KR0153009B1 - 티씨에프-ii의 아미노산 서열을 암호하는 dna를 함유한 플라스미드 형질전환세포 및 이것을 사용하여 생리 활성물질을 생산하는 방법 - Google Patents
티씨에프-ii의 아미노산 서열을 암호하는 dna를 함유한 플라스미드 형질전환세포 및 이것을 사용하여 생리 활성물질을 생산하는 방법Info
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Abstract
본 발명은 인체 섬유 아세포로부터 유래된 신규 당단백질(TCF-Ⅱ)의 아미노산 서열을 암호하는 DNA를 함유하는 플라스미드, 그 플라스미드로 형질전환된 세포 및 형질 전환된 세포를 사용하여 rTCF-Ⅱ의 제조방법에 관한 것이다. rTCF-Ⅱ는 간세포 증식인자 또는 종양 세포 독성 인자로서 이용될 수 있다.
Description
[발명의 명칭]
티씨에프(TCF)-Ⅱ의 아미노산 서열을 암호하는 DNA를 함유한 플라스미드, 형질전환세포 및 이것을 사용하여 생리 활성물질을 생산하는 방법
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 인체의 섬유 아세포로부터 유래된 신규 당단백질(이후에는 TCF-Ⅱ라 한다)의 아미노산 서열을 암호하는 DNA 함유 플라스미드, 그 플라스미드로 형질전환된 세포 및 이 형질 전환 세포를 사용하여 생리 활성 물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 TCF-Ⅱ는 간세포 증식인자, 종양 세포독성 인자등으로서 의약이나 생화학적 또는 약리 작용 시약 등의 분야에 유용하다.
[배경기술]
인체 유래의 섬유아세포가 생산하는 생리 활성 물질(예를 들어 인체-유래의 섬유 아세포로부터 생산되는 종양 세포 독성인자)로서 대표적인 물질은 β-인터페론이다. 이것은 섬유 아세포를 배양후 수거하고, 이어서 폴리 Ⅰ-폴리 C 또는 센다이 비루스(Sendai virus)로 자극하면, 세포외로 분비되는 당단백질이다. 이 당단백질은 항비루스 또는 항종양 효과외에도 다양한 생리 활성을 나타낸다는 것이 밝혀져 있다. CBF라고 하는 섬유아세포-유래의 종양 세포 독성 당단백질은 일본국 특허 공개 번호 제58-146293호 공보에 개시되어 잇다. 35,000-45,000의 분자량을 가진 종양 증식저해 인자(INF)는 인체 조직으로부터 유래된 섬유아세포의 배양액으로부터 추출되며 일본국 특허 공개번호 제61-33120호 공보에 개시되어 있다. 또한 섬유 아세포의 배양액으로부터 정제된 종양 괴사인자-유사물질, 섬유아세포-유래의 괴사 인자(FNF) 및 동물-유래의 섬유 아세포에 의해 생성되고 4만 내지 6만의 분자량 및 5.0±0.5의 등전점을 가진 세포독성 작용을 갖는 생리 활성물질이 각각 일본국 특허 공개 번호 제61-56131호, 일본국 특허 공개 번호 제 61-1872호 및 일본국 특허 공개 번호 제62-103021호 공보에 개시되어 있다. 또한, 인체-유래 섬유아세포의 배양액으로부터 수득되고 36,000±1,000의 분자량 및 10.5 이상의 등전점을 가진 종양 세포 독성인자의 총1차 아미노산 서열 및 그 아미노산 서열을 암호하는 cDNA도 일본국 특허 공개 번호 제64-10998호 공보에 개시되어 있다.
[발명의 개시]
본 발명자들은 인체-유래된 섬유 아세포의 배양액에 존재하는 생리 활성물질에 대한 연구를 지속시켜온 결과, 종래 보고된 물질과 분자량, 등전점등이 상이한 다양한 생리 활성을 가진 당단백질을 발견하여, 그 신규 당단백질에 대하여 특허 출원한 바 있다(PCT/JP90/00314 : 국제 특허 공개 번호, WO90/10651 : 국제공개일, 1990. 9. 20).
이러한 인체 섬유 아세포로부터 유래의 신규 당단백질(TCF-Ⅱ)은 하기의 생리화학적 성질을 특징으로 하는 당단백질이다.
a. 분자량(Mw) : SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시, 비환원조건에서는 분자량 74,000±2,000 및 78,000±2,000을 갖는 밴드를 나타내고, 환원 조건에서는 분자량 52,000±2,000을 가진 공통 밴드 A, 분자량 30,000±2,000을 가진 밴드 B 및 분자량 26,000±2,000을 가진 밴드 C를 나타낸다.
b. 등전점 : 7.4 내지 8.6
c. 열안정성 : 60℃에서 10분동안 가열시에도 안정
d. pH안정성 : ph 6 내지 9의 범위에서 안정
e. 당단백질 : 콘가나발린 A(Con A)-세파로스 칼럼에 흡착성을 나타낸다
f. 생리 활성 : KB 세포, HeLa 세포 및 L929-C18 세포의 성장을 저해하나 IMR-90 세포의 성장은 저해하지 않는다.
g. 항체와의 반응성 : 상기 세포 독성의 활성이 항-TNF, 항-임파성 독소 및 항-인터페론-β 항체들에 의해 중화되지 않는다
또한, 본 발명의 TCF-Ⅱ는 N-말단 아미노산 서열 및 아미노산 조성을 갖는 것이 바람직하다.
h. N-말단 아미노산 서열 : 상기 언급된 밴드 B 및 밴드 C는 각각 밴드 A의 서브 체인(Subchains)이다. 밴드 A는 N-말단의 아미노산이 차단되어 있다. 밴드 B 및 밴드 C는 공통적으로 하기와 같은 N-말단 아미노산 서열을 갖고 있다.
Val-Val-Asn-Gly-Ⅱe-Pro-Thr-또는
Val-Val-Asn-Gly-Ⅱe-Pro-Thr-X-Thr-Asn-Ⅱe-Gly-X-Met-Val-Ser-Leu-
X는 미확인 아미노산이다.
I. 아미노산 조성 : HCl로 가수분해시 하기와 같은 아미노산조성을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 TCF-Ⅱ의 아미노산 서열을 암호하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정했고, 상기 언급된 특허 출원 명세서에 이 뉴클레오티드 서열을 기재하였다. 본 발명들은 하기 순서에 따라 인체 태아의 섬유 아세포 IMR-90세포로부터 유래된 TCF-Ⅱ를 암호하는 mRNA를 정재했고, 그 유전자를 클로닝한 후, 그 유전자의 뉴클레오티드 서열 결정하고, 이 서열로부터 TCF-Ⅱ의 아미노산 서열을 추론하였다.
(1) IMR-90 세포로부터 폴리 (A) RNA의 추출
갓 태어난 송아지 혈청(NBCS) 5%를 첨가한 둘베코의 변형된 이글배지(Dulbecco's modified Eagle medium : DMEM)에서 배양한 2×10 IMR-90세포로부터 구아니딘 티오시안산염-염화세슘 방법(Biochemistry 18. 5294-5299(1979))에 따라 총 RNA를 추출하였다. IMR-90세포를 5mM 구연산 나트륨, 0.5% 사르코실(Sarkosyl) 및 0.1M β-머캅토에탄올을 함유하는 6M 구아니딘 티오시안산염 용액 28ml에 현탁하여 균질화하였다. 0.1M EDTA를 함유하는 5.7M 염화세슘 용액 4ml를 각 폴리아로마(polyallomer) 원심분리 튜브에 주입하였다. 이 염화세슘 용액위에 균질화된 용액 7ml를 로딩하고 베크만(Beckman) 원심 분리기 40Ti로터를 사용하여 35,000rpm에서 16시간 동안 20℃에서 원심분리하였다. 원심분리후, 펠렛은 95% 에탄올로 2회 세척하고 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5) 200㎕내에 넣어 65℃에서 5분간 가열하여 용해하였다. 얻어진 용액을 총 RNA 용액이라 명명한다. 폴리 (A) RNA는 총 RNA로부터 올리고(dT) 셀룰로오스-컬럼 크로마토그래피 방법에 의해 정제하였다. 그 다음, 1mM EDTA, 0.5M NaCl 및 0.05% SDS를 함유하는 10mM Tris-Hcl 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 올리고(dT)셀룰로오스-컬럼위에 상기 총 RNA용액을 로딩하였다. 칼럼상에 흡착된 분획을 1mM EDTA 및 0.05% SDS를 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)으로 용출하였다. 그 용출액을 폴리 (A) RNA용액이라 한다.
(2) cDNA의 합성
상기 (1)에서 얻은 폴리 (A) RNA를 주형으로 하고, cDNA 합성 킷트(파마시아)를 사용하여 이본쇄 cDNA를 합성하였으며, 이 cDNA에 EcoRI 어뎁터(adaptor)를 부착하였다. 합성 방법은 파마시아의 프로토콜에 따라 실시하였고, 단, 제1가닥의 DNA 합성시에는 조류 골수의 비구상(non-sphere) 질환 비루스로부터 유래된 역전사효소(AMV RTase, 40 유니트/반응 혼합물, Life Science)를 첨가하였다.
(3) cDNA 라이브러리(library)의 작제
상기 (2)에서 얻은 EcoRI 어뎁터가 부착된 cDNA를 파아지 벡터 λgt10의 EcoRI 아암(arm)(프로메가)에 삽입하였다. 폴리 (A) RNA의 3.3㎍으로부터 합성된 cDNA를 66mM Tris-HCl 완충액(pH 7.6, 1 mM 스퍼미딘(spermidine), 10mM 염화망간, 15mM DTT(디티오쓰레이톨) 및 0.2mg/ml의 소혈청 알부민을 함유한다(컬럼 완충액)) 150㎕에 용해하였다. 상기 용액 5.2㎕를 λgt10 EcoR I 아암(arm) 1㎕과 혼합한후, 에탄올로 침전시켰다. λgt10 및 cDNA를 모두 함유하는 재조합 파아지 DNA는 하기와 같이 작제하였다. 상기 침전물을 상기 칼럼 완충액 9㎕에 재용해하고, 10mM 아데노신 삼인산염 1㎕ 및 DNA 리가제(350 유니트/㎕) 1㎕를 첨가한 뒤 16℃에서 하룻밤동안 배양했다.
(4) cDNA 라이브러리의 선별
(ⅰ) 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)의 제조
프로브의 제조를 위해, TCF-Ⅱ β-쇄의 N-말단 아미노산 서열중 Val 에서 Pro 까지의 아미노산 서열에 대응하는 17 mer 상보쇄의 올리고뉴클레오티드(384 종류 혼합물) 혼합물이 합성되었고, T폴리뉴클레오티드 키나제(TAKARA SHUZO Co. Ltd) 및 [r- P]ATP(Amersham)로 5'말단을 표지하였다. 이 프로브는 하기와 같다.
프로브로서 사용되는 상보쇄:
(384 종류 혼합물)
(ⅱ) 재조합 파아지의 선별
상기 (3)에서 얻은 재조합 파아지 DNA를 서험관내에서 지가팩 골드(Gigapack Gold : Stratagene)를 사용하여 팩키징한 다음, 이 콜리(E. coli) C600hfl을 감염시켜 약 500,000개의 파아지 플라크를 수득하였다. 상기 플라크를 히본드-엔(Hybond-N) 여과지(Amersham)에 흡착시킨 후 알칼리로 변성시키고, 중화한 다음, 80℃에서 2시간 동안 베이킹했다. 하이브리드화(hybridization)는 Bell등 (Nature 310. 775-777(1984))의 방법에 따라 실시하였다. 1차선별은 (ⅰ)에서 수득된 프로브 혼액을 사용하여 수행하였다. 1차선발시 검출된 양성 플라크들에서 TCF-Ⅱ cDNA 단편을 포함할 것으로 추정되는 한 클론을 찾아내었다.
(5) 아미노산으로 해독될 수 있는 TCF-Ⅱ cDNA의 완전한 암호영역의 클로닝.
TCF-Ⅱ β-쇄의 N-말단 아미노산 서열 및 몇개의 내재 아미노산 서열(1 문자 코드), 리실렌도펩티다제(lysylendopeptidase)로 TCF-Ⅱ를 절단하여 얻어진 α-쇄 및 β-쇄로부터 각각 수득된 (α) NYMGNLSQTRSGL 및 (β)TSXSVYGWGYTGLINYDGLL (X : 미확인)은 인체 간세포 증식인자(hHGF)중 하나의 대응하는 아미노산 서열과 일치하였다. 그러므로 TCF-Ⅱ는 hHGF 유전자들의 부류(family)중 하나로부터 발현되는 것으로 추정된다. hHGF에 대해서, 미야자와(MIYAZAWA) 등(Biochemical and Biophysical Research Communication 163. 967-973 (1989)) 및 나카무라(NAKAMURA)등 (Nature 342. 440-443(1989))은 각각 hHGF cDNA들의 총 뉴클레오티드 서열을 보고하였다. 상기 보고된 2가지 hHGF cDNA로부터 추정되는 아미노산 서열을 비교시 14군데의 아미노산이 차이를 보였다. 이 결과는 hHGF 유전자 과(family)의 존재를 암시하고 있다. 그리하여 상기 2가지 hHGF의 5' 및 3' 비암호화 영역의 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 기초로 하여, 프라이머(primer)로 이용되는 올리고 뉴클레오티드를 화학적으로 합성하였고, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction : PCR) 방법에 따라 TCF-Ⅱ cDNA를 선별하였다. Sa1Ⅰ 제한 효소의 절단자리를 갖고 있는 Sal-77프라이머 및 Sph Ⅰ 제한 효소의 절단 자리를 갖고 있는 Sph 2203 프라이머는 DNA 합성기(Applied System)로 합성하였다.
이들 프라이머는 하기와 같다.
상기 용액을 0.5ml 부피 크기를 가진 소형원심분리 튜브에서 잘 혼합한후, 그 액상 표면위에 약 100㎕의 광유(Sigma)를 덮고, 퀵 써모 시스템(Quick Thermo System : Nippon Genetics Co. Ltd)에 의해 PCR을 실시하였다.
반응 조건은 다음과 같다. 94℃에서 7분동안 전처리후, 3단계 반응(55℃에서 3분 동안 어닐링(annealing)반응 ; 72℃에서 2분동안 폴리머라제 반응 및 94℃에서 2분간 변성 반응)을 35회 반복하였다. 다음 반응 혼액을 55℃에서 3분동안 처리하고 이어서 72℃에서 11동안 처리후 실온으로 복귀시켰다 (각 시간은 온도의 변화시간을 포함한다). 반응 혼합액의 일부를 아가로스 겔 전기 영동으로 분석하였고, 목적하는 TCF-Ⅱ cDNA로서 추정되는 약 2.3킬로 베이스(kb)의 DNA 단편을 수득하였다. 다음 전술한 반응 혼합물을 함유하는 4개 튜브로부터 수득된 DNA를 에탄올로 침전시키고 제한 효소 SalⅠ 및 SphⅠ로 절단하였다. 절단된 DNA의 아가로스 전기영동후 약 2.3kb의 DNA단편을 DE81페이퍼(Whatman)를 사용하여 회수하였다.
(ⅱ) 서브플로닝(Subcloning)
(ⅰ)에서 수득하여 SalⅠ 및 SphⅠ제한 효소로 절단한 약 2.3kb의 cDNA 단편을 제한 효소 SalⅠ 및 SphⅠ로 절단한 플라스미드 벡터 pUC18(Nippon Gene Co. Ltd)의 벡터 단편에 결찰 킷트(ligation kit. TAKARA SHUZO)를 사용하여 삽입한 뒤, BRL 프로토콜에 따라 에세리히아 콜리(Esherichia coli : E. coli) DH 5α로 형질 감염시켰다. 20개 이상의 서브클론을 수득할 수 있었다.
(ⅲ) 뉴클레오티드 서열의 결정
수득된 서브클론의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시-방법(Sequenase Ver. 2.0 TOYOBO)으로 서열결정하였다. 그 다음, 여러 서브클론들의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 엠플리 테크(TAKARA SHUZO)에 의해 유발된 뉴클레오티드의 병입 에러들을 수정하였다. 전술한 절차로 얻은 TCF-Ⅱ cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 그 뉴클레오티드 서열로부터 추정된 아미노산 서열을 제1a도 및 제1b도에 도시하였다. 뉴클레오티드 서열은 해독 개시 코돈 ATG에서부터 종지코돈 TAG까지 2172개의 염기쌍(bp)을 포함한다. 이 DNA가 단백질로 해독된다면, TCF-Ⅱ는 723개의 아미노산을 포함한다. 제1메티오닌 me+1으로부터 29번째 알라닌 (Ala2a)잔기까지의 아미노산 서열은 신호 서열(signal sequence)로 추정된다. α-쇄 및 β-쇄로 구성된 2개의 폴리펩티드가 디설파이드 결합으로 결합되어 있는 TCF-II는 제 1 도에 도시된 바와 같이 처음에는 일본쇄로 합성되어지는 것으로 밝혀졌다.
TCF-II 내에 있는 α-쇄의 N-말단 아미노산 서열은 그 N-말단이 차단되어 있기 때문에 확인하지 못했다. β-쇄의 N-말단 아미노산 서열 및 α-쇄 및 β-쇄의 몇 개의 내부 아미노산 서열은 상기 언급한 바대로 서열분석하여 제1a도 및 제1b도에 도시하였다. 이와같이 얻은 TCF-Ⅱ cDNA는 미야자와등(Biochemical and Biophysical Research Communication 163. 967-973(1989))에 의해 밝혀진 hHGF의 뉴클레오티드 서열과 유사성을 갖고 있었다. 그러나, TCF-Ⅱ cDNA로부터 추론된 아미노산 서열에는 hHGF cDNA로부터 추론된 아미노산 서열내 Phe162에서 ser168까지에 대응하는 5개 아미노산 잔기(F-L-P-S-S)가 결실되어 있다. TCF-Ⅱ는 hHGF의 암호 영역내에 존재하는 5개 아미노산 잔기가 결실되어 있다는 점이 다르다. 그러므로 이 사실들은 TCF-Ⅱ cDNA hHGF유전자 과중 신규한 것임을 나타냈다.
수득된 TCF-Ⅱ cDNA에 관한 상기 사실에 근거하여, 본 발명은 발현 벡터에 TCF-Ⅱ cDNA의 삽입 및 재조합 기술에 의한 TCF-Ⅱ의 생산(이후부터 재조합 기술로 생산된 TCF-Ⅱ는 rTCF-Ⅱ라 한다)으로 방향을 돌렸다. 그러므로 본 발명의 목적은 TCF-Ⅱ의 아미노산 서열을 암호하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 작제하고, TCF-Ⅱ발현 플라스미드로 세포를 형질전환하고, 형질전환된 세포를 사용하여 rTCF-Ⅱ 또는 재조합 간세포 증식인자의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 언급된 그러한 과제를 해결함으로써 실시되었다. 첫째 본 발명은 TCF-Ⅱ의 아미노산 서열을 암호하는 DNA를 함유하는 발현 플라스미드에 관한 것이다. 발현 벡터로는, 예건태 pcDNA Ⅰ(인비트로겐), pMNSM(Tsuchiya 등, Biochemical and Biophysical Research Communication 158. 576-583 (1989)) 등이 있다.
본 발명의 플라스미드는 일반적으로 다음 방법에 따라 작제하였다.
상기 언급된 바와 같이 pUC18 플라스미드(Nippon Gene)내로 서브클로닝된 TCF-Ⅱ cDNA를, 제한 효소를 사용하여 상기 플라스미드로부터 절단한다. 다른 한편으로는 제한 효소를 사용하여, 예컨대 발현 벡터 pcDNAⅠ(인비트로겐)로부터 플라스미드 단편을 절단해낸다. 다음 라가제를 사용하여 전술한 두 단편을 결합시키고, TCF-Ⅱ cDNA단편을 pcDNAⅠ 단편내로 삽입시키므로서 TCF-Ⅱ발현 플라스미드를 작제한다. TCF-Ⅱ cDNA, 플라스미드 단편 등을 절단하는데에는 잘 알려진 다양한 종류의 제한 효소를 사용할 수 있고 특히 BamHⅠ, SphⅠ 등이 제한 효소로서 사용하기에 바람직하다. 또한, 리가제로서 T4DNA리가제가 바람직하다. 플라스미드 단편들의 절단 및 그들의 결합은 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 본 발명에서 다량의 TCF-Ⅱ 발현을 위한 플라스미드 pcDTCFdh는 다량으로 r TCF-Ⅱ를 발현할수 있고, 제4도에 나타난 방법에 따라 작제할 수 있다. 마우스 DHFR발현 플라스미드 PAdD26SVpA(3) (Prco. Natl. Acad. Sci. USA 82. 689-693(1985))를 제한 효소 EcoRⅠ 및 BamHⅠ과 제한 효소 BamHⅠ 및 PstⅠ으로 각각 절단하였다. 각각 절단된 플라스미드를 ME아가로스겔(1%, TAKARA SHUZO)을 사용하여 전기 영동한 후, 1.8 kb 및 0.5kb DNA 단편을 각 플라스미드로부터 각각 DE81 페이퍼(Whatman)를 사용하여 회수하였다.
마우스 DHFR 발현 플라스미드, pBAdDSV는 상기 두가지 DNA단편(1.8kb 및 0.5kb DNA)과 EcoRⅠ 및 PstⅠ으로 절단한 블루스크립트(Bluescript) SK (Stratagene)를 혼합하고, T4 DNA 리가제로 결찰시켜 작제하였다. 다량의 TCF-Ⅱ 발현을 위한 플라스미드인 pcDTCFdh는 다량으로 TCF-Ⅱ를 발현할 수 있고, 이것은 플라스미드 pBAdDSV를 NaeⅠ으로 절단하고 크레노우 단편(Krenow fragment)으로 평활 말단화시키므로써 수득되는 2.4 kb DNA단편을 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드(제2도, 6.3kb)내로 T4 DNA리가제를 사용하여 삽입시켜 수득하였다.
이와같이 수득된 플라스미드 pcDTCFdh는 거대분자비루스 프로모터 및 이 프로모터와 SV40초기 유래의 접합(splicing) 및 폴리아데닐화 부위 사이에 위치하는 TCF-Ⅱ cDNA로 구성되는 TCF-Ⅱ 발현 단위와 아데노비루스 후기 프로모터 및 이 프로모터와 SV40 초기 유전자 유래의 폴리아데닐화 부위사이에 위치하는 마우스 DHFR 유전자로 구성되는 마우스 DHFR 발현 단위를 함유한다.
상기와 같이 수득된 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드는 이. 콜리(E. Coli : Esherichia coli)를 사용하여 증폭시킨 후, 이 콜리로부터 정제한다. 시판용으로 입수 용이한 MC1061/P3등과 같은 다앙한 종류의 이.콜 리가 이용될수 있다. 상기 플라스미드를 선발하고 이 플라스미드를 갖고 있는 이.콜리를 암피실린 등을 함유하는 배지에서 배양하여 증폭시킨 뒤, 이.콜리로부터 정제한다. 본 발명에서는 상기 발현 플라스미드(제2도)로 이.콜리 MC 1061/P3을 형질 감염(transfection)시켜 얻은 형질 전환체를 수탁번호 FERM BP-3479로서 통상산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술연구소(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology)에 기탁하였다.
또한, 본 발명은 전술한 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드를 가지고 세포를 형질 감염(transfection)시켜 얻은 형질전환 세포에 관한 것이다. Cos-1, CHO, Namalwa, Φ2, NIH 3T3, BHK 세포등과 같은 포우류의 세포들이 사용하기에 바람직하다. 형질 감염은 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 리포펙틴(lipofectin), 전기 침투(electroporation)등과 같은 일반적으로 사용되는 방법들에 따라 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 수득된 형질전환 세포의 배양에 의한 rTCF-Ⅱ의 생산 및 배양액으로부터 rTCF-Ⅱ의 정제에 관한 것이다. 상기 배양은 WO90/10651에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 즉, 형질 전환된 포유 동물의 세포는 혈청 배지 또는 무혈청 배지중에서 증식배양한다. 갓 태어난 송아지의 혈청을 5% 함유하는 돌베코의 변형된 이글배지(DMEM)를 기본 배지로서 이용한다. 아미노산, 트랜스페린(transferin), 지방산 및 인슐린 등과 같은 호르몬을 필요에 따라 배지에 첨가할 수도 있다.
상기 세포를 상기 배지에서 배양하고, T-플라스크 등을 사용한 정치 배양, 마이크로캐리어(microcarrier)를 사용한 부유 배양 및 중공 섬유 또는 세라믹 캐리어를 사용한 연속배양을 배양 시스템으러서 사용할 수 있다. 상기 배양은 배양 조건으로서 20-37℃에서 5%CO2를 함유한 대기에서 실시하고 상기 배지는 2내지 3일마다 교환하는 것이 바람직하다. 세포농도가 최적에 도달한 후 상기 배지는 7내지 10일마다 교환하고 배양액을 수거한다. 수거한 배양액으로부터 목적하는 당단백질을 수거된 배양액으로부터 정제한다. 먼저, 배양액을 분자량 6000의 구멍크기를 가진 막을 사용하여 한외 여과(UF)로 약 10배 농축한다. UF 농축물에 존재하는 목적 당단백질을 양이온 교환 수지에 흡착시키고 다음 0.3 내지 0.6M NaCl을 함유하는 완충액으로 상기 수지로부터 용출시킨다. CM 세파덱스 C-50(파마시아) 등을 이온 교환 수지로 이용할 수 있다. 강력한 간세포 증식자극 활성 또는 마우스 L929-C18 세포에 대한 세포독성 활성을 가진 용출된 분획을 수거하고, 연속적으로 당단백질용 친화성 크로마토 그래피에적용한다. ConA-세파로즈(파마시아)가 목적하는 당단백질용 친화성 크로마토 그래피에 특히 적합하다. 친화성 칼럼은 0.5M NaCl을 함유하는 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 평형화하고, 수거된 상술한 활성 분획을 상기 칼럼에 부하한다. 평형화 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 칼럼에 흡착된 당단백질의 탄수화물쇄에 상응하는 탄수화물을 함유하는 용출 완충액으로 칼럼으로부터 상기 활성 물질을 용출시킨다. 전술한 Con A-세파로스를 사용하는 경우에는 α-메틸-D-만노피라노사이드(mannopyranoside)를 함유하는 완충액으로 활성물질을 용출시킨다. 이와같이 용출된 활성 분획을 물에 대해 투석한 후, 동결 건조한다. 그 동결 건조된 활성 물질을 0.2 M NaCl을 함유하는 pH 6.0 내지 7.0의 0.05M Tris-HCl에 재용해한 후 강력한 양이온 교환 수지가 채워진 칼럼을 사용하여 HPLC로 더 정제한다. 모노 S(Mono S) 칼럼(파마시아)은 HPLC를 위한 강력한 양이온 교환 수지가 채워진 칼럼으로서 특히 바람직하다. 모노 S 칼럼으로부터 활성물질의 용출은 0 내지 1.0 M NaCl의 직선 구배로 실시하여 활성 분획을 수거한다. rTCF-Ⅱ는 0.6 내지 0.9M의 NaCl 농도에서 용출된다. 이와같이 얻은 활성 분획은 헤파린-세파로스(파마시아)를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 더욱 정제한다. 헤파린-세파로스 칼럼으로부터 활성물질의 용출은 0.3 내지 2.0 M NaCl의 직선 구배로 실시하며, 그 결과 1.0 내지 1.5M의 NaCl 농도에서 용출되는 목적 물질을 얻었다. 이어서 rTCF-Ⅱ의 간세포 증식자극 활성 분석을 다음과 같이 실시한다.
세그렌(Segren : Method in Cell Biology, Vo1. 13, p 29. Academic Press, New York. 1976)의 방법에 따라 위스터(Wister) 수컷 레트로부터 간세포를 분리하였다. 이와같이 얻은 간세포를 8.8×104세포/0.5ml/웰의 세포 농도로 24-웰 플라스틱 평판(Falcon)의 각 웰에 접종하였고 37℃에서 5% CO2존재하에서 배양하였다. 10% 갓 태어난 송아지 혈청(Hyclone), 10μM 덱사메타손(dexamethasone), 100 μ/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신을 보강시킨 윌리엄 E 배양배지(Flow Laboratory)를 배양 배지(하기에는 기본 배양 배지로 약칭함)로서 사용하였다. 37℃에서 24시간 배양후, 배양 배지는 시험 샘풀을 함유하는 기본 배양 배지로 교환하였다. 간세포를 24시간 동안 더 배양한 후, 배양액은3H -티미딘(Amersham) 4μCi/ml(86 Ci/mmol)를 함유하는 기본 배양배지로 교환하였다. 그다음, 2시간동안 배양후, 상기 세포의 DNA 합성량을 정량하였다.3H-티미딘으로 상기 세포를 표지함에 있어서, 병입된 방사능 활성(dpm)의 차이로 나타내었다. 이 세포를 저온 PBS, 10% 과염소산 및 95% 에탄올로 각각 2회 세척하고, 공기 건조한 후, 상기 세포를 10mM MgCl2를 함유하는 10% SDS 0.8ml에 용해시킨 다음 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 방사능 활성을 정량하였다. 그 결과로서, rTCF의 대표적인 간세포 증식자극 활성을 표1에 나타낸다.
hEGF(WAKUNAGA Pharmaceutical Co.)를 간세포 증식자극 활성의 양성 대조군으로서 이용하였다. 상기 표1의 결과는 rTCF-Ⅱ가 hEGF 보다 간세포 증식자극 활성이 더욱 강하다는 것을 나타낸다.
본 발명에서 rTCF-Ⅱ는 간세포 증식인자, 항종양인자, 백혈병분화 유도인자 및 내피조직 세포 증식인자로서 유용하다.
[도면의 간단한 설명]
제1a도 및 제1b도는 TCF-Ⅱ의 총 1차 아미노산 서열 및 그 아미노산 서열을 암호하는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제2도는 본 발명에서 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드의 작제 방법을 도식적으로 설명한 것이다.
제3도는 TCF-Ⅱ cDNA의 발현을 나타낸 것이다. 이 도면에서, -○-및 -●-은 각각 TCF-Ⅱ cDNA를 함유하지 않거나 TCF-Ⅱ cDNA를 함유하고 있는 Cos-1세포의 배양액 내에서의 HGF 활성을 나타낸 것이다.
제4도는 다량으로 TCF-Ⅱ를 발현시키기 위한 플라스미드 작제 방법을 도식적으로 설명한 것이다.
제5도는 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드를 함유한 형질전환된 나말와(Namalwa) 세포 배양액(5% CS 함유)의 CM 세파덱스 C-50 칼럼 크로마토그래피를 나타낸다. 이 도면에서 (1)과 (2)는 각각 0.3 M NaCl과 0.01% Tween 20을 함유하는 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 6.8 내지 7.0) 및 0.6MNaCl과 0.01% Tween 20을 함유하는 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.0)로 용출된 분획분이다. -○-및 -●-는 각각 280㎚에서의 광학밀도 (OD. 280㎚) 및 L929-C18 세포에 대한 세포독성의 활성을 나타낸다.
제6도는 CM 세파덱스 C-50 크로마토그래피로부터 용출된 rTCF-Ⅱ 분획분(0.6M NaCl에서 용출된 분획분)을 ConA-세파로즈 CL-6B 친화성 크로마토그래피한 결과를 나타낸 것이다. 이 도면에서 (1)과 (2)는 각각 0.5M NaCl을 함유하는 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 및 0.5M NaCl, 0.01% Tween 20 및 0.3 M α-메틸-D-만노피라노사이드를 함유하는 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 용출된 분획을 나타낸다. -○-및 -●-는 각각 280㎚에서의 광학 밀도(OD. 280㎚) 및 L929-C18 세포에 대한 세포독성의 활성을 나타낸다.
제7도는 ConA-세파로즈 CL-6B 친화성 크로마토그래피로부터 용출된 rTCF-Ⅱ 분획의 모노 S-HPLC를 나타낸 것이다.
이 도면에서, -○-,-●-및 ---는 각각 광학 밀도(OD. 280㎚), L929-C18 세포에 대한 세포독성의 활성 및 NaCl농도의 직선 구배를 나타낸다.
제8도는 모노 S-HPLC로부터 용출된 rTCF-Ⅱ 분획분의 헤파린-HPLC 를 나타낸 것이다. 이 도면에서, ―, -●- 및 ---는 각각 광학 밀도(OD.280nm), 세포독성 활성 및 NaCl 농도의 직선 구배를 나타낸다.
제 9도는 정제된 rTCF-Ⅱ의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(비환원 및 환원조건하에서)을 나타낸다.
제10도는 다양한 종양 세포주(cell line)에 대한 rTCF-Ⅱ의 세포 독성 활성을 나타낸 것이다. 이 도면에서 -▲-,-●-,-△-및-○-는 각각 육종(Sarcoma)180, Meth A육종, KB 및 IMR-90 세포에 대한 rTCF-Ⅱ의 세포독성 활성을 나타낸 것이다.
제11도는 rTCF-Ⅱ의 간세포 증식자극 활성을 나타낸 것이다.
[본 발명을 실시하는 최상의 양태]
이어서, 본 발명을 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 더욱 구체적으로 설명한다.
[실시예1]
(1) TCF-Ⅱ 발현 플라스미드의 작제
제2도에 나타낸 바와 같이 pUC18 플라스미드(Nippon Gene)내에 서브클로닝 된 TCF-Ⅱ cDNA(제1도) 및 pcDNA Ⅰ발현 벡터(인비트로겐)의 DNA 단편을 하기의 제한 효소로 처리하여 절단하였고 그 DNA단편을 수득하였다.
TCF-Ⅱ cDNA의 삽입부를 갖고 있는 pUC18 플라스미드 1㎍ 및 pcDNAⅠ 플라스미드 1㎍을 별도로 20mM Tris-HCl 완충액(10mMMgCl, 1mM DTT 및 100mM KCl을 함유, pH 8.5)10㎕에 용해하였다. 그 용액을 BamHⅠ 및 SphⅠ 제한 효소 각 1유니트로 37℃에서 1시간동안 분해하였다. 분해후 약 2.3kb를 갖는 TCF-Ⅱ cDNA 단편과 약 4.0kb를 갖는 pcDNAⅠ단편을 ME 아가로스 겔(1%, TAKARA SHUZO) 전기영동으로 분리하였고 각각 De81 페이퍼(Whatman)를 사용하여 회수하였다.
이어서, TCF-Ⅱ cDNA단편을 하기의 반응에 따라 pcDNAⅠ 단편에 삽입하였다. TCF-Ⅱ cDNA 단편 100ng 및 pcDNA Ⅰ 단편 50ng을 60mM Tris-HCl완충액(1mM ATP. 1mM 스퍼미단, 10mMmgCl및 15mM DTT함유, pH 7.6)10μ1에 용해한 후, 이어서 이 혼합액을 TDNA리가제 300유니트와 함께 15℃에서 하룻밤동안 항온 반응시켜 결찰시켰다.
그 다음, TCF-Ⅱ cDNA발현 플라스미드를 함유하는 형질전환체는 일반적으로 사용되는 방법에 따라 상기 언급된 반응 용액으로 이,콜리 MC1061/P3을 형질감염시켜 수득하였다.
이 형질전환체는 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 수탁번호, FERM BP-3479로서 기탁되어 있다. 상기 작제된 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드는 제2도에 나타낸다.
(2) TCF-Ⅱ발현 플라스미드의 제조 및 정제
상기 언급한 형질 전환된 이.콜리를 25μg/ml 암피실린을 함유하는 L-배지 1리터에서 배양한 후 그 배양액내에 클로람페니콜을 최종 170μg/ml의 농도로 첨가하여 그 배양액의 OD. 660㎚가 0.8에 도달할때까지 하룻밤동안 배양하였다. TCF-Ⅱ발현 플라스미드는 매니아티스(Maniatis) 등 (Molecular cloning 2판)의 방법에 따라 알칼리 및 폴리에틸렌글리콜로 그 플라스미드를 처리한 후 CsCl밀도 구배 초원심분리로 정제하였다.
(3) TCF-Ⅱ발현 플라스미드로 포유동물 세포의 형질전환
파커등(J. Virology 31. 360-369(1979))의 방법에 따라 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드로 인산 칼슘 방법에 따라 Cos-Ⅰ 세포를 형질 감염시켰다. 음성 대조군(negative control)으로서 pcDNAⅠ만으로 동일한 방법에 따라 Cos-Ⅰ세포를 형질감염시켰다.
(4) rTCF-Ⅱ 발현의 검증
생물학적으로 활성인 rTCF-Ⅱ의 발현을 검증하기 위해, TCF-Ⅱ 발현 플라스미드로 Cos-Ⅰ 세포를 형질전환한 후, 72시간 배양한 Cos-Ⅰ 세포의 배양 상청액내에서 rTCF-Ⅱ 발현의 지표로서 이용된 레트 간세포 증식자극 활성을 조사하였다. 래트 간세포의 DNA 합성은 고다등(Gohda et al. : J. Clin. Invest. 81. 414-419(1988))의 방법에 따라 3H-티미딘을 DNA내로 병입시키므로써 측정하였다. 그 결과를 제3도에 나타내었다. 제3도에 나타낸 바와 같이, 래드 간세포 증식자극 활성은 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드로 Cos-Ⅰ 세포를 형질 전환한 후 72시간 배양한 Cos-Ⅰ 세포의 배양상청액을 사용하여 검측하였고, 이로써 rTCF-Ⅱ발현을 검증하였다. 래트 간세포 증식자극 활성은 pcDNAⅠ 벡터만으로 형질 감염된 Cos-Ⅰ세포의 배양 상청액에서는 검출되지 않았다.
[실시예2]
(1) 다량의 TCF-Ⅱ 발현용 플라스미드의 작제
마우스 DHFR 발현 플라스미드, pAD26SVpA(3) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82. 689-693(1985))를 제한 효소 EcoRⅠ 및 BamHⅠ과 제한 효소 BamHⅠ 및 PstⅠ으로 별도로 분해하였다. 별도로 분해된 플라스미드를 ME 아가로스 겔(1%, TAKARA SHUZO)을 사용하여 전기영동한 후, 각 플라스미드로부터 1.8kb DNA 및 0.5kb DNA 단편을 DE81 페이퍼(Whatman)를 사용하여 각각 회수하였다. 마우스 DHFR 발현 플라스미드 pBAdDSV는 제한 효소 EcoRⅠ 및 PstⅠ으로 분해한 Bluescript SK (Stratagene)와 상기 두 DNA 단편(1.8kb 및 0.5kb DNA)을 혼합하고, 그 혼합액을 실시예 1에 표기된 바와 같은 방법에 따라 TDNA 리가제를 사용하여 결찰시켜 작제하였다.
pBAdDSV 플라스미를 EcoRⅠ 및 speI PstⅠ분해하였다. 전기영동으로 분리한 후, 상기 분해된 단편(EcoRⅠ-SpeⅠ, 2.4 kb)을 DE81 페이퍼(Whatman)를 사용하여 회수하고 크레노우 단편으로 평활말단화하였다. 다량의 TCF-Ⅱ 발현용 플라스미드 pcDTCFdh는 pBAdDSV플라스미드로부터의 2, 4kb DNA 단편을 NaeⅠ으로 분해한 TCF-Ⅱ 발현 플라스미드(제2도, 6.3kb)내로 TDNA리가제를 사용하여 삽입하므로써 얻었다. 이와같이 얻은 플라스미드, pcDTCFdh는 시토메가로비루스 포로모터 및 이 프로모터와 SV40 초기 유전자로부터 유래된 접합 및 폴리아데닐화 부위 사이에 위치하는 TCF-Ⅱ cDNA로 구성되는 TCF-Ⅱ 발현 단위 및 아데노비루스의 후기 프로모터와 이 프로모터와 SV40 초기유전자로부터 유래된 폴리아데닐화 부위 사이 위치하는 마우스 DHFR 유전자로 구성되는 마우스 DHFR 발현 단위를 함유한다.
(2) TCF-Ⅱ 발현 플라스미드에 의한 나말와 세포의 형질전환 및 TCF-Ⅱ 유전자의 발현
나말와 세포, ATCC CRL 1432는 하기 설명되는 바와 같은 리포펙틴(lipofectin) 방법(Focus 11(2), 37(1989))으로 TCF-Ⅱ를 다량 발현하기 위한 플라스미드 pcDTCFdh로 형질변환시켰다.
플라스미드 DNA 용액은 pcDTCFdh 플라스미드 10㎍과 pMCⅠneo 플라스미드 1㎍을 TE완충액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)10μ1에 용해하고, 이 DNA 용액에 1.5ml OPTI-MEN(GIBCO)을 첨가하여 준비하였다. 리포펙틴 용액은 BRL의 프로토콜에 따라 1.4ml의 OPTI-MEN에 리포펙틴(1㎍/ml, BRL) 0.1ml를 첨가하여 제조하였다. 나말와 세포 1×10 세포는 0.3ml의 OPTI-MEN에 현탁시켰다. 1.5ml의 리포펙틴 용액 및 0.3ml의 나말와 세포 현탁액을 전술한 플라스미드 DNA용액 1.5ml에 첨가하였다. 이 혼합액을 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 후 T-플라스크(25㎠, SUMITOMO BAKELITE Co.,)로 전이하였고 배양기에서 4시간동안 배양한 후 배양 배지(10% FCS를 함유하는 RPMI 1640) 7ml를 첨가한 다음 하룻밤동안 배양하였다. 이 세포는 배양액을 배양 배지로 교환하여 3일간 배양하였고, 다시 배양액을 500㎍/ml G418(SIGMA)을 함유하는 배양 배지로 교환하여 2주동안 배양하였다. 이 배양물로부터 얻은 G418 내성 세포를 5 nM MTX(methotrexate) 및 10% 투석된 FCS를 함유하는 α-MEM(GIBCO)에 현탁시켰고, 5,000세포/웰의 세포 농도로 96-웰 미소평판(microplate)의 각 웰에 접종하여 2주동안 배양하였다. 이와같이 얻은 MTX 내성 균주중 TCF-Ⅱ 다생산 균주들을 ELISA로 선별하였다. TCF-Ⅱ다생산 클론 GHC는 10% FCS 및 10% 하이브리도마 클로닝 인자(Origen)를 함유하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 상기 수득된 TCF-Ⅱ다생산 세포를 한계희석법으로 클로닝하고, ELISA로 TCF-Ⅱ 다생산 클론을 선별 하였다. 이 클론의 배양 상청액내 TCF-II의 생산률은 약 1.0mg/1이었다. 이 클론 GHC는 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 수탁번호, FERM BP-3480으로서 기탁하였다.
(3) rTCF-Ⅱ의 정제
1) 형질 전환된 나말와 세포 GHC의 배양
형질 전환된 나말와 세포를 5% 송아지 혈청(CS)을 함유하는 RPMI 1640배지 2.5 L에 4×10 세포/ml의 세포 농도로 접종하고 37℃에서 배양하였다. 동일 배지 2.5L를 37℃에서 매 2일 배양마다 첨가하는 유가(fed-batch) 배양법으로 20L의 배양액을 수득하였다.
2) rTCF-Ⅱ활성 분석법
마우스 L929 세포(ATCC CCL1)를 서브클로닝하였고, TCF-Ⅱ에 대해 최고의 감응성을 나타내는 서브클론 L929-C18을 선발하였다. L929-C18 세포는 10% FCS를 함유하는 돌베코의 변형된 이글배지(DMEM)에서 콘플런스(conflence)하게 배양한 후, 트립신으로 처리하여 수거하였다. 이 세포를 10% FCS 및 1㎍/ml 악티노마이신 D를 함유하는 DMEM에 6×10 세포/ml 세포농도로 현탁하였다. 이 세포 현탁액과 같은 방식으로 제조한 DMEM 50μ1를 96-웰미소평판(Falcon, 3072)의 각 웰에 첨가하였고, 본 발명의 rTCF-Ⅱ를 함유하는 샘플을 상기와 동일한 DMEM에 용해하거나 DMEM으로 희석하여 제조한 샘플용액 50㎕를 제1희석 웰에 첨가하였다. 이 두가지 용액을 잘 혼합하여 이 혼합액 50㎕를 제2희석 웰에 연속적으로 첨가한 후 잘 혼합하였다. 연속 희석 샘플을 상기 절차를 반복하여 준비하였다.
상기 세포 현탁액 50㎕를 연속 희석된 샘플을 함유하는 각 웰에 접종하였고, 세포 배양은 37℃, CO배양기내에서 2일동안 실시하였다. 배양후, 배지를 조심스럽게 제거하고 세포를 생리식염수로 2회 세척하였다. 각 웰에 부착된 생세포를 고정하고 메탄올과 물(1:4)의 혼액에 0.5% 크리스탈 비올렛액(crystal violet) 50μ1를 각 웰에 첨가하여 염색하였다. 각 웰을 증류수로 세척한 후 공기건조하였다. 각 웰내 크리스탈 비올렛은 소렌손 완충액(Sorenson's buffer : 0.1M 구연산 이나트륨(disodium citrate) 6.1ml, 0.1N HCl 3.9ml 및 에탄올 10ml의 혼합액)으로 추출하였다. 이 추출물의 흡광도를 570㎚에서 미량역가(microtiter) 분광광도계로 측정하였다.
TCF-Ⅱ의 유니트(U/ml)는 50% 세포사멸시의 희석율로 나타내었다.
3) rTCF-Ⅱ의 정제
1)에서 기술한 배양액 20L를 pH 6.2 내지 7.0으로 조정하였다. 0.05 M Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 습윤중량(wet-weight) 1.5kg의 CM 세파덱스 C-50을 전술한 배양액에 첨가하였고 목적 물질을 pH6.5 내지 7.0의 범위에서 24시간 동안 4℃에서 완만한 교반하에 수지에 흡착시켰다. 흡착후, 수지를 부흐너(Buchner)깔대기위에 와트만 번호 2의 여과지를 통하여 여과하여 수거하였다. 수거한 수지는 0.5M Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 이 세척 수지 약 1,500g을 칼럼(Φ7 x 40㎝)에 채우고 그 칼럼을 0.05M Tris-Hcl 완충액(0.01% Tween 20 및 0.3M NaCl 함유, pH 7.0)으로 용출하였다. 단백질의 용출은 280㎚흡광도로 조사하였다. 단백질을 거의 완전히 용출시킨 후 칼럼을 전술한 동일 완충액내에 함유된 0.6M NaCl의 염농도로 더 용출시켰다. 그 다음, 각 분획내의 L929-C18 세포에 대한 세포 독성 활성을 측정하였다. 이와같이 얻은 용출 프로파일을 제5도에 나타내었다. 0.6M NaCl의 염농도에서 용출된 분획이 강력한 세포독성 활성을 나타내었다. 이 분획을 rTCF-Ⅱ분획으로 표시하였다. 다음, ConA-세파로스 CL-6B(파마시아)를 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.0, 0.5M NaCl, 1mM CaCl및 1mM M8Cl함유)으로 평형화하였고, 그 겔을 칼럼(Φ2.5 x 8㎝)에 채웠다. 이 칼럼을 동일 완충액으로 잘 세척하였다. 이 칼럼 위에 CM 세파덱스 C-50 크로마토그래피로부터 얻은 rTCF-Ⅱ분획(pH 7.0)을 로딩하였다. 이 칼럼을 칼럼 베드 10배량의 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.0, 0.5M NaCl 함유)으로 다시 세척한 후, 목적물질을 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.0, 0.5M NaCl 및 0.3M α-메틸-D-만노피라노사이드 함유)으로 70ml/hr 유속으로 용출시켰다.
단백질의 용출은 광학 흡광도 280㎚로 측정하였고, 각 분획의 세포 독성 활성을 측정하였다. 이와같이 얻은 용출 프로파일을 제6도에 나타내었다. 처음 용출된 분획을 수거하고, 이 분획을 0.01M 인산염 완충액(pH 7.0)으로 희석하여 최종 NaCl 농도를 0.3M 이하로 낮추었다. 이 희석 분획을 pH 6.4 내지 7.0으로 조정한 뒤, 0.01% Tween20을 함유하는 0.01M 인산염 완충액(ph 7.0)으로 평형화한 HPLC용 모노 S 칼럼(파마시아)상에 로딩하였다. 로딩후, 0.01% Tween 20을 함유하는 0.01M 인산염 완충액(ph 7.0)으로 0.5ml/min의 유속으로 20분동안 칼럼을 세척하였고, 그 다음 0에서 1.0M NaCl 까지의 직선 구배로 0.5ml/min의 유속으로 60분 동안 용출시켰다. 용출 프로파일은 제7도에 나타내었다. 활성 분획은 0.76M NaCl에서 용출되었다. 순도를 증가시키기 위해 수거된 활성 분획을 전술한 바와 같이 희석한 뒤, 다시 모노 S 칼럼에 로딩하였다. 다시 0에서 1.0M NaCl의 구배로 용출을 실시하였다. 활성 분획을 수거하였다. 얻은 활성 분획을 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5, 0.01% Tween 20 함유)으로 희석하여 NaCl 최종 농도를 0.3M로 조정한 후, HPLC(TOSO)용 헤파린 칼럼(이 칼럼은 0.3M NaCl 및 0.01% Tween 20을 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 평형하였다)상에 로딩하였다. 로딩후 상기 칼럼을 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5, 0.3M NaCl 및 0.01% Tween 20 함유)으로 20분동안 0.5ml/min의 유속으로 세척하였다. 활성물질을 상기와 동일 완충액내에 함유된 0.3 내지 2.0M NaCl의 직선 구배로 60분 동안 0.5ml/min의 유속으로 칼럼으로부터 용출시켰다. 수득된 용출 프로파일을 제8도에 도시하였다.
이와같이 정제 rTCF-Ⅱ를 수득하였다. 20L의 배양액으로부터 활성 단백질 11.6mg을 얻었다. 세포독성 활성에 있어서 상기 정제 단백질의 비활성도는 약 5.3×10 (유니트/mg 단백질)이었다.
(4) rTCF-Ⅱ의 생리화학적 특성
전술한 절차에 따라 수득된 rTCF-Ⅱ의 생리화학적 특성은 다음과 같았다.
① SDS-포리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분자량 결정
rTCF-Ⅱ의 분자량은 0.1% SDS를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동에 의해 결정하였다. rTCF-Ⅱ의 SDS-전기영동 패턴은 제9도에 도시하였다. rTCF-Ⅱ는 비환원 조건에서 78,000±2,000 및 74,000±2,000의 2개의 인접 밴드를 나타냈다. 환원 조건하에서, rTCF-Ⅱ는 분자량 52,000±2,000의 공통 밴드 A와 분자량 30,000±2,000의 밴드 B 및 분자량 26,000±2,000의 밴드 C로 구성된 3개의 폴리펩티드 밴드로 분리되었다.
② 등전점
rTCF-Ⅱ의 등전점은 LKB 전기 영동 장치 및 파스트(Phast)겔 IEF 3-9를 사용하여 등전 집중법(isoelectric focusing)에 의해 7.4 내지 8.6으로 측정하였다.
③ 열안정성
rTCF-Ⅱ를 600 U/ml 농도로 0.01% Tween 20을 함유하는 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 용해하였다. rTCF-Ⅱ용액을 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90 및 95℃에서 10분동안 방치하였다. 각 온도에서의 열 처리후 잔존 활성을 25℃에서 방치시킨 대조군의 활성(100%)에 대한 상대적인 활성(%)으로서 평가하였다. rTCF-Ⅱ는 60℃까지 안정하였다.
④ pH안정성
0.01% Tween 20을 함유하는 표2에 나타낸 각 완충액을 제조하였다. rTCF-Ⅱ를 최종 농도 600U/ml로 각 완충액(표2)에 용해하고, 37℃에서 1시간동안 방치하였다. 잔존 세포 독성 활성을 1시간 동안 실온에서 pH8.0으로 방치시킨 대조군의 활성(100%)에 대한 상대적인 활성(%)으로서 평가하였다. rTCF-Ⅱ는 pH 6.0 내지 9.0의 범위에서 안정하였다.
⑤ N-말단 아미노산 서열
rTCF-Ⅱ 100㎍을 환원시켜 3개의 폴리펩티드, MW 52,000의 A, MW 32,000의 B 및 MW 28,000의 C를 전기 블롯(electroblot)법으로 분리하였다. 각 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열을 단백질 서열 결정기(Applied Biosystems 477 A Protein Sequencer)를 사용하여 분석하였다. 폴리펩티드 A의 N-말단 아미노산 서열은 그 N-말단이 차단되어 있었기 때문에 결정할 수 없었다. 폴리펩티드 B와 C는 하기와 같은 동일한 N-말단 아미노산 서열을 갖고 있었다.
폴리펩티드B와 C는 동일한 N-말단 아미노산 서열을 나타내므로 rTCF-Ⅱ는 MW52,000의 폴리펩티드 A가 MW32,000의 폴리텝티드 B 또는 MW 28,000의 폴리펩티드 C와 디설파이드결합을 이루고 있는 헤테로이량체(heterodimer) 구조를 가질 것으로 추정된다.
(5) rTCF-Ⅱ의 생물학적 활성
1) 종양 세포 독성 활성
인체 종양 세포 주, KB 및 마우스 종양 세포주, 육종(Sarcoma)180 및 Meth A육종을 표적 세포로서 사용하였다. 또한, 정상 세포로서 인체 태아의 허파 섬유 아세포인 IMR-90세포를 사용하였다. KB 및 육종 180 세포는 10% FCS를 함유하는 DMEM에 1×10 세포/ml의 세포 농도로 현탁하였다. Meth A육종은 10% FCS를 함유하는 RPM1 1640에 세포 농도 1×10 /ml로 현탁시켰다. 정상 세포 IMR-90은 10% FCS를 함유하는DMEM에 1×10 세포/ml의 세포 농도로 현탁시켰다. 각 세포 현탁액 50μ1를 바닥이 편평한 96-웰미량평판(Falcon, 3072)의 각 웰에 첨가하였다.
전술한 바와 같이, KB, 육종 180 및 IMR-90세포가 현탁된 10% FCS함유 DMEM, 및 Meth A 육종 세포가 현탁된 10% FCS 함유 RPMI-1640에 rTCF-Ⅱ가 용해되어 있었다. 이 rTCF-Ⅱ 용액을 상기 10% FCS를 함유하는 DMEM 또는 RPMI-1640으로 희석하여 연속 희석된 rTCF-Ⅱ 용액을 제조하였다. 연속 희석된 rTCF-Ⅱ 용액 50μ1를 각 세포 현탁액 50μ1를 함유하는 각 웰에 첨가하여 최종 rTCF-Ⅱ의 농도를 0, 2, 4, 8, 16, 31, 62, 125, 250, 500 및 1000ng/ml으로 만들었다. 잘 혼합한 후, 상기 평판을 37℃의 CO배양기내에서 4일동안 배양하였다.
각 세포 주(cell line)에 있어서, 각 웰내 생세포수를 혈구측정기(hemacytometer)로 계수하였다. 생세포수는 2회 반복 실험의 평균치로서 나타내었다. 세포독성 활성(%)는 하기식에 따라 계산하였다.
시험된 세포 주에 대한 rTCF-Ⅱ의 세포 독성 활성을 제10도에 나타내었다.
rTCF-Ⅱ는 육종 180 및 Meth A 육종에 대해 강력한 세포 독성 활성을, 또한 KB에 대해서도 세포독성 활성을 나타내었다. 그러나, rTCF-Ⅱ는 정상세포, IMR-90에 대해서는 세포 독성 활성을 전혀 나타내지 않았다.
2) 간세포 증식자극 활성
간세포를 세그렌(Segren : Method in Cell Biology, Vo1. 13, p29, Academic Press, New. York, 1976)의 방법에 따라 위스터 수컷 래트 200g으로부터 분리하였다. 수득한 간세포를 24-웰 평판(Falcon)내 각 웰에 8.8×10 세포/0.5ml/웰시스템 세포 농도로 접종하고 37℃에서 배양하였다. 윌리엄 E 배양 배지(Flow Laboratory)에 10% 태내 송아지 혈청(FCS) 및 10μM 덱사매타손(dexamethasone)을 보강한 배양 배지(하기에는 기본 배양 배지로 약칭함)로서 이용하였다. 37℃에서 24시간 배양후, 배양액을 rTCF-Ⅱ를 함유하는 기본 배양배지로 교환하였다. 간세포를 24시간 동안 더 배양한 다음, 4 μCi/ml의 H-티미딘(Amersham)을 함유하는 기본 배양 배지내에서 2시간동안 배양하였다.
배양후, 세포를 저온 PBS, 5% 과염소산 및 95% 에탄올로 각각 2회 세척하고 공기 건조하였다. 세포를 10mM MgCl를 함유하는 10% SDS 용액에 용해하였고, 그 세포의 DNA 합성을 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 방사능 활성을 측정함으로써 결정하였다. rTCF-Ⅱ의 간세포 증식자극 활성을 제11도에 도시하였다.
[산업상 이용 가능성]
본 발명은 TCF-Ⅱ의 경제적인 대량 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 TCF-Ⅱ의 아미노산 서열을 암호하는 DNA 함유 TCF-Ⅱ 발현 벡터를 작제하고, 이 발현 벡터를 사용하여 재조합 기술로 rTCF-Ⅱ를 생산함으로써 실시된다. 본 발명에서 수득된 rTCF-Ⅱ는 간세포 증식인자, 종양 세포 독성 인자등과 같은 약제학적 생성물 분야에 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 rTCF-Ⅱ는 생화학적 또는 약리적 시약으로서 이용될 수 있다.
[형질전환체에 대한 설명]
1. pcTCF(s)/MC1061/P3
기탁기관
명칭 : 통상산업성 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소
주소 : 일본국, 아미라키켄, 츠쿠바시, 히가시 1 쵸메 1반 3고
기탁일 : 1990. 7. 13
수탁번호 : FERM BP-3479
[부다페스트 조약에 의거하여 기탁 : 일본국내 수탁기관으로부터 이관(수탁번호, FERM P-11605)]
2. TCdGHC
기탁기관
명칭; 통상산업성 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소
주소:일본국, 이바라키켄, 츠쿠바시, 히가시 1쵸메 1반 3고
기탁일:1991.07.10
수탁번호:FERM BP-3480
Claims (5)
- TCF-Ⅱ의 아미노산 서열을 암호하고, 제1a도 및 제1b도에 도시된 서열을 가진 DNA를 함유하는 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 플라스미드로 형질 전환된 포유 동물 숙주 세포.
- 제2항에 있어서, 형질전환체가 통산산업성 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소에 수탁번호, FERM BP-3479로 기탁되어 있는 숙주세포.
- 제2항에 있어서, 형질전환체가 통상산업성 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소에 수탁번호 : FERM BP-3480으로 기탁되어 있는 숙주세포.
- 제1항의 플라스미드로 형질 전환된 포유 동물 숙주 세포를, 이 세포가 전술한 플라스미드에 의해 암호된 rTCF-Ⅱ를 발현하는 조건하에서 배양하고, 그 배양액으로부터 생성된 rTCF-Ⅱ를 정제하는 것을 특징으로 하는 rTCF-Ⅱ의 생산방법.
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