KR101955366B1 - 인터페론 베타-엘라스틴 재조합 단백질 및 이의 생산방법 - Google Patents

인터페론 베타-엘라스틴 재조합 단백질 및 이의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질을 인코딩하는 유전자 및 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 이용한 인터페론 베타-엘라스틴 재조합 단백질 및 이의 생산방법에 관한 것으로, 상기 재조합 단백질은 기존의 단백질 정제방법인 크로마토그래피 사용 없이 온도 및 염 농도 조절을 통하여 원심분리로 정제할 수 있어 낮은 생산 단가로 인터페론 베타 재조합 단백질의 생산 효율을 효과적으로 증가시킬 수 있다.

Description

인터페론 베타-엘라스틴 재조합 단백질 및 이의 생산방법{Interferon beta-elastin recombinant protein and production method thereof}
인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질 및 이의 생산방법에 관한 것이다.
인터페론 베타는 1형 인터페론에 속하는 166 아미노산 크기의 사이토카인으로, 바이러스 감염에 의하여 다양한 세포에서 발견되며, 재조합 인터페론 베타는 다발성경화증(multiple sclerosis)에 치료제로 사용되고 있다.
다발성 경화증은 중추신경계의 만성 자가면역질환으로 정확한 기전은 알려져 있지 않으나, 다양한 환경 및 유전적 인자가 작용하여 신경 축삭 단백질에 대한 자가면역세포가 활성화되어 혈관-뇌 경계를 통과하여 신경의 축삭을 감소시켜 임상 증상을 유발하는 것으로 알려져 있다.
인터페론 베타는 FDA 승인을 받은 최초 다발성 경화증 치료제이나 정확한 작용기전은 밝혀져 있지 않지만, 인터페론의 항염증 작용 및 면역조절 능력에 기인한 것으로 추정되고 있으며, 백혈구의 혈관-뇌 경계 통과를 감소시켜 자가면역을 조절하는 것으로 알려져 있다.
현재 인터페론 베타는 두 종류가 개발되어 사용되고 있는데 IFN-β1a와 IFN-β1b가 해당된다. IFN-β1a는 진핵세포에서 제작되는 당 단백(glycosylated protein)이며, IFN-β1b는 원핵세포에서 제작되는 것으로 당화가 되어 있지 않다.
두 종류의 인터페론 베타 모두 임상에서 사용되고 있으며, 두 단백질 간에 활성 차이는 없으나, 생산 효율이 낮아 제작에 어려움이 있을 뿐 아니라 생체에서 반감기가 매우 짧은 단점이 있다. 이러한 재조합 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 시도로 폴리(에틸렌 글리콜)[poly(ethylene glycol; PEG]를 단백질에 부착하는 페길화(PEGylation)를 수행하고 있으며, 인터페론 베타 또한, 페길화된 인터페론 베타가 제작되어 임상에 사용되고 있다.
그러나 페길화는 재조합 단백질 생산 후 변형시키는 것이기 때문에 여러 번의 정제과정이 필요하여 생산 단가를 높이는 원인이 되고, 페길화된 재조합 단백질의 장기간 사용은 신장의 형태 변화와 PEG에 대한 면역반응이 문제가 되고 있다.
한국공개특허 제2006-0039132호(2006. 05. 08 공개)
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질을 인코딩하는 유전자 및 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하여 생체에 안전한 인터페론 베타 재조합 단백질의 생산 효율을 증가시키고자 한다.
본 발명은 인터페론-베타 1 단백질을 인코딩하는 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 세포를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환시킨 세포를 배양하여 배양액을 회수하고 농축하는 단계; 및 상기 농축된 배양액에 NaCl을 첨가하여 재조합 단백질을 침전시켜 분리하는 단계를 포함하는 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질의 C-말단에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)를 포함하는 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 발현벡터는 생체외 기질인 엘라스틴계 폴리펩타이드와 인터페론 베타를 융합시킨 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질을 생산하여 종래의 화학적으로 페길화된 인터페론 베타 재조합 단백질 사용에 따른 부작용을 해결할 수 있으며, 상기 재조합 단백질은 기존의 단백질 정제방법인 크로마토그래피 사용 없이 온도 및 염 농도 조절을 통하여 원심분리로 정제할 수 있어 낮은 생산 단가로 인터페론 베타 재조합 단백질의 생산 효율을 효과적으로 증가시킬 수 있다.
도 1은 인터페론 베타를 EBPs와 융합된 형태의 재조합 단백질로 제작하기 위한 클로닝 모식도(A)와 각 단백질의 아미노산 서열(B)이다.
도 2는 인터페론 베타 유전자 및 EBPs 유전자의 아가로스 겔 전기연동 이미지(A)와 각 유전자가 삽입된 플라스미드를 Sfi I/Hind III 또는 EcoR V/Not I 제한효소로 절단한 아가로스 겔 이미지(B)이다.
도 3은 재조합 단백질 유전자가 포함된 플라스미드를 HEK293E 세포에 형질 도입한 후 생산된 재조합 단백질을 배양에서 확인한 웨스턴 블롯 이미지(A)와 재조합 단백질을 지속적으로 생산하는 세포주를 확립하여 선택하기 위한 ELISA 결과 및 웨스턴 블롯 이미지 (B)이다.
도 4는 재조합 인터페론 베타-EBPs를 대량으로 생산하여 역전이 순환(ITC)으로 정제한 결과로, A는 대량생산된 재조합 인터페론 베타-EBPs의 웨스턴 블롯 이미지며, B는 ITC로 정제된 인터페론 베타-EBPs의 SDS-PAGE 이미지와 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 5는 정제된 재조합 인터페론 베타-EBPs의 활성을 확인한 결과로, A는 THP-1 세포에 재조합 인터페론 베타-EBPs을 48시간 처리한 후 TRAIL 유전자 발현의 증가를 PCR로 확인한 아가로스 겔 이미지이며, B는 A549 세포주에 재조합 인터페론 베타-EBPs을 48시간 처리한 후 MHC class I의 발현 증가를 유세포 분석기(flow cytomtry)로 확인한 결과이다.
본 발명은 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질을 인코딩하는 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공할 수 있다.
상기 인터페론-베타(IFN-β) 단백질은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 인터페론-베타의 전체 아미노산 서열에서 시그널 펩타이드인 1-21번 아미노산이 결여된 것일 수 있다.
엘라스틴은 세포외기질(extracellular matrix, ECM)에서 주요한 단백질 구성요소이며, 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)는 탄성중합체 도메인(domain)으로부터 유래된 열 반응 생체고분자들이다.
본 발명의 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)는 탄성중합체 도메인을 기반으로 하여 열 감응성(thermal sensitivity)을 가지도록 변형되었고, 5개의 아미노산으로 구성되는 VPAXG (Val-Pro-Ala-X-Gly)로 이루어진 펜타펩타이드(pentapeptide)가 반복 포함될 수 있다.
보다 상세하게 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)는 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열인 [VPAX1G VPAX2G VPAX3G VPAX4G VPAX5G VPAX6G]n로 구성되고; 상기 n은 서열번호 3의 반복횟수로 1 이상의 정수이고, 보다 상세하게는 상기 n은 1 이상 24 이하의 정수이며, 보다 바람직하게는 12 이하일 수 있다.
상기 X1 내지 X6는 프롤린(proline)를 제외한 모든 아미노산일 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 X1 내지 X6는 A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 아미노산 비율로 이루어진 것일 수 있다.
상기 EBPs는 온도에 따른 가역적 위상 전이를 보이는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST) 거동을 나타내며, 상기 LCST는 역전이 순환(inverse transition cycling, ITC)과 같은 쉬운 정제 방법을 사용할 수 있는 장점이 있으며, 열에 촉발되어 입자들, 겔(gel)들, 섬유(fiber)들 및 다른 구조체들로 자가조립되는 장점이 있다.
또한, 가용성 상태의 EBPs는 진보된 약물 전달 시스템, 재생 의학, 및 조직 공학에 적용되어 폴리에틸렌 글라이콜(poly(ethylene glycol), PEG)과 같은 불활성 단백질-기반 생체 재료로 사용되기도 하고, 약물 또는 다른 기능성 단백질과 함께 약물 전달 운반체로도 사용될 수 있다.
상기 재조합 발현벡터는 Hind Ⅲ 제한부위가 추가로 더 삽입될 수 있다.
상기 재조합 발현벡터는 도 1A와 같은 개열지도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능한게 연결된 코팅 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.
그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 세포주를 제공할 수 있으며, 상기 세포는 HEK293E일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 상기 재조합 발현벡터에 의해 생산된 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
본 발명을 상기 재조합 발현벡터로 세포를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환시킨 세포를 배양하여 배양액을 회수하고 농축하는 단계; 및 상기 농축된 배양액에 염 화합물을 첨가하여 재조합 단백질을 침전시켜 분리하는 단계를 포함하는 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질 생산방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질의 C-말단에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)를 포함하는 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
상기 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질은 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 인터페론-베타 1의 전체 아미노산 서열에서 시그널 펩타이드인 1-21번 아미노산이 결여된 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 재조합 인터페론 베타- EBPs 클로닝
IFN-β1은 THP-1 세포의 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, EBP는 서열번호 2와 같은 EBP 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자를 포함하는 Anti-Ftl1-EBP[A1G4I1] 플라스미드 DNA(한양대 제공; 출원특허 제10-2016-0135510호)를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.
각 프라이머는 제한 부위(restriction site)를 삽입하여 제작하였고, pfu premix (TAKARA)로 PCR한 후 Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit (Invitrogen)으로 1차 클로닝하고 시퀀싱(코스모진텍) 하였다. 제한효소(Promega)로 각 단편을 잘라 pSecTag2/Hygro B vector (Invitrogen)에 T4 리가제(Promega)로 2차 클로닝하여 도 1A와 같은 3 종류의 재조합 DNA를 제작하고 시퀀싱(코스모진텍)을 수행하여 확인하였다.
< 실시예 2> 재조합 인터페론 베타- EBP 생산 세포주 확립
10% 불활성화된 태아소혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 DMEM (Hyclone) 배지가 담겨진 6 웰 플레이트에 HEK293E 세포를 8 × 105 cells/well로 넣고 5% CO2에서 하루 동안 배양한 후, 앞선 실험에서 제작된 IFN-β1 재조합 DNA를 리포펙타민 3000 (Invitrogen)으로 형질주입(Transfection)하였다. 다음날 100mm 디쉬로 옮기면서 하이그로마이신 B(hygromycin B)를 500μg/ml로 처리하여 일주일간 배양한 후, 96 웰 플레이트에 단일 세포로 희석하여 배양하였다. 각 웰의 세포가 콜로니를 형성하였을 때, 96 웰 플레이트를 duplication하고 그 중 한 플레이트는 발현 확인을 위해 UltraDoma-PF Hybridoma medium (Lonza)에서 배양하였다. 재조합 단백질의 발현은 배양액을 사용하여 ELISA와 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였다.
웨스턴 블롯은 1차 항체로 anti c-myc 항체(Sigma), 2차 항체로 anti-Rabbit IgG-HRP 항체(Jackson ImmunoResearch)를 이용하였으며, SDS-PAGE 겔은 EZ Gel staining solution (대일랩서비스)로 염색하여 확인하였다.
재조합 단백질 유전자가 포함된 플라스미드가 형질도입된 HEK293E 세포에서 생산된 재조합 단백질을 확인한 결과, 도 3A와 같이 IFN-β1-2-EBP 재조합 단백질의 생산량이 가장 우수한 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 IFN-β1-2-EBP 재조합 단백질을 지속적으로 생산하는 세포주를 확립하기 위해 ELISA와 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 3B와 같이 IFN-β1-2-EBP 세포 중 7 및 8번 세포가 재조합 단백질 생산 세포주로 가장 적합한 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3> 재조합 인터페론 베타- EBP 정제
생산된 재조합 인터페론 베타-EBPs를 정제하기 위해, 앞선 실험에서 선택된 세포주의 배양액을 Amicon Ultra-15, 30k (Millipore)로 농축하고, NaCl의 농도가 2M이 되도록 첨가하여 재조합 단백질을 침전시킨 후 원심분리하여 침전된 재조합 단백질을 분리하였다.
PBS로 침전된 단백질을 용해시킨 후 샌드위치 ELISA로 정량하였다. 샌드위치 ELISA 시 재조합 사람 IFN-β1 (Peprotech)를 기준으로 하여 anti hIFN-β1 항체(Peprotech)를 포획 항체로, 비오틴 표지된 a-hIFN-β1 항체(Peprotech)를 검출 항체로 사용하였으며, 2차 항체인 스트렙타아비딘 HRP (BD Biosciences)로 정제한 재조합 단백질을 정량하였다.
그 결과, 도 4A와 같이 재조합 인터페론 베타-EBPs가 대량으로 생산된 것을 확인할 수 있었으며, 도 4B와 같이 염 농도 조절만으로도 재조합 인터페론 베타-EBPs이 쉽게 정제되는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4> 재조합 인터페론 베타- EBP의 활성 확인
1. 재조합 인터페론 베타- EBP의 TRAIL 유전자 발현 증가 효과 확인
정제된 재조합 인터페론 베타-EBPs의 활성을 확인하기 위해, THP-1 세포에 재조합 인터페론 베타-EBPs을 처리하고 TRAIL 유전자 발현 수준을 확인하였다.
먼저, THP-1 세포를 6 웰 플레이트에 2 × 105 cells/well로 넣은 후 인터페론 베타-EBPs 단백질을 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고 TRAIL 유전자( F : 5′-ACCAACGAGCTGAAGCAGAT-3′, R : 5′-ACGGAGTTGCCACTTGACTT-3′ )과 GAPDH 유전자( F : 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′, R : 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′ )를 확인하였다.
PCR 반응은 PCR premix (Bioneer)를 사용하여 94℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃-30초, 57℃-30초, 72℃-60초의 온도조건으로 20회 반응시켰다. PCR 생성물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 확인하였다.
그 결과, 도 5A와 같이 재조합 인터페론 베타-EBPs가 처리된 세포에서 TRAIL 유전자의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
2. 재조합 인터페론 베타- EBP의 MHC class I 발현 증가 확인
또한, A549 세포를 6 웰 플레이트에 1×105 cells/well로 넣은 후 재조합 단백질과 재조합 사람 IFN-β1 (Peprotech)를 각각의 농도별로 희석하여 48시간 동안 처리한 후 PE anti-human HLA-ABC antibody (ebioscience)를 이용하여 MHC Ⅰ의 발현을 유세포 분석기(flow cytometry)로 확인하였다.
그 결과, 도 5B와 같이 재조합 인터페론 베타-EBPs의 농도 의존적으로 MHC Ⅰ의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> inje university industry-academic cooperation foundation <120> Interferon beta-elastin recombinant protein and production method thereof <130> ADP-2017-0031 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens interferon beta 1 <400> 1 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 <210> 2 <211> 360 <212> PRT <213> Elastin based polypeptide <400> 2 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 35 40 45 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 50 55 60 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 85 90 95 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 100 105 110 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 115 120 125 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 130 135 140 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly 145 150 155 160 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val 165 170 175 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro 180 185 190 Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala 195 200 205 Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 210 215 220 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 225 230 235 240 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 245 250 255 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 260 265 270 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 275 280 285 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 290 295 300 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 305 310 315 320 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 325 330 335 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 340 345 350 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 355 360 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> peptide <400> 3 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30

Claims (11)

  1. 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질을 인코딩하는 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)를 인코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 인터페론-베타(IFN-β) 단백질은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 인터페론-베타 1의 전체 아미노산 서열에서 시그널 펩타이드인 1-21번 아미노산이 결여된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)는 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드가 12회 반복되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)는 VPAX1G VPAX2G VPAX3G VPAX4G VPAX5G VPAX6G로 구성되며, 상기 X1 내지 X6는 A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 아미노산 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 1A에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  7. 청구항 1에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 세포주.
  8. 청구항 1에 따른 재조합 발현벡터에 의해 생산된 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질.
  9. 청구항 1에 따른 재조합 발현벡터로 세포를 형질전환시키는 단계;
    상기 형질전환시킨 세포를 배양하여 배양액을 회수하고 농축하는 단계; 및
    상기 농축된 배양액에 염 화합물을 첨가하여 재조합 단백질을 침전시켜 분리하는 단계를 포함하는 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질 생산방법.
  10. 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질의 C-말단에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPs)가 융합되는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 인터페론-베타(Interferon-β; IFN-β) 단백질은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 인터페론-베타 1의 전체 아미노산 서열에서 시그널 펩타이드인 1-21번 아미노산이 결여된 것을 특징으로 하는 인터페론 베타-엘라스틴(IFN-β-EBP) 재조합 단백질.
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