11. 一种偶联物，其含有权利要求1-10中任一项所述的尿酸酶和与该尿酸酶共价连接或融合表达的合成的聚合物。
  12. 如权利要求11所述的偶联物，其特征在于，所述聚合物选自聚乙二醇(PEG)、磷酰胆碱聚合物、重复肽或“X-TEN”序列的聚合物和基于碳水化合物的聚合物。
  13. 如权利要求12所述的偶联物，其特征在于，所述聚合物与所述尿酸酶的N-末端和/或C-末端融合表达，或通过所述尿酸酶上存在的半胱氨酸残基进行共价连接。
  14. 一种药物组合物，其含有权利要求1-10中任一项所述的尿酸酶或权利要求11-13中任一项所述的偶联物，和药学上可接受的载体。
  15. 权利要求1-10中任一项所述的尿酸酶、权利要求11-13中任一项所述的偶联物或权利要求14所述的药物组合物在制备降低哺乳动物体液和组织中尿酸水平或治疗高尿酸血症的药物中的用途。
PCT/CN2020/120133 2019-10-11 2020-10-10 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法 WO2021068925A1 (zh)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022521317A JP2022553648A (ja) 2019-10-11 2020-10-10 改良されたウリカーゼ及びそれを使用した高尿酸血症の治療方法
KR1020227015028A KR20220078647A (ko) 2019-10-11 2020-10-10 개선된 유리카제 및 그의 고요산혈증을 치료하기 위한 방법
US17/767,718 US20230073183A1 (en) 2019-10-11 2020-10-10 Improved uricase and method for treating hyperuricemia using same
AU2020362820A AU2020362820A1 (en) 2019-10-11 2020-10-10 Improved uricase and method for treating hyperuricemia using same
BR112022005757A BR112022005757A2 (pt) 2019-10-11 2020-10-10 Uricase aperfeiçoada e método de tratamento de hiperuricemia usando a mesma
EP20874785.7A EP4043559A1 (en) 2019-10-11 2020-10-10 Improved uricase and method for treating hyperuricemia using same
CA3153029A CA3153029A1 (en) 2019-10-11 2020-10-10 Improved uricase and method for treating hyperuricemia using same
CN202080070950.5A CN114502728A (zh) 2019-10-11 2020-10-10 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910964325.4 2019-10-11
CN201910964325.4A CN112646790A (zh) 2019-10-11 2019-10-11 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021068925A1 true WO2021068925A1 (zh) 2021-04-15

Family

ID=75342725

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2020/120133 WO2021068925A1 (zh) 2019-10-11 2020-10-10 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230073183A1 (zh)
EP (1) EP4043559A1 (zh)
JP (1) JP2022553648A (zh)
KR (1) KR20220078647A (zh)
CN (2) CN112646790A (zh)
AU (1) AU2020362820A1 (zh)
BR (1) BR112022005757A2 (zh)
CA (1) CA3153029A1 (zh)
WO (1) WO2021068925A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022214086A1 (zh) * 2021-04-09 2022-10-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 尿酸酶、其药物组合物及其用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646790A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
WO2023064732A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Georgia State University Research Foundation, Inc. Delivery of therapeutic recombinant uricase using nanoparticles
CN117230034A (zh) * 2023-10-16 2023-12-15 临沂大学 一种高稳定性哺乳动物尿酸氧化酶突变体

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1322243A (zh) * 1998-08-06 2001-11-14 杜克大学 尿酸氧化酶
CN101198693A (zh) * 2005-04-11 2008-06-11 萨文特医药公司 尿酸氧化酶的变体形式及其用途
CN101875922A (zh) * 2009-04-30 2010-11-03 重庆医科大学 来自苛求芽孢杆菌的两种尿酸酶和其突变体及它们的聚乙二醇修饰与应用
CN105543187A (zh) * 2016-02-18 2016-05-04 重庆医科大学 苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体v145a
CN106554948A (zh) * 2015-09-29 2017-04-05 上海生物制品研究所有限责任公司 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用
CN107614007A (zh) * 2015-05-15 2018-01-19 免疫医疗有限责任公司 改进的尿酸酶序列和治疗方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060188971A1 (en) * 1998-08-06 2006-08-24 Duke University Urate oxidase
KR101637010B1 (ko) * 2015-04-24 2016-07-07 광주과학기술원 위치 특이적으로 알부민이 연결된 요산 산화효소 및 단백질에 위치 특이적으로 알부민을 연결하는 방법
US20200308534A1 (en) * 2017-07-07 2020-10-01 Allena Pharmaceuticals, Inc. Recombinant uricase enzyme
CN112646790A (zh) * 2019-10-11 2021-04-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
CN115197923A (zh) * 2021-04-09 2022-10-18 上海君实生物医药科技股份有限公司 尿酸酶、其药物组合物及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1322243A (zh) * 1998-08-06 2001-11-14 杜克大学 尿酸氧化酶
CN101198693A (zh) * 2005-04-11 2008-06-11 萨文特医药公司 尿酸氧化酶的变体形式及其用途
CN101875922A (zh) * 2009-04-30 2010-11-03 重庆医科大学 来自苛求芽孢杆菌的两种尿酸酶和其突变体及它们的聚乙二醇修饰与应用
CN107614007A (zh) * 2015-05-15 2018-01-19 免疫医疗有限责任公司 改进的尿酸酶序列和治疗方法
CN106554948A (zh) * 2015-09-29 2017-04-05 上海生物制品研究所有限责任公司 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用
CN105543187A (zh) * 2016-02-18 2016-05-04 重庆医科大学 苛求芽孢杆菌尿酸酶突变体v145a

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. D0VWQ1.1
"PCR TECHNOLOGY", 1989, STOCKTON PRESS
"Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems", 1990, MARCEL DEKKER
"Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications", 1993, MARCEL DEKKER
"U.S. Pharmacopeia: National Formulary", 1984, MACK PUBLISHING COMPANY
DATABASE UNIPROTKB 5 April 2011 (2011-04-05), ANONYMOUS: "UniProtKB/Swiss-Prot:D0VWQ1.1", XP055799981, retrieved from UNIPROT Database accession no. D0VWQ1 *
HARDMAN ET AL.: "Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics", 2001, MCGRAW-HILL
MAYNARD ET AL.: "A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice", 1996, INTERPHARM PRESS
MULLIS ET AL., COLD SPRING HARBOR SYMP QUANT. BIOL., vol. 51, 1987, pages 263
TAO LEI, LI DANDAN, LI YONGHONG, SHI XINCHANG, WANG JUNZHI, RAO CHUNMING, ZHANG YINGQI: "Designing a mutant Candida uricase with improved polymerization state and enzymatic activity", PROTEIN ENGINEERING, DESIGN AND SELECTION, OXFORD JOURNAL, LONDON, GB, vol. 30, no. 11, 1 November 2017 (2017-11-01), GB, pages 753 - 759, XP055799984, ISSN: 1741-0126, DOI: 10.1093/protein/gzx056 *
WEINERKOTKOSKIE: "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 2000, LIPPINCOTT, WILLIAMS, AND WILKINS

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022214086A1 (zh) * 2021-04-09 2022-10-13 上海君实生物医药科技股份有限公司 尿酸酶、其药物组合物及其用途
CN115197923A (zh) * 2021-04-09 2022-10-18 上海君实生物医药科技股份有限公司 尿酸酶、其药物组合物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022553648A (ja) 2022-12-26
CA3153029A1 (en) 2021-04-15
EP4043559A1 (en) 2022-08-17
CN114502728A (zh) 2022-05-13
CN112646790A (zh) 2021-04-13
BR112022005757A2 (pt) 2022-06-21
AU2020362820A1 (en) 2022-05-05
US20230073183A1 (en) 2023-03-09
KR20220078647A (ko) 2022-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021068925A1 (zh) 改进的尿酸酶及其用于治疗高尿酸血症的方法
AU2017245352B2 (en) Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
KR101647933B1 (ko) 활성화가능한 기질-분해효소의 생체내 시간적 조절
ES2255147T3 (es) Arginina deiminasa derivada de mycoplasma arthritidis y conjugados de polimeros que la contienen.
EP2799540B1 (en) Human arginase and pegylated human arginase and application thereof
US20150010529A1 (en) Thermally stable ph20 hyaluronidase variants and uses thereof
JP2020528742A (ja) 改変された膜型セリンプロテアーゼ１（ｍｔｓｐ−１）ポリペプチドおよび使用方法
US8859251B2 (en) Oligoadenylate synthetase (OAS)
WO2007058381A1 (ja) 基質特異性を変換した新規高機能酵素
KR20130084323A (ko) Ｏａｓ1 유전자에서의 돌연변이
AU752370B2 (en) Utilization of wolinella succinogenes asparaginase to treat diseases associated with asparagine dependence
KR20190026813A (ko) 시스틴의 인간-효소 매개된 고갈
WO2022214086A1 (zh) 尿酸酶、其药物组合物及其用途
US10406214B2 (en) Propionyl-CoA carboxylase compositions and uses thereof
US9322008B2 (en) Mutants of L-asparaginase
JP5678664B2 (ja) ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＢの基質特異性を変換した新規高機能酵素
US20210309984A1 (en) ChiA Enzyme
WO2024046280A1 (zh) 一种聚乙二醇修饰的il-21衍生物及其应用
TW201828926A (zh) 聚乙二醇化精胺酸脫亞胺酶之調配物
WO2021209930A1 (en) Setd7 epigenetic modulators
EP4323532A1 (en) Delivery of gene therapy vectors
NZ720075B2 (en) Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20874785

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3153029

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022005757

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022521317

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20227015028

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020362820

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20201010

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020874785

Country of ref document: EP

Effective date: 20220511

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112022005757

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20220325