JPS63503357A - 新規な凝固活性タンパク質 - Google Patents
新規な凝固活性タンパク質Info
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- JPS63503357A JPS63503357A JP62503481A JP50348187A JPS63503357A JP S63503357 A JPS63503357 A JP S63503357A JP 62503481 A JP62503481 A JP 62503481A JP 50348187 A JP50348187 A JP 50348187A JP S63503357 A JPS63503357 A JP S63503357A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
新規な凝固活性タンパク質
本発明の研究のある面は、中小企業技術革新研究(Sma ’1IBusine
ss Innovation Re5earch ; 5BIR)認可、DH3
SGrant A I R43HL 35946−01のもとに米国保健奉仕省
(U、S、Department of Health and Human
5ervices;DHH3)から一部資金の提供を受けた。米国政府はこの発
明に対して一定の権利を有する。
本発明は凝固活性を有する物質に関する。より詳細には、本発明は゛遺伝子組み
換え”凝固活性タンパク質、遺伝子工学的に操作された細胞から前記タンパク質
を得る方法、および凝固剤として使用するための前記タンパク質を含有する治療
用組成物に関する。
血漿由来のヒト■因子の特性決定は、その凝固活性が約s o、o o o〜約
210.000ダルトンの分子量をもつ多数のポリハプチド鎖と関連しているこ
とを示している。トロンビンを添加すると、■因子凝固活性を初めに活性化しそ
の後不活化するタンパク質加水分解の特定のノミターンが生ずる。■因子の活性
化および不活化に必要なタンパク質分解を知ることは、〜■■子活性の構造的必
要条件を理解するために必要である。1つの研究方法はトロンビン消化の前およ
び後の特定切断産物のアミノ酸配列を決定する方法であった〔イートン(Eat
on)ら。
この方法は〜■■因子分子に沿ってこのプロテアーゼの切断部位をマツピングす
る上で多少なりとも有用であった。
今や、我々は哨乳動物宿主細胞系から誘導されたヒト組み換え■因子を分析し、
そして血漿由来の■因子から得られたものと同じ切断部位を解明した。我々のデ
ータは、組み換えタンパク質と天然タンパク質が同様に折りたたまれ且つプロセ
ッシングされることを示唆しており、この結果は確信をもって推定できなかつた
だろう。我々のデータは、■因子を産生ずるように遺伝子工学的に操作されだ哺
乳動物細胞株からの調整培地(conditionθamθd1um)より精製
された組み換え■因子を使用して得られた。こうして得られた組み換えタンツク
質は約200Kdのポリはプチドと約76Kaのポリにプチドとの複合体として
固定された。トロンビンで消化すると、200KdJすにプチドはg□Kaの物
質を生じ、最終的に50Kdと40Kaの物質を生成する。76 Ka #?リ
ー!:プチドはトロンビン消化の際に69Kdの物質に切断される。76Kaと
6gKaの物質はほかのところでは“80Kd”および73Ka”の物質と呼ば
れている。
しかしながら、正確な切断部位の存在の知識はこれまで、活性化およびその後の
不活化に対してどんな切断が必要とされるのかについて決定的に確立してはいな
かった。
本発明の研究の別の面では、■因子DNAの変異型の発現と組み合わせた部位特
異的突然変異誘発方法を使用して、■因子の活性化および不活化にとってどの部
位が必要かつ十分であるかを明らかにした。特定の切断部位の不活化をもたらす
特定のアミノ酸を変えるために、特定のDNA配列が変更された。■因子の修飾
型は、クローニングされた修飾〜■因因子コード化化DNAを使用して、高レベ
ル発現の可能な哨乳動物宿主細胞系において産生された〔カラ777 (Kau
fman) 、 PNAS 、 82 : 689(1985)を参照されたい
〕。こうして産生された■因子の修飾型をその後分析した。我々の結果は、g
□ Kaまたは76 Ka切断部位で切断されないタンパク質をもたらす突然変
異が凝固活性またはトロンビンによる活性化を低下させないことを明らかにした
。76Kd切断部位の突然変異からの調整培地中で生産された主な物質は、少な
(とも以後に述べる欠失変異型の場合には、5DS−yf#lJアクリルアミド
ゲル電気泳動で追跡したとき単一のポリはプチド鎖である。50Kdと40Kd
の物質を生じるトロンビン切断部位の突然変異は\■因子を不活性にする。アミ
ン末端における提案された活性化プロティンc (APC)切断部位の突然変異
は、比活性が増大しまた恐らくはタンパク質分解による不活化に対して感受性が
減少した■因子をもたらす。実、験的証拠は、Arg −336のすぐ下流(す
なわちArg−336とMe t −337の間)および、その部位での切断が
以下で述べるように遮断される場合は、恐も< Lye −325、Lys −
338およびArg −359の1つまたはそれ以上のすぐ下流でのタンパク質
切断がAPCにより触媒されることを示唆している。
本発明は、天然ヒト\・■:c因子の1つ以上の切断部位で特定プロテアーゼに
より触媒される切断に対して不安定性が減少するが、凝固活性およびトロンビン
による活性化が保持された天然ヒト■:C因子に関して修飾を含む1群の■:C
因子型タンパク質を提供する。これらの部位は以後単に゛切断部位”と呼ばれ、
Arg−226とAha −227の間の切断部位、Arg−336とMet−
337の間の切断部位および/または先の段落で述べたその他の提案された”A
PC”切断部位を含む”APC”切断部位、Arg−562とG’1y−563
の間の切断部位、Azg−740とSer −741の間の″90Kd切断部位
”、Arg−776とThr−777の間の″c+sKa切断部位”、Arg−
1313とAla (314の間の″115Kd切断部位”、Arg−1648
とGlu−1649の間の゛76Kd切断部位”、およびArg−1721とA
ha−1722+7)間の″′Xa因子切断部位”を包含する。
本明細書全体を通して、アミノ酸のナンバリングは表IK示した〜■:C因子の
アミノ酸配列(ここで成熟タンパク質のアミン末端はAla−1である)に基づ
いている。
゛■:C因子型タンパク質”(以後゛変異型”とも呼ばれる)とは、天然ヒト■
:C因子のアミノ酸配列または凝固活性を保持するSet −373からArg
−1689までの1〜1317個のアミノ酸の欠失を含むその類似体(以後“欠
失類似体”と呼ぶ)のアミノ酸配列と、1個所またはそれ以上の切断部位を除い
て、同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列により特徴づけられる〜■因子型凝
固活性を示すタンパク質を意味する。1個所またはそれ以上の切断部位を除いて
天然ヒト〜■:c因子と”実質的に同じ”アミノ酸配列とは、(1)1個所また
はそれ以上の切断部位でのアミノ酸修飾;および(iia)天然ヒト■:C因子
をコードするc DNAと緊縮条件(stringent conaition
s)下でハイブリダイズし得るcDNAによりコードされること;または(fi
b)表Iに示した最初の40アミノ酸と同じか又は実質的に同じ成熟N末端はプ
チド配列、および最後の50アミノ酸と同じか又は実質的に同じC末端ペプチド
配列を持つこと;により特徴づけられる全ての■因子型タンパク質を包含する。
従って、\■因子型タンパク質はそのタンパク質が凝固活性タンパク質であり、
且つ(1)天然ヒト■:C因子をコードするcDNAと緊縮条件下でハイブリダ
イズし得るc DNAによりコードされるが、あるいは(11)表Iに示したも
のと同じが又は実質的に同じ4oアミノ酸成熟N末端および50アミノ酸C末端
を有する限り、更なる修飾を含んでいてもよい1つ以上の切断部位修飾を有する
全長および欠失類似体を包含する。本発明に含まれる更なる修飾の例には、”硫
酸化変異体(sulfation mutant)”、すなわち1個所またはそ
れ以上の硫酸化可能な部位(例えば346.395.407.1.664.16
80および1709位)でのチロシンのアミノ酸置換または欠失により特徴づけ
られる〜■:c因子型タンパク質、により具体化される修飾が含まれるが、これ
に限定されない。
本発明の修飾型■因子は血清由来の\■因子または組み換え〜■因子よりも均一
なかつ/また安定した形で生産することができ、しかもin ViVO投与の際
に単一鎖分子の活性増加、プロティンC不活化による不活化の減少、半減期また
は比活性の増加、もしくは薬物速度論的プロフィールの改善によりもたらされる
有益な作用を有する。従って、これらのタンパク質は非修飾入組:C因子と比べ
て投与量の低下および/または投与経路の変更を可能にする。
本発明の1つの面は、1個所またはそれ以上のXa因子、APCおよびトロンビ
ン切断部位を修飾して、この種の切断部位が特定のタンパク質加水分解に対して
より安定になった変異型、例えばその切断部位を規定するアミノ酸の一方または
両方(好ましくは少なくともアルギニン残基)が欠失されるか、または目下のと
ころ好適であるように別のアミノ酸で置換された変異型に関する。その置換は保
存的変化(conservative change)であり、例えばタンパク
質の二次構造の変化が起こる機会を最小限に抑えるArgのLysによる置換で
ありうる。また、その変化は非保存的変化であり、例えばタンパク質の加水分解
に対する抵抗性を保証するArgの非塩基性アミノ酸(例えば11e)による置
換であり得る。さらに、切断部位のアミノ酸の置換は2個以上のアミノ酸による
置換であり得る。例えば、Argは1個のアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプ
チド(11e、 l1e−LeulLeu−11e、 l1e−Leu−Gly
など)テ背換することカテきる。
従って、本発明のこの面の化合物には220.226.250.279.282
.336.359.562.740(および/または5er−741)、776
.1313.1648.1719および1721位のうち1個所以上のArgが
欠失されるか、あるいはりシンまたは非塩基性アミノ酸(例えばインロイシン)
から独立に選ばれる1個以上のアミノ酸で置換された変異型が包含される。本発
明はさらに6gKa切断部位でのArg−1689のLyeによる置換を単独で
、またはここに記載の他の修飾との組み合わせで含む■:C因子型タンパク質を
包含する。さらに、Lye −325およびLye −338の一方または両方
が欠失されても、あるいは例えば非塩基性アミノ酸で置換されてもよい。
表■ :ヒト〜■:c因子の全長タンパク質配列(胱き →)
(表Iの続き)
本発明の他の面は、(α)1個所以上の切断部位にわたるトリペプチド配列およ
び/または(b)本発明に従って修飾され得る前記アミノ酸のいずれか1個以上
が共通のアスパラギン−結合グリコシル化部位で置換された変異型に関する。共
通のN−結合グリコシル化部位は式:アスパラギンーX−)レオニンマタはアス
パラギン−X−セリン(ここでXは通常アミノ酸のいずれかであるが、恐らくプ
ロリンを除く)のトリペプチド配列から成る。本発明のこの面の化合物の例には
、Xa因子切断部位にわたる配夕じNRA”が“NR3”または“NRT”で置
換された変異型が含まれる。1個所以上の切断部位に遺伝子工学的に処理された
N−結合グリコシル化部位を含む本発明のこの面の化合物は、1個所以上の他の
切断部位でのアルギニンおよび/またはりシンの欠失もしくは置換、および/ま
たは1個所以上の硫酸化部位でのチロシンの欠失もしくは置換のような前記修飾
をさらに含むことができる。この種の化合物は例えば76Ka切断部位(164
8位)でのArgの工1θによる置換、およびXa因子切断部位(1720〜1
722位)でのNRAのNR8またはNRTによる置換を含む。
現在特に興味ある変異型の1つのグループは、76Ka切断部位に修飾を含むも
のである。従って、これらの変異型はArg−1648での点欠失(point
deletion)または好ましくはアミノ酸置換、もしくはArg−164
8の代わりにまたは76Ka切断部位にわたる3種のトリペプチド配列QREま
たは好ましくはHQRもしくはREIO代わりに使用された配列−NXT −ま
たは−NXS−(ここでXはアミノ酸であるが、好ましくはプロリンでない)か
ら成る共通のN−結合グリコシル化部位を含む。
このグループには76Ka部位でのみ修飾された変異型、および本発明の範囲内
の1.2.3.4.5.6個所またはそれ以上の他の切断部位でさらに修飾され
また場合により1689位のArg。
代わりにLysを含む変異型が含まれる。例えば、このグループはATg−16
48が欠失されるが又は他のアミノ酸で置換され、またGl−u−1649が欠
失されるか又はAsnで置換された変異型を含み、この変異型はさらにArg−
1313の代わりに置換用アミノ酸を含む。このグループはまた提案されたAP
C190Kcl、 95Ka1115 Ka、 76 Ka、 69 Kd(リ
シン置換のみ)およびXa因子切断部位の1個所以上で修飾された変異型を包含
する。
また、現在特に興味あるグループは提案されたAPC切断部位とXa切断部位の
両方に修飾を含む変異型である。このグループはまた1個所以上の他の切断部位
(好ましくは76Kl11部位を含む)で修飾された変異型を包含する。現在特
に興味ある変異型の例を以下の表に示す。表中°X”で表される位置は、アミノ
酸の欠失位置または独立に選ばれた置換用アミノ酸によるその置換位置を示して
いる。”独立に選ばれた”とは、2個所以上のアミノ酸位置(下記の表における
X”)が修飾される場合、それぞれの位置に対する置換用アミノ酸は同じであっ
ても互いに異なっていてもよく、また1個所以上の部位が欠失により修飾され、
一方1個所以上の他の部位がアミノ酸置換により修飾され得ることを意味してい
る。こうして、下記の表の化合物19では、例えばArg−740が■1eで置
換され、そしてArg−1648がLeu″′c置換され得る。また、もちろん
Arg−740が欠失されてArg−1648が■1θで置換されてもよい。
本発明変異型の例
以下により特徴づけられる■:C因子タンパク質7:Arg Lys Lys
Arg Arg Arg Rおよび/またはR17XXXXX
27xxxxx
(続ぎ一一−〉)
(表の続き)
Arg Lys Lye Arg Arg Arg Rおよび/またはR31X
XXX
32xxx xx
33XXXXX
34X XXXX
35XXXXXX
42xx x’ x
43X XX x
44XXXX X
4B x x x x
49X XX x
5QXXX X X
51 XX XX x
52X XXX、 x
53XXXXX X
54 X X
55 X X X
5B x x x x
5g x x x x
60xxx X X
61xx x x x
62X XX X X
63XXXX X X
(続き一一一〉)
(表の続き)
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Rおよび/またはR64X
XX x
55XX XX x
66X X XX x
67X XXX x
68XXX XX X
59XX XXX x
7o χ x x xx x
71 XXXXXX x
※\■:c因子型タンパク質は全長\■因子および以下のような欠失類似体を含
む:
α、A−982からL−1562までが欠失されたもの(”DGR”)d、 S
−373からFl−1648までが欠失されたもの(50−76Kd)e、T−
760からP−1640までが欠失されたもの(”LA”)?二徐表示したアミ
ノ酸は欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換される。
例えばR→■またはに;に→工
本発明による変異型はまた対立遺伝子変異(すなわち、互いに区別される天然変
異性によるDNA塩基配列の変異)をもっタン・々り質、または〜■:c因子型
凝固活性をまだ保持する他のアミノ酸置換もしくは欠失をもつタンパク質を包含
する。
本発明の全ての変異型は、当分野で知られるように、所望の変異型をコードする
組み換えDNA配列を宿主細胞(好ましくは哨乳動物宿主細胞)中で発現させる
ことにより生産される。変異型をコードするDNA配列は、ヒト\■:c因子ま
たはその欠失類似体をコードするDNA配列の特定部位突然変異誘発により作る
ことができる。
ヒト〜■:C因子をコードするDNA配列はすでにクローニングされている。表
Iの全長ヒトタン・ξり質をコードするDNA配列、およびその欠失類似体をコ
ードする配列m1)GR−2はメリーランビ州ロックビルのアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託番号ATCC53100として
寄託された。
全長ヒト\■:C因子cDNAの調製およびヌクレオチド配列は米国特許出願第
546650号(1983年10月28日付)および同第644086号(19
84年8月24日付)、ならびに国際特許出願筒PCT/US 84 / 01
6”41号(1985年5月9日に公開番号WO35101961として発明の
詳細な説明されている。
表1に示したヌクレオチド配列を含むpSP64組み換えクローン(pSP64
−\・■と名づげた)はATCCに寄託番号ATCC39812として寄託され
ている。
%T[:c因子の欠失類似体をコードするc DNAを調製するために、制限エ
ンドヌクレアーゼを使用して全長ヒト〜■:C因子cDNAをそのヌクレオチド
配列の適当な部位で切断した。制限エンドヌクレアーゼは一般にそれらの商業上
の供給者により推薦される条件および方法のもとで利用される。制限エンド1ヌ
クレアーゼは切除することを望む〜■:c因子の部分をコードする塩基配列を実
質上特異的に切断するものが選ばれる。BamHIおよび5acIは特に有用な
エンドヌクレアーゼである。しかしながら、当業者は通常の選択方法により選ば
れた他の制限エンドヌクレアーゼも利用できるであろう。欠失されるヌクレオチ
ドの数は変化しうるが、最終的なc DNA配列の読み枠に影響を及ぼさないよ
うに注意すべきである。
欠失類似体をコードするDNA配列は、他の方法に加えて、例えばモリナガ(M
orinaga、Y、 )ら、 Biotechnolog7+ 2 :636
〜639 (1984)に記載されるようなオリゴヌクレオチド9媒介欠失突然
変異誘発〔しばしば”ループアラ) (1oopout)”突然変異誘発と呼ば
れる〕の適用により全長ヒト\■:c因子DNA配列から誘導することができる
。
gOKa切断部位と69K(1切断部位の間の1〜951個のアミノ酸の欠失を
含む欠失類似体およびそれらの製法は、米国特許出願第725350号(198
5年4月12日付)およびそれに基づく国際特許出願第PCT/US86100
774号(WO86106101として1986年10月23日に発行)に詳細
に記載されている。
581個のアミノ酸が欠失された欠失類似体をコードするcDNAを含むプラス
ミ)” pDGR−2はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにAT
CC53100として寄託された。Arg −372(50/40切断部位)お
よびSer −1690(69Ka切断部位)の間の1〜1317個のアミノ酸
の欠失を含む類似の欠失変異型は、上記のPCT/US 86100774に記
載の一般方法を用いて作ることができる。より詳細には、このような欠失類似体
をコードするDNA分子は、当分野で通常の知識を有する者には容易に理解され
るように、適当なオリゴヌクレオチドを使用するループアウト突然変異誘発また
は適当な制限酵素により、全長〜■因子もしくはpDGR−2のような欠失類似
体をコードするDNA分子から容易に作製しうる。
これらの手段により、アミノ酸配列ニ
−X−B
により特徴づけられ且つ\■:C因子型凝固活性を有するタンパク質をコードす
るcDNAが容易に作製される。式A−X−Bにおいて、Aは\■:C因子の全
長配列(例えば実質的に表■に示すもの)のAla −1からArg−372ま
での41Jペプチド配列から成るタンパク質領域を表す。Bは■:C因子の全長
配列(例えば表■に示すもの)の5er−1690からTyr −2332まテ
ノホIJsプチト9配列から成るタンパク質領域を表す。Xは■:C因子の全長
配列(例えば表1に示すもの)のArg−372から5er−1690までの配
列中に含まれるアミノ酸配列と実質的に同じ0〜1316個のアミノ酸から成る
タンパク質領域を表す。Xのアミン末端はペプチド結合を介してAのカルボキシ
末端に共有結合され、そしてXのカルボキシ末端はBのアミン末端に同様に結合
されることを理解すべきである。しかしながら、Xが0個のアミノ酸を表す場合
は、Aのアミン末端がペプチド結合によりBのカルボキシ末端に直接共有結合さ
れてArg−372:Ser−1690縮合体を形成することをさらに理解すべ
きである。
本発明のタンパク質には、とりわげXが■:C因子の全長配列(例えば表1に示
すもの)のArg−372からArg−740までの配列中に含まれるアミノ酸
配列と実質的に同じ0〜367個のアミノ酸のはプチド配列から成る場合の式A
−X−Bのタンパク質が含まれる。
上述したように、本発明のそれぞれの変異型をコードするDNA配列は、ヒト■
:C因子またはその欠失類似体をコードするDNA配列の慣用的な特定部位突然
変異誘発により作製される。
このような突然変異誘発法にはシーラー(Zoller)およびスミス(Smi
th)、 Nucleic Ac1ds Res、 10 : 6487〜65
00(1gB2) ; Methoas Enzymol、 100 : 46
8〜500(1983) ;およびDNA且:479〜488(1984)に記
載される一本鎖DNAを使用するM13系、およびモリナガ(Morinaga
)ら、Biotechnology 、 636〜639 (1984年7月)
に記載されるヘテロ二本鎖DNAを使用する方法が含まれる。例えば、アルギニ
ンコドンをイソロイシンコドンに変検するために、上記方法に従って使用される
オリゴヌクレオチドの例を表■に示す。もちろん、本発明のそれぞれのタンパク
質をコードするDNAは、適切に選択したオリゴヌクレオチドを使用する特定部
位突然変異誘発により同様に作製し得ることを理解すべきである。
本発明の変異型をコードする新しいDNA配列は、哺乳動物細胞内での発現のた
めに適当なベクターに導入される。一時的にトランスフェクションされた、また
は安定して形質転換された宿主細胞により生産された凝固活性は、血漿試料用の
標準検定法を使用して測定しうる。
表■:オリゴヌクレオチドの例
2、CAT CAA ATA C,AA ATA ※(1)3、CGCCAT
CAA CGG AACATA R1549−−→NACT CGT ACT
ACT
4、CAA C(A AACATA AC※(3)5、GCCATT GAA
ccAA’rc AGCR740−−−−+ ITTC: TCCCAG −
6、GAA CCA ATCAGCTTC※(5)7、G TTT A、TCC
AA ATT ATCR372−−−→■TCA GTT GCCAAG□
8、CAA ATT ATCTCA GTT ※(7)10、GkA CTA
AAG ATCA、AA ※(9)11、GAA AAT CAG AGOGC
G AAA R163g −−−+ KAGCTTT CAA AAG AAA
ACl 2、AGCCCCAAA AGCTTT ※συ13、CAA CG
T AGT AAG A’l旦GCT R1313−−→ITTCAAA CA
A TTC
※ カッコ内に示したオリゴヌクレオチドにより生じた突然変異誘発現象なスク
リーニングするために使用した。置換用アミノ酸のコドンには下線が施されてい
る。当業者が認めるように、オリゴヌクレオチドは1個以上のアミノ酸を欠失さ
せるために、あるいは所望の位置に異なる(置換用)アミノ酸を挿入するために
、それぞれオリゴヌクレオチド中の1個以上のコト9ンを欠失させることにより
、あるいは所望アミノ酸のコドンを代わりに使用することにより容易に構築でき
る。他の突然変異誘発用オリゴヌクレオチドは、所望部位にわたる約20〜50
ヌクレオチド配列に基づいて、変俟を希望するもとのゴドンの置換または欠失に
より考案することができる。
ここに記載の真核細胞発現ベクターは、当業者によく知られた手法を用いて合成
される。細菌レプリコン、選択遺伝子、エン、ハンサー、プロモーターのような
ベクターの諸成分は天然源から得られるか、または既知方法により合成しうる。
カラツマ7 (Kaufman )ら、J、Mo1.Biox、 、 159
: 601〜621(1982):カウ7?ン、 Proc、Natl、Aca
、d、、Sci、 82 : 689〜693(1985)を参照されたい。本
発明の変異型を生産するのに有用な真核細胞発現ベクターはまた誘導プロモータ
ーを含むことができ、また当分野で知られるような誘導発現系でありうる。
宿主としては形質転換細胞株を含む確立された細胞株が適している。通常の二倍
体細胞、−次組織in vitro培養がら誘導される細胞株、ならびに−次移
植片(造血幹細胞のような比較的未分化の細胞を含む)も適している。細胞は選
択遺伝子が優先的に作用する限り、その選択遺伝子に遺伝子型欠陥が存在する必
要はない。
宿主細胞は好ましくは確立された哺乳動物細胞株であるだろう。慣用方法による
ベクターDNAの染色体DNAへの安定した組み込みのために、そして組み込ま
れたベクターDNAのその後の増嘔のために、CHO(チャイニーズ ハムスタ
ー卵巣)細胞が目下のところ好適である。また、ベクターDNAがウシ乳頭腫ウ
ィルスゲノム〔ラスキー(Lusky)ら、Ce1l、36 : 39]〜40
1(1984)を参照〕の全部または一部を含む場合は、安定したエビソーム因
子としてC127マウス細胞のような細胞株に保有させることができる。その他
の使用可能な哺乳動物細胞株にはHeLa、 CO3−1サル細胞、Bowes
細胞のような黒色腫細胞株、マウスL −929細胞、5w1ss、 Ba1b
−cまたはN工Hマウスカら誘導される3T3細胞株、BHKまたはHaKハム
スター細胞株などが含まれる。
その後、安定な形質転換細胞は標準的な免疫検定または活性検定により凝固活性
産物の発現についてスクリーニングされる。
凝固活性タンノξり質をコードするDNAの存在は、サザンブロッティング(S
outhern、 blotting)のような標準方法により検出できる。発
現ベクターDNAを適当な宿主細胞(例えばC08−1サル細胞)中へ導入した
後の数日間にわたる凝固剤遺伝子の一時的発現は、選択することなく培地中のタ
ンパク質の活性検定または免疫検定により測定される。
慣用手段によるDNAの発現後、生産された変異型は既知方法により回収・精製
され、かつ/また物理化学的、生化学的および/または臨床的ノミラメ−ターに
関して同定される。
哺乳動物宿主細胞により生産された野生型全長■:C因子は、〜90KD1〜7
6KDオヨび〜69KDフラグメントと共に〜2ooKDのN末端重鎖および〜
80KDのC末端軽鎖により特徴づけられる。トロンビンで処理すると、次のも
の:すなわち〜180KD(汚れ)、〜69 KD 、 〜65 KD (Xa
因子で消化後)、〜5oKD、〜45KDおよび〜43KD フラグメントを含
むポリRプチト9フラグメントがSDS −PAC,Eにより観察された。活性
物質は〜50KDと〜9QKDポリペプチドの複合体であると考えられ、恐らく
〜43KDポリはプテドとさらに会合していると思われる。9QKD部位と75
KD部位の間で欠失された欠失類似体の場合は、一本領ボリはプチドが約〜18
0KDまでの重鎖および〜76KDの軽鎖と共に〜200KDまでの分子量とし
て観察される。トロンビン消化後、末端切断B−ドメインは〜69KD、〜65
KD (Xa消化後)、〜5QKD、〜4.5KDおよび〜43KDのポリペプ
チドと共に〜92KDまでの分子量として観察される。本発明に従ってタンパク
質の1個所以上の切断部位での特定加水分解を部分的にまたは完全に排除するよ
う突然変異誘発させた\■:c因子型コード化DNA配列な哺乳動物宿主細胞中
で発現させることにより、本発明は以下の特徴を有するホリ投プチドから成る活
性\■:c因子型凝固剤組成物を初めて提供する:
(a) −’プチド配列が75KD部位で切断されないように修飾された態様に
おける、トロンビン消化前および消化後の〜76KDrf +)ペプチドの実質
的不在;
(1!’) −’プチド配列がXa部位(Arg−1721)で切断されないよ
うに修飾された態様における、χa因子処理前および処理後の〜55KDフラグ
メントの実質的不在;(C)″!プチド配列カ90KD部位(Arg−740)
で切断されないように修飾された態様における、トロンビン処理前および処理後
の〜9QKDフラグメントの実質的不在;(d) ペプチド配列がAPC部位(
Arg−336)で切断されないように修飾された態様における、トロンビン処
理前および処理後の〜4QK、Dフラグメントの実質的不在;および(+り2個
所以上の切断部位での特定加水分解が妨げられた態様における、上記(α)〜(
ct)の組合せ。
本発明のタンパク質はヒト\■:c因子に対するモノクローナル抗体と結合する
ことが分かり、こうしてこの種の抗体を使用するイムノアフィニティークロマト
グラフィーにより、および/または慣用のタンパク質精製法により回収・精製さ
れた。さらに、これらの化合物は〜■:c因子様凝固活性を保有する。
本発明化合物は当分野で知られた方法により非経口的に許容されるビヒクルおよ
び/または1種以上の希釈剤を用いて薬学的に許容される製剤に処方される。
非経口投与に適する本発明の薬学的製剤は、有利には、受容者の血液と等張付の
液剤を生ずるように滅菌溶液の添加により用時調製しうる滅菌凍結乾燥タン・ξ
り質製剤から成る。この製剤は単位用量容器または多重用量容器(例えば密閉ア
ンプルやバイアル)で提供される。それらの使用法は効力が適切に調節されたヒ
III因子のそれと類似しているだろう。
本発明は以下の実験実施例および方法によりさらに理解されるだろう。しかしな
がら、これらの実施例および方法は単に例示するためのものであって、請求の範
囲に記載される本発明の真の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない
。
プラスミドの作製
tm因子c DNAの突然変異誘発は、異なるベクター間で塩基配列を様々に変
える労力を最小限にするため、発現ベクター中で直接行った。一般に、突然変異
誘発のために採用された方法はモリナガ(Morinaga)の方法を改変した
ものであった。この方法は\■因子発現プラスミド中に有利な唯一の制限部位を
もつプラスミドを作製することにより促進される。以下は唯一のEC0RV、H
pa工、C1aIおよびXbaI制限部位をもっ〜■因子発現プラスミドの作製
を示す。プラスミ)”pMT2はI)MT2−VWFのEcoRI 消化により
得られ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号ATCC6
7122として寄託されたEcoRI消化はpMT2−VWF中に存在するcD
NA挿入物を切除して線状のpMT2をもたらし、この線状pMT2は連結して
大腸菌HB101またはDH−5をアンピシリン耐性へ形質転換するために使用
できる。プラスミ)l” pMT2 DNAは慣用方法により作製しうる。pM
T2■はその後pMT2をEcoRVおよびXbaIで消化し、消化DNAをD
NA $リメラーゼ■のKlenowフラグメントで処理し、そしてC1aリン
カ−(NEBiolabs社製、 CAT(X;ATG)を連結することにより
作製された。これはpMT 2のsv4 Q複製起点およびエンハンサ−配列に
近℃・Hlna III部位から始まる塩基2171〜2421を除去する(1
1)MT2の01aI誘導体)。■因子cDNAはpsPs4〜■から5aII
で切り取り、’r4 DNAポリメラーゼで平滑末端となし、EcoRI 7ダ
プター(AATTCCTCGAGAGCT)を付加した。
EcoRIアダプターを付加した\■因子cDNAはその後pMT 2の01a
I誘導体のEc oRI部位に連結した。得られたプラスミドはpMT2−〜・
■と名づけだ。
全長■因子発現プラスミドをCO8−1細胞に導入すると、低レベルの〜■因子
が得られる。\■■子コート9領域の中間領域を欠失させることにより(上記の
米国特許出願第725350号および関連PCT出願を参照)、トロンビン活性
化を含めた天然型)■因子と非常に類似した特性を有する〜■因子が比較的高レ
ベルで得られた。従って、〜■■子切断部位における突然変異の分析は、より効
率的に発現されるこれらの欠失肪導体の突然変異を研究することにより促進され
た。こうして、■因子発現プラスミド1)MT2\徂の欠失体が、pDGR−2
からKpnI部位(〜■因子cDNAの1961位)〜Xba工部位(〜■因子
cDNAの7096位)を取り出し、それをpMT2■のKpnI −XbaI
フラグメントに連結することにより作製された。この最終誘導体はpMT2−
DGRである。
突然変異誘発
\■因因子発現プラスミド圧おける特定部位の突然変異誘発は以下の工程を包含
する:
l) プラスミドpMT2− DGRはC1aIで線状化し、ウシp5ホス7プ
ターゼで処理し、そして0.8 %低融解温度トリスー酢酸アガロースゲル上で
分離した。その後、その線状化バンドを二酸化ケイ素に吸着させることにより抽
出し、トリス−EDTAで溶出した。
2) pMT 2− DGHの第20ツトは以下で述べるようにKpnIおよび
XhoIまたはKpnIおよびXbaIで消化し、0.8%低融解温度アガロー
スゲル上で分離し、そして上記の如く抽出した。
3) これらのプラスミド又れぞれ1〜ずつを混合し、容量を18μlに調整し
て2N NaOH2,0μlを加えた。
4) この混合物を室温で10分間変性させ、その後0.02NHClおよび0
.1M)リス−H(J (pHg、o )から成る溶液180μgで中和した。
5) このヘテロ二本鎖混合物40μlに突然変異誘発性のリン酸化オリゴヌク
レオチド20ピコモルを加えた。
6) この混合物を68℃の加熱ブロック中に90分間入れた。
インキュイージョン後、この混合物を室温へ徐々に冷却させた。
7) それぞれの突然変異誘発反応に対して、ペテロ二本鎖オリゴヌクレオチド
混合物を40μl使用した。この反応は2D1MM9012.1 mMβ−メル
カプトエタノール、400μMATP、100/4デオキシヌクレオチド三リン
酸、3〜4単位/μgの大腸菌DNA lリメラーゼ■のKlenowフラグメ
ント、および400単位/μlの’r4 DNAリガーゼ中で行った。
8) この反応は室温で10分間、次に16℃で一晩インキーイーションした。
9) この反応はフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により終
結させ、得られた沈殿物を70%エタノールで洗って、滅菌82010μで中に
再懸濁した。
10)その後DNAを使用してコンピテ:/ ) HB 101またはDH−5
細菌を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーは5 x SSC。
0.1%SDS、 5xDenharat試薬および100μ9/m#性サケ精
子DNA中でI X 106cpm/mlの32p−標識スクリーニングオリゴ
ヌクレオチド9を用いてスクリーニングした。
11)フィルターはオリゴヌクレオチドプローブの計算した融解温度より5℃低
い温度で5xSSC,0,1%SDSにより洗浄した。
12) DNAはポジティブにハイブリダイズするクローンから調製し、初めに
異なる制限酵素での消化およびアガロースゲル電気泳動により分析した。DNA
をニトロセルロースに移行させ、フィルターを調製し、そして突然変異誘発性オ
リゴヌクレオチドが正しいフラグメントに導入されたことを確かめるためにスク
リーニングプローブとハイブリダイズさせた。
13)その後DNAを太陽菌に形質転換させ、アンピシリン耐性コロニーはスク
リーニングオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについてスクリーニ
ングした。
14)最終突然変異はDNA塩基配列決定により確かめた〔サンガー(Sang
er)ら、Proc、Natl、Acad、Sci、 USA 74 :546
3〜5467(1977)を参照〕。
実施例 1
76KD切断部位の変更:
特定切断部位の変更は、切断部位のアミン末端側の塩基性アミノ酸を変えること
により達成される。アミノ酸置換の選択はタンパク質の折りたたみ(foldi
ng)および/または機能に影響を及ぼしうるので、この点に関しての最良の選
択は保存的変更である。若干のプロテアーゼ(例えばトロンビン)はアルギニン
に対して非常に特異的である。従って、アルギニンのりシンへの変更は有意に切
断を阻害する。より劇的な修飾(例えばインロイシンへの変更)はタンパク質加
水分解に対する抵抗性を保証するであろう。76Kaの切断に関与するプロテア
ーゼは知られていないので、1648位のアルギニンからインロイシンへの変更
を行った。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは表Hの39− mar、 A6
1であった。スクリーニングヌクレオチビは表Hの15−mar 、A62であ
った。突然変異誘発はpM’r 2− DGRノKpnI −XbaI 7ラグ
メントおよびpMT2− DGRのCdaI消化線状体を用いて上記のように実
施した。得られた変異体はDNA塩基配列決定(サンガーらの上記文献参照)に
より正しいことを証明した。DNA(pcsM 1648)は塩化セシウム中で
バンド化して調製し、前述の如<cos−1サル細胞をトランスフェクションす
るために使用した(カウフマン、PNAS、照: 689.1985を参照)。
トランスフェクションの60時間後、調整培地の試料を採取して、カビコアテス
ト発色検定法(Kabi社)により\狙因子活性について、またはトロンビン活
性化の前および後に\・■因子欠損血漿を凝血させる能力(活性化部分トロンボ
プラスチン時間; APTTと略す)につ(・て調べた。活性検定から得られた
結果を表IIIに示す。76Ka切断部位の突然変異は調整培地中に生産された
\■因子の活性を低下させなかった。さらに、トロンビン活性化係数に全く変化
がなかった。この突然変異が実際に76Ka切断部位を破壊したことを立証する
ために、トランスフェクションした細胞を353−メチオニンで6時間標識し、
その後調整培地と細胞抽出物を免疫沈降および5DS−41Jアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分析のために調製した。これらの結果は、Argの工leへの
変更が細胞からの\■因子変異型の合成または分泌に影響を与えないことを証明
した。トロンビン消化後の放射性標識タンパク質の分析は6gKa、および50
と40Kaフラグメントの通常の出現を示した。しかしながら、生産された主な
SI因子物質は76Kd部位での切断に対する抵抗性の結果として一本鎖分子で
あった。この結果は、一本領■因子が天然分子と同様に活性であることを示した
。一本領\■:C因子変異型は、それらがより均質な形で生産され且つ天然ヒト
または他の組み換え〜■:C因子タンパク質に比べて改善された薬物反応速度論
的プロフィールを有するという点で優れている。
実施例 2
76Ka切断部位でのArg→IJe変更に代わるべき手段は、切断を遮断する
ためにArgに隣接してアスパラギンのN−結合グリコシル化部位を導入するこ
とであった。この変更の利点は、得られるタンパク質が炭水化物成分を有するた
めに修飾アミノ酸が免疫反応を起こすのを阻止しうるということである。こうし
て、表Hの突然変異誘発性オリゴヌクレオチド腐3が合成された。この突然変異
誘発現象はGJn −Arg−Glu−11e −Tbr配列をGln −Ar
g−Asn −I’le −Thr配列に変換した。突然変異のスクリーニング
のために使用したオリゴヌクレオチドは表■の14−mθr、 /%4であった
。この突然変異のために、突然変異誘発は一本鎖ファージM13ばフタ−にクロ
ーニングされた天然の非欠失〜■因子cDNAを用いて実施した。全\■因子c
DNAを含む5aIIフラグメントはM13起点ばフタ−pcc2のXhoI部
位へ挿入した。pcc 2はアンピシリン耐性、大腸菌複製起点、M13複製起
点およびXhoI部位含有ポIJ リンカ−を含むプラスミドである。その他の
同様の市販プラスミドももちろん使用できる。リン酸化(20ピコモル)突然変
異誘発性オリゴヌクレオチドは1μgの鋳型と共に20mM)リス−HC1,1
0rrM M9C1l 2.50 +nM NaG41 mMジチオトレイトー
ルを含む10μl中で65℃にて10分間アニーリングさせた。この反応を徐々
に冷却させ、10μgの溶液B(20mM)リス−Hcl (pH7,s )、
10mMM9C12、tomMジチ第1・I/イトール、1 mMずツノヌクレ
オチ)、′ニリン酸(a、ATP、acTP、acTPおよびaTTP )、1
0 mM ATP。
400単位/mlリガーゼ、および3〜4単位/μlのDNAポリメラーゼエの
Klenowフラグメント〕、23℃で5分インキュベーションし、次いで16
℃で一晩インキユイーションした。この反応はフェノール/クロロホルム抽出お
よびエタノール沈殿により終結させた。DNAは10111の10mM)リス−
Hcg (7’87.5)およびI mM EDTA中に再懸濁し、1μlを採
取して大腸菌HBIOIを形質転換した。
DNA、(C:SM −164,9)は調製して上記のようにCO3−1細胞に
トランスフェクションした。cos −1<m胞のトランスフェクション後、前
のように調整培地を検定し、この培地はp、M’r2中の野生型\■:C因子c
DNAにより生産されたものと類似した活性を比較的低レベルで含有することが
分かった。上記のような353−メチオニン標識タンパク質の分析は、N−結合
糖の存在が切断を一部阻止することを示した。この特定タイプの突然変異の、切
断を阻止して分泌を可能にする能力は、恐らくタンパク質の構造に依存して個々
のタンパク質配列により変化するで90Kd切断部位の突然変異ニ
740位でのアルギニンのインロイシンへの突然変異は表■のオリゴヌクレオチ
ド屑5を用いて行った。正しい突然変異は表■の15− marA 6を用いて
スクリーニングした。突然変異誘発はpMT 2− DGRのKpnニー Xb
aI 7ラグメントおよびpMT2−DGRのCJa工消化線状体を用いて実施
した。得られたDNA(O31,4−740)は上記のように調製してトランス
フェクションを行った。試料を上記のように検定し、C3M−740はpM’r
2−DGRよりも低い活性を生ずることが分かった。353−メチオニン標識細
胞抽出物および調整培地の免疫沈降ならびにゲル電気泳動による分析は、〜■因
子の合成、分泌、活性およびトロンビン活性化がこの切断部位の変更により劇的
に改変されなかったことを示した。精密な検査によりC3M−740の分泌レベ
ルはあまり効率的でないことが見出された。こうして、gOKa切断部位の切断
は\■因子活性にとって不可欠であるという訳ではない。
実施例 4
372位でのトロンビン切断部位の突然変異:A、372位でアルギニンをイン
ロイシンに変換するための突然変異誘発性オリゴヌクレオチド9は表Hのオリゴ
ヌクレオチド屑7であった。正しい突然変異を同定するのに使用したオリゴヌク
レオチドは表■の腐8であった。突然変異誘発はpMT2− DGRのKpnI
−XhoI 7ラグメントおよびpMT2− DGRのC1aI消化線状体を用
いて実施した。得られたプラスミドDNA(C8M−372)は上記のように調
製してCO3−1細胞にトランスフェクションした。試料を上記の如く検定した
。結果は、372切断部位の破壊が\■因子活性を90%以上低下させることを
証明した。その上、トロンビン処理は活性を回復させない。別の分析は〜■因子
ノ修飾型が適切に合成されて分泌されたことを示した。
B、に−372変異型を作るために、表■のオリゴヌクレオチド9/167およ
び腐8の類似体(IceコドンE匹の代わりにLysコドン例えばAAAを含む
)を用いて実施例4Aを繰り返した。
実施例 5
R−336位でのトロンビン切断部位(提案された活性化プロティンC切断部位
)の突然変異:
A、336位でアルギニンをリシンに変換するための突然変異誘発性オリゴヌク
レオチドは表■のオリゴヌクレオチド/VL9であった。突然変異をスクリーニ
ングするために使用したオリゴヌクレオチドは腐10であった。この突然変異誘
発はpMT′2−DGFiのKpnI −XhoI 7ラグメントおよびpM’
r2− DGRのC1aI消化線状体を用いて実施した。得られたDNA (C
3M−336)は上記のように調製してトランスフェクションを行い、得られた
試料を検定した。その結果は活性の増加および通常のトロンビン活性化を示した
。この修飾\■因子はその合成または分泌に影響を及ぼさなかった。活性が増加
した原因はcobas検定において提案されたXa切断の結果としての不活化が
低下したためであると考えられる。従って、この変更は■因子のより安定した形
を提供すると思われる。
B、l−336変異型を作るために、表■のオリゴヌクレオチド腐9および/%
10の類似体(Lysコドン匹の代わりにIIs コドン例えばATCを含む)
を使用して実施例5Aを繰り返した。
こうして作られたニー 336変異型はに一336変異型と類似した生物学的性
質をもっていた。さらに、全長1−336およびに−336変異型が作られ、こ
れらは対応する欠失変異型と同様の生物学的性質を有することが分かった。
実施例 6
6gKa切断部位の突然変異:
A、アルギニンをリシンに突然変異誘発させるためのオリゴヌクレオチドは表■
のAllであった。スクリーニングオリゴヌクレオチビは表■の15−merJ
612であった。突然変異誘発はpM’r2− DC,RのKpnI −Xba
Iフラ/メントおよびpMT2− DGRの01a I消化線状体を用いて実施
した。正しい突然変異をもつDNA (C8M−1589)を調製してCOS細
胞にトランスフェクションした。細胞は上記の如く分析した。結果は6g Ka
切断部位の突然変異がpMT2− DGRから生成したものと同様の活性をもた
らすことを示した。従って、我々の6gKa切断部位におけるアルギニンに代わ
るリシンの突然変異は〜■:C因子活性を破壊しない。
B、l−1689変異型を作るために、表■のオリゴヌクレオチド9Allおよ
び412の類似体(LyeコドンAAAの代わりに11eコビン例えばATCを
含む)を使用して実施例6Aを繰り返した。
驚いたことに、こうして生産されたI −1689変異型はpMT2−DG〜2
労1られた■:C因子活性の90チ以下の活性を保有することが分かった。我々
の結果は、69Kd部位での切断がこの分子を活性化させるのに重要であり且つ
Arg −1689のLyeによる置換がこのような切断を排除しないことを示
唆して℃・る。
さらに、K−1689変異型は恐ら<tl[I:C因子活性が遅れて開始され、
治療上有用であるだろう。
これらの突然変異の大部分は〜■因子の欠失体(DGR)において構築され且つ
分析されたものであるが、変更は全長”111[因子をコードするDNAを用い
て直接行うこともでき、また突然変異を起こした欠失変異型DNAおよび野生型
\l[c因子コード化DNAを適当な酵素で消化し、適当なフラグメントな連結
させて所望のプラスミドを作製することにより、突然変異を起こした欠失変異型
DNAから全長\■因子cDNA中に再導入することもできる。
さらに、同様の方法を使用して、■因子cDNA中に複数の突然変異を導入する
ことができる。試験したすべての場合に、我々は突然変異を起こした欠失変異型
により得られた結果が対応する全長変異型を用いた場合にも得られ、そして多数
のアミノ酸置換を作る結果が個々のアミノ酸修飾について別々に観察された結果
に関して加法的であることを見出した。提案されたAPC切断部位(例えばR−
336)およびXa切断部位(R−1721)の両方の部位にアミノ酸修飾を含
む変異型は、不活化に対して抵抗性の特に安定した変異型であるだろう。
表■
実験1
実験2
C8M−1649E−+N 196 10倍PMT2\−■ 185 10倍
実験3
C3M −1689R−+K 88 N、T。
pMT2−DGR103N、T。
N、T、 :試、噛しなかった
国際調査報告
lnmnaむ0C11^oが−caIIonNo:PCTI−二isa1r01
299
Claims (14)
- 1.ヒトVIII:c因子型凝固活性およびヒトVIII:c因子と実質的に同 じアミノ酸配列を有するタンパク質またはArg−372とSer−1690と の間で1〜1317個のアミノ酸が欠失されたその欠失類似体であって、(i) アルギニン−1689がリシンで置換されており、そして/または(ii)次の 群:(a)220、226、250、279、282、336、359、562 、740、776、1313、1648、1719および1721位のうち1個 所以上のアルギニン; (b)325位および338位の一方または両方のリシン;(c)346、39 5、407、1364および1380位の1個以上のチロシン;および (d)741位のセリン から選ばれた1個以上のアミノ酸が欠失されているか、あるいは独立に選ばれた 置換用アミノ酸で置換されていることを特徴とする上記タンパク質。
- 2.220、226、250、279、282、325、336、338、35 9、562、740、741、776、1313、1648、1719または1 721位のうち1個所以上を包含するトリペプチド配列がAsn−X−Thrま たはAsn−X−Ser(ここでXはアミノ酸である)から成るトリペプチド配 列で置換されている、請求の範囲第1項記載のタンパク質。
- 3.XはArgでない、請求の範囲第2項記載のタンパク質。
- 4.請求の範囲第1〜3項記載のタンパク質をコードするcDNA。
- 5.発現調節配列に操作可能な状態で連結された請求の範囲第4項記載のcDN Aを含み、そのcDNAによりコードされるタンパク質を発現しうる宿主細胞。
- 6.ヒトVIII:c因子型凝固活性およびヒトVIII:c因子と実質的に同 じアミノ酸配列を有するタンパク質またはArr−372とSer−1690の 間で1〜1317個のアミノ酸が欠失されたその欠失類似体であり、アルギニン −1689がリシンで置換されており、そして/または次の群: (a)220、226、250、279、282、336、359、562、7 40、776、1313、1648、1719および1721位のうち1個所以 上のアルギニン; (b)325および338位の一方または両方のリシン;(c)346、395 、407、1364および1380位の1個以上のチロシン;および (b)741位のセリン から選ばれた1個以上のアミノ酸が欠失されているか、あるいは独立に選ばれた 置換用アミノ酸で置換されていることを特徴とする上記タンパク質を生産する方 法であって、請求の範囲第5項記載の指主細胞を、上記タンパク質を生産させる 条件下で培養することから成る方法。
- 7.請求の範囲第6項記載の方法により生産されたタンパク質。
- 8.有効量の請求の範囲第1項記載のタンパク質を非経口的に許容されるビヒク ルまたは希釈剤と共に含有してなる血友病Aを治療または予防するための薬剤組 成物。
- 9.有効量の請求の範囲第7項記載のタンパク質を非経口的に許容されるビヒク ルまたは希釈剤と共に含有してなる血友病Aを治療または予防するための薬剤組 成物。
- 10.アミノ酸配列: A−X−B (ここで領域Aは実質的に表Iに示したAla−1からArg−372までのポ リペプチド配列を表し;領域Bは実質的に表Iに示したSer−1690からT yr−2332までのポリペプチド配列を表し;そして領域Xは表IのArg− 372からArg−740までの配列内に含まれるアミノ酸配列と実質的に同じ 0〜367個のアミノ酸から成るペプチド配列を表し;その際Xのアミノ末端は Aのカルボキシ末端にペプチド結合を介して共有結合され、そしてXのカルボキ シ末端はBのアミノ末端に同様に結合される) により特徴づけられるVIII:c因子型凝固活性を有するタンパク質。
- 11.請求の範囲第10項記載のタンパク質をコードするcDNA。
- 12.発現調節配列に操作可能な状態で連結された請求の範囲第11項記載のc DNAを含み、そのcDNAによりコードされるタンパク質を発現しうる宿主細 胞。
- 13.アミノ酸配列: A−X−B (ここで領域Aは実質的に表Iに示したAla−1からArg−372までのポ リペプチド配列を表し;領域Bは実質的に表Iに示したSer−1690からT yr−2332までのポリペプチド配列を表し;そして領域Xは表IのArg− 372からArg−740までの配列内に含まれるアミノ酸配列と実質的に同じ 0〜367個のアミノ酸から成るペプチド配列を表し;その際Xのアミノ末端は Aのカルボキシ末端にペプチド結合を介して共有結合され、そしてXのカルボキ シ末端はBのアミノ末端に同様に結合される) により特徴づけられるVIII:c因子型凝固活性を有するタンパク質の生産方 法であって、 請求の範囲第12項記載の宿主細胞を、上記タンパク質を生産させる条件下で培 養することから成る方法。
- 14.有効量の請求の範囲第10項記載のタンパク質を非経口的に許容されるビ ヒクルまたは希釈剤と共に含有してなる血友病Aを治療または予防するための薬 剤組成物。
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