KR100860561B1 - 컴파운드 ｋ 및 메트포민을 유효성분으로 포함하는당뇨병의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 컴파운드 K 및 메트포민을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 컴파운드 K 및 메트포민을 병용 투여함으로써 당뇨병 치료 효과를 상승시킬 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 혈중 포도당 농도를 감소시키고, 인슐린 저항성을 개선하며 포도당 업테이크 관련 유전자의 발현을 증가시키고 간 조직에서 중성지방의 축적을 억제하는 활성이 우수하므로 당뇨병의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.
컴파운드 K, 메트포민, 당뇨병
Description
도 1은 컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 GLUT4 유전자 및 PPARγ 유전자 발현을 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 2는 컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 간 조직의 변화를 헤마토자일린 & 에오신(hematoxylin & eosin) 염색으로 확인한 사진이다.
본 발명은 컴파운드 K 및 메트포민을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 컴파운드 K 및 메트포민을 병용 투여함으로써 당뇨병 치료 효과를 상승시킬 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 만성 대사성 질환으로 오랜 시간이 경과함에 따라 혈관장애와 신경, 신장 및 망막 등의 기능이상을 초래하고 이로 인해 생명까지 잃게 하는 질환이다. 당뇨병은 크게 발생하는 기전에 따라 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 구분된다.
인슐린 의존형 당뇨병은 췌장 베타세포가 선택적으로 손상 또는 파괴되어 체내에서 인슐린을 생성하지 못하기 때문에 혈중 포도당을 소비하지 못하여 발병하는 것으로 알려져 있으며, 심한 고혈당증과 케톤산증, 다갈, 다음, 다뇨, 체중감소 및 피로감을 나타낸다. 소아에서 흔히 발생하게 되며 이의 치료방법은 인슐린의 투여이다.
인슐린 비의존형 당뇨병은 당뇨병 환자의 90% 이상을 차지하며 주로 성인에게서 발생한다. 뚜렷한 원인은 규명되지 않았으며 다만 유전적인 요인과 비정상적인 식생활, 스트레스, 운동, 비만, 노화 등과 같은 환경적인 요인에 의한 췌장 베타 세포의 인슐린 분비 저하 또는 간, 근육, 지방 등의 조직에서의 인슐린 저항성 증가가 복합적으로 관련되어 유발되는 것으로 추정되고 있다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병은 일반적으로 인슐린에 대하여 저항성을 나타내며 인슐린의 작용부전으로 인하여 과혈당 상태가 지속되는 것이 보통이다. 만성적 고혈당은 췌장 베타 세포에 손상을 일으켜 세포 사멸을 야기하므로 제2형 당뇨병의 치료를 위해서는 효과적인 혈당의 조절이 매우 중요하다.
현재 인슐린 비의존형 당뇨병의 치료법으로는 식사요법, 운동요법, 약물요법 등이 있다. 당뇨병 치료에 사용되고 있는 약물로는 탄수화물의 소화를 제한하여 식후 혈당 조절제로서 알파글루코시데이즈 억제제인 아카보즈, 인슐린분비 촉진제인 설포닐우레아, 레파글리나이드, 나테글리나이드, 그리고 인슐린 저항성 개선제인 비구아니드, PPARg 아고니스트(agonist)로써 인슐린 작용을 증가시키는 글리타존 계열의 약물이 임상에 적용되고 있다. 하지만 이들은 복부팽만감, 설사, 저혈당, 체중증가 등 그 부작용이 만만치 않아 부작용은 적고 약효는 우수한 경구용 혈당강하제의 개발이 요구되고 있다. 최근에는 복잡한 병인을 가지고 있는 2형 당뇨의 치료를 위해서 이미 서로 다른 작용 기전을 갖는 약물이 복합적으로 사용되고 있다.
인삼의 생리 활성 물질인 진세노사이드 중 디올(diol)계 진세노사이드는 인슐린 분비 촉진 작용, 트리올(triol)계 진세노사이드는 인슐린 저항성 개선 작용이 있다고 보고 된 바 있다. 예를 들면, 대한민국특허 출원 제2005-93860호에는 진세노사이드 R1을 유효성분으로 함유하는 혈당강하제가 개시되어 있으며, 대한민국특허 출원 제2005-22781호에는 천연물 유래 진세노사이드 RG3, RG5 및 RK1을 포함하는 당뇨 또는 혈당조절 이상의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있다. 한편, 컴파운드 K(IH-901)는 디올계(diol) 진세노사이드의 장내 대사체로 인삼 자체에는 존재하지 않으며 암세포 전이 억제작용, 암세포 괴사 유도작용 및 면역증강작용 등의 약리 활성이 있는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 인슐린 분비 장애와 인슐린 저항성을 동시에 지니고 있 는 제 2형 당뇨 환자에서 뛰어난 치료 효능을 나타내면서 부작용이 적은 약제를 개발하고자 연구하던 중, 상기 컴파운드 K 및 메트포민(metformin)의 복합물을 투여함으로써 각각의 약제를 단독으로 투여한 경우에 비해 항당뇨 활성이 크게 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 컴파운드 K 및 메트포민을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 컴파운드 K 및 메트포민을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분 중 하나인 컴파운드 K는 디올계 진세노사이드의 장내 대사체이며, 하기 화학식 1로 표시되는 20(S)-프로토파낙사다이올-20-0-베타-디-글루코피라노사이드를 말한다.
인삼 특유의 약리활성 사포닌인 진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리테르페노이드인 프로토파낙사다이올 또는 프로토파낙사트라이올에 글루코스, 람노스, 아라비노스 또는 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물들로서 현재까지 고려인삼에서 약 30여종의 유도체들이 밝혀져 있다. 또한 인삼 사포닌은 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합위치에 따라 약리효능이 각각 다르다는 것이 이미 밝혀져 있으며, 인삼 중 함량이 많고 분리하기가 용이한 주요 사포닌의 약리효능에 대해서는 많은 연구가 수행되었으나, 미량 사포닌의 약리효능에 관한 연구는 극히 적은 편이다.
한편, 디올계 인삼사포닌을 경구 투여하게 되면 장내세균, 특히 프리보텔라리스(Prevotellaris)에 의해 대사되어 흡수되며 이들 대사산물이 인삼 사포닌의 약효를 나타내는 체내 매개물로 규명된 바 있다(The Ginseng Review 10, Kobayashi 등, 1994년). 이 중에서 컴파운드 K는 효능실험을 통하여 면역증강작용, 종양혈관신생억제작용 및 암세포침윤 억제작용 등 여러 가지 유효한 효능이 있는 것으로 규명된 바 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 컴파운드 K는 상업적으로 구입하여 사용하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 당업계에 공지된 컴파운드 K의 제조 방법으로는 진세노사이드를 기질로 하여 프리보텔라오리스라는 장내세균을 이용한 방법(Planta Med 62, 453-457, 1996) 및 나린지나아제, 펙티나아제, 셀룰라제, 비스코자임 및 베타-갈락토시다아제와 같은 효소를 이용한 방법(대한민국특허 제418604호, 대한민국특허 제403570호 및 대한민국특허 377546호) 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 (주)일화에서 제공하는 컴파운드 K를 사용하였다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 또 다른 유효성분인 메트포민은 당업계에 공지된 혈당 강하제이다. 본 발명에서 메트포민은 메트포민 염기, 또는 약물학적으로 허용가능한 이들의 염, 예를 들면 메트포민 하이드로클로라이드일 수 있다. 메트포민 하이드로클로라이드는 현재 미국 브리스톨마이어(Bristol-Myers Squibb Co.)사에서 GLUCOPHAGE 라는 상품명으로 정제(tablet) 형태로 시판되고 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 컴파운드 K 및 메트포민이 단일 조성물(single composition)의 형태 또는 개별 조성물(separate composition)의 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 컴파운드 K 및 메트포민을 포함하는 약학적 조성물에 있어 서, 상기 각 성분은 동시에(simultaneous), 개별적(separate) 또는 순차적(sequent ial)으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물에 포함된 각 성분이 단일 조성물(single composition)로 되어 있는 경우에는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 조성물로 되어 있지 않을 경우에는 한 성분을, 다른 성분이 투여되기 전, 후 및/또는 다른 성분과 함께 동시에 투여될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 순서 즉, 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것 인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기와 같은 투여 순서로 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 투여 경로로는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여로는 예를 들면, 정맥 내, 복강 내, 피하, 협측, 직장, 피부, 비강, 기관 및 기관지에 투여되거나 폐에 흡입될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물이 상기와 같은 방법으로 투여되기 위해 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함함으로써 적합한 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 불활성 희석액 또는 충전제, 물 및 다양한 유기 용매가 포함된다. 상기 약학적 조성물은 필요한 경우 추가의 성분, 예를 들면 풍미제, 결합제 및 부형제 등을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구 투여용 담체, 예를 들면 락토스, 전 분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 비경구 투여용 담체, 예를 들면 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 추가로 비경구 투여용 담체로는 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
특히, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 메트포민은 방출조절성 또는 서방성 제제로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 국제특허공개 제WO 99/47128호에 개시된 바와 같이 메트포민 및 1종 이상의 친수성 고분자, 1종 이상의 소수성 고분자 및 1종 이상의 소수성 재료를 포함한 실제로는 균일한 과립 형태인 내부 고체 미립자 상과 외부 연속상을 포함하는 다방출조절성 약물전달 시스템의 형태로 제형화 될 수 있다. 또한, 국제특허공개 제WO 96/08243호에 개시된 바와 같이 메트포민, 팽창제 및 겔화제를 조합함으로써 방출조절성 또는 서방성 제제 형태로 제형화 될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 컴파운드 K는 바람직하게는, 상기 컴파운드 K는 약 0.17 mg/체중 kg 내지 0.83 mg/체중 kg 용량으로 1일 1회 투여될 수 있으며, 메트포민은 2.5 mg/체중 kg 내지 10 mg/체중 kg 용량으로 1일 1회 투여될 수 있다.
그러나 최종 투여량 및 투여 횟수는 약제의 특성, 그 투여 방식 및 경로, 환자의 상태, 연령, 체중, 성별, 증상의 본질 및 중증도 등을 고려하여 임상의 판단에 따라 필요한 범위에서 따라 조정될 수 있다.
한편, 두 종류의 화합물이 병용 투여될 때, 각 성분의 투여량은 상승효과를 고려하여 암의 치료를 위해 단독으로 투여되는 경우의 통상적인 투여량의 약 70 내지 80%로 감소된 양일 수 있다. 따라서 천연물에서 유래한 컴파운드 K와 메트포민을 병용 투여함으로써 부작용이 우려되는 메트포민의 투여량을 최소화하여 인체에 안전하게 사용할 수 있으며 동시에 항당뇨 효과를 상승시킬 수 있는 장점이 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병의 예방 또는 치료에 매우 효과적이다. 본 발명에서 '당뇨병'이란 당대사 기능 이상을 특징으로 하는 만성질환을 말한다. 상기 당뇨병은 혈중 포도당 농도를 조절하는 가장 중요한 호르몬인 인슐린의 절대적 생산 결핍의 결과(인슐린 의존형 당뇨병 또는 제1형 당뇨병)이거나 표적장기에서의 인슐린의 작용저하의 결과로 인해 유발된다(인슐린 비의존형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병).
바람직하게는, 본 발명에서 당뇨병은 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병) 을 말한다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병은 일반적으로 당대사 및 지질대사 이상을 나타낸다. 즉, 상기 인슐린 비의존형 당뇨병 환자의 경우 음식 섭취 후 인슐린 분비가 늦어지거나 충분한 양이 분비되지 못하여 간에서의 당 생성이 줄어들지 못하고 근육, 간 및 지방과 같은 말초 조직에 의한 혈당의 이용률이 증가되지 못한다. 이 때문에 생긴 식후의 과혈당 증상은 인슐린 분비를 항상 촉진시켜 결과적으로 만성적인 인슐린 과다증을 유발하고 이러한 상태가 계속되면 베타세포가 더 이상 증가된 인슐린 분비율을 유지하지 못하게 되어 궁극적으로 인슐린 저항성이 나타난다. 지속적인 인슐린 저항성은 인슐린 생성에 문제를 초래하여 저인슐린혈증을 유도하게 된다.
또한, 인슐린 저항성의 원인으로 혈중 유리지방산의 증가가 제시되고 있다. 혈중 유리지방산의 증가는 말초조직에서 인슐린에 의한 당 이용을 억제시키고 간 조직에서 당 신생억제를 방해함으로써 혈당치를 높인다.
본 발명자들은 본 발명의 약학적 조성물의 당뇨병 치료 활성을 확인하기 위해, 제2형 당뇨병 모델 마우스를 이용하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 당뇨 마우스에 컴파운드 K 및 메트포민을 병용 투여한 후 혈당변화를 관찰하였다(실시예 3 참조). 그 결과, 컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여가 각각의 약물의 단독 투여에 비해 더 탁월한 혈당 강하 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
또한, 본 발명의 다른 실시예에서 당뇨 마우스에 컴파운드 K 및 메트포민을 병용 투여한 후 인슐린 저항성을 관찰한 결과(실시예 4 참조), 컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여가 각 약물의 단독 투여에 비해 인슐린 저항성 개선에 더욱 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(표 3 참조).
나아가, 본 발명의 다른 실시예에서 당뇨 마우스에 컴파운드 K 및 메트포민을 병용 투여한 후 포도당 업테이크에 관여하는 유전자 발현을 관찰한 결과(실시예 6 참조), 컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여가 각 약물의 단독 투여에 비해 GLUT4 유전자 및 PPARγ 유전자의 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다(표 5 참조).
마지막으로, 본 발명의 다른 실시예에서 당뇨 마우스에 컴파운드 K 및 메트포민을 병용 투여한 후 간 조직의 변화를 관찰한 결과(실시예 7 참조), 컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여가 각 약물의 단독 투여에 비해 간 조직에서 지질 대사에 관여하는 중성 지방의 축적을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
실험동물의 사육 및 실험 설계
제2형 당뇨병 모델인 C57BL/KsJ db/db 마우스(5주령)를 (주)중앙실험동물로 부터 구입하여 23±2℃, 상대습도 50±10%, 12시간/12시간의 명/암주기(light/dark cycle, 12h/12h)가 유지되는 동물실에서 2주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 당뇨 마우스는 각 6마리씩 무작위적으로 분류하여 당뇨 대조군(DC), 컴파운드 K 단독 투여군(10 mg/kg, CK 투여군), 메트포민 단독 투여군(150 mg/kg, MET 투여군) 및 컴파운드 K 10 mg/kg와 메트포민 150 mg/kg를 혼합하여 투여한 군(CK+MET 투여군)으로 나누었다. 상기 컴파운드 K는 (주)일화로부터 제공받아 사용하였으며 메트포민은 씨그마사(Sigma, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 약물은 경구 투여로 총 8주간 투여하였으며, 체중 및 식이·물 섭취량은 주 2회, 혈당은 매주 측정하였다.
<실시예 2>
컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 체중, 식이섭취량 및 음수량 변화
실험 종료 시점에 실시예 1의 각 군의 평균체중, 체중 증가량, 식이섭취량 및 음수량을 측정하였다. 측정된 결과는 Student's t-test를 실시하여 각 군 간의 평균차이에 대한 유의성을 p<0.05 이상의 수준에서 검정하였으며 그 결과를 표준오차(standard error)와 함께 나타내었다
실험 결과, 당뇨 대조군의 경우 8주 동안의 체중 증가량이 26.08 g으로 나타 난 반면, CK 투여군은 25.06 g, MET 투여군은 23.67 g으로 나타나 각각의 약물에 의해 체중 증가가 억제된 것을 알 수 있다. 그러나 CK+MET 투여군의 경우에는 체중이 감량되지 않고 오히려 체중이 27.28 g으로 증가한 것으로 나타났다(표 1).
한편, 당뇨 대조군은 높은 체중 증가량을 나타내었으나 식이 섭취량은 약물 투여군에 비해 가장 적은 것으로 나타났다. 각 약물 투여군의 경우에는 그룹 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다. CK+MET 투여군은 당뇨 대조군에 비해 식이 섭취와 물 섭취 모두 높은 수치를 나타내었다(표 1).
| 파라미터 | DC | CK 투여군 | MET 투여군 | CK+MET 투여군 |
| 체중 (g) | 55.94±4.4 | 56.68±4.4 | 53.28±1.7 | 56.53±3.9 |
| 체중증가량 (g) | 26.08 | 25.06 | 23.67 | 27.28 |
| 식이 섭취량 (g) | 219.77 | 234.51 | 233.31 | 232.99 |
| 음수량 (ml) | 227.00 | 212.83 | 223.50 | 243.83 |
<실시예 3>
컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 혈당 변화
상기 실시예 1에서 8 주간의 약물 투여 기간 동안 각 실험군의 혈당을 측정하였다. 혈당을 측정하기 위해 12시간 절식 시킨 후 각 실험군의 안와 정맥으로부터 전혈을 채취하고 5,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 수득된 혈장을 이용하여 포도당 옥시다아제 방법(Trinder method)으로 혈중 포도당 농도를 측정하였으며 흡광도 측정은 UV 스펙트로미터(U-3210, HITACHI; Japan)를 사용하였다. 측정된 결과는 실시예 2와 동일한 방법으로 통계처리하였다.
그 결과, 당뇨 대조군의 경우 실험 시작 시점에서 81.2±8.9 mg/dl 였던 수치가 2 주 간격으로 20 mg/dl 정도씩 증가하여 7 주째에는 191.0±14.8 mg/dl 까지 증가하였다. CK 투여군의 경우에는 3주째부터 당뇨 대조군에 비해 이러한 혈당 증가가 유의적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. MET 투여군의 경우 혈당 상승 억제 작용은 실험 5 주째부터 나타났으며 이러한 유의적인 혈당 상승 억제 효과는 실험 종료 시점까지 지속되었다. CK+MET 복합 투여군은 CK와 MET 단독 투여군에 비해 더 탁월한 혈당 강하 효과를 나타냈다(표 2).
| 실험군 | 혈중 포도당 농도(mg/dl) | ||||
| 0 주 | 1 주 | 3 주 | 5 주 | 7 주 | |
| DC | 81.2±8.9 | 128.8±8.1 | 163.5±15.4 | 170.7±11.0 | 191.0±14.8 |
| CK 투여군 | 80.6±11.2 | 108.7±12.4 | 126.8±12.4* | 155.8±7.6 | 136.8±10.6** |
| MET 투여군 | 81.2±7.4 | 116.8±8.0 | 140.2±7.9 | 148.3±6.8* | 137.2±9.9** |
| CK+MET 투여군 | 79.8±9.2 | 125.3±15.9 | 117.2±9.9** | 152.7±6.5 | 129.4±6.7*** |
* : p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.
** : p<0.01에서 유의적인 차이가 있음.
*** : p<0.001에서 유의적인 차이가 있음.
<실시예 4>
컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 인슐린 농도 및 인슐린 저항성 지수의 변화
상기 실시예 1에서 8 주간의 약물 투여 기간 동안 각 실험군의 인슐린 및 인슐린 저항성 지수(HOMA-IR)의 변화를 아래의 계산식을 사용하여 계산하였다. 혈중 인슐린 농도는 실시예 3과 동일한 방법으로 수득한 혈장을 시료로 하고 마우스 인슐린 ELISA 키트 (Shibayagi, Japan)를 이용하여 ELISA 리더 (Labsystems, Finland)로 측정하였다. 측정된 결과는 실시예 2와 동일한 방법으로 통계처리하였다.
인슐린린 저항성 지수 (HOMA-IR) = 공복시 혈중 인슐린 (μU/ml) × 공복시 혈중 포도당 농도 (mM)/22.5
그 결과, 당뇨 대조군에 비해 약물 투여군에서 인슐린 저항성 지수가 크게 감소하는 경향을 보였다. 보다 구체적으로, 당뇨 대조군의 인슐린 저항성 지수가 189.33±14.6인데 반해 CK 투여군은 103.39±8.0, MET 투여군은 56.01±4.0 그리고 CK+MET 투여군은 20.70±1.7로 나타나 CK와 MET 병용 투여가 인슐린 저항성 개선에 탁월한 효과를 보임을 알 수 있었다(표 3).
| 혈중 포도당 농도 (mM) | 인슐린 농도 (μU/ml) | HOMA-IR | ||
| 실험 시작시점 | 실험 종료시점 | |||
| DC | 4.46±0.5 | 10.50±0.8 | 405.92±27.5 | 189.33±14.6 |
| CK | 4.43±0.6 | 7.51±0.6** | 309.63±44.7 | 103.39±8.0*** |
| MET | 4.46±0.4 | 7.54±0.5** | 167.21±10.4* | 56.01±4.0*** |
| CK+MET | 4.38±0.5 | 7.11±0.4** | 65.51±17.9* | 20.70±1.7*** |
* : p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.
** : p<0.01에서 유의적인 차이가 있음.
*** : p<0.001에서 유의적인 차이가 있음.
<실시예 5>
컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 대사성 지표의 개선
컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 대사성 지표의 개선 정도를 측정하기 위해, 실시예 1의 각 실험군의 당화 혈색소 농도, 혈중 아디포넥틴 농도, 혈중 지질 농도 및 간조직과 지방조직의 무게를 각각 측정하였다.
보다 구체적으로, 당화 혈색소 농도 (HbAlc)는 공복 상태의 각 실험군으로부터 수득한 전혈을 대상으로 헤모글로빈 Alc 키트 (BioSystem S.A., Spain)를 이용하여 측정하였다. 혈중 아디포넥틴 농도는 실시예 3과 동일한 방법으로 수득한 혈장을 시료로 하고 마우스 아디포넥틴 ELISA 키트 (Adipogen, Korea)를 이용하여 ELISA 리더로 측정하였다. 혈중 중성 지방, 총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤은 영동제약에서 각 분석용 키트를 구입하여 측정하였다. 간 조직 및 부고환의 지방 조직 무게는 실험 종료시 마우스를 치사시켜 간과 지방조직을 적출한 다음 측정하였다. 측정된 결과는 실시예 2와 동일한 방법으로 통계처리하였다.
실험 결과, 당화혈색소 수치의 경우 당뇨 대조군에 비해 약물 투여군 모두에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 인슐린 저항성 개선을 나타내는 수치인 혈중 아디포넥틴 수치는 CK 투여군, MET 투여군, CK+MET 투여군에서 각각 5.8%, 11.7%, 3.7% 정도 증가되었다.
또한, 간 조직의 무게는 당뇨 대조군과 비교하여 볼 때 MET 투여군 및 CK+MET 투여군에서 유의적으로 감소된 것으로 나타났다. 지방 조직 또한 그 무게가 CK와 MET 투여로 인해 감소되었으나 CK+MET 투여군에서는 당뇨 대조군과 비슷하게 나타났다. 총 콜레스테롤의 경우 당뇨 대조군에 비해 약물 투여군은 수치가 감소한 것을 확인하였으나 유의적인 차이는 보이지 않았다(표 4).
| 파라미터 | DC | CK 투여군 | MET 투여군 | CK+MET 투여군 |
| HbA1c (%) | 5.90±0.2 | 4.90±0.2** | 4.88±0.2** | 5.01±0.1** |
| 혈중 아디포넥틴 | 124.11±0.3 | 131.33±0.8* | 138.58±23.1 | 128.69±17.5 |
| 간 | ||||
| - 무게 (g) | 2.42±1.0 | 2.39±0.3 | 2.06±0.3* | 1.97±0.3* |
| - 간/체중 (%) | 4.33±0.6 | 4.21±0.4 | 3.87±0.5 | 3.47±0.3** |
| 부고환 지방 | ||||
| - 무게 (g) | 3.52±0.5 | 3.38±0.4 | 2.86±0.3 | 3.41±0.4 |
| - 지방/체중 (%) | 6.28±0.5 | 5.95±0.2 | 5.37±0.4** | 6.03±0.6 |
| 혈중 지질 | ||||
| - 중성지방 (mg/ml) | 96.16±9.3 | 79.47±6.8 | 96.25±6.0 | 89.53±3.5 |
| - 콜레스테롤 (mg/ml) | 203.16±13.2 | 187.17±7.1 | 181.10±9.9 | 185.60±3.0 |
| - HDL-콜레스테롤 (mg/ml) | 67.81±11.1 | 61.83±5.4 | 74.83±2.1 | 75.58±5.6 |
| - LDL-콜레스테롤 (mg/ml) | 116.12±10.9 | 82.08±13.3 | 92.65±15.9 | 90.65±17.4 |
* : p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.
** : p<0.01에서 유의적인 차이가 있음.
<실시예 6>
컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 GLUT4 및 PPARγ 유전자의 발현 변화
실시예 1의 각 실험군 마우스의 지방 및 근육 조직에서 CK 및 MET의 병용 투여가 포도당 업테이크(glucose uptake)에 관여하는 GLUT4 유전자 및 PPARγ 유전자의 발현에 미치는 영향을 실시간 PCR(Real time PCR)을 이용하여 분석하였다.
이를 위해 먼저, 마우스의 지방과 근육 조직에서 총 RNA를 구아니딘 티오시아네이트-물 포화 페놀/클로로포름 (guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chroloform) 방법을 이용하여 분리하였다 (Chomczynski and Sacchi, 1987). 물 층에 있는 총 RNA는 이소프로판올을 이용하여 침전시키고 분리한 RNA는 260 nm 와 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
실시간 PCR은 라이트 사이클러 실시간 PCR 검출 시스템 (Light Cycler real-time PCR detection system, Roche, Germany)에서 라이트사이클러 패스트스타트 DNA 마스터 SYBR 그린 I 키트(LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit, Roche, Germany)의 방법을 이용하여 수행하였다. 반응은 95℃에서 10분 동안의 전-인큐베이션 (pre-incubation) 단계를 거친 후, 95℃에서 10초 동안의 변성, 55℃에서 10초 동안의 붙임 그리고 72℃에서 8초 동안의 증폭의 3단계로 이루어진 증폭 단계를 40회 반복하였다. 특이적인 산물(Specific product)을 판독하기 위한 멜팅 커브(melting curve) 분석은 65℃에서 95℃로의 온도 변화로부터 측정하였다. 각 목적 유전자의 β-액틴 유전자에 대한 상대적인 발현 비율은 다음과 같은 반응식에 의해 계산되었다: 2-ΔΔ Cp where ΔΔCp = ΔCpGE300 sample -ΔCpDC sample, ΔCpGE300 sample = CpGE300 - stumulated target sample - CpGE300 - stimulated β- actin 그리고 ΔCpDC sample=CpDC target gene??CpDC β- actin (Anal. Biochem. 270, 41-49, 1999). 이때, 실험에 사용한 프라이머의 염기서열은 표 5에 나타낸 바와 같다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| β-actin 센스 | GTC GTA CCA CTG GCA TTG TG | 1 |
| β-actin 안티센스 | GCC ATC TCC TGC TCA AAG TC | 2 |
| GLUT4 센스 | CAA CGT GGC TGG GTA GGC A | 3 |
| GLUT4 안티센스 | ACA CAT CAG CCC AGC CGG T | 4 |
| PPAR-γ 센스 | CCC TGG CAA ACG ATT TGT AT | 5 |
| PPAR-γ 안티센스 | AAT CCT TGG CCC TCT GAG AT | 6 |
실험 결과, GLUT4 및 PPARγ 유전자의 발현은 당뇨 대조군에 비해 약물 투여군에서 증가하는 것으로 나타났다 (표 6). 특히, 지방 조직에서는 GLUT4의 발현이 MET와 CK+MET 투여군에서 당뇨 대조군에 비해 증가되었고, PPARγ 유전자 발현 또한 MET와 CK+MET 투여군 모두에서 당뇨 대조군에 비해 그 발현이 증가되었다 (도 1의 A). 근육 조직의 경우 CK, MET, CK+MET 투여군 모두에서 GLUT4 유전자의 발현이 당뇨 대조군에 비해 증가되었다 (도 1의 B). GLUT4 및 PPARγ 유전자의 발현은 CK+MET 투여군에서 가장 높은 것으로 나타났다(표 6).
| 기관 | 유전자 | Fold induction | |||
| DC | CK 투여군 | MET 투여군 | CK+MET 투여군 | ||
| 지방 조직 | GLUT4 | - | 0.709 | 1.203 | 2.24 |
| PPARγ | - | 1.055 | 1.099 | 1.551 | |
| 근육 조직 | GLUT4 | - | 0.770 | 0.916 | 1.102 |
<실시예 7>
컴파운드 K 및 메트포민의 병용 투여에 따른 간 조직의 영향
실시예 1에서 당뇨 마우스에 8 주간 약물을 투여한 후 간 조직 변화를 조사하였다. 즉, 실시예 1의 각 실험군 마우스에서 적출한 간 조직을 10% 중성으로 완충된 포르말린(neutral buffered formalin)을 사용하여 고정하였다. 이후 탈수 및 포매 과정을 거쳐 파라핀 블럭을 제작하고 두께 5 ㎛의 관상 절편으로 제작한 후 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거시키고, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 알코올로 친수화시켰다. 헤마토자일린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색으로 탈수 과정을 거쳐 캐나다 발삼(Canada balsam)으로 봉입하고 광학현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
실험 결과, 당뇨 대조군에서 많이 발견되는 지질 방울(lipid droplet)이 CK+MET 투여군에서 현저히 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 2 참조). 한편, 혈중 지질 농도의 증가는 간조직의 중성 지방 축적을 일으켜 간 무게의 증가를 일으키게 된다. 체중 대비 간 무게 수치는 CK+MET 투여군에서 당뇨 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다 (표 4 참조).
이러한 실험 결과를 종합해 보면, CK+MET 병용 투여는 간 조직에서의 지질 대사에 관여하여 중성 지방의 축적을 감소시키는 것으로 사료되며 비알콜성 지방간에도 효과가 있을 것으로 추측된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 컴파운드 K 및 메트포민을 포함하는 약학적 조성물은 각 약제를 단독으로 투여하는 경우에 비해 혈중 포도당 농도를 감소시키고, 인슐린 저항성을 개선하며 포도당 업테이크 관련 유전자의 발현을 증가시키고 간 조직에서 중성지방의 축적을 억제하는 활성이 우수하므로 당뇨병의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of KyungHee University
<120> Pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes
comprising compound K and metformin
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin sense primer
<400> 1
gtcgtaccac tggcattgtg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin antisense primer
<400> 2
gccatctcct gctcaaagtc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLUT4 sense primer
<400> 3
caacgtggct gggtaggca 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GLUT4 antisense primer
<400> 4
acacatcagc ccagccggt 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR-gamma sense primer
<400> 5
ccctggcaaa cgatttgtat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPAR-gamma antisense primer
<400> 6
aatccttggc cctctgagat 20
Claims (5)
- 컴파운드 K(compound K) 및 메트포민(metformin)을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 컴파운드 K 및 메트포민이 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 컴파운드 K는 0.17~0.83mg/체중 kg 용량으로, 메트포민은 2.5~10mg/체중 kg 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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