ES2255147T3 - Arginina deiminasa derivada de mycoplasma arthritidis y conjugados de polimeros que la contienen. - Google Patents
Arginina deiminasa derivada de mycoplasma arthritidis y conjugados de polimeros que la contienen.Info
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Abstract
Un objeto de la invención es proporcionar una nueva subunidad de la arginina deiminasa purificada (a partir de ahora ADI), obtenida a partir de Mycoplasma arthritidis que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. A este respecto, la invención incluye una molécula aislada de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica ADI que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras y en las ID SEC Nº 1 e ID SEC Nº 2, así como las moléculas de ácido nucleico complementarias a esta. Otros aspectos de la invención incluyen un vector de expresión que contiene un gen clonado de la ADI derivada de Mycoplasma arthritidis; células hospedadoras (recombinantes) útiles para la expresión de la ADI de la presente invención y conjugados poliméricos sustancialmente no antigénicos que contiene la ADI de la presente invención. Otros aspectos adicionales de la invención incluyen un proceso para preparar la ADI purificada, un proceso para preparar composiciones basadasen polímeros sustancialmente no antigénicos que contienen la arginina deiminasa mencionada anteriormente. La invención además proporciona la ADI y sus conjugados según la presente invención para su uso como medicamentos así como el uso de estas ADI y sus conjugados para fabricar una composición para tratar dolencias susceptibles a la arginina deiminasa en mamíferos. Los procedimientos de tratamiento incluyen administrar una cantidad eficaz de las composiciones descritas en este documento, preferiblemente como parte de un conjugado polimérico a mamíferos que necesitan esta terapia.
Description
Arginina deiminasa derivada de Mycoplasma
arthritidis y conjugados de polímeros que la contienen.
La presente invención se dirige a una nueva
arginina deiminasa y composiciones que contienen arginina deiminasa
de acción prolongada. En particular, la invención se dirige a
conjugados de polímeros sustancialmente no antigénicos que contiene
arginina deiminasa derivada de Mycoplasma arthritidis que
muestran niveles elevados de retención de la actividad
enzimática.
Se ha sugerido que la conjugación de proteínas o
enzimas biológicamente activas con polímeros mejora una o más de
las propiedades de vida en circulación, solubilidad en agua o
antigenicidad in vivo. Por ejemplo, algunos de los conceptos
iniciales de acoplamiento de péptidos o polipéptidos con
polietilénglicol (PEG) y polímeros similares solubles en agua se
describen en la patente de EE.UU. Nº 4.179.337, a la cual se hace
referencia en este documento. Los conjugados se forman haciendo
reaccionar un material biológicamente activo con un exceso molar de
varias veces de un polímero que se ha modificado para que contenga
un grupo de unión terminal. La insulina y la hemoglobina estaban
entre los primeros agentes terapéuticos conjugados. Estos
polipéptidos relativamente grandes contienen varios sitios de unión
\varepsilon-amino. Podrían unirse varios polímeros
sin pérdida significativa de actividad biológica.
El proceso de conjugación, sin embargo, no carece
de complicaciones. La conjugación de polímero excesivo o las
reacciones que usan excesos molares de polímeros por encima de
ciertas proporciones pueden dar lugar a la formación de conjugados
inactivos o conjugados que tienen una actividad insuficiente. A
menudo aparecen problemas cuando el sitio activo (es decir, donde se
encuentran los grupos asociados con la bioactividad) en la proteína
o enzima se bloquea como resultado de la unión covalente del
polímero. Este problema puede ser difícil de evitar ya que el
polímero y la proteína o enzima típicamente se unen en reacciones en
solución. Se ha sugerido el bloqueo previo de los sitios activos con
materiales reversibles, tales como fosfato de piridoxal, pero los
resultados no han sido consistentes. Los problemas se agudizan
particularmente con proteínas y péptidos de peso molecular
relativamente bajo. Estos materiales bioactivos a menudo tienen
pocos sitios de unión no asociados con la bioactividad.
La arginina deiminasa (ADI) es un tipo de enzima
que podría beneficiarse de la mejora de las técnicas de conjugación
del polímero. ADI es una enzima que hidroliza la arginina y se ha
postulado que la eliminación de la arginina tiene un efecto mortal
sobre ciertos tumores. En particular, la enzima hidroliza el grupo
guanidinio de la L-arginina en
L-citrulina y amoniaco. La enzima ADI también es
conocida como arginina dihidrolasa, arginina deiminasa o
guanidinodesiminasa. Aunque la ADI se ha obtenido a partir de otros
tipos de cepas de micoplasma, así como de otras fuentes de
microorganismos tales como pseudomonas y estreptococos, hay
variabilidad en la enzima obtenida. En particular, cada cepa
hospedadora produce una enzima que tiene un número diferente de
lisinas así como variaciones en el sitio activo que producen una
enzima que tiene una secuencia primaria y número y localización de
lisinas
diferentes.
diferentes.
Previamente, se han sugerido varios conjugados
polímero-arginina deiminasa. Véase, por ejemplo,
Jpn. J. Cáncer Res. 84, 1195-1200, nov. 1993 que
describe inter alia arginina deiminasa a partir de
Mycoplasma arginini conjugada con
metoxi-polietilenglicol-4,6-dicloro-1,3,5-triacina.
Sin embargo, parece que los conjugados arginina
deiminasa-polímero preparados hasta la fecha no son
aceptables. Uno de los principales inconvenientes ha sido que el
nivel de retención de la actividad arginina deiminasa, proporcionado
por los conjugados altamente modificados, ha sido demasiado bajo en
los estudios de inhibición de crecimiento. Se ha postulado que
ciertos puntos de unión de lisinas en la enzima están estrechamente
conectados con el sitio activo enzimático. Por tanto, los conjugados
altamente modificados que muestran altos niveles de retención de la
actividad no eran posibles con gastos de tiempo y de recursos
razonables.
La presente invención aborda estas
deficiencias.
Un objeto de la invención es proporcionar una
nueva subunidad de la arginina deiminasa purificada (a partir de
ahora ADI), obtenida a partir de Mycoplasma arthritidis que
tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. A este
respecto, la invención incluye una molécula aislada de ácido
nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica ADI
que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras y
en las ID SEC Nº 1 e ID SEC Nº 2, así como las moléculas de ácido
nucleico complementarias a esta.
Otros aspectos de la invención incluyen un vector
de expresión que contiene un gen clonado de la ADI derivada de
Mycoplasma arthritidis; células hospedadoras (recombinantes)
útiles para la expresión de la ADI de la presente invención y
conjugados poliméricos sustancialmente no antigénicos que contiene
la ADI de la presente invención. Otros aspectos adicionales de la
invención incluyen un proceso para preparar la ADI purificada, un
proceso para preparar composiciones basadas en polímeros
sustancialmente no antigénicos que contienen la arginina deiminasa
mencionada anteriormente. La invención además proporciona la ADI y
sus conjugados según la presente invención para su uso como
medicamentos así como el uso de estas ADI y sus conjugados para
fabricar una composición para tratar dolencias susceptibles a la
arginina deiminasa en mamíferos. Los procedimientos de tratamiento
incluyen administrar una cantidad eficaz de las composiciones
descritas en este documento, preferiblemente como parte de un
conjugado polimérico a mamíferos que necesitan esta terapia.
El polímero sustancialmente no antigénico
preferiblemente es un óxido de polialquileno tal como un
polietilénglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 600
a aproximadamente 60.000 y que preferiblemente, tiene un peso
molecular de aproximadamente 12.000. También pueden usarse otros
polímeros sustancialmente no antigénicos. En una realización
preferida, el polímero sustancialmente no antigénico preferiblemente
se conjuga covalentemente a la ADI mediante un enlace uretano o
enlaces similares resistentes a la hidrólisis. Las composiciones que
contienen el conjugado arginina deiminasa-polímero
pueden incluirse como parte de una solución farmacéuticamente
aceptable.
La ADI obtenida a partir de M. arthritidis
de acuerdo con la presente invención difiere de los previamente
publicados en J. Biol. Chem. vol. 253, Nº 17 pág.
6016-6020 (1978) y J. Biol. Chem. vol. 252, Nº 8
pág. 2615-2620 (1977). Estas referencias describen
enzimas ADI denominadas enzimas de tipo I, II y III, que según
informan los autores son proteínas interconvertibles y relacionadas.
Aunque las enzimas ADI publicadas en J. Biol. Chem. y la ADI de la
invención se obtuvieron de la misma cepa 14152 de la American Type
Culture Collection ("ATCC"), la ADI de la invención es
completamente distinguible de las enzimas previamente publicadas
como tipo I, II y III en varias propiedades fundamentales. En primer
lugar, la ADI descrita en este documento tiene sólo dos cisteínas
por subunidad de secuencia. La proteína previamente publicada
incluía dieciocho cisteínas por subunidad. En segundo lugar, la ADI
de la presente invención tiene un pI de aproximadamente 5,25
mientras que la ADI publicada previamente a partir de M.
arthritidis tenía un pI de 7,0. Además, los trabajos publicados
anteriormente también predijeron que la ADI obtenida a partir de
M. arthritidis tendría menos lisinas por subunidad que la ADI
de M. arginini. Los presentes inventores, sin embargo, han
descubierto de forma sorprendente que el caso era el opuesto. Aún
un punto adicional de la diferencia es el hecho de que el resto
N-terminal de la ADI de la presente invención es
serina (tras la eliminación postraduccional de la metionina),
mientras que la ADI de M. arthritidis publicada previamente
tenía una alanina como resto N-terminal. Estas
diferencias son espectaculares y sugieren que hay heterogeneidad en
la ADI obtenida de la obtenida a partir de M. arthritidis.
Aún una posibilidad adicional es que haya más de un gen para la
actividad ADI asociada con M. arthritidis.
Los conjugados arginina
deiminasa-polímero de la presente invención también
ofrecen ventajas sobre las de la técnica anterior. Por ejemplo, la
ADI de la presente invención incluye varias posiciones más de
lisinas susceptibles de ser modificadas que en la ADI de la técnica
anterior, sin recurrir a la preparación de variantes de mutantes de
lisina. Esto permite sustancialmente que se unan covalentemente más
cadenas de polímero a las localizaciones alternas de la superficie
sin que pierda la actividad de inhibición del crecimiento de la
célula tumoral. Además, los conjugados formados de este modo tienen
una vida en circulación in vivo sustancialmente más larga
que los conjugados que tiene niveles similares de retención de
actividad, preparados según la técnica anterior.
Se entenderá que la expresión "dolencia
susceptible a arginina deiminasa" incluye todos los estados de la
enfermedad, tales como crecimientos tumorales, cánceres, o dolencias
relacionadas, que se benefician terapéuticamente de la
administración de arginina deiminasa exógena. Los detalles
concernientes a estas dolencias se proporcionan a continuación en la
Sección 4.
Para un mejor entendimiento de la presente
invención, se hace referencia a la siguiente descripción y su
alcance se señalará en las reivindicaciones adjuntas.
La figura 1 ilustra la secuencia de ADN completa
que codifica la ADI clonada a partir de M. arthritidis ATCC
14152 (1230 bases). Las G subrayadas en los codones de triptófano 5
se cambiaron de A a G mediante mutagénesis dirigida a sitio.
La figura 2 ilustra el producto de traducción
(410 aminoácidos) de la subunidad arginina deiminasa de M.
arthritidis ATCC 14152.
La figura 3 ilustra el alineamiento de las
secuencias de aminoácidos de diversas arginina deiminasas, línea a:
M. arthritidis ATCC 14152; línea b: M. arginini LBIF,
véase Ohno y col. Infection and Immunity 58: nov. 1990, pág
3788-3795; línea c: M. hominis PG21; línea d: M.
orale FERM BP-1970. M. hominis y M.
orale obtenidos según R. Harasawa y col. Microbial. Immunol. 36,
pág. 661-665, 1992.
Por lo tanto, la presente invención incluye una
nueva proteína que comprende la ID SEC Nº 2, que tienen actividad
enzimática de arginina deiminasa y una molécula de ácido nucleico
que codifica la misma. Preferiblemente, la ADI es expresada por un
gen nuevo, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC
Nº 1, que se aísla a partir de M. arthritidis. La presente
invención también incluye procedimientos para fabricar y usar los
mismos. Para que el lector aprecie mejor la siguiente descripción,
se explican los siguientes términos.
La secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 se
presenta en forma de una secuencia de ácido desoxirribonucleico o
ADN. Sin embargo, el experto entenderá que la secuencia de
nucleótidos de la ID SEC Nº 1 también puede prepararse, si es
necesario, en forma de una molécula de ARN. Adicionalmente, los
nucleótidos que comprende la molécula de ADN o de ARN también pueden
estar en forma de derivados o análogos de nucleótidos, tales como,
por ejemplo, los enumerados en la normativa 37 C.F.R. §
1.822(p)(1), cuya descripción se incorpora como referencia en
este documento en su totalidad. Además, la invención también abarca
la secuencia complementaria de las secuencias de nucleótidos según
la invención. El experto apreciará el hecho de que el alcance de la
invención también incluye codones alternos que pueden codificar el
mismo aminoácido debido a la naturaleza degenerada del código
genético.
"Transfección" se refiere a la captación de
un vector de expresión en una célula hospedadora, se exprese o no
de hecho cualquier secuencia codificadora. Los expertos conocen
numerosos procedimientos de transfección. Por ejemplo, la
transfección se efectúa en presencia de un vector de expresión y
altas concentraciones de CaPO_{4} mediante electroporación usando
un vector de expresión fágico o viral para la inserción en una
célula hospedadora, por inserción mecánica de ácido nucleico o
incluso cultivando las células hospedadoras en presencia de
fragmentos de ácido nucleido sin empaquetar. Generalmente, se
reconoce que la transfección ha sido satisfactoria cuando en la
célula hospedadora tiene lugar cualquier indicación del
funcionamiento del vector de interés.
"Transformación" describe la introducción de
un ácido nucleico en un organismo, de modo que el ácido nucleico
sea capaz de replicarse bien como elemento extracromosómico o bien
por integración en el cromosoma hospedador. Dependiendo de la célula
hospedadora usada, la transformación se consigue usando
procedimientos conocidos en la técnica apropiados para células
hospedadoras en particular. El tratamiento con calcio empleando
cloruro cálcico, como describen Cohen, S. N. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA), 69:2110 (1972) y Mandel y col., J. Mol. Biol. 53:154 (1970),
generalmente se usa para procariotas u otras células que están
encapsuladas dentro de paredes celulares (por ejemplo, muchas
células bacterianas y/o vegetales). Para células de mamíferos sin
estas paredes celulares, se prefiere el procedimiento de
precipitación con fosfato de calcio de Graham, F. y van der Eb, A.,
Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales
de transformaciones de sistemas hospedadores de células de mamíferos
se han descritos en la Pat. de EE.UU. Nº 4.399.216 presentada el 16
de agosto de 1983. Típicamente, las transformaciones en levaduras se
realizan según el procedimiento de Van Solingen P., y col. J. Bact.,
130:946 (1977) y Hsiao, C. L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
76:3829 (1979). Sin embargo, también puede usarse cualquier otro
procedimiento conocido en la técnica para introducir ácidos
nucleicos, por ejemplo, ADN en células, tales como, por ejemplo,
mediante inyección nuclear o mediante fusión de protoplastos.
Según se usa en este documento, el término
"complementario" con respecto a un ácido nucleico se refiere a
la cadena opuesta (usando el apareamiento de bases de Watson y
Crick) producida cuando una primera molécula de ácido nucleico se
replica usando esta molécula como molde, para formar una segunda
cadena nueva de ácido nucleico que es complementaria a la primera.
En un aspecto de la invención, se considera que dos moléculas de
ácido nucleico son complementarias entre sí, cuando hibridan o se
unen conjuntamente en condiciones rigurosas.
La expresión "hibridar en condiciones
rigurosas" para describir la hibridación de moléculas de ácido
nucleico incluidas en el alcance de esta invención se refiere a
hibridar en condiciones de alta especificidad de hibridación, por
ejemplo, lavado a baja fuerza iónica y elevada temperatura. Estas
condiciones rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación con NaCl
0,15 M/citrato sódico 0,015 M/NaDodSO_{4} al 0,1% a 50ºC, o
alternativamente, hibridación en presencia de agentes
desnaturalizantes tales como formamida, por ejemplo, formamida al
50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/
polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5
con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. "Hibridación en
condiciones de baja rigurosidad" se refiere a hibridar en
condiciones de hibridación de especificidad reducida. Estas
condiciones incluyen, simplemente a modo de ejemplo, hibridar a 42ºC
en formamida al 20%, SSC x 5, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8,
pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt x 5 y ADN de
esperma de salmón a 5 mg/ml y lavar con SSC x 2, SDS al 0,1% a
42ºC.
Adicionalmente, pueden introducirse mutaciones
específicas en el gen de la arginina deiminasa de la presente
invención usando "mutagénesis dirigida a sitio". Esta es una
técnica convencional en la materia y se realiza, por ejemplo, usando
un cebador oligonucleotídico sintético complementario al ADN del
fago de doble cadena que va a sufrir la mutagénesis, excepto por una
falta de coincidencia limitada, que representa la mutación deseada.
Estas mutaciones pueden incluir, por ejemplo, la deleción, inserción
o sustitución de los codones que expresan aminoácidos naturales.
Estas mutaciones pueden conferir características de proteína
alterada, que puede, por ejemplo, mejorar y/o alterar la estabilidad
oxidativa, térmica y/o de pH de la proteína. Brevemente, en este
procedimiento, el oligonucleótido sintético se usó como cebador para
dirigir la síntesis de una cadena complementaria a la del fago, y el
ADN de doble cadena resultante se transforma en una bacteria
hospedadora que puede mantener al fago. Los cultivos de la bacteria
transformada se disponen en placas de agar, permitiéndose la
formación de placas a partir de células únicas que albergan al fago.
Normalmente de aproximadamente el 50 hasta aproximadamente el 90% de
las nuevas placas contendrán al fago, como cadena sencilla, que
tiene la forma mutada. Las placas se hibridan con el cebador
sintético fosforilado a una temperatura que permite la hibridación
de una zona de coincidencia exacta, pero en el que la falta de
coincidencias con la cadena original es suficiente para prevenir la
hibridación. A continuación, se seleccionan y se cultivan las placas
que hibridan con la sonda y se recupera el ADN. De este modo, el
experto apreciará que la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1
puede someterse convenientemente a mutagénesis mediante técnicas
conocidas en la materia, por ejemplo, mediante sustitución de
nucleótidos, para producir variantes alélicas útiles. Simplemente a
modo de ejemplo, la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 1 se ha
preparado de distinto modo con sustituciones que proporcionan una T
en el nucleótido 39, una C en el nucleótido 104, una A en el
nucleótido 206, una G en el nucleótido 337, una A en el nucleótido
729, una C en el nucleótido 830, una C en el nucleótido 1023, una A
en el nucleótido 6, una T en el nucleótido 15, una C en el
nucleótido 18 y/o combinaciones de las mismas. En particular, la
sustitución específica en 337 podría cambiar la treonina por
alanina.
"Unido de forma operativa" se refiere a una
yuxtaposición de componentes, por ejemplo, una región reguladora y
una fase de lectura abierta, de modo que puede realizarse la función
normal de los componentes. De este modo, una fase de lectura abierta
que está "unida de forma operativa" a secuencias de control se
refiere a una configuración en la que la secuencia codificadora
puede expresarse bajo el control de estas secuencias y en la que las
secuencias de ADN que se han unido están contiguas y, en el caso de
un líder secretor, contiguo y en fase de lectura. Por ejemplo, el
ADN de una presecuencia o líder secretor se une de forma operativa
al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteina que
participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un
potenciador se une de forma operativa a una secuencia codificadora
si éste afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de
unión al ribosoma se une de forma operativa a una secuencia
codificadora si se coloca de modo que facilita la traducción. La
unión se logra por ligamiento a sitios de restricción convenientes.
Si estos sitios no existen, entonces, por ejemplo, se usan
adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo
con la práctica convencional.
"Secuencias control" se refiere a secuencias
de ácido nucleico, necesarias para la expresión de una secuencia
codificadora, unidas de forma operativa a una secuencia codificadora
en un organismo hospedador en particular. Las secuencias control que
son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor,
opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas
y posiblemente, otras secuencias poco conocidas. Se sabe que las
células eucarióticas utilizan como secuencias control, por ejemplo,
promotores, señales de poliadenilación y potenciadores, por nombrar
algunas.
"Sistema de expresión" o "vector de
expresión" se refiere a secuencias de ácido nucleico que
contienen una secuencia codificadora deseada y secuencias control en
unión operativa, de modo que los hospedadores transformados con
estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas.
Para lograr la transformación, el sistema de expresión puede
incluirse en un vector, sin embargo, a continuación la molécula de
ácido nucleico relevante también puede integrarse en el cromosoma
del hospedador.
Según se usa en este documento, "célula",
"línea celular" y "cultivo celular" se usan
indistintamente y todas estas designaciones incluyen a la progenie.
De este modo, "transformantes" o "células transformadas"
incluye la célula sujeto primaria y cultivos derivados de éstas sin
tener en cuenta el número de transferidos. También se entiende que
toda la progenie no tiene porqué ser exactamente idéntica en
contenido genómico, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas.
Se incluye la progenie mutante que tiene la misma funcionalidad que
la analizada en las células originariamente transformadas. Cuando se
pretendan designaciones diferentes, se entenderá por el
contexto.
Los vectores descritos en este documento son
adecuados para su uso en un amplio rango de células hospedadoras de
organismos procarióticos y eucarióticos. En general, se prefieren
procariotas para la clonación inicial de las secuencias de ADN y la
construcción de vectores útiles para la invención. Por ejemplo, es
particularmente útil la cepa MM294 (ATCC Nº 31.446) de E.
coli K12. Otras cepas microbianas, simplemente a modo de
ejemplo, que pueden usarse incluyen cepas de E. coli tales
como E. coli B y E. coli X1776 (ATCC Nº 31.537).
También pueden usarse procariotas para la expresión. Pueden usarse
las cepas mencionadas anteriormente, así como, por ejemplo las
cepas de E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrófico, ATCC Nº
27.325), K5772 (ATCC Nº 53.635), y SR101, bacilos tales como
Bacillus subtilis y otras enterobacteriáceas tales como
Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y
diversas especies de Pseudomonas.
En general, en conexión con estos cebadores se
usan vectores plasmídicos que contienen secuencias replicones y
control que derivan de especies compatibles con la célula
hospedadora. El vector, generalmente lleva un sitio de replicación,
así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la
selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo,
típicamente, E. coli se transforma usando pBR322, un plásmido
derivado de una especie de E. coli (véase, por ejemplo,
Bolívar y col., 1977, Gene, 2: 95). pBR322 contiene genes para
resistencia a ampicilina y tetraciclina y, de este modo, proporciona
medios fáciles para identificar las células transformadas. De forma
similar, los plásmidos pUC proporcionan vectores de clonación
convenientes con moléculas de ADN para selección y replicación
(Yanisch-Perron, y col., 1985, Gene
33:103-119, a cuyas descripciones se hace referencia
en este documento en su totalidad. El plásmido pBR322 u otro
plásmido o fago microbiano, también debe contener o modificarse para
contener, promotores que puedan ser usados por el organismo
microbiano para la expresión de sus propias
proteínas.
proteínas.
Los ``plásmidos se denominan con una letra
minúscula "p" precedida y/o seguida por letras y/o números en
mayúsculas. Los plásmidos de inicio de este documento están
disponibles en el mercado, están a disposición del público sin
restricciones, o pueden construirse a partir de estos plásmidos
disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, se
conocen en la técnica otros plásmidos equivalentes que serán obvios
para el experto.
Los promotores más frecuentemente usados en la
construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas promotores de
la beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa
(Chang y col., 1978 Nature, 375:615; Itakura y col., 1977, Science,
198:1056; Goeddel y col., 1979, Nature, 281:544) y un sistema
promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col, 1980, Nucleic Acids
Res., 8:4057; Sol. Publi. EPO Nº 0036.776). Mientras que estos son
los más frecuentemente usados, se han descrito y utilizado otros
promotores microbianos, y se han publicado detalles relativos a sus
secuencias de nucleótidos, lo que permite a un experto ligarlos
funcionalmente con vectores conocidos en la técnica, por ejemplo,
vectores plasmídicos.
Simplemente a modo de ejemplo, la regulación de
la transcripción en E. coli puede lograrse con cualquiera de
los siguientes promotores inducibles: lac, trp,
phoA, araBAD, T7, y derivados de los promotores
P_{L} y P_{R} de lambda así como otros bien conocidos en la
técnica (por ejemplo, Makrides, 1996, Microbiol. Rev.
60:512-538, a cuya descripción se hace referencia
en este documento en su totalidad). Preferiblemente, el promotor es
el promotor híbrido O_{L}/P_{R}, descrito por Scandella y col.,
en la patente compartida de EE.UU. Nº 5.162.216, a cuya descripción
se hace referencia en ese documento en su totalidad.
Además de procariotas, también pueden usarse
microbios eucarióticos, tales como cultivos de levaduras.
Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería,
es la usada más frecuentemente entre los microorganismos
eucarióticos, aunque frecuentemente se dispone de otras cepas. Para
la expresión en Saccharomyces, frecuentemente se usa, por
ejemplo, el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., 1979, Nature, 282:39;
Kingsman y col., 1979, Gene, 7:141; Tschemper y col., 1980, Gene,
10: 157). Este plásmido ya contiene el gen trip1 que
proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura que no tiene capacidad para crecer en presencia de
triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44.076 o PEP4-1
(Jones, 1977, Genetics, 85: 12). La presencia de la lesión
trip1 como una característica del genoma de la célula
hospedadora de levadura proporciona, entonces, un ambiente eficaz
para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de
triptófano.
Se ha demostrado que el sistema de expresión de
Pichia pastoris alcanza los mayores niveles de producción de
varias proteínas (Cregg, J.M. y col., 1993, Bio/Technology
11:905-910), cuya descripción se incorpora como
referencia en este documento en su totalidad) y puede emplearse para
expresar ADI como una proteína soluble en el citoplasma de Pichia
pastoris.
Las secuencias promotoras adecuadas en vectores
de levadura incluyen los promotores para la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., 1980, J.
Biol. Chem., 255:2073) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col.,
1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149; Holland y col., 1978,
Biochemistry, 17:4900), tales como enolasa,
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. En
la construcción de plásmidos adecuados para la expresión, las
secuencias de terminación asociadas con estos genes también están
ligadas dentro del vector de expresión 3’ de la secuencia deseada
que se va a expresar para proporcionar la poliadenilación del ARNm y
la terminación de la transcripción. Otros promotores, que tiene la
ventaja adicional de una transcripción controlada por las
condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la
alcohol 2 deshidrogenasa, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas
degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno y la
gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa mencionada
previamente, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y
galactosa. Es adecuado cualquier vector plasmídico que contenga
secuencias promotoras, origen de replicación y de terminación
compatibles con levaduras.
Puede proporcionarse un origen de replicación
mediante la construcción del vector para incluir un origen exógeno,
tal como el que puede derivar de SV40 u otra fuente viral (por
ejemplo, polioma, adeno, VSV, BPV) o puede proporcionarse mediante
los mecanismos de replicación del cromosoma de la célula
hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula
hospedadora, a menudo es suficiente con este último.
Los cultivos celulares producen cantidades
satisfactorias de proteína, sin embargo, los refinamientos, usando
una secuencia codificadora secundaria, sirven para potenciar más
incluso los niveles de producción. Una secuencia codificadora
secundaria comprende dihidrofolato reductasa (DHFR) que está
afectada por un parámetro controlado externamente, tal como
metotrexato (MTX), permitiendo de este modo el control de la
expresión mediante el control de la concentración de
metotrexato.
Aunque puede emplearse cualquier cepa de M.
arthritidis como fuente del nuevo gen según la invención,
preferiblemente, la cepa de M. arthritidis que se emplea es
la cepa depositada en la American Type Culture Collection
("ATCC") con número de acceso 14152.
Un gen capaz de expresar la nueva enzima arginina
deiminasa según la invención se aísla, preferiblemente del genoma de
M. arthritidis mediante amplificación del ácido nucleico
dirigida por un cebador y a continuación se clona en cualquier
vector de selección y sistema de expresión adecuado (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, J. Sambrook, E. F.
Fritsch y T Maniatis, Eds., Cold Spring Harbor Press, 1989). El
experto apreciará que puede emplearse cualquier procedimiento de
amplificación de ácidos nucleicos apropiado conocido en la técnica,
utilizando cebadores adecuados. Preferiblemente, el procedimiento de
amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa como,
simplemente a modo de ejemplo, describe Mullís en las Patentes de
EE.UU. Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, a cuyas descripciones se
hace referencia en este documento en su totalidad.
El experto también apreciará que puede emplearse
cualquier vector de expresión plasmídico, fagémico o cósmido,
insertado en las células hospedadores respectivas, para expresar,
seleccionar e identificar un fragmento de ácido nucleico amplificado
que codifica la arginina deiminasa de la invención. Preferiblemente,
se emplea un sistema de expresión de Escherichia coli. Más
preferiblemente, se emplea un sistema de expresión de Escherichia
coli GX6712/pGX9401.
Los cebadores usados para la amplificación del
gen ADI según los ejemplos proporcionados en este documento a
continuación eran oligonucleótidos que tenían las secuencias de ID
SEC Nº 3 y 4, respectivamente. Estos cebadores amplifican de forma
satisfactoria el gen completo. Como se indica en los siguientes
ejemplos, el cebador de la ID SEC Nº 3 difiere del correspondiente
extremo N-terminal de la región codificadora del gen
aislado (ID SEC Nº 1) en tres sustituciones de bases que no alteran
la secuencia del péptido codificado. Las tres sustituciones de base,
cuya numeración se basa en la numeración de la ID SEC Nº 1, son las
siguientes: en la base 6 A se ha sustituido por T, en la base 15 T
se ha sustituido por C y en la base 18 C se ha sustituido por
T.
De este modo, la amplificación satisfactoria del
gen completo que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº 1
fue sorprendente, ya que como resultado de las faltas de
coincidencia mencionadas anteriormente, en relación a la secuencia N
terminal natural del gen ADI aislado, el cebador de la ID SEC Nº 3
hibridaba mal con el fragmento diana, proporcionando de este modo
una explicación a la señal de PCR tan débil que resultaba de la
amplificación usando el cebador de la ID SEC Nº 3.
El experto apreciará que un cebador basado en la
secuencia N-terminal natural exacta de la ID SEC Nº
1 también servirá fácilmente, incluso con mejor eficacia, para
amplificar el gen ADI según la invención.
Los clones proporcionados según los ejemplos
siguientes de este documento incluyen el plásmido pEN232 que
comprende el gen ADI en el vector de expresión pGX 9401. Los dos
aislados de PCR iniciales del gen ADI de M. arthritidis
también se clonaron en el plásmido pBluescript II SK(-) (Stratagene
Cloning Systems, La Jolla, CA) y denominados pEN241 y pEN242. La
clonación del fragmento del extremo N-terminal de un
segmento del gen ADI en pBluescript II SK(-), descrito en el ejemplo
1B, incluía dos clones analizados independientemente denominados
pEN245 y pEN246. Las transformaciones independientes de E.
coli DH5-alfa (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD.) con
los plásmidos pEN241, pEN242, pEN245 y pEN246 producían los clones
E. coli denominados EN243, EN244, EN247 y EN248,
respectivamente.
Una vez que se obtiene una célula hospedadora
transfectada o transformada, se produce fácilmente una molécula de
ácido nucleico que incluye una secuencia según la ID SEC Nº 1
cultivando la célula hospedadora, y extrayendo y aislando el ácido
nucleico según se desee, por procedimientos bien conocidos en la
técnica. Dependiendo del grado de pureza deseado, el ácido nucleido
extraído puede aislarse, o cuando se desee, aislarse sustancialmente
mediante procedimientos conocidos en la técnica, para que esté libre
o sustancialmente libre de proteínas y ácidos nucleicos
contaminantes de la célula hospedadora. De forma similar, las
células hospedadoras que expresan la proteína arginina deiminasa
codificada por los vectores de expresión según la invención, se
cultivan mediante procedimientos adecuados para la célula
hospedadora seleccionada.
Por ejemplo, las células hospedadoras se cultivan
hasta que se alcanzan las densidades celulares deseadas y, a
continuación, las células se separan del medio de cultivo y se
extraen las proteínas y, después de esto, se renaturalizan según
procedimientos conocidos en la técnica. En particular, las células
se separan del medio de cultivo para forma una pasta de células. A
continuación, la pasta de células se resuspende y después se
disgrega mediante procedimientos convencionales, por ejemplo,
disgregación mecánica, por ultrasonidos y/o química.
Preferiblemente, las células se disgregan por procesamiento en un
Microfluidizador (Microfluidics Corp. Newton MA) seguido del lavado
con un tensioactivo adecuado, tal como, por ejemplo, Tritón
X-100.
El homogeneizado resultante se desnaturaliza con
guanidina HCl, 6 M y, a continuación, se diluye en tampón de
replegamiento (por ejemplo, K_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,0), se
retiran las partículas, por ejemplo, mediante centrifugación seguida
de purificación del sobrenadante mediante procedimientos
convencionales, por ejemplo, mediante cromatografía en columna de Q
Sepharose, para proporcionar arginina deiminasa sustancialmente
purificada, por ejemplo, con una pureza de aproximadamente el 60% y
que tiene una actividad específica que oscila de aproximadamente 3 a
aproximadamente 25 UI/mg, o más, y preferiblemente, de
aproximadamente 5 a aproximadamente 20 UI/mg. Puede lograrse una
concentración adicional de la ADI usando un
Centriprep-10, Amicon, Inc. Beverly, MA. Si se
desea, también pueden usarse otras columnas que funcionan de forma
similar.
Para formar los conjugados
polímero-arginina deiminasa de la presente
invención, los polímeros tales como poli(óxidos de alquileno) (POA)
se convierten en formas activas, como tal término es conocido por
los expertos en la técnica. De este modo, uno o ambos grupos
terminales hidroxilo del polímero (es decir, los grupos alfa y omega
hidroxilo terminales) se convierten en grupos funcionales reactivos
que permiten la conjugación covalente. Este proceso frecuentemente
se denomina "activación" y el producto se denomina
"poli(oxido de alquileno) activado". Los polímeros que
contiene tanto grupos de enlace alfa como omega se denominan
polióxidos de alquileno bis-activados. Otros
polímeros sustancialmente no antigénicos se "activan" o hacen
funcionales de forma similar. Entre los polímeros sustancialmente no
antigénicos, se prefieren óxidos de polialquileno monoactivados
(POA), tales como monometoxi-polietilénglicoles. En
realizaciones alternativas, se prefieren polímeros homobifuncionales
bis-activados, tales como PEG
bis-succiminidil carbonato activado.
De este modo, los polímeros activados son
adecuados para reaccionar con la arginina deiminasa y formar
conjugados ADI-polímero en los que la unión
preferiblemente tiene lugar en el grupo amino terminal
\alpha-amino o grupos
\varepsilon-amino de las lisinas encontradas en la
ADI.
En un aspecto preferido de la invención, se
forman las uniones carbamato (uretano) usando los grupos
\varepsilon-amino y los óxidos de polialquileno
activados. Preferiblemente, la unión de carbamato se forma como se
describe en la patente compartida de EE.UU. Nº 5.122.614, a cuya
descripción se hace referencia en este documento. Esta patente
describe la formación de derivados mono y bis
N-succinimidil carbonato de óxidos de polialqueno
(SC-PEG). Las alternativas incluyen polímeros de
para-nitrofenil carbonato y carbonil imidazol
activados.
En otro aspecto de la invención, los polímeros
activados con enlazadores que forman amidas tales como óxidos de
polialquileno activado con imidotiona, ésteres de succinimidilo o
similares, se usan para efectuar la unión entre la arginina
deiminasa y grupos terminales del polímero, véase por ejemplo, la
patente de EE. UU. Nº 5.349.001 de Greenwald y col., a cuya
descripción se hace referencia en este documento. Otros aspectos
adicionales de la invención incluyen el uso de otros polímeros
activados para formar uniones covalentes del polímero con la
arginina deiminasa a través de grupos e-amino u
otros. Por ejemplo, pueden usarse las formas de isocianato o
isotiocianato de polímeros terminalmente activados para formar
enlaces a base de urea o tiourea con los grupos amino lisina. Los
PEG-dialdehidos también pueden reaccionar con la
arginina deiminasa, seguido de la reducción con NaCNBH_{3} para
formar un enlace amino secundario.
Los polímeros adecuados variarán sustancialmente
en peso, sin embargo, para los fines de la presente invención,
normalmente se seleccionan los polímeros que tienen un peso
molecular que oscila de aproximadamente 200 a aproximadamente
60.000. Se prefieren pesos moleculares de aproximadamente 1.000 a
aproximadamente 40.000 y particularmente se prefieren de 2.000 a
aproximadamente 20.000.
Preferiblemente, las sustancias poliméricas
incluidas también son solubles en agua a temperatura ambiente. Una
lista no limitante de estos polímeros incluye homopolímeros de óxido
de polialquileno, tales como polietilénglicol (PEG) o
polipropilénglicoles, polioles polioxietilenado, copolímeros de los
mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se
mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros bloqueados.
Como alternativa a los polímeros a base de PAO,
pueden usarse materiales eficazmente no antigénicos, tales como
polímeros a base de dextrano, polivinilpirrolidonas,
poliacrilamidas, alcoholes de polivinilo, carbohidratos o similares.
De hecho, la activación de grupos alfa y omega terminales de estas
sustancias poliméricas puede efectuarse de manera similar a la usada
para convertir los óxidos de polialquileno y, de este modo, serán
evidentes para los expertos. Los expertos en la técnica entenderán
que la lista anterior es solamente ilustrativa y se contemplan todos
los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas en
este documento. Para los fines de la presente invención,
"eficazmente no antigénico" significa todos los materiales
entendidos en la técnica como no tóxicos y que no provocan una
respuesta inmunogénica apreciable en mamíferos.
Las reacciones de conjugación, algunas veces
denominadas como reacciones de pegilación, generalmente tienen lugar
en una solución de aproximadamente equimolar a aproximadamente con
un exceso varias veces molar de polímero activado. Preferiblemente,
el exceso molar de polímero activado es de aproximadamente 50 veces
o mayor. Una manera de mantener la bioactividad de la arginina
deiminasa es evitar sustancialmente incluir las lisinas de la
arginina deiminasa asociadas con el sitio activo en el proceso de
conjugación con el polímero. Dada la naturaleza normalmente no
específica de la reacción de conjugación esta etapa teórica, a
menudo, es difícil de conseguir en la práctica. El procedimiento de
la presente invención, sin embargo, proporcionan conjugados de
arginina deiminasa que retiene niveles elevados de actividad, usando
la arginina deiminasa obtenida de M. arthritidis, la cual
tiene un aumento sustancial del número de lisinas disponibles para
su unión al polímero y evitando el uso de un exceso molar demasiado
alto, por ejemplo, más de aproximadamente 100 veces, de polímero
activado durante las reacciones de conjugación.
De este modo, las condiciones de conjugación
incluyen la reacción de arginina deiminasa obtenida de M.
arthritidis con un polímero sustancialmente no antigénico
activado adecuadamente, tal como SC-PEG, en una
solución tamponada adecuada en una proporción de polímero activado
con respecto a arginina deiminasa de aproximadamente 50 a
aproximadamente 100 veces.
La reacción de conjugación se realizó en
condiciones relativamente suaves para evitar la inactivación de la
arginina deiminasa. Las condiciones suaves incluyen el mantenimiento
del pH de la solución de reacción en el intervalo de
6-8 y las temperaturas de reacción en el intervalo
de aproximadamente 0-30ºC y, preferiblemente, a
aproximadamente 4ºC durante aproximadamente una hora. Los tampones
adecuados incluyen soluciones tamponadoras capaces de mantener el
intervalo de pH preferido de 6-8 sin interferir con
la reacción de conjugación. Una lista no limitante de tampones
adecuados incluye, por ejemplo, tampón fosfato, tampón citrato,
tampón acetato.
Aunque las condiciones de reacción descritas en
este documento pueden dar lugar a alguna arginina deiminasa sin
modificar, la arginina deiminasa sin modificar puede recuperarse
fácilmente y reciclarse en futuros lotes para reacciones adicionales
de conjugación.
Las reacciones de conjugación de la presente
invención inicialmente proporcionan una mezcla o conjunto de
reacción que contiene conjugados de arginina deiminasa que tienen de
aproximadamente 16 a aproximadamente 22 cadenas de polímero por
subunidad de enzima (31 lisinas totales), arginina deiminasa sin
reaccionar, si hay alguna, y polímero sin reaccionar. Después de
retirar las especies sin reaccionar, se recuperan las composiciones
que contienen los conjugados arginina
deiminasa-polímero. Estas composiciones tienen al
menos aproximadamente el 20% de la actividad biológica asociada con
la arginina deiminasa nativa o inicial medida usando un ensayo tal
como el que se describe a continuación en el ejemplo 3. En aspectos
preferidos de la invención, sin embargo, los conjugados tienen al
menos aproximadamente el 30% de la actividad biológica asociada con
la arginina deiminasa inicial y, mas preferiblemente, los conjugados
tiene al menos aproximadamente el 90% de la actividad biológica
asociada con la arginina deiminasa inicial.
A continuación se muestra una reacción de
conjugación representativa:
Se disuelve un exceso molar de aproximadamente 50
veces de polímero activado en agua para inyección (pH
aproximadamente 6,0) y a continuación se añade a una solución de
arginina deiminasa de M. arthritidis ajustada a un pH de
aproximadamente 8,0 con un tampón adecuado, tal como un tampón
fosfato o borato. La reacción se deja incubar aproximadamente a 4ºC,
aproximadamente a pH 8,0 durante un tiempo adecuado, tal como
aproximadamente 1 hora, con agitación suave continua. A
continuación, la reacción de conjugación se detiene, por ejemplo con
un exceso varias veces molar de arginina o glicina. La arginina
deiminasa sin modificar presente en la mezcla de reacción, si la
hay, después de que se haya inactivado la reacción de conjugación,
puede recuperarse para su reciclaje en futuras reacciones usando
cromatografía de intercambio iónico o de exclusión molecular, o por
técnicas similares de separación. Preferiblemente, las soluciones
que contienen los conjugados de la presente invención contienen
menos de aproximadamente el 5% de arginina deiminasa sin
modificar.
Si se desea, los conjugados arginina
deiminasa-polímero se aíslan a partir de la mezcla
de reacción para retirar las especies de alto peso molecular y la
arginina deiminasa sin modificar. El proceso de separación comienza
colocando las especies mezcladas en una solución tampón que contenga
aproximadamente 1-10 mg/ml de los conjugados
arginina deiminasa-polímero. Las soluciones
adecuadas tienen un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0
y preferiblemente, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5.
Las soluciones preferiblemente contienen una o más sales
tamponadoras seleccionadas entre KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4},
KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3},
NaBO_{4} y NaOH. Se prefieren tampones con fosfato sódico.
Dependiendo del tampón de reacción, la solución
del conjugado arginina deiminasa-polímero puede
someterse, en primer lugar, a intercambio de tampón/ultrafiltración
para retirar cualquier polímero sin reaccionar. Por ejemplo, la
solución del conjugado POA-arginina deiminasa puede
ultrafiltrarse a través de una membrana de punto de corte de bajo
peso molecular (10.000 a 30.000 Daltons) para retirar la mayoría de
los materiales no deseados, tales como polímero sin reaccionar,
tensioactivos, si están presentes o similares.
El fraccionamiento de los conjugados
ADI-polímero, si se desea, también puede realizarse
usando un medio cromatográfico de intercambio aniónico. Estos
medios son capaces de unirse selectivamente a conjugados
POA-arginina deiminasa a través de diferencias en la
carga que varía, en cierto modo, de manera predecible. Por ejemplo,
las cargas superficiales de ADI se determinan mediante el número de
aminoácidos cargados disponibles en la superficie de la proteína. De
estos aminoácidos cargados, los restos de lisina sirven como
potencial punto de unión a conjugados de óxido de polialquileno.
Por tanto, los conjugados de arginina deiminasa tendrán una carga
diferente a las otras especies para permitir su aislamiento
selectivo. Se prefiere, especialmente, para el procedimiento de la
presente invención el uso de resinas de intercambio aniónico
fuertemente polares, tal como una resina de intercambio aniónico de
aminas cuaternarias. Entre las resinas cuaternarias de intercambio
aniónico disponibles en el mercado para su uso con la presente
invención se incluyen Q-HD, QA TRISACRYL®. y
QMA-SPHEROSIL®, resinas aminocuaternarias que
recubren una matriz polimérica, fabricadas por IBF de Garenne,
Francia para Sepracor de Malrborough, Massachusetts TMAF650M®, una
resina tetrametilaminoetilo que recubre una matriz polimérica,
fabricada por EM-Separators de Gibbstown, Nueva
Jersey.; QAE550® y SUPERQC®, cada una, una resina amino cuaternaria
que recubre una matriz polimérica y fabricada por TosoHaas de
Montgomeryville, PA. También pueden usarse QMA Accell, fabricada por
Millipore de Millford, MA y resinas PEI fabricadas por JT Baker de
Phillipsburg, NJ. También pueden usarse otras resinas de intercambio
aniónico adecuada, por ejemplo, resinas DEAE.
Por ejemplo, la resina de intercambio aniónico
preferiblemente está empaquetada en una columna y equilibrada en
medios convencionales. Se usa un tampón que tiene el mismo pH y
osmolaridad que los de la solución de arginina deiminasa conjugada
con el polímero. El tampón de elución preferiblemente contiene una o
más sales seleccionadas entre KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4},
KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3},
NaBO_{4} y (NH_{4})_{2}CO_{3}. A continuación, la
solución que contiene el conjugado se absorbe en la columna, no
quedando retenidas ni las especies de alto peso molecular ni el
polímero sin reaccionar. Tras finalizar la carga, para eluir la
fracción deseada de arginina deiminasa conjugada con óxido de
polialquileno se aplica a la columna un gradiente de flujo de un
tampón de elución con concentraciones crecientes de sales.
Preferiblemente, las fracciones eluídas mezcladas se limitan a
conjugados de mono y bis polímeros de arginina deiminasa uniformes
tras la etapa de separación por intercambio aniónico. A
continuación, cualquier especie de arginina deiminasa no conjugada
puede desprenderse de la columna por procedimientos convencionales.
Si se desea, la especie arginina deiminasa también puede separarse
mediante cromatografía de intercambio iónico adicional o
cromatografía de exclusión molecular. El intervalo de temperatura
para la elución está entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente
25ºC. Preferiblemente, la elución se realiza a una temperatura de
aproximadamente 6ºC a aproximadamente 22ºC. La recogida de
fracciones puede realizarse simplemente a través de los perfiles de
tiempo de elución.
Otro aspecto de la presente invención proporciona
medicamentos. Estos medicamentos son adecuados para su uso en
procedimientos de tratamiento de diversas dolencias médicas en
mamíferos. Los procedimientos incluyen administrar una cantidad
eficaz de conjugados arginina deiminasa-polímero,
que se han preparado según se describe en este documento, a un
mamífero que necesita este tratamiento. Los conjugados son útiles
para, entre otras cosas, el tratamiento de dolencias susceptibles a
arginina deiminasa o dolencias que podrían responder positiva o
favorablemente, en los términos conocidos en las técnicas médicas
como terapia basada en arginina deiminasa.
Aunque sin desear quedar ligado a hipótesis o
teoría alguna, el experto apreciará que la arginina es un aminoácido
natural que se considera como un nutriente no esencial de la dieta
humana. Un mamífero que tiene una dolencia, enfermedad o trastorno
que se beneficiará de un descenso de la cantidad o concentración de
arginina en el tejido, célula o fluidos circulantes o un mamífero,
se beneficiará de este tratamiento con conjugados
ADI-polímero según la invención. La arginina
deiminasa cataliza la conversión directa de
L-arginina y H_{2}O en L-citrulina
y NH_{3}.
De este modo, sin limitaciones, los conjugados de
arginina deiminasa puede usarse para tratar dolencias, incluyendo,
carcinomas deficientes en la enzima argininosuccinato sintetasa, por
ejemplo, melanoma (Sugimura y col., 1992, Melanoma Res. 2:
191-196) y dolencias relacionadas con óxido nítrico
(NO), por ejemplo, dolencias que pueden tratarse o mejorarse con la
modulación de la óxido nítrico sintetasa. En particular, se ha
demostrado que la producción de NO celular depende absolutamente de
la disponibilidad de arginina (Nagasaki y col., 1996, J. Biol. Chem.
211:2658-2662; Xia y col., 1996, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93:6770-6774). ADI también tiene ciertas
aplicaciones alimenticias, por ejemplo, modulando los efectos
negativos de dietas bajas en proteínas (Narita y col., 1995, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92:4552-4556).
La cantidad del conjugado arginina
deiminasa-polímero administrada para tratar las
dolencias descritas anteriormente se basa en la actividad arginina
deiminasa del conjugado polimérico. Esta es una cantidad que es
suficiente para lograr de forma significativa una respuesta clínica
positiva. La dosis máxima para mamíferos, incluyendo a humanos, es
la dosis más alta que no cause efectos adversos clínicamente
importantes. Para los fines de la presente invención, estos efectos
adversos clínicamente importantes, tales como, por ejemplo
reacciones de hipersensibilidad y/u otras reacciones inmunogénicas,
son los que podrían requerir el cese de la terapia.
De forma natural, las dosificaciones de las
composiciones a base de arginina deiminasa variarán un tanto
dependiendo del resto arginina deiminasa y del polímero
seleccionado. En general, sin embargo, el conjugado se administra en
cantidades que oscilan de aproximadamente 300 a aproximadamente
3000 UI/m^{2} de arginina deiminasa por día, en base a la dolencia
del mamífero. El intervalo mostrado anteriormente es ilustrativo y
los expertos en la materia determinarán la dosificación óptima del
conjugado seleccionado en base a la experiencia clínica y a la
indicación del tratamiento.
Los conjugados ADI-polímero de la
presente invención pueden incluirse en una o más composiciones
farmacéuticas adecuadas para su administración a mamíferos. Las
composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una solución,
suspensión, comprimido, cápsula o similares, preparados según
procedimientos bien conocidos en la técnica. También se contempla
que la administración de estas composiciones será sobre todo a
través de la vía parenteral, aunque también pueden usarse la vía
oral o por inhalación dependiendo de las necesidades del
experto.
Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar
una apreciación adicional de la invención, pero no pretenden
restringir de ninguna forma el alcance eficaz de la invención.
Ejemplo
1
La cepa 14152 de M. arthritidis se obtuvo
de la American Type Culture Collection. El gen de la arginina
deiminasa de M. arthritidis se amplificó mediante una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el par de cebadores
5'-GGCAATCGATGTCTGTATTTGACAGTA-3'
(ID SEC Nº 3) y
5'-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTT
TACG-3' (ID SEC Nº 4) derivados de la secuencia publicada de M. arginini LBIF (Ohno, T. y col. 1990) "Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding Arginine Deiminase of Mycoplasma arginini" Infect. Immun. 58:3788-3795, a cuyos contenidos se hace referencia en este documento.
TACG-3' (ID SEC Nº 4) derivados de la secuencia publicada de M. arginini LBIF (Ohno, T. y col. 1990) "Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding Arginine Deiminase of Mycoplasma arginini" Infect. Immun. 58:3788-3795, a cuyos contenidos se hace referencia en este documento.
La amplificación por PCR se realizó mediante
procedimientos convencionales (como se revisa en Saiki y col.,
1989, PCR Technology, páginas 7-16, Ed. Henry
A., Erlich, Stockton Press) con los siguientes parámetros.
La reacción se realizó en un volumen de 100
microlitros, con un tampón de PCR de Tris-HCl 10
milimolar, pH 8,3, KCl 50 milimolar, MgCl_{2} 2 milimolar y 200
\muM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
y 2,5 unidades de la ARN polimerasa Taq (de Perkin Elmer). Se
realizaron treinta ciclos de amplificación en un termociclador de
Perkin Elmer, sistema de PCR 9600, fijado como desnaturalización a
94ºC durante 60 segundos, hibridación a 37 grados C durante 180
segundos y extensión a 72 grados C durante 120 segundos.
Tras la amplificación por PCR, en el análisis en
gel de agarosa se observaron dos bandas más bien tenues de 1,4 kb y
1,2 kb que representaban dos fragmentos amplificados.
Respectivamente, las muestras de cada fragmento se escindieron del
gel, se purificaron y clonaron como un fragmento
ClaI-BamHI directamente en un plásmido de expresión
pGX9401 de la forma descrita por Filpula y col. en "Engineering of
Immunoglobulin Fc and Single Chain Fv Proteins in Escherichia
coli" en Antibody Expression and Engineering (H. Y.
Wang y T. Imanaka, eds.), American Chemical Society, pág.
70-85, a cuyos contenidos se hace referencia en este
documento. Ambos fragmentos se secuenciaron y se confirmó que el
fragmento de 1,2 kb codificaba ADI por su homología parcial con
genes previamente conocidas que codifican enzimas con actividad de
enzima ADI.
Los cinco codones TGA del gene ADI aislado, que
codifican para triptófano en Mycoplasma, se cambiaron por
codones TGG mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótido según el
procedimiento de Sayers y col. Biotechniques
13:592-596 (1992); a cuya descripción se hace
referencia en este documento, antes de la expresión del gen en E.
coli. El sistema de expresión de E. coli usado,
GX6712/pGX9401, fue el mismo que el descrito en la referencia
mencionada anteriormente de Filpula y col. La ADI recombinante se
expresaba en cuerpos de inclusión a niveles del 10% de la proteína
total de la célula.
Para confirmar la región de
N-terminal del gen de M. arthritidis
correspondiente al cebador de PCR de la ID SEC Nº 3, se realizó una
amplificación por PCR independiente de la región
N-terminal usando los datos de secuencia de ADN
establecidos a partir de la primera PCR. La técnica empleada fue la
de "PCR inversa" como se describe en H. Ochman y col., 1990.
(PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic
Press, Inc., Eds., M. A. Innis, D. H. Gelfand y col.).
La PCR inversa se realizó usando los cebadores
para PCR
5'-CTAAAACGGTTTCTAGTTCACC-3' (ID SEC
Nº 5) y 5'-AGCGTGGAATTAATGTTGTTG-3'
(ID SEC Nº 6). Se digirieron dos microgramos de ADN genómico de
M. arthritidis con la endonucleasa de restricción Sau
3A, a continuación, los fragmentos se circularizaron mediante
tratamiento con ADN ligasa de T4. A continuación, esta preparación
de ADN se sometió a amplificación por PCR usando las ID SEC Nº 5 y
6. El ADN amplificado se clonó y se analizó mediante secuenciación
de ADN. El análisis de la secuencia de ADN confirmó la asignación de
serina como el aminoácido que sigue a la metionina de inicio (que se
predice que es eliminada postraduccionalmente). También se señalaron
los tres cambios de base silentes: la base 6 es A en lugar de T, la
base 15 es T en lugar de C, la base 18 es C en lugar de T. Además,
en esta secuencia clonada, la base 39 es T en lugar C. Ninguno de
estos cambios modifica la secuencia de la proteína traducida.
Se cree que las diferencias de tres bases entre
la región codificadora N-terminal de la secuencia
genómica confirmada y el cebador de la ID SEC Nº 3 empleado para
aislar el gen son responsables de las bandas más bien débiles, como
se discute anteriormente, que se producían cuando se analizó el
producto de PCR por electroforesis en gel. Se cree que las tres
bases diferentes son el resultado de una pobre hibridación entre el
cebador y la región codificadora N-terminal, dando
lugar a una señal débil de PCR observada en electroforesis en gel.
De este modo, dado esta diferencia y la débil señal de PCR, la
amplificación satisfactoria del gen completo ADI mediante PCR
requería la selección cuidadosa de las condiciones de PCR y, por
tanto, el aislamiento satisfactorio del gen representado por la ID
SEC Nº 1 fue inesperado.
Ejemplo
2
En este Ejemplo, la proteína ADI obtenida como
resultado del Ejemplo 1 se renaturalizó según las técnicas
publicadas por Misawa y col. con modificaciones menores (Misawa y
col., 1994 "High-Level Expression of Mycoplasma
arginine deiminase in Escherichia coli and Its Efficient
Renaturation As An Antitumor Enzyme" en J. Biotechnol. 36:
145-155; a cuyos contenidos se hace referencia en
este documento).
Para empezar, se resuspenden 100 gramos de pasta
de células en 800 ml de K_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM
(tampón 1) y las células se disgregaron mediante dos pases por un
Microfluidizador (Microfluidics Corp. Newton MA.). Se añade Tritón
X-100 hasta alcanzar una concentración final del 4%
(v/v). El homogeneizado se agita durante 30 minutos a 4 grados C y a
continuación, se centrifuga durante 30 minutos a 13.000 g. Se recoge
el sedimento y se resuspende en un litro de tampón 1 que contiene
Tritón X-100 al 0,5%. La solución se diafiltró
frente a 5 volúmenes de tampón de desnaturalización (Tris HCl 50
mM, pH 8,5, DTT 10 mM) usando cartuchos de fibra huecos con un
índice de retención de 100 kD (Microgon Inc. Laguna Hills, CA). Se
añade guanidina HCl hasta alcanzar una concentración final de 6 M y
la solución se agita durante 15 minutos a 4 grados C. A
continuación, la solución se diluye 100 veces en tampón de
replegamiento (K_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,0) y se agita durante 48
horas a 15 grados C. Las partículas se retiran por centrifugación a
13.000 g. El sobrenadante resultante se concentró en una columna de
Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Inc. Piscataway, N.J.)
preequilibrada en tampón de replegamiento. ADI se eluye usando el
tampón de replegamiento con NaCl 0,2 M. El procedimiento de
purificación produce una proteína ADI que está pura a >95% según
se estima por análisis en SDS-PAGE. Se producen
aproximadamente ocho gramos de proteína ADI pura renaturalizada a
partir de 1 kilogramo de pasta de células, que corresponde con un
rendimiento de 200 miligramos de ADI por litro de fermentación.
Ejemplo
3
La actividad ADI se determina mediante una
modificación menor del procedimiento descrito por Oginsky y col., en
"Isolation and Determination of Arginine and Citrulline"
Methods Enzymology 3:639-643 (1957), a cuya
descripción se hace referencia en este documento. En una placa de
microvaloración de 96 pocillos se pusieron diez microlitros de
muestras en Na_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 7,0 (tampón de ensayo BUN),
se añadieron 40 microlitros de arginina 0,5 M en tampón de ensayo
BUN y las placas se cubrieron e incubaron a 37ºC durante 15 minutos.
Se añadieron 200 microlitros de reactivo BUN completo (Sigma
Diagnostics) y la placa cubierta se incubó durante 10 minutos a
100ºC. La placa se enfrió hasta 22ºC y se analizó a 490 nM mediante
un lector de placas de microvaloración (Molecular Devices, Inc.).
Una UI es la cantidad de enzima que convierte 1 micromol de
L-arginina en L-citrulina por
minuto. Las concentraciones de proteínas se determinaron usando el
reactivo de ensayo de proteínas Pierce Coomassie Plus (Pierce Co.,
Rockford, IL) con albúmina de suero bovina como patrón. Se determinó
que la actividad enzimática específica de las preparaciones de ADI
purificada era de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 UI/mg.
Ejemplo
4
En este Ejemplo, se usó
monometoxi-polietilénglicol activado con
succinimidil carbonato, de 12.000 de peso molecular, para modificar
la arginina deiminasa obtenida como resultado del Ejemplo 2. El
mPEG activado con succinimidil carbonato se preparó según el
procedimiento de la patente de EE.UU. Nº 5.122.614 mencionada
anteriormente.
Una solución de arginina deiminasa (0,910 mg en
un volumen de 1 ml) se ajustó a pH 8,0 con tampón borato 100 mM. Se
disolvió un exceso 50 veces molar del PEG activado en agua para
inyección y, a continuación, se añadió la arginina deiminasa. La
reacción se incubó a 4ºC durante aproximadamente 1 hora con
agitación suave continua. Después de 1 hora, la reacción se detuvo
con un exceso de arginina. Los conjugados PEG-ADI se
diafiltraron a través de Centriprep 30 con 15 volúmenes de fosfato
sódico 0,1 molar, pH 7,0, en el que se controló la presencia del
polímero a 220 nm hasta <0,05. Los productos de reacción se
analizaron como se describe en el Ejemplo 3, supra, y se
encontró que retenía aproximadamente el 40% de la actividad ADI.
Ejemplo
5
Se repite el procedimiento del ejemplo 4 excepto
porque se usa mPEG activado con una N-acil
tioazolidina de 12.000 de peso molecular.
Ejemplo
6
Se repite el procedimiento del ejemplo 4 excepto
por que se usa monometoxipolietilénglicol activado con succiminidil
carbonato de peso molecular 5.000.
Ejemplo
7
En este ejemplo, el PEG-ADI
preparado según el ejemplo 4 se comparó con los conjugados PEG ADI
hechos usando ADI obtenida a partir de M. arginini en un
ensayo de inhibición del crecimiento celular. La ADI de M.
arginini se obtuvo de manera similar a la usada para obtener la
ADI de M. arthritidis, excepto porque la ADI de M.
arginini se purificó en mayor grado que la ADI de M.
arthritidis. En particular, se extrajo la ADI de M.
arthritidis y se replegó hasta aproximadamente el 60% de pureza
pero no se procesó a través de cromatografía de intercambio
aniónico. Se espera que el procesamiento a través de la
cromatografía de intercambio aniónico produzca una enzima ADI de
M. arthritidis de pureza superior al 90%. La técnica de
conjugación de PEG usada para hacer los conjugados con ADI derivada
de M. arginini fue la misma que la usada en el ejemplo 4. En
ambos casos, se usó para hacer los conjugados PEG de 12.000 de
PM.
Las células de melanoma se cultivaron en Medio
Mínimo Esencial (Eagle) con aminoácidos no esenciales 0,1 mM,
piruvato sódico 1 mM y sales de Earle; suero bovino fetal al 10%.
Tras la tripsinización, las células viables se contaron mediante
exclusión de azul de trypan. Se añadieron células (10^{4}) a cada
pocillo en un total de 100 microlitros en placas de microvaloración
de 96 pocillos. Los conjugados PEG_{12.000}-ADI se
diluyeron en una dilución seriada con factor 2 de dilución en medio
completo (0,1 ml) y se añadieron a cada pocillo. Las placas se
incubaron a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5%. El crecimiento
celular a día 3 se midió añadiendo 1/10 de volumen de colorante
"Azul de alamar"(Alamar Biosciences, Inc. Sacramento, CA).
Después de cinco horas de incubación, las placas se leyeron a
570-630 nm con un lector de placas de Molecular
Device.
Se encontró que los conjugados
PEG-ADI derivados de M. arginini tenían una
CI_{50} de 0,00015 UI/ml mientras que los PEG-ADI
derivados de M. arthritidis tenían una CI_{50} de 0,00010
UI/ml. De este modo, cuando se normalizaron en unidades de UI/ml, se
observó que los PEG-ADI derivados de M.
arthritidis tenían el 150% de la potencia de los
PEG-ADI derivados de M. arginini.
Ejemplo
8
Se realizó un análisis en
SDS-PAGE para comparar los conjugados
PEG_{12.000}-ADI preparados con ADI derivada de
M. arginini o, según la presente invención, con ADI derivada
de M. arthritidis. Los resultados indican que los conjugados
derivados de M. arthritidis tienen una distribución de tamaño
más uniforme y tiene un peso molecular medio más alto (y, por tanto,
tiene más moléculas PEG unidad por subunidad ADI). Aunque los
solicitantes no se ciñen a la teoría, se cree que la ADI derivada
de M. arthritidis incluye un número mayor de lisinas a las
que el PEG podría unirse covalentemente y, quizás lo más importante,
hay un número suficiente de lisinas en esta ADI específica que no
están asociadas con el sitio activo.
Ejemplo
9
En este ejemplo, se investigaron las secuencias
de aminoácidos y el alineamiento de secuencias de diversas arginina
deiminasas. Volviendo a la Figura 3, se aprecia que la línea
"a" representa la ADI de M. arthritidis ATCC 14152 usada
según la presente invención. La línea "b" representa la ADI de
M. arginini LBIF. La línea "c" representa la ADI de
M. hominis PG21 y la línea "d" representa la ADI de
M. orale FERM BP-1970. Las rayas indican los
aminoácidos idénticos a los encontrados en la línea "a". Los
puntos indican huecos. El porcentaje de identidad de la secuencia de
aminoácidos con la ADI de M. arthritidis es:
M. arginini - 87%
M. hominis - 81%
M. orale - 83%.
Este nivel de no homología entre las secuencias
de aminoácidos codificadoras de los genes respectivos indican
diferencias significativas entre las proteínas codificadas de las
respectivas especies de Mycoplasma. Los sitios de
sustituciones de lisinas están dispersos y extendidos, lo que indica
una diversidad mayor en los potenciales sitios de conjugación con el
polímero.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Enzon, Inc.
\hskip1,5cm20 Kingsbridge Road
\hskip1,5cmPiscataway, Nueva Jersey 08854-3998
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: Arginina deiminasa derivada de Mycoplasma y conjugados de polímeros que la contienen.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: ROBERTS & MERCANTI
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 81 Tamarack Circle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Skillman
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 08558
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulgadas 1,4 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: Aún no disponible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-ENE-1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: Aún no disponible
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/792.283
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-ENE-1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Mercanti, Michael N.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33966
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2131055PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 609-921-3500
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 609-921-9535
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1230 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- AISLADO INDIVIDUAL: EN231
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 410 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- AISLADO INDIVIDUAL: EN231
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no revelante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 14152
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: EN231
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TÍPO DE CÉLULA: unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAATCGAT GTCTGTATTT GACAGTA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 14152
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: EN231
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGGATCCT TACTACCACT TAACATCTTT ACG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 14152
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: EN231
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAAAACGGT TTCTAGTTCA CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: ATCC 14152
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: EN231
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGTGGAAT TAATGTTGTT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 410 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma arginini
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: LBIF
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Ohno, y col.,
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Infection and Immunity
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 58
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PÁGINAS: 3788-3795
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: noviembre 1990.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 410 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma hominis
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: PG21
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 410 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mycoplasma orale
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: FERM BP-1970
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULA: unicelular
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (47)
1. Una molécula aislada de ácido nucleico que
codifica una enzima arginina deiminasa que comprende una secuencia
de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.
2. La molécula aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico de
la ID SEC Nº 1.
3. La molécula aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 2, en la que dicha secuencia de ácido nucleico de la
ID SEC Nº 1 está mutada por sustituciones de nucleótidos
seleccionados a partir del grupo compuesto por una T en el
nucleótido 39, una C en el nucleótido 104, una A en el nucleótido
206, una A en el nucleótido 729, una G en el nucleótido 337, una C
en el nucleótido 830, una C en el nucleótido 1023, una A en el
nucleótido 6, una T en el nucleótido 15 y una C en el nucleótido
18.
4. La molécula aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que se selecciona entre el grupo compuesto por una
molécula de ARN y una molécula de ADN.
5. Una molécula aislada de ácido nucleico que es
complementaria de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación
1.
6. Un vector de expresión, que comprende la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 unida de forma
operativa a una secuencia control.
7. El vector de expresión de la reivindicación 6,
en el que dicha secuencia comprende un promotor.
8. El vector de expresión de la reivindicación 7,
en el que dicho promotor es inducible.
9. El vector de expresión de la reivindicación 6,
en el que dicho promotor se selecciona entre el grupo compuesto por
un promotor de beta-lactamasa, un promotor lac, un
promotor trp, un promotor phoA, un promotor araBAD, un promotor de
T7, derivados de los promotores lambda P_{L} y P_{R} y un
promotor híbrido O_{L}/P_{R}.
10. El vector de expresión de la reivindicación
6, seleccionado entre el grupo compuesto por un plásmido, un fago y
un cósmido.
11. Una célula hospedadora recombinante, que
comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
12. La célula hospedadora de la reivindicación
11, seleccionada entre el grupo compuesto por una célula hospedadora
procariótica y una célula hospedadora eucariótica.
13. La célula hospedadora de la reivindicación
11, seleccionada entre el grupo compuesto por una bacteria y una
levadura.
14. La célula hospedadora de la reivindicación
13, que es Escherichia coli.
15. Una arginina deiminasa aislada, que comprende
la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC Nº 2.
16. La arginina deiminasa aislada de la
reivindicación 15, que tiene una actividad específica de
aproximadamente 3 a aproximadamente 30 UI/mg.
17. Un procedimiento para producir arginina
deiminasa, que comprende:
- a)
- transformar o transfectar una célula hospedadora con el vector de la reivindicación 6;
- b)
- cultivar la célula hospedadora transformada o transfectada; y
- c)
- expresar la arginina deiminasa en dicha célula hospedadora cultivada.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, que
además comprende recuperar dicha arginina deiminasa expresada.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que dicha arginina deiminasa se recupera mediante un
procedimiento que comprende la extracción de dicha arginina
deiminasa expresada a partir de dicha célula hospedadora y
renaturalizar dicha arginina deiminasa expresada.
20. La molécula aislada de ácido nucleico de la
reivindicación 1, amplificada a partir de una genoma de
Mycoplasma arthritidis mediante reacción en cadena de la
polimerasa usando un par de cebadores que comprende las ID SEC Nº 3
e ID SEC Nº 4, en la que la ID SEC Nº 3 no está modificada o está
modificada en la base 6, de modo que la A se ha sustituido por una
T, en la base 15 de modo que la T se ha sustituido por una C, en la
base 18 de modo que la C se ha sustituido por la T o combinaciones
de las mismas.
21. Un conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa, que comprende la
arginina deiminasa (ADI) purificada obtenida a partir de
Mycoplasma arthritidis, conjugada covalentemente con un
polímero no antigénico, en el que dicha ADI comprende la secuencia
de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.
22. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
21, en el que dicho polímero inmunogénico comprende un óxido de
polialquileno.
23. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
22, en el que dicho óxido de polialquileno comprende un alquilo
terminal.
24. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
22, en el que el óxido de polialquileno es polietilénglicol.
25. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
23, en el que dicho óxido de polialquileno terminado en alquilo es
un polietilénglicol terminado en monometilo (mPEG).
26. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
21, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular
de aproximadamente 200 a aproximadamente 60.000.
27. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
26, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular
de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000.
28. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
27, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular
de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 12.500.
29. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
21, en el que dicho polímero no antigénico se selecciona entre el
grupo compuesto por polímeros a base de dextrano,
polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, polivinilalcoholes y
carbohidratos.
30. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
21, que además comprende un enlace carbamato entre la arginina
deiminasa y el polímero no antigénico.
31. El conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación
21, que además comprende un enlace amida entre la arginina deiminasa
y el polímero no antigénico.
32. Una arginina deiminasa que comprende la
secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 para su uso como
medicamento.
33. Un conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa que comprende una
arginina deiminasa con la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2
conjugada covalentemente con un polímero no antigénico, para su uso
como medicamento.
34. Uso de una arginina deiminasa que comprende
la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 para la fabricación de
una composición para tratar una dolencia susceptible a la arginina
deiminasa en un mamífero.
35. Uso de un conjugado polímero no
antigénico-arginina deiminasa que comprende una
arginina deiminasa con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº
2 conjugada covalentemente con un polímero no antigénico, para la
fabricación de una composición para tratar una dolencia susceptible
a la arginina deiminasa en un mamífero.
36. Un procedimiento para preparar un conjugado
polímero no antigénico-arginina deiminasa, que
comprende poner en contacto la arginina deiminasa (ADI) purificada,
obtenida de Mycoplasma arthritidis, con la secuencia de
aminoácido de la ID SEC Nº 2, con un polímero no antigénico en
condiciones suficientes para que tenga lugar la conjugación de dicha
arginina deiminasa purificada y dicho polímero no antigénico.
37. El uso de la reivindicación 34 o de la
reivindicación 35, en el que dicha dolencia susceptible a la
arginina deiminasa es un tumor o cáncer susceptible a la arginina
deiminasa.
38. El uso de la reivindicación 34 o de la
reivindicación 35, en el que dicho mamífero es un paciente
humano.
39. El uso de la reivindicación 35, en el que
dicho polímero no antigénico comprende un óxido de
polialquileno.
40. El uso de la reivindicación 39, en el que
dicho óxido de polialquileno comprende un alquilo terminal.
41. El uso de la reivindicación 39, en el que
dicho óxido de polialquileno es polietilénglicol.
42. El uso de la reivindicación 35, en el que
dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular de
aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000.
43. El uso de la reivindicación 35, en el que
dicho polímero antigénico tiene un peso molecular de aproximadamente
1.000 a aproximadamente 15.000.
44. El uso de la reivindicación 35, en el que
dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular de
aproximadamente 2.000 a aproximadamente 12.500.
45. El uso de la reivindicación 35, en el que
dicho polímero no antigénico se selecciona entre el grupo compuesto
por polímeros a base de dextrano, polivinilpirrolidonas,
poliacrilamidas, alcoholes polivinílicos y carbohidratos.
46. El uso de la reivindicación 35, en el que
dicho conjugado además comprende un enlace carbamato entre la
arginina deiminasa y el polímero no antigénico.
47. El uso de la reivindicación 35, en el que
dicho conjugado además comprende un enlace amida entre la arginina
deiminasa y el polímero no antigénico.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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