JPH093099A - マクロファージ刺激蛋白質改変体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】天然型マクロファージ刺激蛋白質を遺伝子工学
的に多量に製造する方法を提供する。 【構成】天然型マクロファージ刺激蛋白質のＮ−末端か
ら第６７２位のシステインが欠失されるか、または他の
アミノ酸、例えばアラニンで置換されたマクロファージ
刺激蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子断片、該遺伝
子を含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質
転換された形質転換体および該形質転換体を培養し、該
培養物からマクロファージ刺激蛋白質改変体を採取する
方法。 【効果】天然型マクロファージ刺激蛋白質をコードする
遺伝子を用いて製造した組換え蛋白質が、システイン残
基間に異常なジスルフィド結合を生じて、マクロファー
ジ刺激活性のない成分が多量に含まれるのに対して、本
発明では、マクロファージ刺激蛋白質改変体が天然マク
ロファージ刺激蛋白質と同じシステイン残基間で架橋さ
れ、その結果、マクロファージ刺激活性を有する組換え
蛋白質が大量に生産される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はマクロファージ刺激蛋白
質のアミノ酸配列のうち、Ｎ−末端から第６７２位のシ
ステインが欠失された、または他のアミノ酸で置換され
たマクロファージ刺激蛋白質改変体、該改変体をコード
する遺伝子断片、該遺伝子を含む組換えベクター、該組
換えベクターで形質転換された形質転換体および該形質
転換体を培養して、マクロファージ刺激蛋白質改変体を
製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】マクロファージ刺激蛋白質（以下、ＭＳ
Ｐと略称する）とは、例えばマウス腹腔マクロファージ
に作用して、貪食能を高め、走化性を刺激し、形態変化
を誘導する蛋白質である(Leonardら:Exp.Cell.Res.102,
434(1976), Skeelら:J.Exp.Med.,173,1227(1991))。この
ように、ＭＳＰは貪食系細胞であるマクロファージを活
性化するため、感染症の予防治療薬の可能性が期待され
ている。

【０００３】従来、ＭＳＰはヒト血清から初めて単離精
製され、その部分アミノ酸配列が決定されている（Skee
lら:J.Experimental.Medicine.173,1227(1991), Leonar
dら:米国特許第5,219,991 号) 。一方、これとは別に、
ヒト肝癌細胞であるＨｅｐＧ２から肝細胞増殖因子に相
同性のあるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配
列が報告され、肝細胞増殖因子様蛋白質（HGF-like pro
tein）と命名されている(Hanら:Biochemistry,30,9768
(1991)),Degenら: 米国特許第 5,315,000号) 。その
後、ＭＳＰの部分アミノ酸配列からクローニングされた
ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列は、該肝細胞増殖因
子様蛋白質（HGF-like protein）のアミノ酸配列と完全
に一致したことが報告されている（吉村ら:J. Biologic
al Chemistry,268,15461(1993))。さらに、このｃＤＮ
Ａを組込んだ発現ベクターで形質転換したＣＯＳ培養上
清に、ＭＳＰ活性が認められ、ＭＳＰと肝細胞増殖因子
様蛋白質（HGF-like protein）が同一蛋白質であること
が判明している。

【０００４】ＭＳＰは、シグナル配列を除くと、６９３
個のアミノ酸で構成される糖蛋白質である。ＭＳＰは一
本鎖不活性型（以下、プロ−ＭＳＰと略す）で分泌され
る。ヒトカリクレインなどの酵素が作用すると、プロ−
ＭＳＰはＡｒｇ(493) とＶａｌ(494) の間で、特異的に
ペプチド鎖が切断され、活性のある２本鎖型ＭＳＰに変
換される (Wangら:J.Biological.Chemistry,269,3436(1
994)) 。ヒトの血清から精製された天然ＭＳＰは、２本
鎖型である。非還元条件のＳＤＳ電気泳動では分子量約
７０Ｋｄの単一なバンドであるが、還元条件では分子量
約４７Ｋｄのα鎖バンドと２２Ｋｄのβ鎖バンドに分離
する。すなわち、ＭＳＰのα鎖(Gln19からArg493) とβ
鎖(Val494 からGly711) は、ジスルフィド結合で架橋さ
れている。肝細胞増殖因子やプラスミノーゲンのアミノ
酸配列から類推すると、ＭＳＰのアミノ酸配列上のＣｙ
ｓ(468) とＣｙｓ(588) の間のジスルフィド結合が、α
鎖とβ鎖を架橋すると考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、生理活
性（マクロファージ刺激性）を保持したＭＳＰ組換え蛋
白質を大量に安価に提供する目的で、ＣＨＯ細胞を宿主
細胞にして、天然型ＭＳＰをコードする遺伝子をもと
に、天然型ＭＳＰを発現する組換え体を作製した。しか
しながら、本発明者らがＣＨＯ組換え体の培養上清につ
いて調べたところ、２本鎖活性型ＭＳＰと同時に遊離し
たα鎖とβ鎖を生じた。ＭＳＰ組換え蛋白質の一部がα
鎖とβ鎖の間のジスルフィド結合を形成していないこと
が判明した。さらに、これら遊離したα鎖とβ鎖には、
マクロファージを活性化する作用が認められなかった。

【０００６】上述のように、ＭＳＰ組換え蛋白質の一部
でα鎖とβ鎖を架橋するジスルフィド結合が形成されて
いなかった。生合成されたポリペプチド鎖が細胞内で折
り畳まれてフォールディング(folding) する過程には、
さまざまの蛋白質が関与していることが、近年、知られ
てきている。プロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ
(PDI) 、ペプチディル・プロリル・シス−トランス・イ
ソメラーゼ、またシャペロンと総称されるストレス蛋白
質などである。組換え蛋白質のフォールディングは、宿
主細胞のこれらシャペロン様蛋白質の助けを借りて達成
される。このため、組換え蛋白質を天然蛋白質と同じフ
ォールディングさせるには、天然における産生細胞によ
り近い宿主細胞を選ぶのが有利である。しかしながら、
それには限界があり、そのため組換え蛋白質が天然の蛋
白質と異なったフォールディングやジスルフィド結合を
する可能性が常に考えられる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＭＳＰ組
換え蛋白質のジスルフィド結合に関連して、ＭＳＰのア
ミノ酸配列を詳細に検討した。ＭＳＰのアミノ酸配列
は、プラスミノーゲンや肝細胞増殖因子と同じくクリン
グルドメインとセリンプロテアーゼ類似ドメインで構成
される。このドメイン部分のアミノ酸配列は、これらの
蛋白質間で相同性がある。ＭＳＰにはシステインが全部
で４４個あり、４０個はプラスミノーゲンのアミノ酸配
列にも類似した位置に保存されている。 Hanらが詳しく
述べているように(Hanら:Biochemistry,30,9708(199
1))、プラスミノーゲンのアミノ酸配列から類推して、
大部分のシステインについて、ジスルフィド結合の組み
合わせが推定できる。すなわち、５６と７８、６０と６
６、１１０と１８６、１３１と１６９、１５７と１８
１、１９１と２６８、２１２と２５１、２４０と２６
３、２８３と３６１、３０４と３４３、３３２と３５
５、３７０と４４８、３９１と４３１、４１９と４４
３、５０７と５２３、６０２と６６７、６３２と６４
６、６５７と６８６、１９４と３２４、４６８と５８８
である（図１参照）。

【０００８】しかし、Ｃｙｓ(98)、Ｃｙｓ(527) 、Ｃｙ
ｓ(562) 、Ｃｓｙ(672) の４個のシステインは、プラス
ミノーゲンをはじめ、多数の類縁蛋白質のアミノ酸配列
にまったく保存されていない。このため、これらのシス
テインがどのような組み合わせで、ジスルフィド結合し
ているのか、もしくはフリーの状態で存在するのかにつ
いては今までに情報がない。本発明者らは、これら４個
のシステインのいずれかが、Ｃｙｓ(468) ないしＣｙｓ
(588) とジスルフィド結合するために、本来のα鎖とβ
鎖を架橋するＣｓｙ(468) とＣｙｓ(588) の間のジスル
フィド結合が形成できないのではないかと考えた。

【０００９】本発明者らは、さらに蛋白質の立体構造に
関する知見をもとに、上記の可能性をさらに検討した。
蛋白質分子内でジスルフィド結合するには、２つのシス
テイン残基の側鎖が空間的に近い距離に存在するはずで
ある。ＭＳＰの３次元立体構造に関しては、Ｘ線結晶構
造解析がなされていない。しかしながら、ＭＳＰのβ鎖
はセリンプロテアーゼ類似ドメインであり、アミノ酸配
列に相同性のある多数の類縁蛋白質について、既にＸ線
結晶構造が決定されている(Stephenら:Biochemistry,2
7,8097(1988)、Randy ら:Biochemistry,23,6570(198
4))。このセリンプロテアーゼ類縁蛋白質の３次元立体
構造が相互によく保存されていることが知られている。
そこで、セリンプロテアーゼであるウシトリプシンの結
晶構造に当てはめて、ＭＳＰのβ鎖内にあるＣｓｙ(52
7) 、Ｃｓｙ(562) 、Ｃｓｙ(588) 、Ｃｙｓ(672) の相
互間の距離を推定してみた。その結果、Ｃｙｓ(672) が
Ｃｙｓ(588) と空間的に近いと推定された。もし、Ｃｙ
ｓ(672) とＣｙｓ(588) がジスルフィド結合を形成すれ
ば、Ｃｙｓ(588) とＣｙｓ(468) の間のジスルフィド結
合が形成されない。このため 493位と 494位の間でペプ
チド消化されると同時に、２本鎖活性体とならずに活性
のないα鎖とβ鎖に遊離してしまう。

【００１０】本発明者らは、これらの知見をもとに、組
換えＤＮＡ技術、特定部位特異的変換法(Site directed
mutagenesis) により、ＭＳＰの 672位のシステイン
（Ｃｙｓ）に変異を導入したところ、ＭＳＰ活性を有す
る２本鎖活性型の組換えＭＳＰが効率よく産生されるこ
とを見いだし、本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち本発明はマクロファージ刺激蛋白
質を構成するアミノ酸配列のシステンが欠失された蛋白
質または他のアミノ酸で置換された蛋白質であることを
特徴とするマクロファージ刺激蛋白質改変体である。

【００１２】また本発明は配列表・配列番号１に記載さ
れるマクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列
のＮ−末端から第６７２位のシステインが、欠失された
蛋白質または他のアミノ酸で置換された蛋白質であるこ
とを特徴とするマクロファージ刺激蛋白質改変体であ
る。

【００１３】また本発明は配列表・配列番号１に記載さ
れるマクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列
のＮ−末端から第６７２位のシステインが、欠失された
蛋白質であるマクロファージ刺激蛋白質改変体である。

【００１４】さらに本発明は配列表・配列番号１に記載
されるマクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配
列のＮ−末端から第６７２位のシステインが、他のアミ
ノ酸で置換された蛋白質であることを特徴とするマクロ
ファージ刺激蛋白質改変体である。

【００１５】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
１に記載されるアミノ酸配列のＮ−末端から第６７２位
のシステインが、アラニンで置換された蛋白質であるマ
クロファージ刺激蛋白質改変体である。

【００１６】本発明は配列表・配列番号１に記載される
マクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ
−末端から第６７２位のシステインが欠失された蛋白質
であるマクロファージ刺激蛋白質改変体をコードする遺
伝子断片である。

【００１７】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
２に記載される塩基配列の第2014位から第2016位の塩基
配列が欠失された、マクロファージ刺激蛋白質改変体を
コードする遺伝子断片である。

【００１８】また本発明は配列表・配列番号１に記載さ
れるマクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列
のＮ−末端から第６７２位のシステインが、他のアミノ
酸で置換された蛋白質であるマクロファージ刺激蛋白質
改変体をコードする遺伝子断片である。

【００１９】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
１に記載されるアミノ酸配列のＮ−末端から第６７２位
のシステンが、アラニンで置換された蛋白質であるマク
ロファージ刺激蛋白質改変体をコードする遺伝子断片で
ある。

【００２０】本発明はベクターが配列表・配列番号１に
記載されるマクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ
酸配列のＮ−末端から第６７２位のシステインが欠失さ
れた蛋白質であるマクロファージ刺激蛋白質改変体をコ
ードする遺伝子断片を含むことを特徴とする組換えベク
ターである。

【００２１】また本発明はベクターが配列表・配列番号
１に記載されるマクロファージ刺激蛋白質を構成するア
ミノ酸配列のＮ−末端から第６７２位のシステインが、
他のアミノ酸で置換された蛋白質であるマクロファージ
刺激蛋白質改変体をコードする遺伝子断片を含むことを
特徴とする組換えベクターである。

【００２２】本発明は宿主細胞が配列表・配列番号１に
記載されるマクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ
酸配列のＮ−末端から第６７２位のシステインが欠失さ
れた蛋白質であるマクロファージ刺激蛋白質改変体をコ
ードする遺伝子断片を含む組換えベクターで形質転換さ
れた形質転換体である。

【００２３】また本発明は宿主細胞が配列表・配列番号
１に記載されるマクロファージ刺激蛋白質を構成するア
ミノ酸配列のＮ−末端から第６７２位のシステインが、
他のアミノ酸で置換された蛋白質であるマクロファージ
刺激蛋白質改変体をコードする遺伝子断片を含む組換え
ベクターで形質転換された形質転換体である。

【００２４】本発明は配列表・配列番号１に記載される
マクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ
−末端から第６７２位のシステインが、欠失された蛋白
質であるマクロファージ刺激蛋白質改変体をコードする
遺伝子を含む組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、
該形質転換体を培養し、該培養物からマクロファージ刺
激蛋白質改変体を採取することを特徴とするマクロファ
ージ刺激蛋白質改変体の製造法である。

【００２５】また本発明は配列表・配列番号１に記載さ
れるマクロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列
のＮ−末端から第６７２位のシステインが、他のアミノ
酸で置換された蛋白質であるマクロファージ刺激蛋白質
改変体をコードする遺伝子を含む組換えベクターで宿主
細胞を形質転換し、該形質転換体を培養し、該培養物か
らマクロファージ刺激蛋白改変体を採取することを特徴
とするマクロファージ刺激蛋白質改変体の製造法であ
る。

【００２６】本発明のＭＳＰ改変体とは、ヒトＭＳＰの
アミノ酸配列（配列表・配列番号１）において、第 672
位のシステインが欠失もしくは他のアミノ酸配列で置換
されたものである。好ましくはシステインがシステイン
以外の１個のアミノ酸、例えばアラニン、グリシン、セ
リンなどで置換されたＭＳＰ改変体である。

【００２７】本発明のＭＳＰ改変体をコードする遺伝子
断片としては、配列表・配列番号１に記載されるＭＳＰ
をコードするＤＮＡの塩基配列の第2014〜2016番目の塩
基が欠失、もしくは他のアミノ酸配列をコードする塩基
配列で置換されたものである。

【００２８】ＭＳＰ改変体をコードするＤＮＡとして
は、ＭＳＰをコードするメッセンヤーＲＮＡから組換え
ＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤＮＡまたは染色体
ＤＮＡから得られるｈＭＳＰをコードするＤＮＡなどが
利用できる。ＭＳＰｃＤＮＡとしては、ＭＳＰをコード
しているものであればいかなるものも用いることができ
るが、具体的には配列表・配列番号１に記載されるもの
を用いることができる。

【００２９】ＭＳＰｃＤＮＡを調製する方法としては、
例えば、酸性グアニジウム・チオシアネート・フェノー
ル・クロロフォルム抽出法 [Analytical Biochemistry,
162, 156-159(1987)]により、培養細胞あるいはヒト組
織より、全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセルロースカラ
ムあるいは Oligotex-dt30 (日本ロッシュ) を用いてポ
リＡ・ＲＮＡとする。オリゴｄＴプライマーを用いて、
逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成することがで
き、さらにＲＮａｓｅとＤＮＡポリメラーゼＩを作用さ
せることにより２本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。得
られたｃＤＮＡをλファージ等に組み込み、ヒトＭＳＰ
のＤＮＡ情報を基に作製したプローブを用いてヒトＭＳ
ＰのｃＤＮＡをスクリーニングすることができる。ま
た、ヒトＭＳＰのＤＮＡ情報を基に適当なＰＣＲプライ
マーを作製し、ＰＣＲ反応を行うことによってもヒトＭ
ＳＰのｃＤＮＡを得ることができる。

【００３０】ＭＳＰ遺伝子に変異を導入する方法は、例
えばＴ７ Gen In Vitro Mutagenesis Kit (United Stat
es Biochemical社製) を利用する方法がある。すなわち
ＭＳＰ遺伝子クローンより１本鎖ＤＮＡを調製し、変異
を導入したい部位の前後、約４０bpの領域にわたり変異
や欠失を含む逆ストランドのプライマーを作製し、１本
鎖ＭＳＰとアニールさせる。その後、例えば5-Methyl-d
CTP 存在下でＴ７ＤＮＡポリメラーゼによりプライマー
から鋳型の相補鎖を合成し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼ
により２本鎖環状ＤＮＡを作製する。その後、例えばＭ
ｓｐＩやＨｈａＩ等により鋳型や不完全伸長鎖を切断
し、残った新たに合成された変異をもったＤＮＡで大腸
菌を形質転換することによりＭＳＰ改変体をコードする
遺伝子が得られる。

【００３１】本発明の組換えベクターは、上記ＭＳＰ改
変体をコードする遺伝子断片が、ＤＮＡの発現機能をも
つ適当なベクター（プラスミド）に組み込まれたもので
ある。ベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミ
ド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、
あるいは動物ウイルス由来のプラスミドなどがあげられ
る。

【００３２】ＭＳＰ改変体をコードするＤＮＡとベクタ
ーＤＮＡとの組換えは、制限酵素を用いて、両ＤＮＡを
消化後、T4ＤＮＡリガーゼを用いて結合する一般的組換
えＤＮＡ技法を用いて行うことができる。結合に際して
は、制限酵素を用いて消化したＤＮＡ断片の末端を、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を用いる埋め込み反
応、T4ＤＮＡポリメラーゼを用いる埋め込み反応または
削り込み反応を利用して加工する方法やＤＮＡリンカー
を用いる方法によっても行うことができる。

【００３３】このようにして構築されたＭＳＰ改変体を
コードする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクタ
ーを用いて、該ベクターを保持する形質転換体を製造す
る。宿主細胞としては、たとえば大腸菌、枯草菌、酵
母、動物細胞などが挙げられる。宿主細胞として用いる
動物細胞としては、サル細胞ＣＯＳ−１、チャイニーズ
ハムスターＣＨＯ細胞などが挙げられる。

【００３４】上記宿主細胞を形質転換するには、たとえ
ば、Methods in Enzymology(Goeddel 編、(1991)、185
巻、Academic press,inc.)などに記載の方法に従って行
う。動物細胞を形質転換するには、たとえばリポフェク
ション法を用いて行う。このようにして、ＭＳＰ改変体
をコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベク
ターを保持する形質転換体が得られる。

【００３５】該形質転換体を培地に培養することによ
り、ＭＳＰ改変体を産生させる。宿主が動物細胞である
形質転換体を培養する際には、培地としてはたとえば約
１〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地(Science,12
2,501(1952))、RPMI1640培地(Journal of the American
Medical Association,199,519(1967)) などが挙げられ
る。ｐＨは約６〜８であることが好ましい。培養時間は
約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加
える。

【００３６】

【実施例】次に本発明を実施例により詳細に説明する。実施例１ ヒトＭＳＰの遺伝子クローニング セルライン Hep G2 由来のｍＲＮＡを鋳型に下記プライ
マー１、プライマー２およびＰｆｕポリメラーゼを用い
て、ＰＣＲ反応を行った。得られた０．３６ｋｂのフラ
グメントをpBlueScript sk⁺ （ストラタジーン製) の制
限酵素ＥｃｏＲＶの部位にサブクローニングした。サブ
クローニングで得られたクローンのＤＮＡ配列を確認の
後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で処理し、挿入
されたＭＳＰの０．３６ｋｂのフラグメントを得た。
このフラグメントをＤＮＡプローブとして、上記セルラ
イン Hep G2由来のｃＤＮＡライブラリー（クローンテ
ック社製）より５×１０⁵ クローンをスクリーニングし
て４個の陽性クローンを得た。この中でインサートの長
さが約２．３ｋｂと最長のクローン（ＭＳＰ９）を選
び、制限酵素ＥｃｏＲＩで約２．３ｋｂのインサートを
切り出し、pBlueScript sk⁺ の制限酵素ＥｃｏＲＩの部
位にサブクローニングした。得られたクローン（ｐＢＳ
（ＭＳＰ９））のＤＮＡ配列を確認し、配列表・配列番
号１に記載される配列であることを確認した。 プライマー１： TGGCCATTGAATGACTTCCA プライマー２： TGATCATTCGGGAACTTGTG

【００３７】実施例２ 天然型ＭＳＰの 672位のＣｙｓ
をＡｌａに変換したＭＳＰ改変体（以下、C672A と略記
することもある）ＭＳＰ遺伝子のＣＨＯ発現用ベクターｐＥＶＳＶへの組
み込み ヒトＭＳＰのｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドベクタ
ー、ｐＢＳ（ＭＳＰ９））から、制限酵素EcoRI で消化
することにより、ヒトＭＳＰのｃＤＮＡを含む２．３ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をT4ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、ラージフラグメント（クレノーフラ
グメント）により処理し、平滑末端ＤＮＡとした。次に
ＣＨＯ用発現ベクターｐＥＶＳＶの遺伝子挿入部位にあ
るＥｃｏＲＶの制限酵素サイトを消化し、セルフライゲ
ーションを防ぐため、アルカリフォスファターゼ(BAP)
処理を行った。ＥｃｏＲＶ消化で平滑末端ＤＮＡを持つ
ベクターと、上述のヒトＭＳＰｃＤＮＡを含むＤＮＡ断
片を混ぜ、T4ＤＮＡリガーゼにより連結した。連結した
ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピ
シリン含有のＬＢプレート上にまいた。ＳＶ４０の初期
プロモーターと順方向にヒトＭＳＰのＤＮＡが挿入され
ているクローンを選択し、ＣＨＯ用発現ベクターｐＥＶ
ＳＶ（ＭＳＰ）を得た。

【００３８】ＭＳＰ改変体 (C672A)をコードする遺伝子
の製造 ＭＳＰのＣＨＯ用発現ベクターｐＥＶＳＶ（ＭＳＰ）
を、制限酵素BamHI で消化し、ヒトＭＳＰのＣ末部分を
含む１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、１本鎖ＤＮ
Ａを得ることができるファージベクターＭ１３ｍｐ１８
を制限酵素BamHIで消化し、先に得られたＭＳＰのＣ末
部分を含む１．６ｋｂのＤＮＡ断片と混ぜ、T4ＤＮＡリ
ガーゼにより連結した。連結したＤＮＡを用いて大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換し、Ｈプレート上にまいた。ＭＳ
ＰのＣ末部分のマイナス鎖が放出される方向にＭＳＰの
Ｃ末部分を含む１．６ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されてい
るクローンを選択し、Ｍ１３ｍｐ１８（ＭＳＰ）を得
た。得られたクローンを培養することにより、導入され
たＤＮＡ断片を含む一本鎖状Ｍ１３ｍｐ１８をファージ
粒子の形で培地に放出した。この一本鎖ＤＮＡを精製し
て変異導入のための鋳型として使用した。ここで得られ
た一本鎖ＤＮＡはＭＳＰのＣ末部分のマイナス鎖を含ん
でいる。

【００３９】ＭＳＰの 672位のシステインをアラニンに
変換するため、オリゴヌクレオチド (5'- T GCC TGC TTT ACC CAC AAC GCC TGG GTC CTG GAA GGA ATT -3' A C F T H N A W V L E G I を合成した。このオリゴヌクレオチド４００ピコモルを
T4ＤＮＡキナーゼを用い5'-OH 末端をリン酸化した。こ
のうち２０ピコモルを用い、先に調製したヒトＭＳＰの
Ｃ末部分のマイナス鎖を含む一本鎖状Ｍ１３ｍｐ１８Ｄ
ＮＡを鋳型として、変異導入のためのキット、T7 GEN
（United States Biochemical 社製）を使用して変異の
導入を行った。得られたＤＮＡを大腸菌Ｋ８０２株(mcr
B-) にトランスフォームし、大腸菌ＪＭ１０９株(F')を
ローンにＬＢプレートにまいた。得られたプラークより
ファージを大腸菌ＪＭ１０９株に感染させ、培養し菌体
よりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡのうち１１クロ
ーンについて、ＤＮＡ配列の確認を行ったところ、２ク
ローンに変異の導入が確認され、 672位のシステインが
アラニンに変換されたクローンＭ１３ｍｐ１８(C672A)
を得た。

【００４０】ＭＳＰ改変体(C672A) をコードする遺伝子
のCHO発現ベクターへの組み込み ＭＳＰのｃＤＮＡが組み込まれた発現ベクターｐＥＶＳ
Ｖ（ＭＳＰ）から、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消
化することにより、ヒトＭＳＰのｃＤＮＡのＮ−末端部
分とＳＶ４０の初期プロモーター領域を含む２．１ｋｂ
ペアのＤＮＡ断片を得た。また先に変異が導入されたＭ
１３ｍｐ１８(C672A) を制限酵素SmaIとBglII とで消化
することにより、ＭＳＰのｃＤＮＡのＣ末部分を含む
０．６ｋｂペアのＤＮＡ断片を得た。次にＣＨＯ用発現
ベクターｐＥＶＳＶの遺伝子挿入部位にある制限酵素サ
イトＥｃｏＲＶと、ＳＶ４０の初期プロモーター領域の
直前にある制限酵素サイトＥｃｏＲＩとでベクターを消
化し、ＤＨＦＲ遺伝子等を含む４．６ｋｂペアのＤＮＡ
断片を得た。以上で得られた３種のＤＮＡ断片を混ぜ、
T4ＤＮＡリガーゼにより連結した。ＥｃｏＲＩ切断部位
はＥｃｏＲＩ切断部位と、ＢｇｌII切断部位はＢｇｌII
切断部位と連結され、ＥｃｏＲＶ切断部位とＳｍａＩ切
断部位は共に平滑末端となるため、両制限酵素による切
断部位同士が連結された。連結したＤＮＡを用いて大腸
菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン含有のＬＢプ
レート上にまいた。ＭＳＰ改変体(C672A) のｃＤＮＡが
挿入されているクローン、ｐＥＶＳＶ(C672A)を選択し
た。

【００４１】形質転換体作製のためのベクターＤＮＡの
調整 ４０mlのＬＢ培地にアンピシリンを100mg/ml添加し、ｐ
ＥＶＳＶ(C672A) あるいはｐＥＶＳＶ(C672A) を保有す
る大腸菌のクローンを一晩培養した。得られた菌体よ
り、アルカリ法によりプラスミドＤＮＡを調製し、得ら
れたＤＮＡを更に、塩化セシウムによる超遠心分離にて
精製し、ヒトＭＳＰおよびＭＳＰ改変体(C672A) のＣＨ
Ｏ細胞を宿主とする組換え体の作製に用いた。

【００４２】ＣＨＯ細胞を宿主とする組換え体の作製 ＣＨＯ細胞の形質転換は、リポフェクション法を用い
た。φ60mmディッシュに1.0 ×10⁶ 個のＣＨＯ細胞を播
種し、10% ＦＣＳを添加したαＭＥＭ培地にて１日間培
養した。ヒトＭＳＰもしくはＭＳＰ改変体(C672A) 発現
プラスミド、20μg をOpti-MEM I培地 100μl に懸濁し
た。リポフェクチン溶液（GIBCO 社）25μl を血清を含
まないOpti-MEM I培地75μlと混合した。これにＤＮＡ
懸濁液 100μl を混合後、15分間室温に静置して、ＤＮ
Ａ−リポフェクチン複合体を形成させた。さらに、 1.8
mlのOpti-MEM I培地を加えて全量を 2mlにした。ディッ
シュのＣＨＯ細胞に、このＤＮＡ−リポフェクチン複合
体溶液 2mlを全量加え、37℃、5%ＣＯ₂ インキュベータ
ー中に18〜24時間静置して形質転換した。10% ＦＣＳを
添加したαＭＥＭ培地に置き換え、さらに１日間培養し
た。こうして得られた形質転換体を含む細胞を、ディッ
シュまたはフラスコに適当な細胞数で播種しコロニーを
形成させた。培養は、核酸を含まないαＭＥＭ合成培地
に透析により核酸を除いたＦＢＳを10% 加えた培地で培
養した。コロニーの単離は、ペニシリンカップを用い
た。採取したコロニー細胞を上記の核酸を含まないαＭ
ＥＭ培地中で12-well の培養プレートに拡大培養後、上
清のヒトＭＳＰおよびＭＳＰ改変体(C672A) の発現量を
免疫学的測定法(Wang ら:J.Leukoc.Biol.54,289(1993))
で調べた。

【００４３】ＣＨＯ組換え体の培養と、ＭＳＰおよびＭ
ＳＰ改変体(C672A) の精製 ＭＳＰもしくはＭＳＰ改変体(C672A) のＣＨＯ組換え体
を、10% ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ培地を用い
て、T225フラスコにコンフルエントになるまで拡大培養
した。１本鎖型の組換えＭＳＰを得るため、50μg/mlの
ロイペプチンを添加した無血清ＲＰＭＩ培地に置き換え
た。１日毎に培養上清を採取し、全量約１Ｌの培養上清
をそれぞれの組換え体について得た。この培養上清を、
抗ヒトＭＳＰモノクローナル抗体カラムにロードした。
リン酸緩衝液でよく洗浄後、ｐＨ２．８のグリシン緩衝
液にて組換えＭＳＰもしくはＭＳＰ改変体(C672A) を溶
出させた。こうして得られた粗精製物を、ＳＤＳ電気泳
動で分析した（図４）。発色は銀染色を用いた。１本鎖
型ＭＳＰは還元非還元に関わらず、約７０ｋｄの単一バ
ンドであるが、２本鎖ＭＳＰは還元時には約４７ｋｄの
α鎖バンドと２２ｋｄのβ鎖バンドに分離する。図４に
示すように、上記ロイペプチン添加の無血清培地から得
た組換えＭＳＰおよびＭＳＰ改変体(C672A) は、還元条
件下のＳＤＳ電気泳動でも、約９０Ｋｄの単一バンドで
あり、１本鎖型ＭＳＰである（以下、それぞれプロ−Ｍ
ＳＰ、プロ−C672A と呼ぶ）。

【００４４】プロ−ＭＳＰおよびプロ−C672A のカリク
レイン処理 ヒトカリクレイン(American Diagnostica)を用いて、プ
ロ−ＭＳＰおよびプロ−C672A 精製物の 493位のアルギ
ニンと 494位のバリンの間でペプチド結合を特異的に消
化した。すなわち、1mg のヒトカリクレインをAffi-Gel
10 カラムに結合し、プロ−ＭＳＰおよびプロ−C672A
精製画分を通過させた。こうして得られたそれぞれの画
分について、還元条件のＳＤＳ電気泳動を調べた（図
４）。カリクレイン処理前のプロ−ＭＳＰおよびプロ−
C672A では約７０ｋｄの単一なバンドであった。カリク
レイン処理により、このバンドが完全に消失し新たに約
４７ｋｄと２２ｋｄのそれぞれα鎖とβ鎖に対応するバ
ンドを生じた。すなわち、カリクレイン処理によりプロ
−ＭＳＰおよびプロ−C672A は共にほぼ100%消化され
た。非還元条件のＳＤＳ電気泳動では、約７０、４７、
２２ｋｄの３本のバンドが認められた。それぞれ２鎖型
ＭＳＰ、遊離α鎖、遊離β鎖の分子量に対応する。これ
ら量比を調べるため、逆相カラムを用いてこれらの分子
種を分離した。

【００４５】遊離α鎖およびβ鎖の分析 カリクレイン処理したプロ−ＭＳＰおよびプロ−C672A
をそれぞれ、フェニル5PW逆相カラムにロードした。水
−アセトニトリルのグラディエントで溶出させ、280nm
の吸収でモニターした（図５）。各溶出画分の還元条件
のSDS電気泳動の結果、溶出はα鎖、２本鎖、β鎖で順
であった。α鎖ピークと２本鎖ピークにはそれぞれメイ
ンピークの横にマイナーピークが認められるが、これら
は糖鎖組成による溶出位置のずれと思われる。ＭＳＰの
アミノ酸配列には３個所の糖鎖結合可能部位があり、α
鎖に２個所とβ鎖に１個所である。このため、β鎖ピー
クは比較的単純であるが、α鎖と２本鎖のピークは複雑
なパターンとなっていると考えられる。これらα鎖、２
本鎖、β鎖の３つピークの面積の比率を調べたところ、
天然型ＭＳＰの組換え蛋白では、２６：５８：１６であ
った。C672A 改変体では、この比は７：８８：５とな
り、遊離鎖の割合が顕著に減少した。天然型ＭＳＰの組
換え蛋白質の一部では、α鎖とβ鎖がジスルフィド結合
で架橋されていない。６７２位のシステンをアラニンに
改変することで、図５に示すように、この架橋が顕著に
促された。プラスミノーゲンからの類推によると、α鎖
とβ鎖はＣｙｓ（４６８）とＣｙｓ（５８８）の間のジ
スルフィド結合で架橋される。しかし、組換え蛋白質の
一部ではＣｙｓ（５８８）が同じβ鎖内のＣｙｓ（６７
２）とシスルフィド結合してしまったと考えられる。

【００４６】マクロファージ刺激活性の評価 上記Ｃ６７２Ａ改変体が及ぼすマウス腹腔マクロファー
ジに対する走化性刺激活性を評価した。その方法は、Sk
eel ら記載の方法（Skeel ら:J.Experimental.Medicin
e.173,1227(1991) ）に従って行った。すなわちＣ３Ｈ
／ＨｅＮマウス（チャールズリバー）の腹腔に無血清の
冷ＲＭＰＩ培地を注入後、回収し、常在性腹腔マルロフ
ァージを採取した。走化性応答はマルチウエルのケモタ
キシスチャンバーを用いて希釈した天然ＭＳＰおよびＣ
６７２Ａ改変体を加えた。上室には無血清ＲＰＭＩに浮
遊した120,000 個のマルクファージを加えた。孔径 5μ
m のポリカーボネートメンブレンで上室と下室を仕切っ
た。37℃で3.5 時間インキュベーション後、フィルター
の上室面に付着した遊走しなかった細胞をラバーでこす
りとった。フィルターを回転後、Diff-Quik で染色し、
遊走面の細胞数をイメージアナライザーで計数し、上室
に加えた細胞に対する割合 (%)を求めた。

【００４７】図６は、上述の精製したプロ−C672A をカ
リクレイン処理して活性化したC672A 改変体と上記の文
献記載の方法でヒト血清から精製された天然ＭＳＰとの
比較である。C672A 改変体は、天然ＭＳＰと同程度の生
理活性を保持していた。すなわち６７２位のシステイン
を天然とは異なるアミノ酸であるアラニンにて改変して
も、生物活性は保持されていた。

【００４８】

【発明の効果】本発明のＭＳＰ改変体は、天然型ＭＳＰ
の組換え発現においてシステン残基間のジスルフィド結
合に異常を生じ、生理活性のない遊離鎖成分を多量に生
じる問題を解決し、ヒトＭＳＰと同等の生理活性を有す
る２本鎖活性型組換えＭＳＰが効率よく生産でき、安価
に提供できることを可能にした。

【００４９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：711 配列の特徴：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： Met Gly Trp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gln Tyr Leu Gly Val 1 10 Pro Gly Gln Arg Ser Pro Leu Asn Asp Phe Gln Val Leu Arg Gly Thr 20 30 Glu Leu Gln His Leu Leu His Ala Val Val Pro Gly Pro Trp Gln Glu 40 Asp Val Ala Asp Ala Glu Glu Cys Ala Gly Arg Cys Gly Pro Leu Met 50 60 Asp Cys Arg Ala Phe His Tyr Asn Val Ser Ser His Gly Cys Gln Leu 70 80 Leu Pro Trp Thr Gln His Ser Pro His Thr Arg Leu Arg Arg Ser Gly 90 Arg Cys Asp Leu Phe Gln Lys Lys Asp Tyr Val Arg Thr Cys Ile Met 100 110 Asn Asn Gly Val Gly Tyr Arg Gly Thr Met Ala Thr Thr Val Gly Gly 120 Leu Pro Cys Gln Ala Trp Ser His Lys Phe Pro Asn Asp His Lys Tyr 130 140 Thr Pro Thr Leu Arg Asn Gly Leu Glu Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 150 160 Asp Gly Asp Pro Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ala Val 170 Arg Phe Gln Ser Cys Gly Ile Lys Ser Cys Arg Glu Ala Ala Cys Val 180 190 Trp Cys Asn Gly Glu Glu Tyr Arg Gly Ala Val Asp Arg Thr Glu Ser 200 Gly Arg Glu Cys Gln Arg Trp Asp Leu Gln His Pro His Gln His Pro 210 220 Phe Glu Pro Gly Lys Phe Leu Asp Gln Gly Leu Asp Asp Asn Tyr Cys 230 240 Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro 250 Gln Ile Glu Arg Glu Phe Cys Asp Leu Pro Arg Cys Gly Ser Glu Ala 260 270 Gln Pro Arg Gln Glu Ala Thr Thr Val Ser Cys Phe Arg Gly Lys Gly 280 Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ala Asn Thr Thr Thr Ala Gly Val Pro Cys 290 300 Gln Arg Trp Asp Ala Gln Ile Pro His Gln His Arg Phe Thr Pro Glu 310 320 Lys Tyr Ala Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp 330 Gly Ser Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Arg Pro Gly Met Arg Ala 340 350 Ala Phe Cys Tyr Gln Ile Arg Arg Cys Thr Asp Asp Val Arg Pro Gln 360 Asp Cys Tyr His Gly Ala Gly Glu Gln Tyr Arg Gly Thr Val Ser Lys 370 380 Thr Arg Lys Gly Val Gln Cys Gln Arg Trp Ser Ala Glu Thr Pro His 390 400 Lys Pro Gln Phe Thr Phe Thr Ser Glu Pro His Ala Gln Leu Glu Glu 410 Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ser His Gly Pro Trp Cys Tyr 420 430 Thr Met Asp Pro Arg Thr Pro Phe Asp Tyr Cys Ala Leu Arg Arg Cys 440 Ala Asp Asp Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp Pro Pro Asp Gln Val Gln 450 460 Phe Glu Lys Cys Gly Lys Arg Val Asp Arg Leu Asp Gln Arg Arg Ser 470 480 Lys Leu Arg Val Val Gly Gly His Pro Gly Asn Ser Pro Trp Thr Val 490 Ser Leu Arg Asn Arg Gln Gly Gln His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val 500 510 Lys Glu Gln Trp Ile Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Ser Ser Cys His 520 Met Pro Leu Thr Gly Tyr Glu Val Trp Leu Gly Thr Leu Phe Gln Asn 530 540 Pro Gln His Gly Glu Pro Ser Leu Gln Arg Val Pro Val Ala Lys Met 550 560 Val Cys Gly Pro Ser Gly Ser Gln Leu Val Leu Leu Lys Leu Glu Arg 570 Ser Val Thr Leu Asn Gln Arg Val Ala Leu Ile Cys Leu Pro Pro Glu 580 590 Trp Tyr Val Val Pro Pro Gly Thr Lys Cys Glu Ile Ala Gly Trp Gly 600 Glu Thr Lys Gly Thr Gly Asn Asp Thr Val Leu Asn Val Ala Leu Leu 610 620 Asn Val Ile Ser Asn Gln Glu Cys Asn Ile Lys His Arg Gly Arg Val 630 640 Arg Glu Ser Glu Met Cys Thr Glu Gly Leu Leu Ala Pro Val Gly Ala 650 Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Thr His Asn Cys 660 670 Trp Val Leu Glu Gly Ile Ile Ile Pro Asn Arg Val Cys Ala Arg Ser 680 Arg Trp Pro Ala Val Phe Thr Arg Val Ser Val Phe Val Asp Trp Ile 690 700 His Lys Val Met Arg Leu Gly *** 710

【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：2216 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号： sig peptide 存在位置：1..54 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..2133 配列： ATG GGG TGG CTC CCA CTC CTG CTG CTT CTG ACT CAA TAC TTA GGG GTC 48 Met Gly Trp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gln Tyr Leu Gly Val 1 10 CCT GGG CAG CGC TCG CCA TTG AAT GAC TTC CAA GTG CTC CGG GGC ACA 96 Pro Gly Gln Arg Ser Pro Leu Asn Asp Phe Gln Val Leu Arg Gly Thr 20 30 GAG CTA CAG CAC CTG CTA CAT GCG GTG GTG CCC GGG CCT TGG CAG GAG 144 Glu Leu Gln His Leu Leu His Ala Val Val Pro Gly Pro Trp Gln Glu 40 GAT GTG GCA GAT GCT GAA GAG TGT GCT GGT CGC TGT GGG CCC TTA ATG 192 Asp Val Ala Asp Ala Glu Glu Cys Ala Gly Arg Cys Gly Pro Leu Met 50 60 GAC TGC CGG GCC TTC CAC TAC AAC GTG AGC AGC CAT GGT TGC CAA CTG 240 Asp Cys Arg Ala Phe His Tyr Asn Val Ser Ser His Gly Cys Gln Leu 70 80 CTG CCA TGG ACT CAA CAC TCG CCC CAC ACG AGG CTG CGG CGT TCT GGG 288 Leu Pro Trp Thr Gln His Ser Pro His Thr Arg Leu Arg Arg Ser Gly 90 CGC TGT GAC CTC TTC CAG AAG AAA GAC TAC GTA CGG ACC TGC ATC ATG 336 Arg Cys Asp Leu Phe Gln Lys Lys Asp Tyr Val Arg Thr Cys Ile Met 100 110 AAC AAT GGG GTT GGG TAC CGG GGC ACC ATG GCC ACG ACC GTG GGT GGC 384 Asn Asn Gly Val Gly Tyr Arg Gly Thr Met Ala Thr Thr Val Gly Gly 120 CTG CCC TGC CAG GCT TGG AGC CAC AAG TTC CCG AAT GAT CAC AAG TAC 432 Leu Pro Cys Gln Ala Trp Ser His Lys Phe Pro Asn Asp His Lys Tyr 130 140 ACG CCC ACT CTC CGG AAT GGC CTG GAA GAG AAC TTC TGC CGT AAC CCT 480 Thr Pro Thr Leu Arg Asn Gly Leu Glu Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 150 160 GAT GGC GAC CCC GGA GGT CCT TGG TGC TAC ACA ACA GAC CCT GCT GTG 528 Asp Gly Asp Pro Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ala Val 170 CGC TTC CAG AGC TGC GGC ATC AAA TCC TGC CGG GAG GCC GCG TGT GTC 576 Arg Phe Gln Ser Cys Gly Ile Lys Ser Cys Arg Glu Ala Ala Cys Val 180 190 TGG TGC AAT GGC GAG GAA TAC CGC GGC GCG GTA GAC CGC ACG GAG TCA 624 Trp Cys Asn Gly Glu Glu Tyr Arg Gly Ala Val Asp Arg Thr Glu Ser 200 GGG CGC GAG TGC CAG CGC TGG GAT CTT CAG CAC CCG CAC CAG CAC CCC 672 Gly Arg Glu Cys Gln Arg Trp Asp Leu Gln His Pro His Gln His Pro 210 220 TTC GAG CCG GGC AAG TTC CTC GAC CAA GGT CTG GAC GAC AAC TAT TGC 720 Phe Glu Pro Gly Lys Phe Leu Asp Gln Gly Leu Asp Asp Asn Tyr Cys 230 240 CGG AAT CCT GAC GGC TCC GAG CGG CCA TGG TGC TAC ACT ACG GAT CCG 768 Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro 250 CAG ATC GAG CGA GAG TTC TGT GAC CTC CCC CGC TGC GGG TCC GAG GCA 816 Gln Ile Glu Arg Glu Phe Cys Asp Leu Pro Arg Cys Gly Ser Glu Ala 260 270 CAG CCC CGC CAA GAG GCC ACA ACT GTC AGC TGC TTC CGC GGG AAG GGT 864 Gln Pro Arg Gln Glu Ala Thr Thr Val Ser Cys Phe Arg Gly Lys Gly 280 GAG GGC TAC CGG GGC ACA GCC AAT ACC ACC ACT GCG GGC GTA CCT TGC 912 Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ala Asn Thr Thr Thr Ala Gly Val Pro Cys 290 300 CAG CGT TGG GAC GCG CAA ATC CCT CAT CAG CAC CGA TTT ACG CCA GAA 960 Gln Arg Trp Asp Ala Gln Ile Pro His Gln His Arg Phe Thr Pro Glu 310 320 AAA TAC GCG TGC AAA GAC CTT CGG GAG AAC TTC TGC CGG AAC CCC GAC 1008 Lys Tyr Ala Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp 330 GGC TCA GAG GCG CCC TGG TGC TTC ACA CTG CGG CCC GGC ATG CGC GCG 1056 Gly Ser Glu Ala Pro Trp Cys Phe Thr Leu Arg Pro Gly Met Arg Ala 340 350 GCC TTT TGC TAC CAG ATC CGG CGT TGT ACA GAC GAC GTG CGG CCC CAG 1104 Ala Phe Cys Tyr Gln Ile Arg Arg Cys Thr Asp Asp Val Arg Pro Gln 360 GAC TGC TAC CAC GGC GCA GGG GAG CAG TAC CGC GGC ACG GTC AGC AAG 1152 Asp Cys Tyr His Gly Ala Gly Glu Gln Tyr Arg Gly Thr Val Ser Lys 370 380 ACC CGC AAG GGT GTC CAG TGC CAG CGC TGG TCC GCT GAG ACG CCG CAC 1200 Thr Arg Lys Gly Val Gln Cys Gln Arg Trp Ser Ala Glu Thr Pro His 390 400 AAG CCG CAG TTC ACG TTT ACC TCC GAA CCG CAT GCA CAA CTG GAG GAG 1248 Lys Pro Gln Phe Thr Phe Thr Ser Glu Pro His Ala Gln Leu Glu Glu 410 AAC TTC TGC CGG AAC CCA GAT GGG GAT AGC CAT GGG CCC TGG TGC TAC 1296 Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ser His Gly Pro Trp Cys Tyr 420 430 ACG ATG GAC CCA AGG ACC CCA TTC GAC TAC TGT GCC CTG CGA CGC TGC 1344 Thr Met Asp Pro Arg Thr Pro Phe Asp Tyr Cys Ala Leu Arg Arg Cys 440 GCT GAT GAC CAG CCG CCA TCA ATC CTG GAC CCC CCA GAC CAG GTG CAG 1392 Ala Asp Asp Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp Pro Pro Asp Gln Val Gln 450 460 TTT GAG AAG TGT GGC AAG AGG GTG GAT CGG CTG GAT CAG CGG CGT TCC 1440 Phe Glu Lys Cys Gly Lys Arg Val Asp Arg Leu Asp Gln Arg Arg Ser 470 480 AAG CTG CGC GTG GTT GGG GGC CAT CCG GGC AAC TCA CCC TGG ACA GTC 1488 Lys Leu Arg Val Val Gly Gly His Pro Gly Asn Ser Pro Trp Thr Val 490 AGC TTG CGG AAT CGG CAG GGC CAG CAT TTC TGC GGG GGG TCT CTA GTG 1536 Ser Leu Arg Asn Arg Gln Gly Gln His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val 500 510 AAG GAG CAG TGG ATA CTG ACT GCC CGG CAG TGC TTC TCC TCC TGC CAT 1584 Lys Glu Gln Trp Ile Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Ser Ser Cys His 520 ATG CCT CTC ACG GGC TAT GAG GTA TGG TTG GGC ACC CTG TTC CAG AAC 1632 Met Pro Leu Thr Gly Tyr Glu Val Trp Leu Gly Thr Leu Phe Gln Asn 530 540 CCA CAG CAT GGA GAG CCA AGC CTA CAG CGG GTC CCA GTA GCC AAG ATG 1680 Pro Gln His Gly Glu Pro Ser Leu Gln Arg Val Pro Val Ala Lys Met 550 560 GTG TGT GGG CCC TCA GGC TCC CAG CTT GTC CTG CTC AAG CTG GAG AGA 1728 Val Cys Gly Pro Ser Gly Ser Gln Leu Val Leu Leu Lys Leu Glu Arg 570 TCT GTG ACC CTG AAC CAG CGC GTG GCC CTG ATC TGC CTG CCC CCT GAA 1776 Ser Val Thr Leu Asn Gln Arg Val Ala Leu Ile Cys Leu Pro Pro Glu 580 590 TGG TAT GTG GTG CCT CCA GGG ACC AAG TGT GAG ATT GCA GGC TGG GGT 1824 Trp Tyr Val Val Pro Pro Gly Thr Lys Cys Glu Ile Ala Gly Trp Gly 600 GAG ACC AAA GGT ACG GGT AAT GAC ACA GTC CTA AAT GTG GCC TTG CTG 1872 Glu Thr Lys Gly Thr Gly Asn Asp Thr Val Leu Asn Val Ala Leu Leu 610 620 AAT GTC ATC TCC AAC CAG GAG TGT AAC ATC AAG CAC CGA GGA CGT GTG 1920 Asn Val Ile Ser Asn Gln Glu Cys Asn Ile Lys His Arg Gly Arg Val 630 640 CGT GAG AGT GAG ATG TGC ACT GAG GGA CTG TTG GCC CCT GTG GGG GCC 1968 Arg Glu Ser Glu Met Cys Thr Glu Gly Leu Leu Ala Pro Val Gly Ala 650 TGT GAG GGT GAC TAC GGG GGC CCA CTT GCC TGC TTT ACC CAC AAC TGC 2016 Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Thr His Asn Cys 660 670 TGG GTC CTG GAA GGA ATT ATA ATC CCC AAC CGA GTA TGC GCA AGG TCC 2064 Trp Val Leu Glu Gly Ile Ile Ile Pro Asn Arg Val Cys Ala Arg Ser 680 CGC TGG CCA GCT GTC TTC ACG CGT GTC TCT GTG TTT GTG GAC TGG ATT 2112 Arg Trp Pro Ala Val Phe Thr Arg Val Ser Val Phe Val Asp Trp Ile 690 700 CAC AAG GTC ATG AGA CTG GGT TAGGCCCAGC CTTGATGCCA TATGCCTTGG 2163 His Lys Val Met Arg Leu Gly 710 GGAGGACAAA ACTTCTTGTC AGACATAAAG CCATGTTTCC TCTTTATGCC TGT 2216

【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成DNA 配列: TGCCTGCTTT ACCCACAACG CCTGGGTCCT GGAAGGAATT 40

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミノーゲンから推定されたＭＳＰのシス
テイン残基間の架橋を示す図である。

【図２】実施例におけるプラスミドｐＥＶＳＶ（ＭＳ
Ｐ）および変異導入鋳型として用いたＭ１３ｍｐ１８
（ＭＳＰ）の構築図を示す。

【図３】実施例におけるｐＥＶＳＶ（ｍＭＳＰ）の構築
図を示す。

【図４】プロ−ＭＳＰ、プロ−Ｃ６７２Ａの精製物およ
びそれらのカリクレイン処理後のサンプルをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけた結果を示す図面である。

【図５】プロ−ＭＳＰ（天然型ＭＳＰ）とプロ−Ｃ６７
２Ａ（Ｃ６７２改変体）をカリクレイン処理した後、フ
ェニル５ＰＷ逆相ＨＰＬＣで分析した際の溶出パターン
を示す図である。

【図６】ヒト血清から精製したＭＳＰとＣ６７２Ａ改変
体のマウス腹腔マクロファージに対する走化性刺激活性
を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１０月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】 プロ−ＭＳＰ、プロ−Ｃ６７２Ａの精製物お
よびそれらのカリクレイン処理後のサンプルをＳＤＳ−
ＰＡＧＥにかけた結果を示す図面に代わる電気泳動写真
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 竹原 豊浩 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社医薬研究所内 (72)発明者 萩屋 道雄 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社医薬研究所内

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マクロファージ刺激蛋白質を構成するア
   ミノ酸配列のシステンが欠失された蛋白質または他のア
   ミノ酸で置換された蛋白質であることを特徴とするマク
   ロファージ刺激蛋白質改変体。
2. 【請求項２】 配列表・配列番号１に記載されるマクロ
   ファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ−末端
   から第６７２位のシステインが、欠失された蛋白質また
   は他のアミノ酸で置換された蛋白質であることを特徴と
   するマクロファージ刺激蛋白質改変体。
3. 【請求項３】 配列表・配列番号１に記載されるマクロ
   ファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ−末端
   から第６７２位のシステインが、欠失された蛋白質であ
   ることを特徴とするマクロファージ刺激蛋白質改変体。
4. 【請求項４】 配列表・配列番号１に記載されるマクロ
   ファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ−末端
   から第６７２位のシステインが、他のアミノ酸で置換さ
   れた蛋白質であることを特徴とするマクロファージ刺激
   蛋白質改変体。
5. 【請求項５】 配列表・配列番号１に記載されるマクロ
   ファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ−末端
   から第６７２位のシステインが、欠失された蛋白質であ
   るマクロファージ刺激蛋白質改変体をコードする遺伝子
   断片。
6. 【請求項６】 配列表・配列番号２に記載されるマクロ
   ファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列をコードす
   る遺伝子の第2014〜2016番目の塩基配列が欠失した請求
   項５記載のマクロファージ刺激蛋白質改変体をコードす
   る遺伝子断片。
7. 【請求項７】 配列表・配列番号１に記載されるマクロ
   ファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ−末端
   から第６７２位のシステンが他のアミノ酸で置換された
   マクロファージ刺激蛋白質改変体をコードする遺伝子断
   片。
8. 【請求項８】 他のアミノ酸がアラニンである請求項７
   記載のマクロファージ刺激蛋白質改変体をコードする遺
   伝子断片。
9. 【請求項９】 配列表・配列番号２に記載されるマクロ
   ファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列をコードす
   る遺伝子の第2014〜2016番目の塩基配列が他の塩基配列
   で置換された請求項７記載のマクロファージ刺激蛋白質
   改変体をコードする遺伝子断片。
10. 【請求項１０】 配列表・配列番号２に記載されるマク
    ロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列をコード
    する遺伝子の第2014〜2016番目の塩基配列がＧＣＣ、Ｇ
    ＣＵ、ＧＣＡまたはＧＣＧで置換された請求項７記載の
    マクロファージ刺激蛋白質改変体をコードする遺伝子断
    片。
11. 【請求項１１】 ベクターが請求項５記載の遺伝子を含
    むことを特徴とする組換えベクター。
12. 【請求項１２】 ベクターが請求項７記載の遺伝子を含
    むことを特徴とする組換えベクター。
13. 【請求項１３】 宿主細胞が請求項１１記載の組換えベ
    クターで形質転換された形質転換体。
14. 【請求項１４】 宿主細胞が請求項１２記載の組換えベ
    クターで形質転換された形質転換体。
15. 【請求項１５】 配列表・配列番号１に記載されるマク
    ロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ−末
    端から第６７２位のシステインが、欠失された蛋白質で
    あるマクロファージ刺激蛋白質改変体をコードする遺伝
    子を含む組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、該形
    質転換体を培養し、該培養物からマクロファージ刺激蛋
    白質改変体を採取することを特徴とするマクロファージ
    刺激蛋白質改変体の製造法。
16. 【請求項１６】 配列表・配列番号１に記載されるマク
    ロファージ刺激蛋白質を構成するアミノ酸配列のＮ−末
    端から第６７２位のシステインが、他のアミノ酸で置換
    された蛋白質であるマクロファージ刺激蛋白質改変体を
    コードする遺伝子を含む組換えベクターで宿主細胞を形
    質転換し、該形質転換体を培養し、該培養物からマクロ
    ファージ刺激蛋白改変体を採取することを特徴とするマ
    クロファージ刺激蛋白質改変体の製造法。