JPH05219957A - 組織因子誘導体 - Google Patents
組織因子誘導体Info
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- JPH05219957A JPH05219957A JP3033513A JP3351391A JPH05219957A JP H05219957 A JPH05219957 A JP H05219957A JP 3033513 A JP3033513 A JP 3033513A JP 3351391 A JP3351391 A JP 3351391A JP H05219957 A JPH05219957 A JP H05219957A
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- JP
- Japan
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- tissue factor
- amino acid
- derivative
- cdna
- vii
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 汎発性血管内凝固症治療薬として有効な血液
凝固第VII因子との結合活性を有する組織因子誘導体の
作製方法の提供。 【構成】 ヒト組織因子の親水性ペプチド領域の一部か
らなり、本来のヒト組織因子のアミノ末端側のジスルフ
ィド結合を構成しうるアミノ酸配列、好ましくはアミノ
末端アミノ酸から数えて１１番目のアミノ酸から６７番
目のアミノ酸までのペプチド領域を含むＮ端側アミノ酸
配列からなる組織因子誘導体を遺伝子組換え法を用いて
作製する。さらに、得られた組織因子誘導体と血液凝固
第VII因子との結合活性を評価する独自の測定系を開発
し、得られた組織因子誘導体が血液凝固第VII因子との
結合活性を有することを確認する。
凝固第VII因子との結合活性を有する組織因子誘導体の
作製方法の提供。 【構成】 ヒト組織因子の親水性ペプチド領域の一部か
らなり、本来のヒト組織因子のアミノ末端側のジスルフ
ィド結合を構成しうるアミノ酸配列、好ましくはアミノ
末端アミノ酸から数えて１１番目のアミノ酸から６７番
目のアミノ酸までのペプチド領域を含むＮ端側アミノ酸
配列からなる組織因子誘導体を遺伝子組換え法を用いて
作製する。さらに、得られた組織因子誘導体と血液凝固
第VII因子との結合活性を評価する独自の測定系を開発
し、得られた組織因子誘導体が血液凝固第VII因子との
結合活性を有することを確認する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え組織因子
誘導体に関する。さらに詳細には、血液凝固第VII因子
（以下、Ｆ.VII）との結合活性を有する組織因子誘導体
に関する。
誘導体に関する。さらに詳細には、血液凝固第VII因子
（以下、Ｆ.VII）との結合活性を有する組織因子誘導体
に関する。
【０００２】
【従来技術】出血は生体にとって最も重篤な状態のひと
つであり、これを制御する一連の血液凝固反応が、数多
くある生体防御反応の中でも重要なシステムである事は
よく知られている。多くの複雑な反応から構成される一
連の血液凝固反応はカスケード反応と呼ばれている。カ
スケード反応は、内因系カスケード反応と外因系カスケ
ード反応の２つに大別される。血液凝固研究の歴史を見
ると、内因系カスケード反応の研究が先に行われた。こ
れは外因系を構成する一連の凝固因子群の精製が困難で
ありその実態が分析出来なかった事にある。これに比べ
て、内因系を構成する一連の凝固因子は、困難を伴いつ
つも研究が行われそのメカニズムが蛋白分子レベルで解
明された。その結果、内因系の研究が進展するにつれ、
実際に生体内でおこる血液凝固カスケード反応における
内因系の果たす生理的意義は疑問視されるようになって
きた（Y. Nemerson, Blood, 71(1988)p1-8）。
つであり、これを制御する一連の血液凝固反応が、数多
くある生体防御反応の中でも重要なシステムである事は
よく知られている。多くの複雑な反応から構成される一
連の血液凝固反応はカスケード反応と呼ばれている。カ
スケード反応は、内因系カスケード反応と外因系カスケ
ード反応の２つに大別される。血液凝固研究の歴史を見
ると、内因系カスケード反応の研究が先に行われた。こ
れは外因系を構成する一連の凝固因子群の精製が困難で
ありその実態が分析出来なかった事にある。これに比べ
て、内因系を構成する一連の凝固因子は、困難を伴いつ
つも研究が行われそのメカニズムが蛋白分子レベルで解
明された。その結果、内因系の研究が進展するにつれ、
実際に生体内でおこる血液凝固カスケード反応における
内因系の果たす生理的意義は疑問視されるようになって
きた（Y. Nemerson, Blood, 71(1988)p1-8）。
【０００３】一方、遺伝子工学・モノクローナル抗体等
を中心としたバイオテクノロジーは驚異的な発達を遂
げ、多くの未知の蛋白質を分子レベルで解析することを
可能にした。この波は凝固因子の研究分野にも当然波及
して来た。このような状況の中で、外因系を構成する血
液凝固因子をバイオテクノロジーの手法を用いて、蛋白
分子レベルで解析することが可能となった。その結果現
在では、生理的に重要な血液凝固反応は主として外因系
カスケード反応であると考えられるようになった（Y. N
emerson, Blood, 71(1988)p1-8）。外因系カスケード反
応は、組織因子がその開始因子である。従って、生理的
に血液が凝固する殆どの場合、組織因子がその引き金を
引いている。即ち止血という正常な血液凝固反応から、
血栓症・汎発性血管内凝固症候群など病的な血液凝固反
応にいたるまで、組織因子はそれらの開始因子という意
味で非常に重要な蛋白質である（第１図）。
を中心としたバイオテクノロジーは驚異的な発達を遂
げ、多くの未知の蛋白質を分子レベルで解析することを
可能にした。この波は凝固因子の研究分野にも当然波及
して来た。このような状況の中で、外因系を構成する血
液凝固因子をバイオテクノロジーの手法を用いて、蛋白
分子レベルで解析することが可能となった。その結果現
在では、生理的に重要な血液凝固反応は主として外因系
カスケード反応であると考えられるようになった（Y. N
emerson, Blood, 71(1988)p1-8）。外因系カスケード反
応は、組織因子がその開始因子である。従って、生理的
に血液が凝固する殆どの場合、組織因子がその引き金を
引いている。即ち止血という正常な血液凝固反応から、
血栓症・汎発性血管内凝固症候群など病的な血液凝固反
応にいたるまで、組織因子はそれらの開始因子という意
味で非常に重要な蛋白質である（第１図）。
【０００４】血液は組織因子に接触するだけで凝固す
る。組織因子は血球、血管内皮細胞等、血液が通常接し
ている生体構成成分の表面には存在せず、それ以外の大
部分の組織に存在する。このことが『組織因子』の名前
の由来でもある。組織因子は脂質部分と蛋白の安定な複
合体で、一種のリポ蛋白で、細胞膜中に存在している
（小林紀夫、Annual Review 血液 1988 p136）。まず、
血中の血液凝固第VII因子（以下Ｆ.VIIと省略）が組織
因子に結合し複合体を形成する。この複合体が血液凝固
第IX因子、X因子（以下それぞれＦ.IX、Ｆ.Xと省略）を
活性化する事によって血液凝固カスケード反応が進行
し、最終的に血液が凝固する。これらの反応において組
織因子は、Ｆ.VIIがＦ.IX、Ｆ.Xを活性化する反応にお
いて必須である。即ち組織因子がＦ.VIIと複合体を形成
しなければ、上記の反応は進行せず重篤な出血症状を呈
することになる。組織因子それ自体の機能は補酵素であ
る。即ち組織因子がないと反応は実質的に進まない。以
上のことから組織因子は、止血という正常な血液凝固反
応においてスイッチの役割を果たしている（第１図）。
る。組織因子は血球、血管内皮細胞等、血液が通常接し
ている生体構成成分の表面には存在せず、それ以外の大
部分の組織に存在する。このことが『組織因子』の名前
の由来でもある。組織因子は脂質部分と蛋白の安定な複
合体で、一種のリポ蛋白で、細胞膜中に存在している
（小林紀夫、Annual Review 血液 1988 p136）。まず、
血中の血液凝固第VII因子（以下Ｆ.VIIと省略）が組織
因子に結合し複合体を形成する。この複合体が血液凝固
第IX因子、X因子（以下それぞれＦ.IX、Ｆ.Xと省略）を
活性化する事によって血液凝固カスケード反応が進行
し、最終的に血液が凝固する。これらの反応において組
織因子は、Ｆ.VIIがＦ.IX、Ｆ.Xを活性化する反応にお
いて必須である。即ち組織因子がＦ.VIIと複合体を形成
しなければ、上記の反応は進行せず重篤な出血症状を呈
することになる。組織因子それ自体の機能は補酵素であ
る。即ち組織因子がないと反応は実質的に進まない。以
上のことから組織因子は、止血という正常な血液凝固反
応においてスイッチの役割を果たしている（第１図）。
【０００５】組織因子は通常、血球・血管内皮細胞等、
血液が通常接している生体構成成分の表面には存在しな
い。このため血液は通常血管が破壊されるなどして組織
因子に接触しない限り、凝固することなく流動性を保ち
続けている。しかしながらある疾患では血液中に組織因
子が出現し、その結果血液が凝固を開始し、汎発性血管
内凝固（ＤＩＣ）という病態を呈する事がある。血液中
に組織因子が出現する疾患としては白血病、その中でも
急性前骨髄性白血病が上げられる。この疾患においてＤ
ＩＣが出現する機構は次の通りである。白血球がある種
の癌化状態になると、その表面に組織因子を発現する。
白血球上に発現した組織因子は血液と接触するので全身
のあちこちで凝固反応が進行する。このため全身に微細
な血栓が多数生じ、その結果ＤＩＣ症状を呈することと
なる。以上の事より組織因子は、ＤＩＣという異常な血
液凝固反応においてその原因物質の役割を果たしている
といえる
血液が通常接している生体構成成分の表面には存在しな
い。このため血液は通常血管が破壊されるなどして組織
因子に接触しない限り、凝固することなく流動性を保ち
続けている。しかしながらある疾患では血液中に組織因
子が出現し、その結果血液が凝固を開始し、汎発性血管
内凝固（ＤＩＣ）という病態を呈する事がある。血液中
に組織因子が出現する疾患としては白血病、その中でも
急性前骨髄性白血病が上げられる。この疾患においてＤ
ＩＣが出現する機構は次の通りである。白血球がある種
の癌化状態になると、その表面に組織因子を発現する。
白血球上に発現した組織因子は血液と接触するので全身
のあちこちで凝固反応が進行する。このため全身に微細
な血栓が多数生じ、その結果ＤＩＣ症状を呈することと
なる。以上の事より組織因子は、ＤＩＣという異常な血
液凝固反応においてその原因物質の役割を果たしている
といえる
【０００６】組織因子の存在は古くより指摘されていた
が、実際蛋白質レベルで発見、同定されたのは1985年前
後である(Broze, J. Biol. Chem., 260(1985)10917-109
20 etc)。その後、組織因子のアミノ酸部分シークエン
スが解明される(Am.Heat.Assoc., Bach及びMorrissey
ら、1986年11月)などの研究成果を経て、ｃＤＮＡクロ
ーニングが行われるようになった。その中で、Spicerら
は、組織因子のアポ蛋白は263アミノ酸残基からなり、
さらに、この蛋白は３つのドメインからなり、1-219残
基の親水性ペプチド領域が細胞外に、220-242残基が細
胞膜内に、243-263残基が細胞質内に存在していること
を報告している（E.Spicer et al, Proc. Natl.Acad. S
ci. USA, 84(1987)5148-5152）。組織因子のアポ蛋白
は、それ自身凝固活性はないが、細胞膜のリン脂質内に
埋め込まれた形で凝固活性化作用を示す。
が、実際蛋白質レベルで発見、同定されたのは1985年前
後である(Broze, J. Biol. Chem., 260(1985)10917-109
20 etc)。その後、組織因子のアミノ酸部分シークエン
スが解明される(Am.Heat.Assoc., Bach及びMorrissey
ら、1986年11月)などの研究成果を経て、ｃＤＮＡクロ
ーニングが行われるようになった。その中で、Spicerら
は、組織因子のアポ蛋白は263アミノ酸残基からなり、
さらに、この蛋白は３つのドメインからなり、1-219残
基の親水性ペプチド領域が細胞外に、220-242残基が細
胞膜内に、243-263残基が細胞質内に存在していること
を報告している（E.Spicer et al, Proc. Natl.Acad. S
ci. USA, 84(1987)5148-5152）。組織因子のアポ蛋白
は、それ自身凝固活性はないが、細胞膜のリン脂質内に
埋め込まれた形で凝固活性化作用を示す。
【０００７】
【発明が解決しようとする問題点】従来技術の項目で述
べたように、組織因子は血液凝固の開始因子である。従
って、組織因子が血液と接触する事によって生じるＤＩ
Ｃ等の血液凝固異常疾患の治療には、組織因子を無力化
することが非常に有効であると期待される。現在、ＤＩ
Ｃ治療薬の代表的なものとしては、AT-III、ヘパリン、
ＦＯＹ等があるが、そのいずれも作用するポイントが血
液凝固カスケード反応の下流であるため、量的に増幅さ
れた凝固因子をブロックする必要があり、多くの投与量
が必要である。これと比較して、Ｆ.VIIと結合し、かつ
凝固活性を持たない組織因子誘導体をアナログとして患
者に投与してやれば、血液凝固カスケード反応の最上流
をブロックすることとなり、より少量の投与量で済み、
最も理に適ったＤＩＣ治療薬となりうる。
べたように、組織因子は血液凝固の開始因子である。従
って、組織因子が血液と接触する事によって生じるＤＩ
Ｃ等の血液凝固異常疾患の治療には、組織因子を無力化
することが非常に有効であると期待される。現在、ＤＩ
Ｃ治療薬の代表的なものとしては、AT-III、ヘパリン、
ＦＯＹ等があるが、そのいずれも作用するポイントが血
液凝固カスケード反応の下流であるため、量的に増幅さ
れた凝固因子をブロックする必要があり、多くの投与量
が必要である。これと比較して、Ｆ.VIIと結合し、かつ
凝固活性を持たない組織因子誘導体をアナログとして患
者に投与してやれば、血液凝固カスケード反応の最上流
をブロックすることとなり、より少量の投与量で済み、
最も理に適ったＤＩＣ治療薬となりうる。
【０００８】Genentech社は、1986年11月の Am. Heart
Assoc. において、Bachら、及びMorrisseyらのグループ
の発表した組織因子の部分アミノ酸配列データーを基に
オリゴヌクレオチドプローブを作製し、これを用いて組
織因子（１−２２０；アミノ末端アミノ酸(１)から２２
０番目のアミノ酸までのペプチドを意味する）のｃＤＮ
Ａをスクリーニング及びクローニングしたと述べている
（特開昭63-301797）。又、得られた組織因子を再脂質
化し、これを血友病犬に投与したときの無毒性・止血上
の有効性を述べている。すなわち、Genentech社は組織
因子を血有病の治療薬としての応用を考えている。
Assoc. において、Bachら、及びMorrisseyらのグループ
の発表した組織因子の部分アミノ酸配列データーを基に
オリゴヌクレオチドプローブを作製し、これを用いて組
織因子（１−２２０；アミノ末端アミノ酸(１)から２２
０番目のアミノ酸までのペプチドを意味する）のｃＤＮ
Ａをスクリーニング及びクローニングしたと述べている
（特開昭63-301797）。又、得られた組織因子を再脂質
化し、これを血友病犬に投与したときの無毒性・止血上
の有効性を述べている。すなわち、Genentech社は組織
因子を血有病の治療薬としての応用を考えている。
【０００９】Scripps研究所のエジントンらは、PCT公
開:WO88/07543、第１３回国際止血血栓学会、Cell, 50
(1987)129-135等の中で、組織因子の蛋白質１次構造を
基に10〜30残基から構成される種々のペプチドを合成
し、これら合成ペプチドによる凝固阻害実験をin-vitro
で行っている。その結果、『Trp-Lys-Ser』構造を含む
２種類の合成ペプチドが、凝固反応を阻害したので、こ
れらをＦ.VII分子との結合部位であると称している。し
かし、この実験ではこれら合成ペプチドが直接Ｆ.VIIと
結合し凝固反応を阻害したかどうかは不明であり、単に
合成されたペプチドがその化学的性質等の偶然性故に、
複雑な凝固反応系の別の所を阻害した可能性は否定出来
ない。更に重要な事には、これら多種の合成ペプチドを
リン脂質で再構成すると、そのほとんどが、凝固反応を
阻害している。従って、この実験系は果たして特異的な
ものかどうか疑念の余地がある。
開:WO88/07543、第１３回国際止血血栓学会、Cell, 50
(1987)129-135等の中で、組織因子の蛋白質１次構造を
基に10〜30残基から構成される種々のペプチドを合成
し、これら合成ペプチドによる凝固阻害実験をin-vitro
で行っている。その結果、『Trp-Lys-Ser』構造を含む
２種類の合成ペプチドが、凝固反応を阻害したので、こ
れらをＦ.VII分子との結合部位であると称している。し
かし、この実験ではこれら合成ペプチドが直接Ｆ.VIIと
結合し凝固反応を阻害したかどうかは不明であり、単に
合成されたペプチドがその化学的性質等の偶然性故に、
複雑な凝固反応系の別の所を阻害した可能性は否定出来
ない。更に重要な事には、これら多種の合成ペプチドを
リン脂質で再構成すると、そのほとんどが、凝固反応を
阻害している。従って、この実験系は果たして特異的な
ものかどうか疑念の余地がある。
【００１０】以上のことより、組織因子をＤＩＣ治療薬
として応用するには、Ｆ.VIIと結合しかつ凝固活性を持
たない組織因子誘導体をデザインする必要がある。即
ち、組織因子の任意の部分誘導体を可能な限りインタ
クトなコンフォメーションを伴った状態で調製できる
事、血液凝固第VII因子との結合力を特異的に調べら
れるスクリーニング系を持つ事が非常に重要である。さ
らに、これらを踏まえた上で、凝固反応を阻害すること
を満足しなければならない。また、ＤＩＣ治療薬として
の応用を考えた場合、大量に、安定に、しかも低コスト
で得られることが重要となる。実際、生体臓器を原料と
して、組織因子及びその誘導体、特にＦ.VII結合部位を
調製し、治療薬に応用することは、原料の入手・収率・
コスト・純度・コンタミする微生物等の問題より、実質
上不可能である。
として応用するには、Ｆ.VIIと結合しかつ凝固活性を持
たない組織因子誘導体をデザインする必要がある。即
ち、組織因子の任意の部分誘導体を可能な限りインタ
クトなコンフォメーションを伴った状態で調製できる
事、血液凝固第VII因子との結合力を特異的に調べら
れるスクリーニング系を持つ事が非常に重要である。さ
らに、これらを踏まえた上で、凝固反応を阻害すること
を満足しなければならない。また、ＤＩＣ治療薬として
の応用を考えた場合、大量に、安定に、しかも低コスト
で得られることが重要となる。実際、生体臓器を原料と
して、組織因子及びその誘導体、特にＦ.VII結合部位を
調製し、治療薬に応用することは、原料の入手・収率・
コスト・純度・コンタミする微生物等の問題より、実質
上不可能である。
【００１１】このような場合には、遺伝子組換え法が一
つの有効な手段と考えられる。しかしながら、遺伝子組
換え法では、組換え蛋白が大きいと、発現効率が悪く、
コストも高くなり、また、Cys-Cys結合が多い分子種で
は、ジスルフィド結合の再構成の不正確のため、生産性
が低下する等の欠点がある。逆に、組換え蛋白が小さす
ぎると、組織因子が本来有する生物学的活性、すなわ
ち、Ｆ.VII結合活性が喪失し、さらに、このような分子
サイズの小さいペプチドは、菌体内で分解を受け易く、
発現量をコントロールすることが困難であるという欠点
がある。
つの有効な手段と考えられる。しかしながら、遺伝子組
換え法では、組換え蛋白が大きいと、発現効率が悪く、
コストも高くなり、また、Cys-Cys結合が多い分子種で
は、ジスルフィド結合の再構成の不正確のため、生産性
が低下する等の欠点がある。逆に、組換え蛋白が小さす
ぎると、組織因子が本来有する生物学的活性、すなわ
ち、Ｆ.VII結合活性が喪失し、さらに、このような分子
サイズの小さいペプチドは、菌体内で分解を受け易く、
発現量をコントロールすることが困難であるという欠点
がある。
【００１２】
【問題を解決するための手段】このような状況におい
て、本発明者らは、ＤＩＣ治療薬として有効な、Ｆ.VII
結合活性を有する、可能な限りコンパクトな組織因子誘
導体を調製すべく検討を重ねた結果、ヒト組織因子の親
水性ペプチド領域においてジスルフィド結合が保存され
ている領域（４９−５７）、かつ、ヒト及びマウスの組
織因子のアミノ酸配列の比較データより、ホモロジーが
最も高い領域（１１−６７）が重要であると考え、少な
くともその領域を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
フラグメントを選択した。そして、遺伝子組換え法を用
いて、係る領域を含む種々の組織因子誘導体を調製する
ことに成功した。さらに、本発明によって、強いＦ.VII
結合活性を有する組織因子誘導体を調製することに成功
した。特に、高発現性、及び、強いＦ.VII結合活性を有
する、上記ペプチド領域を含む、より分子サイズの小さ
い組織因子誘導体を得ることに成功した。
て、本発明者らは、ＤＩＣ治療薬として有効な、Ｆ.VII
結合活性を有する、可能な限りコンパクトな組織因子誘
導体を調製すべく検討を重ねた結果、ヒト組織因子の親
水性ペプチド領域においてジスルフィド結合が保存され
ている領域（４９−５７）、かつ、ヒト及びマウスの組
織因子のアミノ酸配列の比較データより、ホモロジーが
最も高い領域（１１−６７）が重要であると考え、少な
くともその領域を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
フラグメントを選択した。そして、遺伝子組換え法を用
いて、係る領域を含む種々の組織因子誘導体を調製する
ことに成功した。さらに、本発明によって、強いＦ.VII
結合活性を有する組織因子誘導体を調製することに成功
した。特に、高発現性、及び、強いＦ.VII結合活性を有
する、上記ペプチド領域を含む、より分子サイズの小さ
い組織因子誘導体を得ることに成功した。
【００１３】すなわち、本発明は、ＤＩＣ治療薬として
の応用の可能性を有する、最もエッセンシャルかつ、十
分なＦ.VII結合活性をもった最小のヒト組織因子誘導体
を提供するものである。
の応用の可能性を有する、最もエッセンシャルかつ、十
分なＦ.VII結合活性をもった最小のヒト組織因子誘導体
を提供するものである。
【００１４】以下に本発明の組織因子誘導体の調製方法
について詳細に説明する。
について詳細に説明する。
【００１５】まず、組織因子の蛋白質フラグメントを調
製するのに必要なセルラインとしては、白血病細胞の一
種で組織因子を常に高く発現しているRET-1 cellが用い
られる。
製するのに必要なセルラインとしては、白血病細胞の一
種で組織因子を常に高く発現しているRET-1 cellが用い
られる。
【００１６】このRET-1 cell 由来ＲＮＡから合成され
たｃＤＮＡより、ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン（ＰＣＲ）法を用いて、所望とするアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡフラグメントを増幅する。この場合、公
知のヒト組織因子の塩基配列（J. Morrissey et al., C
ell, 50(1987)129-135 等）を基に、所望とするＤＮＡ
フラグメントの5'側及び3'側プライマーをＤＮＡ合成機
を用いて調製する。
たｃＤＮＡより、ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン（ＰＣＲ）法を用いて、所望とするアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡフラグメントを増幅する。この場合、公
知のヒト組織因子の塩基配列（J. Morrissey et al., C
ell, 50(1987)129-135 等）を基に、所望とするＤＮＡ
フラグメントの5'側及び3'側プライマーをＤＮＡ合成機
を用いて調製する。
【００１７】ここで、公知のヒト組織因子の塩基配列
（J. Morrissey et al., Cell, 50(1987)129-135 等）
より、ジスルフィド結合が保存されている領域は４９−
５７であり、さらに、ヒト及びマウスの組織因子のアミ
ノ酸配列の比較データ（S. Hartzell et al., Molecula
r and Cellular Biology, 9(1989)2567-2573）より、ホ
モロジーが最も高い領域は１１−６７である。また、宿
主として大腸菌を用いる場合、一般的に分子量が１０Ｋ
Ｄ（キロダルトン）以下の分子は分解を受け易く、その
発現量をコントロールすることが困難であるため、Ｎ端
側アミノ酸約１０ＫＤを含むポリペプチドをデザインす
るか、または、βgalactosidase（以下、βGal）等と融
合させて発現させることが望ましい。従って、本発明の
組織因子誘導体を調製する場合、ヒト組織因子のアミノ
酸配列のうち、少なくとも４９−５７領域、好ましくは
１１−６７領域、さらに好ましくは１−８３領域を含む
アミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントを用いる
ことが望ましい。
（J. Morrissey et al., Cell, 50(1987)129-135 等）
より、ジスルフィド結合が保存されている領域は４９−
５７であり、さらに、ヒト及びマウスの組織因子のアミ
ノ酸配列の比較データ（S. Hartzell et al., Molecula
r and Cellular Biology, 9(1989)2567-2573）より、ホ
モロジーが最も高い領域は１１−６７である。また、宿
主として大腸菌を用いる場合、一般的に分子量が１０Ｋ
Ｄ（キロダルトン）以下の分子は分解を受け易く、その
発現量をコントロールすることが困難であるため、Ｎ端
側アミノ酸約１０ＫＤを含むポリペプチドをデザインす
るか、または、βgalactosidase（以下、βGal）等と融
合させて発現させることが望ましい。従って、本発明の
組織因子誘導体を調製する場合、ヒト組織因子のアミノ
酸配列のうち、少なくとも４９−５７領域、好ましくは
１１−６７領域、さらに好ましくは１−８３領域を含む
アミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントを用いる
ことが望ましい。
【００１８】このようにして得られたＤＮＡフラグメン
トを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターで宿主細
胞を形質転換させる。宿主細胞には、大腸菌、酵母、動
物細胞等が用いられる。該形質転換細胞を培養すること
によって、所望とする組織因子誘導体が得られる。βGa
l融合法を用いた場合は、組織因子誘導体及びβGalの融
合蛋白質が得られる。所望とする組織因子誘導体の発現
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・
ブロット法によって確認することができる。
トを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターで宿主細
胞を形質転換させる。宿主細胞には、大腸菌、酵母、動
物細胞等が用いられる。該形質転換細胞を培養すること
によって、所望とする組織因子誘導体が得られる。βGa
l融合法を用いた場合は、組織因子誘導体及びβGalの融
合蛋白質が得られる。所望とする組織因子誘導体の発現
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・
ブロット法によって確認することができる。
【００１９】このようにして得られた組織因子誘導体
は、少なくとも４９−５７のジスルフィド結合領域を含
むポリペプチドであり、好ましくは１１−６７領域を含
むポリペプチドである。このような本発明の組織因子誘
導体の最も好ましいものの一つとして、１−８３のペプ
チド領域からなる分子量約１０ＫＤのポリペプチドが挙
げられる。
は、少なくとも４９−５７のジスルフィド結合領域を含
むポリペプチドであり、好ましくは１１−６７領域を含
むポリペプチドである。このような本発明の組織因子誘
導体の最も好ましいものの一つとして、１−８３のペプ
チド領域からなる分子量約１０ＫＤのポリペプチドが挙
げられる。
【００２０】次に、得られた組織因子誘導体のＦ.VII結
合活性を評価する。まず、Ｆ.VIIをコーティングしたＥ
ＬＩＳＡプレートに上記で得られた組織因子誘導体を反
応させ、その後、パーオキシダーゼで標識したヒト組織
因子に対するモノクローナル抗体を反応させる。ここ
で、本発明で用いたこのモノクローナル抗体はヒト組織
因子誘導体をマウスに免疫することにより、常法に従っ
て得られたもので、このモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマHTF-K108は、工業技術院微生物工学研究
所（微工研）に受託番号第１１９７９（FERM P-11979）
として寄託されている。この系を用いると、得られた組
織因子誘導体のＦ.VII結合活性を評価することが可能と
なる。
合活性を評価する。まず、Ｆ.VIIをコーティングしたＥ
ＬＩＳＡプレートに上記で得られた組織因子誘導体を反
応させ、その後、パーオキシダーゼで標識したヒト組織
因子に対するモノクローナル抗体を反応させる。ここ
で、本発明で用いたこのモノクローナル抗体はヒト組織
因子誘導体をマウスに免疫することにより、常法に従っ
て得られたもので、このモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマHTF-K108は、工業技術院微生物工学研究
所（微工研）に受託番号第１１９７９（FERM P-11979）
として寄託されている。この系を用いると、得られた組
織因子誘導体のＦ.VII結合活性を評価することが可能と
なる。
【００２１】
【発明の効果】以上、本発明により、遺伝子組換え法を
用いて、Ｆ.VII結合活性を有するよりコンパクトな組織
因子誘導体を調製することが可能となった。その結果、
分子サイズの小さい組織因子誘導体を発現する系が高発
現性を有し、かつ、これより発現された組織因子誘導体
が優れたＦ.VII結合活性を有していることが明らかとな
った。このことは、ＤＩＣ治療薬としての応用の観点か
ら、この組織因子誘導体が非常に有効であることを示唆
するものである。
用いて、Ｆ.VII結合活性を有するよりコンパクトな組織
因子誘導体を調製することが可能となった。その結果、
分子サイズの小さい組織因子誘導体を発現する系が高発
現性を有し、かつ、これより発現された組織因子誘導体
が優れたＦ.VII結合活性を有していることが明らかとな
った。このことは、ＤＩＣ治療薬としての応用の観点か
ら、この組織因子誘導体が非常に有効であることを示唆
するものである。
【００２２】以下、本発明の理解を深めるために実施例
に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
【００２３】
【実施例１】組織因子に対するモノクローナル抗体の作製 組織因子に対するモノクローナル抗体はヒト胎盤由来の
組織因子を免疫原として、常法に従い作製した。
組織因子を免疫原として、常法に従い作製した。
【００２４】(1)組織因子の精製 ヒト胎盤をホモジナイズしアセトンパウダーを作製し
た。次に２％トライトンＸ１００で組織因子を抽出し、
第VII因子をリガンドとしたアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーで組織因子を精製した。純度はSDS PAGE
法で測定した（第３図）。
た。次に２％トライトンＸ１００で組織因子を抽出し、
第VII因子をリガンドとしたアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーで組織因子を精製した。純度はSDS PAGE
法で測定した（第３図）。
【００２５】(2)免疫・ハイブリドーマの作製 精製ヒト組織因子を免疫原としてBALB/cマウスへ免疫し
た。抗血清を採取し、組織因子活性阻害能を測定・確認
後、マウスの脾臓からＢ細胞を回収し、ミエローマ（Ｐ
３Ｘ６３）とフュージョンさせ、ハイブリドーマを作製
した。約４００ウエルのハイブリドーマが形成された。
その後の培養は一般的手法に従った。
た。抗血清を採取し、組織因子活性阻害能を測定・確認
後、マウスの脾臓からＢ細胞を回収し、ミエローマ（Ｐ
３Ｘ６３）とフュージョンさせ、ハイブリドーマを作製
した。約４００ウエルのハイブリドーマが形成された。
その後の培養は一般的手法に従った。
【００２６】(3)スクリーニング・クローニング スクリーニングはＥＬＩＳＡプレートに、免疫原として
も使用した組織因子抗原を吸着させ、ＢＳＡでブロッキ
ング後、ハイブリドーマの培養上清を反応させた。非特
異成分を十分洗い流し、西洋ワサビパーオキシダーゼ標
識抗マウスIgGを反応させた。基質としてはオルソフェ
ニルジアミンを用いた。適当に発色後、２Ｍの硫酸で反
応を停止させ、492nmの吸光度を測定した。約５０ウエ
ルのハイブリドーマが陽性を示した。この５０個につい
て力価の高い１４クローンを選択し、更にクローニング
を行いモノクローナル抗体を得た。クローニング後、抗
体のサブクラスを検定したところ総てIgＧ1、κの組み
合わせであった。
も使用した組織因子抗原を吸着させ、ＢＳＡでブロッキ
ング後、ハイブリドーマの培養上清を反応させた。非特
異成分を十分洗い流し、西洋ワサビパーオキシダーゼ標
識抗マウスIgGを反応させた。基質としてはオルソフェ
ニルジアミンを用いた。適当に発色後、２Ｍの硫酸で反
応を停止させ、492nmの吸光度を測定した。約５０ウエ
ルのハイブリドーマが陽性を示した。この５０個につい
て力価の高い１４クローンを選択し、更にクローニング
を行いモノクローナル抗体を得た。クローニング後、抗
体のサブクラスを検定したところ総てIgＧ1、κの組み
合わせであった。
【００２７】(4)モノクローナル抗体の調製 このようにして作製したハイブリドーマ１４クローンを
各々プリスタン処理したマウス腹腔内で培養させ、モノ
クローナル抗体を含む腹水を回収した。腹水からモノク
ローナル抗体の精製はファルマシア社から販売されてい
るプロテインＡカラムクロマトグラフィーで行った。
各々プリスタン処理したマウス腹腔内で培養させ、モノ
クローナル抗体を含む腹水を回収した。腹水からモノク
ローナル抗体の精製はファルマシア社から販売されてい
るプロテインＡカラムクロマトグラフィーで行った。
【００２８】(5)モノクローナル抗体のキャラクタリゼ
ーション このようにして得られた、モノクローナル抗体１４種類
について、３種類の組換え組織因子誘導体；rTF1-219、
rTF1-174、rTF1-83と反応性をウエスタンブロットで調
べた。その結果、クローンナンバーHTF-K108のみが全て
の組換え組織因子誘導体と反応した。このモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ（HTF-K108）は、工業
技術院微生物工業研究所（微工研）に受託番号FERM-P11
979号として寄託されている。以下の実施例には本クロ
ーンを使用した。
ーション このようにして得られた、モノクローナル抗体１４種類
について、３種類の組換え組織因子誘導体；rTF1-219、
rTF1-174、rTF1-83と反応性をウエスタンブロットで調
べた。その結果、クローンナンバーHTF-K108のみが全て
の組換え組織因子誘導体と反応した。このモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ（HTF-K108）は、工業
技術院微生物工業研究所（微工研）に受託番号FERM-P11
979号として寄託されている。以下の実施例には本クロ
ーンを使用した。
【００２９】
【実施例２】組織因子ｃＤＮＡの合成 (1)細胞の選択とＲＮＡの抽出 組織因子高発現セルラインとしてRET-1 cellを選択し
た。これは森川らによって樹立された急性前骨髄性白血
病由来のセルラインで(森川;J.Histochem.Cytochem.,3
0:569.1982)、中村らによって組織因子の高い発現が確
認されている。RET-1 cell(３ディッシュ:30ml)を培養
し、γ-インターフェロン（東レ社製品）・フォルボー
ルエステル(Phorbol Myristate Acetate=Tetradecanoyl
Phorbol Acetate=TPA シグマ社)でインダクションをか
けた状態で３時間培養した。次に細胞を回収し、燐酸バ
ッファーで洗浄し、グアニジンチオシアネートで核酸を
抽出した。次に塩化セシウムの密度勾配遠心でＲＮＡを
分画しフェノールエタノール法で沈澱回収した。本サン
プルを５０μlのトリス−ＥＤＴＡバッファーに懸濁
し、RET-1 cell由来ＲＮＡサンプルとした。
た。これは森川らによって樹立された急性前骨髄性白血
病由来のセルラインで(森川;J.Histochem.Cytochem.,3
0:569.1982)、中村らによって組織因子の高い発現が確
認されている。RET-1 cell(３ディッシュ:30ml)を培養
し、γ-インターフェロン（東レ社製品）・フォルボー
ルエステル(Phorbol Myristate Acetate=Tetradecanoyl
Phorbol Acetate=TPA シグマ社)でインダクションをか
けた状態で３時間培養した。次に細胞を回収し、燐酸バ
ッファーで洗浄し、グアニジンチオシアネートで核酸を
抽出した。次に塩化セシウムの密度勾配遠心でＲＮＡを
分画しフェノールエタノール法で沈澱回収した。本サン
プルを５０μlのトリス−ＥＤＴＡバッファーに懸濁
し、RET-1 cell由来ＲＮＡサンプルとした。
【００３０】(2)ＲＮＡサンプルからｃＤＮＡの合成 ＲＮＡサンプルからｃＤＮＡの合成は、アマシャム社か
ら市販されている「ｃＤＮＡ合成システム・プラス」を
用いて行った。取り扱い説明書に従い以下のように行っ
た。ＲＮＡサンプルに逆転写酵素を作用させてファース
トストランドｃＤＮＡを合成した。プライマーはランダ
ムヘキサヌクレオチドを用いた。このようにして作製し
たＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを基質とし以下のよう
に行った。まず大腸菌リボヌクレアーゼＨを作用させて
ＲＮＡ鎖にニックとギャップを形成させた。引き続き大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを作用させてＲＮＡ鎖をＤＮ
Ａに置き換えた。最後にＴ４ＤＮＡポリメラーゼを作用
させてファーストストランドＤＮＡの3'末端にある小さ
なオーバーハングを除去した。以上の様にしてRET-1 ce
ll由来の総てのｃＤＮＡ混合物を得た。
ら市販されている「ｃＤＮＡ合成システム・プラス」を
用いて行った。取り扱い説明書に従い以下のように行っ
た。ＲＮＡサンプルに逆転写酵素を作用させてファース
トストランドｃＤＮＡを合成した。プライマーはランダ
ムヘキサヌクレオチドを用いた。このようにして作製し
たＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを基質とし以下のよう
に行った。まず大腸菌リボヌクレアーゼＨを作用させて
ＲＮＡ鎖にニックとギャップを形成させた。引き続き大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを作用させてＲＮＡ鎖をＤＮ
Ａに置き換えた。最後にＴ４ＤＮＡポリメラーゼを作用
させてファーストストランドＤＮＡの3'末端にある小さ
なオーバーハングを除去した。以上の様にしてRET-1 ce
ll由来の総てのｃＤＮＡ混合物を得た。
【００３１】
【実施例３】組織因子（１−２１９）（rTF1-219）の作製 (1)ＰＣＲ法による組織因子 cＤＮＡの増幅 ヒト組織因子の塩基配列はモリシー等（J.Morrissey et
al,Cell,50:129-135(1987)）、スパイサー等(E.Spicer
et al,ProNAS,84:5148-5152(198) )、スカルパチー等
(E.Scarpati et al,Biochemistry,26:5234-5238(198
7))、フィッシャー等(K.Fisher et al,Thrombsis Resea
rch,48:89-99,(1987))らによって発表されている。これ
らのデーターを基にＰＣＲ用のプライマーをＤＮＡ合成
機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマーは、
制限酵素であるNcoIサイト、開始コドン、Ala及びアミ
ノ酸配列１−４を含む20merからなる配列（5'-CCATGGCT
-TCA-GGC-ACT-ACA-3'）をもったＤＮＡフラグメントで
ある。これをTFN1と命名した。3'側のプライマーは、ア
ミノ酸配列２１６−２１９、ストップコドン、制限酵素
HindIIIサイトに対するアンチセンスの19merから構成さ
れる配列（5'-AAGCTTA-TTC-TCT-GAA-TCC-3'）を持った
ＤＮＡフラグメントである。これをTFC219と命名した。
al,Cell,50:129-135(1987)）、スパイサー等(E.Spicer
et al,ProNAS,84:5148-5152(198) )、スカルパチー等
(E.Scarpati et al,Biochemistry,26:5234-5238(198
7))、フィッシャー等(K.Fisher et al,Thrombsis Resea
rch,48:89-99,(1987))らによって発表されている。これ
らのデーターを基にＰＣＲ用のプライマーをＤＮＡ合成
機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマーは、
制限酵素であるNcoIサイト、開始コドン、Ala及びアミ
ノ酸配列１−４を含む20merからなる配列（5'-CCATGGCT
-TCA-GGC-ACT-ACA-3'）をもったＤＮＡフラグメントで
ある。これをTFN1と命名した。3'側のプライマーは、ア
ミノ酸配列２１６−２１９、ストップコドン、制限酵素
HindIIIサイトに対するアンチセンスの19merから構成さ
れる配列（5'-AAGCTTA-TTC-TCT-GAA-TCC-3'）を持った
ＤＮＡフラグメントである。これをTFC219と命名した。
【００３２】上記の２つのＤＮＡフラグメントを5'側及
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より市販
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−２１９、蛋白質分子量；約２６Ｋ、
ＤＮＡサイズ約６６０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットの添付文書に従った。ＰＣＲ後、サンプルの一
部をアガロース電気泳動で分析し、分子量を確認したと
ころ、約660bpの位置に特異的に増幅されたバンドが観
察された。これは予想どおりの分子サイズであった。
又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しのサンプルでＰＣ
Ｒを行ったが、いかなるバンドも検出されなかった（第
４図）。次にサンプル全量をアガロース電気泳動にアプ
ライしバンドを確認後バンドを含むアガロース断片を切
り出した。アガロース断片を少量のバッファーと共に透
析チューブに入れ電流を流しアガロース断片からＰＣＲ
増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。これをエタノール
で沈澱させ適当量のバッファーに懸濁した。このように
して得られたフラグメントをTFDNA1-219と命名した。
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より市販
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−２１９、蛋白質分子量；約２６Ｋ、
ＤＮＡサイズ約６６０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットの添付文書に従った。ＰＣＲ後、サンプルの一
部をアガロース電気泳動で分析し、分子量を確認したと
ころ、約660bpの位置に特異的に増幅されたバンドが観
察された。これは予想どおりの分子サイズであった。
又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しのサンプルでＰＣ
Ｒを行ったが、いかなるバンドも検出されなかった（第
４図）。次にサンプル全量をアガロース電気泳動にアプ
ライしバンドを確認後バンドを含むアガロース断片を切
り出した。アガロース断片を少量のバッファーと共に透
析チューブに入れ電流を流しアガロース断片からＰＣＲ
増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。これをエタノール
で沈澱させ適当量のバッファーに懸濁した。このように
して得られたフラグメントをTFDNA1-219と命名した。
【００３３】(2)rTF1-219発現用ベクターの調製 発現ベクターに組み込むため、TFDNA1-219を制限酵素Nc
oIとHindIIIで消化した。発現ベクターとして、ファル
マシア社から発売されているpKK233-2を用いた。pKK233
-2を制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、アガロース電気
泳動で分離・抽出し、制限酵素によって切り放される小
さなDNA断片を除去した。この消化済み発現ベクター
と、RET-1TF1-219ＤＮＡフラグメントの２つをＴ４リガ
ーゼで結合させた。これをpTF1-219と命名した（第５
図）
oIとHindIIIで消化した。発現ベクターとして、ファル
マシア社から発売されているpKK233-2を用いた。pKK233
-2を制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、アガロース電気
泳動で分離・抽出し、制限酵素によって切り放される小
さなDNA断片を除去した。この消化済み発現ベクター
と、RET-1TF1-219ＤＮＡフラグメントの２つをＴ４リガ
ーゼで結合させた。これをpTF1-219と命名した（第５
図）
【００３４】(3)トランスフォーメーション・発現・ス
クリーニング 上記反応溶液でＪＭ１０９のコンピータントセル（宝酒
造販売）をトランスフォーメーションし、アンピシリン
を含んだアガロースプレートにまき、３７℃で一晩培養
し、コロニーを形成させた。ランダムに１４コロニーを
サンプリングし、２mMのイソプロピルベーターチオガラ
クトピラノシドを含む１０mlのＬＢ培地で３７℃、一晩
振蕩培養した。培養液から大腸菌体を回収しグラスビー
ズで破壊し、１％ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７
℃、１時間処理し、蛋白質を抽出した。抽出サンプル１
４個についてSDS ポリアクリルアミド電気泳動を行い、
引き続きウェスタン・ブロットを行った。抗体には、実
施例１で得られた抗ヒトＴＦマウスモノクローナル抗体
HTF-K108を使用した。その結果１４コロニー中１３コロ
ニーが抗体と反応し、分子量約26KDの位置にバンドが確
認された。このようにして得られた組換え蛋白をrTF1-2
19と命名した。陰性コントロールとして大腸菌の抽出液
・陽性コントロールとしてヒト胎盤から精製した組織因
子を用いた。結果の一部を第６図に示す。
クリーニング 上記反応溶液でＪＭ１０９のコンピータントセル（宝酒
造販売）をトランスフォーメーションし、アンピシリン
を含んだアガロースプレートにまき、３７℃で一晩培養
し、コロニーを形成させた。ランダムに１４コロニーを
サンプリングし、２mMのイソプロピルベーターチオガラ
クトピラノシドを含む１０mlのＬＢ培地で３７℃、一晩
振蕩培養した。培養液から大腸菌体を回収しグラスビー
ズで破壊し、１％ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７
℃、１時間処理し、蛋白質を抽出した。抽出サンプル１
４個についてSDS ポリアクリルアミド電気泳動を行い、
引き続きウェスタン・ブロットを行った。抗体には、実
施例１で得られた抗ヒトＴＦマウスモノクローナル抗体
HTF-K108を使用した。その結果１４コロニー中１３コロ
ニーが抗体と反応し、分子量約26KDの位置にバンドが確
認された。このようにして得られた組換え蛋白をrTF1-2
19と命名した。陰性コントロールとして大腸菌の抽出液
・陽性コントロールとしてヒト胎盤から精製した組織因
子を用いた。結果の一部を第６図に示す。
【００３５】
【実施例４】組織因子（１−１７４）（rTF1-174）の作製 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップは実施例２と同じである。
Ａの合成までのステップは実施例２と同じである。
【００３６】(1)ＰＣＲ法による組織因子 cＤＮＡの増
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデーターを基にＤＮＡ
合成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマー
は実施例３のTFN1を用いた。3'末端のプライマーはアミ
ノ酸配列171-174、ストップコドン、HindIIIサイトを含
むアンチコドン側の19merから構成される配列（5'-AAGC
TTA-CTC-ATT-AGT-GTT-3'）を持ったＤＮＡフラグメント
を用いた。これをTFC176と命名した。
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデーターを基にＤＮＡ
合成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマー
は実施例３のTFN1を用いた。3'末端のプライマーはアミ
ノ酸配列171-174、ストップコドン、HindIIIサイトを含
むアンチコドン側の19merから構成される配列（5'-AAGC
TTA-CTC-ATT-AGT-GTT-3'）を持ったＤＮＡフラグメント
を用いた。これをTFC176と命名した。
【００３７】上記の２つのＤＮＡフラグメントを5'側及
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−１７４、蛋白質分子量；約２１Ｋ、
ＤＮＡサイズ約５２０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣ
Ｒ後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分
子量を確認したところ約５２０bpの位置に特異的に増幅
されたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サ
イズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しの
サンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出さ
れなかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース
電気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガ
ロース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッ
ファーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース
断片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。こ
れをエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁し
た。このようにして得られたフラグメントをTFDNA1ー174
と命名した。
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−１７４、蛋白質分子量；約２１Ｋ、
ＤＮＡサイズ約５２０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣ
Ｒ後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分
子量を確認したところ約５２０bpの位置に特異的に増幅
されたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サ
イズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しの
サンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出さ
れなかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース
電気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガ
ロース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッ
ファーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース
断片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。こ
れをエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁し
た。このようにして得られたフラグメントをTFDNA1ー174
と命名した。
【００３８】(2)rTF1-174発現用ベクターの調製 発現ベクターに組み込むため、TFDNA1ー174を制限酵素Nc
oI・HindIIIで消化した。発現ベクターとして、ファル
マシア社から発売されているpKK233-2を用いた。pKK233
-2を制限酵素NcoI・HindIIIで消化し、アガロース電気
泳動で分離・抽出し、制限酵素によって切り放される小
さなDNA断片を除去した。この消化・精製済み発現ベク
ターと、TFDNA1ー174の２つをＴ４リガーゼで結合させ
た。この操作によって得られたプラスミドをpTF1-174と
命名した。
oI・HindIIIで消化した。発現ベクターとして、ファル
マシア社から発売されているpKK233-2を用いた。pKK233
-2を制限酵素NcoI・HindIIIで消化し、アガロース電気
泳動で分離・抽出し、制限酵素によって切り放される小
さなDNA断片を除去した。この消化・精製済み発現ベク
ターと、TFDNA1ー174の２つをＴ４リガーゼで結合させ
た。この操作によって得られたプラスミドをpTF1-174と
命名した。
【００３９】(3)トランスフォーメーション・発現・ス
クリーニング pTF1-174をコンピータントな大腸菌株ＪＭ１０９へトラ
ンスフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロ
ースプレートに蒔き３７℃で一晩培養し、コロニーを形
成させた。ランダムな２０コロニーをサンプリングし、
２mMのイソプロピルベーターチオガラクトピラノシドを
含む１０mlのＬＢ培地で３７℃、一晩振蕩培養した。培
養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで破壊し、１％
ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、１時間インキ
ュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サンプルについ
てSDS ポリアクリルアミド電気泳動を行い、引き続きウ
ェスタン・ブロットを行った。組織因子に対する抗体は
HTF-K108を使用した。その結果２０コロニー中１８コロ
ニーが抗体と反応し、分子量約２１ＫＤの位置にバンド
が確認された。このようにして得られた組換え蛋白をrT
F1-174と命名した。陰性コントロールとして大腸菌の抽
出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤から精製した組
織因子を用いた。結果の一部を第６図に示す。
クリーニング pTF1-174をコンピータントな大腸菌株ＪＭ１０９へトラ
ンスフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロ
ースプレートに蒔き３７℃で一晩培養し、コロニーを形
成させた。ランダムな２０コロニーをサンプリングし、
２mMのイソプロピルベーターチオガラクトピラノシドを
含む１０mlのＬＢ培地で３７℃、一晩振蕩培養した。培
養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで破壊し、１％
ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、１時間インキ
ュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サンプルについ
てSDS ポリアクリルアミド電気泳動を行い、引き続きウ
ェスタン・ブロットを行った。組織因子に対する抗体は
HTF-K108を使用した。その結果２０コロニー中１８コロ
ニーが抗体と反応し、分子量約２１ＫＤの位置にバンド
が確認された。このようにして得られた組換え蛋白をrT
F1-174と命名した。陰性コントロールとして大腸菌の抽
出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤から精製した組
織因子を用いた。結果の一部を第６図に示す。
【００４０】
【実施例５】組織因子（１−８３）（rTF1-83）の作製 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップは実施例２と同じである。
Ａの合成までのステップは実施例２と同じである。
【００４１】(1)ＰＣＲ法による組織因子 cＤＮＡの増
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデーターを基にＤＮＡ
合成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマー
は実施例１のTFN1を用いた。3'末端のプライマーはアミ
ノ酸配列80-83、ストップコドン、制限酵素HindIIIサイ
トを含むアンチコドン側の19merから構成される配列
（5'-AAGCTTA-CAC-ATT-CCC-TGC-3'）を持ったＤＮＡフ
ラグメントを用いた。これをTFC83と命名した。
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデーターを基にＤＮＡ
合成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマー
は実施例１のTFN1を用いた。3'末端のプライマーはアミ
ノ酸配列80-83、ストップコドン、制限酵素HindIIIサイ
トを含むアンチコドン側の19merから構成される配列
（5'-AAGCTTA-CAC-ATT-CCC-TGC-3'）を持ったＤＮＡフ
ラグメントを用いた。これをTFC83と命名した。
【００４２】上記の２つのＤＮＡフラグメントを5'側及
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−８３、蛋白質分子量；約１０ＫＤ、
ＤＮＡサイズ約２５０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣ
Ｒ後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分
子量を確認したところ約２５０bpの位置に特異的に増幅
されたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サ
イズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しの
サンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出さ
れなかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース
電気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガ
ロース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッ
ファーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース
断片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。こ
れをエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁し
た。このようにして得られたフラグメントをTFDNA1ー83
と命名した。
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−８３、蛋白質分子量；約１０ＫＤ、
ＤＮＡサイズ約２５０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣ
Ｒ後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分
子量を確認したところ約２５０bpの位置に特異的に増幅
されたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サ
イズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しの
サンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出さ
れなかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース
電気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガ
ロース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッ
ファーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース
断片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。こ
れをエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁し
た。このようにして得られたフラグメントをTFDNA1ー83
と命名した。
【００４３】(2)rTF1-83発現用ベクターの調製 発現ベクターに組み込むため、TFDNA1ー83を制限酵素Nco
I・HindIIIで消化した。発現ベクターとして、ファルマ
シア社から発売されているpKK233-2を用いた。pKK233-2
を制限酵素NcoI・HindIIIで消化し、アガロース電気泳
動で分離・抽出し、制限酵素によって切り放される小さ
なDNA断片を除去した。この消化・精製済み発現ベクタ
ーと、TFDNA1ー83の２つをＴ４リガーゼで結合させた。
この操作によって得られたプラスミドをpTF1-83と命名
した。
I・HindIIIで消化した。発現ベクターとして、ファルマ
シア社から発売されているpKK233-2を用いた。pKK233-2
を制限酵素NcoI・HindIIIで消化し、アガロース電気泳
動で分離・抽出し、制限酵素によって切り放される小さ
なDNA断片を除去した。この消化・精製済み発現ベクタ
ーと、TFDNA1ー83の２つをＴ４リガーゼで結合させた。
この操作によって得られたプラスミドをpTF1-83と命名
した。
【００４４】(3)トランスフォーメーション・発現・ス
クリーニング pTF1-83をコンピータントな大腸菌株ＪＭ１０９へトラ
ンスフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロ
ースプレートに蒔き３７℃で一晩培養し、コロニーを形
成させた。ランダムな３８コロニーをサンプリングし、
２mMのイソプロピルベーターチオガラクトピラノシドを
含む１０mlのＬＢ培地で３７℃、一晩振蕩培養した。培
養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで破壊し、１％
ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、１時間インキ
ュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サンプルについ
てSDS ポリアクリルアミド電気泳動を行い、引き続きウ
ェスタン・ブロットを行った。組織因子に対する抗体は
HTF-K108を使用した。その結果３８コロニー中１８コロ
ニーが抗体と反応し、分子量約１０ＫＤの位置にバンド
が確認された。このようにして得られた組換え蛋白をrT
F1-83と命名した。陰性コントロールとして大腸菌の抽
出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤から精製した組
織因子を用いた。結果の一部を第６図に示す。
クリーニング pTF1-83をコンピータントな大腸菌株ＪＭ１０９へトラ
ンスフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロ
ースプレートに蒔き３７℃で一晩培養し、コロニーを形
成させた。ランダムな３８コロニーをサンプリングし、
２mMのイソプロピルベーターチオガラクトピラノシドを
含む１０mlのＬＢ培地で３７℃、一晩振蕩培養した。培
養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで破壊し、１％
ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、１時間インキ
ュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サンプルについ
てSDS ポリアクリルアミド電気泳動を行い、引き続きウ
ェスタン・ブロットを行った。組織因子に対する抗体は
HTF-K108を使用した。その結果３８コロニー中１８コロ
ニーが抗体と反応し、分子量約１０ＫＤの位置にバンド
が確認された。このようにして得られた組換え蛋白をrT
F1-83と命名した。陰性コントロールとして大腸菌の抽
出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤から精製した組
織因子を用いた。結果の一部を第６図に示す。
【００４５】
【実施例６】組織因子のＦ.VIIに対する結合アッセイ法 (1)アッセイ法の構築 ＥＬＩＳＡプレートにＦ.VIIをコートしＢＳＡでブロッ
キング反応を行った。このプレートにヒト胎盤由来精製
組織因子を1-1000μg/mlの濃度で３７度で１時間反応さ
せた。トリス緩衝液で洗浄後、西洋ワサビ由来のパーオ
キシダーゼで標識したHTF-K108を反応させた。過剰の
（未反応の）標識抗体を十分洗い流した後、オルソフェ
ニールジアミンを基質とし発色させ492/630nmの吸光度
を測定した。その結果、本アッセイ系は組織因子の濃度
に依存して発色した（第２図）。Ｆ．VIIはモノクロー
ナル抗体で精製した。モノクローナル抗体、精製法は、
今村らの方法によった（特許願平１−２０２２３９）。
組織因子,HTF-K108は実施例１の物を使用した。
キング反応を行った。このプレートにヒト胎盤由来精製
組織因子を1-1000μg/mlの濃度で３７度で１時間反応さ
せた。トリス緩衝液で洗浄後、西洋ワサビ由来のパーオ
キシダーゼで標識したHTF-K108を反応させた。過剰の
（未反応の）標識抗体を十分洗い流した後、オルソフェ
ニールジアミンを基質とし発色させ492/630nmの吸光度
を測定した。その結果、本アッセイ系は組織因子の濃度
に依存して発色した（第２図）。Ｆ．VIIはモノクロー
ナル抗体で精製した。モノクローナル抗体、精製法は、
今村らの方法によった（特許願平１−２０２２３９）。
組織因子,HTF-K108は実施例１の物を使用した。
【００４６】(2)組織因子誘導体のＦ.VII結合活性測定 上記で構築されたアッセイ系において、ヒト胎盤由来精
製組織因子のかわりに、実施例３〜５で得られた３種類
の組換え組織因子誘導体を用いて、その組織因子誘導体
のF.VIIに対する結合活性を測定した。その結果、３種
類の組換え組織因子誘導体全てがF.VIIと結合した。第
１表に組織因子誘導体の血液凝固第VII因子に対する結
合アッセイの結果する。
製組織因子のかわりに、実施例３〜５で得られた３種類
の組換え組織因子誘導体を用いて、その組織因子誘導体
のF.VIIに対する結合活性を測定した。その結果、３種
類の組換え組織因子誘導体全てがF.VIIと結合した。第
１表に組織因子誘導体の血液凝固第VII因子に対する結
合アッセイの結果する。
【００４７】
【第１表】 陽性コントロール;胎盤由来組織因子(20ng/ml) 陰性コントロール;大腸菌抽出液
【００４８】
【実施例７】組織因子（１−２１９）のβガラクトシダーゼとの融合
発現（βrTF1-219の調製） 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップは実施例１と同じである。
発現（βrTF1-219の調製） 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップは実施例１と同じである。
【００４９】(1)ＰＣＲ法による組織因子ｃＤＮＡの増
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデータを基にＤＮＡ合
成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマーは
XhoIサイト、NcoIサイト、開始コドン、アミノ酸配列の
−１〜＋６を含むセンス側の３２merから構成される配
列（5'-CTCGAG-CCATGGCT-TCA-GGC-ACT-ACA-AAT-ACT-
3'）を持ったＤＮＡフラグメントである。これをβTFN1
と命名した。
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデータを基にＤＮＡ合
成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマーは
XhoIサイト、NcoIサイト、開始コドン、アミノ酸配列の
−１〜＋６を含むセンス側の３２merから構成される配
列（5'-CTCGAG-CCATGGCT-TCA-GGC-ACT-ACA-AAT-ACT-
3'）を持ったＤＮＡフラグメントである。これをβTFN1
と命名した。
【００５０】3'末端のプライマーはアミノ酸配列214-21
9、ストップコドン、制限酵素HindIIIサイト、SalIサイ
トを含むアンチコドン側の31merから構成される配列
（5'-GTCGAC-AAGCTTA-TTC-TCT-GAA-TCC-CCC-TTT-3'）を
持ったＤＮＡフラグメントである。これをβTFC219と命
名した。
9、ストップコドン、制限酵素HindIIIサイト、SalIサイ
トを含むアンチコドン側の31merから構成される配列
（5'-GTCGAC-AAGCTTA-TTC-TCT-GAA-TCC-CCC-TTT-3'）を
持ったＤＮＡフラグメントである。これをβTFC219と命
名した。
【００５１】上記の２つのＤＮＡフラグメントを5'側及
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−２１９、蛋白質分子量；約２６Ｋ、
ＤＮＡサイズ約６６０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣ
Ｒ後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分
子量を確認したところ約６６０bpの位置に特異的に増幅
されたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サ
イズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しの
サンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出さ
れなかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース
電気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガ
ロース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッ
ファーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース
断片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。こ
れをエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁し
βTFDNA1ー219と命名した。
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−２１９、蛋白質分子量；約２６Ｋ、
ＤＮＡサイズ約６６０bp）を特異的に増幅した。操作法
はキットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣ
Ｒ後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分
子量を確認したところ約６６０bpの位置に特異的に増幅
されたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サ
イズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しの
サンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出さ
れなかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース
電気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガ
ロース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッ
ファーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース
断片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。こ
れをエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁し
βTFDNA1ー219と命名した。
【００５２】(2)βrTF1-219発現用ベクターの調製 発現ベクターに組み込むため、βTFDNA1ー219をXhoI、Sa
lIの制限酵素で消化した。βガラクトシダーゼ（βGa
l）融合発現ベクターとしては、アマシャム社から発売
されているpUEX2を用いた。pUEX2を制限酵素SalIで消化
後、アルカリフォスファターゼで処理し、末端の燐酸残
基を除去した。この消化・脱燐酸化済み発現ベクター
と、βTFDNA1ー219の２つをＴ４リガーゼで結合させた。
この操作によって得られたプラスミドをpβTF1-219と命
名した（第７図）。
lIの制限酵素で消化した。βガラクトシダーゼ（βGa
l）融合発現ベクターとしては、アマシャム社から発売
されているpUEX2を用いた。pUEX2を制限酵素SalIで消化
後、アルカリフォスファターゼで処理し、末端の燐酸残
基を除去した。この消化・脱燐酸化済み発現ベクター
と、βTFDNA1ー219の２つをＴ４リガーゼで結合させた。
この操作によって得られたプラスミドをpβTF1-219と命
名した（第７図）。
【００５３】(3)トランスフォーメーション・発現・ス
クリーニング pβTF1-219をコンピータントな大腸菌株HB-101へトラン
スフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロー
スプレートに蒔き３０℃で一晩培養させ、コロニーを形
成させた。ランダムな４８コロニーをサンプリングし、
１０mlのＬＢ培地で３０℃、一晩振蕩培養した。培養温
度を４２℃に上げて発現プラスミドの誘導培養を２時間
行なった。培養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで
破壊し、１％ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、
１時間インキュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サ
ンプルについてSDSポリアクリルアミド電気泳動を行
い、クマシ−ブリリアントブルーで染色した。４８コロ
ニー中４コロニーが、分子量約145KDの位置にβGALとＴ
Ｆ1ー219の融合蛋白質として確認された。
クリーニング pβTF1-219をコンピータントな大腸菌株HB-101へトラン
スフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロー
スプレートに蒔き３０℃で一晩培養させ、コロニーを形
成させた。ランダムな４８コロニーをサンプリングし、
１０mlのＬＢ培地で３０℃、一晩振蕩培養した。培養温
度を４２℃に上げて発現プラスミドの誘導培養を２時間
行なった。培養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで
破壊し、１％ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、
１時間インキュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サ
ンプルについてSDSポリアクリルアミド電気泳動を行
い、クマシ−ブリリアントブルーで染色した。４８コロ
ニー中４コロニーが、分子量約145KDの位置にβGALとＴ
Ｆ1ー219の融合蛋白質として確認された。
【００５４】引き続きウェスタン・ブロットを行った。
組織因子に対する抗体はHTF-K108を使用した。分子量14
5KDの位置にバンドが確認された。このようにして得ら
れた組換え蛋白をβrTF1-219と命名した。これは先に、
SDSポリアクリルアミド電気泳動において、確認された
のと同じ145KDの位置であった。陰性コントロールとし
て大腸菌の抽出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤か
ら精製した組織因子を用いた。結果の一部を第８図に示
す。
組織因子に対する抗体はHTF-K108を使用した。分子量14
5KDの位置にバンドが確認された。このようにして得ら
れた組換え蛋白をβrTF1-219と命名した。これは先に、
SDSポリアクリルアミド電気泳動において、確認された
のと同じ145KDの位置であった。陰性コントロールとし
て大腸菌の抽出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤か
ら精製した組織因子を用いた。結果の一部を第８図に示
す。
【００５５】
【実施例８】組織因子（１−８３）のβガラクトシダーゼとの融合発
現（βrTF1-83の調製） 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップは実施例１と同じである。
現（βrTF1-83の調製） 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップは実施例１と同じである。
【００５６】(1)ＰＣＲ法による組織因子ｃＤＮＡの増
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデーターを基にＤＮＡ
合成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマー
は実施例７で使用した物を用いた。
幅 ＰＣＲ法を用いたcDNAの増幅反応に使う、プライマーの
塩基配列は、フィッシャー(K.Fisher et al,Thrombsis
Research,48:89-99,(1987))らのデーターを基にＤＮＡ
合成機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマー
は実施例７で使用した物を用いた。
【００５７】3'末端のプライマーはアミノ酸配列78-8
3、ストップコドン、制限酵素ＨindIIIサイト、SalIサ
イトを含むアンチコドン側の31merから構成される配列
（5'-GTCGAC-AAGCTTA-CAC-ATT-CCC-TGC-CGG-GTA-3'）を
持ったＤＮＡフラグメントである。これをβTFC83と命
名した。
3、ストップコドン、制限酵素ＨindIIIサイト、SalIサ
イトを含むアンチコドン側の31merから構成される配列
（5'-GTCGAC-AAGCTTA-CAC-ATT-CCC-TGC-CGG-GTA-3'）を
持ったＤＮＡフラグメントである。これをβTFC83と命
名した。
【００５８】上記の２つのＤＮＡフラグメントを5'側及
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−８３、蛋白質分子量；約１０Ｋ、Ｄ
ＮＡサイズ約２５０bp）を特異的に増幅した。操作法は
キットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣＲ
後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分子
量を確認したところ約２５０bpの位置に特異的に増幅さ
れたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サイ
ズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しのサ
ンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出され
なかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース電
気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガロ
ース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッフ
ァーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース断
片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。これ
をエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁しβ
TFDNA1ー83と命名した。
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列１−８３、蛋白質分子量；約１０Ｋ、Ｄ
ＮＡサイズ約２５０bp）を特異的に増幅した。操作法は
キットに付属している業者の添付文書に従った。ＰＣＲ
後、サンプルの一部をアガロース電気泳動で分析し分子
量を確認したところ約２５０bpの位置に特異的に増幅さ
れたバンドが観察された。これは予想どおりの分子サイ
ズであった。又、コントロールとしてｃＤＮＡ無しのサ
ンプルでＰＣＲを行ったが、いかなるバンドも検出され
なかった（第４図）。次にサンプル全量をアガロース電
気泳動にアプライしバンドを確認後バンドを含むアガロ
ース断片を切り出した。アガロース断片を少量のバッフ
ァーと共に透析チューブに入れ電流を流しアガロース断
片からＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを抽出した。これ
をエタノールで沈澱させ適当量のバッファーに懸濁しβ
TFDNA1ー83と命名した。
【００５９】(2)βrTF1-83発現用ベクターの調製 発現ベクターに組み込むため、TFDNA1ー83をXhoI、SalI
の制限酵素で消化した。βGal融合発現ベクターとして
は、アマシャム社から発売されているpUEX2を用いた。p
UEX2を制限酵素SalIで消化後、アルカリフォスファター
ゼで処理し、末端の燐酸残基を除去した。この消化・脱
燐酸化済み発現ベクターと、βTFDNA1ー83の２つをＴ４
リガーゼで結合させた。この操作によって得られたプラ
スミドをpβTF1-83と命名した。
の制限酵素で消化した。βGal融合発現ベクターとして
は、アマシャム社から発売されているpUEX2を用いた。p
UEX2を制限酵素SalIで消化後、アルカリフォスファター
ゼで処理し、末端の燐酸残基を除去した。この消化・脱
燐酸化済み発現ベクターと、βTFDNA1ー83の２つをＴ４
リガーゼで結合させた。この操作によって得られたプラ
スミドをpβTF1-83と命名した。
【００６０】(3)トランスフォーメーション・発現・ス
クリーニング pβTF1-83をコンピータントな大腸菌株HB-101へトラン
スフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロー
スプレートに蒔き３０℃で一晩培養させ、コロニーを形
成させた。ランダムな４８コロニーをサンプリングし、
１０mlのＬＢ培地で３０℃、一晩振蕩培養した。培養温
度を４２℃に上げて発現プラスミドの誘導培養を２時間
行なった。培養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで
破壊し、１％ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、
１時間インキュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サ
ンプルについてSDSポリアクリルアミド電気泳動を行
い、クマシ−ブリリアントブルーで染色した。４８コロ
ニー中４コロニーが、分子量約130KDの位置にβGalとTF
1-83の融合蛋白質として確認された。
クリーニング pβTF1-83をコンピータントな大腸菌株HB-101へトラン
スフォーメーションし、アンピシリンを含んだアガロー
スプレートに蒔き３０℃で一晩培養させ、コロニーを形
成させた。ランダムな４８コロニーをサンプリングし、
１０mlのＬＢ培地で３０℃、一晩振蕩培養した。培養温
度を４２℃に上げて発現プラスミドの誘導培養を２時間
行なった。培養液から大腸菌体を回収しグラスビーズで
破壊し、１％ＳＤＳを含むＴＢＳバッファーで３７℃、
１時間インキュベーションし蛋白質を抽出した。抽出サ
ンプルについてSDSポリアクリルアミド電気泳動を行
い、クマシ−ブリリアントブルーで染色した。４８コロ
ニー中４コロニーが、分子量約130KDの位置にβGalとTF
1-83の融合蛋白質として確認された。
【００６１】引き続きウェスタン・ブロットを行った。
組織因子に対する抗体はHTF-K108を使用した。分子量13
0KDの位置にバンドが確認された。このようにして得ら
れた組換え蛋白をβrTF1-83と命名した。これは先に、S
DSポリアクリルアミド電気泳動において、確認されたの
と同じ140KDの位置であった。陰性コントロールとして
大腸菌の抽出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤から
精製した組織因子を用いた。結果の一部を第８図に示
す。
組織因子に対する抗体はHTF-K108を使用した。分子量13
0KDの位置にバンドが確認された。このようにして得ら
れた組換え蛋白をβrTF1-83と命名した。これは先に、S
DSポリアクリルアミド電気泳動において、確認されたの
と同じ140KDの位置であった。陰性コントロールとして
大腸菌の抽出液・陽性コントロールとしてヒト胎盤から
精製した組織因子を用いた。結果の一部を第８図に示
す。
【００６２】
【実施例９】βGal融合組織因子誘導体のＦ.VII結合活性測定 (1)アッセイ法の構築 実施例６に従った。
【００６３】(2)組織因子誘導体のＦ.VII結合活性測定 上記で構築されたアッセイ系を使用して、実施例７、８
で得られた、２種類のβGal融合組織因子誘導体のF.VII
に対する結合性を測定した。その結果２種類の組換え組
織因子誘導体ともF.VIIと結合した。第２表にβGal融合
組織因子誘導体の血液凝固第VII因子に対する結合アッ
セイの結果を示す。
で得られた、２種類のβGal融合組織因子誘導体のF.VII
に対する結合性を測定した。その結果２種類の組換え組
織因子誘導体ともF.VIIと結合した。第２表にβGal融合
組織因子誘導体の血液凝固第VII因子に対する結合アッ
セイの結果を示す。
【００６４】
【第２表】 陽性コントロール;胎盤由来組織因子(20ng/ml) 陰性コントロール;大腸菌抽出液
【００６５】
【実施例１０】動物培養細胞を用いた組織因子（１−８３）（rTFS-8
3）の調製 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップはrTF1-219と同じである。
3）の調製 細胞の選択とＲＮＡの抽出・ＲＮＡサンプルからｃＤＮ
Ａの合成までのステップはrTF1-219と同じである。
【００６６】(1)ＰＣＲ法による組織因子 cＤＮＡの増
幅 ヒト組織因子の塩基配列はモリシー等（J.Morrissey et
al,Cell,50:129-135(1987)）、スパイサー等(E.Spicer
et al,ProNAS,84:5148-5152(1987))、スカルパチー等
(E.Scarpati et al,Biochemistry,26:5234-5238(198
7))、フィッシャー等(K.Fisher et al,Thrombsis Resear
ch,48:89-99,(1987))らによって発表されている。これ
らのデーターを基にＰＣＲ用のプライマーをＤＮＡ合成
機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマーは制
限酵素XhoIサイト、NcoIサイト、開始コドン、Met及び
アミノ酸配列−３２〜−２７を含むコドン側の26merか
らなる配列（5'-CTCGAG-CCATGGAG-ACC-CCT-GCC-TGG-
3'）もったＤＮＡフラグメントである。3'末端のプライ
マーは実施例７で使用した物を用いた。
幅 ヒト組織因子の塩基配列はモリシー等（J.Morrissey et
al,Cell,50:129-135(1987)）、スパイサー等(E.Spicer
et al,ProNAS,84:5148-5152(1987))、スカルパチー等
(E.Scarpati et al,Biochemistry,26:5234-5238(198
7))、フィッシャー等(K.Fisher et al,Thrombsis Resear
ch,48:89-99,(1987))らによって発表されている。これ
らのデーターを基にＰＣＲ用のプライマーをＤＮＡ合成
機（アプライド社）で調製した。5'側のプライマーは制
限酵素XhoIサイト、NcoIサイト、開始コドン、Met及び
アミノ酸配列−３２〜−２７を含むコドン側の26merか
らなる配列（5'-CTCGAG-CCATGGAG-ACC-CCT-GCC-TGG-
3'）もったＤＮＡフラグメントである。3'末端のプライ
マーは実施例７で使用した物を用いた。
【００６７】上記の２つのＤＮＡフラグメントを5'側及
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列−３２〜８３、ＤＮＡサイズ３５０bp）
を特異的に増幅した。操作法はキットに付属している業
者の添付文書に従った。ＰＣＲ後、サンプルの一部をア
ガロース電気泳動で分析し分子量を確認したところ約３
５０bpの位置に特異的に増幅されたバンドが観察され
た。これは予想どおりの分子サイズであった。又、コン
トロールとしてｃＤＮＡ無しのサンプルでＰＣＲを行っ
たが、いかなるバンドも検出されなかった（第４図）。
次にサンプル全量をアガロース電気泳動にアプライしバ
ンドを確認後バンドを含むアガロース断片を切り出し
た。アガロース断片を少量のバッファーと共に透析チュ
ーブに入れ電流を流しアガロース断片からＰＣＲ増幅Ｄ
ＮＡフラグメントを抽出した。これをエタノールで沈澱
させ適当量のバッファーに懸濁しTFDNAS-83と命名し
た。
び3'側のプライマーとした。これにシータス社より供給
されているＰＣＲキットを用いて、先に調製したRET-1
cell由来の総てのｃＤＮＡ混合物から組織因子ｃＤＮＡ
（アミノ酸配列−３２〜８３、ＤＮＡサイズ３５０bp）
を特異的に増幅した。操作法はキットに付属している業
者の添付文書に従った。ＰＣＲ後、サンプルの一部をア
ガロース電気泳動で分析し分子量を確認したところ約３
５０bpの位置に特異的に増幅されたバンドが観察され
た。これは予想どおりの分子サイズであった。又、コン
トロールとしてｃＤＮＡ無しのサンプルでＰＣＲを行っ
たが、いかなるバンドも検出されなかった（第４図）。
次にサンプル全量をアガロース電気泳動にアプライしバ
ンドを確認後バンドを含むアガロース断片を切り出し
た。アガロース断片を少量のバッファーと共に透析チュ
ーブに入れ電流を流しアガロース断片からＰＣＲ増幅Ｄ
ＮＡフラグメントを抽出した。これをエタノールで沈澱
させ適当量のバッファーに懸濁しTFDNAS-83と命名し
た。
【００６８】(2)rTFS-83発現用ベクターの調製 動物細胞発現ベクターに組み込むため、TFDNAS-83を制
限酵素XhoI・SalIで消化した。発現ベクターとして、当
所で独自に開発したｐＳＡＣ／ＤＨＦＲ(欧州公開特許E
P-351586A)を用いた。ｐＳＡＣ／ＤＨＦＲを制限酵素Sa
lIで消化した。この消化済み発現ベクターと、TFDNAS-8
3DNAフラグメントの２つをＴ４リガーゼで結合させた。
この操作によって得られたプラスミドをpTFS-83と命名
した（第９図）。
限酵素XhoI・SalIで消化した。発現ベクターとして、当
所で独自に開発したｐＳＡＣ／ＤＨＦＲ(欧州公開特許E
P-351586A)を用いた。ｐＳＡＣ／ＤＨＦＲを制限酵素Sa
lIで消化した。この消化済み発現ベクターと、TFDNAS-8
3DNAフラグメントの２つをＴ４リガーゼで結合させた。
この操作によって得られたプラスミドをpTFS-83と命名
した（第９図）。
【００６９】(3)トランスフォーメーション・発現・ス
クリーニング pRTFS32-83をチャイニーズハムスターオバレー（ＣＨ
Ｏ）細胞に導入した。方法はファルマシア社市販のＤＥ
ＡＥデキストランキットに準じた。トランスフォーマン
ト用核酸欠損培地（ギブコ社製核酸欠損培地；アルファ
ーメム）で２週間培養しトランスフォーマントを作成し
た。ランダムに２０コロニーをサンプリングし各を培養
した。これらの上清を回収し濃縮後、ウエスタンブロッ
トを行った。組織因子に対する抗体はHTF-K108を使用し
た。その結果２０コロニー中１２コロニーが抗体と反応
した。ただしクローンごとにバンドの濃さは異なった。
陰性コントロールとしてＣＨＯ細胞の培養上清・陽性コ
ントロールとしてヒト胎盤から精製した組織因子を用い
た。
クリーニング pRTFS32-83をチャイニーズハムスターオバレー（ＣＨ
Ｏ）細胞に導入した。方法はファルマシア社市販のＤＥ
ＡＥデキストランキットに準じた。トランスフォーマン
ト用核酸欠損培地（ギブコ社製核酸欠損培地；アルファ
ーメム）で２週間培養しトランスフォーマントを作成し
た。ランダムに２０コロニーをサンプリングし各を培養
した。これらの上清を回収し濃縮後、ウエスタンブロッ
トを行った。組織因子に対する抗体はHTF-K108を使用し
た。その結果２０コロニー中１２コロニーが抗体と反応
した。ただしクローンごとにバンドの濃さは異なった。
陰性コントロールとしてＣＨＯ細胞の培養上清・陽性コ
ントロールとしてヒト胎盤から精製した組織因子を用い
た。
【００７０】１２コロニーのうち、特に活性の高いコロ
ニーを選び、それを１０-8Ｍの濃度のメトトレキセート
（ＭＴＸ）を含む培地で培養し、ＭＴＸ耐性のトランス
フォーマントを作成した。ランダムに２０コロニー選
び、上記と同様にウエスタンブロッティングを行った。
その結果特に力価の高い、コロニーを選び、更に１０- 7
Ｍの濃度のメトトレキセートを含む培地で培養した。同
様な操作を繰り返し、１０-6Ｍの濃度のメトトレキセー
トを含む培地で耐性及び、ウエスタンブロッティング活
性の高いクローンを得た。このようにして得られた組換
え蛋白をrTFS-83と命名した。その結果の一部を第６図
に示す。
ニーを選び、それを１０-8Ｍの濃度のメトトレキセート
（ＭＴＸ）を含む培地で培養し、ＭＴＸ耐性のトランス
フォーマントを作成した。ランダムに２０コロニー選
び、上記と同様にウエスタンブロッティングを行った。
その結果特に力価の高い、コロニーを選び、更に１０- 7
Ｍの濃度のメトトレキセートを含む培地で培養した。同
様な操作を繰り返し、１０-6Ｍの濃度のメトトレキセー
トを含む培地で耐性及び、ウエスタンブロッティング活
性の高いクローンを得た。このようにして得られた組換
え蛋白をrTFS-83と命名した。その結果の一部を第６図
に示す。
【００７１】(4)動物細胞で発現した組織因子誘導体の
Ｆ.VII結合活性測定 1)アッセイ法の構築 実施例６に従った。
Ｆ.VII結合活性測定 1)アッセイ法の構築 実施例６に従った。
【００７２】2)組織因子誘導体のＦ.VII結合活性測定 上記で構築されたアッセイ系を使用して、実施例１０で
得られた、動物細胞で発現された分泌型の融合組織因子
誘導体のF.VIIに対する結合性を測定した結果、F.VIIと
結合した。第３表にrTFS-83のF.VIIに対する結合アッセ
イの結果を示す。
得られた、動物細胞で発現された分泌型の融合組織因子
誘導体のF.VIIに対する結合性を測定した結果、F.VIIと
結合した。第３表にrTFS-83のF.VIIに対する結合アッセ
イの結果を示す。
【００７３】
【第３表】 陽性コントロール;胎盤由来組織因子(20ng/ml) 陰性コントロール;細胞培養上清
【第１図】血液凝固因子活性化カスケード反応図を示
す。
す。
【第２図】組織因子の血液凝固第VII因子に対する結合
アッセイ法を示す。
アッセイ法を示す。
【第３図】ヒト胎盤由来精製組織因子のSDSポリアクリ
ルアミド電気泳動の結果を示す。
ルアミド電気泳動の結果を示す。
【第４図】組織因子DNAフラグメントPCRプロダクトのア
ガロース電気泳動による分析結果を示す。
ガロース電気泳動による分析結果を示す。
【第５図】組織因子（１−２１９）発現プラスミドの構
築行程を示す。
築行程を示す。
【第６図】組織因子誘導体のウエスタンブロットアッセ
イの結果を示す。
イの結果を示す。
【第７図】βGal融合組織因子（１−２１９）発現プラ
スミドの構築行程を示す。
スミドの構築行程を示す。
【第８図】βGal組織因子誘導体のウエスタンブロット
アッセイの結果を示す。
アッセイの結果を示す。
【第９図】動物培養細胞を用いた組織因子誘導体発現プ
ラスミドの構築行程を示す。
ラスミドの構築行程を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＡ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 宮本 誠二 熊本県菊池郡西合志町須屋2066−８ (72)発明者 船津 昭信 熊本県熊本市清水町麻生田1775−７
Claims (11)
- 【請求項１】 ヒト組織因子の親水性ペプチド領域の一
部からなり、少なくとも本来のヒト組織因子のアミノ末
端側のジスルフィド結合を構成しうるペプチド領域を含
み、血液凝固第VII因子との結合活性を有する組織因子
誘導体。 - 【請求項２】 ヒト組織因子のアミノ末端アミノ酸から
数えて１１番目のアミノ酸から６７番目のアミノ酸まで
のペプチド領域を含む前記第１項記載の組織因子誘導
体。 - 【請求項３】 ヒト組織因子のアミノ末端アミノ酸から
数えて１番目のアミノ酸から８３番目のアミノ酸までの
ペプチド領域を含む前記第１項記載の組織因子誘導体。 - 【請求項４】 分子量が約１０キロダルトンのポリペプ
チドである前記第１項記載の組織因子誘導体。 - 【請求項５】 ヒト組織因子の親水性ペプチド領域の一
部からなる、少なくとも本来の組織因子のアミノ末端側
のジスルフィド結合を構成しうるアミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み、該ベクターで
宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養すること
からなる組織因子誘導体の製造方法。 - 【請求項６】 該ｃＤＮＡが、ヒト組織因子のアミノ末
端アミノ酸から数えて１１番目のアミノ酸から６７番目
のアミノ酸までのペプチド領域をコードする遺伝子断片
を含む前記第５項記載の製造方法。 - 【請求項７】 該ｃＤＮＡが、ヒト組織因子のアミノ末
端アミノ酸から数えて１番目のアミノ酸から８３番目の
アミノ酸までのペプチド領域をコードする遺伝子断片を
含む前記第５項記載の製造方法。 - 【請求項８】 該ｃＤＮＡが、分子量が約１０キロダル
トンのポリペプチドをコードする遺伝子断片である前記
第５項記載の製造方法。 - 【請求項９】 宿主細胞が大腸菌である前記第５項記載
の製造方法。 - 【請求項１０】 発現ベクターがβガラクトシダーゼと
の融合蛋白を発現するベクターで、組織因子誘導体がβ
ガラクトシダーゼ融合蛋白として得られる前記第９項記
載の製造方法。 - 【請求項１１】 宿主細胞が動物細胞である前記第５項
記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3033513A JPH05219957A (ja) | 1991-02-02 | 1991-02-02 | 組織因子誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3033513A JPH05219957A (ja) | 1991-02-02 | 1991-02-02 | 組織因子誘導体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219957A true JPH05219957A (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=12388630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3033513A Pending JPH05219957A (ja) | 1991-02-02 | 1991-02-02 | 組織因子誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05219957A (ja) |
-
1991
- 1991-02-02 JP JP3033513A patent/JPH05219957A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20010123 |