CN103230598A - 融合肽治疗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及融合肽治疗组合物。具体地，本发明提供含有包含弹性蛋白样肽(ELPs)和肽活性治疗剂的融合蛋白(FPs)的治疗组合物，及制备和使用这种组合物和融合蛋白的方法。这类治疗组合物与单独的肽活性治疗剂相比，使得肽活性治疗剂的改进功效得以实现。与相应的含有相同肽活性治疗剂但不含相关ELPs的组合物相比，本发明治疗组合物中的肽活性治疗剂的增强的功效可包括改进的溶解性、生物利用度、生物不可利用度和半寿期等。

Description

融合肽治疗组合物
本申请是申请日为2007年9月6目的中国专利申请200780041180.6“融合肽治疗组合物”的分案申请。
相关申请资料
本申请依据美国法典第35卷第119条第5项(35U.S.C.§119(e))要求2006年9月6日提交的美国专利申请系列号60/842,464的优先权，该专利申请通过引用整体结合到本文中。
技术领域
本发明提供掺入了包含弹性蛋白样肽(elastin-like peptides，ELPs)和肽活性治疗剂的融合蛋白(fusion proteins，FPs)的新一代治疗组合物。本发明的治疗组合物与含有相同肽活性治疗剂但不含与之结合的ELPs的相应组合物相比，能使所给予的肽活性治疗剂的溶解度、生物利用度或生物不可利用度(bio-unavailability)和半寿期的提高得以实现。
背景技术
为所有目的，将2005年2月8日授权的、Ashutosh Chilkoti名下的题为“FUSION PEPTIDES ISOLATABLE BY PHASETRANSITION”(可通过相转变分离的融合肽)”的美国专利第6,852,834号和2005年2月8日提交的Ashutosh Chilkoti名下的题为“FUSIONPEPTIDES ISOLATABLE BY PHASE TRANSITION”(可通过相转变分离的融合肽)”的美国专利申请第11/053,100号的公开内容各自通过引用整体结合到本文中。
上述Chilkoti的专利和专利申请公开了包含ELP肽的遗传上可编码的环境响应性融合蛋白。这种融合蛋白显示出独特的物理化学特性和功能特性，这些特性可随溶液环境变化来进行调节。
发明内容
本发明主要涉及包含弹性蛋白样肽和肽活性治疗剂的融合蛋白治疗组合物。
在本发明的FP治疗组合物中，有至少一个肽活性治疗剂与一个或多个ELPs偶联(coupled)，例如在其N末端或C末端共价键合，以实现肽活性治疗剂的功效的增强，这一增强是相对于相应的单独治疗剂而言。肽活性治疗剂-ELP构建物功效的增强表现在多个特性的任何一个，如所给予的肽活性治疗剂的溶解度、生物利用度、生物不可利用度、治疗剂量、对蛋白水解的抗性、半寿期等。
在另一个方面，本发明涉及包含与表达控制元件如适当类型的启动子可操作地连接(operably linked)的异源核苷酸序列的融合基因构建物，其中异源核苷酸序列编码包含与至少一个ELP偶联的至少一种肽活性治疗剂的融合蛋白。
在又一个方面，本发明涉及增强肽活性治疗剂的功效的方法。所述方法包括将肽活性治疗剂与至少一个ELP偶联以形成FP治疗组合物，其中这种FP治疗组合物中的肽活性治疗剂相对于单独的肽活性治疗剂来说具有增强的功效。在一个方面，增强的功效是体内功效。
本发明的另一个方面涉及治疗需要肽活性治疗剂的受试者的方法，所述方法包括给予该患者包含以下的治疗组合物：(i)与至少一个ELP偶联的肽活性治疗剂，或(ii)编码包含肽活性治疗剂和至少一个ELP的融合蛋白的核苷酸序列，这个序列可操作地连接到其表达控制元件。
在还另一个方面，本发明涉及其中治疗剂与ELP缀合(conjugate)的治疗剂剂型。
由下续的公开内容和所附的权利要求书，可更加清楚地了解本发明各个其他的方面、特征和实施方案。
附图说明
图1是SDS-PAGE凝胶图，显示了使用实施例1的表达和纯化方法进行的37个氨基酸的肽的表达情况。
图例：M＝分子量标记；S＝超声处理后的裂解物；
P＝离心所得的沉淀(转变前)；L＝可溶性裂解物；
Tn＝第n次转变所得的沉淀
图2是曲线图，证实了实施例1的方法所得的肽的纯化。
图3是SDS-PAGE凝胶图，显示了实施例6所述的BFP、CAT和K1-3的ITC纯化的结果。
图4A和4B是曲线图，显示了实施例8的每个融合构建物在PBS缓冲液中作为温度函数的浊度的增加。
图5是曲线图，说明了实施例9所述的14C标记ELP的血液浓度与时间的变化关系。
图6是柱图，显示了实施例10所述的14C标记ELP1-150和ELP2-160在裸鼠中的生物分布。
图7是柱图，显示了实施例10所述的14C标记ELP2-[V1A8G7-160]在裸鼠中的生物分布。
具体实施方式
本发明提供掺入了包含弹性蛋白样肽和肽活性治疗剂的融合蛋白的治疗组合物。
本发明的治疗组合物与含有相同肽活性治疗剂但不含与之结合的ELPs的相应组合物相比，能使所给予的肽活性治疗剂的功效的提高得以实现，所述功效的提高例如溶解度、生物利用度、生物不可利用度(在需要避免出现蓄积和/或毒性如心脏毒性的情况下)、半寿期等的改进。
为在后续的说明中便于查考，以下给出在其中出现的具体术语的定义。
术语“蛋白(质)”在本文中以一般性含义使用，包括任何长度的多肽。
本文所用的术语“肽”要作广义解释，包括分子量最高达约10,000的多肽本身，以及分子量超过约10,000的蛋白质，其中分子量是数均分子量。在一个具体的方面，具有约2至约100个氨基酸残基的肽特别优选作为本发明的肽活性治疗剂。
本文所用的术语“偶联”意指各指定部分(specified moieties)相互间直接发生共价键合，或者它们相互间通过一个或多个间插部分(intervening moiety)例如桥(bridge)、间隔序列(spacer)或键(linkage)部分间接发生共价连接，或者它们相互间通过例如氢键键合、离子键合、范德华力等发生非共价偶联。
本文所用的术语“半寿期”意指活性剂的生物活性出现50％减低所需的时间。这个术语要与“持续期”和“清除率”区别开来，持续期是活性剂在身体内的总持续时间，清除率是一个动态变化的变量，可与半寿期和持续期的数值有关联或没有关联。
词语“转化”在本文中作广义使用，指通过任何本领域公知的方法(包括例如来自细胞或病毒颗粒的多核苷酸序列的直接传导及通过感染性病毒颗粒的传导)将外源多核苷酸序列导入到原核生物或真核生物细胞中，导致无限增殖化或非无限增值化细胞系的基因型的永久或暂时改变。
术语“功能等同物”在本文中用来指作为天然蛋白质的活性类似物、衍生物、片段、截短同种型等的蛋白质。某多肽当它保持了相应天然多肽的一些或全部生物活性时是有活性的。
本文所用的本发明制剂的“药物可接受”成分(如盐、载体、赋形剂或稀释剂)是这样的成分，它(1)与制剂的其他成分相容，表现在它能与本发明的FPs结合在一起又不会消除FPs的生物活性；和(2)适合在动物(包括人)中使用而不会产生过度的不利副作用(如毒性、刺激和过敏反应)。副作用在药物组合物的风险大于它们所提供的好处时是“过度”的。药物可接受成分的实例包括但不限于任何标准的药物载体如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、微乳液和各种类型的湿润剂。
本文所用的涉及蛋白质的术语“天然”表示该蛋白质具有自然界中所存在的相应蛋白质的氨基酸序列。
本文所用的术语“间隔序列”指任何可插入在给定的ELP/肽活性治疗剂构建物中的ELP和肽活性治疗剂之间的部分。例如，间隔序列可以是在一个末端与ELP共价键合、在另一个末端与肽活性治疗剂共价键合的二价基团。因此，ELP/肽活性治疗剂构建物能纳入任何另外的不会妨碍ELP/肽活性治疗剂构建物用于其预定用途的功效的化学结构。间隔序列例如可以是提供来控制ELP/肽活性治疗剂构建物的药代动力学的蛋白酶敏感性间隔序列部分，或者它可以是蛋白酶不敏感性ELP/肽活性治疗剂构建物。
本发明的融合蛋白(FP)治疗组合物包含与至少一个肽活性治疗剂偶联的至少一个弹性蛋白样肽(ELP)。组合物的ELP成分和肽活性治疗剂成分可以以任何合适的方式互相偶联，包括共价键合、离子键合、缔合键合(associative bonding)、复合或者任何其他的能有效地使ELP成分和肽活性治疗剂成分聚集在一起的偶联方式，使得肽活性治疗剂对其预定用途是有效的，并使得偶联的ELP的存在能在一些功能上的、治疗上的或生理上的方面对组合物中的肽活性治疗剂进行增强，以使它比单独的肽活性治疗剂更加有效。
因此，FP治疗组合物中的ELP偶联肽活性治疗剂可在任何其他的特性方面得到增强，例如它的生物利用度、生物不可利用度、治疗剂量、制剂相容性、对蛋白水解或其他降解方式的抗性、溶解度、给予后在身体内的半寿期或持续期的其他量度方式、给予后从身体的清除率等。
在本发明的FP治疗组合物中，有至少一个肽活性治疗剂与一个或多个ELPs偶联，例如在其N末端或C末端共价键合，以实现肽活性治疗剂的功效的增强，这一增强是相对于相应的单独治疗剂而言。
本发明的FP治疗组合物可直接进行治疗给予，或者在体内从相应的融合基因构建物产生，所述融合基因构建物包含与表达控制元件如适当类型的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列的融合基因构建物，其中异源核苷酸序列编码包含与至少一个ELP偶联的至少一种肽活性治疗剂的融合蛋白。
本发明例如通过将肽活性治疗剂与至少一个ELP偶联形成FP治疗组合物，来使肽活性治疗剂的功效得到增强，其中这种FP治疗组合物中的肽活性治疗剂相对于单独的肽活性治疗剂而言具有增强的功效。
本发明可用任何合适的包含与至少一个ELP偶联的至少一种肽活性治疗剂的治疗剂型来实施。
本发明通过将肽活性治疗剂与至少一个ELP偶联形成FP治疗组合物，来使肽活性治疗剂能对蛋白水解降解保持稳定。
本发明的FP治疗组合物可包含一个或多个ELP种类和一种或多种肽活性治疗剂。如上所述，各个ELP种类和肽活性治疗剂可直接相互偶联，或者这种偶联可通过构建物中包含间插在ELP和肽活性治疗剂之间的间隔序列部分来实现。
本发明的FP治疗组合物中所用的ELP种类可以是任何合适的类型。ELPs是已被发现存在于弹性蛋白中的重复肽序列。这些重复肽序列包括聚四肽、聚五肽、聚六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽。
ELPs会发生可逆的反温度转变(inverse temperature transition)。在低于转变温度(Tt)下它们在水中是结构上无序的和高度可溶的，但当温度升高到Tt以上时会显示急剧的(2-3℃范围)从无序到有序的相转变(phase transition)，导致多肽的去溶剂化和聚集。ELP聚集体当达到足够的大小时，可容易地通过离心从溶液中移取和分离。这种相转变是可逆的，分离的ELP聚合物当在温度恢复到ELPs的Tt以下时可完全重溶于缓冲溶液中。
在本发明的实施中，ELPs种类起到稳定或以别的方式改进治疗组合物中的肽活性治疗剂的作用。在将偶联的肽活性治疗剂-ELP构建物给予需要肽治疗剂的患者之后，肽活性治疗剂和ELP保持互相偶联，同时肽活性治疗剂具有治疗活性，例如具有治疗或预防疾病状态或生理状况的活性或者具有其他治疗干预活性。
例如，本发明的治疗组合物中的ELPs可包含这样的ELPs，它们由包括但不限于以下的各种特征性四肽、五肽、六肽、七肽、八肽和九肽的多聚或寡聚重复单元(repeats)所形成：
(a)四肽Val-Pro-Gly-Gly，或者VPGG(SEQ ID NO：1)；
(b)四肽Ile-Pro-Gly-Gly，或者IPGG(SEQ ID NO：2)；
(c)五肽Val-Pro-Gly-X-Gly(SEQ ID NO：3)，或者VPGXG，其中X为任何天然或非天然氨基酸残基，且其中X任选在各个多聚或寡聚重复单元之间不相同；
(d)五肽Ala-Val-Gly-Val-Pro，或者AVGVP(SEQ ID NO：4)；
(e)五肽Ile-Pro-Gly-Val-Gly，或者IPGVG(SEQ ID NO：5)；
(f)五肽Leu-Pro-Gly-Val-Gly，或者LPGVG(SEQ ID NO：6)；
(g)六肽Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，或者VAPGVG(SEQ ID NO：7)；
(h)八肽Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly，或者GVGVPGVG(SEQ IDNO：8)；
(i)九肽Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly，或者VPGFGVGAG(SEQ ID NO：9)；和
j)九肽Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly，或者VPGVGVPGG(SEQ ID NO：10)。
其他大小和构造的任何其他多聚或寡聚重复单元，也可有效地应用于本发明的广泛实施中。
在一个实施方案中，肽活性治疗剂-ELP构建物的中的ELP包括五肽Val-Pro-Gly-X-Gly的重复单元，其中X如上定义，且其中Val-Pro-Gly-X-Gly五肽单元与ELP的其他氨基酸残基的比例大于约75％，更优选大于约85％，还更优选大于约95％。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可用合成法(例如重组法)产生。
在肽活性治疗剂-ELP构建物中，ELP可在肽活性治疗剂的C末端和/或N末端连接，且任选可有间隔序列存在，将ELP与肽活性治疗剂隔开。
在一个方面，本发明构思了包含编码肽活性治疗剂-ELP融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，所述融合蛋白任选包含如上所述的将ELP与肽活性治疗剂隔开的间隔序列。该多核苷酸可作为表达载体的成分提供。本发明还构思了被这种表达载体转化以表达融合蛋白的宿主细胞(原核细胞或真核细胞)。
肽活性治疗剂-ELP构建物在合成或表达后，可通过涉及产生相转变的方法来进行分离，相转变例如是通过提高温度或通过其他方式来进行，从而造成在介质(medium)中以非分离形式存在的融合蛋白的相转变。
例如，肽活性治疗剂-ELP构建物可通过如下步骤来合成和回收：构建包含编码能显示相转变的肽活性治疗剂-ELP融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，在培养物中表达融合蛋白，和使培养物的含有融合蛋白的材料进行包括分离(例如通过离心、膜分离等进行分离)和反转变循环(inverse transition cycling，ITC)的处理以回收肽活性治疗剂-ELP融合蛋白。
在一个具体的实施方案中，肽活性治疗剂-ELP融合蛋白包括这样的ELP部分，它包含选自VPGG、IPGG、AVGVP、IPGVG、LPGVG、VAPGVG、GVGVPGVG、VPGFGVGAG和VPGVGVPGG的多肽的多聚或寡聚重复单元。
在另一个具体的实施方案中，肽活性治疗剂-ELP融合蛋白包括这样的ELP部分，它包含选自LPGXG(SEQ ID NO：11)、IPGXG(SEQID NO：12)和它们的组合的多聚或寡聚重复单元，其中X为不会妨碍ELP融合蛋白的相转变的氨基酸残基。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物包含能给构建物赋予相转变特征的氨基酸序列。
肽活性治疗剂-ELP构建物中的ELP可包含β-转角成分。适合用作β-转角成分的多肽的实例在Urry等人的国际专利申请PCT/US96/05186中有描述。或者，肽活性治疗剂-ELP中的ELP可以是缺乏β-转角成分或另外具有不同的构象和/或折叠特性的成分。
如所述，ELPs可包括各种四肽、五肽、六肽、七肽、八肽和九肽的多聚或寡聚重复单元，这些肽包括但不限于VPGG、IPGG、VPGXG、AVGVP、IPGVG、LPGVG、VAPGVG、GVGVPGVG、VPGFGVGAG和VPGVGVPGG(SEQ NO：1至SEQ NO：10)。本领域技术人员会认识到，ELPs并不需要仅由以上所列的多聚或寡聚序列组成，以显示相转变或另外构成适用于本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的ELPs种类。
在一个实施方案中，肽活性治疗剂-ELP构建物包括这样的ELPs，它是五肽VPGXG(SEQ ID NO：3)的多聚或寡聚重复单元，其中客体残基(guest residue)X为任何不会消除ELP的相转变特征的氨基酸。X可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。例如，X可选自以下：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一个具体的实施方案中，X不是脯氨酸。
X可以是非传统氨基酸。非传统氨基酸的实例包括：普通氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计氨基酸(designer amino acid)如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和全体氨基酸类似物。
在每次ELP重复中，X的身份的选择是独立的。选择可基于任何所需的特征，如考虑到X位置中的带正电荷残基或带负电荷残基。可以认为，在X位置中具有中性值(neutral value)的ELPs可具有较长的半寿期。
在另一个实施方案中，肽活性治疗剂-ELP构建物包括这样的ELPs，它是五肽IPGXG(SEQ ID NO：11)或LPGXG(SEQ ID NO：12)的多聚或寡聚重复单元，其中X如上所定义。
ELP序列的多聚或寡聚重复单元可被一个或多个不会消除肽活性治疗剂-ELP构建物的总体相转变特征的氨基酸残基隔开。在一个具体的实施方案中，当肽活性治疗剂-ELP构建物的ELP成分包含五肽VPGXG的多聚或寡聚重复单元时，VPGXG重复单元与ELP的其他氨基酸残基的比例大于约75％，更优选大于约85％，还更优选大于约95％，最优选大于约99％。
在每个重复单元中，X为独立进行选择。所产生的不同的ELPs种类在本文中用代号ELPk[XiYj-n]来区别，其中k表示ELP重复单元的具体类型，括号中的大写字母是单字母氨基酸代码，它们相应的下标表示每个客体残基X在重复单元中的相对比例，n以五肽重复单元的数目描述ELP的总长度。例如，ELP1[V5A2G3-10]表示含有10个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X为缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸，它们相对比例为5∶2∶3；ELP1[K1V2F1-4]表示含有4个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，它们相对比例为1∶2∶1；ELP1[K1V7F1-9]表示含有9个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，它们相对比例为1∶7∶1；ELP1[V-5]表示含有5个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸；ELP1[V-20]表示含有20个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸；ELP2[5]表示含有5个五肽AVGVP重复单元的多肽；ELP3[V-5]表示含有5个五肽IPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸；ELP4[V-5]表示含有5个五肽LPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸。
Urry及其同事之前进行的研究证实，弹性蛋白五肽序列VPGXG中的第四个残基(X)可进行改变而又不消除β-转角的形成。这些研究还证实Tt是客体残基的疏水性的函数。通过改变客体残基的身份和它们的摩尔分数，可合成出在0-100℃范围内显示反转变的ELPs。
在给定ELP长度下，可通过在ELP序列中掺入较大比例的疏水客体残基来降低Tt。合适的疏水客体残基的实例包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。也可使用中等疏水的酪氨酸。相反，可通过掺入选自以下的残基来提高Tt：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺，优选丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸。
在一个实施方案中，选择ELP以提供在如下范围内的Tt：约10至约80℃，更优选约35至约60℃，最优选约38至约45℃。
Tt还可通过改变ELP链长度来改变。Tt随着分子量的下降而提高。对于分子量大于100,000的多肽，优选用Urry等人(PCT/US96/05186)开发的疏水性尺度来预测特定ELP序列的大约Tt。
对于分子量小于100,000的多肽，优选用以下二次函数来确定Tt：Tt＝M0+M1X+M2X2
其中X为FP的分子量，且M0＝116.21；M1＝-1.7499；M2＝0.010349。
ELP的Tt和因此ELP与肽活性治疗剂连接所成的构建物的Tt，受到客体残基X的身份和疏水性的影响，构建物的另外的特性也可能受到影响。这种特性包括但不限于ELP本身和构建物的溶解度、生物利用度或生物不可利用度和半寿期。
在下文的实施例部分可知道，ELP偶联的肽活性治疗剂与游离蛋白质形式的这种治疗剂相比，保持了大部分的治疗剂生物活性。另外，还证实ELPs显示长的半寿期。因此，可按照本发明将ELPs用来缀合治疗剂而极大地增加它的半寿期(相比于游离(未缀合)形式的治疗剂的半寿期，例如在具体的实施方案中增加10％、20％、30％、50％、100％、200％以上)。此外，还证实ELPs当进行体内给予时能靶向高血液含量的器官，因此可在身体中进行分配，以提供治疗剂在身体各个不同器官或区域当中的预定所需身体分布，或者提供治疗剂的所需选择性或靶向性。总之，本发明所构思的活性ELP-治疗剂缀合物，是作为具有长半寿期的位点特异性活性组合物来给予或在体内产生。
在本发明的一个实施方案中，ELP长度为5至约500个氨基酸残基，更优选约10至约450个氨基酸残基，还更优选约15至约150个氨基酸残基。可通过在ELP序列中掺入较大比例的疏水客体残基，来减少ELP长度而同时又保持目标Tt。
肽活性治疗剂-ELP构建物中的活性治疗剂可以是任何合适的类型。合适的肽包括在医学、农业及其他科学和工业领域中有意义的肽，特别包括治疗性蛋白质如促红细胞生成素、爪蟾抗菌肽、β-防御素、干扰素、胰岛素、单克隆抗体、血液因子、集落刺激因子、生长激素、白细胞介素、生长因子、治疗性疫苗、降钙素、肿瘤坏死因子(TNF)、受体拮抗剂、皮质类固醇和酶类。这种肽的具体实例包括但不限于用于替代疗法的酶类；抗细菌肽；用于促进生长的激素和用于各种应用的活性蛋白质物质。具体的实例包括但不限于超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶(glutamase)、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chromotrypsin)、木瓜蛋白酶(papin)、胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-I)、somatosin、生长激素(somatropin)、生长调节素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素(erthyropoietin)、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽和血管升压素。
在本发明的一个实施方案中，肽活性治疗剂是硫氧还蛋白。
在另一个实施方案中，肽活性治疗剂是淀粉酶抑肽。淀粉酶抑肽-ELP融合蛋白提供了作为α-淀粉酶抑制剂例如用于治疗胰腺炎的淀粉酶抑肽的容易分离的活性形式(version)。这个融合蛋白适于作为药物制剂的成分提供，它在药物制剂中与药物可接受载体相结合。淀粉酶抑肽-ELP融合蛋白保持了游离淀粉酶抑肽的大部分α-淀粉酶抑制活性，是稳定的构建物。
在一个具体的实施方案中，肽活性治疗剂包括选自以下的生理活性肽：胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、促生长素抑制素、促生长素、生长调节素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、血管升压素、非天然的阿片样物质(opiods)、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。
本发明因此涵盖各种用于(体内)治疗应用的组合物，其中肽活性治疗剂-ELP构建物的肽成分是生理活性肽或生物活性肽。在这种含肽组合物的优选形式中，肽成分与ELP种类的偶联是通过直接共价键合或间接(通过适当的间隔基团)键合来实现的，肽部分和ELP部分可相互间以任何合适的涉及这种直接或间接共价键合的方式进行结构上的安排。因此，在本发明的广泛实施中有很多种肽可适用，在给定的治疗应用中可按要求或按需要选用。
用作本发明肽活性治疗剂-ELP构建物中的肽活性治疗剂的肽，在一个实施方案中包括用于替代疗法的酶类和用于促进生长的激素。这种酶类包括超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶(glutamase)、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。在肽激素当中，适用于本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的具体种类包括但不限于胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、somatosin、生长激素、生长调节素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽和血管升压素。
在另一个具体的方面，ELPs/肽活性治疗剂构建物中的肽活性治疗剂选自以下种类和它们所有的变体、片段和衍生物：刺鼠蛋白相关肽(agouti related peptide)、支链淀粉、血管紧张素、天蚕杀菌肽、铃蟾肽、胃泌素(包括胃泌素释放肽)、乳铁蛋白、抗微生物肽(包括但不限于爪蟾抗菌肽)、尿扩张素(urodilatin)、核定位信号(NLS)、胶原肽、存活蛋白、淀粉样肽(包括β-淀粉样肽)、利尿钠肽、肽YY、神经退行性肽和神经肽(包括但不限于神经肽Y)、强啡肽、内啡素、内皮素、脑啡肽、毒蜥外泌肽、纤连蛋白、神经肽W和神经肽S、肽T、黑皮质素、淀粉样蛋白前体蛋白、片层形成阻断肽(sheet breaker peptide)、CART肽、淀粉样蛋白抑制肽、朊病毒抑制肽、氯毒素、促肾上腺皮质激素释放因子、催产素、血管升压素、缩胆囊素、分泌素、胸腺素、表皮生长因子(EGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、胰抑制素、黑素细胞刺激激素、骨钙蛋白、缓激肽、肾上腺髓质素、perinerin、metastatin、抑肽酶(aprotinin)、甘丙肽(包括甘丙肽样肽)、瘦蛋白、防御素(包括但不限于α-防御素和β-防御素)、salusin和各种毒液(包括但不限于芋螺毒素、抗栓肽、kurtoxin、anenomae毒液和鸟蛛毒液)、利尿钠肽(包括脑利尿钠肽(B-型利尿钠肽或BNP)、心房利尿钠肽和血管钠肽)、神经激肽A、神经激肽B、神经调节肽、神经降压肽、食欲肽、胰多肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、催乳素释放肽、蛋白脂质蛋白质(PLP)、促生长素抑制素、TNF-α、Grehlin、蛋白质C(Xigris)、SSl(dsFv)-PE38和假单胞菌外毒素蛋白、凝血因子(包括抗凝血酶III和凝血因子VIIA、因子VIII、因子IX)、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、β-葡糖脑苷脂酶和α-D-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-1，4-葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖-2-硫酸酯酶、脱氧核糖核酸酶I、人激活蛋白、卵泡刺激激素、绒毛膜促性腺激素、促黄体生成激素、生长激素、骨形态发生蛋白、奈西立肽、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、角化细胞生长因子、人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白细胞介素(包括IL-I、IL-IRa、IL-2、11-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-11、IL-12)、糖蛋白IIB/IIIA、免疫球蛋白(包括乙型肝炎球蛋白、γ-球蛋白、venoglobulin)、水蛭素、抑肽酶、抗凝血酶III、α-1-蛋白酶抑制剂、非格司亭和依那西普。
在另一个实施方案中，本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物的肽成分可以是涉及免疫疗法或其他治疗干预的抗体或抗原。
还将如下的各种其他的蛋白质和肽与不同的ELP多肽进行融合以形成能显示反相转变行为的FPs：胰岛素A肽、T20肽、干扰素α2B肽、烟草蚀纹病毒蛋白酶、小异型二聚体伴侣孤儿受体、雄激素受体配体结合结构域、糖皮质类固醇受体配体结合结构域、雌激素受体配体结合结构域、G蛋白αQ、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽、G蛋白αS、血管生长抑素(K1-3)、蓝色荧光蛋白(BFP)、钙调蛋白(CalM)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)、萤光素酶、组织转谷氨酰胺酶(tTg)、吗啡调节神经肽(MMN)、神经肽Y(NPY)、食欲肽-B、瘦蛋白、ACTH、降钙素、肾上腺髓质素(AM)、甲状旁腺激素(PTH)、防御素和生长激素。
作为活性治疗剂应用的各种蛋白质和肽，可在它们的一级结构、二级结构、三级结构、大小、分子量、溶解度、电荷分布、粘度和生物功能上有很大的不同。
包含FPs的衍生物也包括在本发明的范围内，这些衍生物是在FPs合成过程中或合成后例如通过以下方法进行差异修饰得到的：苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、PEG化、通过已知的保护基团/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的键合等。在一个实施方案中，FPs在N末端进行乙酰化和/或在C末端进行酰胺化。在另一个实施方案中，将FPs与聚合物缀合，所述聚合物例如本领域公知能促进多肽的口服递药、降低多肽的酶促降解、增加多肽的溶解度或者以别的方式改进治疗性多肽的化学特性以便给予人或其他动物的聚合物。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可通过公知的重组表达技术获得。为重组产生肽活性治疗剂-ELP构建物，将编码该构建物的核酸序列操作性地连接到合适的启动子序列，使得编码这种融合肽的核酸序列会在宿主细胞中被转录和/或翻译成所需的融合肽。优选的启动子是可用于在大肠杆菌中表达的启动子，如T7启动子。
可以使用任何常用的表达系统，例如真核生物系统或原核生物系统。具体的实例包括酵母、毕赤酵母属、杆状病毒、哺乳动物和细菌系统，如大肠杆菌和柄杆菌属(Caulobacter)。
可将包含核酸序列的载体导入细胞中以表达肽活性治疗剂-ELP构建物。载体可以保持游离型，或者可整合到染色体中，只要它所携带的基因能被转录产生所需的RNA。载体可用标准的重组DNA技术方法来构建。载体可以是质粒、噬菌体、黏粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、病毒，或者本领域公知的用以在原核细胞或真核细胞中进行复制和表达的任何其他类型载体。本领域技术人员会认识到，有多种本领域公知的成分可包括在这种载体中，它们包括多种转录信号，如启动子和其他能调节RNA聚合酶向启动子上的结合的序列。任何已知在要表达载体的细胞中有效的启动子，都可用来引发肽活性治疗剂-ELP构建物的表达。合适的启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。合适的启动子的实例包括SV40早期启动子区、包含在Rous肉瘤病毒的3′长末端重复序列中的启动子、HSV-1(单纯疱疹病毒-1)胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调节序列等，以及以下能显示组织特异性和已被应用在转基因动物中的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区；在睾丸、乳腺、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区；在肝脏中有活性的清蛋白基因控制区；在肝脏中有活性的α-胎蛋白基因控制区；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区；在类红细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区；在大脑的少突神经胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。
在一个实施方案中，对哺乳动物进行遗传修饰以在其乳汁中产生肽活性治疗剂-ELP构建物。进行这种遗传修饰的技术在2000年1月11日授权的美国专利6,013,857(标题：“Transgenic Bovines and Milkfrom Transgenic Bovines(转基因牛和转基因牛产生的牛奶)”)中有描述。将转基因动物的基因组进行修饰以包含这样的转基因，它包含与乳腺启动子可操作地连接的编码肽活性治疗剂-ELP构建物的DNA序列。该DNA序列的表达导致在乳汁中产生肽活性治疗剂-ELP构建物。肽活性治疗剂-ELP构建物然后可通过相转变从获自转基因哺乳动物的乳汁中分离得到。转基因哺乳动物优选是牛。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可用相转变循环程序使之与其他污染性蛋白质分离开来而获得高纯度，操作方法是利用肽活性治疗剂-ELP构建物的温度依赖性溶解度，或者将盐加到含有该构建物的介质中。可使用连续的反相转变循环来获得高度纯度。
除了温度和离子强度外，其他可用于调节肽活性治疗剂-ELP构建物的反转变的环境变量包括pH、无机和有机溶质和溶剂的加入、侧链离子化或化学修饰及压力。
在本发明一个具体的示例性实施方案中，构建了10聚五肽ELP(ELP10聚体)。该ELP10聚体可进行寡聚化或多聚化达18倍，以产生出具有精确指定分子质量的一文库的(a library of)ELPs(10-、20-、30-、60-、90-、120-、150-和180聚体)。然后可将ELP聚合物或寡聚物融合到肽活性治疗剂的C末端或N末端，以形成肽活性治疗剂-ELP构建物。可将第二肽活性治疗剂融合到该融合蛋白构建物的ELP成分，产生出三元融合体。任选地，可使用一个或多个间隔序列来将ELP成分与肽活性治疗剂隔开。
本发明因此提供了这样的肽活性治疗剂-ELP构建物，其中的肽活性治疗剂可以是多种内源分子的任何一种的天然或合成形式，或者是非天然的肽物质，或者任何前述肽的功能等同物。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物克服了肽活性治疗剂当进行胃肠外给予时的主要缺陷，即这种肽容易被血浆蛋白酶代谢掉。肽活性治疗剂的口服给予途径更成问题，因为除了胃中的蛋白水解外，胃的高酸性还会在这种肽活性治疗剂到达它们预定的靶标组织之前就把它们破坏掉。通过胃和胰腺酶类的作用所产生的肽和肽片段，被肠刷状缘膜中的外肽酶和内肽酶切割产生二肽和三肽，即使能避免胰酶类的蛋白水解，多肽还会受到刷状缘肽酶的降解。任何能通过胃部又幸存下来的肽活性治疗剂在胃黏膜中又受到代谢作用，黏膜有穿透屏障阻止它们进入细胞。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物克服了这种缺陷，提供了在生物利用度、生物不可利用度、治疗半寿期、降解抗性等方面具有增强的功效的组合物形式的肽活性治疗剂。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物因此使得可以采用口服和胃肠外剂型以及各种其他的可使肽活性治疗剂以高效的方式得到利用的剂型。例如，这种构建物使得可以使用能实现高度黏膜吸收的剂型，同时还可以用较低的剂量产生最佳的疗效。
ELP/肽活性治疗剂构建物还可包括间隔序列作为构建物的一个部分。间隔序列可以是任何合适的类型，可以是肽间隔序列，或者是非肽化学部分。
肽间隔序列可以被蛋白酶切割，或者不被蛋白酶切割。举例说，可切割的肽间隔序列包括但不限于被各种类型的蛋白酶所识别的肽序列，所述蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、纤溶酶(血液蛋白酶)、金属蛋白酶、组织蛋白酶(例如GFLG等)和在其他身体区室(corporealcompartment)中存在的蛋白酶。不可切割的间隔序列同样可以是任何合适的类型，包括例如式[(Gly)n-Ser]m所示的不可切割间隔序列部分，其中n为1-4，包括1和4；m为1-4，包括1和4。
另外，非肽化学间隔序列也可以是任何合适的类型，包括例如在Bioconjugate Techniques，Greg T.Hermanson，出版Academic Press，Inc.，1995中描述的功能接头(functional linker)和Cross-LinkingReagents Technical Handbook，获自Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Illinois)中指定的功能接头，两个参考文献通过引用结合到本文中。示例性的化学间隔序列包括能连接到Lys的胺基团的同双功能接头(homobifunctional linker)及能在一个末端连接Cys和在另一个末端连接Lys的异双功能接头(heterobifunctional linker)，还有其他能将蛋白质与抗体的Fc区连接的双功能接头，其中抗体中的糖首先被氧化成二醇或醛。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可应用于预防或治疗病症(condition)或疾病状态(disease state)。虽然这种构建物在本文中是针对在动物受试者上有用的肽活性治疗剂进行描述的，但本发明还构思了对植物系统的病症或疾病状态的预防或治疗有用的肽活性治疗剂-ELP构建物。举例说，在植物上有用的肽活性治疗剂-ELP构建物的肽成分可具有杀昆虫、除草、杀真菌和/或杀害虫功效。
本发明的又一个方面涉及这样的基因疗法，它采用本发明的融合基因治疗组合物和相关联的任何合适类型的载体，例如AAV、牛痘、痘病毒、HSV、反转录病毒、脂质转染、RNA转移等。
在治疗使用中，本发明构思了治疗已遭受或潜在易遭受这种病症或疾病状态且需要这种治疗的动物受试者的方法，所述方法包括将对所述病症或疾病状态有疗效的有效量的本发明肽活性治疗剂-ELP构建物给予该动物。
要用本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物治疗的动物受试者包括人和非人动物(例如鸟、狗、猫、牛、马)受试者，优选哺乳动物受试者，最优选人受试者。
可将本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物以任何合适的治疗上有效和安全的剂量给予动物受试者，这视所要治疗的具体病症或疾病状态而定，这个剂量可由本领域技术人员根据本文的公开内容无需过多的实验就容易确定出。
一般来说，为实现疗效肽活性治疗剂-ELP构建物中的肽活性治疗剂的合适剂量可例如为1微克(μg)至100毫克(mg)每公斤接受者体重每天，优选10微克(μg)至50毫克(mg)每公斤体重每天，最优选10微克(μg)至50毫克(mg)每公斤接受者体重每天。所需的剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量来给出，在一天中的适当间隔时间给予。这些分剂量可以以单位剂量形式给予，每个单位剂量形式例如含有10μg-1000mg、优选50μg-500mg、更优选50μg-250mg活性成分。或者，如果接受者的病况需要的话，可以以连续输注的形式给予剂量。
给予方式和剂型当然会影响到对特定治疗应用所要求的和有效的肽活性治疗剂治疗量。
[00100]例如，对于同一肽活性治疗剂，口服给予的剂量可以是胃肠外给予方法所用的剂量水平的至少两倍，例如2-10倍。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可以原样给予，也可以以其药物可接受酯、盐和其他生理上功能衍生物的形式给予。
本发明还构思了包含本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的兽医用和人医疗用药物制剂。
在这种药物制剂中，肽活性治疗剂-ELP构建物可以与它的一种或多种药物可接受载体和任选与任何其他的治疗成分一起使用。载体必须在与制剂的其他成分相容和不会对其接受者过度有害的意义上来说是药物可接受的。肽活性治疗剂-ELP构建物是以能有效实现如上所述的所需药理学作用的量和以适于实现达到所需的日剂量的数量来提供。
肽活性治疗剂-ELP构建物的制剂既包括适于胃肠外给予的制剂，也包括适于非胃肠外给予的制剂，具体的给予方式包括口服、直肠内、口腔、局部、鼻内、眼内、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管内、淋巴、阴道和子宫内给予。优选适合口服给予和胃肠外给予的制剂。
当肽活性治疗剂-ELP构建物在包括液体溶液的制剂中使用时，该制剂可方便地进行口服给予或胃肠外给予。当肽活性治疗剂-ELP构建物在液体混悬剂制剂中使用或者作为散剂在生物相容性载体制剂中使用时，该制剂可以方便地进行口服给予、直肠内给予或支气管内给予。
当肽活性治疗剂-ELP构建物以粉末固体的形式直接使用时，活性剂可方便地进行口服给予。或者，它可进行支气管内给予，这是这样进行：将粉末在载气中雾化以形式粉末的气体分散体，患者从包括合适的喷雾装置的呼吸管路吸入该气体分散体。
包含本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的制剂可便利地以单位剂量形式呈现，且可通过药学领域公知的任何方法来制备。这种方法通常包括将肽活性治疗剂-ELP构建物与构成一种或多种辅助成分的载体结合在一起的步骤。通常，制剂是这样制备的：将肽活性治疗剂-ELP构建物与液体载体、微细固体载体或这两种载体均匀地和紧密地结合在一起，然后如有需要，将产品成形为所需制剂的剂型。
适合口服给予的本发明制剂可作为不连续单元(discrete unit)呈现，如胶囊剂、扁囊剂(cachet)、片剂或锭剂，每个不连续单元含有预定量的粉末或颗粒形式的活性成分；或者作为在含水液体或非水液体中的混悬剂呈现，如糖浆剂、酏剂、乳剂或饮剂(draught)
片剂可通过压制或模制来制备，任选加有一种或多种辅助成分。压制片剂可通过在合适的机器中进行压制来制备，其中肽活性治疗剂-ELP构建物为自由流动形式，如粉末或颗粒，任选与粘合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或脱模剂(discharging agent)混合。包含粉末状肽活性治疗剂-ELP构建物和合适载体的混合物的模制片剂，可通过在合适的机器中进行模制来制备。
糖浆剂可通过将肽活性治疗剂-ELP构建物加到糖(例如蔗糖)的浓缩水溶液中来制备，在该水溶液中还可加入任何辅助成分。这种辅助成分可包括矫味剂、合适的防腐剂、防止糖结晶的物质和增加任何其他成分的溶解度的物质如多元醇(例如甘油或山梨糖醇)。
适合胃肠外给予的制剂便利地包含肽活性治疗剂-ELP构建物的无菌含水制品(preparation)，该制品优选与接受者的血液等渗(例如生理盐水溶液)。这种制剂可包含悬浮剂和增稠剂或者其他设计来将肽活性治疗剂靶向血液成分或者一个或多个器官的微颗粒系统。这些制剂可以以单位剂量形式或多剂量形式呈现。
鼻腔喷雾剂包含纯化的肽活性治疗剂-ELP构建物水溶液与防腐剂和等渗剂。优选将这种制剂调节到与鼻腔黏膜相容的pH和等渗状态。
供直肠内给予的制剂可作为与合适载体如可可脂、氢化脂肪或氢化脂肪羧酸所成的栓剂呈现。
眼用制剂的制备方法类似于鼻腔喷雾剂，例外的是优选对pH和等渗因素加以调整以与眼睛相匹配。
局部用制剂包含溶于或悬浮于一种或多种介质，如矿物油、石油、多元醇或其他用于局部用药物制剂的基料的肽活性治疗剂-ELP构建物。
除了上述成分外，本发明的制剂还可包含一种或多种选自以下的辅助成分：稀释剂、缓冲剂、矫味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。
以下非限制性实施例更加充分地说明本发明的特征和优点。
实施例
以下示例性地给出一些涉及到融合蛋白的实验对本发明的特征作更加充分的说明，这些融合蛋白含有与各种不同的ELP序列融合的各种不同的重组蛋白质，如硫氧还蛋白、淀粉酶抑肽、胰岛素、T20蛋白、干扰素、烟草蚀纹病毒蛋白酶、小异型二聚体伴侣孤儿受体、雄激素受体配体结合结构域、糖皮质类固醇受体配体结合结构域、雌激素受体配体结合结构域、G蛋白、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽、血管生长抑素(K1-3)、蓝色荧光蛋白(BFP)、钙调蛋白(CalM)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)、萤光素酶、组织转谷氨酰胺酶(tTg)、吗啡调节神经肽(MMN)、神经肽Y(NPY)、食欲肽-B、瘦蛋白、ACTH、降钙素、肾上腺髓质素(AM)、甲状旁腺激素(PTH)、防御素和生长激素。
实施例1：
蛋白质和长肽的产生和纯化
在所给出的案例研究中，使含有ELP-(TEV)-肽/蛋白质构建物的大肠杆菌菌株BL21star(Invitrogen)在补加有抗生素的培养基中37℃生长24小时，不作诱导。收获培养物，重悬在50mM Tris-HCL pH8.0和1mM EDTA中。细胞通过在冰上超声破碎进行裂解。细胞碎片通过在20,000g下4℃离心30分钟进行去除。通过在25℃下向裂解物中加入NaCl至最终浓度1.5M，然后在25℃下20,000g离心15分钟，诱导反温度转变。所得的沉淀含有ELP-(TEV)-肽/蛋白质融合体和非特异性NaCl沉淀蛋白质。将沉淀重悬于40ml用冰预冷的缓冲液中，20,000g，4℃下离心15分钟，以除去非特异性的不溶性蛋白质。将温度转变循环再反复进行三次，以提高ELP-TEV融合蛋白的纯度和将最终体积减少到小于5ml。
肽/蛋白质与ELP的分离是通过加入ELP-TEV蛋白酶并在25℃下温育18小时来实现。在0.5M NaCl存在下用最终温度转变，然后在室温下10,000g离心，以进一步将被切割的肽/蛋白质从ELP和ELP-TEV蛋白酶纯化出来。经NaCl转变的ELP、ELP-TEV蛋白酶和不被切割的ELP-肽/蛋白质存在于不可溶部分，而肽/蛋白质则保留在可溶部分中。进行HPLC和液相色谱质谱(LC-MS)分析，以检验TEV切割的ELP-(TEV)-肽/蛋白质的准确性和肽/蛋白质的最终纯度。用通过ExPASy tools ProtParam计算得到的消光系数，分光光度法测定ELP-(TEV)-肽/蛋白质、ELP和纯化的肽/蛋白质的浓度。(19th AnnualAmerican Peptide Symposium，2005年6月；展板展示)。
37氨基酸肽的产生
用以上(deltaPhaseTM)系统表达和纯化37氨基酸肽。表达的ELP-肽融合体通过几轮转变来纯化。纯化的融合体与TEV蛋白酶温育以将肽切割。在单独的实验中将TEV蛋白酶制备成ELP融合体，这使得TEV蛋白酶在温育后随同被切割的ELP一起从溶液中分离出来。结果在图1中显示，其中M是分子量标记，S是超声处理后的裂解物，P是离心所得的沉淀(转变前)，L是可溶性裂解物，Tn是第n次转变所得的沉淀。
图2显示分子量和纯度的LC-MS验证结果，由图可见所得的肽纯度大于90％，同时有微量的脱酰胺所产生的杂质。
一系列肽变体的快速产生
然后测定对于一系列的肽可能实现的通量和纯度。表1所示的结果证明在一系列的肽中能够产生一致的结果。之前，化学合成的局限使肽的产生限制在每3-6星期产生一个肽，这限制了进行肽优化的速度。使用如上所述的deltaPhaseTM系统，可在不到两星期时间里产生出以下六个肽。由于这个系统能够进行平行运行，其实本应能够容易地使通量在几个星期内增加到数百个。
表1：一系列肽变体的产率和纯度。
实施例2：
含有硫氧还蛋白和/或淀粉酶抑肽的融合蛋白
硫氧还蛋白和淀粉酶抑肽代表了蛋白质表达的两种极限情形(limiting scenario)：(1)肽活性治疗剂高水平过量表达且高度可溶(硫氧还蛋白)，和(2)肽活性治疗剂主要作为不溶性包涵体表达(淀粉酶抑肽)。
硫氧还蛋白-ELP融合蛋白与游离ELP相比显示出Tt仅稍有升高(1-2℃)，而淀粉酶抑肽融合体则显示出Tt剧烈下降15℃。这个转变对于三元(硫氧还蛋白-ELP-淀粉酶抑肽)构建物和二元(ELP-淀粉酶抑肽)构建物是相同的，这表明Tt转变特异性地与淀粉酶抑肽有关。这些观察结果与如下结论一致：Tt的降低是由ELP链和淀粉酶抑肽中的暴露于溶剂的疏水区域之间的相互作用所致，而对于高度可溶的硫氧还蛋白，这些疏水相互作用可忽略不计。此外，对于高度可溶的蛋白质，在与ELP标签融合后，仅会造成与游离ELP相比Tt稍有波动。
为了说明基本的概念，合成了编码ELP序列的基因并将其连接到两个融合蛋白构建物中。在第一个构建物中，ELP序列融合到大肠杆菌硫氧还蛋白的C末端，硫氧还蛋白是109个残基的蛋白质，常用作载体来增加目标重组蛋白质的溶解度。在第二个更为复杂的构建物中，淀粉酶抑肽(含77个残基，是α-淀粉酶的蛋白抑制剂)与硫氧还蛋白-ELP融合体的C末端融合，形成三元融合体。
Urry及其同事之前的研究已证实，有两个ELP特异性变量，即客体残基组成(即VPGXG单体中的X的身份和摩尔分数)和ELP的链长，会显著影响转变温度，从而使得肽活性治疗剂-ELP构建物可通过Tt来表征。
合成了编码这样的ELP序列(SEQ ID NO：13)的基因，该ELP序列客体残基缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸比例为5∶2∶3，预测的水中Tt为约40℃。将该编码10个VPGXG五肽重复单元(10聚体)的合成基因进行寡聚化最高达18次，以产生出一文库的编码具有从3.9到70.5kDa的精确指定分子量(MW)的ELPs的基因。硫氧还蛋白作为与10-、20、30-、60-、90-、120-、150-和180聚体ELP序列的N末端融合体被表达，而淀粉酶抑肽作为与硫氧还蛋白/90聚体ELP的C末端融合体被表达。
这些融合蛋白在大肠杆菌中表达，并通过使用融合蛋白中存在的(组氨酸)6标签进行固定化金属亲和层析(IMAC)，或者通过进行反转变循环(ITC)(下文有描述)，来从细胞裂解物中纯化出来。纯化的融合蛋白用凝血酶切割，以从ELP释放出目标蛋白。然后通过进行另一轮的ITC使ELP与目标蛋白分离，从而获得纯的目标蛋白。对于每个构建物，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化的融合蛋白、目标蛋白和ELP进行表征，该SDS-PAGE证实了蛋白质的纯度、验证了凝血酶切割是否完全，证明了每个蛋白质的迁移与其预测大小一致(结果未显示)。
这样形成的融合蛋白，其反转变可用分光光度法进行表征，即通过监测溶液浊度随着温度的变化来进行表征，该溶液浊度变化是由该含ELP的融合蛋白在经历转变过程中发生的聚集所致。温度在升高到临界温度前，溶液保持澄清。温度再升高，就导致在约2℃范围里浊度急剧升高至最大值(OD350～2.0)。Tt定义为在分光光度法观察到的转变的中点时的温度，是描述这个过程的方便参数。
研究了游离ELP、硫氧还蛋白-ELP融合体、ELP-淀粉酶抑肽融合体和三元硫氧还蛋白-ELP-淀粉酶抑肽融合体在PBS中的反转变。游离ELP的Tt为51℃，硫氧还蛋白融合体则为54℃，这表明与硫氧还蛋白融合时，Tt只稍受影响。从三元的淀粉酶抑肽融合体切割产生的硫氧还蛋白-ELP，其Tt比直接产生的硫氧还蛋白-ELP要高(60℃对54℃)，这大概是因为紧邻ELP序列的前导氨基酸序列和尾随氨基酸序列的差异所致。ELP-淀粉酶抑肽和硫氧还蛋白-ELP-淀粉酶抑肽的转变谱图(transition profile)几乎相同，Tt为34℃。融合蛋白的聚集是可逆的，将温度降低到Tt以下后聚集体完全再溶解。但是，ELP-淀粉酶抑肽融合体和硫氧还蛋白-ELP-淀粉酶抑肽融合体的再溶解动力学较慢，通常需要5-10分钟，而游离ELP和硫氧还蛋白-ELP则仅需几秒钟。硫氧还蛋白和淀粉酶抑肽对照品不显示吸光度随温度升高的变化，这表明融合蛋白所观察到的热诱导聚集是由于ELP载体的反转变所致。通常，融合蛋白的反转变还比游离ELP的稍宽，在它们的浊度谱图(turbidity profile)中观察到小的上肩和下肩峰(shoulder)。
在Urry及其同事的研究中观察到随着ELP链长的增加Tt下降，同时还研究了ELP分子量对融合蛋白的反转变的影响。测定了一组硫氧还蛋白融合蛋白随ELP载体的分子量(从12.6到71.0kDa)变化的Tt。较高分子量的融合蛋白的Tt接近40℃的设计目标温度(对于71kDa ELP为42℃)，而较低分子量的融合蛋白的Tt显著高得多(例如对于12.6kDa ELP为77℃)。
除了影响Tt的ELP特异性变量(即客体残基组成和分子量)外，对于给定ELP，还可通过几个外在因素，如溶剂的选择、ELP浓度和离子强度，对Tt作进一步的调整。尤其是控制离子强度能使Tt得以在50℃范围内进行调整，因此为特定应用提供优化给定ELP的Tt的便利方法。操纵溶液温度和离子强度也为诱导特定ELP的反转变提供了实验灵活性，可以有以下几个做法：(1)在给定离子强度下提高溶液温度，使其高于Tt；(2)在等温条件下增加离子强度，使Tt降低到溶液温度以下；或者(3)同时改变溶液温度和离子强度。
由胰岛素还原测定法测出的硫氧还蛋白/60聚体融合蛋白的比活性，与市售的大肠杆菌硫氧还蛋白相同(结果未显示)，这表明在Tt以下，ELP对硫氧还蛋白活性没有影响。对于三元的硫氧还蛋白-ELP-淀粉酶抑肽融合体，α-淀粉酶抑制测定显示，硫氧还蛋白/90聚体ELP载体使淀粉酶抑肽的α-淀粉酶抑制活性降低2倍(结果未显示)。但是，在进行凝血酶切割和将淀粉酶抑肽从硫氧还蛋白-ELP载体纯化出来后，纯化的淀粉酶抑肽的活性与独立通过IMAC纯化的重组淀粉酶抑肽没有区别。
应用ITC来进行蛋白质纯化，要求ELP的相转变不会使目标蛋白变性。因此，对硫氧还蛋白/60聚体ELP融合体在1.5M NaCl进行热循环时的聚集、再溶解和功能活性进行监测。向缓冲液中加入1.5M NaCl仅仅是为了降低Tt(从水中的62℃到27℃)，使得融合蛋白在24-35℃的实验便利温度之间进行的每个热循环中都会发生反转变。在开始热循环之前，24℃的溶液温度低于硫氧还蛋白融合蛋白的Tt，蛋白质溶液没有显示可检测的浊度。在这个温度下初始测定融合蛋白的硫氧还蛋白活性，以建立一个基线值。温度提高到35℃时，融合蛋白发生聚集，导致浊度升高(OD350～2.0)。将温度降低到24℃后，溶液完全变澄清，这表明融合蛋白已发生再溶解。移取等分试样，测定硫氧还蛋白活性，发现与初始值相同。将这个热循环过程重复进行两次。每个热循环后，在24℃没有观察到活性的变化，这证实小范围的温度变化和所产生的聚集/再溶解对蛋白质稳定性和功能没有影响。另外，在将温度降低到24℃后，聚集的融合蛋白的再溶解和回收是定量的和完全的。
通过ITC从细胞裂解物中纯化了六个硫氧还蛋白融合蛋白(其中每个融合蛋白含有C末端30-、60-、90-、120-、150-或180聚体ELP标签)和硫氧还蛋白/90聚体ELP/淀粉酶抑肽融合蛋白，该ITC是通过在交替高于和低于转变温度的条件(即NaCl浓度和温度)下进行反复离心来实现。
在进行纯化之前，通过离心从培养基收获被诱导的大肠杆菌，在低盐缓冲液(通常是PBS)中再溶解，通过超声破碎进行裂解。高速离心除去不溶物后，向裂解物加入聚乙烯亚胺使DNA沉淀，产生可溶裂解物。然后加入NaCl和/或提高溶液温度引发ITC，以诱导融合蛋白的反转变，造成溶液因为融合蛋白的聚集而变混浊。通过在高于Tt的温度下离心使聚集的融合蛋白与溶液分离，在离心管的底部形成半透明沉淀。倾析出含有污染性大肠杆菌蛋白质的上清液并弃去。将沉淀在低于ELP的Tt的温度下重溶于低离子强度缓冲液中，并在低温下离心以除去任何剩余的不溶物。尽管另外进行了几轮的ITC，但在一轮ITC后污染性蛋白质的水平就低于SDS-PAGE的检测限。
对硫氧还蛋白在硫氧还蛋白/ELP融合蛋白纯化的每个阶段的比活性进行研究，并通过BCA测定法估测总蛋白质，结果表明可溶性裂解物中(1)的总蛋白质有大约20％在第一轮的反转变纯化(3)中沉淀下来，余下的可溶性蛋白质被倾析和弃去(2)。上清液中测量到的低硫氧还蛋白活性(其中一部分由天然大肠杆菌硫氧还蛋白贡献)证实，上清液部分主要含有污染性宿主蛋白质。再溶解的蛋白质的硫氧还蛋白比活性接近市售的硫氧还蛋白(数据未显示)，这证实一轮的ITC就导致完全纯化。第二轮的纯化不会导致硫氧还蛋白比活性有可检测的增加(数据未显示)。在几轮的反转变纯化后的总硫氧还蛋白活性，没法用实验证明与细胞裂解物的总硫氧还蛋白活性有区别，这表明目标蛋白在弃去的上清液中的损失可忽略不计。这些结果定量地证实了硫氧还蛋白融合蛋白的高纯度和有效回收，此外还证明在进行了几轮的ITC后硫氧还蛋白的功能活性仍完全保持。
硫氧还蛋白融合构建物的蛋白质产率通常高于50毫克纯化融合蛋白/升培养物。发现随着ELP长度的增加，融合蛋白的总重量产率(gravimetric yield)下降，其中对于30聚体(MW＝12.6kDa)平均为约70mg/L，对于180聚体(MW＝71.0kDa)平均为约50mg/L。三元的硫氧还蛋白-ELP-淀粉酶抑肽融合体(45mg/L三元融合体或7mg/L淀粉酶抑肽)与硫氧还蛋白-淀粉酶抑肽融合体(10mg/L硫氧还蛋白-淀粉酶抑肽融合体，4mg/L淀粉酶抑肽)相比，可溶性淀粉酶抑肽的水平稍高。
如上所述，表达了两种与环境响应性ELP序列融合的重组蛋白即硫氧还蛋白和淀粉酶抑肽，并利用ELP序列的反转变实现了这些融合蛋白与其他可溶性大肠杆菌蛋白质的温和、一步骤的分离。选择硫氧还蛋白和淀粉酶抑肽作为目标蛋白是因为它们代表了可溶性蛋白质表达的两种极限情形：(1)目标蛋白高水平过量表达且高度可溶(硫氧还蛋白)，和(2)目标蛋白主要作为不溶性包涵体表达(淀粉酶抑肽)。但是，后一类代表性蛋白质必须显示一定水平的作为可溶性蛋白质的表达以通过ITC进行纯化。
硫氧还蛋白在大肠杆菌中作为可溶性蛋白质高水平表达，因此它是确定ELP标签的可逆的可溶-不可溶反转变是否会在融合蛋白中得到保持的良好候选蛋白质。相反，选择淀粉酶抑肽作为另一试验蛋白质，因为它主要作为包涵体中的不溶性蛋白质表达。虽然与硫氧还蛋白形成融合蛋白能促进目标蛋白的可溶性表达，但过量表达的硫氧还蛋白-淀粉酶抑肽融合蛋白只有5-10％作为可溶性和功能活性蛋白质得到回收。
用于目标重组蛋白的热诱导相分离的ELP多肽标签，衍自哺乳动物弹性蛋白中存在的多肽重复单元。由于ELPs的相转变是通过ITC进行的蛋白质纯化的基础，转变温度的明确是ELP标签的设计中的主要目标。
Urry及其同事之前的研究已证实，聚五肽序列VPGXG中的第四个残基(X)可进行改变而又不会消除β-转角这种有利于反转变的结构的形成。这些研究还证实，Tt随客体残基的疏水性而变。因此，通过改变客体残基的身份和它们的摩尔分数，可合成出能在0-100℃范围内显示反转变的ELP共聚物。基于这些结果，选择氨基酸序列，形成在水中约40℃的预测Tt，使得ELP载体会在培养过程中在大肠杆菌中保持可溶，但在细胞裂解后会因温度的小小升高而发生聚集。
除了氨基酸序列外，还知道Tt还会随ELP链长而变。因此，设计工作还包括通过基因寡聚化策略对分子量进行精确控制，使得可合成出一文库的分子量有系统地改变的ELPs。较高分子量的ELPs的Tt接近目标温度，其中实验观察到对于硫氧还蛋白/180聚体融合体(25μM，于PBS中)，Tt为42℃。但是，随着分子量的下降，Tt急剧提高。在低离子强度的缓冲液中，较低分子量的ELPs的Tt对于蛋白质纯化而言太高，因此会需要高浓度的NaCl来使Tt降低到有用的温度。ELP链长对于蛋白质产率而言也是重要的。除了观察到随着ELP分子量的增加所表达的融合蛋白的总产率下降外，随着ELP载体的分子量的增加，目标蛋白与ELP的重量百分比也下降。因此，纯化用的ELP标签的设计，优选是通过使ELP分子量最小化来使目标蛋白表达最大化，同时通过在ELP序列中掺入较大比例的疏水性客体残基来保持目标Tt接近40℃。
上述的硫氧还蛋白-ELP融合体与游离ELP相比仅显示Tt有小小的增加(1-2℃)，而淀粉酶抑肽-ELP融合体则显示Tt剧烈下降15℃。这个转变对于三元(硫氧还蛋白-ELP-淀粉酶抑肽)构建物和二元(ELP-淀粉酶抑肽)构建物是相同的，这表明Tt转变特异性地与淀粉酶抑肽有关。这些观察结果提示，Tt的降低是由ELP链和淀粉酶抑肽中的暴露于溶剂的疏水区域之间的相互作用所致，而对于高度可溶的硫氧还蛋白，这些疏水相互作用可忽略不计。尽管这一Tt转变给用于含大比例暴露疏水区域的蛋白质的反转变纯化的ELP载体的设计增添了复杂性，但对于高度可溶的蛋白质，在与ELP标签融合后，仅会造成Tt与游离ELP相比稍有波动。
用标准的分子生物学方案进行ELP标签的基因合成和寡聚化。10聚体聚五肽VPGXG ELP的合成基因是从四种5′-磷酸化的经PAGE纯化的合成寡核苷酸(Integrated DNA Technologies，Inc.)构建，这些寡核苷酸大小为86-97个碱基。使这些寡核苷酸退火形成跨ELP基因的、带EcoRI和HindIII相容末端(compatible end)的双链DNA。然后用T4DNA连接酶将退火的寡核苷酸连接到EcoRI/HindIII线性化和脱磷酸化的pUC-19(NEB，Inc.)中。用该连接混合物转化化学感受态大肠杆菌细胞(XLl-Blue)，然后将细胞在含有氨苄青霉素的琼脂平板上温育。菌落最初通过蓝-白筛选法进行筛选，随后通过菌落PCR进行筛选，以验证插入物的存在。推定的插入物的DNA序列通过染料终止子DNA测序(ABI370DNA测序仪)进行验证。
首先通过将10聚体ELP基因连接到含有相同10聚体ELP基因的载体中，产生20聚体ELP基因。类似地，将该20聚体基因与原始10聚体基因进行组合，形成30聚体基因。重复这一组合过程，以产生出一文库的编码从10聚体到180聚体聚五肽的ELPs的基因。对于典型的聚合或寡聚化，将载体用PflMI线性化并进行酶促脱磷酸化。将插入物用PflMI和BgII双重消化，通过琼脂糖凝胶电泳(Qiaex II GelExtraction Kit，Qiagen Inc.)纯化，用T4DNA连接酶连接到线性化的载体中，然后转化到化学感受态大肠杆菌细胞中。转化子通过菌落PCR进行筛选，并进一步通过DNA测序进行证实。
对于硫氧还蛋白融合蛋白，将pET-32b表达载体(Novagen Inc.)进行修饰以在硫氧还蛋白基因的下游包括SfiI限制位点和转录终止密码子。对于三元的淀粉酶抑肽融合体，将之前构建的基于pET-32a的含有硫氧还蛋白-淀粉酶抑肽融合体基因的质粒进行修饰，以在凝血酶识别位点上游或下游的两个备选位置(alternate location)中含有SfiI限制位点。然后将用PflMI和BglI消化产生的ELP基因区段连接到每个经修饰表达载体的SfiI位点中。通过菌落PCR和DNA测序验证克隆情况。
将表达载体转化到表达菌株BLR(DE3)(对于硫氧还蛋白融合体)或BL21-trxB(DE3)(对于淀粉酶抑肽融合体)(Novagen，Inc.)中。用转化细胞接种摇瓶中补加有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基，在摇动(250rpm)下37℃温育，在OD600为0.8时通过加入异丙基α-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)至1mM的最终浓度进行诱导。将培养物再温育3小时，4℃下离心收获，重溶于低离子强度的缓冲液(约1/30培养物体积)中，通过4℃超声破碎进行裂解。将裂解物在约20,000x g下4℃离心15分钟，以除去不溶物。加入聚乙烯亚胺(0.5％最终浓度)使核酸沉淀，然后在约20,000x g下4℃离心15分钟。然后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，对细胞裂解物的可溶部分和不可溶部分进行表征。
含有(His)6标签的硫氧还蛋白-ELP融合体，通过用能螯合镍的氨基三乙酸衍生化树脂(Novagen Inc.)进行固定化金属离子亲和层析(IMAC)来纯化，或者通过ITC来纯化。淀粉酶抑肽-ELP融合体唯有通过ITC来纯化。对于通过ITC进行的纯化，通过将细胞裂解物的温度升高到约45℃和/或通过加入NaCl至约2M的浓度，使得融合蛋白发生聚集。通过在10-15,000x g下35-45℃离心15分钟，使聚集的融合蛋白与溶液分离开来。将上清液倾析并弃去，含有融合蛋白的沉淀重溶于冷的低离子强度缓冲液中。然后将重溶解的沉淀在4℃下进行离心，以除去任何剩余的不溶物。
在装备有多室热电温度控制器的Cary300紫外光/可见光分光光度计上，在4-80℃范围对ELP融合体溶液的350nm吸光度进行监测。Tt是从350nm处吸光度由融合蛋白聚集所致变化的中点确定出，该融合蛋白的聚集是温度(以1.5℃min1的加热或冷却速度)的函数。
SDS-PAGE分析使用到带不连续缓冲体系的预制Mini-Protean10-20％梯度凝胶(BioRad Inc.)。融合蛋白的浓度用计算得到的消光系数通过分光光度法进行测定。总蛋白质浓度通过BAC测定法(Pierce)进行测定。硫氧还蛋白活性通过比色胰岛素还原测定法进行测定。淀粉酶抑肽活性通过比色α-淀粉酶抑制测定法(Sigma)进行测定。
还合成了ELP-GFP融合蛋白，其中ELP90聚体和180聚体融合到绿色荧光蛋白(GFP)或其变体蓝色荧光蛋白(BFP)的N末端或C末端。由对随温度变化的浊度的紫外可见光分光光度测量及温度依赖性荧光测量鉴定出，所有的融合多肽都显示可逆的反转变。利用GFP-ELP融合体和BFP-ELP融合体的反转变，通过ITC将这些融合蛋白纯化至均一，并通过SDS-PAGE和考马斯染色进行验证。
进一步使用标准的分子生物学方案，合成出ELP分子量减低的ELP基因并对其进行聚合/寡聚化(Ausubel等人)。在本实施例中采用了两种ELP序列的单体基因。
第一种单体ELP1[V5A2G3-10](SEQ ID NO：13)编码10个Val-Pro-Gly-Xaa-Gly重复单元，其中Xaa为Val、Ala和Gly，比例分别为5∶2∶3。第二种单体ELP1[V-5](SEQ ID NO：14)编码5个Val-Pro-Gly-Val-Gly五肽(即Xaa全部是Val)。ELP1[V-5]单体基因的编码序列为：
5′-GTGGGTGTTCCGGGCGTAGGTGTCCCAGGTGTGGGCGTACCGGGCGTTGGTGTTCCTG GTGTCGGCGTGCCGGGC-3′(SEQ IDNO：15)。从化学合成的5′-磷酸化的寡核苷酸(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA)装配出单体基因，连接到基于pUC19的克隆载体中。有关单体基因合成的详细描述在别处给出。
将ELP1[V5A2G3-10]和ELP1[V-5]这两种ELP序列的单体基因通过串联重复进行无缝寡聚化，以编码一文库的分子量递增的ELPs。有关使用称为“递归定向连接(recursive directional ligation)”的方法进行的基因寡聚化的详细描述在别处给出。简单地说，将ELP基因区段(起初是单体基因，在后面的各轮中是更大的多重单体)通过限制酶切消化从其载体切除下来，纯化后连接到含有同一或另一ELP基因区段的第二克隆载体中，从而将两个基因区段并置在一起。这个过程可反复进行，每一轮都使基因长度加倍。
不同的ELP构建物在本文中用代号ELPk[XiYj-n]来区别，其中k表示ELP重复单元的具体类型，括号中的大写字母是单字母氨基酸代码，它们相应的下标表示每个客体残基X在重复单元中的相对比例，n以五肽重复单元的数目描述ELP的总长度。本实施例重要的两个ELP构建物是ELP1[V5A2G3-90](35.9kDa)(SEQ ID NO：16)和ELP1[V-20](9.0kDa)(SEQ ID NO：17)。
为产生硫氧还蛋白融合蛋白，将编码ELP1[V5A2G3-90]和ELP1[V-20]的基因从它们各自的克隆载体切除下来，分别连接到pET-32b表达载体(Novagen，Madison，WI)中，该表达载体之前已进行过修饰以引入独特SfiI位点(位于硫氧还蛋白基因下游)、(His)6标签和凝血酶蛋白酶切割位点。将编码没有ELP标签的游离硫氧还蛋白(“硫氧还蛋白(His6)”)的经修饰pET32b载体，和两个各自编码融合蛋白(“硫氧还蛋白-ELP1[VsA2G3-90]”和“硫氧还蛋白-ELP1[V-20]”)的表达载体，转化到BLR(DE3)大肠杆菌菌株(Novagen)中。
为定量比较蛋白质表达水平和纯化产率，将三个构建物平行地分别进行表达和纯化。对于每个样品(硫氧还蛋白(His6)、硫氧还蛋白-ELP1[V-20]和硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]各四个样品)，将2ml起子培养物(CircleGrow培养基，Qbiogene，Carlsbad，CA，补加有100μg/ml氨苄青霉素)用取自刚划线的琼脂平板上的单菌落的挑取物进行接种，然后在300rpm摇动下37℃温育过夜。为从培养基除去β-内酰胺酶，之后通过离心(2000x g，4℃，15min)将细胞从500μl的成片(confluent)过夜培养物中沉淀出来，重悬于新鲜培养基中，洗涤，再次进行沉淀。细胞再次在新鲜培养基中重悬后，用来接种250ml烧瓶中的50ml表达培养物(CircleGrow培养基，具100μg/ml氨苄青霉素)。
将培养烧瓶在300rpm摇动下37℃温育。通过600nm光密度监测生长情况，在OD600＝1.0时通过加入异丙基β-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)至1mM的最终浓度诱导蛋白质表达。再培养3小时后，通过离心(2,000x g，4℃，15min)从40ml收获细胞，对于硫氧还蛋白(His6)，重悬于2ml的IMAC结合缓冲液(5mM咪唑，500mM NaCl，20mM Trix-HCl，pH7.9)中，对于硫氧还蛋白-ELP1[V-20]和硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]，重悬于PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.2mMNa2HPO4，1.4mM KH2PO4，pH7.3)中，在-20℃下冻藏以备纯化。在新鲜缓冲液中1∶10稀释后，以OD600测量收获时的细胞密度。在进行质粒分离(plasmid miniprep spin kit，Qiagen，Valencia，CA)后，通过紫外可见光分光光度测定法定量收获时的质粒DNA的量。
作为硫氧还蛋白-ELP融合蛋白的ITC纯化的对照，用标准的IMAC方案纯化游离硫氧还蛋白。简单地说，将解冻的细胞转移到冰冷的15ml离心管中，通过超声破碎(Fisher Scientific550SonicDismembrator，使用microtip)进行裂解。转移到1.5ml微量离心管后，将大肠杆菌裂解物离心(16,000x g，4℃，30min)除去不溶性细胞碎片。将1ml的可溶细胞裂解物通过重力流动装载到填充有1ml氨基三乙酸树脂床的柱子上，该树脂已装有5ml的50mM NiSO4。
用15ml的IMAC结合缓冲液洗涤柱子后，将硫氧还蛋白(His6)在补加有250mM咪唑的6ml IMAC结合缓冲液中洗脱。通过用3,500MWCO膜对低盐缓冲液(25mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.4)进行透析过夜，将咪唑从洗脱液中去除。IMAC纯化情况是用带不连续缓冲体系的预制10-20％梯度凝胶(BioRad Inc.，Hercules，CA)进行SDS-PAGE监测。
纯化的硫氧还蛋白(His6)的产率通过分光光度测定法进行测定，测定中使用到硫氧还蛋白的经修饰包括了C末端标签中存在的单一Trp残基的吸收的摩尔消光系数(对于硫氧还蛋白(His6)和所有硫氧还蛋白-ELP，不管ELP分子量如何，ε280＝19870M1Cm-1)。
在典型的ITC纯化中，将解冻的细胞转移到冰冷的15ml离心管，通过超声破碎(Fisher Scientific550Sonic Dismembrator，带microtip)进行裂解。将大肠杆菌裂解物转移到1.5ml微量离心管，然后4℃离心30分钟，除去不溶性细胞碎片。(ITC纯化过程中的所有离心步骤都是在Eppendorf5415C微量离心管中在16,000x g下进行)。
向倾析出的细胞裂解物上清液加入聚乙烯亚胺(至0.5％w/v)，使核酸沉淀出来，然后再在4℃下离心20分钟除去。保留上清液，通过增加NaCl浓度1.3M引发ELP相转变。在33℃下离心5分钟，使聚集的融合蛋白与溶液分离开来，导致在离心管底部有半透明沉淀形成。
将上清液倾析并弃去，含有融合蛋白的沉淀重溶于等体积的4℃PBS。在4℃下作最后一次离心15分钟，除去任何剩余的不溶物，保留含有纯化的融合蛋白的上清液。如上文对IMAC纯化所述，融合蛋白纯化的进程通过SDS-PAGE进行监测，蛋白质浓度通过分光光度测定法进行测定。
硫氧还蛋白是用凝血酶蛋白酶(Novagen)从其ELP融合伴侣释放下来，该酶是在位于硫氧还蛋白和ELP标签之间的识别位点切割融合蛋白。使用约10单位凝血酶/μmol融合蛋白，让凝血酶蛋白水解反应在PBS中室温下过夜进行，融合蛋白的浓度通常为约100μM。然后再作一轮ITC，使游离ELP与切割下来的硫氧还蛋白分离开来，这次保留的是含有产物硫氧还蛋白的上清液。
可通过用光度法测定随温度变化的溶液浊度，来对反转变进行监测，这是利用到这样一个事实，即温度升高到超过临界点，会导致ELP的聚集所引发的在大约2℃范围内浊度急剧增加到最大值(OD350大约2.0)。在最大浊度的50％时的温度Tb，是定量监测聚集过程的方便参数。
硫氧还蛋白-ELP融合蛋白的温度依赖性聚集行为，是通过测量随温度变化的350nm光密度来进行表征。将融合蛋白以大肠杆菌裂解物在蛋白纯化过程中通常所见的浓度(对于硫氧还蛋白-ELP1[V-20]为160μM，对于硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]为40μM)在装备有热电温度控制多室固定器(multicell holder)的Cary Bio-300紫外光/可见光分光光度计(Varian Instruments，Walnut Creek，CA)中，以1℃min-1的恒定速度进行加热或冷却。各实验是在PBS中进行，另外补加不同浓度的NaCl。ELP Tt定义为光密度达到350nm光密度最大值的5％时的温度。
用动态光散射(DLS)监测硫氧还蛋白-ELP融合蛋白随温度和NaCl浓度变化的颗粒大小分布。制备出反映上述浊度测量中所用的蛋白质和溶剂组成的样品，在4℃和16,000x g下离心10分钟，以除去气泡和不溶性杂质。在进行颗粒大小测量之前，将样品在低于Tt的温度下滤过20nm Whatman Anodisc滤器。
用装备有Peltier温控元件的DynaPro-LSR动态光散射仪(ProteinSolutions，Charlottesville，VA)收集自相关函数。使用Protein Solutions的Dynamics软件(版本5.26.37)，利用其对球形颗粒的规则化分析(regularization analysis)来进行分析。在溶液从20℃加热到60℃的过程中，在固定的温度间隔(1或2℃)收集光散射数据。在每个温度下数据是这样进行收集的：将细胞递增到目的温度，让样品温度平衡至少1分钟，收集10个测量值，每个收集时间为5秒钟。
每个硫氧还蛋白-ELP融合蛋白在溶液中的反转变，是通过监测随温度变化的350nm光密度来进行表征。由于在ITC纯化过程中常规使用不同的NaCl溶液来降低Tt或等温引发反转变，获取了40μM硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]和160μM硫氧还蛋白-ELP1[V-20]在PBS中和在补加1M、2M和3M NaCl的PBS中的浊度谱图。
对硫氧还蛋白-ELP融合蛋白的溶液评估了随温度变化的350nm光密度。浊度谱图是在以1℃min-1的速度加热下，对在PBS中和在补加1、2和3M NaCl的PBS中的硫氧还蛋白-ELP1[V-20](实线)和硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90](虚线)获取的。在四个PBS溶液的每一个中，硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]的浓度为40μM，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]的浓度为160μM，这与ITC纯化过程中可溶性细胞裂解物中的每个蛋白的典型浓度匹配。所有溶液随着被加热通过Tt都显示出浊度的快速升高，但在继续加热超出Tt的情况下，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]溶液最终变得没那么混浊，而硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]溶液始终保持混浊。硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]的所有溶液在冷却到Tt以下后完全变澄清。但是，ELP1[V-20]的溶液只有在不被加热到超过约55℃才能可逆地变澄清，这提示硫氧还蛋白融合蛋白的热变性是在这个温度以上出现的。
蛋白质浓度选为每种融合蛋白在大肠杆菌裂解物的可溶部分中获得的典型浓度，在ITC纯化过程中首先诱导ELP反转变的阶段。在补加1和2M NaCl的大肠杆菌可溶性细胞裂解物中直接获取的浊度谱图，与前面段落中描述的硫氧还蛋白融合蛋白测定到的相应浊度谱图不可区别。(不经常在大肠杆菌裂解物中获取浊度谱图，因为有大肠杆菌蛋白质热变性产生的浊度的潜在可能，这一浊度不能与ELP融合蛋白的聚集所产生的浊度区分开来)。还获取了每种融合蛋白在具1.3M盐的PBS中的浊度谱图，该条件与用于下述ITC纯化的条件匹配。
对其浓度在具1.3M NaCl的PBS中的裂解物蛋白质浓度下的硫氧还蛋白-ELP1[V-20](实线)和硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90](虚线)溶液，针对用于ITC纯化的溶液条件测定了加热和冷却浊度谱图，该条件对应于表达和纯化的定量比较所用的ITC条件。选择这些条件是为了使硫氧还蛋白-ELP1[V-20]溶液的最大浊度在33℃的离心温度下出现。溶液以1℃min-1的速度进行加热和冷却。所观察到的加热曲线和冷却曲线之间的微小途径差异，主要原因是在高于Tt的温度下，聚集体随时间推移的慢沉降，另一原因是随溶液冷却到Tt以下，与聚集动力学相比更慢的解聚动力学。
硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]的热诱导聚集行为与游离ELPs相似。对于所有四个盐浓度，随着硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]溶液的温度的升高，在达到ELP Tt之前溶液都保持澄清，到Tt时浊度急剧增加。在补加0、1、2和3M盐的PBS中，这分别在51、31、15和4℃出现。游离硫氧还蛋白对照溶液在这个温度范围内随着温度的升高不显示浊度的变化，这表明所观察到的热诱导聚集是因为ELP标签的反转变所致(结果未显示)。随着这些溶液被进一步加热到超过Tt，浊度水平保持基本恒定，仅因为聚集体随时间推移发生的沉降而稍有减少。在冷却到Tt以下后，聚集体发生重溶解，光密度回复到零，这表明ELP1[V5A2G3-90]融合蛋白的反转变是完全可逆的。虽然增加NaCl浓度能显著降低Tt，但盐对最大光密度、对浊度谱图的总体形状或对聚集现象的可逆性没有可测量的影响。
与此对比，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]的相转变行为比硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]融合蛋白和游离ELPs要复杂得多。虽然在Tt(在补加1、2和3M NaCl的PBS中分别为33、17和4℃)下浊度的初始快速升高与其他的ELP构建物相似，但每一种硫氧还蛋白-ELP1[V-20]溶液所观察到的最大浊度是随着盐浓度的提高而增加。此外，温度升高到超过Tt最终会导致浊度的显著下降。这个下降是可逆的；如果溶液在被加热到浊度出现下降的温度后进行冷却，浊度再次增加。由于这一变清现象随温度可逆变化，推断认为在Tt下的初始ELP聚集事件之后，随着温度的升高，出现第二个热动力学驱动的分子重排。
硫氧还蛋白-ELP1[V-20]浊度谱图的另一个独特特征是，在约55℃下开始出现浊度的第二次增加，这可能是因为硫氧还蛋白的不可逆热变性引起的聚集所致。被加热到低于55℃的样品在冷却到Tt以下后可逆地变澄清，而对于1M和1M以上的盐浓度来说，被加热到超过55℃的样品即使在冷却到Tt以下后也保持混浊(未显示)。这个现象似乎是硫氧还蛋白-ELP1[V-20]融合蛋白所独有，因为游离硫氧还蛋白的溶液和硫氧还蛋白与更大ELPs所成的融合蛋白的溶液对于高得多的温度是稳定的(结果未显示)。对于在PBS中的硫氧还蛋白-ELP1[V-20]，在60℃以下没有观察到反转变，但是加入盐后Tt下降，使得在补加1、2和3M NaCl的PBS溶液中，反转变在变性温度以下出现。
用DLS测量随温度变化的融合蛋白颗粒大小，以确定温度和盐对在PBS、PBS+1M NaCl和PBS+2M NaCl中的40μM硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]的颗粒大小分布(水合半径，Rh)的影响。PBS、PBS+1M NaCl和PBS+2M NaCl中的硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]颗粒的大小表明，在Tt下浊度的急剧增加是由水动力半径(Rh)为5.9±3.9nm的单体转化成Rh为180±62nm的聚集体所致。这些聚集体随着温度的升高而生长，直到在高于转变开始温度大约6℃时达到2.2±3.8μm的稳定Rh。虽然加入NaCl导致Tt下降，但单体和完全形成的聚集体的大小都没有受到盐浓度或温度(在紧接Tt的范围的外部)的显著影响，这提供了在反Tt以上时的稳态浊度的原理。大聚集体形成开始时的温度紧密匹配对相应溶液条件进行的浊度测量所测出的Tt。
对于每个所研究的盐浓度，还研究了归属于每种类型颗粒散射强度的相应定量分解。当两个或更多个相在给定的温度范围内共存时，这些数据显示相对颗粒群体的转变。应指出的是，归属于某特定群体的强度不与该群体的质量呈线性相关，且可能伴随反相转变出现的堆积密度变化，会使多种颗粒的相对质量的计算复杂化。若对温度如何影响ELPs和ELP融合蛋白的堆积密度没有更详细的认识，则不可能对归属于每一颗粒类型的质量作出合理估计。尽管有这些定量限制，但这些数据还是证实，在Tt下，归属于聚集体的散射光的量急剧增加，代价是单体减少。
数据还反映出偶然存在着与2μm聚集体共存的未鉴定小颗粒(表观Rh＝17±31nm，虽然非常不定)和极大聚集体(表观Rh＝74±55μm)。小颗粒不太可能是聚集体悬浮液的真正成分；相反，它的存在反应了正则化算法中的由自相关函数中的噪音产生的假象。小颗粒的非常不定的大小和在转变温度以上的温度下的不稳定存在，支持了将它归为分析假象。同样，由于从数据分析推测的极大聚集体其表观大小比DLS仪器所能辨别的要大得多，它也不太可能代表悬浮液中的真正种类。相反，归属于这一种类的散射可能是由更小颗粒组成的网络的协同慢速运动所致。
与硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]相反，更小的硫氧还蛋白-ELP1[V-20]融合蛋白显示出更为复杂的温度依赖性颗粒大小分布，这与其更为复杂的浊度谱图相一致。
研究了温度对ELP1[V-20]在PBS+1M NaCl和PBS+2M NaCl中的颗粒大小分布的影响。当温度升高到超出Tt时的浊度澄清与质量从大聚集体向新的更小颗粒(Rh＝12nm)的转变同时发生。
同样研究了盐和温度对颗粒Rh的分布和每种颗粒群体对160μM硫氧还蛋白-ELP1[V-20]在加入1M和2M NaCl的PBS中的散射强度的相应贡献的影响。对于加入1M盐的硫氧还蛋白-ELP1[V-20]，Rh为5.9±5.1nm的单体在30℃下被转化成Rh为140±79nm的聚集体，这对应于在Tt下的浊度快速升高之前的小肩峰。在30℃以上，聚集体随温度的提高而生长(直到40℃下的Rh＝1.5±0.98μm)，这与在33℃开始观察到的浊度的快速升高相一致。类似于大融合蛋白的聚集行为，在高于40℃的温度下，在加入1M NaCl的PBS中的硫氧还蛋白-ELP1[V-20]显示非常大的聚集体(表观Rh＝64±67μm)的存在，这个非常大的聚集体可能反映了更小颗粒组成的网络的协同慢速运动。
但是，与更大的融合蛋白不同的是，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]在40℃以上的温度下还显示出之前未观察到的小颗粒的持续存在。这个颗粒的Rh为12±4.9nm，大约为单体的两倍。然而相对于它的平均Rh，它的可变性(variability)仅为单体的一半。这个颗粒在40℃以上的大小、一致性和连续存在表明，它既不是由自相关函数中的噪音产生的分析假象，也不是再溶剂化的单体。该12nm颗粒似乎是以消耗在Tt以上原先存在的聚集体的质量为代价而形成的，这由当12nm颗粒存在时更大聚集体(Rh＝200±210nm)的大小和散射强度的下降证明。
当NaCl浓度增加到2M时观察到类似的12nm颗粒。在这个NaCl浓度下，由浊度测量测定出，Tt下降到17℃。这个温度范围在较低的温度下受到水蒸气在样品小容器(cuvette)上的凝结的限制。因此，在20℃和30℃之间，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]已转变成平均Rh为2.4±1.7μm的稳定聚集体。由于样品被加热超过约36℃，聚集体的Rh大小逐渐降低到230±170nm，出现12nm颗粒(Rh＝12±4.7nm)。可归属于12nm颗粒的散射光的百分数也逐渐增加，代价是更大聚集体的缩小。
硫氧还蛋白-ELP1[V-20]和硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]各自通过ITC从裂解的大肠杆菌培养物的可溶部分纯化，硫氧还蛋白(His6)通过IMAC作为没有ELP标签的对照被纯化。反转变通过加入1.3MNaCl来诱导，离心在33℃下进行。更小的ELP1[V-20]标签被成功地用于通过ITC将融合蛋白纯化至均一，产率和纯度类似于通过常规亲和层析方法纯化的游离硫氧还蛋白。
注意，ELP标签不被考马斯染色，因此只有融合蛋白的硫氧还蛋白部分在染色胶中可见。对可溶细胞裂解物中的硫氧还蛋白-ELP1[V-20]和硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]的表达水平的定性比较清楚表明，将ELP标签的大小从36kDa截短到9kDa大大增加了硫氧还蛋白的表达产率。此外，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]被表达至与游离硫氧还蛋白可定性比较的水平。SDS-PAGE分析还表明，对于任何靶标蛋白，没有对细胞裂解物的不溶性部分的可检测损失(结果未显示)。
对于ITC纯化，通过加入1.3M额外的NaCl和将溶液温度提高到～33℃以上，来引发ELP相转变。细胞裂解物因为硫氧还蛋白-ELP融合蛋白的聚集而变得混浊，该融合蛋白然后通过在～33℃下离心与溶液分离开来，在离心管底部形成半透明沉淀。SDS-PAGE表明，大多数污染性大肠杆菌蛋白质保留在被弃去的上清液中。将沉淀溶于～4℃下的PBS中，低温(～12℃)离心，以除去任何剩余的不溶物。保留含有纯化的硫氧还蛋白-ELP融合蛋白的上清液。最后，用凝血酶在位于硫氧还蛋白和ELP标签之间的被编码识别位点切割每个融合蛋白，然后再进行一轮ITC以从溶液除去ELP标签后，获得纯化的游离硫氧还蛋白。在这里，凝血酶随靶标硫氧还蛋白一起保留在上清液中(尽管它低于考马斯染色的检测限)，但是会发展出凝血酶-ELP融合体，这个融合体在切割后会随同游离ELP一起被去除。
这些SDS-PAGE结果清楚表明，硫氧还蛋白可通过ITC纯化至均一，用更短的9kDa ELP1[V-20]进行的考马斯染色确证这一点。但是，观察到两种ELP融合蛋白在这些条件下的纯化效率的差异，由SDS-PAGE定性确证这一点。硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]通过ITC从可溶细胞裂解物的回收是几乎完全的，而硫氧还蛋白-ELP1[V-20]有少量但却显著的一部分保留在弃去的上清液中。用ELP1[V-20]标签通过ITC获得的纯度水平，在定性上与游离硫氧还蛋白的IMAC纯化获得的纯度水平一样好或更好，不过用IMAC纯化时，靶标蛋白没有在柱流通物(flow-through)中的可检测损失。
使用紫外可见光分光光度测定法，定量了通过ITC或IMAC回收的每种蛋白的产率。虽然这些数据描述的是纯化后回收的蛋白的量，但SDS-PAGE结果提示这个量几乎等于可溶裂解物中的表达产率。为进行这个分析，对于三种蛋白构建物的每一个，将四个培养物在相同条件下平行生长。为了实验方便起见，这些数据是对50ml培养物获得的，并外推到产率/升培养物。对单独的1升培养物的纯化证实实际产率紧密匹配外推值(数据未显示)。
测定了硫氧还蛋白(His6)、硫氧还蛋白-ELP1[V-20]和硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]从50ml试验培养物的总产率，外推到毫克/升培养物(平均值±SD，n＝4)。还测定了ELP标签和硫氧还蛋白分别对产率的贡献(由它们各自占融合蛋白的质量分数计算出)，以作比较。在所有其他实验条件相同的情况下，将ELP标签从36kDa(硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90])减少到9kDa(硫氧还蛋白-ELP1[V-20])导致了靶标硫氧还蛋白产率增加近四倍。
数据表明，降低ELP标签的分子量能极大地增加硫氧还蛋白的产率。在大肠杆菌培养物的实验上相同的条件下，将ELP标签从硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]中的36kDa降低到硫氧还蛋白-ELP1[V-20]中的9kDa，增加了融合蛋白产率达70％(分别为82±12mg/L和137±21mg/L；P＜0.005，非配对t检验)。此外，由于截短ELP标签的大小降低了它在融合蛋白中的质量分数，靶标蛋白硫氧还蛋白(即如果在凝血酶切割位点从融合蛋白分离的话)占据了融合蛋白产率中的更大质量分数。因此，用较小的标签时硫氧还蛋白的产率大了365％(较大标签和较小标签分别为23±3.3mg/L和83±12mg/L；P＜0.0001)。用9kDa标签通过ITC获得的这个硫氧还蛋白产率，与不用ELP标签表达且用IMAC纯化的硫氧还蛋白获得的产率(93±13mg/L；P＞0.25)在统计学上不可区别。
这些结果确证了SDS-PAGE结果，因为硫氧还蛋白的相对产率与细胞裂解物中观察到的表达水平相关联。ELP标签的产率对于两种融合蛋白都是相同的(对于硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]为59±8.6mg/L，对于硫氧还蛋白-ELP1[V-20]为54±8.1mg/L；P＞0.4)。这合乎之前的观察结果：对于多肽的ELP1[V5A2G3-90]]家族当中24-72kDa的ELP分子量，硫氧还蛋白融合蛋白中的ELP标签的重量产率基本上恒定。
为证明纯化效率和ITC溶液条件之间的关系，用盐浓度和离心温度的不同组合，重复进行硫氧还蛋白-ELP1[V-20]融合蛋白的ITC纯化。
进行了NaCl浓度和离心温度对硫氧还蛋白-ELP[V-20]的ITC纯化的影响的SDS-PAGE分析(SL＝可溶细胞裂解物；S＝融合蛋白进行反转变和离心除去聚集的靶标蛋白后的上清液；和P＝在PBS中溶解后含有纯化的融合蛋白的重溶解沉淀)。记录每次纯化的摩尔NaCl浓度和离心温度。虽然在每个情况中都获得高水平的纯度，但适当的NaCl浓度和离心温度的选择对于获得完全的纯化效率是至关重要的。
当将含1M NaCl的PBS和49℃离心这两个条件组合用于进行ITC纯化时，大部分的靶标融合蛋白丢失在被弃去的上清液中。当使用含2M NaCl的PBS和33℃的离心温度时，超过一半的靶标蛋白被离心捕集到。最后，使用含3M NaCl的PBS和12℃的离心温度，绝大部分的靶标蛋白被成功纯化。尽管在这些实例的每一个中靶标蛋白都被纯化至均一，但这些结果表明盐浓度和温度的选择是影响ITC纯化的效率的重要因素。
本实例的目的是产生大小相对于之前的报道降低的ITC纯化用ELP标签，和表征这一降低对表达水平和对纯化效率的影响。在之前的研究中，基于ELP1[V5A2G3-10]单体序列开发出第一代的ELP纯化标签。将这个序列反复寡聚化，产生出一文库的编码分子量从4kDa(ELP1[V5A2G3-10])至71kDa(ELP1[V5A2G3-180])的ELPs的合成基因。这个具体的客体残基组成是根据Urry等人之前的研究来选择，具有这个组成的ELPs据预测对于在水中约100kDa的分子量来说显示约40℃的Tt。目标定在40℃Tt，使得融合蛋白在37℃下培养时会保持可溶，但可通过稍微提高盐浓度或溶液温度而凭借ELP相转变被诱导发生可逆聚集。
虽然较高分子量的构建物的Tt接近40℃(对于硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-180]，Tt＝42℃，MWELP＝71kDa，PBS中25μM)，硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3]融合蛋白的Tt随分子量的下降剧烈提高(对于硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-30]，Tt＝77℃，MWELP＝13kDa，在相同条件下)。较低分子量的ELPs的高Tt要求加入非常高浓度的NaCl(＞3M)来使它们的Tt降低到有用温度(例如20-40℃)，这排除了它们用于进行ITC纯化普遍用途，因为有靶标蛋白被盐诱导变性的潜在可能。虽然较大的ELP1[V5A2G3]多肽被成功用来纯化硫氧还蛋白和第二模型靶标蛋白淀粉酶抑肽，但观察到随着ELP1[V5A2G3]链长的增加，融合蛋白的产率显著降低。
这些观察结果推动了以上实验中对ELP表达标签的重设计，以减少ELP表达标签的大小，同时还降低其Tt，使得较低分子量的ELP标签会在更为适中的NaCl浓度下显示接近40℃的Tt。新近为本研究合成的这第二单体基因，编码其中第四客体残基全部是Val的五聚ELP序列(ELP1[V-5])。由于ELP1[V]中存在的Val比ELP1[V5A2G3]中存在的Ala和Gly更具疏水性，硫氧还蛋白-ELP1[V]融合蛋白据预测在比硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3]融合体在更小的ELP分子量下具有40℃的Tt。
由于在经验上观察到其在裂解物蛋白质浓度和适中(1M)NaCl条件下的Tt接近40℃，因此从一文库的ELP1[V-5]寡聚体选择ELP1[V-20]序列(ELP1[V-5]基因的四个串联重复)，以在ITC纯化标签作进一步表征。在本实例中，将硫氧还蛋白-ELP1[V-20]构建物(MWELP＝9kDa)与之前描述的硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]构建物(MWELP＝36kDa)进行比较，因为这两个融合蛋白在裂解物条件中对不同的NaCl浓度具有非常相似的T1。也就是说，它们是来自符合上述的ITC纯化标签所需Tt特征的两个文库的每一个的热类似物。
虽然之前的观察结果提示降低ELP的大小可能提高融合蛋白的总体表达水平，但是推理来看并不清楚降低的标签大小是否会不利影响ELP融合蛋白的ITC纯化。因此，除了ELP标签长度对靶标蛋白的表达水平的影响外，还研究了该长度对纯化效率(即回收程度)和对ITC纯化后的靶标蛋白纯度的影响。
SDS-PAGE和分光光度测定结果表明，将ELP分子量从36kDa降低到9kDa提高了融合蛋白的表达近四倍，且在任何用以诱导反转变的溶液条件(即NaCl浓度和温度)下没有不利影响最终蛋白质的纯度。用ELP[V-20]标签的表达水平与游离硫氧还蛋白相当，这表明ELP标签的进一步缩短预期不会增加硫氧还蛋白产率。
随着ELP标签长度的降低所观察到的硫氧还蛋白产率的增加，其一个可能的解释是对于给定的培养条件，不管ELP链长如何，细胞所能表达的ELP的质量是有限的。这得到结果以及得到用不同分子量的其他ELPs进行的观察的支持。这个限制很可能是由代谢因素造成，或许是由于不足的tRNA库和/或由于高度重复的ELP序列所致的氨基酸耗竭造成。如果ELP的质量产率是限制性因素，那么这提供了用ELP[V-20]标签时增加的硫氧还蛋白产率的理论基础。对于给定的ELP重量产率，降低ELP链长能增加融合蛋白的摩尔产率，从而增加靶标蛋白的摩尔产率。此外这还提示，增加ELP的重量产率，例如通过在培养过程中补加特定的ELP相关氨基酸来增加，这一做法提供了改进融合蛋白产率的另一潜在途径。
虽然靶标蛋白的产率用较短的ELP1[V-20]标签而增加，但这个好处需要更为复杂的转变行为才能获得。用这个标签获得的回收效率取决于ITC所用的溶液条件，在较大的ELP1[V5A2G3-90]标签的情况下，融合蛋白的回收在所有溶液条件下都是完全的(结果未显示)。因此，虽然截短的ELP1[V-20]标签能使硫氧还蛋白得以ITC纯化至均一，但纯化效率对选择来诱导反转变的具体条件敏感。
浊度和DLS数据提供了更小的ELP1[V-20]标签的纯化效率对溶液条件的敏感性的深入认识。硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]的溶液在所有高于Tt的温度下都保持混浊，而硫氧还蛋白-ELP1[V-20]的浊度谱图在Tt下的初始快速升高后，在高于Tt的温度下进一步加热时开始澄清。这一随着温度升高变澄清的现象，据我们所知之前在其他ELPs或ELP融合蛋白上是未曾观察到的。为研究这个复杂的聚集行为，用动态光散射测量随温度变化的融合蛋白颗粒大小，以确定两种融合蛋白的明显不同浊度谱图的结构基础。
随着温度的升高，硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]的单体经历突然的不连续相转变，形成在所有高于Tt的温度下都持续存在的聚集体，稳态Rh为～2μm。由于聚集体在Tt以上是稳定的，聚集的蛋白质能够在高于其Tt的任何温度下(或者在任何将Tt降低到溶液温度以下的NaCl浓度下)通过离心完全回收。
虽然硫氧还蛋白-ELP1[V-20]也显示出突然的相转变而形成聚集体，但这些聚集体并不是在其相转变以上的所有温度下都是稳定的。随着温度升高到超过Tt，Rh为约12nm的小聚集体以消耗更大聚集体的质量为代价得以形成，这些更大聚集体也随着温度的升高而显示大小降低。这提供了在硫氧还蛋白-ELP1[V-20]的Tt以上所观察到的浊度下降的结构性理论基础。在加热到Tt以上的温度时(对于具1MNaCl的PBS，在Tt以上约10℃开始，对于具2M NaCl的PBS，在Tt以上约15℃开始)，较大的散射中心被转化成散光不太有效的小颗粒。这些12nm颗粒以消耗较大聚集体为代价的形成，导致了融合蛋白通过离心从可溶裂解物的回收不完全。因此，当ELP1[V-20](以及潜在地其他的小ELP标签)用于融合蛋白的纯化时，对于完全蛋白回收来说必要的是，选定NaCl浓度以及与之互补的溶液温度，使得只有可容易通过离心分离的较大聚集体存在于悬浮液中。
只根据大小不能够预测12nm颗粒的精确结构。但是，颗粒可能是含有少量融合蛋白分子(或许大约40-60级别)的胶束样结构，这些分子发生聚集，使得溶剂化的硫氧还蛋白结构域包住颗粒核心中的坍缩的疏水ELP结构域。所观察到的颗粒的大小(Rh约12nm)会与这个结构一致，因为亲水性硫氧还蛋白“头部”直径约3nm，疏水性20个五聚ELP“尾巴”长度为约7nm。
这个胶束结构中所要求的硫氧还蛋白分子的接近性，还可解释在高于约55℃的温度下观察到的不可逆聚集。在这一低温度下的变性只在与ELP1[V-20]融合的硫氧还蛋白观察到，和只对1M及以上的NaCl浓度观察到。而且，只有这些条件观察到12nm颗粒。硫氧还蛋白在胶束的溶剂化亲水壳中的极高有效浓度——在硫氧还蛋白分子之间很少有ELP缓冲——与观察到的热稳定性的下降一致。
NaCl浓度和溶液温度的适当选择对于有效进行ITC是适当的。为实验方便起见选择了三个离心温度：微量离心管当放在4℃冷冻实验室橱柜时为12℃，当放在22℃实验室台面时为33℃，当放在37℃静力培养箱中时为49℃(所有样品温度都是在10分钟离心后通过热电偶直接测量)。NaCl浓度以1M增加量进行选择，以将Tt降低到每个离心温度以下的某个点。
对于前面两个实例，回收是不完全的，因为在离心温度和NaCl浓度的这些组合下，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]显示出两相行为，其中较大的聚集体与12nm颗粒共存。这些颗粒由于它们的质量小，在离心过程中保持悬浮，只有在较大聚集体相中所含的那部分融合蛋白被离心移取而回收在重溶解沉淀中。在49℃下，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]在具1M NaCl的PBS中的浊度谱图从其最大值显著下降，数据显示大部分的散射强度来自12nm颗粒。相应地，SDS-PAGE数据显示所存在的融合蛋白只有小部分在ITC纯化过程中被离心捕集。在33℃下在具2M NaCl的PBS中，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]的浊度尽管仍低于其最大值，但更接近其峰值，且数据表明归属于12nm颗粒的散射强度小得多。与这些观察结果一致的是，SDS-PAGE确证大多数的融合蛋白被ITC纯化所捕集，尽管因12nm颗粒所致的在上清液中的损失仍明显。
在具3M NaCl的PBS中使用12℃的离心温度，融合蛋白在重溶解沉淀中的回收几乎完全。在这些条件下，溶液浊度非常接近其最大值。浊度的程度，加上较低盐浓度所确立的颗粒大小分布的倾向，提示这些条件下通过ITC获得的完全回收，是因为在这些溶液条件下只存在较大的聚集体。
这些实例说明，为进行硫氧还蛋白-ELP1[V-20]的有效ITC纯化，和潜在地为进行具有小ELP标签的其他可溶融合蛋白的有效ITC纯化，应选定NaCl浓度和离心温度以达到浊度谱图的最大点。对于没有进行温度控制的微量离心机，这最实际地如下来实现：测定离心样品温度，然后通过精确加入盐来调整溶液蛋白的Tt。对于装备有冷冻系统的较大离心机，回收效率可通过NaCl浓度和离心温度的组合改变来达到最大化。相对于可用能诱导反转变的温度和盐浓度的任何组合得到完全回收的硫氧还蛋白-ELP1[V5A2G3-90]而言，硫氧还蛋白-ELP1[V-20]在ITC过程中所要求的控制溶液条件的精确性，是这个靶标蛋白收率的四倍增加所要付出的代价。
将ELP纯化标签的长度从36kDa降低到9kDa，造成了大肠杆菌硫氧还蛋白这一模型靶标蛋白的表达水平的四倍增加。用9kDa标签所得的表达水平类似于不用ELP标签所表达的游离硫氧还蛋白表达水平，因此进一步降低ELP标签大小不太可能提供任何额外的好处。虽然ELP的截短没有不利影响最终蛋白质产物的纯度，但重要的是选择盐浓度和溶液温度的适当组合，以有利于在ITC纯化过程中形成更大的聚集体。
实施例3：
使用ELP标签进行重组蛋白的高通量纯化
通过将两个5′-磷酸化的合成寡核苷酸(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA)退火产生具有PflMI和HinDIII相容末端的双链DNA，构建出5聚五肽VPGVG ELP序列的基因。将这个基因插入到PflMI/HinDIII线性化和脱磷酸化的经修饰pUC-19(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)载体中，用采用PflMI和BgII(Meyer，1999；Meyer，2000)进行的递归定向连接进行聚合，产生出20聚五肽ELP序列的基因。然后用PflMI和BgII切除这个ELP基因，凝胶纯化(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen，Valencia，CA)，插入到SfiI线性化和脱磷酸化的经修饰pET32b载体(Novagen，Madison，WI；Meyer，1999)中。然后将这个表达载体转化到BLR(DE3)(Novagen)大肠杆菌表达菌株中。
上述细胞取自冷冻(DMSO)原种，在补加100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上划线，让其生长过夜。用多通道移液器，将200微升的生长培养基(100μg/ml氨苄青霉素于CircleGrow培养基中；Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA)注射到标准96孔微量培养板(Costar，Corning Inc.，Corning，NY)的每个孔中。使用200μl移液管头，给微量培养板的每个孔接种上从上述琼脂平板上的菌落获取的针头大小细胞聚集物。盖住微量培养板，在37℃和275r.p.m振摇下进行温育。微量培养板用专门的微量培养板固定器原位保持在摇动器中。当用微量培养板读数器(Thermomax；Molecular Devices Co.，Sunnyvale，CA)测出对于大多数培养物OD650达到0.65时——这个光密度对应于用紫外光/可见光分光光度计(UV-1601，Shimadzu Scientifc Instruments，Inc.)测出的OD6502.0——通过加入异丙基α-硫代半乳吡喃糖苷至1mM的最终浓度，对培养物进行诱导。诱导后将培养物温育和振摇4小时，然后用匹配重量微量培养板载体适配器(matched-weight microplate carrieradaptor)(Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，CA)在4℃下1100g离心40分钟进行收获。弃去培养基，细胞沉淀在微量培养板中于-80℃下冷冻，以备进行纯化。
ELP1[V-20]/硫氧还蛋白如下所述在从微量培养板中的细胞培养物纯化。向每个孔加入1μl的溶菌酶溶液(25mg/ml；VI级；Sigma，St.Louis，MO)和25ul的裂解缓冲液(50mM NaCl，5％甘油，50mMTris-HCl，pH7.5)，将细胞裂解。然后用定轨振荡器将微量培养板在4℃下振摇20分钟。向每个孔加入2μl的1.35％(以质量计)脱氧胆酸钠溶液，将微量培养板在4℃下振摇5分钟。向每个孔加入2μl的脱氧核糖核酸酶I溶液(100单位/ul；II型；Sigma，St.Louis，MO)，将微量培养板在4℃下振摇10分钟。然后将微量培养板用匹配重量微量培养板载体适配器(Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，CA)在4℃下1100g离心20分钟，使细胞颗粒物和不溶性蛋白质沉淀。向每个孔加入2μl的10％(以质量计)聚乙烯亚胺溶液，将微量培养板在4℃下振摇15分钟。然后将微量培养板在4℃下1100g离心20分钟，以使DNA沉淀。将上清液转移到新的微量培养板上的各孔，弃去旧的微量培养板。为诱导ELP1[V-20]/硫氧还蛋白聚集，向每个孔加入20μl的饱和NaCl溶液；浊度的明显升高表示靶标蛋白的聚集。为使聚集的蛋白质沉淀，将微量培养板在30℃下1100g离心40分钟。将蛋白质沉淀重溶于30μl的磷酸盐缓冲溶液中，然后将微量培养板在4℃下1100g离心20分钟，以除去不溶性脂质。最后，将纯化的蛋白质上清液转移到新的微量培养板的各孔，在4℃下保存。对ITC纯化的ELP1[V-20]/硫氧还蛋白融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶分析。
或者，ELPs/ELP融合蛋白可用市售的提取试剂按照以下方案进行纯化。向微量培养板的每个孔加入25微升的Novagen BugBuster蛋白质提取试剂，将细胞裂解。将微量培养板以振摇速度2在FisherVortex Genie上(或者以最大速度在定轨振荡器上)室温下放置15分钟。使用微量培养板适配器，在4℃下进行离心(2300rpm，1700x g，对于JS4.2转子的Beckman适配器)20分钟，以形成沉淀。向各孔加入2微升聚乙烯亚胺(至0.66％)，用Vortex Genie或振摇器振摇5分钟。在冰上温育10分钟，不时振摇。使用微量培养板适配器，在最大速度下4℃离心25分钟。将上清液转移到新的微量培养板，弃去带沉淀的旧微量培养板。加入NaCl(晶体)和/或提高溶液的温度，以诱导ELP聚集。只通过振摇进行混合——用移液管吸上吸下(pipeting)会使ELP聚集在移液管头上。溶液应变混浊到一定程度。在转变温度以上的温度下离心(2300rpm，1700g，35-40℃，45分钟)。弃去上清液，通过用移液管在孔底和孔壁周围吸上吸下将沉淀(通常不可见或者是微细的沉淀)重悬于30微升的选用的冷缓冲液(PBS)中。离心(2300rpm，1700x g，4℃，20分钟)除去不溶性杂质如脂质。将上清液转移到另一个微量培养板。纯化的ELP可在微量培养板中-80℃冻藏备用。(对于融合体，必须确保冷冻对于融合蛋白是适合的)。这个技术中所采用的适当NaCl浓度和温度取决于ELP、融合伴侣和ELP浓度。目的是使有效ELP转变温度降低到溶液温度以下至少3-5℃。25-30℃的有效转变温度和35-40℃下的温暖离心已得到有效应用，不过如果融合蛋白能耐受的话，可以使用更高的温度。
蛋白质浓度是通过测量A280(UV-1601，Shimadzu ScientificInstruments，Inc.)和使用ELP1[V-20]/硫氧还蛋白的摩尔消光系数(ε＝19,870)进行测定；这假定ELP1[V-20]/硫氧还蛋白蛋白质样品纯净而不含蛋白质和DNA杂质。硫氧还蛋白活性是用胰岛素还原测定法进行测定(Holmgren，1984)。
对于融合蛋白的构建，使用之前公布的理论Tt数据(Urry，1991)，设计出Tt在70℃左右的小ELP标签。对ELP标签的表征显示Tt为76.2℃，这证实有可能理性地设计出具有指定Tt的ELP标签。对于ELP/硫氧还蛋白融合蛋白，在低盐缓冲液、1M和2M盐溶液中的Tt分别为68℃、37℃和18℃，这证实可溶性蛋白质与ELP标签的融合极少影响其Tt，和表明Tt可通过调整盐浓度在很宽范围内进行操纵。
根据前述内容，可产生出一家族的含有ELP序列和通过切割位点连接的多聚接头区域(靶标蛋白插入其中)的质粒表达载体，用来促进多种蛋白质的表达。嵌入这一家族的质粒中的ELP序列可具有不同的转变温度(通过改变客体残基的身份)。特定靶标蛋白的表达载体宜根据蛋白质表面疏水性质进行选择。然后在纯化过程中调整溶液的盐浓度，以获得所需的Tt。
对于涉及细胞培养物在微量培养板孔中生长的蛋白质表达，细胞培养物宜在OD600≈2时诱导，在诱导后生长4小时。在诱导时用于微量培养板生长的细胞密度是常规蛋白质表达方案所达到的两到三倍。即使在这些高细胞密度下，可通过对培养物通气在微量培养板孔中维持快速和健康的细胞生长，培养物在孔中生长时其特征是有高的表面积-体积比。在诱导后生长较长时间的细胞培养物极低限度地产生出更多的靶标蛋白，用超表达方案(hyper expression protocol，Guda，1995)进行的生长具有更多的污染性蛋白质(10倍左右)，极低限度地产生出更多的融合蛋白。为了避免微量培养板孔中的高表面积-体积比细胞生长中的细胞培养基的蒸发，有必要在培养过程中用适当的盖子盖住微量培养板，和在诱导过程中用额外的培养基灌输细胞生长。按每升计，在微量培养板孔中生长的培养物其融合蛋白表达水平高于用常规方案生长的培养物。
当细胞用市售的非离子型蛋白质提取配方进行裂解时，用ITC进行的高通量蛋白质纯化是成功的。细胞裂解后，聚乙烯亚胺的加入在离心时将核酸和高分子量蛋白质从粗裂解物的可溶部分除去。在可溶裂解物的融合蛋白和盐浓度下，融合蛋白Tt的大约为65℃。将可溶裂解物加热超过这个温度来诱导融合蛋白聚集，会使可溶污染性蛋白质以及靶标蛋白本身变性和沉淀。此外，这个温度不能在离心过程中在离心室中维持。因此，向可溶裂解物加入盐至大约2M；这使融合蛋白Tt的降低到大约18℃，使得融合蛋白可在室温下发生聚集。这个盐浓度没有使任何污染性蛋白质沉淀，也没有改变最终纯化蛋白质产物的功能性。
用ITC进行的高通量蛋白质纯化既有效果(effective)又有效率(efficient)。约15％的被表达融合蛋白损失在细胞裂解物的不溶性蛋白质部分中。融合蛋白聚集后对样品的离心有效地分离蛋白质：90％融合蛋白被沉淀，而10％的融合蛋白随同所有的可溶污染性蛋白质保留在上清液中。总的来说，使用ITC纯化提取到约75％的被表达蛋白质，纯化产物中的大肠杆菌污染性蛋白质水平低于SDS-PAGE可检测的水平。可通过提高离心速度来加快纯化过程和提高纯化效率；更高的离心速度使得离心时间减少，在较高的离心速度下(5000g)，所有的融合蛋白在聚集后的离心过程中被沉淀。凝血酶的加入完全切割融合蛋白，再进行一轮ITC使ELP标签与硫氧还蛋白靶标蛋白分离开来，没有损失硫氧还蛋白。
用吸光度测定(A280，ε＝19,870)测出的每孔纯化的融合蛋白的平均数量为33ug，标准偏差为8.5ug。数值均匀分散在19.7-48.3ug/孔之间。纯化蛋白质的产率的大变动，更多地是因为不同孔中表达的蛋白质的量不同，而不是ITC过程的纯化效率的变动。在不同的细胞培养物中表达的蛋白质的量不同，这是因为：1)接种量不精确，这意味着细胞培养物的初始细胞量不同，2)更有可能的是由于通气更为充分，周围各孔中的细胞培养物趋向于具有更快的生长和达到更高的稳定期细胞密度。为了操作简便起见，所有的细胞培养物都是同时进行诱导然后进行收获，而不是对各个细胞培养物分别进行诱导和收获。
硫氧还蛋白靶标蛋白的酶活性用胰岛素还原测定法进行测量。根据这个酶活性测出的每孔融合蛋白的平均量为35.7ug，标准偏差为8.0ug。同样，数值均匀分散在最小值24.6至最大值50.8ug/孔之间。要着重指出的是，硫氧还蛋白尽管仍与ELP标签连接，但具有酶活性。被表达并用这个高通量ITC技术纯化的硫氧还蛋白，其每单位质量的酶活性平均比市售硫氧还蛋白(Sigma)高10.3％，这证明了ITC过程的温和性和ITC过程所能达到的纯度。
平均来说，高通量ELP/硫氧还蛋白蛋白质表达和纯化产生了大约160mg/升生长物的蛋白质。这与用常规的蛋白质表达和ITC纯化方法获得的ELP/硫氧还蛋白收率(140-200mg蛋白质/L生长物)相当。
按照上述程序，对用微量培养板和ITC进行的高通量蛋白质纯化的各阶段进行SDS-PAGE凝胶分析，其中ELP/硫氧还蛋白融合蛋白用记载的方案进行纯化。将凝胶样品用SDS变性，用β-巯基乙醇还原，在10-20％梯度Tris-HCl凝胶上200V跑胶45分钟。
应用矩形图来定量纯化的蛋白质样品，包括用吸光度测量(A280，ε＝19,870)测出的每孔总融合蛋白的矩形图(n＝20，μ＝32.97，σ＝8.48)，和每个样品与市售硫氧还蛋白(Sigma)相比的融合蛋白功能性/纯度的矩形图(n＝20，μ＝l10.37％，σ＝16.54％)。
鉴于这种高通量蛋白质表达和纯化方法，要指出的是镍螯合的多孔板仅能纯化1ng的His标记蛋白质/孔，而使用ITC的高通量纯化的能力仅受到可被孔中生长的培养物表达的蛋白质的量所限制；对于ELP标记蛋白质，蛋白质表达的水平在几十微克的范围。
使用ITC的高通量纯化因此能提供高产率，产生出足够的融合蛋白供进行肽活性治疗剂-ELP构建物的纯化，以产生治疗组合物用的活性成分。毫克水平的纯化融合蛋白，可通过将细胞培养物在其他容器中生长并将重悬的细胞沉淀转移到多孔板进行纯化过程来获得。最后，这种高通量纯化技术在技术上比当前的常规市售高通量纯化方法更简单更便宜，因为它仅需要将纯化中间体向新的多孔板转移一次。
实施例4：
不同ELP基因表达系列的构建
细菌菌株和质粒
各克隆步骤在大肠杆菌菌株XL1-Blue(recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rk -，mk +)，supE44，relA1，lac[F′，proAB，lαcIqZAM15，Tn10(Tetr)](Stratagene La Jolla，CA)中进行。pUC19(NEB，Beverly，MA)用作克隆载体进行ELP构建(Meyer和Chilkoti，1999)。修饰形式的pET15b和pET24d载体(Novagen)用来在BL21Star(DE3)菌株(F-，omp T，hsdSB(rB -mB -)，gal，dcm，mel31，(DE3))(Invitrogen Carlsbed，CA)或BLR(DE3)(F-，ompT，hsdSB(rB -mB -)，gal，dcm，Δ(srl-recA)306::Tnl0(TcR)(DE3))(Novagen Madison，WI)中表达ELP和ELP-融合蛋白。合成的DNA寡聚物购自Integrated DNA Technologies，Coralville，IA。所有的载体构建物都用标准的分子生物学方案(Ausubel，et al.，1995)制备。
ELP1[V 5 A 2 G 3 ]基因系列的构建
ELP1[V5A2G3]系列表示含有五肽VPGXG的多个重复单元的多肽，其中X为缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸，相对比例为5∶2∶3。
ELP1[V5A2G3]系列单体ELP1[V5A2G3-10]如下构建：使四个5′磷酸化的、经PAGE纯化的合成寡聚物退火，形成具有EcoRI和HindIII相容末端的双链DNA(Meyer和Chilkoti，1999)。寡聚物是在四个寡聚物于50μl1X连接酶缓冲液(Invitrogen)中的1μM混合物中在加热块(heating block)中退火至95℃，然后让加热块慢慢冷却到室温。将ELP1[V5A2G3-10]/EcoRI-HindIII DNA区段连接到用EcoRI和HindIII消化和CIAP脱磷酸化(Invitrogen)的pUC19载体中，以形成pUC19-ELP1[V5A2G3-10]。如下开始建立ELP1[V5A2G3]系列文库：将来自pUC19-ELP1[V5A2G3-10]的ELP1[V5A2G3-10]PflM1/Bgl1片段插入到用PflM1线性化和用CIAP脱磷酸化的pUC19-ELP1[V5A2G3-10]中，以产生pUC19-ELP1[V5A2G3-20]。然后通过将ELP1[V5A2G3-10]或ELP1[V5A2G3-20]PflM1/Bgl1片段分别连接到PflMI消化的pUC19-ELP1[V5A2G3-20]中，将pUC19-ELP1[V5A2G3-20]建立成pUC19-ELP1[V5A2G3-30]和pUC19-ELP1[V5A2G3-40]。采用这个程序扩展ELP1[V5A2G3]系列，产生pUC19-ELP1[V5A2G3-60]、pUC19-ELP1[V5A2G3-90]和pUC19-ELP1[V5A2G3-180]基因。
ELP1[K 1 V 2 F 1 ]基因系列的构建
ELP1[K1V2F1]系列表示含有五肽VPGXG的多个重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，相对比例为1∶2∶1。
ELP1[K1V2F1]系列单体ELP1[K1V2F1-4](SEQ ID NO：18)如下构建：使两个5′磷酸化的、经PAGE纯化的合成寡聚物退火，形成具有EcoRI和HindIII相容末端的双链DNA(Meyer和Chilkoti，1999)。寡聚物是在四个寡聚物于50μl 1X连接酶缓冲液(Invitrogen)中的1μM混合物中在加热块中退火至95℃，然后让加热块慢慢冷却到室温。将ELP1[K1V2F1-4]/EcoRI-HindIII DNA区段连接到用EcoRI和HindIII消化和CIAP脱磷酸化(Invitrogen)的pUC19载体中，以形成pUC19-ELP1[K1V2F1-4]。如下开始建立ELP1[K1V2F1]系列文库：将来自pUC19-ELP1[K1V2F1-4]的ELP1[K1V2F1-4]PflM1/Bgl1片段插入到用PflM1线性化和用CIAP脱磷酸化的pUC19-ELP1[K1V2F1-4]中，以产生pUC19-ELP1[K1V2F1-8]。采用相同的程序，将ELP1[K1V2F1]系列在每次连接加倍，以形成PUC19-ELP1[K1V2F1-16]、pUC19-ELP1[K1V2F1-32]、pUC19-ELP1[K1V2F1-64]和pUC19-ELP1[K1V2F1-128]。
ELP1[K 1 V 7 F 1 ]基因系列的构建
ELP1[K1V7F1]系列表示含有五肽VPGXG的多个重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，相对比例为1∶7∶1。
ELP1[K1V7F1]系列单体ELP1[K1V7F1-9](SEQ ID NO：19)如下构建：使四个5′磷酸化的、经PAGE纯化的合成寡聚物退火，形成具有PflMI和HindIII相容末端的双链DNA。然后将ELP1[K1V7F1-9]DNA区段连接到PflMI/HindIII脱磷酸化的PUC19-ELP1[V5A2G3-180]载体中，从而用[K1V7F1-9]取代ELP1[V5A2G3-180]，产生出pUC19-ELP1[K1V7F1-9]单体。按与ELP1[K1V2F1]系列相同的方式，扩展ELP1[K1V7F1]系列，产生出pUC19-ELP1[K1V7F1-18]、PUC19-ELP1[K1V7F1-36]、pUC19-ELP1[K1V7F1-72]和pUC19-ELP1[K1V7Fr144]。
ELP1[V]基因系列的构建
ELP1[V]系列表示含有五肽VPGXG的多个重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸。
ELP1[V]系列单体ELP1[V-5](SEQ ID NO：14)如下构建：使两个5′磷酸化的、经PAGE纯化的合成寡聚物退火，形成具有EcoRI和HindIII相容末端的双链DNA。然后将ELP1[V-5]DNA区段连接到EcoRI/HindIII脱磷酸化的pUC19载体中，产生pUC19-ELP1[V-5]单体。按与ELP1[V5A2G3]系列相同的方式产生ELP1[V]系列，最终将pUC19-ELP1[V-5]扩展成pUC19-ELP1[V-60]和pUC19-ELP1[V-120]。
ELP2基因系列的构建
ELP2系列表示含有五肽AVGVP的多个重复单元的多肽。
ELP2系列单体ELP2[5](SEQ ID NO：20)如下构建：使两个5′磷酸化的、经PAGE纯化的合成寡聚物退火，形成具有EcoRI和HindIII相容末端的双链DNA。然后将ELP2[5]DNA区段连接到EcoRI/HindIII脱磷酸化的pUC19载体中，产生pUC19-ELP2[5]单体。按与ELP1[K1V2F1]系列相同的方式扩展ELP2系列，产生pUC19-ELP2[10]、pUC19-ELP2[30]、pUC19-ELP2[60]和pUC19-ELP2[120]。
ELP3[V]基因系列的构建
ELP3[V]系列表示含有五肽IPGXG的多个重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸。
ELP3[V]系列单体ELP3[V-5](SEQ ID NO：21)如下构建：使两个5′磷酸化的、经PAGE纯化的合成寡聚物退火，形成具有PfLM1氨基末端和GGC羧基末端相容末端的双链DNA，由于缺乏便利的羧基末端限制位点，但仍能够无缝添加单体。然后将ELP3[V-5]DNA区段连接到PflM1/BglI脱磷酸化的pUC19-ELP4[V-5]，从而用ELP3[V-5]取代ELP4[V-5]，产生出pUC19-ELP3[V-5]单体。ELP3[V]系列通过将退火的ELP3寡聚物连接到用PflM1消化的pUC19-ELP3[V-5]中来扩展。每次连接以5个肽扩展ELP3[V]系列，产生出ELP3[V-10]、ELP3[V-15]等。
ELP4[V]基因系列的构建
ELP4[V]系列表示含有五肽LPGXG的多个重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸。
ELP4[V]系列单体ELP4[V-5](SEQ ID NO：22)如下构建：使两个5′磷酸化的、经PAGE纯化的合成寡聚物退火，形成具有EcoRI和HindIII相容末端的双链DNA。然后将ELP4[V-5]DNA区段连接到EcoRI/HindIII脱磷酸化的pUC19载体中，产生pUC19-ELP4[V-5]单体。按与ELP1[K1V2F1]系列相同的方式扩展ELP4[V]系列，产生出pUC19-ELP4[V-10]、pUC19-ELP4[V-30]、pUC19-ELP4[V-60]和pUC19-ELP4[V-120]。
还将ELP基因插入到其他载体如pET15b-SD0、pET15b-SD3、pET15b-SD5、pET15b-SD6和pET24d-SD21中。pET载体系列获自Novagen，San Diego，CA。
pET15b-SD0载体是通过用含有多克隆限制位点(Sac1-Nde1-Nco1-Xho1-SnaB1-BamH1)的SD0双链DNA区段修饰pET15b载体来形成。SD0双链DNA区段具有Xba1和BamH1相容末端，将其连接到Xba1/BamH1线性化和5′-脱磷酸化的pET15b中，形成pet15b-SD0载体。
pET15b-SD3载体是通过用含有位于铰链区-凝血酶切割位点上游的Sfi1限制位点(其后是多克隆位点(Nde1-Nco1-Xho1-SnaB1-BamHI))的SD3双链DNA区段，对pET15b-SD0载体进行修饰来形成。SD3双链DNA区段具有Sac1和Nde1相容末端，将其连接到Sac1/Nde1线性化和5′-脱磷酸化的pET15b-SD0中，形成pET15b-SD3载体。
pET15b-SD5载体是通过用含有位于凝血酶切割位点上游的Sfi1限制位点(其后是铰链和多克隆位点(Nde1-Nco1-Xho1-SnaB1-BamHI))的SD5双链DNA区段，对pET15b-SD3载体进行修饰来形成。SD5双链DNA区段具有Sfi1和Ndel相容末端，将其连接到Sfil/Ndel线性化和5′-脱磷酸化的pET15b-SD3中，形成pET15b-SD5载体。
pET15b-SD6载体是通过用含有位于接头区-TEV切割位点上游的Sfi1限制位点(其后是多克隆位点(Nde1-Nco1-Xho1-SnaB1-Bam HI))的SD6双链DNA区段，对pET15b-SD3载体进行修饰来形成。SD6双链DNA区段具有Sfi1和Nde1相容末端，将其连接到sfi1/Nde1线性化和5′-脱磷酸化的pET15b-SD3中，形成pET15b-SD6载体。
pET24d-SD21载体是通过用具有Nco1和Nhe1相容末端的SD21双链DNA区段对pET24d载体进行修饰来形成。将SD21双链DNA区段连接到Nco1/Nhe1线性化和5′磷酸化的pET24d中，产生pET24d-SD21载体，它含有新的多克隆位点NcoI-SfiI-NheI-BamHI-EcoRI-SacI-SalI-HindIII-NotI-XhoI，两个终止密码子紧接在SfiI位点之后，供插入和表达具有最小额外氨基酸数目的ELP。
将在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[V5A2G3-60]、pUC19-ELP1[V5A2G3-90]和pUC19-ELP1[V5A2G3-180]质粒用PflM1和Bgl1消化，如上所述将含有ELP的片段连接到pET15b-SD3表达载体的Sfi1位点，分别产生出pET15b-SD3-ELP1[V5A2G3-60]，pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-90]和pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-180]。
将在XLl-Blue中产生的pUC19-ELP1[V5A2G3-90]、pUC19-ELP1[V5A2G3-180]、pUC19-ELP1[V-60]和pUC19-ELP1[V-120]质粒用PflM1和Bgl1消化，如上所述将含有ELP的片段连接到pET15b-SD5表达载体的Sfi1位点，分别产生出pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-90]、pET15b-SD5-ELP1[V5A2G3-180]、pET15b-SD5-ELP1[V-60]和pET15b-SD5-ELP1[V-120]。
将在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[V5A2G3-90]质粒用PflM1和Bgl1消化，如上所述将含有ELP的片段连接到pET15b-SD6表达载体的Sfi1位点，产生出pET15b-SD6-ELP1[V5A2G3-90]。
将在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[K1V2F1-64]和pUC19-ELP1[K1V2F1-128]质粒用PflM1和Bgl1消化，如上所述将含有ELP的片段连接到pET24d-SD21表达载体的Sfi1位点，分别产生出pET24d-SD21-ELP1[K1V2F1-64]和pET24d-SD21-ELP1[K1V2F1-128]。
将在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP1[K1V7F1-72]和pUC19-ELP1[K1V7F1-144]质粒用PflM1和Bgl1消化，如上所述将含有ELP的片段连接到pET24d-SD21表达载体的Sfi1位点，分别产生出pET24d-SD21-ELP1[K1V7F1-72]和pET24d-SD21-ELP1[K1V7F1-144]。
将在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP2[60]和pUC19-ELP2[120]质粒用NcoI和HindIII消化，如上所述将含有ELP的片段连接到pET24d-SD21表达载体的NcoI和HindIII位点，分别产生出pET24d-SD21-ELP2[60]和pET24d-SD21-ELP2[120]。
将在XL1-Blue中产生的pUC19-ELP4[V-60]和pUC19-ELP4[V-120]质粒用NcoI和HindIII消化，如上所述将含有ELP的片段连接到pET24d-SD21表达载体的NcoI和HindIII位点，分别产生出pET24d-SD21-ELP4[V-60]和pET24d-SD21-ELP4[V-120]。
实施例5：
各种融合蛋白的构建、分离和纯化
要指出的是，以下融合蛋白说明具体的组合中的多种肽活性治疗剂和ELP种类。
虽然这些融合蛋白在各自的肽活性治疗剂部分和ELP部分之间设计有切割位点，供用于切割反应以产生肽活性治疗剂部分和ELP部分以作进一步研究，但相应的缺乏这种切割位点的肽活性治疗剂-ELP构建物是容易产生的，产生方法简单方便，是将肽活性治疗剂直接与ELP键合，而不用任何易受蛋白酶或其他降解剂切割或者易受构建物在给予后在体内可能遇到的条件的影响的间插切割基团或部分。
进行了实验，以证实各种靶标蛋白(肽活性治疗剂)在形成含ELP的融合蛋白上的用途和这种融合蛋白所显示的反相转变行为。具体的说，用符合上文的教导和公开内容的已知重组表达技术，在大肠杆菌中形成以下36个含ELP的融合蛋白：
·胰岛素A肽和ELP1[V-60]多肽，它们之间具有肠激酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：23)；
·胰岛素A肽和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有肠激酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：24)；
·胰岛素A肽和ELP1[V-120]多肽，它们之间具有肠激酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：25)；
·胰岛素A肽和ELP1[V5A2G3-180]多肽，它们之间具有肠激酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：26)；
·T20肽和ELP1[V-60]多肽，它们之间具有肠激酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：27)；
·T20肽和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有肠激酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：28)；
·T20肽和ELP1[V-120]多肽，它们之间具有肠激酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：29)；
·T20肽和ELP1[V-60]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：30)；
·T20肽和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：31)；
·T20肽和ELP1[V-120]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：32)；
·T20肽和ELP1[V-60]多肽，它们之间具有烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点(在QS残基之间切割)(SEQ ID NO：33)；
·T20肽和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有TEV蛋白酶切割位点(在QS残基之间切割)(SEQ ID NO：34)；
·T20肽和ELP1[V-120]多肽，它们之间具有TEV蛋白酶切割位点(在QS残基之间切割)(SEQ ID NO：35)；
·T20肽和ELP1[V-60]多肽，它们之间具有TEV蛋白酶切割位点(在QY残基之间切割)(SEQ ID NO：36)；
·T20肽和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有TEV蛋白酶切割位点(在QY残基之间切割)(SEQ ID NO：37)；
·T20肽和ELP1[V-120]多肽，它们之间具有TEV蛋白酶切割位点(在QY残基之间切割)(SEQ ID NO：38)；
·干扰素α2B蛋白和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：39)；
·烟草蚀纹病毒蛋白酶和ELP1[V-60]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：40)；
·烟草蚀纹病毒蛋白酶和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：41)；
·烟草蚀纹病毒蛋白酶和ELP1[V-120]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：42)；
·烟草蚀纹病毒蛋白酶和ELP1[V5A2G3-180]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：43)；
·小异型二聚体伴侣孤儿受体和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：44)；
·雄激素受体配体结合域和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：45)；
·雄激素受体配体结合域和ELP1[V5A2G3-180]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：46)；
·糖皮质类固醇受体配体结合域和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：47)；
·雌激素受体配体结合域和ELP1[VsA2G3-60]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：48)；
·雌激素受体配体结合域和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：49)；
·雌激素受体配体结合域和ELP1[V5A2G3-180]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：50)；
·雌激素受体配体结合域和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有TEV蛋白酶切割位点(在QG残基之间切割)(SEQ ID NO：51)；
·G蛋白αQ和ELP1[VsA2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：52)；
·G蛋白αQ和ELP1[VsA2G3-180]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：53)；
·1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽和ELP1[VsA2G3-60]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：54)；
·1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽和ELP1[VsA2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：55)；
·1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽和ELP1[VsA2G3-180]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：56)；
·1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽和ELP1[VsA2G3-90]多肽，它们之间具有TEV蛋白酶切割位点(在QG残基之间切割)(SEQ ID NO：57)；和
·G蛋白αS和ELP1[V5A2G3-90]多肽，它们之间具有凝血酶蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：58)。
发现以上所列的36个含ELP的融合蛋白全部保持了相应ELP标签的反相转变行为，并用反转变循环(ITC)技术按照以下实验程序成功地得到分离和纯化：
含有胰岛素A肽(InsA)的融合蛋白的分离和纯化
将含有各自的ELP-InsA融合蛋白的大肠杆菌菌株BLR(DE3)(Novagen)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的5mlCircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在37℃下250rpm振摇生长5小时。然后将5ml培养物接种到500ml培养基中，让其在25℃下生长16小时，然后用1mM IPTG在25℃下诱导4小时。收获培养物，悬浮在40ml20mM Tris-HCl pH7.4，50mM NaCl，1mM DTT和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(1Complete EDTA freeProtease inhibitor pellet)(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达1.0M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有各自的ELP-InsA融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的20mM Tris-HCl pH7.4，50mMNaCl，1mM DTT中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-InsA融合蛋白的纯度并将最终体积减至0.5ml。
含有T20肽(T20)的融合蛋白的分离和纯化
将含有各自的ELP-T20融合蛋白的大肠杆菌菌株BLR(DE3)(Novagen)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的500ml CircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在37℃下250rpm振摇生长24小时。收获培养物，悬浮在40ml50mM Tris-HCl pH8.0，0.5mM EDTA和1个完全蛋白酶抑制剂颗粒(1Complete Proteaseinhibitor pellet)(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达1.0M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有各自的ELP-T20融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的50mM Tris pH8.0，0.5mMEDTA中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-T20融合蛋白的纯度并将最终体积减至5ml。
含有干扰素α2B肽(IFNA2)的融合蛋白的分离和纯化
将含有ELP-IFNA2融合蛋白和Codon Plus-RIL质粒(Stratagene)的大肠杆菌菌株BL21(DE3)TrxB-(Novagen)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)、25ug/ml氯霉素(Sigma)的500mlCircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在27℃下250rpm振摇生长48小时。收获培养物，悬浮在50mM Tris-HCl pH7.4，50mMNaCl和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达1.5M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有ELP-IFNA2融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的50mM Tris-HCl pH7.4，50mMNaCl中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-IFNA2融合蛋白的纯度并将最终体积减至5ml。
含有烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)的融合蛋白的分离和纯化
将含有pET15b-SD5-ELP-TEV构建物和Codon Plus-RIL质粒(Stratagene)的大肠杆菌菌株BL21star或BRL(DE3)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)、25ug/ml氯霉素(Sigma)的500mlCircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在27℃下250rpm振摇生长48小时。收获培养物，悬浮在50mM Tris-HCl pH8.0，1mMEDTA，5mM DTT，10％甘油和1mM PMSF中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达1.5M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有各自的ELP-TEV融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的50mM Tris-HCl pH8.0，1mMEDTA，5mM DTT，10％甘油中，在4℃下20,000g在离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-TEV融合蛋白的纯度并将最终体积减至1ml。
含有小异型二聚体伴侣孤儿受体(SHP)的融合蛋白的分离和纯化
将含有ELP-SHP融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21Star(DE3)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)和10％蔗糖的500mlCircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在27℃下250rpm振摇生长48小时。收获培养物，悬浮在50mM Tris-HCl pH8.0，150mMKCl，1mM DTT1mM EDTA和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。可溶裂解物中的DNA和RNA通过加入2μl Benzonase(Novagen)和在4℃下温育30分钟进一步降解。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达1.5M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有ELP-SHP融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的50mM Tris-HCl pH8.0，150mM KCl，1mM DTT1mM EDTA和1％N-辛基葡糖苷中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性不溶性蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高ELP-SHP融合蛋白的纯度并将最终体积减至2ml。
含有雄激素受体配体结合域(AR-LBD)的融合蛋白的分离和纯化
将含有各自的ELP-AR-LBD融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21Star(DE3)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)和10μMDHT的500ml CircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在27℃下250rpm振摇生长48小时。收获培养物，悬浮在40ml50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，0.1％N-辛基葡糖苷，10％甘油，1mM DTT，1μMDHT和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。可溶超声裂解物中的DNA和RNA通过加入2μlBenzonase(Novagen)和在4℃下温育30分钟进一步降解。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达2.0M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有各自的ELP-AR-LBD融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的50mM Hepes pH7.5，150mMNaCl，0.1％N-辛基葡糖苷，10％甘油，1mM DTT和1μM DHT中，在4℃下20,000g离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-AR-LBD融合蛋白的纯度并将最终体积减至25ml。
含有糖皮质类固醇受体配体结合域(GR-LBD)的融合蛋白的分离和纯 化
将含有ELP-GR-LBD融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21Star(DE3)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的500mlCircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在37℃下250rpm振摇生长24小时。收获培养物，悬浮在50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，1mM DTT，10％甘油，0.1％CHAPS和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。可溶裂解物中的DNA和RNA通过加入2μl Benzonase(Novagen)和在4℃下温育30分钟进一步降解。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达2.0M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有ELP-GR-LBD融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的50mM Hepes pH7.5，150mMNaCl，1mM DTT，10％甘油，0.1％CHAPS中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高ELP-GR-LBD融合蛋白的纯度并将最终体积减至10ml。
含有雌激素受体配体结合域(ERα-LBD)的融合蛋白的分离和纯化
将含有各自的ELP-ERα-LBD融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21Star(DE3)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)和10％蔗糖的500ml CircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在27℃下250rpm振摇生长48小时。收获培养物，悬浮在40ml50mM Tris-HClpH8.0，150mM KCl，1mM EDTA，1mM DTT和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。可溶裂解物中的DNA和RNA通过加入2μl Benzonase(Novagen)和在4℃下温育30分钟进一步降解。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达1.5M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有各自的ELP-ERα-LBD融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于40ml用冰预冷的50mM Tris-HCl pH8.0，150mMKCl，1mM EDTA，1mM DTT中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-ERα-LBD融合蛋白的纯度并将最终体积减至10ml。
含有G蛋白αQ(Gαq)的融合蛋白的分离和纯化
将含有各自的ELP-Gαq融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21Star(DE3)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)和1μM GDP的500ml CircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在37℃下250rpm振摇生长24小时。收获培养物，悬浮在40ml50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，1.0％CHAPS，10％甘油，1mM DTT，10μM GDP和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。可溶裂解物中的DNA和RNA通过加入2μlBenzonase(Novagen)和在4℃下温育30分钟进一步降解。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达2.0M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有各自的ELP-Gαq融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于30ml用冰预冷的50mM Hepes pH7.5，150mMNaCl，1.0％CHAPS，10％甘油，1mM DTT，10μM GDP中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-Gαq融合蛋白的纯度并将最终体积减至5ml。
含有l-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的融合蛋白的分离和 纯化
将含有各自的ELP-DXR融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21Star(DE3)的单菌落接种到补加100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)和1mMMnCl2(VWR)的500ml CircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在37℃下250rpm振摇生长24小时。收获培养物，悬浮在40ml0.1MTris pH7.6，1mM DTT和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。可溶裂解物中的DNA和RNA通过加入2μl Benzonase(Novagen)和在4℃下温育30分钟进一步降解。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达2.0M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有各自的ELP-DXR融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于20ml用冰预冷的0.1M Tris pH7.6，1mM DTT中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高各自的ELP-DXR融合蛋白的纯度并将最终体积减至5ml。
含有G蛋白αS(Gαs)的融合蛋白的分离和纯化
将含有ELP-Gαs融合蛋白的大肠杆菌菌株BL21 Star(DE3)的单菌落接种到补加100 μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的500 ml CircleGrow(Q-BIOgene，San Diego，CA)中，在37℃下250rpm振摇生长24小时。收获培养物，悬浮在40ml PBS，10％甘油，1mM DTT和1个完全无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒(Roche，Indianapolis，IN)中。将细胞在冰上通过超声破碎裂解3分钟，超声破碎是35％功率下脉冲10秒钟和冷却30秒钟相间进行。可溶裂解物中的DNA和RNA通过加入2μlBenzonase(Novagen)和在4℃下温育30分钟进一步降解。在4℃下20,000g离心30分钟，除去细胞碎片。
通过在室温下向细胞裂解物加入NaCl至在其中达1.5M的终浓度，引发反相转变，然后在室温下20,000g离心15分钟。所得的沉淀含有ELP-Gαs融合蛋白和非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。
将沉淀重悬于10ml用冰预冷的PBS，10％甘油，1mM DTT中，在4℃下20,000g再离心15分钟，以除去非特异性地被NaCl沉淀的蛋白质。再重复进行反转变循环两次，以提高ELP-Gαs融合蛋白的纯度并将最终体积减至1ml。
实施例6：
不用色谱法产生10个蛋白质
成功地对实施例1所述的deltaPhaseTM系统技术试验了10个蛋白质的表达和纯化。表2所示的结果和图3的三个蛋白质的SDS-PAGE清楚表明，不同的蛋白质可被纯化至大于95％纯度。通过彻底表征以与ELP1[V5A2G3-90]融合并带有供通过固定化金属亲和层析(IMAC)进行纯化的标签的融合蛋白形式表达的蓝色荧光蛋白(BFP)、硫氧还蛋白(Trx)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、钙调蛋白(CalM)和血管生长抑素(K1-3)，对ELP融合蛋白表达和纯化进行了系统性评估。表达是在大肠杆菌中进行。表2列出ELP融合蛋白的纯化所获得的产率。
表2：deltaPhaseTM在蛋白质纯化中的应用
Figure BDA00003043908500731
图3显示BFP、CAT和K1-3的ITC纯化的SDS-PAGE凝胶图。图中包括可溶性大肠杆菌裂解物(L)、在融合蛋白的Tt以上离心后的上清液(S)和纯化的蛋白(P)。第二个凝胶图显示Trx(A)、BFP(B)、CAT(C)、K1-3(D)、GFP(E)的纯化ELP[VsA2G3-90]融合体。
实施例7：
10个药物相关肽的产生
使用实施例1所述的deltaPhaseTM系统，表达和纯化了10个药物相关肽，它们的大小在2.0-6.2kDa之间，等电点在4.11-12.3之间。在改变多个表达和纯化条件进行的大量工作后，成功地表达和纯化了6个肽，它们的纯度大于90％，产率在17-23mg/L之间，如下表3所示。
表3
Figure BDA00003043908500741
产生的融合蛋白包括：ELP4-60-MMN、ELP4-60-NPY、ELP4-60-食欲肽B、ELP4-60-瘦蛋白、ELP4-60-ACTH、ELP4-60-GH和ELP1-90-降钙素。
有四个肽经证明要大量产生会更具挑战性。鉴于肽的不定的特性，包括大小、溶解性和蛋白水解倾向性，这并不奇怪。成功地产生了有挑战性的肽的融合蛋白ELP-肾上腺髓质素(AM)、ELP-甲状旁腺激素(PTH)、ELP-防御素和ELP-生长激素。但是，在将ELP从目的肽切割后，要么用烟草蚀纹病毒(TEV)的切割系统是不充分的，要么肽是不可溶的。只实现了ELP-生长激素的部分切割，在ELP-AM、ELP-PTH和ELP-防御素的切割后没有肽保留。这些结果证明了ELP系统在不用色谱进行的治疗性相关肽的纯化上的灵活性和广泛应用。
实施例8：
融合蛋白活性
用以下四种蛋白质产生了融合肽治疗用蛋白：蓝色荧光蛋白(BFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、硫氧还蛋白(Trx)和白细胞介素1受体拮抗剂(IL-Ra)。每个组合物是用ELP1[V5A2G3-90]以ELP/蛋白质方向和蛋白质/ELP方向来产生。
八个融合构建物的接头序列：
CAT/ELP CAT-VENLYFQGGMG(SEQ ID NO：59)-ELP
ELP/CAT ELP-VPGWPSSGDYDIPTTENLYFQGAH(SEQ ID NO：60)-CAT
Trx/ELP Trx-GSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGK(SEQ ID NO：61)-ELP
ELP/Trx ELP-VPGWPSSGDYDIPTTENLYFQGAH(SEQ ID NO：62)-Trx
BFP/ELP BFP-VDKLAAALDMHHHHHHSSGLVPRGSGK(SEQ ID NO：63)-ELP
ELP/BFP ELP-VPGWPSSGDYDIPTTENLYFQGAH(SEQ ID NO：64)-BFP
IL-1Ra/ELP IL-1Ra-LENLYFQGGMG(SEQ ID NO：65)-ELP
ELP/IL-1Ra ELP-VPGWPSSGDYDIPTTENLYFQGAH(SEQ ID NO：66)-IL-1Ra
将所有八个蛋白质融合体构建物转化到BLR(DE3)细胞中，在50mL TB培养基中按一式三份进行生长，通过ITC纯化。在一轮的ITC中，通过加入NaCl降低Tt来诱导相转变，离心收集大的微米大小的聚集体。将沉淀重悬于低离子强度的缓冲液中，然后进行冷离心(coldspin)除去包埋在ELP融合蛋白沉淀中的不溶性污染物。将每个融合构建物循环进行了3-5次相转变，以获得纯的蛋白质。
对于所有的构建物，蛋白质/ELP融合体的产率高于ELP/蛋白质构建物的产率，但是这两个方向的产率之比取决于靶标蛋白的大小(表4)。在ELP/蛋白质方向，较小的蛋白质Trx和IL-1Ra所获得的产率显著高于较大蛋白质CAT和BFP。
表4：八个融合蛋白的产率、比活性和转变温度
Figure BDA00003043908500751
*产率已从50mL培养物外推到1L。
**对于Trx和CAT，比活性以U/mg进行测量，一个单位对应于每分钟转化1纳摩尔底物。BFP的比活性作为通过每mg蛋白质的荧光(A.U./μg)获得的积分面积来报道，IL-1Ra的活性作为EC50值(μg/mL)来测量。
***所有的融合蛋白浓度都是2μM，实验在PBS缓冲液中进行。
Trx/ELP和BFP/ELP与游离的未融合的靶标蛋白相比，没有观察到显著的活性变化(Trabbic-Carlson K，et al.Protein Eng.Des.Sel.2004，17：57-66；Meyer DE，Chilkoti A，Nat.Biotechnol.1999，17：1112-1115)，而CAT/ELP与游离的CAT相比显示出约15％的少量活性下降。之前发现，IL-1Ra/ELP活性与游离的IL-1Ra相比下降超过100倍，这是这些ELP融合蛋白所观察到的最大差异(Shamji，Setton etal.，已录用，在印)。
已按Holmgren(11.Holmgren A.，J.Biol.Chem.1979，254：9627-9632；Holmgren A.，Bjornstedt M.，Methods Enzymol.1984，107：295-300)的描述，通过胰岛素还原测定法测量了Trx在两个融合体构建物中的活性。在净(net)酶促反应中，胰岛素中的二硫键被还原，而NADPH被氧化成NADP+，这在340nm处进行光谱跟踪。在每个实验中在25℃下测量初始速度，并将其换算成比活性。对于三个纯化批次的每一个，都进行了三次的测定。表4中显示了两个融合构建物的比活性，单位为U/mg融合蛋白(Trx测定中的1U是每分钟转化1纳摩尔底物)。观察了两个Trx构建物之间的比活性的差异；ELP/Trx的比活性降低至Trx/ELP活性的约60％。
通过底物1-脱氧氯霉素的酶促乙酰化，测定了CAT与ELP在两个方向上的融合体的活性。活性是对三轮纯化的每一轮按一式三份进行了测量。剩余的底物和所形成的产物在测量它们的荧光强度前，先通过薄层层析进行分离。两个CAT构建物的比活性在表4中以U/mg报道，其中1U是每分钟转化1纳摩尔底物。这里可见ELP/CAT构建物的比活性与CAT/ELP相比降低了。观察到显著的降低，在ELP/CAT融合蛋白中只剩下约37％的活性(表4)。
IL-1Ra能与白细胞介素1(IL-1)竞争白细胞介素1受体，这个拮抗剂的效价通过细胞增殖测定进行测量，在该测定中活性IL-1Ra会抑制细胞的生长。将人外周血白细胞RPMI1788在存在和不存在IL-1Ra下生长了72小时，该IL-1Ra为ELP融合体的形式或者为未融合的形式，为市售的拮抗剂。通过CellTiter Gio测定测量了增殖情况。这两个融合体构建物的活性在表4中列出。与CAT和Trx一样，IL-1Ra也显示在ELP/蛋白质方向活性降低，IL-1Ra/ELP比ELP/IL-1Ra强效四倍。与未融合的IL-1Ra相比，游离的IL-1Ra的活性比IL-1Ra/ELP强约300倍(IL-1Ra的EC50为1.6ng/ml)。
BFP不是生物活性蛋白，但在近紫外区域会发荧光。荧光是蛋白质的三级结构的变化的灵敏度量，在这里用来评估两个BFP融合体构建物之间的结构差异。每个BFP构建物在385nm处激发后在430-600nm区间收集荧光光谱。将各曲线积分，面积用蛋白质质量进行归一化。结果在表4中列出。已将这些实验中使用的ELP/BFP从两个1L培养物生长，以获得与BFP/ELP在相同范围内的浓度供进行荧光测量。用蛋白质质量进行归一化后，两个BFP构建物之间没有观察到显著的荧光差异。
融合蛋白的转变温度(Tt)对可接近的(accessible)的表面积的疏水/亲水比敏感。除了BFP构建物之外，ELP/蛋白质构建物不如相反的融合体那么有活性，如果这个活性下降是由于主要结构变化所致，转变温度会改变。在350nm处从15-90℃跟踪了每个构建物的光密度变化，Tt是作为转变的中点导出(图4和表4)。每个融合蛋白的浓度为2μM，这样选定是因为一些ELP/蛋白质构建物的产率非常低。图4显示了PBS缓冲液中的2μM每个融合体构建物作为温度函数的浊度的增加：A.Trx/ELP(实心圆圈)、ELP/Trx(空心圆圈)、IL-1Ra/ELP(实心下三角)和ELP/IL-1Ra(空心下三角)，B.BFP/ELP(实心正方形)，ELP/BFP(空心正方形)、CAT/ELP(实心上三角)、ELP/CAT(空心上三角)。Tt作为每个转变曲线的中点计算，在表4中显示。
ELP/Trx和ELP/IL-1Ra的转变温度大于它们对应的蛋白质/ELP融合体。Trx构建物和IL-1Ra构建物分别相差5.6℃和2.8℃，而两个CAT构建物之间的差异几乎可以忽略(图4A和B，表4)。ELP/BFP显示一个转变，在62.4℃下形成大聚集体，而BFP/ELP构建物显示非常不同的模式；这个融合蛋白开始形成聚集体的温度几乎与ELP/BFP蛋白质相同，但随着温度的提高，聚集体发生解离，BFP/ELP构建物改为形成胶束样结构。形成胶束样结构的转变温度也是作为曲线的中点报道，在表4中作为BFP/ELP的第二转变温度给出。
所有八个构建物都通过反转变循环进行纯化，在反转变循环中，使融合蛋白经过由加入NaCl诱导的聚集相，然后进行离心步骤，最后将所获得的沉淀重悬在缓冲液中。ELP/蛋白质融合体在纯化过程后的最终产率低于它们各自的蛋白质/ELP构建物，但是较小的靶标蛋白具有较高的相对产率。较低的产率不是因为纯化过程中的明显损失所致，而是因为ELP/蛋白质的表达水平较低的结果，表达水平较低很可能是因为靶标蛋白在翻译过程中的错折叠所致。纯化的ELP/蛋白质据认为其折叠方式与靶标蛋白的天然折叠方式稍有不同；除了BFP外，在ELP/蛋白质方向的比活性都较低。另外，ELP/蛋白质构建物的测出的转变温度比蛋白质/ELP构建物稍高，同样BFP例外。转变温度取决于融合蛋白的疏水/亲水比，这表明ELP/蛋白质构建物发生了折叠，但不是以天然折叠方式发生折叠。
实施例9：
ELP1的半寿期
如下测定ELP1的药代动力学：给带有腿/侧腹FaDu异种移植物(xenograft)的裸鼠(Balb/c nu/nu)静脉内给予[14C]ELP1，在给予后不同时间间隔收集血液样品。血液浓度时程和血浆半寿期(初始t1/2α和终末t1/2β)在图5中显示。血液药代动力学显示出大分子的特征性分布和消除反应，这很好地由双指数过程来描述。
将图5中的血浆浓度时程曲线与二室模型的解析解拟合，以近似估计消除和分布反应(在图5中实线显示)，相关的药代动力学参数在表5中显示。ELP的分布体积(1.338μl)与1.363μl的假设血浆体积(Barbee，R.W.，et al.，Am.J.Physio.263(3)(1992)R728-R733)几乎相同，这表明ELP在给予后没有立即快速分布到或结合到特定的器官和组织。AUC是对中央室(central compartment)或血浆中的ELP的累积暴露的度量。身体清除率定义为身体中ELP相对于其血浆浓度的消除速度，是通过包括肾脏、肝脏和其他器官在内的所有器官的清除率的总和。这些药代动力学参数如长终末半寿期(t1/2β＝8.37hr)和低分布体积(即几乎等于血浆体积)，被认为有利于治疗药物递送到实体瘤和潜在的其他疾病部位。这是因为这些数值表明，ELP具有适于以类似于其他成功药物载体的方式开发EPR作用的特性(R.Duncan，Nat.Rev.Drug.Discov.2(5)(2003)347-360)。
表5：对[14C]ELP1计算的药代动力学参数
Figure BDA00003043908500791
传质速度常数来自标准的二室模型(k1，从中央室到外周室(peripheral compartment)；k2，从外周室到中央室；ke，从中央室的消除)。显示了分布体积(Vd)、中央室浓度时程曲线下面积(AUC)和身体清除率(ClB)。数据是以平均值显示(n＝5，例外的是Vd和初始血浆浓度(C0)是从n＝3的类似组(cohort)计算得到)。
实施例10：
ELP在裸鼠中的生物分布
14 C标记的ELP1-150和/或 14 C标记的ELP2-160
将14C标记的ELP1-150和/或14C标记的ELP2-160给予带有FaDu肿瘤的裸鼠(平均值±SD，n＝6)。在给予ELP后在41.5℃水浴中对肿瘤进行加热。在图6中可看到，在具有最高血液含量的器官中分布最高：肝脏、肾脏、脾脏和肺。
14 C标记的ELP2-[V 1 A 8 G 7 -160]
将14C标记的ELP2-[V1A8G7-160](Tt＞60℃)给予裸鼠以达到15μM的血浆浓度。在对位于裸鼠右后腿的植入FaDu肿瘤进行1小时加热(41℃)后，测定ELP浓度。数据以平均值加95％置信区间显示，N＝6。
结果在图7中以每克(g)组织注射剂量(ID)百分数对组织类型的柱图表示。ELP浓度在系统给予14C标记的ELP2-[V1A8G7-160]1.5小时后测量。在具有最高血液含量的器官看到最高分布：肝脏、肾脏、脾脏和肺。
******
在本文中已参照本发明的各具体方面、特征和示例性实施方案对本发明进行了说明，但应认识到本发明的应用并不因此受限，相反本发明的应用可延伸和涵盖本发明技术领域的普通技术人员根据本公开说明书会想到的众多其他变化方案、修改方案和另选实施方案。
因此，在权利要求书中提出权利要求的本发明要作广泛解释和说明，认为所有这些变化方案、修改方案和另选实施方案都包括在本发明的精神和范围内。
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Claims (22)

1.一种融合蛋白(FP)治疗组合物，所述FP治疗组合物包含与至少一个肽活性治疗剂偶联的至少一个弹性蛋白样肽(ELP)。
2.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP与肽活性治疗剂在其N末端或C末端共价键合。
3.权利要求1的FP治疗组合物，所述FP治疗组合物包含至少两个肽活性治疗剂，其中一个肽活性治疗剂在N末端与ELP共价键合，另一个肽活性治疗剂在C末端与ELP共价键合。
4.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述肽活性治疗剂相对于相应的不与ELP偶联的肽活性治疗剂来说其特征在于增强的体内功效。
5.权利要求4的FP治疗组合物，其中所述增强的体内功效包括选自以下的增强的特征：溶解性、生物利用度、生物不可利用度、有效治疗剂量、制剂相容性、蛋白水解抗性、给予的肽活性治疗剂的半寿期、给予后在身体内的持续性和给予后从身体的清除率。
6.权利要求1的FP治疗组合物，所述治疗组合物还包括在ELP和肽活性治疗剂之间的间隔序列部分。
7.权利要求6的FP治疗组合物，其中所述间隔序列部分选自：控制组合物的药代动力学的部分、蛋白酶不敏感性部分、非肽化学部分、凝血酶、Xa因子、血液蛋白酶、金属蛋白酶、组织蛋白酶、可连接到Lys的胺基团的同型双功能接头；可在一个末端与Cys连接、在另一个末端与Lys连接的异型双功能接头；和可将蛋白质连接到抗体的Fc区的双功能接头。
8.权利要求6的FP治疗组合物，其中所述间隔序列部分包含选自具有式[(Gly)n-Ser]m的非可切割间隔序列部分的部分，其中n为1-4，包括1和4；m为1-4，包括1和4。
9.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP包括重复肽序列，其中所述重复肽序列选自聚四肽、聚五肽、聚六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽。
10.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP包括多聚或寡聚重复单元，其中所述重复单元选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
11.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述肽活性治疗剂包括选自以下的蛋白质：胰岛素A肽、T20肽、干扰素α2B肽、烟草蚀纹病毒蛋白酶、小异型二聚体伴侣孤儿受体、雄激素受体配体结合结构域、糖皮质类固醇受体配体结合结构域、雌激素受体配体结合结构域、G蛋白αQ、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽、G蛋白αS、血管生长抑素、蓝色荧光蛋白、钙调蛋白、氯霉素乙酰转移酶、绿色荧光蛋白、白细胞介素1受体拮抗剂、萤光素酶、组织转谷氨酰胺酶、吗啡调节神经肽、神经肽Y、食欲肽-B、瘦蛋白、ACTH、降钙素、肾上腺髓质素、甲状旁腺激素、防御素和生长激素。
12.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP包含五肽Ile-Pro-Gly-X-Gly或Leu-Pro-Gly-X-Gly的寡聚重复单元，其中X为任何天然或非天然氨基酸残基，且其中X任选在各多聚或寡聚重复单元之间有变化。
13.权利要求12的融合蛋白，其中所述多聚或寡聚重复单元的X成分包含一个或多个选自以下的氨基酸残基：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸残基。
14.一种融合基因治疗组合物，所述融合基因治疗组合物包括编码包含与至少一个弹性蛋白样肽(ELP)偶联的至少一个肽活性治疗剂的融合蛋白的核苷酸序列。
15.权利要求14的融合基因治疗组合物，其中所述核苷酸序列可操作地连接到表达控制元件。
16.权利要求15的融合基因治疗组合物，其中所述表达控制元件包含启动子。
17.一种增强肽活性治疗剂的体内功效的方法，所述方法包括将所述肽活性治疗剂与至少一个弹性蛋白样肽(ELP)偶联以形成融合肽治疗组合物，其中所述肽活性治疗剂相对于相应的不与ELP偶联的肽活性治疗剂来说其特征在于增强的体内功效。
18.权利要求17的方法，其中所述增强的体内功效是所述肽活性治疗剂对抗蛋白水解降解的稳定化作用。
19.权利要求17的方法，其中所述增强的体内功效是所述肽活性治疗剂的提高的生物利用度。
20.一种治疗需要肽活性治疗剂的受试者的方法，所述方法包括给予所述患者包括以下的治疗组合物：(i)所述与至少一个ELP偶联的肽活性治疗剂，或者(ii)编码包含所述肽活性治疗剂和至少一个ELP的融合蛋白的、可操作地连接到其表达控制元件的核苷酸序列。
21.一种治疗剂剂型，其中所述治疗剂与ELP缀合。
22.权利要求20的治疗剂剂型，所述剂型适于口服或胃肠外给予。
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