CN110179994B - 一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白类药物可控缓释与靶向递送技术领域，具体涉及一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用。本发明提供的温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物，包括蛋白质类药物以及与其顺次偶联的酶响应性多肽和温度响应性高分子。该蛋白质高分子偶联物一方面由于其温度响应性，显著延长了蛋白质类药物的半衰期，改善了药代动力学参数，在提高药物代谢表现方面具有显著优势；另一方面由于其酶响应性，有效提高蛋白质类药物在酶切释放后的组织渗透能力和活性，提高药物的疗效，降低药物的毒副作用，适用于多种药用蛋白类物质的给药和疾病的治疗，具有优异的推广应用价值和潜力。

Description

一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及蛋白类药物可控缓释与靶向递送技术领域，具体涉及一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用。
背景技术
蛋白质-高分子偶联物由于可以增加小分子蛋白质的水合半径，从而逃逸肾脏清除作用，已经成为有效延长蛋白药物循环半衰期最常用的方法。目前，延长蛋白药物循环半衰期最常用的方法是用聚乙二醇(PEG)修饰蛋白质药物，这种方法通常被称为PEG化(PEGylation)。采用聚乙二醇(PEG)修饰IFN，能有效改善其药代动力学，改善药物分布，提高其疗效。另外，将治疗性蛋白融合到人血清白蛋白(HSA)和抗体的Fc片段等长效循环蛋白是另一种延长其循环半衰期的方法。通过融合人血清白蛋白能够有效提高干扰素循环半衰期并有效控制修饰位点。最近，无规卷曲的多肽被用于提高药物蛋白的体内半衰期，包括XTEN化,PAS化,和ELP化。这些方法可以将药物蛋白在小鼠体内半衰期延长到1-2天，将给药频率降低到每周一次。然而，这些方法很难进一步显著提高药物代谢水平。
环境响应性高分子材料是指对外界刺激(如温度、pH值、光、电场、磁场、化学物质等)能够产生敏感响应性行为的一类高分子材料。目前,无论在学术界还是应用领域,环境响应性高分子材料的研究都尤为活跃,已成为国内外众多学者关注的热点。这些刺激敏感型高分子材料在药物控制释放、生物材料培养、分离、蛋白酶的活性控制等方面具有潜在的应用价值。
目前，温度响应性高分子材料已经有商业化的应用。例如具有最低临界溶液温度(LCST)水凝胶已经被用来作为药物载体，实现药物缓释；在较低温度下，LCST水凝胶具有亲水性，可以稳定地存在于血液中；当温度升高，LCST水凝胶变为亲脂性，从而可以穿透细胞膜。温敏性蛋白递送方法，可以有效突破传统的药物代谢提高途径中延长半衰期的限制。又如，通过基因工程将一种重要的药用蛋白干扰素ɑ与一种温敏性类弹性蛋白多肽融合，形成温敏性融合蛋白。对小鼠模型一次皮下注射融合蛋白可以在原位形成一个储库，并表现出持续一个月的零级释放，从而大大增强了肿瘤聚集、肿瘤治愈，并大幅度提高了耐受性和生物安全性。这种温敏性蛋白递送途径可能提供了一种新型、简单、有效的途径用于极大地提高循环半衰期短的药用蛋白的药代动力学表现。
酶响应药物载体系统具有其独特的优势，首先，相比光、温度、超声等物理刺激药物递释系统需借助特殊仪器外加光源、磁场等辅助手段，酶响应药物载体系统无需仪器辅助；其次，不同于pH响应与温度响应型刺激，大多数酶刺激响应的反应条件较为温和；再者，不同酶对其特异性底物具有高选择性，易于构建多种针对不同病变组织高表达酶的纳米材料。研究表明，某些组织特异性高表达多种酶类，如基质金属蛋白酶-2(metrixmetalloproteinase-2,MMP-2)在肿瘤细胞外基质中特异性高表达，因此，为了减少药物对正常组织细胞的毒副作用，同时增强药物在目标组织中的活性和渗透能力，期望能够得到一种酶响应的纳米药物载体，其在体内运输过程中可以稳定存在，而当到达目标部位时可以释放药物达到治疗目的。近年来，酶响应型纳米药物载体发展迅速，主要类型包括脂质体、聚合物胶束、聚合物纳米粒、介孔纳米粒、纳米凝胶等。对于酶响应性材料的设计，多肽具有特有的优势，通过设计，将含有酶切位点的多肽序列设计到材料中，材料便可能具有酶响应活性，从而提高疾病的诊断或治疗效果。因此，开发特异性高、制备方法简单的酶响应性药物载体很有必要。
综上所述，合成兼具温度与酶响应的蛋白质-高分子偶联物材料对于药物释放与输运具有非常重要的意义。这种温敏性和酶响应结合的蛋白递送途径可能提供了一种新型、简单、有效的途径用于提高循环半衰期短的药用蛋白的药代动力学表现，同时提高药物在目标组织中的渗透性和活性，获得更好的疗效。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种能够同时响应温度和酶刺激、包括蛋白类药物、酶响应性底物肽和温敏性高分子的蛋白质高分子偶联物以及由此组成的药物智能释放体系；蛋白类药物由于温敏性高分子的温度响应性缓慢释放后到达可分泌某种水解酶的细胞，进而切断底物肽，最后释放蛋白类药物；该药物智能释放体系具有药物半衰期长、特异性高、组织渗透性强以及释放蛋白类药物活性高的优点。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种温度和酶双重响应性药物递释载体，包括酶响应性多肽和温度响应性高分子，所述酶响应性多肽与所述温度响应性高分子顺次偶联。
本发明中，所述温度响应性高分子包括温敏性蛋白、多肽或高分子聚合物。
所述温敏性多肽包括类弹性蛋白多肽。
所述温敏性高分子聚合物包括聚乙烯醇接枝聚合物、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯、聚丙烯酸寡聚乙二醇酯、聚(N，N-乙基甲基丙烯酰胺)、聚乙烯甲醚、聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚(丙烯氧化物)中的至少一种。
本发明中，所述酶响应性多肽是指在某种酶高表达的环境刺激下具有发生酶解能力的多肽片段，例如，脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸所组成的多肽分子可以在基质金属蛋白酶-2(MMP-2)作用下被酶解。
本发明所述的酶响应性多肽可以采用本领域常规的合成方法制备。
作为优选，所述温度响应性高分子为类弹性蛋白多肽，所述类弹性蛋白多肽的序列包括(XGVPG)n，其中，n为不小于10的整数，X是除脯氨酸以外的任何一种天然氨基酸。
类弹性蛋白多肽(ELP)具有温敏性可逆相变的特性，其中，可逆相变是指类弹性蛋白在两相之间在一定温度时的相平衡压力下发生的相变化，也就是说，若环境温度低于它的相变温度,该多肽在水溶液中为高度可溶；相反,当环境温度高于该相变温度时，富含水的多肽链结构脱水，并开始聚集，形成一个富含ELP的聚集物，并且这个相变过程是可逆的。发明人研究发现，ELP具有生物相容性，无毒无免疫原性，可以利用基因工程技术与蛋白和多肽融合用于蛋白和多肽的纯化和转运；而且ELP的相变温度可随氨基酸的疏水性和重复单元的数量而改变：重复单元的数量(n)与相变温度(Tt)之间呈负相关，重复单元数越多，相变温度越低。利用ELP蛋白的温敏可逆相变特性可以实现蛋白类药物的温度依赖性可控释放，进而将循环半衰期延长与温度依赖性可控释放结合起来，用于温敏性缓释药物载体，并用于小分子蛋白和多肽类药物的给药。
发明人对ELP的重复氨基酸序列、重复单元数量和序列大小进行选择，使药物递释载体的相变温度适当低于正常人体体温，既保证相变温度低于体温，在体内呈凝胶状，实现体内聚集，并缓释蛋白类药物入血，显著降低了药物的释放速率，实现蛋白类药物的零级释放，有效延长了药物的循环半衰期，并显著提高了药物的生物利用度，改善了药代动力学参数。药物能够长效缓释，又具有良好的组织渗透性，生物利用率高。如果n过大，则融合蛋白分子量过大，即尺寸过大，会导致组织渗透性差而影响药效；而如果n过小，相变温度过高，则无法达到有效的体内聚集(如皮下聚集)，无法实现药物的长效缓释。
“体内呈凝胶状”是指蛋白质高分子偶联物在给药部位聚集，形成富含ELP的聚集物，该聚集物呈凝胶状，而给药部位可以根据疾病的种类，治疗的部位和药物的种类等进行选择，可以是皮下给药，即形成皮下凝胶，也可以是腹腔给药，即在腹腔内形成凝胶，或是瘤内给药，即在肿瘤内部形成凝胶，以及其它可行的给药方式。
作为优选，所述类弹性蛋白多肽的序列包括(XGVPG)n，其中，10≤n≤200，X为选自缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种。所述类弹性蛋白多肽的响应温度为10-60℃。
进一步优选地，其中，X为缬氨酸，30≤n≤120，所述类弹性蛋白多肽的响应温度为20-36℃。
本发明中，所述药物递释载体携带蛋白类药物到达分泌某种水解酶的细胞后，在该水解酶的作用下切断酶响应性多肽，释放蛋白类药物；酶响应性多肽使得所述药物递释载体具有特异性高、组织渗透性强以及释放蛋白类药物的活性高的优点。
作为优选，本发明所述酶切位点多肽为底物肽，所述底物肽为选自金属基质蛋白酶家族底物肽、过氧化物酶底物肽、酪氨酸酶底物肽、转肽酶底物肽、成纤维激活蛋白酶底物肽、分泌型磷脂酶A2底物肽、组织促凝血酶原激酶底物肽、凝血酶底物肽、组织蛋白酶B底物肽中的一种或多种。
金属基质蛋白酶家族成员基质金属蛋白酶-2(MMP-2)已被证实在多种肿瘤细胞中高表达，例如直肠肿瘤细胞、乳腺癌细胞等。
为设计靶向肿瘤细胞等MMP-2高表达细胞的药物递释载体，作为本发明的一种实施方式，所述酶响应性多肽为金属基质蛋白酶-2底物肽。
本发明中，所述金属基质蛋白酶-2底物肽的序列包括PLGLAG、PLGVR中的一种或多种。
现有技术关于ELP或MMPS作为药物载体或间隔肽的应用多为单独使用或与其它多肽融合，本发明发现将MMPS和ELP顺次连接，通过对MMPS和ELP特定的序列设计和融合，能够同时很好地保证融合肽同时发挥ELP的缓释作用和MMPS的酶响应功能。
作为优选，所述酶响应性多肽为金属基质蛋白酶-2底物肽，所述药物递释载体为序列包括GPLGLAGSRAGVG(VGVPG)n的偶联多肽，其中，60≤n≤120。更优选地，90≤n≤120
上述偶联多肽序列中，GPLGLAGSRAGVG为MMP-2底物肽序列，(VGVPG)n为ELP多肽序列。
进一步地，本发明提供一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物，包括蛋白质类物质和与所述蛋白质类物质顺次偶联的所述温度和酶双重响应性药物递释载体；所述蛋白质高分子偶联物的水合直径≤200nm。此纳米尺度的蛋白质高分子偶联物具有通过高渗透性与滞留效应(EPR)介导的被动靶向肿瘤的优势。
优选地，所述蛋白质高分子偶联物的水合直径为20-100nm。
本发明所述蛋白质高分子偶联物包括顺次偶联的蛋白质类物质、酶响应性多肽和温度响应性高分子。
本发明所述蛋白质类物质包括蛋白质、多肽或小肽中的一种或多种，所述的蛋白质类物质的分子量为1000-300000Da。
分子量为1000-300000Da的蛋白质类物质的分子量较小，容易被体内蛋白酶降解和肾排出，循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，尤其适于通过前述的温敏性长效缓释高分子药物载体，避免蛋白酶降解和肾排出，延长药物的半衰期。
作为优选，所述蛋白质类物质包括胰岛素、单克隆抗体、血液因子、集落刺激因子、生长激素、白介素、生长因子、治疗性疫苗、降钙素、肿瘤坏死因子和酶。
进一步优选地，所述蛋白质类物质选自天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF、转化生长因子TGF、神经生长因子NGF、血小板衍生的生长因子PDGF、骨形态发生蛋白BMP、成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子CSF、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽VIP、肠促胰酶肽CCK、胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素TRH、促甲状腺激素、促黄体生成激素、促黄体激素释放激素LHRH、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂IL-1RA、胰高血糖素样肽-1、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白细胞介素-2、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶、巨噬细胞活化因子、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体中的至少一种。
作为本发明的优选实施方式，所述蛋白质类物质为干扰素、粒细胞集落刺激因子、瘦素、胰高血糖素样肽-1及其类似物和水蛭素中的至少一种。
进一步地，本发明提供所述温度和酶双重响应性药物递释载体或所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物在制备药物中的应用。
利用本发明提供的温度和酶双重响应性药物递释载体携带蛋白类药物或制备温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物能够使得药物递送体系智能性响应温度和酶的刺激，有效提高药物循环半衰期、组织细胞的特异性、渗透性以及蛋白类药物的活性。
作为优选，所述药物包括但不限于用于预防或治疗肿瘤、组织器官病变、免疫性疾病、代谢性疾病的药物。
所述组织器官病变包括但不限于肝炎。
所述免疫性疾病包括但不限于风湿。
所述代谢性疾病包括但不限于糖尿病。
作为优选，所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤、卵巢癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏肿瘤、神经胶质瘤等常见实体瘤。
进一步地，本发明还提供一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物智能药物释放体系，所述智能药物释放体系包含所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物。
进一步地，本发明还提供一种药物，其包含所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物。
除所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物外，所述药物还可包含药学领域允许的辅料。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种干扰素药物，包括由干扰素多肽和所述温度和酶双重响应性药物递释载体组成的偶联物；其中，所述干扰素多肽与所述药物递释载体可操作地连接。
本发明所述干扰素(IFN)包括干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ。
本发明利用基因工程技术将MMP-2酶底物肽(MMPS)的N末端和C末端分别与药用蛋白IFN多肽和温敏性ELP多肽融合表达，得到药用蛋白IFN-酶底物肽MMPS-温敏性ELP多肽偶联物。通过调控该偶联物中ELP的重复单元序列和重复单元数量，确定了最优偶联物中的配合IFN和MMPS使用的ELP序列，即(VGVPG)90，进一步确定了偶联物的序列，使得偶联物能够达到低于体温的适宜相变温度。在实际应用时，如皮下注射，皮下注射的IFN-酶底物肽MMPS-温敏性ELP多肽偶联物会从溶液中析出并在注射部位皮下形成凝胶储库。而且，由于ELP相变温度具有浓度依赖性，储库中边缘的ELP融合蛋白分子会在相当长的一段时期内逐渐溶解扩散释放进入血液循环系统，实现干扰素的长时间零级释放，有效延长干扰素的循环半衰期，并能保证药物的生物利用度和组织渗透性。
作为优选，本发明所述干扰素药物中，由干扰素多肽和所述温度和酶双重响应性药物递释载体组成的偶联物的氨基酸序列包括如下任一氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO.9所示氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO.9所示的序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的多肽的氨基酸序列；
(3)与如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列。
上述序列如SEQ ID NO.9所示的由干扰素多肽和所述温度和酶双重响应性药物递释载体组成的偶联物(融合多肽)包括顺次连接的如下序列：IFNα多肽序列、linker、MMPS、ELP上述linker的序列为GSGG。本发明通过大量筛选和优化确定了IFNα与温度和酶双重响应性药物递释载体连接的linker，保证了IFNα与MMPS-ELP药物递释载体的两个肽段不会发生功能区的折叠和遮挡，能够最大程度地保持IFNα和药物递释载体的活性和功能。
本发明提供纳米级别的IFN-MMPS-ELP偶联物；所述纳米级别的IFN-MMPS-ELP偶联物的分子直径≤200nm。此纳米尺度的蛋白质高分子偶联物具有通过高渗透性与滞留效应(EPR)介导的被动靶向肿瘤的优势，本发明利用肿瘤模型验证了所述蛋白质高分子偶联物在肿瘤治疗中的功能。结果表明，一次性皮下注射温度和酶双重响应性IFN-MMPS-ELP偶联物表现出显著增强的肿瘤聚集和渗透能力。
本发明提供的上述干扰素药物的半衰期不低于1周，甚至可长达20天。上述干扰素药物的半衰期显著延长，药代动力学参数更优异，且具有良好的组织渗透性和活性，药物的疗效提高，药物的毒副作用小。
本发明所述的干扰素药物可采用不同的给药方式，当采用皮下注射给药时，所述干扰素药物中所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物(IFN-MMPS-ELP)的浓度大于1μM。
干扰素药物中所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物(IFN-MMPS-ELP)以大于1μM的浓度进行皮下注射，会从溶液中析出，原位形成储库，而且由于低浓度溶解效应会逐渐从储库释放扩散进入循环系统，实现药物的长效缓释。
进一步地，本发明提供编码所述温度和酶双重响应性药物递释载体或所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物或所述干扰素药物的核酸。
本领域技术人员应该理解，当偶联物的氨基酸序列确定后，本领域技术人员可以根据密码子简并性和宿主细胞的密码子偏好性设计编码相同氨基酸序列的不同核酸序列，这些核酸序列均在本发明的保护范围内。
进一步地，本发明提供含有所述核酸的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或细胞系。
本发明中，所述载体可以通过将所述核酸插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。所述载体可以是质粒或病毒。
质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。病毒很容易转染到受体细胞中。本领域技术人员可以根据需要进行选择。
对于用于构建重组细胞的重组载体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
所述工程菌或所述宿主细胞含有所述核酸或含有携带所述核酸的载体。
进一步地，本发明提供所述核酸或所述生物材料在制备蛋白质或多肽类药物中的应用。
本发明还提供一种温度和酶双重响应性蛋白药物的制备方法，其为将所述温度和酶双重响应性药物递释载体与药用蛋白类物质的C末端融合表达，得到所述温度和酶双重响应性蛋白药物。
本发明还提供所述干扰素药物的制备方法，包括：将编码所述由干扰素多肽和与其顺次偶联的所述药物递释载体组成的偶联物的核酸导入宿主细胞，表达所述偶联物，经提取和纯化制备得到。
本发明的发明点主要在于提供由酶响应性多肽和温度响应性高分子偶联构成的温度和酶双重响应性药物递送载体，以及由酶响应性多肽作为连接肽将蛋白质药物和温度响应性高分子偶联所获得的蛋白质高分子偶联物及其制备方法，本发明的技术方案中对偶联的操作方法并没有特别的限定。本领域的技术人员可以采用本领域常规使用的手段进行蛋白质、多肽和高分子的偶联，只要能够获得本发明所述的温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物即可，例如根据本发明的一种优选的具体实施方式，在实施例中，当所应用的温度响应性高分子为温敏性多肽时，所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物的制备方法可以包括：利用基因工程技术将酶响应性多肽的N末端和C末端分别与药用蛋白和温敏性多肽融合表达，得到药用蛋白-酶响应性多肽-温敏性多肽偶联物。
本发明的有益效果在于：本发明提供由酶响应性多肽和温度响应性高分子组成的温度和酶双重响应性蛋白类药物递送载体，其中，温度响应性高分子能够在温度作用下响应性将蛋白质高分子偶联物缓释入血，作为蛋白类药物与温度响应性高分子之间连接肽的酶响应性多肽能够在目标组织内的酶作用下响应性二次释放具有活性的蛋白类药物。
本发明提供的温度和酶双重响应性的长效缓释蛋白递送体系是一种全新的纳米载药体系，一方面由于其温度响应性，有效突破传统的药代提高途径中延长半衰期的限制，显著延长了药物的半衰期(IFNα的半衰期从游离IFNα的1.9h延长到IFNα-MMPS-ELP(V)的422.2h，延长了222.2倍)，改善了药代动力学参数，在提高药物代谢表现方面具有显著优势；另一方面由于其酶响应性，有效提高蛋白类药物在酶切释放后的组织渗透能力(IFNα-MMPS-ELP(V)经MMP-2酶切后的IFNα活性由37％恢复到91％)，进而提高药物的疗效，降低药物的毒副作用；不仅可减少给药频率，还可极大提高治疗效果，同时降低毒副作用，适用于多种药用蛋白类物质的给药和疾病的治疗，大大提高患者的生活质量。此外，本发明提供的长效缓释蛋白递送体系还具有制备所需设备简单、成本低廉、工艺操作方便等优势。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1显示了本发明实施例1中IFNα-MMPS-ELP质粒构建的方法流程示意图。
图2显示了本发明实施例2中通过ITC纯化获得IFNα-MMPS-ELP和镍柱亲和层析纯化获得IFN的结果。
图3显示了本发明实施例3中MALDI-TOF分析IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα的分子量的结果。
图4显示了本发明实施例3中IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα的水合半径结果。
图5显示了本发明实施例3中IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP的相转变温度结果。
图6显示了本发明实施例3中IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP相转变温度的浓度依赖性结果。
图7显示了本发明实施例4中IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα的体外生物活性结果。
图8显示了本发明实施例5中IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP在MMP-2酶作用下的SDS-PAGE结果。
图9显示了本发明实施例5中IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP在C8161和OVCAR-3肿瘤细胞培养液作用下的SDS-PAGE结果。
图10显示了本发明实施例6中IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP在MMP-2酶作用下的体外生物活性结果。
图11显示了本发明实施例6中静脉注射相同干扰素剂量的IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(A)和IFNα后在裸鼠体内的血药浓度随时间的变化的结果。
图12显示了本发明实施例6中IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα的最大耐受剂量结果。
图13显示了本发明实施例6中皮下最大耐受剂量注射后Cy5标记的IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα在原位形成储库随时间变化情况的活体成像结果。
图14显示了本发明实施例6中皮下注射最大耐受剂量IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα在裸鼠体内的血药浓度随时间的变化的结果。
图15显示了本发明实施例6中皮下最大耐受剂量给药后循环系统中IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα的药时曲线面积随时间变化曲线的结果。
图16显示了本发明实施例7中IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα在肿瘤及其他组织中的分布结果。
图17显示了本发明实施例8中静脉注射5mg/kg体重IFNα剂量的Cy5标记的IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(A)和IFNα在肿瘤组织中渗透能力的结果。
图18显示了本发明实施例8中皮下最大耐受剂量注射后Cy5标记的IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα在肿瘤组织中渗透能力的结果。
图19显示了本发明实施例9中皮下最大耐受剂量给药后IFNα-MMPS-ELP，IFNα-ELP和IFNα抑制肿瘤生长情况的结果。
图20显示了本发明实施例9中小鼠皮下最大耐受剂量注射药物后肿瘤生长情况。
图21显示了本发明实施例9中小鼠皮下最大耐受剂量注射药物后的生存曲线结果。
图22显示了本发明实施例9中皮下最大耐受剂量注射药物后裸鼠体重随时间的变化结果。
图23显示了本发明实施例9中皮下最大耐受剂量注射药物后裸鼠肿瘤及其他组织的组织学变化情况的结果。
图24显示了本发明实施例9中小鼠皮下最大耐受剂量注射药物后肾、肝、心脏功能生理指标和血液指标变化情况的结果。
具体实施方式
本发明所用术语“智能药物释放体系”，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。
本文所用术语“治疗”是指疾病或疾病状态的任何不期望的病征或症状的任何程度的减轻、预防或抑制。这些不期望的病征可以包括使个体的良好状态或外观的整体感觉恶化的那些病征。这个术语并非必须意味着疾病或疾病状态的完全治愈或消失。“治疗剂”是指在以治疗有效量向哺乳动物给药时，向该哺乳动物提供治疗益处的化合物。本文中，治疗剂可以指蛋白药物。本领域技术人员应当理解，术语“治疗剂”并不限于得到监管机构批准的蛋白药物。“治疗剂”可以与至少一种酶响应性酶切位点/底物肽和/或温度响应性高分子操作地相关联。
“操作地相关联”，即可以是这几个分子直接地关联，中间不含有其它分子，也可以是间接地关联，中间含有其它的分子。例如，酶底物肽(MMPS)的N末端和C末端分别可以直接与药用蛋白IFN的C末端和温敏性ELP多肽的N末端相连，也可以二者之间含有其他的肽段。同时，“操作地相关联”表示分子之间存在电子相互作用。这类相互作用可以采取化学键的形式，其包括但不限于共价键、极性共价键、离子键、静电缔合、配位共价键、芳香键、氢键、偶极或范德华相互作用。本领域的普通技术人员理解，这些相互作用的相对强度可以变化很大。
本发明所用术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。
本发明所用术语“重组载体”是指这样的一种遗传载体，包含特定的核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，重组载体的形式不受特别限制。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1 IFNα-MMPS-ELP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中表达
本发明通过对ELP重复单元的氨基酸序列和重复单元的重复次数进行设计和优化，获得不同序列和分子大小的ELP，并经筛选确定了性能优异的ELP(既保证相变温度适当低于体温，在体内呈凝胶状，实现体内聚集，并缓释蛋白类药物入血，使得药物既能够长效缓释又具有良好的组织渗透性)。本实施例以ELP重复单元的氨基酸序列为VGVPG，重复次数n为90，命名为ELP(V)90的性能优异的ELP为例，ELP(V)90的相变温度在20-36℃范围内。
由生工生物技术(上海，中国)合成包含上述重复单元和BseRI/AcuI粘性末端的基因片段。
上游片段：5’GCGTGGGTGTTCCGGGCGTAGGTGTCCCAGGTGTGGGCGTACCGGGCGTTGGTGTTCCTGGTGTCGGCGTGCCGGGC3’(SEQ ID NO：1)
下游片段：5’TAGCCCGGCACGCCGACACCAGGAACACCAACGCCCGGTACGCCCACACCTGGGACACCTACGCCCGGAACACCCAC3’(SEQ ID NO：2)
通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-24a(+)载体中，通过滚环法质粒构建获得18个如上重复单元的质粒。
本实施例中，ELP(A)序列的氨基酸重复单元为：(AGVPG)，共重复90次。
由生工生物技术(上海，中国)合成包含上述重复单元和BseRI/AcuI粘性末端的基因片段，
上游片段：5’GCGCAGGTGTGCCGGGCGCGGGTGTTCCGGGCGCAGGTGTC CCGGGC3’(SEQ IDNO：3)
下游片段：5’CAGCCCGGGACACCTGCGCCCGGAACACCCGCGCCCGGCACAC CTGC3’(SEQ IDNO：4)
通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-24a(+)载体中，通过滚环法质粒构建获得30个如上重复单元的质粒。
MMP-2底物肽(MMPS,GPLGLAGSRAGVG)的基因序列由生工生物技术(上海，中国)合成并通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-24a(+)载体中，该MMPS基因序列引物如下：
上游引物：5’GAGATAGAGGAGTACATATGGGCGGCCCGCTGGGTCTGGCA GGCA3’(SEQ IDNO：5)
下游引物：5’TTTCCGCTGAAGGCAGAGAGCCACCGCCAACTCCGGCACGGC TGC3’(SEQ IDNO：6)
IFNα基因序列(NCBI GI 386795)由生工生物技术(上海，中国)合成并插入
Figure BDA0002046933560000101
-T载体中。利用PCR技术，从
Figure BDA0002046933560000102
-T载体中扩增IFNα编码序列，通过BseRI/AcuI酶切位点插入到pET-24a(+)载体中，通过质粒构建获得含有IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP基因的质粒，其中，IFNα基因序列如SEQ ID NO：10所示。
该IFNα基因序列引物如下：
上游引物：5’GAGATAGAGGAGTACATATGGGCTGTGATCTGCCTCAGACTCA TT3’(SEQ IDNO：7)
下游引物：5’TTTCCGCTGAAGGCAGAGAGCCACCGCCACCGGATCCTTCTTTAGAACGCAGGCTCT3’(SEQ ID NO：8)
融合蛋白IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP质粒构建方法如图1所示，构建得到质粒后在大肠杆菌(Rosetta-gami(DE3)pLysS，Novagen)中表达。在大规模的表达之前，先将转化得到的单克隆菌接种在50mL TB培养基中(含100μg/mL卡那霉素)，在37℃、180rpm条件下震荡培养过夜。第二天再转接入1L新鲜TB培养基当中(盛在2L的摇瓶中，卡那霉素浓度为100μg/mL)进行大规模培养并诱导表达。具体步骤如下：首先在37℃，200rpm条件下震荡培养5h，随后将培养温度设为18℃，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，终浓度为0.5mM，培养16h后收集菌体。
实施例2 IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP融合蛋白的纯化
1、采用反相转变循环技术(Inverse transition cycling,ITC)纯化IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP，具体方法如下：
(1)将1L大肠杆菌培养液收集于离心瓶，以3000×g离心力离心收集菌体，去除上层培养液。
(2)用30mL冰冷PBS重悬菌体，再用超声仪在4℃条件下破碎细胞，然后将大肠杆菌破碎产物在4℃、14000×g离心力下离心15分钟。
(3)在步骤(2)收集的上清液中加入2mL聚乙烯亚胺(PEI，10％)，再次离心15分钟，目的为除去细胞裂解液中的核酸及其他带负电物质，得到的上清液进行ITC纯化：加入终浓度为3M的NaCl，37℃充分溶解后14000×g离心力下离心15分钟，去上清，沉淀溶解在提前预冷的10mM PBS中，完全溶解后离心，得到上清。此过程重复2-3次即可获得样品。
2、采用Ni亲和层析的方法来纯化带有His标签的IFNα重组蛋白，具体步骤如下：将上清用0.22μm滤膜过滤后，上样到镍亲和柱中，然后用AKTA Purifier 10系统进行纯化，之后用0～100％缓冲液B(10mM PBS,500mM咪唑,pH 7.4)进行梯度冲洗，收集各个洗脱峰，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。得到目标蛋白后，用HiPrep 26/10脱盐柱去除咪唑，并置将缓冲液置换成10mM PBS，pH 7.4，溶液中，保存在-80℃。
纯化样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试纯度，并用分光光度计法(NanoDrop 2000)测定了蛋白的浓度。SDS-PAGE分析样品由含有5％β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液配制，浓度为1mg/mL，95℃下加热5min后，10μL样品装载到预制的10％SDS-PAGE凝胶中，垂直电泳80～100V电压下运行90min(电泳液为：25mM Tris、250mMGlycine、0.1％SDS)。凝胶用考马斯蓝G-250染色处理后观察条带位置。图2显示了IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα的表达与纯化。结果表明，通过大肠杆菌进行表达，纯化后获得纯度＞95％的蛋白，该蛋白即为IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP蛋白质高分子偶联物。
实施例3 IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP融合蛋白的物理化学表征参数测定
1、用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定实施例2获得纯化产物的分子量，所用仪器为4800PlusMALDI-TOF/TOFTM分析仪(AB SCIEX)，结果如图3所示，表明IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα的实验所测分子量与理论值接近。
2、在Malvern Zetasizer Nano-zs90上用动态光散射(DLS)方法测定样品的水合半径：样品稀释在PBS缓冲液中，测试前经0.22μm孔径滤膜过滤处理。经DLS测试，IFNα的水合半径为2.9nm，而合成的蛋白质-高分子偶联物的水合半径达到11nm。而肾脏滤过清除尺寸约为5nm半径，表明蛋白质-高分子偶联物可以延长IFNα的循环半衰期，图4显示了DLS分析IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα的水合半径。
3、IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP的相转变温度(Tt)通过浊度法进行测定：样品用PBS稀释至1mg/mL，用酶标仪(Molecular Devices)测定在4-80℃(以1℃/min递增)温度范围内OD350的紫外吸收，再以同样速率降温至4℃测定OD350的紫外吸收，其中，Tt指样品浊度达到最大值一半时的温度，结果如图5所示，图5显示了IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP的相转变温度，二者都表现出急剧的可逆相转变行为。
4、为了探索IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP相转变温度的浓度依赖性，样品用PBS稀释至不同浓度，用酶标仪(Molecular Devices)测定在4-80℃(以2℃/min递增)温度范围内OD350的紫外吸收，结果如图6所示，图6显示IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)的相变温度在高浓度(≥1μM)时低于体温，而低浓度(<1μM)下高于体温，结果表明IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)以1μM以上高浓度皮下注射时，会从溶液中析出，原位形成储库，但是由于低浓度溶解效应会逐渐从储库释放扩散进入循环系统。虽然IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα-ELP(A)的相变温度也有浓度依赖性，但当它的浓度达到500μM时相变温度仍远高于体温，表明IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα-ELP(A)即使高浓度皮下注射也不会形成储库。因此，在后续实施例中体内实验皮下注射时最大耐受剂量给药的浓度均为500μM，此浓度下IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)形成储库而IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα-ELP(A)不会形成储库。
实施例4 IFNα-MMPS-ELP偶联物的体外生物活性检测
本实施例对实施例2制备得到的IFNα-MMPS-ELP偶联物的体外活性进行检测。
IFNα-MMPS-ELP的抗细胞增殖活性采用MTT方法测定。MTT实验选用了人Burkitt’sB淋巴瘤细胞(Daudi B)，因为该细胞对IFN-α具有较高的敏感度。Daudi B细胞在含有10％FBS、50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的RMPI-1640中培养一段时间后，在96孔板中接种一定浓度的细胞悬浮液(50μL/孔，104个细胞)，将IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα样品系列稀释，各50μL加入96孔培养板中，设阴性对照(不含IFN-α)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％CO2培养72～96h，加MTT溶解液(Promega)20μL/孔，3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值，比较不同样品处理后细胞增殖的程度。结果如图7和表1所示，结果显示了MTT测定IFNα-MMPS-ELP的体外生物活性，其中，IFNα-MMPS-ELP(V)活性保持了37％，远远高于人白蛋白修饰的IFNα的活性保持率(<1％)。该结果表明经温敏性ELP修饰后并没有严重降低IFNα的活性，为体内抗肿瘤活性测试提供了依据。
表1
样品 IC50(pg/mL) 相对于游离IFNα的活性(％)
IFNα 20.2 100
IFNα-ELP(A) 56.9 36
IFNα-ELP(V) 54.6 37
IFNα-MMPS-ELP(A) 53.8 38
IFNα-MMPS-ELP(V) 55.3 37
实施例5 IFNα-MMPS-ELP偶联物的MMP-2酶响应性测试
本实施例对实施例2制备得到的IFNα-MMPS-ELP偶联物的MMP-2酶响应性进行测试。
将100μg的IFNα-MMPS-ELP或IFNα-ELP样品加入到500μL、100μg/mL的MMP-2酶切体系中，37℃孵育6h，酶切产物用SDS-PAGE进行检测，结果如图8所示，结果表明IFNα-MMPS-ELP被MMP-2成功酶切为IFNα和ELP两部分，而IFNα-ELP未被切断。
分别将5×106个人卵巢癌肿瘤细胞(OVCAR-3)和人黑色素瘤细胞(C8161)在六孔板中培养4h，待其贴壁后将培养液换成无血清培养液培养24h，收集细胞培养液12,000rpm、4℃离心10min取上清以去除细胞碎片，之后将IFNα-MMPS-ELP或IFNα-ELP分别与OVCAR-3和C8161肿瘤细胞培养液上清37℃孵育48h。细胞培养液中包含的MMP-2酶切效果用SDS-PAGE进行检测。结果如图9所示，结果表明IFNα-MMPS-ELP被成功酶切为IFNα和ELP两部分，而IFNα-ELP未被切断。
将IFNα-MMPS-ELP被细胞培养液酶切产物样品系列稀释，选用人Burkitt’s B淋巴瘤细胞(Daudi B)用MTT法检测不同样品处理后细胞增殖的程度。并测定IFNα-MMPS-ELP用细胞培养液孵育后的体外生物活性。结果如图10和表2所示，结果显示，IFNα-MMPS-ELP酶切后的体外生物活性由37％上升到了91％和93％，而IFNα-ELP酶切前后的活性没有改变。该结果表明IFNα-MMPS-ELP经MMP-2酶切后释放出IFNα并恢复了IFNα的活性，为体内抗肿瘤活性测试提供了依据。
表2
Figure BDA0002046933560000131
实施例6 IFNα-MMPS-ELP偶联物的药物代谢动力学测试
本实施例对实施例2制备得到的IFNα-MMPS-ELP偶联物的药物代谢动力学进行测试。
利用裸鼠模型，经尾静脉注射相同干扰素剂量的IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(A)和IFNα后，测定了血液中干扰素浓度随时间变化的情况，并利用DAS软件进行数据分析。
在药物处理期前，12只8周龄体重为20g左右的雌性裸鼠观察一段时间后，随机分成3组。以1mg/kg体重剂量尾静脉注射IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(A)和IFNα，然后在设定的时间点用异氟烷对裸鼠进行麻醉后经眼内眦静脉取血0.3-0.4mL，室温静置1h，在4℃、3000×g下离心收集上层血清，保存于-80℃低温冰箱。用人IFN-α2ELISA试剂盒(PBLinterferon source)根据说明书测定血清中的IFN-α2含量。利用DAS 3.0药物代谢动力学分析软件计算出药物代谢动力学参数。利用DAS软件中房室消除模型分析IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(A)和IFNα的药物代谢动力学参数，IFNα的终末半衰期(t1/2β)(1.4±0.21h)延长到了IFNα-ELP(A)的9.6±2.7h和IFNα-MMPS-ELP(A)的8.9±1.0h。IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα-ELP(A)的曲线下面积(AUCs)为684.1±12.1μg/L·h和707.3±37.1μg/L·h，分别为IFNα(61.8±1.7μg/L·h)的11.1和11.4倍，结果见图11，结果表明，由于尺寸增大和肾脏清除减弱，ELP融合可显著提高IFN的药代动力学水平，这与其他延长半衰期的途径如PEG化，HSA融合，Fc融合和无规卷曲多肽融合的原理相同。但是，静脉注射融合蛋白后血药浓度降低的结果显示，应用酶响应性而未应用温度响应性的IFNα-MMPS-ELP(A)偶联物可以延长半衰期，药代动力学效果类似IFNα-ELP(A)，但并不能消除药代的峰谷波动效应。
以最大耐受剂量皮下注射了IFNα-MMPS-ELP和IFNα-ELP。图12显示，IFNα-MMPS-ELP(V)和IFN-ELP(V)的最大耐受剂量(100mg/kg体重(BW))是IFNα-MMPS-ELP(A)(20mg/kgBW)和IFNα(15mg/kg BW)的5.0和6.7倍。表明温度响应的IFNα-MMPS-ELP偶联物可显著提高药物耐受度。由图6可知，最大耐受剂量的IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-MMPS-ELP(A)相变温度分别大大低于和高于体温。因此，以最大耐受剂量皮下一次注射IFNα-MMPS-ELP(V)会在原位形成一个储库，正如图13所示在原位形成了一个可持续一个月的肿块，而IFNα-MMPS-ELP(A)则不能形成储库。
以最大耐受剂量皮下注射IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα，并按同上方法分析药物代谢动力学参数，图14显示，经过皮下注射，IFNα和IFNα-MMPS-ELP(A)组血液中IFNα水平很快于4h和2.8h提高到5878.7±187.1μg/L和5456.9±758.5μg/L，之后快速下降，表现出药代动力学的峰谷变化。相反，皮下注射IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)组的IFNα血药浓度在13.2h达到5416.9±589.3和5461.1±558.8μg/L后，在30天内维持几乎稳定的水平，表现出持续一个月的零级稳定释放。这种及其显著的差异可由表4中IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα的药代动力学参数进一步证明。IFNα-MMPS-ELP(V)的半衰期(422.2±13.7h)与IFNα-ELP(V)(491.8±38.1h)近似，分别是IFNα-MMPS-ELP(A)(9.0±0.87h)和IFNα(1.9±0.08h)的46.9和222.2倍，表明将延长半衰期与温敏性可控释放相结合有效提高了IFNα的半衰期。IFNα-MMPS-ELP(V)组的药时曲线面积(2755.9±16.8mg/L·h)与IFNα-ELP(V)组(3102.0±269.8mg/L·h)相似，分别是IFNα-MMPS-ELP(A)(118.3±15.1mg/L·h)和IFNα(46.9±7.8mg/L·h)的23.3和58.8倍，表明温敏性ELP(V)融合极大提高了药物的生物利用度。而且，由图15可知，IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)在血液循环系统中累积的药时曲线面积与时间呈线性相关，证实满足一个月的零级持续释放，而IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα呈对数释放曲线。综上所述，这些结果证明了温敏性的ELP(V)融合可在为期一个月的相当长的时期消除IFN药代动力学的峰谷波动效应。表3显示了静脉注射相同干扰素剂量的IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(A)和IFNα后的药物代谢动力学数据分析。表4显示了最大耐受剂量皮下注射IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα的药物代谢动力学数据分析。
表3
Figure BDA0002046933560000141
Figure BDA0002046933560000151
表4
Figure BDA0002046933560000152
实施例7 IFNα-MMPS-ELP偶联物在组织中的分布情况
本实施例对实施例2得到的IFNα-MMPS-ELP偶联物在组织中的分布情况进行检测，具体如下：
利用移植了黑色素瘤细胞的裸鼠测定了一次皮下注射最大耐受剂量，给药1d，3d，30d后各主要组织器官中残留的干扰素的浓度。将12只雌性无胸腺(Nude)裸鼠分成4组，IFNα、IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(V)和IFNα-MMPS-ELP(V)组，人黑色素瘤细胞(C8161)在含有10％FBS，50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的RMPI-1640培养基中培养一段时间后，用胰蛋白酶消化剥离，经PBS洗涤，重悬于不含上述添加物的RMPI-1640培养基，0.2mL单细胞悬液(5×106个细胞)接种于裸鼠左后肢股骨处背部皮下，培养30天后形成100mm3大小的实体瘤肿块。IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα以最大耐受剂量背部皮下注射，给药1d，3d，30d后分别处死裸鼠，收集主要器官如心、肾、肝脏、脾脏、肺、胰腺、胃、肌肉、小肠及肿瘤。组织用提取缓冲液(PBS含1mM EDTA，0.5％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，1mM PMSF，按1:100比例稀释的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich))破碎后，离心取上清提取液。组织中的IFN的浓度用ELISA方法定量测定。
检测结果如图16所示，图16显示了IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)在各组织中累积情况。在注射样品1d，3d，30d后，IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)在各组织中能够有效累积。IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)主要在肿瘤和肾脏中有高浓度，即使在给药后30天也是如此。这是由于存在一个月的零级持续释放动力学。与之相反，IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα在肿瘤中聚集量较少，并且按最大耐受剂量给药后3d在所有主要组织器官中都几乎检测不到了，这是由于它们循环半衰期短。这些结果表明温敏性高分子ELP(V)的偶联大大提高了IFNα在小鼠体内的生物分布，从而提高干扰素在体内的生物利用度和抗肿瘤功效。
实施例8 IFNα-MMPS-ELP偶联物在肿瘤组织中的渗透能力
本实施例分析实施例2得到的IFNα-MMPS-ELP偶联物在肿瘤组织中的渗透能力，具体如下：
利用移植了C8161黑色素瘤细胞的裸鼠测定了IFNα-MMPS-ELP偶联物在肿瘤组织中的渗透能力。IFNα-MMPS-ELP、IFNα-ELP和IFNα用Cy5标记。
当肿瘤长到100mm3大小时，以5mg/kg体重IFNα剂量尾静脉注射IFNα-MMPS-ELP(A)、IFNα-ELP(A)和IFNα，8h后取出肿瘤组织，制作冷冻切片。用CD31一抗标记肿瘤血管，然后用Cy3标记的IgG二抗孵育，用DAPI染核后封片。用LSM710激光共聚焦显微镜观察Cy5荧光强度，并用Image J软件分析。检测结果如图17所示，与IFNα-ELP(A)和IFNα相比，加入酶响应性的IFNα-MMPS-ELP(A)组在距肿瘤血管较远处检测到了更强的Cy5荧光，显示了更强的肿瘤组织渗透力。这可能是由于肿瘤中高表达的MMP-2酶将IFNα-MMPS-ELP(A)切断为IFNα和ELP(A)后，IFNα更容易渗透进入更深的组织。
为了检测IFNα-MMPS-ELP(V)的肿瘤渗透能力，以最大耐受剂量皮下注射Cy5标记的IFNα,IFNα-ELP(V),IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα-MMPS-ELP(V)，12h后收取肿瘤组织并按上述方法观察并统计荧光强度。检测结果如图18所示，与其他各组相比，IFNα-MMPS-ELP(V)组在距肿瘤血管较远处检测到了更强的Cy5荧光，显示了更强的肿瘤组织渗透力。这是由于与IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα相比，温度响应性大大提高了IFNα-MMPS-ELP(V)和IFNα-ELP(V)的MTD、药代动力学和肿瘤聚集，而酶响应性进一步促进IFNα的渗透，从而使温度和酶双重响应的IFNα-MMPS-ELP(V)表现出优于IFNα-ELP(V)的渗透能力。
实施例9 IFNα-MMPS-ELP偶联物的抗肿瘤活性分析
本实施例中，利用裸鼠模型测试实施例2得到的IFNα-MMPS-ELP偶联物的体内抗肿瘤活性，本实施例采用C8161黑色素瘤细胞和OVCAR卵巢癌细胞在裸鼠皮下肿瘤模型来评价IFNα-MMPS-ELP的体内生物活性。
将C8161或OVCAR细胞接种于裸鼠右后肢股骨处背部皮下，培养至形成实体瘤肿块(～30mm3和30mm3)，从而建立裸鼠肿瘤模型。将40只裸鼠分成5组，IFNα,IFNα-ELP(V),IFNα-MMPS-ELP(A)，IFNα-MMPS-ELP(V)和生理盐水组。以最大耐受剂量一次背部皮下注射打入裸鼠体内，直至对照组小鼠全部死亡。每周观察裸鼠生存状态以及肿瘤生长情况，动态测量裸鼠体重和肿瘤体积随时间的变化。治疗结束后通过眼球取血，获得血液和血清送至清华大学校医院检验科测定乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等基本生理指标水平。当小鼠肿瘤生长超过1000mm3或体重下降超过15％，小鼠即安乐处死。
图19，20显示，对于C8161黑色素瘤模型，IFNα-MMPS-ELP(V)的治疗效果大大优于IFNα-MMPS-ELP(A)，IFNα-ELP(V)和IFNα，图21显示，经一次皮下注射最大耐受剂量，IFNα-MMPS-ELP(V)组的60％的小鼠肿瘤被治愈，均未见复发。与之相比，IFNα-ELP(V),IFNα-MMPS-ELP(A)，IFNα组治愈率分别为30％，0％和0％。对于OVCAR卵巢癌模型，IFNα-MMPS-ELP(V)也收到了相似效果。IFNα-MMPS-ELP(V)组的37.5％的小鼠肿瘤被治愈，均未见复发，而其他各组治愈率均为0％。综上所述，这些体内抗肿瘤数据表明温度和酶双重响应的IFNα-MMPS-ELP(V)可以显著提高IFNα在小鼠体内的药效动力学表现。能够有效地治愈或抑制肿瘤的生长，具有非常好的体内抗肿瘤活性。图19显示了IFN-ELP抑制肿瘤生长情况，图20为小鼠肿瘤生长实物图，图21显示了注射药物后小鼠的生存曲线。
图22显示，所有组裸鼠都没有观察到明显的体重变化，表明IFNα-MMPS-ELP没有明显的副作用。图23 H&E染色表明IFNα-MMPS-ELP(V)，IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα-ELP(V)对主要器官如心、肝、脾、肺、肾都没有引起明显的组织学改变，而IFNα引起了肾脏损伤，表现为广泛性的肾小管颗粒变性和肾间隙水肿。表明IFNα-MMPS-ELP不会对体内器官造成明显毒性，为未来用于临床使用提供了基础。图24血液生化分析进一步证实了上述结果，其中IFNα组的肾功能标志物如肌酸酐(CREA)和血液尿素氮(UREA)显著高于生理盐水组。与生理盐水组相比，IFNα-MMPS-ELP(V)，IFNα-MMPS-ELP(A)和IFNα-ELP(V)都没有引起所有血常规标志物水平的显著变化。这些数据表明温度和酶双重响应的IFNα-MMPS-ELP(V)偶联物可以降低IFNα对小鼠的系统毒性。图22显示了注射药物后裸鼠体重随时间的变化情况。图23显示了注射药物后裸鼠各主要器官组织学改变。图24显示了小鼠注射药物后心脏(乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶)、肝(谷丙转氨酶、谷草转氨酶)、肾(肌酐、尿素氮)功能生理指标变化情况和血液指标(红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白)变化情况。
综上所述，本发明实施例创新性地提出了一种温度和酶双重响应的蛋白质高分子偶联物IFNα-MMPS-ELP(V)，通过整合温度响应性长效缓释和酶响应性可控释放，大大提高循环半衰期短的药用蛋白的药代动力学性能并提高药用蛋白的渗透能力和活性。给小鼠一次皮下注射温度和酶双重响应的IFNα-MMPS-ELP(V)偶联物显示出大大延长的持续一个月的零级释放动力学，这是目前可知的蛋白递送系统所达到的最长的循环时间。基于应用一个与体重相关的动力学方程推导出的异速生长缩放比例，小鼠药代动力学数据表明温度和酶双重响应的IFNα-MMPS-ELP(V)偶联物可以实现人的每三个月给药一次的剂量。同时，肿瘤中高表达的MMP-2酶将IFNα-MMPS-ELP(V)切断为IFNα和ELP(V)后，IFNα恢复活性并且更容易渗透进入更深的组织。因此，一次性皮下注射温度和酶双重响应的IFNα-MMPS-ELP(V)偶联物表现出大大增强的肿瘤聚集和肿瘤渗透，提高疗效而且显著提高了小鼠的耐受性和生物安全性。这种温度和酶双重响应的蛋白质-高分子偶联物智能药物释放体系适用于很多药用蛋白、酶和高分子，不仅可减少给药频率，还可极大提高渗透能力、蛋白活性和治疗效果，同时降低毒副作用，从而大大提高患者的生活质量。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京大学
<120> 一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物及其制备方法与应用
<130> KHP191111332.2
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgtgggtgt tccgggcgta ggtgtcccag gtgtgggcgt accgggcgtt ggtgttcctg 60
gtgtcggcgt gccgggc 77
<210> 2
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagcccggca cgccgacacc aggaacacca acgcccggta cgcccacacc tgggacacct 60
acgcccggaa cacccac 77
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgcaggtgt gccgggcgcg ggtgttccgg gcgcaggtgt cccgggc 47
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcccggga cacctgcgcc cggaacaccc gcgcccggca cacctgc 47
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagatagagg agtacatatg ggcggcccgc tgggtctggc aggca 45
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttccgctga aggcagagag ccaccgccaa ctccggcacg gctgc 45
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagatagagg agtacatatg ggctgtgatc tgcctcagac tcatt 45
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttccgctga aggcagagag ccaccgccac cggatccttc tttagaacgc aggctct 57
<210> 9
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys
20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ala
165 170 175
Gly Ser Arg Ala Gly Val Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
180 185 190
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
195 200 205
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
210 215 220
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
225 230 235 240
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
245 250 255
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
260 265 270
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
275 280 285
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
290 295 300
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
305 310 315 320
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
325 330 335
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
340 345 350
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
355 360 365
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
370 375 380
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
405 410 415
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
420 425 430
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
435 440 445
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
450 455 460
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
465 470 475 480
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
485 490 495
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
500 505 510
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
515 520 525
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
530 535 540
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
545 550 555 560
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
565 570 575
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
580 585 590
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
595 600 605
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
610 615 620
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Tyr
625 630
<210> 10
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgtgtgatc tgcctcagac tcattctctg ggtagtcgtc gtacgctgat gctgctggct 60
caaatgcgcc gtattagcct gttttcttgc ctgaaagatc gccacgattt tgggtttcca 120
caggaagaat ttggcaacca gttccagaaa gccgaaacaa ttccggtact gcacgagatg 180
attcaacaaa tctttaacct gttcagcacc aaagactctt ctgctgcctg ggatgaaaca 240
ctgctggaca aattctatac cgagctgtat cagcaactga acgatctgga ggcatgtgtt 300
attcagggtg ttggtgtgac tgaaactccg ctgatgaaag aggatagcat tctggcagtc 360
cgtaaatatt ttcagcgtat cacactgtat ctgaaagaga aaaaatatag cccgtgtgcc 420
tgggaagttg ttcgtgccga aatcatgcgc agctttagtc tgtctaccaa cctgcaagag 480
agcctgcgtt ctaaagaa 498

Claims (14)

1.一种温度和酶双重响应性药物递释载体，其特征在于，包括酶响应性多肽和温度响应性高分子，所述酶响应性多肽与所述温度响应性高分子顺次偶联；
所述温度响应性高分子为类弹性蛋白多肽，所述类弹性蛋白多肽的序列包括（VGVPG）n，所述类弹性蛋白多肽的响应温度为20-36℃；
所述酶响应性多肽为金属基质蛋白酶-2底物肽，所述金属基质蛋白酶-2底物肽的序列为GPLGLAGSRAGVG；
所述药物递释载体的序列为GPLGLAGSRAGVG(VGVPG)n，其中，60≤n≤120。
2.根据权利要求1所述的温度和酶双重响应性药物递释载体，其特征在于，90≤n≤120。
3.一种温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物，其特征在于，包括蛋白质类物质和与所述蛋白质类物质顺次偶联的权利要求1或2所述的药物递释载体；所述蛋白质高分子偶联物的水合直径为20-100 nm；
所述蛋白质类物质的分子量为1000-300000Da，所述蛋白质类物质为胰岛素、单克隆抗体、血液因子、集落刺激因子、生长激素、白介素、生长因子、治疗性疫苗、降钙素、肿瘤坏死因子或酶。
4.根据权利要求3所述的温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物，其特征在于，所述蛋白质类物质选自天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF、转化生长因子TGF、神经生长因子NGF、血小板衍生的生长因子PDGF、骨形态发生蛋白BMP、成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子CSF、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽VIP、肠促胰酶肽CCK、胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素TRH、促甲状腺激素、促黄体生成激素、促黄体激素释放激素LHRH、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂IL-1RA、胰高血糖素样肽-1、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子GM-CSF、白细胞介素-2、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶、巨噬细胞活化因子、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体中的至少一种。
5.权利要求1或2所述药物递释载体或权利要求3~4任一项所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物在制备药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括用于预防或治疗肿瘤、组织器官病变、免疫性疾病、代谢性疾病的药物。
7.一种药物，其特征在于，包含权利要求3~4任一项所述温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物。
8.一种干扰素药物，其特征在于，包括由干扰素多肽和权利要求1或2所述的药物递释载体组成的偶联物；所述干扰素多肽与所述药物递释载体可操作地连接。
9.根据权利要求8所述的干扰素药物，其特征在于，所述偶联物的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
10.编码权利要求1或2所述药物递释载体或权利要求3~4任一项温度和酶双重响应性蛋白质高分子偶联物或权利要求8或9所述干扰素药物的核酸。
11.含有权利要求10所述核酸的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、工程菌、宿主细胞或细胞系。
12.权利要求10所述核酸或权利要求11所述生物材料在制备蛋白质或多肽类药物中的应用。
13.权利要求7所述的药物的制备方法，其特征在于，将权利要求1或2所述药物递释载体与药用蛋白类物质的C末端融合表达，得到所述温度和酶双重响应性蛋白药物。
14.权利要求8或9所述干扰素药物的制备方法，其特征在于，包括：将编码所述由干扰素多肽和与其顺次偶联的权利要求1或2所述的药物递释载体组成的偶联物的核酸导入宿主细胞，表达所述偶联物，经提取和纯化制备得到。
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