KR101759122B1

KR101759122B1 - 오렉신 a를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101759122B1
Application number: KR1020150111322A
Authority: KR
Inventors: 송대규; 박재형; 황미열; 송승은; 신수경
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2015-08-07
Publication date: 2017-07-18
Also published as: KR20170017434A

Abstract

본 발명은 오렉신 A를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 오렉신 A는 혈당이 낮은 경우에 렙틴의 분비를 촉진하여 인슐린의 분비를 감소시킴으로서 저혈당을 방지하는 효과를 나타낸다. 따라서 오렉신 A와 당뇨병 치료제인 혈당강하제 또는 인슐린제제를 병용 투여하여 혈당강하제 또는 인슐린제제에 의해 나타나는 부작용인 저혈당을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

오렉신 A를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising orexin A for treating of diabetes}

본 발명은 오렉신 A를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

당뇨병이란 높은 혈당 수치가 오랜 기간 지속되는 대사 질환군을 말하는 것으로(세계 보건 기구. 2015), 췌장의 랑게르한스섬에서 분비되는 인슐린이 모자라거나 성능이 떨어지게 되면 체내에 흡수된 포도당이 이용되지 못해 혈액 속에 쌓여 소변으로 넘쳐 나오게 되는 병적인 상태를 일컫는다(David G. G. et al., 2011). 당뇨병을 치료하지 않으면 당뇨병케톤산증, 고혈당성 혼수(Kitabachi, A. E. et al., 2009), 심혈관질환, 고혈압, 뇌졸중, 만성신부전, 당뇨병성 궤양, 당뇨망막병(WHO, 2013) 등과 같은 합병증을 유발한다.

당뇨병은 통상 세 가지로 나누어진다. 첫 번째가 제1형 당뇨병으로 충분한 인슐린을 만들어내지 못하는 것에 기인한다. 두 번째로 제2형 당뇨병은 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 못하는 인슐린 저항으로 시작된다. 또한 병이 진행되면서 인슐린 부족이 발생할 수도 있다. 세 번째로는 임신당뇨병으로 당뇨병의 병력이 없는 임신한 여성이 고혈당으로 발전하는 경우에 발병한다(WHO, 2013).

2014년에는 세계적으로 약 3억 8천여 명의 당뇨병 환자가 존재하였으며(국제 당뇨병 연맹, 2015), 제2형 당뇨병이 90%를 차지했다. 이는 성인 인구의 8.3%에 해당된다(Shi, Y. et al., 2014). 2012년부터 2014년까지, 매년 당뇨병으로 사망한 사람은 150만에서 490만에 이르는 것으로 추정되었다(세계 보건 기구, 2013; 국제 당뇨병 연맹, 2015). 당뇨병 환자는 2035년 5억 9천여 만 명에 이를 것으로 예측되며, 세계적으로 당뇨병에 드는 경제적 비용은 6,120억 달러에 이를 것으로 추정되었다(국제 당뇨병 연맹, 2015). 실제로 2012년 미국에서는 당뇨병에 드는 비용이 2,450억 달러에 달했다(American Diabetes, Association, 2013).

당뇨병 관리의 가장 기본은 혈당을 조절하는 것으로 운동요법이나 식사요법을 통해 혈당을 조절한다. 이러한 방법으로 혈당이 조절되지 않는 경우에는 약물요법을 시작한다. 제1형 당뇨병의 경우에는 인슐린 주사로 관리된다(WHO, 2013). 제2형 당뇨병은 경구 혈당강하제나 인슐린의 투약으로 관리된다(김동림, 2012). 표 1에서는 현재 사용 가능한 혈당강하제들의 특징을 보여주고 있다. 혈당강하제는 그 작용 기전에 따라 크게 다섯 가지로 나뉜다. 첫째는 베타 세포로부터 인슐린 분비를 직접 자극하는 설포닐우레아(sulfonylurea)계, 둘째는 간에서 포도당 합성을 억제하는 비구아니드(biguanide)계, 셋째는 장에서 포도당 흡수를 억제하는 알파-글루코시다아제 억제제(α-glucosidase inhibitor)계, 넷째로 말초의 인슐린 저항을 개선시키는 티아졸리딘디온(thiazolidinedione)계, 다섯째로 인크레틴(incretin) 효과를 증가시키는 GLP(glucagon-like peptide)-1 작용제, DPP(dipeptidyl peptidase)-Ⅳ 억제제 등이 있다(당뇨병 진료지침위원회, 2011).

표 1. 혈당강하제

혈당강하제나 인슐린은 투약시 부작용으로 저혈당(hypoglycemia)이 나타날 수 있다(강양교, 2006). 저혈당은 여러 가지 원인에 의하여 혈당이 정상 수치 이하로 감소함으로써, 신체 기관에 공급되는 포도당의 양이 감소하여 다양한 증상을 나타내는 상태를 일컫는다.

저혈당이 발생하면 뇌와 신경기관에 공급되는 포도당이 부족해지고, 뇌 신경계는 에너지 부족을 느끼게 되어 신체의 자율신경계를 작동시키게 된다. 그 결과로 현기증, 피로감이 발생할 수 있고, 심해지면 간질 발작과 의식 소실이 발생할 수 있으며 사망할 수도 있다. 또한 저혈당을 극복하기 위해 아드레날린이 분비됨으로 인해 혈압 상승, 맥박수 증가, 가슴 두근거림, 떨림, 불안감이 발생하고, 부교감 신경의 작용으로 식은땀, 공복감, 이상 감각 등이 발생할 수 있다. 저혈당증을 방치하였을 경우 단기간에 뇌의 손상을 일으키고 생명을 위협할 수 있는 심각한 질환이다(강양교, 2006).

오렉신(orexin)은 하이포크레틴(hyphocretins)로 불리기도 하며 시상하부(hypothalamus)에 존재하는 극히 적은 수의 뉴런에 의해 만들어진다. 초기에는 섭식(feeding)의 조절 기능을 가진 것으로 생각되었으나(Sakurai T. et al., 1998) 수면과 각성의 조절(Higuchi S. et al., 2002), 보상과 중독, 우울증의 병리에도 관여한다는 것이 추가적으로 밝혀졌다(신현성 et al., 2009).

오렉신은 A와 B, 2종류가 존재하며 주로 음식 섭취와 에너지 항상성 유지에 중요한 역할을 담당하는 시상하부에서 생성되는 신경 펩타이드이다(Sakurai T. et al., 1998). 오렉신 A는 33개의 아미노산으로 이루어졌고, 오렉신 B는 선형의 28개 아미노산 펩타이드로 이루어져 있다. 오렉신은 GPCR(G-protein coupled receptor)인 오렉신 수용체(orexin receptor, OXR) 1과 2를 통해 작용한다. 오렉신 수용체 1은 오렉신 B에 비해 오렉신 A에 대한 친화력이 높은 반면에 오렉신 수용체 2는 두 오렉신에 비슷한 친화력으로 결합한다(Sakurai T. et al., 1998).

오렉신이 음식 섭취를 자극하는 것과 대조적으로 아디포카인(adipokine)인 렙틴(leptin)은 음식 섭취와 인슐린 분비에 영향을 주어 음식 소비를 억제한다. 즉, 렙틴은 인슐린 분비를 억제하고, 오렉신은 인슐린의 분비를 증가시킨다. 이를 통해 렙틴과 오렉신 간에 높은 관련성이 있음을 예측할 수 있다.

또한, 최근의 연구에서 오렉신이 인슐린의 분비와 혈액 내 글루코스 수준에 영향을 준다는 결과들이 발표되었다(Ehrstrom, M. et al., 2004; Tsuneki, H. et al., 2002; Switonska, M. M. et al., 2002; Nowak, K. W. et al., 2000; Goncz, E. et al., 2008). 이를 통해 오렉신이 글루코스 항상성과 에너지 대사의 조절에서 중요한 역할을 할 것으로 예측할 수 있다.

한편 한국공개특허 제2010-0056517호에서는 오렉신 A의 펩타이드를 함유하는 자가면역질환, 섬유성 질환, 염증성 질환, 신경 변성 질환, 감염성 질환, 폐질환, 심장 혈관 질환 및 대사성 질환의 치료 및/또는 예방용 약제학적 조성물을 개시하고 있다. 한국 한국공개특허 제2007-0010161호에서는 사람에서 정신분열증과 관련된 인식기능 이상 및 당 조절 이상을 치료하는 방법으로, 오렉신 효능제를 추가 활성 성분으로 하여, 이의 치료학적 유효량을 투여하여 당 조절 이상을 치료하는 방법에 대해서 개시하고 있다.

이에 본 발명자는 오렉신 A가 혈액 내 글루코스의 양이 많아지면 인슐린의 분비를 촉진하고, 글루코스의 양이 적어지면 렙틴의 분비를 촉진하여 인슐린 분비를 저해함으로써 혈당이 낮아지는 것을 방지한다는 것을 밝힘으로서 발명을 완성할 수 있었다.

한국공개특허 제2010-0056517호, 치료제로서의 펩티드의 용도, 2010년 5월 27일 공개. 한국공개특허 제2007-0010161호, 정신분열증 및/또는 당조절 이상 치료용 약제학적 조성물, 2007년 1월 22일 공개.

강양교, 제2형 당뇨병환자의 저혈당 대처방안에 대한 조사, 32차 대한당뇨병학회 추계학술대회, 2006. 국제 당뇨병 연맹, Update 2014, 2015. 김동림, 제2형 당뇨병의 약물 치료, 건국대학교 병원 KRC, 2012. 당뇨병 진료지침위원회, 당뇨병의 관리: 당뇨병치료제 경구약제와 GLP-1 analogue, 진료지침, 당뇨병 학회, 62-71, 2011. 신현성 et al., 오렉신의 뇌신경망 조절 기능과 역할, 생화학분자생물학 뉴스, 3월호, 1-6, 2009. 세계 보건 기구, "About diabetes". 2015. 세계 보건 기구, The top 10 causes of death Fact sheet Nㅀ310, 2013. American Diabetes, Association, Economic costs of diabetes in the U. S. in 2012, Diabetes Care, 36(4), 1033~1046, 2013. David, G. G. et al., Greenspan's basic & clinical endocrinology, 뉴욕: McGraw-Hill Medical, 9판, 2011. Ehrstrom, M. et al., Pharmacokinetic profile of orexin A and effects on plasma insulin and glucagon in the rat, Regulatory peptides, 119, 209-212, 2004, Goncz, E. et al., Orexin-A inhibits glucagon secretion and gene expression through a Foxo 1-dependent pathway, Endocrinology, 149, 1618-1626, 2008. Higuchi, S. et al., Plasma orexin-A is lower in patients with narcolepsy. Neuroscience letters, 318, 61-64, 2002. Kitabachi, A. E. et al., Hyperglycemic crises in adult patients with diabets, Diabetes care, 32(7), 1335-1345, 2009. Nowak, K. W. et al., Acute orexin effects on insulin secretion in the rat: in vivo and in vitro studies, Life science, 66, 119-454, 2000. Sakurai, T. et al., Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior, Cell, 92, 573-585, 1998. Shi, Y. et al., The global implications of diabetes and cancer, The Lancet, 383(9933), 1947~1948, 2014. Switonska, M. M. et al., Orexin and adipoinsular axis function in the rat, Regulatory peptides, 104, 69-73, 2002. Tsuneki, H. et al., Reduction of blood glucose level by orexins in fasting normal and streptozotocin-diabetic mice, Eur. J. Pharmacol., 448, 245-252, 2002. WHO, Diabetes Fact sheet Nㅀ312, 2013.

본 발명의 목적은 오렉신 A를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 당뇨병 치료용 약학 조성물은 i) 오렉신 A 및 ii) 혈당강하제 또는 인슐린제제를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물일 수 있다.

상기 혈당강하제는 설포닐우레아(sulfonylurea)계 제제 및 메글리티니드(meglitinide)계 제제일 수 있다.

또한, 본 발명은 혈당강하제 또는 인슐린제제로 당뇨병 치료 시 나타나는 부작용인 저혈당을 방지할 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 오렉신 A를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, i) 오렉신 A 및 ii) 혈당강하제 또는 인슐린제제를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 오렉신 A는 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.

상기 혈당강하제는 설포닐우레아계 제제 및 메글리티니드계 제제일 수 있으며, 설포닐우레아계 제제는 글리클라자이드(gliclazide), 글리플리자이드(gliplizide), 글리메피리드(glimepiride) 및 글리벤클라마이드(glibenclamide)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택할 수 있고, 메글리티니드계 제제는 레파글리니드(repaglinide), 나테글리니드(nateglinide) 및 미티글리니드(mitiglinide)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택할 수 있다.

또한, 상기 인슐린제제는 아연이슐린, 프로타민아연인슐린, 글로빈아연인슐린, 이소판인슐린으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 오렉신 A를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 오렉신 A를 함유하는 당뇨병 치료용 약학 조성물은 혈당강하제나 인슐린제제로 당뇨병 치료 시 나타나는 부작용인 저혈당을 방지할 수 있다.

상기 오렉신 A는 혈당이 낮아지면 렙틴의 분비를 촉진하여 인슐린 분비를 억제시킴으로서 저혈당의 위험을 줄 일 수 있다.

도 1은 정상적인 마우스에 본 발명의 오렉신 A와 글루코스를 주입하여 시간에 따른 혈액 내 오렉신 A(도 1a), 글루코스(도 1b), 인슐린(도 1c) 및 렙틴(도 1d)의 양을 확인한 결과를 나타낸다. 그래프에서 검은색 원은 대조군을, 흰색 원은 오렉신 A를 투여한 결과를 나타낸다.
도 2는 당뇨병이 유도된 마우스에 본 발명의 오렉신 A와 글루코스를 주입하여 시간에 따른 혈액 내 글루코스(도 2a), 인슐린(도 2b) 및 렙틴(도 2c)의 양을 확인한 결과를 나타낸다. 그래프에서 검은색 원은 대조군을, 흰색 원은 오렉신 A를 투여한 결과를 나타낸다.
도 3은 혈액 내 글루코스의 양에 따라 오렉신 A가 인슐린 및 렙틴의 분비량을 조절하는 기작을 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 실험 동물>

실험에 이용한 C57BL/6 마우스를 낮 12시간/밤 12시간의 사이클 및 지방에서 10%, 탄수화물에서 70% 및 단백질로부터 20%의 칼로리를 제공하는 정상적인 음식을 공급함으로써 관리하였다.

제2형 당뇨병 모델을 유도하기 위해 5주된 C57BL/6 마우스에 지방에서 60%, 탄수화물에서 20% 및 단백질로부터 20%의 칼로리를 제공하는 고지방식 음식을 8주 동안 공급하였다.

<실시예 2. 정상적인 마우스에서의 복강 내 당 내성 시험>

정상적인 마우스를 이용하여 복강 내 당 내성 시험을 수행하였다.

실험에 들어가기 12시간 전에 마우스를 금식 시켰다. 마우스에 16m㏖/㎏의 오렉신 A 또는 0.2㎖의 염분을 주사하였다. 이때 염분은 대조군으로 사용하였다. 오렉신 A 또는 대조군을 주입하고 30분 후에 500㎎/㎏가 되도록 글루코스를 복강 주사하였다. 글루코스 주입 후 0분 내지 240분 사이에 꼬리 혈액 샘플을 채취하였다.

채취한 혈액으로부터 혈장(plasma)을 분리하고, 혈액 내 글루코스의 양과 혈장 내 인슐린, 렙틴 및 오렉신 A의 양을 측정하였다. 글루코스, 인슐린, 렙틴 및 오렉신 A의 양은 ELISA 키트를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에서 보여주듯이, 오렉신 A를 복강으로 주입한 경우(흰색 원)에는 혈액 내 오렉신 A(도 1a)의 양이 20분 후부터 증가되는 것을 볼 수 있다. 이와 반대로 대조군의 경우(검은색 원) 오렉신 A의 혈액 내 양의 변화가 크지 않는 것으로 나타났다. 글루코스(도 1b)의 경우에는 오렉신 A 및 대조군에서 글루코스 주입에 따라 혈당이 빠르게 증가하다가 감소하는 것을 볼 수 있으며, 오렉신 A 투여군에서 혈당 증가가 초기에 적게 나타났다. 반대로 60분이 경과 한 경우에는 혈액 내 글루코스의 양이 오렉신 A를 투여한 경우 일정하게 유지되는 것과 달리 대조군에서는 글루코스가 지속적으로 감소하는 것을 관찰 할 수 있다. 이와 관련하여 인슐린(도 1c)의 경우도 글루코스의 증가에 따라 인슐린의 분비가 증가하는 것을 알 수 있으며, 특히나 오렉신 A를 주입한 경우에 대조군에 비해 인슐린의 분비가 더 많이 분비되었고, 60분이 경과하고 나서는 오렉신 A를 투여한 경우 인슐린의 양이 지속적으로 감소하는 반면, 대조군의 경우에는 인슐린이 일정량 유지되는 것을 알 수 있다. 렙틴(도 1d)의 경우에는 오렉신 A와 글루코스를 투여하고 나서 60분이 경과한 경우 렙틴의 양이 대조군에 비해 높게 나타나는 것을 알 수 있다.

이를 통해 오렉신 A가 혈액 내 당이 높은 경우 인슐린의 분비를 촉진시키고, 당이 낮아지면 렙틴의 분비를 촉진하여 인슐린의 분비를 억제함으로써 혈당이 낮아지는 것을 방지한다는 것을 알 수 있다.

<실시예 3. 당뇨병 유도 마우스에서의 복강 내 당 내성 시험>

당뇨병 유도 마우스를 만들기 위해 5주가 된 C57BL/6 마우스에, 60%는 지방이고, 20%는 탄수화물 이며, 20%는 단백질로 이루어진 고지방식을 8주 동안 섭취하도록 하였다.

채취한 혈액으로부터 혈장(plasma)을 분리하고 혈액 내 글루코스의 양과 혈장 내 인슐린 및 렙틴의 양을 측정하였다. 글루코스, 인슐린 및 렙틴의 양은 ELISA 키트로 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보여주듯이, 오렉신 A를 주입한 경우(흰색 원)에는 복강내 당부하에 의한 혈액 내 글루코스(도 2a)의 양이 덜 증가하였다 감소하는 것을 알 수 있다. 인슐린(도 2b)의 경우에는 오렉신 A를 투여한 경우 인슐린의 분비가 더 많이 이루어지고, 60분이 경과한 이후 대조군에 비해 오렉신 A를 투여한 경우 인슐린의 양이 더 감소한 것을 볼 수 있다. 렙틴(도 2c)의 경우에는 글루코스 투여 후 60분 정도까지는 대조군과 오렉신 A 투여한 경우에는 렙틴의 양이 비슷하게 분비가 되었으나, 60분이 경과하면 오렉신 A를 투여한 경우에는 렙틴의 양이 대조군에 비해 많은 것을 알 수 있으며, 대조군은 지속적으로 감소하는 반면, 오렉신 A를 투여한 경우에는 렙틴의 양이 일정하게 유지되는 것을 알 수 있었다.

이를 통해 당뇨 유도 모델에서도 오렉신 A가 혈액 내 인슐린의 분비를 촉진시키고, 당이 낮아지면 렙틴의 분비를 촉진하여 인슐린의 분비를 억제함으로써 혈당이 낮아지는 것을 방지한다는 것을 알 수 있다.

실시예 2 및 3을 통해, 도 3에서 보여주듯이, 혈액 내 글루코스의 양이 많은 경우 오렉신 A가 인슐린의 분비를 증가시키고, 인슐린에 의해 글루코스의 양이 적어지면 렙틴의 분비를 촉진시켜 인슐린의 분비를 억제함으로써 혈액 내 글루코스가 지속적으로 떨어져 저혈당이 되는 것을 방지하는 것을 알 수 있다.

<실시예 4. 독성실험>

실시예 4-1. 급성독성

본 발명의 오렉신 A를 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군은 10마리, 실험군은 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 아무것도 투여하지 않았으며, 실험군은 본 발명의 오렉신 A를 2.0g/㎏(일반적인 동물실험에서 사용되는 양의 50배 정도)의 농도로 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2.0g/㎏ 농도의 본 발명의 오렉신 A를 투여한 실험군에서 마우스가 모두 생존하였다.

실시예 4-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 오렉신 A를 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<실험예 1. 혈당강하제에 의한 저혈당 방지 효과>

오렉신 A와 혈당강하제를 병용 투여할 경우 오렉신 A에 의한 저혈당 방지 효과를 확인하기 위해 수행하였다. 이때, 혈당강하제로는 글리메피리드를 이용하였다.

실험을 위해 당뇨병 유도 마우스를 이용하였다. 실험에 들어가기 12시간 전에 마우스를 금식 시켰다. 마우스에 16m㏖/㎏의 오렉신 A 단독 또는 오렉신과 혈당강하제 혼합액을 주사하였다. 오렉신 A를 주사하고 30분 후에 글루코스를 500㎎/㎏가 되도록 복강 주사하였다. 글루코스 주입 후 0분 내지 240분 사이에 꼬리 혈액 샘플을 채취하였다.

채취한 혈액으로부터 혈장(plasma)을 분리하고 혈액 내 글루코스의 양과 혈장 내 인슐린 및 렙틴의 양을 측정하였다. 글루코스, 인슐린 및 렙틴의 양은 ELISA 키트로 측정하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

글루코스 (m㏖/ℓ)
시간 (분)	대조군(염분)	글리메피리드	오렉신 A	오렉신 A + 글리메피리드
0	5.02±0.32	5.32±0.31	5.53±0.32	5.11±0.25
30	11.37±0.74	7.84±0.53	8.84±0.62	6.78±0.43
60	8.15±0.61	5.87±0.55	6.27±0.43	5.74±0.50
120	4.97±0.41	4.21±0.21	5.51±0.28	5.31±0.32
240	3.56±0.31	3.17±0.42	5.17±0.36	5.12±0.34

인슐린 (ng/㎖)
시간 (분)	대조군(염분)	글리메피리드	오렉신 A	오렉신 A + 글리메피리드
0	0.46±0.08	0.42±0.09	0.41±0.07	0.43±0.09
30	1.41±0.15	2.01±0.10	1.86±0.16	2.11±0.12
60	0.88±0.10	1.77±0.15	1.06±0.10	1.32±0.10
120	0.61±0.08	1.54±0.07	0.48±0.09	0.97±0.05
240	0.56±0.09	1.22±0.08	0.20±0.08	0.64±0.07

렙틴 (ng/㎖)
시간 (분)	대조군(염분)	글리메피리드	오렉신 A	오렉신 A + 글리메피리드
0	62.82±1.93	62.71±1.97	62.72±2.21	62.78±2.02
30	74.82±2.92	75.02±3.34	75.30±3.43	75.14±2.71
60	73.31±3.25	73.54±3.15	74.06±2.95	74.15±1.84
120	62.68±2.66	62.86±3.43	73.92±4.13	73.88±3.26
240	62.35±2.73	62.56±3.56	73.78±3.52	73.57±2.83

상기 표 1의 결과를 참고하면, 오렉신 A와 글리메피리드를 동시에 처리한 경우, 혈액 내 글루코스의 양이 시간에 따라 감소하다가 일정 수준이 유지되는 것을 알 수 있다. 반면 글리메피리드만을 처리한 경우에는 글루코스의 양이 시간에 따라 지속적으로 감소되는 것을 통해 오렉신 A가 글리메피리드에 의한 글루코스의 지속적인 감소를 방지하는 것을 알 수 있다. 이는 오렉신 A가 글리메피리드에 의한 시간에 따른 인슐린과 렙틴의 분비를 조절하는 것을 통해 알 수 있다. 따라서, 오렉신 A가 혈당강하제 및 인슐린에 의해 나타날 수 있는 저혈당 예방 효과가 우수함을 알 수 있다.

< 실험예 2. 인슐린제제에 의한 저혈당 방지 효과>

오렉신 A와 인슐린제제를 병용 투여할 경우 오렉신 A에 의한 저혈당 방지 효과를 확인하기 위해 수행하였다. 이때 인슐린제제로는 이소판인슐린을 이용하였다.

실험을 위해 당뇨병 유도 마우스를 이용하였다. 실험에 들어가기 4시간 전에 마우스를 금식 시켰다. 마우스에 인슐린제제(0.5 mU/g BW) 단독 혹은 16m㏖/㎏의 오렉신 A와 인슐린제제(0.5 mU/g BW) 혼합액을 주사하였고, 주입 후 0 내지 240분 사이에 꼬리 혈액 샘플을 채취하였다.

채취한 혈액으로부터 혈장(plasma)을 분리하고 혈액 내 글루코스의 양과 혈장 내 렙틴의 양을 측정하였다. 글루코스 및 렙틴의 양은 ELISA 키트로 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

글루코스 (m㏖/ℓ)
시간 (분)	이소판인슐린	오렉신 A + 이소판인슐린
0	6.10±0.30	6.08±0.28
30	10.01±0.62	9.78±0.54
60	7.94±0.42	8.44±0.37
120	6.25±0.30	7.01±0.22
240	5.88±0.29	6.45±0.31

렙틴 (ng/㎖)
시간 (분)	이소판인슐린	오렉신 A + 이소판인슐린
0	56.60±2.19	57.67±2.35
30	82.41±3.59	88.49±4.11
60	85.21±4.77	80.17±5.01
120	69.42±3.33	76.01±2.99
240	54.69±4.91	73.85±5.16

상기 표 2의 결과를 참고하면, 당뇨병이 있는 경우에, 오렉신 A와 이소판인슐린을 동시에 처리하면, 혈액 내 글루코스의 양이 시간에 따라 감소하다가 일정 수준이 유지되는 것을 알 수 있다. 반면 이소판인슐린만을 처리한 경우에는 글루코스의 양이 시간에 따라 지속적으로 감소되어 저혈당이 나타날 수 있음을 보여준다. 이는 실험예 1에서 얻은 결과와 동일하게 오렉신 A가 이소판인슐린에 의한 시간에 따른 인슐린과 렙틴의 분비를 조절함으로써 저혈당을 예방 할 수 있음을 보여주고 있다.

Claims

i) 오렉신 A;
ii) 혈당강하제 또는 인슐린제제;
를 함유하는 혈당강하제 또는 인슐린제제로 당뇨병 치료 시 나타나는 부작용인 저혈당 방지용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혈당강하제는 설포닐우레아계 제제 및 메글리티니드계 제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료 시 나타나는 부작용인 저혈당 방지용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 설포닐우레아계 제제는 글리클라자이드, 글리플리자이드, 글리메피리드 및 글리벤클라마이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료 시 나타나는 부작용인 저혈당 방지용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 메글리티니드계 제제는 레파글리니드, 나테글리니드 및 미티글리니드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료 시 나타나는 부작용인 저혈당 방지용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인슐린제제는 아연이슐린, 프로타민아연인슐린, 글로빈아연인슐린, 이소판인슐린으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료 시 나타나는 부작용인 저혈당 방지용 약학 조성물.
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