ES2255147T3 - Arginina deiminasa derivada de mycoplasma arthritidis y conjugados de polimeros que la contienen. - Google Patents

Abstract

Un objeto de la invención es proporcionar una nueva subunidad de la arginina deiminasa purificada (a partir de ahora ADI), obtenida a partir de Mycoplasma arthritidis que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. A este respecto, la invención incluye una molécula aislada de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica ADI que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras y en las ID SEC Nº 1 e ID SEC Nº 2, así como las moléculas de ácido nucleico complementarias a esta. Otros aspectos de la invención incluyen un vector de expresión que contiene un gen clonado de la ADI derivada de Mycoplasma arthritidis; células hospedadoras (recombinantes) útiles para la expresión de la ADI de la presente invención y conjugados poliméricos sustancialmente no antigénicos que contiene la ADI de la presente invención. Otros aspectos adicionales de la invención incluyen un proceso para preparar la ADI purificada, un proceso para preparar composiciones basadasen polímeros sustancialmente no antigénicos que contienen la arginina deiminasa mencionada anteriormente. La invención además proporciona la ADI y sus conjugados según la presente invención para su uso como medicamentos así como el uso de estas ADI y sus conjugados para fabricar una composición para tratar dolencias susceptibles a la arginina deiminasa en mamíferos. Los procedimientos de tratamiento incluyen administrar una cantidad eficaz de las composiciones descritas en este documento, preferiblemente como parte de un conjugado polimérico a mamíferos que necesitan esta terapia.

Description

Arginina deiminasa derivada de Mycoplasma arthritidis y conjugados de polímeros que la contienen.

Antecedentes de la invención

La presente invención se dirige a una nueva arginina deiminasa y composiciones que contienen arginina deiminasa de acción prolongada. En particular, la invención se dirige a conjugados de polímeros sustancialmente no antigénicos que contiene arginina deiminasa derivada de Mycoplasma arthritidis que muestran niveles elevados de retención de la actividad enzimática.

Se ha sugerido que la conjugación de proteínas o enzimas biológicamente activas con polímeros mejora una o más de las propiedades de vida en circulación, solubilidad en agua o antigenicidad in vivo. Por ejemplo, algunos de los conceptos iniciales de acoplamiento de péptidos o polipéptidos con polietilénglicol (PEG) y polímeros similares solubles en agua se describen en la patente de EE.UU. Nº 4.179.337, a la cual se hace referencia en este documento. Los conjugados se forman haciendo reaccionar un material biológicamente activo con un exceso molar de varias veces de un polímero que se ha modificado para que contenga un grupo de unión terminal. La insulina y la hemoglobina estaban entre los primeros agentes terapéuticos conjugados. Estos polipéptidos relativamente grandes contienen varios sitios de unión \varepsilon-amino. Podrían unirse varios polímeros sin pérdida significativa de actividad biológica.

El proceso de conjugación, sin embargo, no carece de complicaciones. La conjugación de polímero excesivo o las reacciones que usan excesos molares de polímeros por encima de ciertas proporciones pueden dar lugar a la formación de conjugados inactivos o conjugados que tienen una actividad insuficiente. A menudo aparecen problemas cuando el sitio activo (es decir, donde se encuentran los grupos asociados con la bioactividad) en la proteína o enzima se bloquea como resultado de la unión covalente del polímero. Este problema puede ser difícil de evitar ya que el polímero y la proteína o enzima típicamente se unen en reacciones en solución. Se ha sugerido el bloqueo previo de los sitios activos con materiales reversibles, tales como fosfato de piridoxal, pero los resultados no han sido consistentes. Los problemas se agudizan particularmente con proteínas y péptidos de peso molecular relativamente bajo. Estos materiales bioactivos a menudo tienen pocos sitios de unión no asociados con la bioactividad.

La arginina deiminasa (ADI) es un tipo de enzima que podría beneficiarse de la mejora de las técnicas de conjugación del polímero. ADI es una enzima que hidroliza la arginina y se ha postulado que la eliminación de la arginina tiene un efecto mortal sobre ciertos tumores. En particular, la enzima hidroliza el grupo guanidinio de la L-arginina en L-citrulina y amoniaco. La enzima ADI también es conocida como arginina dihidrolasa, arginina deiminasa o guanidinodesiminasa. Aunque la ADI se ha obtenido a partir de otros tipos de cepas de micoplasma, así como de otras fuentes de microorganismos tales como pseudomonas y estreptococos, hay variabilidad en la enzima obtenida. En particular, cada cepa hospedadora produce una enzima que tiene un número diferente de lisinas así como variaciones en el sitio activo que producen una enzima que tiene una secuencia primaria y número y localización de lisinas
diferentes.

Previamente, se han sugerido varios conjugados polímero-arginina deiminasa. Véase, por ejemplo, Jpn. J. Cáncer Res. 84, 1195-1200, nov. 1993 que describe inter alia arginina deiminasa a partir de Mycoplasma arginini conjugada con metoxi-polietilenglicol-4,6-dicloro-1,3,5-triacina. Sin embargo, parece que los conjugados arginina deiminasa-polímero preparados hasta la fecha no son aceptables. Uno de los principales inconvenientes ha sido que el nivel de retención de la actividad arginina deiminasa, proporcionado por los conjugados altamente modificados, ha sido demasiado bajo en los estudios de inhibición de crecimiento. Se ha postulado que ciertos puntos de unión de lisinas en la enzima están estrechamente conectados con el sitio activo enzimático. Por tanto, los conjugados altamente modificados que muestran altos niveles de retención de la actividad no eran posibles con gastos de tiempo y de recursos razonables.

La presente invención aborda estas deficiencias.

Resumen de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar una nueva subunidad de la arginina deiminasa purificada (a partir de ahora ADI), obtenida a partir de Mycoplasma arthritidis que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. A este respecto, la invención incluye una molécula aislada de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica ADI que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras y en las ID SEC Nº 1 e ID SEC Nº 2, así como las moléculas de ácido nucleico complementarias a esta.

Otros aspectos de la invención incluyen un vector de expresión que contiene un gen clonado de la ADI derivada de Mycoplasma arthritidis; células hospedadoras (recombinantes) útiles para la expresión de la ADI de la presente invención y conjugados poliméricos sustancialmente no antigénicos que contiene la ADI de la presente invención. Otros aspectos adicionales de la invención incluyen un proceso para preparar la ADI purificada, un proceso para preparar composiciones basadas en polímeros sustancialmente no antigénicos que contienen la arginina deiminasa mencionada anteriormente. La invención además proporciona la ADI y sus conjugados según la presente invención para su uso como medicamentos así como el uso de estas ADI y sus conjugados para fabricar una composición para tratar dolencias susceptibles a la arginina deiminasa en mamíferos. Los procedimientos de tratamiento incluyen administrar una cantidad eficaz de las composiciones descritas en este documento, preferiblemente como parte de un conjugado polimérico a mamíferos que necesitan esta terapia.

El polímero sustancialmente no antigénico preferiblemente es un óxido de polialquileno tal como un polietilénglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000 y que preferiblemente, tiene un peso molecular de aproximadamente 12.000. También pueden usarse otros polímeros sustancialmente no antigénicos. En una realización preferida, el polímero sustancialmente no antigénico preferiblemente se conjuga covalentemente a la ADI mediante un enlace uretano o enlaces similares resistentes a la hidrólisis. Las composiciones que contienen el conjugado arginina deiminasa-polímero pueden incluirse como parte de una solución farmacéuticamente aceptable.

La ADI obtenida a partir de M. arthritidis de acuerdo con la presente invención difiere de los previamente publicados en J. Biol. Chem. vol. 253, Nº 17 pág. 6016-6020 (1978) y J. Biol. Chem. vol. 252, Nº 8 pág. 2615-2620 (1977). Estas referencias describen enzimas ADI denominadas enzimas de tipo I, II y III, que según informan los autores son proteínas interconvertibles y relacionadas. Aunque las enzimas ADI publicadas en J. Biol. Chem. y la ADI de la invención se obtuvieron de la misma cepa 14152 de la American Type Culture Collection ("ATCC"), la ADI de la invención es completamente distinguible de las enzimas previamente publicadas como tipo I, II y III en varias propiedades fundamentales. En primer lugar, la ADI descrita en este documento tiene sólo dos cisteínas por subunidad de secuencia. La proteína previamente publicada incluía dieciocho cisteínas por subunidad. En segundo lugar, la ADI de la presente invención tiene un pI de aproximadamente 5,25 mientras que la ADI publicada previamente a partir de M. arthritidis tenía un pI de 7,0. Además, los trabajos publicados anteriormente también predijeron que la ADI obtenida a partir de M. arthritidis tendría menos lisinas por subunidad que la ADI de M. arginini. Los presentes inventores, sin embargo, han descubierto de forma sorprendente que el caso era el opuesto. Aún un punto adicional de la diferencia es el hecho de que el resto N-terminal de la ADI de la presente invención es serina (tras la eliminación postraduccional de la metionina), mientras que la ADI de M. arthritidis publicada previamente tenía una alanina como resto N-terminal. Estas diferencias son espectaculares y sugieren que hay heterogeneidad en la ADI obtenida de la obtenida a partir de M. arthritidis. Aún una posibilidad adicional es que haya más de un gen para la actividad ADI asociada con M. arthritidis.

Los conjugados arginina deiminasa-polímero de la presente invención también ofrecen ventajas sobre las de la técnica anterior. Por ejemplo, la ADI de la presente invención incluye varias posiciones más de lisinas susceptibles de ser modificadas que en la ADI de la técnica anterior, sin recurrir a la preparación de variantes de mutantes de lisina. Esto permite sustancialmente que se unan covalentemente más cadenas de polímero a las localizaciones alternas de la superficie sin que pierda la actividad de inhibición del crecimiento de la célula tumoral. Además, los conjugados formados de este modo tienen una vida en circulación in vivo sustancialmente más larga que los conjugados que tiene niveles similares de retención de actividad, preparados según la técnica anterior.

Se entenderá que la expresión "dolencia susceptible a arginina deiminasa" incluye todos los estados de la enfermedad, tales como crecimientos tumorales, cánceres, o dolencias relacionadas, que se benefician terapéuticamente de la administración de arginina deiminasa exógena. Los detalles concernientes a estas dolencias se proporcionan a continuación en la Sección 4.

Para un mejor entendimiento de la presente invención, se hace referencia a la siguiente descripción y su alcance se señalará en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra la secuencia de ADN completa que codifica la ADI clonada a partir de M. arthritidis ATCC 14152 (1230 bases). Las G subrayadas en los codones de triptófano 5 se cambiaron de A a G mediante mutagénesis dirigida a sitio.

La figura 2 ilustra el producto de traducción (410 aminoácidos) de la subunidad arginina deiminasa de M. arthritidis ATCC 14152.

La figura 3 ilustra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de diversas arginina deiminasas, línea a: M. arthritidis ATCC 14152; línea b: M. arginini LBIF, véase Ohno y col. Infection and Immunity 58: nov. 1990, pág 3788-3795; línea c: M. hominis PG21; línea d: M. orale FERM BP-1970. M. hominis y M. orale obtenidos según R. Harasawa y col. Microbial. Immunol. 36, pág. 661-665, 1992.

Descripción detallada de la invención 1. Arginina deiminasa

Por lo tanto, la presente invención incluye una nueva proteína que comprende la ID SEC Nº 2, que tienen actividad enzimática de arginina deiminasa y una molécula de ácido nucleico que codifica la misma. Preferiblemente, la ADI es expresada por un gen nuevo, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC Nº 1, que se aísla a partir de M. arthritidis. La presente invención también incluye procedimientos para fabricar y usar los mismos. Para que el lector aprecie mejor la siguiente descripción, se explican los siguientes términos.

La secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 se presenta en forma de una secuencia de ácido desoxirribonucleico o ADN. Sin embargo, el experto entenderá que la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 también puede prepararse, si es necesario, en forma de una molécula de ARN. Adicionalmente, los nucleótidos que comprende la molécula de ADN o de ARN también pueden estar en forma de derivados o análogos de nucleótidos, tales como, por ejemplo, los enumerados en la normativa 37 C.F.R. § 1.822(p)(1), cuya descripción se incorpora como referencia en este documento en su totalidad. Además, la invención también abarca la secuencia complementaria de las secuencias de nucleótidos según la invención. El experto apreciará el hecho de que el alcance de la invención también incluye codones alternos que pueden codificar el mismo aminoácido debido a la naturaleza degenerada del código genético.

"Transfección" se refiere a la captación de un vector de expresión en una célula hospedadora, se exprese o no de hecho cualquier secuencia codificadora. Los expertos conocen numerosos procedimientos de transfección. Por ejemplo, la transfección se efectúa en presencia de un vector de expresión y altas concentraciones de CaPO_{4} mediante electroporación usando un vector de expresión fágico o viral para la inserción en una célula hospedadora, por inserción mecánica de ácido nucleico o incluso cultivando las células hospedadoras en presencia de fragmentos de ácido nucleido sin empaquetar. Generalmente, se reconoce que la transfección ha sido satisfactoria cuando en la célula hospedadora tiene lugar cualquier indicación del funcionamiento del vector de interés.

"Transformación" describe la introducción de un ácido nucleico en un organismo, de modo que el ácido nucleico sea capaz de replicarse bien como elemento extracromosómico o bien por integración en el cromosoma hospedador. Dependiendo de la célula hospedadora usada, la transformación se consigue usando procedimientos conocidos en la técnica apropiados para células hospedadoras en particular. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, como describen Cohen, S. N. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69:2110 (1972) y Mandel y col., J. Mol. Biol. 53:154 (1970), generalmente se usa para procariotas u otras células que están encapsuladas dentro de paredes celulares (por ejemplo, muchas células bacterianas y/o vegetales). Para células de mamíferos sin estas paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham, F. y van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de transformaciones de sistemas hospedadores de células de mamíferos se han descritos en la Pat. de EE.UU. Nº 4.399.216 presentada el 16 de agosto de 1983. Típicamente, las transformaciones en levaduras se realizan según el procedimiento de Van Solingen P., y col. J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao, C. L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829 (1979). Sin embargo, también puede usarse cualquier otro procedimiento conocido en la técnica para introducir ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN en células, tales como, por ejemplo, mediante inyección nuclear o mediante fusión de protoplastos.

Según se usa en este documento, el término "complementario" con respecto a un ácido nucleico se refiere a la cadena opuesta (usando el apareamiento de bases de Watson y Crick) producida cuando una primera molécula de ácido nucleico se replica usando esta molécula como molde, para formar una segunda cadena nueva de ácido nucleico que es complementaria a la primera. En un aspecto de la invención, se considera que dos moléculas de ácido nucleico son complementarias entre sí, cuando hibridan o se unen conjuntamente en condiciones rigurosas.

La expresión "hibridar en condiciones rigurosas" para describir la hibridación de moléculas de ácido nucleico incluidas en el alcance de esta invención se refiere a hibridar en condiciones de alta especificidad de hibridación, por ejemplo, lavado a baja fuerza iónica y elevada temperatura. Estas condiciones rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación con NaCl 0,15 M/citrato sódico 0,015 M/NaDodSO_{4} al 0,1% a 50ºC, o alternativamente, hibridación en presencia de agentes desnaturalizantes tales como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/ polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. "Hibridación en condiciones de baja rigurosidad" se refiere a hibridar en condiciones de hibridación de especificidad reducida. Estas condiciones incluyen, simplemente a modo de ejemplo, hibridar a 42ºC en formamida al 20%, SSC x 5, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt x 5 y ADN de esperma de salmón a 5 mg/ml y lavar con SSC x 2, SDS al 0,1% a 42ºC.

Adicionalmente, pueden introducirse mutaciones específicas en el gen de la arginina deiminasa de la presente invención usando "mutagénesis dirigida a sitio". Esta es una técnica convencional en la materia y se realiza, por ejemplo, usando un cebador oligonucleotídico sintético complementario al ADN del fago de doble cadena que va a sufrir la mutagénesis, excepto por una falta de coincidencia limitada, que representa la mutación deseada. Estas mutaciones pueden incluir, por ejemplo, la deleción, inserción o sustitución de los codones que expresan aminoácidos naturales. Estas mutaciones pueden conferir características de proteína alterada, que puede, por ejemplo, mejorar y/o alterar la estabilidad oxidativa, térmica y/o de pH de la proteína. Brevemente, en este procedimiento, el oligonucleótido sintético se usó como cebador para dirigir la síntesis de una cadena complementaria a la del fago, y el ADN de doble cadena resultante se transforma en una bacteria hospedadora que puede mantener al fago. Los cultivos de la bacteria transformada se disponen en placas de agar, permitiéndose la formación de placas a partir de células únicas que albergan al fago. Normalmente de aproximadamente el 50 hasta aproximadamente el 90% de las nuevas placas contendrán al fago, como cadena sencilla, que tiene la forma mutada. Las placas se hibridan con el cebador sintético fosforilado a una temperatura que permite la hibridación de una zona de coincidencia exacta, pero en el que la falta de coincidencias con la cadena original es suficiente para prevenir la hibridación. A continuación, se seleccionan y se cultivan las placas que hibridan con la sonda y se recupera el ADN. De este modo, el experto apreciará que la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 puede someterse convenientemente a mutagénesis mediante técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, mediante sustitución de nucleótidos, para producir variantes alélicas útiles. Simplemente a modo de ejemplo, la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 1 se ha preparado de distinto modo con sustituciones que proporcionan una T en el nucleótido 39, una C en el nucleótido 104, una A en el nucleótido 206, una G en el nucleótido 337, una A en el nucleótido 729, una C en el nucleótido 830, una C en el nucleótido 1023, una A en el nucleótido 6, una T en el nucleótido 15, una C en el nucleótido 18 y/o combinaciones de las mismas. En particular, la sustitución específica en 337 podría cambiar la treonina por alanina.

"Unido de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición de componentes, por ejemplo, una región reguladora y una fase de lectura abierta, de modo que puede realizarse la función normal de los componentes. De este modo, una fase de lectura abierta que está "unida de forma operativa" a secuencias de control se refiere a una configuración en la que la secuencia codificadora puede expresarse bajo el control de estas secuencias y en la que las secuencias de ADN que se han unido están contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en fase de lectura. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor se une de forma operativa al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador se une de forma operativa a una secuencia codificadora si éste afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se une de forma operativa a una secuencia codificadora si se coloca de modo que facilita la traducción. La unión se logra por ligamiento a sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, entonces, por ejemplo, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

"Secuencias control" se refiere a secuencias de ácido nucleico, necesarias para la expresión de una secuencia codificadora, unidas de forma operativa a una secuencia codificadora en un organismo hospedador en particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente, otras secuencias poco conocidas. Se sabe que las células eucarióticas utilizan como secuencias control, por ejemplo, promotores, señales de poliadenilación y potenciadores, por nombrar algunas.

"Sistema de expresión" o "vector de expresión" se refiere a secuencias de ácido nucleico que contienen una secuencia codificadora deseada y secuencias control en unión operativa, de modo que los hospedadores transformados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para lograr la transformación, el sistema de expresión puede incluirse en un vector, sin embargo, a continuación la molécula de ácido nucleico relevante también puede integrarse en el cromosoma del hospedador.

Según se usa en este documento, "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas estas designaciones incluyen a la progenie. De este modo, "transformantes" o "células transformadas" incluye la célula sujeto primaria y cultivos derivados de éstas sin tener en cuenta el número de transferidos. También se entiende que toda la progenie no tiene porqué ser exactamente idéntica en contenido genómico, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma funcionalidad que la analizada en las células originariamente transformadas. Cuando se pretendan designaciones diferentes, se entenderá por el contexto.

Los vectores descritos en este documento son adecuados para su uso en un amplio rango de células hospedadoras de organismos procarióticos y eucarióticos. En general, se prefieren procariotas para la clonación inicial de las secuencias de ADN y la construcción de vectores útiles para la invención. Por ejemplo, es particularmente útil la cepa MM294 (ATCC Nº 31.446) de E. coli K12. Otras cepas microbianas, simplemente a modo de ejemplo, que pueden usarse incluyen cepas de E. coli tales como E. coli B y E. coli X1776 (ATCC Nº 31.537). También pueden usarse procariotas para la expresión. Pueden usarse las cepas mencionadas anteriormente, así como, por ejemplo las cepas de E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrófico, ATCC Nº 27.325), K5772 (ATCC Nº 53.635), y SR101, bacilos tales como Bacillus subtilis y otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y diversas especies de Pseudomonas.

En general, en conexión con estos cebadores se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias replicones y control que derivan de especies compatibles con la célula hospedadora. El vector, generalmente lleva un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, típicamente, E. coli se transforma usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (véase, por ejemplo, Bolívar y col., 1977, Gene, 2: 95). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y, de este modo, proporciona medios fáciles para identificar las células transformadas. De forma similar, los plásmidos pUC proporcionan vectores de clonación convenientes con moléculas de ADN para selección y replicación (Yanisch-Perron, y col., 1985, Gene 33:103-119, a cuyas descripciones se hace referencia en este documento en su totalidad. El plásmido pBR322 u otro plásmido o fago microbiano, también debe contener o modificarse para contener, promotores que puedan ser usados por el organismo microbiano para la expresión de sus propias
proteínas.

Los ``plásmidos se denominan con una letra minúscula "p" precedida y/o seguida por letras y/o números en mayúsculas. Los plásmidos de inicio de este documento están disponibles en el mercado, están a disposición del público sin restricciones, o pueden construirse a partir de estos plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica otros plásmidos equivalentes que serán obvios para el experto.

Los promotores más frecuentemente usados en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas promotores de la beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (Chang y col., 1978 Nature, 375:615; Itakura y col., 1977, Science, 198:1056; Goeddel y col., 1979, Nature, 281:544) y un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col, 1980, Nucleic Acids Res., 8:4057; Sol. Publi. EPO Nº 0036.776). Mientras que estos son los más frecuentemente usados, se han descrito y utilizado otros promotores microbianos, y se han publicado detalles relativos a sus secuencias de nucleótidos, lo que permite a un experto ligarlos funcionalmente con vectores conocidos en la técnica, por ejemplo, vectores plasmídicos.

Simplemente a modo de ejemplo, la regulación de la transcripción en E. coli puede lograrse con cualquiera de los siguientes promotores inducibles: lac, trp, phoA, araBAD, T7, y derivados de los promotores P_{L} y P_{R} de lambda así como otros bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60:512-538, a cuya descripción se hace referencia en este documento en su totalidad). Preferiblemente, el promotor es el promotor híbrido O_{L}/P_{R}, descrito por Scandella y col., en la patente compartida de EE.UU. Nº 5.162.216, a cuya descripción se hace referencia en ese documento en su totalidad.

Además de procariotas, también pueden usarse microbios eucarióticos, tales como cultivos de levaduras. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panadería, es la usada más frecuentemente entre los microorganismos eucarióticos, aunque frecuentemente se dispone de otras cepas. Para la expresión en Saccharomyces, frecuentemente se usa, por ejemplo, el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., 1979, Nature, 282:39; Kingsman y col., 1979, Gene, 7:141; Tschemper y col., 1980, Gene, 10: 157). Este plásmido ya contiene el gen trip1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que no tiene capacidad para crecer en presencia de triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44.076 o PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics, 85: 12). La presencia de la lesión trip1 como una característica del genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona, entonces, un ambiente eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

Se ha demostrado que el sistema de expresión de Pichia pastoris alcanza los mayores niveles de producción de varias proteínas (Cregg, J.M. y col., 1993, Bio/Technology 11:905-910), cuya descripción se incorpora como referencia en este documento en su totalidad) y puede emplearse para expresar ADI como una proteína soluble en el citoplasma de Pichia pastoris.

Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., 1980, J. Biol. Chem., 255:2073) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., 1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149; Holland y col., 1978, Biochemistry, 17:4900), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. En la construcción de plásmidos adecuados para la expresión, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también están ligadas dentro del vector de expresión 3’ de la secuencia deseada que se va a expresar para proporcionar la poliadenilación del ARNm y la terminación de la transcripción. Otros promotores, que tiene la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol 2 deshidrogenasa, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno y la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa mencionada previamente, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Es adecuado cualquier vector plasmídico que contenga secuencias promotoras, origen de replicación y de terminación compatibles con levaduras.

Puede proporcionarse un origen de replicación mediante la construcción del vector para incluir un origen exógeno, tal como el que puede derivar de SV40 u otra fuente viral (por ejemplo, polioma, adeno, VSV, BPV) o puede proporcionarse mediante los mecanismos de replicación del cromosoma de la célula hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, a menudo es suficiente con este último.

Los cultivos celulares producen cantidades satisfactorias de proteína, sin embargo, los refinamientos, usando una secuencia codificadora secundaria, sirven para potenciar más incluso los niveles de producción. Una secuencia codificadora secundaria comprende dihidrofolato reductasa (DHFR) que está afectada por un parámetro controlado externamente, tal como metotrexato (MTX), permitiendo de este modo el control de la expresión mediante el control de la concentración de metotrexato.

Aunque puede emplearse cualquier cepa de M. arthritidis como fuente del nuevo gen según la invención, preferiblemente, la cepa de M. arthritidis que se emplea es la cepa depositada en la American Type Culture Collection ("ATCC") con número de acceso 14152.

Un gen capaz de expresar la nueva enzima arginina deiminasa según la invención se aísla, preferiblemente del genoma de M. arthritidis mediante amplificación del ácido nucleico dirigida por un cebador y a continuación se clona en cualquier vector de selección y sistema de expresión adecuado (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch y T Maniatis, Eds., Cold Spring Harbor Press, 1989). El experto apreciará que puede emplearse cualquier procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos apropiado conocido en la técnica, utilizando cebadores adecuados. Preferiblemente, el procedimiento de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa como, simplemente a modo de ejemplo, describe Mullís en las Patentes de EE.UU. Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, a cuyas descripciones se hace referencia en este documento en su totalidad.

El experto también apreciará que puede emplearse cualquier vector de expresión plasmídico, fagémico o cósmido, insertado en las células hospedadores respectivas, para expresar, seleccionar e identificar un fragmento de ácido nucleico amplificado que codifica la arginina deiminasa de la invención. Preferiblemente, se emplea un sistema de expresión de Escherichia coli. Más preferiblemente, se emplea un sistema de expresión de Escherichia coli GX6712/pGX9401.

Los cebadores usados para la amplificación del gen ADI según los ejemplos proporcionados en este documento a continuación eran oligonucleótidos que tenían las secuencias de ID SEC Nº 3 y 4, respectivamente. Estos cebadores amplifican de forma satisfactoria el gen completo. Como se indica en los siguientes ejemplos, el cebador de la ID SEC Nº 3 difiere del correspondiente extremo N-terminal de la región codificadora del gen aislado (ID SEC Nº 1) en tres sustituciones de bases que no alteran la secuencia del péptido codificado. Las tres sustituciones de base, cuya numeración se basa en la numeración de la ID SEC Nº 1, son las siguientes: en la base 6 A se ha sustituido por T, en la base 15 T se ha sustituido por C y en la base 18 C se ha sustituido por T.

De este modo, la amplificación satisfactoria del gen completo que tiene una secuencia que comprende la ID SEC Nº 1 fue sorprendente, ya que como resultado de las faltas de coincidencia mencionadas anteriormente, en relación a la secuencia N terminal natural del gen ADI aislado, el cebador de la ID SEC Nº 3 hibridaba mal con el fragmento diana, proporcionando de este modo una explicación a la señal de PCR tan débil que resultaba de la amplificación usando el cebador de la ID SEC Nº 3.

El experto apreciará que un cebador basado en la secuencia N-terminal natural exacta de la ID SEC Nº 1 también servirá fácilmente, incluso con mejor eficacia, para amplificar el gen ADI según la invención.

Los clones proporcionados según los ejemplos siguientes de este documento incluyen el plásmido pEN232 que comprende el gen ADI en el vector de expresión pGX 9401. Los dos aislados de PCR iniciales del gen ADI de M. arthritidis también se clonaron en el plásmido pBluescript II SK(-) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) y denominados pEN241 y pEN242. La clonación del fragmento del extremo N-terminal de un segmento del gen ADI en pBluescript II SK(-), descrito en el ejemplo 1B, incluía dos clones analizados independientemente denominados pEN245 y pEN246. Las transformaciones independientes de E. coli DH5-alfa (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD.) con los plásmidos pEN241, pEN242, pEN245 y pEN246 producían los clones E. coli denominados EN243, EN244, EN247 y EN248, respectivamente.

Una vez que se obtiene una célula hospedadora transfectada o transformada, se produce fácilmente una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia según la ID SEC Nº 1 cultivando la célula hospedadora, y extrayendo y aislando el ácido nucleico según se desee, por procedimientos bien conocidos en la técnica. Dependiendo del grado de pureza deseado, el ácido nucleido extraído puede aislarse, o cuando se desee, aislarse sustancialmente mediante procedimientos conocidos en la técnica, para que esté libre o sustancialmente libre de proteínas y ácidos nucleicos contaminantes de la célula hospedadora. De forma similar, las células hospedadoras que expresan la proteína arginina deiminasa codificada por los vectores de expresión según la invención, se cultivan mediante procedimientos adecuados para la célula hospedadora seleccionada.

Por ejemplo, las células hospedadoras se cultivan hasta que se alcanzan las densidades celulares deseadas y, a continuación, las células se separan del medio de cultivo y se extraen las proteínas y, después de esto, se renaturalizan según procedimientos conocidos en la técnica. En particular, las células se separan del medio de cultivo para forma una pasta de células. A continuación, la pasta de células se resuspende y después se disgrega mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, disgregación mecánica, por ultrasonidos y/o química. Preferiblemente, las células se disgregan por procesamiento en un Microfluidizador (Microfluidics Corp. Newton MA) seguido del lavado con un tensioactivo adecuado, tal como, por ejemplo, Tritón X-100.

El homogeneizado resultante se desnaturaliza con guanidina HCl, 6 M y, a continuación, se diluye en tampón de replegamiento (por ejemplo, K_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,0), se retiran las partículas, por ejemplo, mediante centrifugación seguida de purificación del sobrenadante mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante cromatografía en columna de Q Sepharose, para proporcionar arginina deiminasa sustancialmente purificada, por ejemplo, con una pureza de aproximadamente el 60% y que tiene una actividad específica que oscila de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 UI/mg, o más, y preferiblemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 UI/mg. Puede lograrse una concentración adicional de la ADI usando un Centriprep-10, Amicon, Inc. Beverly, MA. Si se desea, también pueden usarse otras columnas que funcionan de forma similar.

2. Polímeros no antigénicos

Para formar los conjugados polímero-arginina deiminasa de la presente invención, los polímeros tales como poli(óxidos de alquileno) (POA) se convierten en formas activas, como tal término es conocido por los expertos en la técnica. De este modo, uno o ambos grupos terminales hidroxilo del polímero (es decir, los grupos alfa y omega hidroxilo terminales) se convierten en grupos funcionales reactivos que permiten la conjugación covalente. Este proceso frecuentemente se denomina "activación" y el producto se denomina "poli(oxido de alquileno) activado". Los polímeros que contiene tanto grupos de enlace alfa como omega se denominan polióxidos de alquileno bis-activados. Otros polímeros sustancialmente no antigénicos se "activan" o hacen funcionales de forma similar. Entre los polímeros sustancialmente no antigénicos, se prefieren óxidos de polialquileno monoactivados (POA), tales como monometoxi-polietilénglicoles. En realizaciones alternativas, se prefieren polímeros homobifuncionales bis-activados, tales como PEG bis-succiminidil carbonato activado.

De este modo, los polímeros activados son adecuados para reaccionar con la arginina deiminasa y formar conjugados ADI-polímero en los que la unión preferiblemente tiene lugar en el grupo amino terminal \alpha-amino o grupos \varepsilon-amino de las lisinas encontradas en la ADI.

En un aspecto preferido de la invención, se forman las uniones carbamato (uretano) usando los grupos \varepsilon-amino y los óxidos de polialquileno activados. Preferiblemente, la unión de carbamato se forma como se describe en la patente compartida de EE.UU. Nº 5.122.614, a cuya descripción se hace referencia en este documento. Esta patente describe la formación de derivados mono y bis N-succinimidil carbonato de óxidos de polialqueno (SC-PEG). Las alternativas incluyen polímeros de para-nitrofenil carbonato y carbonil imidazol activados.

En otro aspecto de la invención, los polímeros activados con enlazadores que forman amidas tales como óxidos de polialquileno activado con imidotiona, ésteres de succinimidilo o similares, se usan para efectuar la unión entre la arginina deiminasa y grupos terminales del polímero, véase por ejemplo, la patente de EE. UU. Nº 5.349.001 de Greenwald y col., a cuya descripción se hace referencia en este documento. Otros aspectos adicionales de la invención incluyen el uso de otros polímeros activados para formar uniones covalentes del polímero con la arginina deiminasa a través de grupos e-amino u otros. Por ejemplo, pueden usarse las formas de isocianato o isotiocianato de polímeros terminalmente activados para formar enlaces a base de urea o tiourea con los grupos amino lisina. Los PEG-dialdehidos también pueden reaccionar con la arginina deiminasa, seguido de la reducción con NaCNBH_{3} para formar un enlace amino secundario.

Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso, sin embargo, para los fines de la presente invención, normalmente se seleccionan los polímeros que tienen un peso molecular que oscila de aproximadamente 200 a aproximadamente 60.000. Se prefieren pesos moleculares de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000 y particularmente se prefieren de 2.000 a aproximadamente 20.000.

Preferiblemente, las sustancias poliméricas incluidas también son solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitante de estos polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno, tales como polietilénglicol (PEG) o polipropilénglicoles, polioles polioxietilenado, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros bloqueados.

Como alternativa a los polímeros a base de PAO, pueden usarse materiales eficazmente no antigénicos, tales como polímeros a base de dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, alcoholes de polivinilo, carbohidratos o similares. De hecho, la activación de grupos alfa y omega terminales de estas sustancias poliméricas puede efectuarse de manera similar a la usada para convertir los óxidos de polialquileno y, de este modo, serán evidentes para los expertos. Los expertos en la técnica entenderán que la lista anterior es solamente ilustrativa y se contemplan todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas en este documento. Para los fines de la presente invención, "eficazmente no antigénico" significa todos los materiales entendidos en la técnica como no tóxicos y que no provocan una respuesta inmunogénica apreciable en mamíferos.

3. Condiciones de reacción

Las reacciones de conjugación, algunas veces denominadas como reacciones de pegilación, generalmente tienen lugar en una solución de aproximadamente equimolar a aproximadamente con un exceso varias veces molar de polímero activado. Preferiblemente, el exceso molar de polímero activado es de aproximadamente 50 veces o mayor. Una manera de mantener la bioactividad de la arginina deiminasa es evitar sustancialmente incluir las lisinas de la arginina deiminasa asociadas con el sitio activo en el proceso de conjugación con el polímero. Dada la naturaleza normalmente no específica de la reacción de conjugación esta etapa teórica, a menudo, es difícil de conseguir en la práctica. El procedimiento de la presente invención, sin embargo, proporcionan conjugados de arginina deiminasa que retiene niveles elevados de actividad, usando la arginina deiminasa obtenida de M. arthritidis, la cual tiene un aumento sustancial del número de lisinas disponibles para su unión al polímero y evitando el uso de un exceso molar demasiado alto, por ejemplo, más de aproximadamente 100 veces, de polímero activado durante las reacciones de conjugación.

De este modo, las condiciones de conjugación incluyen la reacción de arginina deiminasa obtenida de M. arthritidis con un polímero sustancialmente no antigénico activado adecuadamente, tal como SC-PEG, en una solución tamponada adecuada en una proporción de polímero activado con respecto a arginina deiminasa de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 veces.

La reacción de conjugación se realizó en condiciones relativamente suaves para evitar la inactivación de la arginina deiminasa. Las condiciones suaves incluyen el mantenimiento del pH de la solución de reacción en el intervalo de 6-8 y las temperaturas de reacción en el intervalo de aproximadamente 0-30ºC y, preferiblemente, a aproximadamente 4ºC durante aproximadamente una hora. Los tampones adecuados incluyen soluciones tamponadoras capaces de mantener el intervalo de pH preferido de 6-8 sin interferir con la reacción de conjugación. Una lista no limitante de tampones adecuados incluye, por ejemplo, tampón fosfato, tampón citrato, tampón acetato.

Aunque las condiciones de reacción descritas en este documento pueden dar lugar a alguna arginina deiminasa sin modificar, la arginina deiminasa sin modificar puede recuperarse fácilmente y reciclarse en futuros lotes para reacciones adicionales de conjugación.

Las reacciones de conjugación de la presente invención inicialmente proporcionan una mezcla o conjunto de reacción que contiene conjugados de arginina deiminasa que tienen de aproximadamente 16 a aproximadamente 22 cadenas de polímero por subunidad de enzima (31 lisinas totales), arginina deiminasa sin reaccionar, si hay alguna, y polímero sin reaccionar. Después de retirar las especies sin reaccionar, se recuperan las composiciones que contienen los conjugados arginina deiminasa-polímero. Estas composiciones tienen al menos aproximadamente el 20% de la actividad biológica asociada con la arginina deiminasa nativa o inicial medida usando un ensayo tal como el que se describe a continuación en el ejemplo 3. En aspectos preferidos de la invención, sin embargo, los conjugados tienen al menos aproximadamente el 30% de la actividad biológica asociada con la arginina deiminasa inicial y, mas preferiblemente, los conjugados tiene al menos aproximadamente el 90% de la actividad biológica asociada con la arginina deiminasa inicial.

A continuación se muestra una reacción de conjugación representativa:

Se disuelve un exceso molar de aproximadamente 50 veces de polímero activado en agua para inyección (pH aproximadamente 6,0) y a continuación se añade a una solución de arginina deiminasa de M. arthritidis ajustada a un pH de aproximadamente 8,0 con un tampón adecuado, tal como un tampón fosfato o borato. La reacción se deja incubar aproximadamente a 4ºC, aproximadamente a pH 8,0 durante un tiempo adecuado, tal como aproximadamente 1 hora, con agitación suave continua. A continuación, la reacción de conjugación se detiene, por ejemplo con un exceso varias veces molar de arginina o glicina. La arginina deiminasa sin modificar presente en la mezcla de reacción, si la hay, después de que se haya inactivado la reacción de conjugación, puede recuperarse para su reciclaje en futuras reacciones usando cromatografía de intercambio iónico o de exclusión molecular, o por técnicas similares de separación. Preferiblemente, las soluciones que contienen los conjugados de la presente invención contienen menos de aproximadamente el 5% de arginina deiminasa sin modificar.

Si se desea, los conjugados arginina deiminasa-polímero se aíslan a partir de la mezcla de reacción para retirar las especies de alto peso molecular y la arginina deiminasa sin modificar. El proceso de separación comienza colocando las especies mezcladas en una solución tampón que contenga aproximadamente 1-10 mg/ml de los conjugados arginina deiminasa-polímero. Las soluciones adecuadas tienen un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0 y preferiblemente, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5. Las soluciones preferiblemente contienen una o más sales tamponadoras seleccionadas entre KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4} y NaOH. Se prefieren tampones con fosfato sódico.

Dependiendo del tampón de reacción, la solución del conjugado arginina deiminasa-polímero puede someterse, en primer lugar, a intercambio de tampón/ultrafiltración para retirar cualquier polímero sin reaccionar. Por ejemplo, la solución del conjugado POA-arginina deiminasa puede ultrafiltrarse a través de una membrana de punto de corte de bajo peso molecular (10.000 a 30.000 Daltons) para retirar la mayoría de los materiales no deseados, tales como polímero sin reaccionar, tensioactivos, si están presentes o similares.

El fraccionamiento de los conjugados ADI-polímero, si se desea, también puede realizarse usando un medio cromatográfico de intercambio aniónico. Estos medios son capaces de unirse selectivamente a conjugados POA-arginina deiminasa a través de diferencias en la carga que varía, en cierto modo, de manera predecible. Por ejemplo, las cargas superficiales de ADI se determinan mediante el número de aminoácidos cargados disponibles en la superficie de la proteína. De estos aminoácidos cargados, los restos de lisina sirven como potencial punto de unión a conjugados de óxido de polialquileno. Por tanto, los conjugados de arginina deiminasa tendrán una carga diferente a las otras especies para permitir su aislamiento selectivo. Se prefiere, especialmente, para el procedimiento de la presente invención el uso de resinas de intercambio aniónico fuertemente polares, tal como una resina de intercambio aniónico de aminas cuaternarias. Entre las resinas cuaternarias de intercambio aniónico disponibles en el mercado para su uso con la presente invención se incluyen Q-HD, QA TRISACRYL®. y QMA-SPHEROSIL®, resinas aminocuaternarias que recubren una matriz polimérica, fabricadas por IBF de Garenne, Francia para Sepracor de Malrborough, Massachusetts TMAF650M®, una resina tetrametilaminoetilo que recubre una matriz polimérica, fabricada por EM-Separators de Gibbstown, Nueva Jersey.; QAE550® y SUPERQC®, cada una, una resina amino cuaternaria que recubre una matriz polimérica y fabricada por TosoHaas de Montgomeryville, PA. También pueden usarse QMA Accell, fabricada por Millipore de Millford, MA y resinas PEI fabricadas por JT Baker de Phillipsburg, NJ. También pueden usarse otras resinas de intercambio aniónico adecuada, por ejemplo, resinas DEAE.

Por ejemplo, la resina de intercambio aniónico preferiblemente está empaquetada en una columna y equilibrada en medios convencionales. Se usa un tampón que tiene el mismo pH y osmolaridad que los de la solución de arginina deiminasa conjugada con el polímero. El tampón de elución preferiblemente contiene una o más sales seleccionadas entre KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4} y (NH_{4})_{2}CO_{3}. A continuación, la solución que contiene el conjugado se absorbe en la columna, no quedando retenidas ni las especies de alto peso molecular ni el polímero sin reaccionar. Tras finalizar la carga, para eluir la fracción deseada de arginina deiminasa conjugada con óxido de polialquileno se aplica a la columna un gradiente de flujo de un tampón de elución con concentraciones crecientes de sales. Preferiblemente, las fracciones eluídas mezcladas se limitan a conjugados de mono y bis polímeros de arginina deiminasa uniformes tras la etapa de separación por intercambio aniónico. A continuación, cualquier especie de arginina deiminasa no conjugada puede desprenderse de la columna por procedimientos convencionales. Si se desea, la especie arginina deiminasa también puede separarse mediante cromatografía de intercambio iónico adicional o cromatografía de exclusión molecular. El intervalo de temperatura para la elución está entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 25ºC. Preferiblemente, la elución se realiza a una temperatura de aproximadamente 6ºC a aproximadamente 22ºC. La recogida de fracciones puede realizarse simplemente a través de los perfiles de tiempo de elución.

4. Medicamentos

Otro aspecto de la presente invención proporciona medicamentos. Estos medicamentos son adecuados para su uso en procedimientos de tratamiento de diversas dolencias médicas en mamíferos. Los procedimientos incluyen administrar una cantidad eficaz de conjugados arginina deiminasa-polímero, que se han preparado según se describe en este documento, a un mamífero que necesita este tratamiento. Los conjugados son útiles para, entre otras cosas, el tratamiento de dolencias susceptibles a arginina deiminasa o dolencias que podrían responder positiva o favorablemente, en los términos conocidos en las técnicas médicas como terapia basada en arginina deiminasa.

Aunque sin desear quedar ligado a hipótesis o teoría alguna, el experto apreciará que la arginina es un aminoácido natural que se considera como un nutriente no esencial de la dieta humana. Un mamífero que tiene una dolencia, enfermedad o trastorno que se beneficiará de un descenso de la cantidad o concentración de arginina en el tejido, célula o fluidos circulantes o un mamífero, se beneficiará de este tratamiento con conjugados ADI-polímero según la invención. La arginina deiminasa cataliza la conversión directa de L-arginina y H_{2}O en L-citrulina y NH_{3}.

De este modo, sin limitaciones, los conjugados de arginina deiminasa puede usarse para tratar dolencias, incluyendo, carcinomas deficientes en la enzima argininosuccinato sintetasa, por ejemplo, melanoma (Sugimura y col., 1992, Melanoma Res. 2: 191-196) y dolencias relacionadas con óxido nítrico (NO), por ejemplo, dolencias que pueden tratarse o mejorarse con la modulación de la óxido nítrico sintetasa. En particular, se ha demostrado que la producción de NO celular depende absolutamente de la disponibilidad de arginina (Nagasaki y col., 1996, J. Biol. Chem. 211:2658-2662; Xia y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6770-6774). ADI también tiene ciertas aplicaciones alimenticias, por ejemplo, modulando los efectos negativos de dietas bajas en proteínas (Narita y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4552-4556).

La cantidad del conjugado arginina deiminasa-polímero administrada para tratar las dolencias descritas anteriormente se basa en la actividad arginina deiminasa del conjugado polimérico. Esta es una cantidad que es suficiente para lograr de forma significativa una respuesta clínica positiva. La dosis máxima para mamíferos, incluyendo a humanos, es la dosis más alta que no cause efectos adversos clínicamente importantes. Para los fines de la presente invención, estos efectos adversos clínicamente importantes, tales como, por ejemplo reacciones de hipersensibilidad y/u otras reacciones inmunogénicas, son los que podrían requerir el cese de la terapia.

De forma natural, las dosificaciones de las composiciones a base de arginina deiminasa variarán un tanto dependiendo del resto arginina deiminasa y del polímero seleccionado. En general, sin embargo, el conjugado se administra en cantidades que oscilan de aproximadamente 300 a aproximadamente 3000 UI/m^{2} de arginina deiminasa por día, en base a la dolencia del mamífero. El intervalo mostrado anteriormente es ilustrativo y los expertos en la materia determinarán la dosificación óptima del conjugado seleccionado en base a la experiencia clínica y a la indicación del tratamiento.

Los conjugados ADI-polímero de la presente invención pueden incluirse en una o más composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a mamíferos. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una solución, suspensión, comprimido, cápsula o similares, preparados según procedimientos bien conocidos en la técnica. También se contempla que la administración de estas composiciones será sobre todo a través de la vía parenteral, aunque también pueden usarse la vía oral o por inhalación dependiendo de las necesidades del experto.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar una apreciación adicional de la invención, pero no pretenden restringir de ninguna forma el alcance eficaz de la invención.

Ejemplo 1

Expresión del gen ADI de M. arthritidis en E. coli A. Aislamiento y clonación del gen ADI

La cepa 14152 de M. arthritidis se obtuvo de la American Type Culture Collection. El gen de la arginina deiminasa de M. arthritidis se amplificó mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el par de cebadores 5'-GGCAATCGATGTCTGTATTTGACAGTA-3' (ID SEC Nº 3) y 5'-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTT
TACG-3' (ID SEC Nº 4) derivados de la secuencia publicada de M. arginini LBIF (Ohno, T. y col. 1990) "Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding Arginine Deiminase of Mycoplasma arginini" Infect. Immun. 58:3788-3795, a cuyos contenidos se hace referencia en este documento.

La amplificación por PCR se realizó mediante procedimientos convencionales (como se revisa en Saiki y col., 1989, PCR Technology, páginas 7-16, Ed. Henry A., Erlich, Stockton Press) con los siguientes parámetros.

La reacción se realizó en un volumen de 100 microlitros, con un tampón de PCR de Tris-HCl 10 milimolar, pH 8,3, KCl 50 milimolar, MgCl_{2} 2 milimolar y 200 \muM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 2,5 unidades de la ARN polimerasa Taq (de Perkin Elmer). Se realizaron treinta ciclos de amplificación en un termociclador de Perkin Elmer, sistema de PCR 9600, fijado como desnaturalización a 94ºC durante 60 segundos, hibridación a 37 grados C durante 180 segundos y extensión a 72 grados C durante 120 segundos.

Tras la amplificación por PCR, en el análisis en gel de agarosa se observaron dos bandas más bien tenues de 1,4 kb y 1,2 kb que representaban dos fragmentos amplificados. Respectivamente, las muestras de cada fragmento se escindieron del gel, se purificaron y clonaron como un fragmento ClaI-BamHI directamente en un plásmido de expresión pGX9401 de la forma descrita por Filpula y col. en "Engineering of Immunoglobulin Fc and Single Chain Fv Proteins in Escherichia coli" en Antibody Expression and Engineering (H. Y. Wang y T. Imanaka, eds.), American Chemical Society, pág. 70-85, a cuyos contenidos se hace referencia en este documento. Ambos fragmentos se secuenciaron y se confirmó que el fragmento de 1,2 kb codificaba ADI por su homología parcial con genes previamente conocidas que codifican enzimas con actividad de enzima ADI.

Los cinco codones TGA del gene ADI aislado, que codifican para triptófano en Mycoplasma, se cambiaron por codones TGG mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótido según el procedimiento de Sayers y col. Biotechniques 13:592-596 (1992); a cuya descripción se hace referencia en este documento, antes de la expresión del gen en E. coli. El sistema de expresión de E. coli usado, GX6712/pGX9401, fue el mismo que el descrito en la referencia mencionada anteriormente de Filpula y col. La ADI recombinante se expresaba en cuerpos de inclusión a niveles del 10% de la proteína total de la célula.

B. Confirmación de la secuencia N-terminal del gen ADI

Para confirmar la región de N-terminal del gen de M. arthritidis correspondiente al cebador de PCR de la ID SEC Nº 3, se realizó una amplificación por PCR independiente de la región N-terminal usando los datos de secuencia de ADN establecidos a partir de la primera PCR. La técnica empleada fue la de "PCR inversa" como se describe en H. Ochman y col., 1990. (PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, Inc., Eds., M. A. Innis, D. H. Gelfand y col.).

La PCR inversa se realizó usando los cebadores para PCR 5'-CTAAAACGGTTTCTAGTTCACC-3' (ID SEC Nº 5) y 5'-AGCGTGGAATTAATGTTGTTG-3' (ID SEC Nº 6). Se digirieron dos microgramos de ADN genómico de M. arthritidis con la endonucleasa de restricción Sau 3A, a continuación, los fragmentos se circularizaron mediante tratamiento con ADN ligasa de T4. A continuación, esta preparación de ADN se sometió a amplificación por PCR usando las ID SEC Nº 5 y 6. El ADN amplificado se clonó y se analizó mediante secuenciación de ADN. El análisis de la secuencia de ADN confirmó la asignación de serina como el aminoácido que sigue a la metionina de inicio (que se predice que es eliminada postraduccionalmente). También se señalaron los tres cambios de base silentes: la base 6 es A en lugar de T, la base 15 es T en lugar de C, la base 18 es C en lugar de T. Además, en esta secuencia clonada, la base 39 es T en lugar C. Ninguno de estos cambios modifica la secuencia de la proteína traducida.

Se cree que las diferencias de tres bases entre la región codificadora N-terminal de la secuencia genómica confirmada y el cebador de la ID SEC Nº 3 empleado para aislar el gen son responsables de las bandas más bien débiles, como se discute anteriormente, que se producían cuando se analizó el producto de PCR por electroforesis en gel. Se cree que las tres bases diferentes son el resultado de una pobre hibridación entre el cebador y la región codificadora N-terminal, dando lugar a una señal débil de PCR observada en electroforesis en gel. De este modo, dado esta diferencia y la débil señal de PCR, la amplificación satisfactoria del gen completo ADI mediante PCR requería la selección cuidadosa de las condiciones de PCR y, por tanto, el aislamiento satisfactorio del gen representado por la ID SEC Nº 1 fue inesperado.

Ejemplo 2

Renaturalización y purificación de ADI recombinante

En este Ejemplo, la proteína ADI obtenida como resultado del Ejemplo 1 se renaturalizó según las técnicas publicadas por Misawa y col. con modificaciones menores (Misawa y col., 1994 "High-Level Expression of Mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and Its Efficient Renaturation As An Antitumor Enzyme" en J. Biotechnol. 36: 145-155; a cuyos contenidos se hace referencia en este documento).

Para empezar, se resuspenden 100 gramos de pasta de células en 800 ml de K_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM (tampón 1) y las células se disgregaron mediante dos pases por un Microfluidizador (Microfluidics Corp. Newton MA.). Se añade Tritón X-100 hasta alcanzar una concentración final del 4% (v/v). El homogeneizado se agita durante 30 minutos a 4 grados C y a continuación, se centrifuga durante 30 minutos a 13.000 g. Se recoge el sedimento y se resuspende en un litro de tampón 1 que contiene Tritón X-100 al 0,5%. La solución se diafiltró frente a 5 volúmenes de tampón de desnaturalización (Tris HCl 50 mM, pH 8,5, DTT 10 mM) usando cartuchos de fibra huecos con un índice de retención de 100 kD (Microgon Inc. Laguna Hills, CA). Se añade guanidina HCl hasta alcanzar una concentración final de 6 M y la solución se agita durante 15 minutos a 4 grados C. A continuación, la solución se diluye 100 veces en tampón de replegamiento (K_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,0) y se agita durante 48 horas a 15 grados C. Las partículas se retiran por centrifugación a 13.000 g. El sobrenadante resultante se concentró en una columna de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Inc. Piscataway, N.J.) preequilibrada en tampón de replegamiento. ADI se eluye usando el tampón de replegamiento con NaCl 0,2 M. El procedimiento de purificación produce una proteína ADI que está pura a >95% según se estima por análisis en SDS-PAGE. Se producen aproximadamente ocho gramos de proteína ADI pura renaturalizada a partir de 1 kilogramo de pasta de células, que corresponde con un rendimiento de 200 miligramos de ADI por litro de fermentación.

Ejemplo 3

Ensayo de arginina deiminasa

La actividad ADI se determina mediante una modificación menor del procedimiento descrito por Oginsky y col., en "Isolation and Determination of Arginine and Citrulline" Methods Enzymology 3:639-643 (1957), a cuya descripción se hace referencia en este documento. En una placa de microvaloración de 96 pocillos se pusieron diez microlitros de muestras en Na_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 7,0 (tampón de ensayo BUN), se añadieron 40 microlitros de arginina 0,5 M en tampón de ensayo BUN y las placas se cubrieron e incubaron a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 200 microlitros de reactivo BUN completo (Sigma Diagnostics) y la placa cubierta se incubó durante 10 minutos a 100ºC. La placa se enfrió hasta 22ºC y se analizó a 490 nM mediante un lector de placas de microvaloración (Molecular Devices, Inc.). Una UI es la cantidad de enzima que convierte 1 micromol de L-arginina en L-citrulina por minuto. Las concentraciones de proteínas se determinaron usando el reactivo de ensayo de proteínas Pierce Coomassie Plus (Pierce Co., Rockford, IL) con albúmina de suero bovina como patrón. Se determinó que la actividad enzimática específica de las preparaciones de ADI purificada era de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 UI/mg.

Ejemplo 4

En este Ejemplo, se usó monometoxi-polietilénglicol activado con succinimidil carbonato, de 12.000 de peso molecular, para modificar la arginina deiminasa obtenida como resultado del Ejemplo 2. El mPEG activado con succinimidil carbonato se preparó según el procedimiento de la patente de EE.UU. Nº 5.122.614 mencionada anteriormente.

Una solución de arginina deiminasa (0,910 mg en un volumen de 1 ml) se ajustó a pH 8,0 con tampón borato 100 mM. Se disolvió un exceso 50 veces molar del PEG activado en agua para inyección y, a continuación, se añadió la arginina deiminasa. La reacción se incubó a 4ºC durante aproximadamente 1 hora con agitación suave continua. Después de 1 hora, la reacción se detuvo con un exceso de arginina. Los conjugados PEG-ADI se diafiltraron a través de Centriprep 30 con 15 volúmenes de fosfato sódico 0,1 molar, pH 7,0, en el que se controló la presencia del polímero a 220 nm hasta <0,05. Los productos de reacción se analizaron como se describe en el Ejemplo 3, supra, y se encontró que retenía aproximadamente el 40% de la actividad ADI.

Ejemplo 5

Se repite el procedimiento del ejemplo 4 excepto porque se usa mPEG activado con una N-acil tioazolidina de 12.000 de peso molecular.

Ejemplo 6

Se repite el procedimiento del ejemplo 4 excepto por que se usa monometoxipolietilénglicol activado con succiminidil carbonato de peso molecular 5.000.

Ejemplo 7

Inhibición del crecimiento de células SK-MEL-2 por PEG_{12.000}-ADI

En este ejemplo, el PEG-ADI preparado según el ejemplo 4 se comparó con los conjugados PEG ADI hechos usando ADI obtenida a partir de M. arginini en un ensayo de inhibición del crecimiento celular. La ADI de M. arginini se obtuvo de manera similar a la usada para obtener la ADI de M. arthritidis, excepto porque la ADI de M. arginini se purificó en mayor grado que la ADI de M. arthritidis. En particular, se extrajo la ADI de M. arthritidis y se replegó hasta aproximadamente el 60% de pureza pero no se procesó a través de cromatografía de intercambio aniónico. Se espera que el procesamiento a través de la cromatografía de intercambio aniónico produzca una enzima ADI de M. arthritidis de pureza superior al 90%. La técnica de conjugación de PEG usada para hacer los conjugados con ADI derivada de M. arginini fue la misma que la usada en el ejemplo 4. En ambos casos, se usó para hacer los conjugados PEG de 12.000 de PM.

Las células de melanoma se cultivaron en Medio Mínimo Esencial (Eagle) con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM y sales de Earle; suero bovino fetal al 10%. Tras la tripsinización, las células viables se contaron mediante exclusión de azul de trypan. Se añadieron células (10^{4}) a cada pocillo en un total de 100 microlitros en placas de microvaloración de 96 pocillos. Los conjugados PEG_{12.000}-ADI se diluyeron en una dilución seriada con factor 2 de dilución en medio completo (0,1 ml) y se añadieron a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5%. El crecimiento celular a día 3 se midió añadiendo 1/10 de volumen de colorante "Azul de alamar"(Alamar Biosciences, Inc. Sacramento, CA). Después de cinco horas de incubación, las placas se leyeron a 570-630 nm con un lector de placas de Molecular Device.

Se encontró que los conjugados PEG-ADI derivados de M. arginini tenían una CI_{50} de 0,00015 UI/ml mientras que los PEG-ADI derivados de M. arthritidis tenían una CI_{50} de 0,00010 UI/ml. De este modo, cuando se normalizaron en unidades de UI/ml, se observó que los PEG-ADI derivados de M. arthritidis tenían el 150% de la potencia de los PEG-ADI derivados de M. arginini.

Ejemplo 8

Análisis por SDS-PAGE

Se realizó un análisis en SDS-PAGE para comparar los conjugados PEG_{12.000}-ADI preparados con ADI derivada de M. arginini o, según la presente invención, con ADI derivada de M. arthritidis. Los resultados indican que los conjugados derivados de M. arthritidis tienen una distribución de tamaño más uniforme y tiene un peso molecular medio más alto (y, por tanto, tiene más moléculas PEG unidad por subunidad ADI). Aunque los solicitantes no se ciñen a la teoría, se cree que la ADI derivada de M. arthritidis incluye un número mayor de lisinas a las que el PEG podría unirse covalentemente y, quizás lo más importante, hay un número suficiente de lisinas en esta ADI específica que no están asociadas con el sitio activo.

Ejemplo 9

Comparaciones de secuencias

En este ejemplo, se investigaron las secuencias de aminoácidos y el alineamiento de secuencias de diversas arginina deiminasas. Volviendo a la Figura 3, se aprecia que la línea "a" representa la ADI de M. arthritidis ATCC 14152 usada según la presente invención. La línea "b" representa la ADI de M. arginini LBIF. La línea "c" representa la ADI de M. hominis PG21 y la línea "d" representa la ADI de M. orale FERM BP-1970. Las rayas indican los aminoácidos idénticos a los encontrados en la línea "a". Los puntos indican huecos. El porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos con la ADI de M. arthritidis es:

M. arginini - 87%

M. hominis - 81%

M. orale - 83%.

Este nivel de no homología entre las secuencias de aminoácidos codificadoras de los genes respectivos indican diferencias significativas entre las proteínas codificadas de las respectivas especies de Mycoplasma. Los sitios de sustituciones de lisinas están dispersos y extendidos, lo que indica una diversidad mayor en los potenciales sitios de conjugación con el polímero.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Enzon, Inc.

\hskip1,5cm

20 Kingsbridge Road

\hskip1,5cm

Piscataway, Nueva Jersey 08854-3998

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Arginina deiminasa derivada de Mycoplasma y conjugados de polímeros que la contienen.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: ROBERTS & MERCANTI

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 81 Tamarack Circle

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Skillman

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Nueva Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 08558

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulgadas 1,4 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible con PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: Aún no disponible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-ENE-1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN: Aún no disponible

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/792.283

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-ENE-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Mercanti, Michael N.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33966

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2131055PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 609-921-3500

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 609-921-9535

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1230 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

AISLADO INDIVIDUAL: EN231

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 410 RESTOS DE AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

AISLADO INDIVIDUAL: EN231

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no revelante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ATCC 14152

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: EN231

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TÍPO DE CÉLULA: unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAATCGAT GTCTGTATTT GACAGTA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ATCC 14152

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: EN231

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGGATCCT TACTACCACT TAACATCTTT ACG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ATCC 14152

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: EN231

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAAAACGGT TTCTAGTTCA CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma arthritidis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: ATCC 14152

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: EN231

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGTGGAAT TAATGTTGTT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 410 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma arginini

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: LBIF

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULA: organismo unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES: Ohno, y col.,

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REVISTA: Infection and Immunity

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN: 58

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PÁGINAS: 3788-3795

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: noviembre 1990.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 410 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma hominis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: PG21

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULA: unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 410 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

COMPLEMENTARIA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mycoplasma orale

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: FERM BP-1970

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULA: unicelular

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

Claims (47)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una enzima arginina deiminasa que comprende una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

2. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico de la ID SEC Nº 1.

3. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de ácido nucleico de la ID SEC Nº 1 está mutada por sustituciones de nucleótidos seleccionados a partir del grupo compuesto por una T en el nucleótido 39, una C en el nucleótido 104, una A en el nucleótido 206, una A en el nucleótido 729, una G en el nucleótido 337, una C en el nucleótido 830, una C en el nucleótido 1023, una A en el nucleótido 6, una T en el nucleótido 15 y una C en el nucleótido 18.

4. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, que se selecciona entre el grupo compuesto por una molécula de ARN y una molécula de ADN.

5. Una molécula aislada de ácido nucleico que es complementaria de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 unida de forma operativa a una secuencia control.

7. El vector de expresión de la reivindicación 6, en el que dicha secuencia comprende un promotor.

8. El vector de expresión de la reivindicación 7, en el que dicho promotor es inducible.

9. El vector de expresión de la reivindicación 6, en el que dicho promotor se selecciona entre el grupo compuesto por un promotor de beta-lactamasa, un promotor lac, un promotor trp, un promotor phoA, un promotor araBAD, un promotor de T7, derivados de los promotores lambda P_{L} y P_{R} y un promotor híbrido O_{L}/P_{R}.

10. El vector de expresión de la reivindicación 6, seleccionado entre el grupo compuesto por un plásmido, un fago y un cósmido.

11. Una célula hospedadora recombinante, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

12. La célula hospedadora de la reivindicación 11, seleccionada entre el grupo compuesto por una célula hospedadora procariótica y una célula hospedadora eucariótica.

13. La célula hospedadora de la reivindicación 11, seleccionada entre el grupo compuesto por una bacteria y una levadura.

14. La célula hospedadora de la reivindicación 13, que es Escherichia coli.

15. Una arginina deiminasa aislada, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la ID SEC Nº 2.

16. La arginina deiminasa aislada de la reivindicación 15, que tiene una actividad específica de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 UI/mg.

17. Un procedimiento para producir arginina deiminasa, que comprende:

a)

transformar o transfectar una célula hospedadora con el vector de la reivindicación 6;

b)

cultivar la célula hospedadora transformada o transfectada; y

c)

expresar la arginina deiminasa en dicha célula hospedadora cultivada.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, que además comprende recuperar dicha arginina deiminasa expresada.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dicha arginina deiminasa se recupera mediante un procedimiento que comprende la extracción de dicha arginina deiminasa expresada a partir de dicha célula hospedadora y renaturalizar dicha arginina deiminasa expresada.

20. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, amplificada a partir de una genoma de Mycoplasma arthritidis mediante reacción en cadena de la polimerasa usando un par de cebadores que comprende las ID SEC Nº 3 e ID SEC Nº 4, en la que la ID SEC Nº 3 no está modificada o está modificada en la base 6, de modo que la A se ha sustituido por una T, en la base 15 de modo que la T se ha sustituido por una C, en la base 18 de modo que la C se ha sustituido por la T o combinaciones de las mismas.

21. Un conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa, que comprende la arginina deiminasa (ADI) purificada obtenida a partir de Mycoplasma arthritidis, conjugada covalentemente con un polímero no antigénico, en el que dicha ADI comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

22. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 21, en el que dicho polímero inmunogénico comprende un óxido de polialquileno.

23. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 22, en el que dicho óxido de polialquileno comprende un alquilo terminal.

24. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 22, en el que el óxido de polialquileno es polietilénglicol.

25. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 23, en el que dicho óxido de polialquileno terminado en alquilo es un polietilénglicol terminado en monometilo (mPEG).

26. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 21, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 60.000.

27. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 26, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000.

28. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 27, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 12.500.

29. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 21, en el que dicho polímero no antigénico se selecciona entre el grupo compuesto por polímeros a base de dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, polivinilalcoholes y carbohidratos.

30. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 21, que además comprende un enlace carbamato entre la arginina deiminasa y el polímero no antigénico.

31. El conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa de la reivindicación 21, que además comprende un enlace amida entre la arginina deiminasa y el polímero no antigénico.

32. Una arginina deiminasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 para su uso como medicamento.

33. Un conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa que comprende una arginina deiminasa con la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2 conjugada covalentemente con un polímero no antigénico, para su uso como medicamento.

34. Uso de una arginina deiminasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 para la fabricación de una composición para tratar una dolencia susceptible a la arginina deiminasa en un mamífero.

35. Uso de un conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa que comprende una arginina deiminasa con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 conjugada covalentemente con un polímero no antigénico, para la fabricación de una composición para tratar una dolencia susceptible a la arginina deiminasa en un mamífero.

36. Un procedimiento para preparar un conjugado polímero no antigénico-arginina deiminasa, que comprende poner en contacto la arginina deiminasa (ADI) purificada, obtenida de Mycoplasma arthritidis, con la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2, con un polímero no antigénico en condiciones suficientes para que tenga lugar la conjugación de dicha arginina deiminasa purificada y dicho polímero no antigénico.

37. El uso de la reivindicación 34 o de la reivindicación 35, en el que dicha dolencia susceptible a la arginina deiminasa es un tumor o cáncer susceptible a la arginina deiminasa.

38. El uso de la reivindicación 34 o de la reivindicación 35, en el que dicho mamífero es un paciente humano.

39. El uso de la reivindicación 35, en el que dicho polímero no antigénico comprende un óxido de polialquileno.

40. El uso de la reivindicación 39, en el que dicho óxido de polialquileno comprende un alquilo terminal.

41. El uso de la reivindicación 39, en el que dicho óxido de polialquileno es polietilénglicol.

42. El uso de la reivindicación 35, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000.

43. El uso de la reivindicación 35, en el que dicho polímero antigénico tiene un peso molecular de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000.

44. El uso de la reivindicación 35, en el que dicho polímero no antigénico tiene un peso molecular de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 12.500.

45. El uso de la reivindicación 35, en el que dicho polímero no antigénico se selecciona entre el grupo compuesto por polímeros a base de dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, alcoholes polivinílicos y carbohidratos.

46. El uso de la reivindicación 35, en el que dicho conjugado además comprende un enlace carbamato entre la arginina deiminasa y el polímero no antigénico.

47. El uso de la reivindicación 35, en el que dicho conjugado además comprende un enlace amida entre la arginina deiminasa y el polímero no antigénico.