CN111825770B - 长效白介素21-Fc融合蛋白及其用途 - Google Patents

长效白介素21-Fc融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白介素21‑Fc融合蛋白及其用途。本发明提供了一种融合蛋白，它是由白介素21与免疫球蛋白Fc段通过基因工程融合表达产生。本发明的融合蛋白，能够提高白介素21在体内的稳定性，增强其抗癌效果。

Description

长效白介素21-Fc融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白介素21-Fc融合蛋白及其用途。
背景技术
细胞因子(Cytokine)是一类由免疫细胞或非免疫细胞产生的高活性小分子多肽或糖蛋白，具有调节免疫应答、诱导炎症反应、影响造血功能、损伤组织修复以及介导肿瘤发生等多种生物学功能。细胞因子疗法在肿瘤治疗中的应用是当今世界医学研究的热点之一。
白细胞介素21(IL-21)是一种新型的I型细胞因子，由162个氨基酸组成，分子量为15.5kD，等电点为9.42，分子内有2个二硫键。IL-21主要在淋巴细胞，特别是NK细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞中表达。IL-21通过与其受体IL-21R特异性结合介导多种生物学效应：促进CD8+ T细胞的功能和增殖、促进NK细胞细胞毒活性和IFN-γ产生，以及促进活化B细胞的增殖和抗体产生。近年来研究表明，IL-21可激活免疫细胞，调节免疫细胞的增殖和分化，增强免疫系统对抗肿瘤细胞的功能。IL-21与多种抗肿瘤药物联用可显著减少抗肿瘤药物剂量、缩小实体瘤体积、延长患者生存期。
但IL-21在体内的半衰期较短，不利于其抗癌效果的充分发挥。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种融合蛋白。
本发明的技术方案包括：
一种融合蛋白，它是由白介素21与免疫球蛋白Fc段通过基因工程融合表达产生。
如前述的融合蛋白，所述白介素21与免疫球蛋白均为人源蛋白。
如前述的融合蛋白，白介素21与免疫球蛋白Fc段之间还有连接序列，该连接序列是IgG4铰链区序列。
如前述的融合蛋白，所述白介素21的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
如前述的融合蛋白，所述免疫球蛋白Fc段的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
如前述的融合蛋白，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO.4所示。
表达前述融合蛋白的DNA。
含有前述DNA的重组载体。
含有前述重组载体的宿主细胞。
一种抗癌药物，它是由前述融合蛋白为主要活性成分，添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的。
本发明具有如下有益效果：
本发明的融合蛋白，能够提高白介素21在体内的稳定性，增强其抗癌效果。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：琼脂糖凝胶电泳图。
图2：SDS-PAGE检测图。
图3：使用白介素21-Fc融合蛋白治疗后的黑色素瘤组织外观图。
图4：白介素21-Fc融合蛋白结构示意图。
具体实施方式
实施例1白介素21-Fc融合蛋白重组表达质粒的构建
1.IL-21基因克隆
以cDNA克隆为模板扩增人白介素21基因(GeneBank：NM_001207006.2)，
引物序列如下(包含酶切位点、Kozak)：
上游引物：5’-ATATCCTTAAGCGGCCGCCACCATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTG-3’，
下游引物：5’-ATATGGGATCCGAATCTTCACTTCCGTGTGTTCT-3’。
在50ul的PCR反应体系中，20mM的引物各加1ul；2.5mM each的dNTP加1ul；高保真pfu DNA聚合酶加1ul。
反应条件为95℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，30个循环。
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析(如图1)，与预期相符。
2.重组表达质粒构建
将得到的PCR产物用凝胶回收后AfLII与BamHI限制性内切酶(购自Fermentas公司)酶切克隆至实验室保存的pcDNA3.1-IgG4-Fc表达载体中。
所述pcDNA3.1-IgG4-Fc表达载体，是将IgG4的Fc片段、IgG4的铰链区片段构建到pcDNA3.1载体中得到的。
筛选获得的质粒经测序比对，与预期序列完全一致。
所述IL-21基因表达的蛋白的序列(SEQ ID NO.1)如下：
Figure BDA0002029792000000021
所述Fc片段的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：
Figure BDA0002029792000000031
所述IgG4的铰链区氨基酸序列(SEQ ID NO.3)如下：
ESKYGPPCPSCP
白介素21-Fc融合蛋白的整体氨基酸序列(SEQ ID NO.4)如下：
Figure BDA0002029792000000032
实施例2白介素21-Fc融合蛋白的生产
1.表达
将处于对数生长期的HEK293细胞用胰酶消化后稀释至6×105/mL的密度，接种到10cm培养皿中，每个培养皿加10ml的DMEM/F12培养液(含1％FBS，Gibco)，培养约24小时左右进行转染。用Lipofectamine 3000转染试剂(Life公司)重组质粒转染至HEK293细胞，所用质粒由无内毒素质粒抽提试剂盒提取(Sigma公司)。转染的细胞在5％的二氧化碳培养箱中培养5天后收集上清液。
2.纯化
将收集的培养上清用Protein A亲合层析柱(购自GE公司)纯化。用1×PBS(PH＝7.4)清洗和平衡纯化柱后，将培养上清按1ml/min的流速进行上样。上样结束后，再用50倍柱体积的1×PBS(PH＝7.4)冲洗未结合的培养液。再用甘氨酸柠檬酸溶液(PH＝3.5)洗脱融合蛋白，最后透析至1×PBS(PH＝7.4)中。
纯化结果如图2所示。
以下将用实验例的形式做进一步说明。
实验例动物实验
采用黑色素瘤细胞B16荷瘤模型评价重组人IL-21蛋白的治疗效果。
对照组：对黑色素瘤荷瘤模型皮下注射白介素21；
实验组：对黑色素瘤荷瘤模型皮下注射等摩尔量的白介素21-Fc融合蛋白。
结果如图3所示。由图可知，实验组的抑癌效果显著高于对照组。
综上，本发明通过构建白介素21与免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白(示意图见图4)，能显著提升该白介素21在体内的半衰期，并最大程度地保留其抗肿瘤活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都医学院
<120> 长效白介素21-Fc融合蛋白及其用途
<130> GY044-2019P016242CC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser
130
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser
35 40 45
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
50 55 60
Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
85 90 95
Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
115 120 125
Gly Ser Glu Asp Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atatccttaa gcggccgcca ccatggagag gattgtcatc tgtctg 46
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atatgggatc cgaatcttca cttccgtgtg ttct 34

Claims (2)

1.一种融合蛋白在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，其特征在于，所述融合蛋白是由白介素21与免疫球蛋白 Fc段通过基因工程融合表达产生；所述融合蛋白的序列如SEQID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是由融合蛋白为主要活性成分，添加药学上可接受的辅助性成分制备而成的。
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