JPS63185387A - ヒトｂ組胞分化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトＢ細胞分化活性因子およびその製造法に
関する。

（従来技術） Ｂ細胞分化因子（Ｂ　　ｃｅｌｌ　　ｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｔｉｏｎ　　Ｆａｃｔｏｒ：　　ＢＣＤＦ：　特
にマウスではＴ　　ｃｅｌｌ　　Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ　
　Ｆａｃｔｏｒ（ＴＲＦ）ともよばれ、また最近はＩＬ
−５とも呼ばれている）は、Ｔ細胞系列から産生され、
Ｂ細胞に直接作用し、これを抗体産生細胞に分化・誘導
するポリペプチドからなる因子である。

抗体は、生体に侵入する細菌、ウィルスあるいは癌細胞
などの生体異物と反応し、これらを不活性化したり排除
したりする機能をもっている。Ｂ細胞分化因子は、特定
抗原（生体異物）に特異的なり細胞クローン即ち特定抗
原に感作されたＢ細胞クローンを抗体産生細胞に誘導し
て、該抗原に対する抗体を産生させることから、ＢＣＤ
Ｆは、種々の感染症および癌の治療の面から有用な物質
である。即ち、ＢＣＤＦは、この因子の生体内での過少
によってひきおこされると考えられる自己免疫疾患や免
疫不全症等の診断、治療のみならず種々の感染症や癌の
治療に利用できることが期待される。

ＢＣＤＦの活性には、種特異性があるといわれている。

従って本因子をヒトにおける上記のような疾患、感染症
、癌などの診断あるいは治療に用いるためには、ヒト由
来のＢＣＤＦを使用することが望まれる。

これまで、ＢＣＤＦあるいはＴＲＦに関していくつかの
研究がなされている。まず、マウスのＢＣＤＦ　（もし
くはＴＲＦ）については、Ｒ，Ｗ。

Ｄｕｔｔｏｎら（Ｐｒｏｇ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．。

土、３５５　（１９７１））およびＡ、　　Ｓｃｈｉｍ
ｐｌおよびＥ、　　ＷｅｃＫｅｒ　（Ｎａｔｕｒｅ。

２３７．１５　（１９７２））によって報告された。

その後、ヒトにおいてもマウスのＢＣＤＦ　（もしくは
ＴＲＦ）に相当する物質の存在がＧｅｈａ。

ＲｏＳ、ら（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１３Ｂ、１２３０
（１９７３））、　　Ｆａｕｃｉ、Ａ、Ｓ。

ら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．　、１１ユ、２１（１６）
（１９７６）　）およびＨ３ｒａｎｏ、Ｔ、ら（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏ　１．．１上９．１２３５　（１９７７）
）によって報告されているが、以下に述べるように構造
についても不明な点が多く、また、関与する遺伝子も不
明のため、混沌とした状態である（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ
、Ｔ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、３，１３３　（１９８５））。

従来、ヒトＢＣＤＦを得るには、ヒト末梢血より分離し
た正常ヒトＴ−細胞をマイトゲン刺激して培養すること
により、その培養上清から得る方法がとられている（Ｈ
ｉｒａｎｏ、Ｔ、　　ら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２６，５１７　（１９８１）およ
びＲａ１ｐｈ、Ｐ、ら、Ｊ、Ｉ　ｍｍｕｎ　Ｏｌ。

１３２．１８５８　（１９８４））、上記のＲａ１Ｐｈ
、Ｐ、　　らは、マイトゲン刺激した正常ヒトＴ細胞の
３ｘの培養上清から、硫安沈澱、ＤＥＡＥセルロースカ
ラムクロマトグラフィー（ＤＥ−５２）、ウルトロゲル
力ラムクロマトグラフィー（ＡｃＡ４４）、ブルーアガ
ロースおよびレッドアガロースによるアフィニティーク
ロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーな
どにより約１１．（１６）０倍まで精製し、ゲル濾過法
による分子量が約２０，（１６）０であることを測定し
たが、純粋なりＣＤＦを得るまでには至っておらず・ま
た得られた量も極微量（３１の培養上清から４゜２μｇ
）であった。また、０ｋａｄａ、Ｍ、ら（Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、１５７．５８３　（１９８３））は、正常ヒ
トＴ細胞とヒトＴ細胞株ＣＥＭ−ＡＧ”とを融合して得
たヒトＴ細胞融合株の培養液からヒトＢＣＤＦを得る方
法を報告しているが、一般にヒト融合細胞株は、継代培
養中に物質の産生能が低下する傾向があり、実用面での
物質生産には不向きと考えられる。

ヒトＢＣＤＦには、ＢＣＤＦＩとＢＣＤＦＩｒの二種類
があり、各々の性質は下記の様に報告されている（Ｔｅ
ｒａｎｉｓｈｉ、Ｔ、　　らＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１
２８．１９０３　（１９８２）およびＨｉｒａｎｏ、Ｔ
、　　ら、Ｊ、ＩＨｌｍｕｎｏｌ。

１３２．２２９　（１９８４））。即ち、ＢＣＤＦＩ： 分子量：２０，（１６）０（ゲル濾過 法）ＰＩ：　　６．５〜８．０ 作用；　スタフィロコッカス　アウレウスコワンＩ　（
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ ｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ　　ＣｏｗａｎＩ　（ＳＡＣ）
）刺激Ｂｍ胞（ブラス ト化Ｂ細胞）を免疫グロブリン〔Ｉ ｇ〕産生細胞に分化・誘導する。

ＢＣＤＦｎ： 分子量：２２．０Ｏ（１，３６，（１６）０（ゲル濾過
法） ｐｒ：　　５〜６ 作用　　１）ＥＢウィルスでトランスフオームさせたＢ
リンパ芽球様細胞（Ｂ− ＬＣＬ）にＩｇＧ産生を誘導する。

２）ＢＣＤＦＩ存在下にＳＡＣで刺 激されたＢ細胞の１ｇ産生細胞への 分化を増強する（ＢＣＤＦＩＩ単独で はこの作用はない）。

最近、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）によりト
ランスフオームされたしトＴ細胞の１株ＶＴ−１を用い
たヒトＢＣＤＦの生産方法が報告されている（岸本忠三
、平野俊夫、特開昭６１−１１５０２４および特開昭６
１−１１５０２５号）。これらの出願の発明者らは、Ｖ
Ｔ−１細胞の無血清培養上清１０ｆより、限外濾過、Ａ
ｃＡ−３４ゲル濾過カラムクロ、マドグラフィー、クロ
”マドフォカシング、逆相クロマトグラフィーを用いて
、１０４２倍まで精製しく収率１．８％）、ヒトＢＣＤ
Ｆの分子量は３．５±Ｄ、５Ｘ１０’ダルトン（ゲル濾
過法）または２．２±０．２×１０４ダルトン（ＳＤＳ
ポリアクリルアミド電気泳動法）、等電点は４．９〜５
．１、またＮ末端部分のアミノ酸配列は、Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−３ｅｒ
−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−であると
報告している。この精製ＢＣＤＦは、その活性をＥＢウ
ィルスでトランスフオームさせた細胞であるＣＦ。

ＳＳのＩｇＧ生産量を指標にして精製している点および
分子量やＰＩ値などからＢＣＤＦＩＩと考えられる。一
方、前記のＲａ１ｐｈ、Ｐ、らが報告したヒトＢＣＤＦ
の分子量はゲル濾過法で２０゜（１６）０ダルトンであ
る。これはＢＣＤＰＩと考えられるが、その構造やその
他の物理化学的性質は明らかにされていない。また、上
記のＶＴ−１細胞を用いたＢＣＤＦの生産方法は、既述
のヒト末梢血からの細胞やヒトＴ融合細胞を用いた方法
に比べ改善はされているが、多量の培養上清から得られ
るＢＣＤＦ量は極微量であり、またＨＴＬＶ感染細胞を
出発原料としている点からも医薬を目的とする工業的生
産には向いていない。

このように、ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）に関して
は、その構造が明らかにされていないばかりか、物理化
学的性質ならびに機能について不明な点が多い。また、
それを大量に生産し実用に供することは従来の技術では
不可能であった。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、遺伝子組み換え技術を駆使し、これらの問題
を解決しようとするものである。

即ち、本発明はヒトＢＣＤＦ高生産細胞からＢＣＤＦ　
　ｍＲＮＡを単離し、ＢＣＤＦ生産を支配するＢＣＤＦ
遺伝子（即ちＤＮＡ配列）、あるいはまた染色体由来の
ＢＣＤＦ遺伝子を明らかにすると共に、ＢＣＤＦ分子の
構造（アミノ酸配列）を明らかにすることにより、組み
換えＤＮＡ技術でＢＣＤＦの大量生産および医薬などへ
の応用の可能性を提供しようとするものである。

尚、本発明におけるヒトＢ細胞分化因子はＢＣＤＦＩに
相当するものであるが、本発明と同様な手法により他の
ＢＣＤＦの構造も明らかにすることも出来よう。

（問題点を解決するための手段） ヒ１−ＢＣＤＦ遺伝子の調製と塩　配りの′本発明のヒ
トＢＣＤＦｃＤＮＡは、既に本発明者らによって調製さ
れたマウスのＢ細胞分化因子の遺伝子（ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
　）がクローニングされたプラスミドｐｓＰ６に−ｍＴ
ＲＦ２３　（特願昭６１−１５７２２７号明細書）のＢ
　ａ　ｍＨＩ　−Ａ　ｃ　ｃ　１断片（マウスのＢ細胞
分化因子の遺伝子の全コーディング領域を含んでいる）
をプローブとして以下に述べるようにして得ることがで
きる。尚、プラスミドｐＳＰ６に−ｍＴＲＦ２３が導入
されている大腸菌（ＨＢ　１（１７）／ｐｓＰ６に−ｍ
ＴＲＦ２３）は、ＳＢＭ２８５と命名され、微工研にＦ
ＥＲＭ　　Ｐ−８８２８の受託番号を得て寄託されてい
る。

先ず、ヒト染色体ＤＮＡに、マウスのＢ細胞分化因子遺
伝子とハイブリダイズする配列が存在するかどうかを確
かめるため、例えば正常ヒト胎盤細胞より抽出したＤＮ
ＡをＰｖｕＩＩあるいはＰｓｔｌで消化し、上記のプラ
スミドｐｓＰ６に−ｍＴＲＦ２３のＢ　ａｍＨｌ−Ａｃ
　ｃ　Ｉ断片を−”−７クトランスレイシヨン法により
２２ｐでラベル後、これをプローブとしてサザーンブロ
ットハイプリダイゼイション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　　ｂ
ｌｏｔ　　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行う。ヒト
胎盤からのＤＮＡをＰｖｕＩ［で消化した場合は３　、
　ＯｋｂのＤＮＡ断片が、またＰｓｔｌで消化した場合
は４　、１　ｋｂのＤＮＡ断片が上記プローブとハイブ
リダイズすることが認められ、ヒト染色体にマウスのＢ
細胞分化因子遺伝子と類似の配列をもつＤＮＡが存在す
ることが確認される。この結果は、上記のプローブを用
いてヒトのＢＣＤＦｃＤＮＡをクローニングできること
を示すものである。

次に上記知見をもとにヒトＢＣＤＦのｃ　ＤＮＡライブ
ラリーを調製する。先ず、Ｍａｅｄａ、Ｍ。

ら（Ｊ、Ｅｘｐ９Ｍｅｄ、、１６２．２１６９（１９８
５））によって確立されているしトＴ細胞株ＡＴＬ−２
の培養細胞から常法（Ｎｉｋａｉｄｏ、Ｔ、ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、３１１，６３１（１９８４））に従い、ポリ（
Ａ）”ＲＮＡを調製し、ｐＣＤベクターを用いるＯｋａ
ｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，及びＢｅ
ｒｇ。

Ｐ、、Ｍｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、、３，２８０　（
１９８３）’Ｊに準じ、ｃＤＮＡライブラリーを調製す
る。次にこのｃＤＮＡライブラリーをいくつかの群に分
け、それらからプラスミドＤＮＡを分離し、５ａｉｌま
たはＢａｍＨＩで消化したのち、上記のプローブ・（”
ＰでラベルされたＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ　　ＤＮＡ断片
）とサザーンプロットハイブリダイゼイション（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ。

ＥｌＭ、　、　　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、　９８
．５０３　（１９７５））を行い、マウスのＢ細胞分化
因子の遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ断片をもつ群
を選択する。続いて、ポジティブとなった群の各クロー
ンについて、上記のプローブを用いて同様にサザーンブ
ロットハイブリダイゼイションを行うことにより、上記
プローブとハイブリダイズするクローンを選択する。こ
のポジティブなりローンには、ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡ
遺伝子をもつプラスミドが含まれていると考えられる。

このようにして得られるポジティブなりローンの一つ（
ｐｈ・ＩＬ−５−３０）がもつプラスミドはｐＣＤＶＴ
ＲＦと命名され、またそのプラスミドを大腸菌Ｈ８１（
１７）株へ導入した形質転換体（ＨＢｌ　（１７）／ｐ
　ＣＤＶＴＲＦ）　はＳＢＭ２８６と命名され、微工研
にＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１７１の受託番号を得て寄託さ
れている。

次にポジティブなりローンのプラスミドについて、制限
酵素解析および上記プローブとのハイブリダイゼーショ
ンにより、確かにマウスＢ細胞分化因子遺伝子と類似し
たヒトＢＣＤＦ’ｃＤＮＡがクローン化されていること
を確認し、以下に記すようにそのＤＮＡの塩基配列を決
定するとともに、そのＤＮＡがヒトＢＣＤＦ活性を有す
る蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子であるかを
調べる。

先ず、常法に従いそのクローンのプラスミド（例えば、
ｐｈ・ＩＬ−５−３０）の制限酵素切断マツプを調べた
後、ｐｈ−ＩＩ、−５に挿入されているｃＤＮＡ（ヒト
ＢＣＤＦ　　ｃＤＮＡ３Ｊ伝子を含む）を一旦ｐＵ（１
７）８等の適当なプラスミドのＢａｍＨＩサイトにクロ
ーニングしなおし、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、
　　ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４，５、’１
６３　（１９７７））に従って、上記ｃＤＮＡの塩基配
列をきめる。本発明者らの実験によれば、上記方法によ
って、ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡを含む第１図のｃＤＮＡ
塩基配列が得られた。

ヒト８１！Ｉ胞分化因子をコードする領域の決上記で得
られたｃＤＮＡ塩基配列にヒトＢ細胞分化因子をコード
する領域が含まれることは、次のようにして決定した。

即ち、この塩基配列のオープンリーディングフレームを
探すとともに、既に本発明者らによって決定されている
マウスＢ細胞分化因子遺伝子の塩基配列と比較すること
により、ヒトＢ細胞分化因子ｉｏ 域とアミノ酸配列を決定する（第２図）。そして。

そのコーディング領域のアミノ酸配列およびヒトＢＣＤ
Ｆが細胞外に分泌される蛋白質であることから、ヒトＢ
ＣＤＦの前駆体ポリペプチドは、Ｎ末端側に１９個のア
ミノ酸からなるシグナルペプチド（リーダー配列）を含
む１３４個のアミノ酸からなるポリペプチドであること
が分かった（第３図参照）。即ち、第３図のアミノ酸配
列のうち２０〜１３４番目が成熟ヒトＢＣＤＦポリペプ
チドである。前駆体のアミノ酸配列中には、２カ所Ｎ−
グリコジル化可能部位（４７番および９０番のＡ　ｓ　
ｎ　）および後述するとおり少なくとも１ケ所の０−グ
リコジル化可能部位（２２番のＴｈｒ）があり、ここに
糖鎖が付加されることを考えると、上記の成熟ヒトＢＣ
ＤＦポリペプチドの計算分子１ｔ（１３，１４９）は、
既に報告されているヒトＢＣＤＦＩ（ｍ鎖が付加されて
いる）の分子量（約２０．（１６）０）と矛盾は無い。

尚、第３図に示すポリペプチドのＮ末端のＭｅｔ（メチ
オニン）は、翻訳後の修理過程（ｐｏｓｔ　　ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎａｌ　　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ。

ｎ　　ｐｒＯｃｅｓｓ）で、フォルミル化やアセチル化
されることがあり、またＭｅｔが取り除かれたりするこ
ともある。また、上記の成熟ヒトＢＣＤＦポリペプチド
のＮ末端のアミノ酸も同様な過程でアセチル化されるこ
とがある。

一方、前記のプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３０に挿入さ
れているｃＤＮＡ、即ち上記の如く同定したＤＮＡがヒ
トＢＣＤＦ活性を有する蛋白質（ポリペプチド）を生産
する遺伝子であることは当該遺伝子を組み込んだ発現ベ
クターによって形質転換された宿主細胞が産生ずる蛋白
質の活性を測定することによって知ることができるが、
また以下のようにしても調べられる。

即ち、先ずプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３０に挿入され
ているヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮＡ全部を含むＢａｍＨＩ
　　ＤＮＡ断片をｐｓＰ６４ベクターに再クローンする
。ｐｓＰ６４は、挿入された外来遺伝子がＳＰ６プロモ
ーター支配下にのみ発現されうるように改良されたベク
ターであり、１ｎｖｉｔｒｏＴ：５Ｐ６ＲＮＡポリメラ
ーゼ存在下に挿入された外来遺伝子のｍ　ＲＮ　Ａを合
成することができる（Ｋｒｉｅｇ、Ｐ、Ａ、およびＭｅ
ｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、、Ｎｕｃ　１．Ａｃ　ｉｄ、Ｒｅｓ
。

、上２゜７０５７　（１９８４）、およびＫｏｎａｒ　
ｓ　ｋａ、Ｍ、Ｍ、　　ら、Ｃｅｌ　１，３８，７３１
（１９８４））。次にこのようにして、上記のＣＤＮＡ
からｉｎ　　ｖｉｔｒｏでＳ用型されるｍＲＮＡ溶液を
、アフリカッメガエル（ＸｅｎｏｐｕＳ）の卵母細胞（
ｏｏｃｙｔｅ）に注射して培養し、培養上清に分泌され
てくるｍＲＮＡからの翻訳産物（蛋白質）のＢＣＤＦ活
性を測定する。ヒトＢＣＤＦ　（特にヒトＢＣＤＰＩ）
活性は、既に記載したように、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓａｕｒｅｕｓ　　Ｃｏｗａｎ　　Ｉ　（ＳＡＣ）
で刺激したヒトＢ細胞の１ｇＭ産生誘導能をコントロー
ルと比較して調べることにより測定される。このように
して上記のｃＤＮＡが、ヒトＢＣＤＦ活性を有する蛋白
質（ポリペプチド）を生産する遺伝子であることが確か
められるとともに、本発明のＤＮＡによる特許請求の範
囲に示すようなヒトＢＣＤＦポリペプチドの大量生産の
可能性を示す。

ヒトＢＣＤＦの発現 本発明によれば、上記のようにして調製された、遺伝子
配列を使用することにより、ヒトＢＣＤＦを製造するこ
とが可能である。

例えば、ヒトＢＣＤＦをコードする遺伝子としてｃＤＮ
Ａを使用する場合には、ｃＤＮＡの５゛側上流に適当な
他のプロモーター（例えばＳＶ４０由来のプロモーター
）を挿入した発現ベクターを造成し、適当な細胞（例え
ば、酵母細胞、大腸菌細胞、或いはＣＯ３−１細胞やＣ
１−Ｔｏ細胞等の動物細胞）でヒトＢ細胞を分化させる
蛋白質をつくることもできる。この場合、前駆体蛋白質
をコードするＤ　Ｎ　Ａ　？ｉＪｆ域を用いることが好
ましいが、成熟形歪白質（ポリペプチド）をコードする
ｃＤＮＡ領域を用いてもよい。また、当該蛋白質をコー
ドするＤＮＡの直近の５”上流に、適当な制限酵素（例
えばＨｉｎｄＩＩＩ）切断部位を適当な方法、例えば部
位特異的ミュータジェネシス（ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ　　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を用いて設けてお
くと外来プロモーターの導入が容易である。

本発明によれば、ｃＤＮＡを用いる代わりに、ヒト染色
体からイントロンを含むヒトＢＣＤＦ遺伝子を調製し、
これを用いて、上記と同様にしてヒトＢ細胞を分化する
蛋白質を製造することもできる。

即ち、ヒトＢＣＤＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を上記ｃＤ
ＮＡをプローブとして、適当なヒト遺伝子ライブラリー
（例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）のヒト遺
伝子ライブラリー）から分離し、次にｃＤＮＡの場合と
同様、ヒトＢＣＤＦをコードするＤＮＡ領域の５”上流
に適当なプロモーターを挿入した発現ベクターを造成し
、この発現ベクターによって形質転換あるいはトランス
フェクションされた細胞を培養することにより、ヒトＢ
ＣＤＦを効率よく製造することができる。

この場合の宿主細胞は、好ましくはスプライス能力のあ
る細胞が使用される。特に動物細胞が好ま可８） しい。

なお、ヒト染色体由来のＢＣＤＦ遺伝子が組み込まれた
発現ベクター（ｐ　ｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｇｅｎｅ
）が導入されている大腸菌（ＨＢＩＯＩ／ｐｄＫＣＲ−
ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ）は、３８Ｍ２９３と命名され、微
工研に国際寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１４７７を得て寄託
されている。

えヒトＢＣＤＦの精製 上記のようにして造成された動物細胞が産生ずる組換え
ヒトＢＣＤＦは、適当な方法、例えばモノクローナル抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーやゲル濾
過、逆相高速液体クロマトグラフィーなどによって精製
することができる。

本発明らは、このようにして精製・純化された組換えヒ
トＢＣＤＦを、アミノ酸配列分析や電気泳動分析にかけ
、このアミノ酸配列分析の結果およびヒトＢＣＤＦをコ
ードする遺伝子の塩基配列からの推定（例えば第２図参
照）に基づいて、成熟型ヒトＢＣＤＦのポリペプチド部
分の構造は、前記のとおり第３図の第２０番の■βｅか
ら第１３４番のＳｅｔまでの配列を有することを明らか
にすると共に、その２次元的配列の推定も行った（第１
２図）。

以下、実施例をもって本発明を説明する。

実施例 （１）　　ヒトＢＣＤＦ遺伝子の確認 光に、本発明者らは、マウスＢＣＤＦ　（ＴＲＦ）の産
生を司る遺伝子、即ちＤＮＡ配列を同定した（特＠昭６
１−１５７２２７号明細書）。そしてこの遺伝子によっ
て産生されるマウスＴＲＦは、ＴＲＦ活性〔１）マウス
慢性Ｂ白血病細胞（ＢＣＬ＋　）をＩｇＭ抗体産生細胞
に分化させる活性、２）抗原（ＤＮＰ−ＫＬＨ）感作さ
せたマウス肺臓内Ｂ細胞を抗原（ＤＮＰ−オバルブミン
）で刺激し、特異的抗体（抗ＤＮＰ−１ｇＧ）産生細胞
に分化させる活性、３）ｉｎ　　ｖｉｖ。

で活性化したＢ細胞ブラストのＩｇＭ合成誘導活性〕お
よびＢＣＧＦｎ活性（１）ＢＣＬ　Ｉ細胞の分裂促進、
２）デキストラン硫酸刺激休止Ｂ細胞の分裂促進〕をも
っていることを明らかにした。

マウスＴＲＦ　　ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＳＰ６に−ｍＴＲＦ２３をＢａｍＨｌおよび
Ａ　ｃ　ｃ　Ｉで消化して、６５４ｂｐよりなるＢａｍ
Ｈｌ−Ａｃ　ｃ　Ｉフラグメントを分離した。マウスＢ
ＣＤＦ　（ＴＲＦ）の全コーディング領域を含んでいる
、このフラグメントをニックトランスレイジョンによっ
てｚｐでラベルしたものをプローブにしてヒト染色体Ｄ
ＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションを常法（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ＥｏＭ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
、９一旦−，５０３（１９７５））に従って行った。ヒ
ト染色体ＤＮＡは正常ヒト胎盤よりＹａｏｉｔａ。

Ｙ、およびＨｏｎｊｏ、Ｔ、（Ｂｉｏｍｅｄ、ＲｅＳ、
、上、１６４　（１９８０））に準じて抽出したのち、
各々２μｇをＰｖｕＩ［またはＰｓｔＩで消化してサザ
ンプロットハイブリダイゼーションのために０．６％ア
ガロースゲルで電気泳動した。泳動後、ゲル中のＤＮＡ
はニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
　　＆　　５ｃｈｕｅｌ　（Ｄａｓｓｅｌ））に移し上
記のプローブとハイブリダイズさせた。洗浄条件を０．
１％ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ（ＳＳＣ：０．１５Ｍ　　
Ｎａｃｌ−０−（１７）５Ｍ　　クエン酸ナトリウム）
、５０℃、４５分で行うと、ＰｖｕＩＩで消化した場合
には３　、０　ｋｂのＤＮＡフラグメントが、そしてＰ
ｓｔｌで消化した場合には４．１ｋｂのＤＮＡフラグメ
ントがマウスＢＣＤＦプローブとハイブリダイズするこ
とが判明した。このプローブは、マウス染色体ＤＮＡの
フラグメントには、よりストリンジェント（ｓｔｒｉｎ
ｇｅｎｔ）な条件でもハイブリダイズすることより、ヒ
ト染色体ＤＮＡ中にマウスＢＣＤＦ　（ＴＲＦ）ｃＤＮ
Ａと全く同一ではないが相同性の高い配列があることが
判明し、このプローブを用いてヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡ
クローンのスクリーニングが可能であると判断した。

＋２）　　ヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮＡクローンの分離ヒ
トＢＣＤＦのｃＤＮＡライブラリーは下記の如く作成し
た。Ｍ、　Ｍａ　ｅ　ｄ　ａら（Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１６２．２１６９　（１９８５））が成人性
Ｔ細胞白血病患者の血液より樹立したヒトＴ細胞株ＡＴ
Ｌ−２をＲＰＭＩ　　１６４０＋１０％牛脂児血清の培
地中、３７°Ｃ１５％ＣＯ□中で培養して細胞を集めた
。この細胞より常法（Ｎｉｋａｉｄｏ、Ｔ、　　ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３１１．６３１　（１９８４））に従い、
ポリ（Ａ）”ＲＮＡを調製した。このポリ（Ａ）’ＲＮ
Ａ　　３μｇを用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した
が、方法はＰＣＤベクターを用いるＯｋａｙａｍａ−Ｂ
ｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，およびＢｅｒｇ、Ｐ。

、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、３，２８０（１９８
３））に準じ、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ株）の
形質転換体として２Ｘ１０ｓ個の独立のｃＤＮＡクロー
ンを得た。

この２Ｘ１０５個のｃＤＮＡクローン中にヒトＢＣＤＦ
遺伝子に相当するｃＤＮＡが存在するがどうかを調べる
ため、全形質転換体の混合物からプラスミドＤＮＡを調
製し、各々２μｇのＤＮＡを５ａｉｌまたはＢａｍＨｒ
で消化し、上記の方法によりサザンプロットハイブリダ
イゼーションを行った。その結果、ＰＣＤベクターに１
カツトを入れる５ａｌＩ消化では４　、１　ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントがハイブリダイズし、これに対してイン
サートされたｃＤＮＡのほぼ両端の位置で切断するＢａ
ｍＨＩ消化では１　、　ＯｋｂのＤＮＡフラグメントが
ハイブリダイズすることが判った。

これらの結果からｃＤＮＡライブラリー中にヒトＢＣＤ
Ｆ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を持つクローンが含まれ
ていることが示唆された。そこで前記マウスのプローブ
を用いて上記の２Ｘ１０’個のｃＤＮＡクローンを常法
のコロニーハイブリダイゼイション（Ｈａｎａｈａｎ、
Ｄ、およびＭｅｓｅｒｌｓｏｎ　　Ｍ、、Ｇｅｎｅ、１
０．６３（１９８０））に準じてスクリーニングした。

スクリーニングの結果２９クローンがマウスＢＣＤＦ　
（ＴＲＦ）ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、この
２９クローンのプラスミドＤＮＡのエンドヌクレアーゼ
切断マツプおよびエンドヌクレアー一ゼで消化したＤＮ
Ａフラグメントの上記プローブを用いたサザンハイプリ
ダイゼーションの結果、この２９クローンは全て同一と
判断された。

上記２９クローンのうちの一つｐ　ｈ−Ｉ　Ｌ−５−３
０を更に詳細に調べた。制限エンドヌクレアーゼ切断マ
ツプを常法に従い調べた後、ｐｈ−ＩＬ−５−３０に挿
入されたｃＤＮＡを−ＨｐＵＣ１８プラスミドのＢａｍ
ＨＪサイトにサブクローニックし、ｃＤＮＡのＤＮＡ配
列を常法に従いジデオキシ法（Ｓ　ａ　ｎ　ｇ　ｅ　ｒ
、　　Ｆ、　　ら、　　　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．５４６３
　（１９７７））によって決定した。その結果、挿入さ
れたｃＤＮＡはポリＡテールを除く８１６の塩基対より
なることが判った。

この結果とマウスのＢＣＤＦ　（ＴＲＦ）のＤＮＡ配列
を比較することによってヒ１−ＢＣＤＦのコ−ディング
領域を決定し、ヒトＢＣＤＦの前駆体が１３４個のアミ
ノ酸からなると決定された。ヒトＢＣＤＦはＴ細胞外に
分泌されるためにこの１３４個のアミノ酸配列中、Ｎ末
端配列にシグナル配列を含むことが予想され、成熟した
ヒトＢＣＤＦは上記１３４個のアミノ酸配列中２０番目
のアミノ酸から１３４３４番目のアミノ酸よりなるポリ
ペプチドを含む分子であると考えられる。このアミノ酸
配列中には、２カ所のＮ−グリコジル化可能部位（第３
図中、４７番および９０番のＡｓｎ）および少なくとも
１ケ所のＯ−グリコジル化可能部位（第３図中、２２番
目のＴｈｒ）があり、この付加の可能性のある糖の分子
量とポリペプチドの分子Ｎ（２０番〜１３４番のポリペ
プチドで１３．１４９）を加算すると、ＢＣＤＦＩの分
子量として報告されている２０，（１６）０に矛盾しな
い。

マウスＢＣＤＦ　（ＴＲＦ）と比較すると、前駆体では
ヒトＢＣＤＦのアミノ酸数は一つ多い。ヒトＢＣＤＦの
二個所のＮ−グリコジル化の可能すイトはマウスＢＣＤ
Ｆの１番目と３番目のＮ−グリコジル化可能サイトと一
致する。マウスＢＣＤＦ　（ＴＲＦ）中の三つのシステ
ィン残基のうち、Ｃ末端側の二つのシスティン残基はヒ
トＢＣＤＦにおいても保存されている。マウスおよびヒ
トのＢＣＤＦのコーディング領域のヌクレオチドおよび
アミノ酸配列は各々７８％および７０％の相同性を持つ
。ｐ　ｈ　−Ｉ　Ｌ−５−３０のＰｓｔＩフラグメント
（５１５ｂｐ）をニックトランスレイジョンによって２
Ｐでラベルしたものをプローブに用いて前記のヒト染色
体ＤＮＡのＰｖｕｌｒまたはＰｓｔｌで消化したＤＮＡ
フラグメントについて前記のとおりサザンプロットハイ
ブリダイゼーションを行った結果、マウスＢＣＤＦプロ
ーブを用いた時と同様、それぞれ４　、１　ｋｂおよび
３　、０　ｋｂのフラグメントとハイブリダイズした。

ヒトのプローブを用いた場合、洗浄条件を０．ｌＸ５Ｓ
Ｃ−〇、１％ＳＤＳ、６５°ｃ、４５分というストリン
ジェントな条件にしても充分なハイブリダイズがなされ
た。また、このヒトのプローブを用いてＡＴＬ−２ポリ
（Ａ）”　ＲＮＡを常法に従い（Ｔｈｏｍａｓ、Ｄ、Ｄ
、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、
７７．５２（１７）　（１９８０））、ノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションを行った結果１　、　Ｏｋｂ
のただ１本のバンドを認めた。このことは、本発明者ら
が同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がヒト染色体ＤＮＡ配列
中、マウスＢＣＤＦ　（ＴＲＦ）遺伝子に特異的な相同
遺伝子であること、またこのヒトＢＣＤＦ遺伝子からは
ただ一種類のｍＲＮＡのみしか翻訳されていないことを
示している。

（４）　　ヒトＢＣＤＦ：　の測 上記のようにして同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がその生
産を支配しているポリペプチドあるいはそのポリペプチ
ドよりなる物質にヒトＢＣＤＦＩ活性があることを以下
の方法で確認した。プラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３０の
ヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮＡインサート全部と小部分のベ
クターＤＮＡを含むＢａｍＨＩ　　ＤＮＡフラグメント
をｐｓＰ６４ベクターに再クローンした。このプラスミ
ドを５ａｌｌで消化した後、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ
を用いてｉｎ　　ｖｉｔｒｏでｍ　ＲＮ　Ａを合成させ
た（Ｋｒ　ｉ　ｅｇ、　Ｐ、　Ａ、および　Ｍｅｌｔ。

ｎ、１１　Ａ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅ
ｓ、、上２，７０５７　（１９８４）；およびＫＯｎａ
ｒｓｋａ、Ｍ、Ｍ、ら、Ｃｅｌ　Ｉ、３８，７３１　（
１９８４））。このようにして調製したｍＲＮ　Ａ　Ｗ
ｊ液をアフリカッメガエル（ＸｅｎｏｐｕＳ）の卵母細
胞（ｏ　ｏ　ｃ　ｙ　ｔ　ｅ）に注射し、２０°Ｃ４８
時間培養後、培養液中に分泌された生成物を集めて遠心
分離して、その上清を濃縮装置（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　
　１０；　　Ａｍｌｃｏｎ社製）で４倍に濃縮したもの
をヒト・リコンビナントＢＣＤＦとして、以下の実験に
用いた。このヒト・リコンビナントＢＣＤＦがＢＣＤＦ
　Ｉ活性を持つか否かをＳＡＣで刺激したヒトＢ細胞の
１８Ｍ産生誘導能で調べた。

ヒトＢ、細胞に冨むフラクションを正常ヒト血液から５
ａｉｋｉ、Ｏ，および　Ｒａ１ｐｈ、Ｐ、。

（３つ） Ｅｕｒ、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１じ３，３１（１
９８４））に準じて調製し、１×１０５細胞／１（１６
）μｌの細胞をＳＡＣ（０，（１６）１〜０．（１６）
２５％）で刺激した。次いで上記ヒト・リコンビナント
ＢＣＤＦを１５％濃度になるよう添加し、３７°Ｃ，５
％ＣＯ２下、６日間培養した。培養上滑中の１ｇＭ量を
エンザイムイムノアッセイキットで測定したところ、１
１０ｎｇ／ウェルの値が認められ、コントロールが約５
０ｎｇ／ウェルであったのに対し、有意にＩｇＭ産生が
誘導された。この誘導はＩ　Ｌ　　２　（５０ｕ／ｄ）
添加によって１３５　ｎｇ／ウェルまで増強された。コ
ントロールにもＩｇＭ産生が認められたのは、完全にＴ
細胞を含まないＢ＠胞フラクションを得ることが困難な
ためと考えられる。

（５）　　ヒトＢＣＤＦ染色体遺云子の単一・Ｅ既に、
実施例（１１で正常ヒト胎盤細胞の染色体にヒトＢＣＤ
Ｆ遺伝子の存在を認めていたが、ここでは別の供給源か
らヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を単離した。

（朔 即ち、その供給源として、ヒト胎児肝臓ＤＮＡのＡｌｕ
ｌ−Ｈａｅｍ部分消化断片を持つシャロン４Ａフアージ
ライブラリー（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、ら、Ｃｅ１１，１５，６８７−７０２　（１９７８
））、ヒト胎盤ＤＮＡのＥｃｏＲ１部分消化断片をもつ
シャロン４Ａフアージライブラリー（Ｙａｏｉｔａ、Ｙ
、およびＨｏｎｊｏ、Ｔ、。

Ｂｉｏｍｅｄ、Ｒｅｓ、１．１６４　（１９８０）に準
じて作製）およびヒトＩｇＥ産生ミエローマ細胞株２６
６Ｂ１のＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化断片を持つシャロ
ン４Ａフアージライブラリー（Ｎｉｓｈｉｄａ、Ｙ−ら
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．３８３３　３８３７
　（１９８２））を選んだ。

次に、この３種のライブラリーを用いて、既述のヒトＢ
ＣＤＦ　　ｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片（５１５
ｂｐ）をプローブとしてファージのスクリーニングを、
ベクトンおよびデービス（Ｂｅｃ　ｔ　ｏ　ｎ、　Ｗ、
Ｄ、および　Ｄａ　ｖ　ｉ　ｓ、　ＲｌＷ。

、５ｃｉｅｎｃｅ、１９６，１８０−１８２　（１９７
７））の方法に準じて行った。胎児肝臓、胎盤及びミエ
ローマの各々のライブラリーより各５×１０５個のファ
ージプラークをスクリーニングしてプローブとハイブリ
ダイズする３個のクローンλ１２（胎児肝臓ライブラリ
ーより）、λ２２（胎盤ライブラリーより）およびλ３
８（ミエローマライブラリーより）を得た。

続いて、この３個のクローンの制限エンドヌクレアーゼ
切断地図を常法に従い作製し、ヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮ
ＡのＰｓｔｌ−ＰｓｔＩ断片をプローブとして用いたサ
ザンプロットハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ　　ｂｌｏｔ　　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）分析
した。分析のストラテジーおよびヒトＢＣＤＦ遺伝子の
構成を第４図に示すが、図中Ｅ、ＨおよびＢは各々Ｅｃ
ｏＲＩ、ＨｉｎｄｌｌＩおよびＢａｍＨＩによる切断部
位を示し、黒ボックス部はエクソン領域を示す。この分
析の結果によれば、これら３個のクローンのインサート
は互いにオーバーラツプしており、第４図に示す各クロ
ーンに共通の３．２ｋｂ　ＢａｍＨ１１１片のみが上記
のプローブとハイブリダイズした。従ってこの３．２ｋ
ｂＢａｍＨＩ断片にヒトＢＣＤＦをコードする全てのエ
クソンが含まれていると考え、この３　、２ｋｂＢ　ａ
　ｍＨＩ断片を分離し、Ｈｉ　ｎｄｌｌ［で消化後２つ
になった１　、　６　ｋｂ断片の各々をｐＵｃ１８ベク
ターにサブクローニングした。

次いで、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ０ら（Ｇｅ
ｎｅ、３３．１０３−１１９　（１９８５））に従い、
上で得られた２個の１　、６　ｋｂ断片をクローンした
プラスミドの各々を両端からエクソヌクレアーゼ■及び
■で消化して、ユニディレクシゴナルディリーション（
ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）
ミュータントクローンのシリーズを作製した。このミュ
ータンドブラスミドのインサートのヌクレオチド配列は
、常法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、　　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ＋Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．５４６３　５４
６９　（１９７７）に従い、ジデオキシチェインターミ
ネーション（ｄｉｄｅｏｘｙ　　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｏｎ）法によって決定した。

ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ地
図及び４個のエクソンと３個のイントロンの配ｆｉ（ｏ
ｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）も、ヌクレオチド配列分析の
ストラテジーと共に第４図に示す。また、実際のヒトＢ
ＣＤＦ遺伝子を含むＢａｍＨＩ　　３．２ｋｂ断片のヌ
クレオチド配列を第５図に示す。ここで明らかになった
ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子上のエクソン部分のヌクレオ
チド配列は、先に明らかにしたヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列と完全に一致した。

上記の結果から１．染色体遺伝子において、第１エクソ
ンは、ヒトＢＣＤＦ前駆体ポリペプチド鎖のＮ末端側の
第１アミノ酸（Ｍｅｔ）から第４８アミノ酸（Ｇｌｕ）
迄を、第２エクソンは第４９アミノ酸（Ｔｈｒ）から第
５９アミノ酸（Ａｓｎ）迄を、第３エクソンは第６０ア
ミノ酸（ＨｉＳ）から第１０２アミノ酸（Ｌｙｓ）迄を
、そして第４エクソンは第１０３アミノ酸（Ｌｙｓ）か
ら第１３４アミノ酸（Ｓｅｔ）迄をそれぞれコードして
いることが分かった。

（６）　　ヒトＢＣＤＦ　　　ベクターの造実施例Ｃ２
）で取得したヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮＡおよび実施例（
５）で取得したヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を用いて、次
の４種類の動物細胞発現ベクターを作製した。

■ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ ■ｐ　ｄ　ＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｃ　ＤＮＡ−ｄ　ｈ
　ｆ　ｒ■ｐ　ｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｇ　ｅ　ｎ　
ｅ■ｐｄＫＣＲ−ｈｌＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ実施例
（２）で、オカヤマーベルグ法（Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，
および　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　、　Ｍｏ　１．Ｃｅ１ｌ　
　Ｂｉｏｌ、、３，２８０（１９８３））に従い、ｐＣ
ＤベクターにｃＤＮＡをクローニングし、Ｅ、ｃｏｌｉ
　　ＨＢＩＯＩ形質転換クローンりｈ・ＩＬ−５−３０
を得た。このクローンよりプラスミドを分離し、Ｂａｍ
ＨＩ消化およびＰｓｔＩでの部分消化を行い、ヒトＢＣ
ＤＦの全コ−ディング領域を含むｃＤＮＡであるＢａｍ
ＨＩ−Ｐｓｔｌ断片を得た。この断片をファージＭ１３
ｍｐ１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩサイト間にクロ
ーニングし、Ｍｌ　３ｍｐ　１９−ｈ　Ｉ　Ｌ　−５ｃ
ＤＮＡを得た。

次いで、ヒトＢＣＤＦコーディング領域の直近の５′上
流にＩ（ｉｎｄＩ［［サイトを導入する目的で、第７図
に示すヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列中の２重
下線を引いた部位で、同図に示す配列と逆方向のＤＮＡ
ストランドとハイブリダイズする３０ｍｅ　ｒのオリゴ
ヌクレオチド：５’　−ＧＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＡＡ
ＧＣＴＴＡＴＧＡＧ（１，ＡＴＧｃＴＴ−３’ （下線部のＡＡＧＣＴＴはＨｉｎｄｎ［切断配列を示す
） を用いて常法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、ｉｎ　　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖ。

１．１（１７）　　Ｐａｒｔ　　Ｃ，ｐｐ６２−６５　
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｅｄ、Ｗｕ、Ｒｏ
））に従い、部位特異的ミュータジェネシスを行１Ｒｍ
、−。

い、クローンＭ１３ｍｐ１９−ｂｌＬ−５ｃＤＮＡ（Ｈ
ｉｎｄＩ［）を得た。このファージＤＮＡをＨｉｎｄＩ
［［で消化し、ヒトＢＣＤＦの全コーディング領域に相
当するｃＤＮＡを含むＨｉｎｄＩｆｆ断片をベクターｐ
ｄＫＣＲ（Ｎｉｋａｉｄｏ、Ｔ。

ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１１．６３１−６３５　　（１９
８４）：ｐｄＫＣＲベクターはｐＫＣＲベクターのｐＢ
Ｒ３２２部分がｐＢＲ３２７に置換したベクターである
）のＨｉｎｄｌｌ［サイトに正しい方向に導入し、発現
ベクターｐｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５−ｃＤＮＡを作製
した。

次に、この発現ベクターｐ　ｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ　−
５ｃＤＮＡの５ａｌＩサイトにジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　　ｒｅｄｕｃｔａｓ
ｅ：　　ｄｈｆｒ）遺伝子発現ユニ７トを導入する目的
で、ｐ　ｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｃＤＮＡプラスミド
を５ａｌＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断部
位を粘着末端とした。ｄｈｆｒ遺伝子発現ユニットは、
ｐｓＶ２ｄｈｆｒ（ＢＲＬ　　Ｉｎｃ、）のＰｖｕｌｌ
サイトにＢａｍ１彎１１１４／） Ｈｌリンカ−を付加したプラスミドｐｓｖ２ａｈｆｒ−
ＢＬを作製し、これをＢａｍＨＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで切断部位を粘着末端として、ｄｈｆｒ遺
伝子発現ユニット断片を分離した。この断片を先に得た
１カツトの入ったｐｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｃＤＮＡ
に連結して、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５−ｄｈｆ　ｒを作
製した。

実施例（５）で得たヒトＢＣＤＦ遺伝子を有するファー
ジクローンλ１２から、ヒトＢＣＤＦをコードする全遺
伝子領域を含む３．２ｋｂＢａｍＨＩ断片を分離してｐ
Ｕｃ１８ベクターにサブクローニングし、形質転換体ｐ
Ｕｃ１Ｂ−ｈｌＬ−５ｇｅｎｅを得た。この形質転換体
のプラスミドをＢａｍ１（ＩおよびＰｓｔＩで消化し、
ヒトＢＣＤＦをコードする全遺伝子領域を含むＢａｍＨ
Ｉ−Ｐｓｔｌ断片（２，２ｋｂ）を得た。この断片をフ
ァージＭｌ　３ｍｐ　１９ＤＮＡのＢａｍＨＬ　Ｐｓ　
ｔ　１サイト間にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１９−ｈ
ＩＬ−５ｇｅｎｅを得た。次いで、前記Ａ）と同様に、
部位特異的ミュータジェネシスを行い、ヒトＢＣＤＦコ
ーディング領域の直近の５゛上流にＨｉｎｄ■サイトが
導入されたクローンＭ　１３　ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｇ
ｅｎｅ　（Ｈｉｎｄｕ）を得た。このファージＤＮＡを
ＢａｍＨＩとＰＳｔｌで消化し、ヒトＢＣＤＦ遺伝子を
ｐＵｃ１９にサブクローニングして得たプラスミドｐＵ
Ｃ１９−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ　（ＨｉｎｄＩＩＩ）を更
にＨｉｎｄｎＩで部分的に消化して、ヒトＢＣＤＦをコ
ードする全遺伝子領域をベクターｐｄＫＣＲのＨｌｎｄ
ｌ［［サイトに正しい方向で導入して、発現ベクターｐ
　ｄ　ＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｇ　ｅ　ｎ　ｅを作製し
た。

次いでこの発現ベクターのＮｒｕｌサイトにｄｈｆｒ遺
伝子発現ユニットを導入する目的でｐｄＫＣＲ−ｈｌＬ
−５ｇｅｎｅプラスミドをＮ　ｒ　ｕ　１で消化し、生
成した粘着末端に前記Ａ）で得られたｄｈｆｒ逍伝子発
転子ニット断片を連結させて、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５
ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒを作製した。

以上で作製した４種の発現ベクターは、ＳＶ４０　　（
Ｓｉｍｉａｎ　　ｖｉｒｕｓ　　　４０）アーリープロ
モーターによりヒトＢＣＤＦおよびｄｈｆ　ｒの発現が
司られており、また、ＳＶ４０の複製オリジンを含んで
いる。さらに、発現量を増強させるため、ヒトＢＣＤＦ
　　ｃＤＮＡ及びヒトＢＣＤＦ遺伝子共に５′および３
”非翻訳領域の不必要な部分が除去されている。

（７）ｔ　　　　によるヒトＢＣＤＦの　現実施例（６
）で作製されたヒトＢＣＤＦ発現ベクターを用いて、Ｃ
０３−Ｉ細胞およびＣＨＯ細胞でヒトＢＣＤＦの発現を
行わせた。

動物細胞株Ｃ０３−Ｉ　（サル腎臓細胞）は、１０％の
牛脂児血清を含むダルベツコの修正エッセンシャル培地
で継代を行い、５０〜７０％コンフルエントの状態の細
胞を用いて、Ｇｒａｈａｍ。

Ｆ、Ｌ、およびｖａｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｂ、　Ａ、Ｊ。

（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２，４５６−４６７　（１９７
３））に準じて、リン酸カルシウム法でトランスフェク
ションを行った。直径１０ωの培養シャーレの細胞当た
り各々１０ＪＩｇの、実施例（６）で得られた４種類の
発現ベクターを使用した。３日間、３７°Ｃ１５％ＣＯ
２下で培養を行い、上滑のＢＣＤＦ活性を調べると共に
、細胞からＦｒｅｅｍａｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１
．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ。

ＵＳＡ、■立、４０９４　（１９８３））に従ってＲＮ
Ａを抽出した。得られたＲＮＡを用いて、Ｎａｍｂｕ、
　Ｊ、Ｒ，ら（Ｃｅ　１　ｌ、、　３５．４７−５６　
（１９８３））に従いノーザンプロット分析を行い（２
０ｐｇＲＮＡ／レーン）、ヒトＢＣＤＦｍ　ＲＮ　Ａの
発現量を調べた。用いたプローブは、ヒトＢＣＤＦの全
コーディング領域を含むＭ１’３ｍｐ　１９−ｈ　Ｉ　
Ｌ−５ｃＤＮＡ　（Ｈｉ　ｎｄｌＩ［）の、Ｈ３ｎｄｌ
［１−Ｐｓｔｌ断片である。

ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞での発現は
ＣＨＯｄｈｆｒ−株を用いて行った。細胞は１０％の牛
脂児血清を含むＭＥＭα＋　（ＧＩＢＣＯ）で継代をし
、上記と同様にトランスフェクションを行った。用いた
発現ベクターはｐｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｃ　ＤＮＡ
−ｄ　ｈ　ｒ　ｒおよびｐｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｇ
　ｅ　ｎ　ｅ−ｄ　ｈ　ｆ　ｒである。

トランスフェクション後４８時間培養を行い、Ｗｅｉｓ
ｓｍａｎ、Ｃ＋　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｔｄｓ　　
Ｒｅｓ、１上、６８．７　（１９８３））に従い、１０
％透析牛脂児血清を含むＭＥＭα−（ＧＩＢＣＯ）で培
養選別後、培養液にメトトレキセート０．１μＭを添加
し、更に数日培養を行ってメトトレキセートに耐性のコ
ロニーを分離し、継代後その上清のＢＣＤＦ活性を調べ
た。高発現細胞株を得る目的で、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、Ｃ
０Ｃ０およびＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ、Ｄ、（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．２４９５
−２４９９　（１９８３））に従い、継代培養液に更に
高濃度のメトトレキセートを段階的に１１まで添加し、
ヒトＢＣＤＦ産生細胞株を樹立した。

ヒトＢＣＤＦのアッセイ方法は、Ｔ　　ｃｅｌｌｒｅｐ
ｌａｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒの活性測定方法をとり、Ｋ
ｉｎａｓｈｉ、Ｔ、ら（Ｎａｔｕｒｅ、３２４．７０−
７３　（１９８６））にしたがった。アッセイに用いた
細胞は、ＢＣＬ　１マウス慢性Ｂ白血病細胞（ｉｎ　ｖ
ｉｖｏ継代株或いはＢＣＬ１クローン５Ｂ１ｂ　（ＡＴ
ＣＣＴｌＢ１９７））であり、この細胞をサンプル希釈
系列と混和し、５Ｘ１０−３個／２（１６）パずつ９６
穴平底プレート中で４８時間５％ＣＯ２，３７℃で培養
した。培地は１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＪ−１６４
０であり、５Ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール
、５０　Ｕ　／　ｍｆｌのペニシリン０５５０μｇ　／
　ｍｌのストレプトマイシンを含んでいる。

４８時間後、細胞を遠心で集め、ハンクス液で洗浄後、
２（１６）ｐ１．／穴に懸濁し、その半量の１（１６）
　ｐＲの細胞を用いてプロティンＡプラークアッセイを
Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ、Ｅ、ら（Ｅｕ　ｒ、Ｊ、　Ｉ　ｍ
ｍｕｎｏｌ、、６．５８８　５９０（１９７６））に従
って行い、ＩｇＭ産生細胞数を測定した。ＢＣＬ１細胞
がマウス由来であるため、上記アッセイ法ではヒトＢＣ
ＤＦの測定感度はマウスＢＣＤＦに比して劣る（精製標
品を用いた結果では、約１／１（１６））が、測定可能
であった。

Ｃ０３−Ｉ細胞をｐ　ｄ　ＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｃ　
ＤＮＡ及びｐｄＫＣＲ−ｈｌＬ−５ｇｅｎｅの発現ベク
ターでトランスフェクションし、３日後の両細胞のヒト
ＢＣＤＦｍＲＮＡをノーザンプロット分析により分析す
ると、両者共にｌｋｂに相当する位置にハイブリダイゼ
ーションバンドを認めた。

このことはＣ０３−Ｉ細胞中でヒトＢＣＤＦ遺伝子の転
写物が正しくスプライスされていることを示した。又ヒ
トＢＣＤＦ　ｍＲＮＡの発現量は、驚くべきことに、Ｃ
０３−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅの方がＣＯ
Ｓ　−１／　ｐ　ｄ　Ｋ　ＣＲ−ｈｔＬ−５ｃＤＮＡに
比して約２０倍高かった。

また、ＢＣＤＦ活性を表すプロティンＡ・プラークアッ
セイ（ＰＦＣＮｏ、）でも、上記ノーザンプロット分析
と同様の傾向が観察された。即ち、両発現ベクターでト
ランスフェクションし、３日間培養したＣＯ３−１細胞
の培養上清の２０％と共に培養したＢＣＬ　１１ｉｔ胞
のプラーク形成数を調べたところ　第１表に示すように
、コントロール（宿主細胞Ｃ０３−Ｉ）との差で比較す
ると、ＣＯ３−１／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅの
方が、ＣＯ３−１／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡよ
り約１７倍も高いプラーク形成数を与えた。

第１表　形質転換体のＢＣＤＦ活性の比較ＣＯ５−１／
ｐｄＫｃＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ　　　　　　　３９３
　　　　　　　３０このことは、ｐ　ｄＫｃＲ−ｈ　Ｉ
　Ｌ−５ｇ　ｅ　ｎ　ｅの方がｐ　ｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　
Ｌ−５ｃＤＮＡによるよりトランスフェクション効率が
高いことに起因する可能性を否定は出来ないが、むしろ
ヒトＢＣＤＦｉｌｔ転子のイントロン部分にＳＶ４０プ
ロモーターに働く未知の増強機能が存在していることを
示唆している。

（８）　　ヒトＢＣＤＦの精製と物 ｃｏｓ−ｒ細胞をｐ　ｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｇ　ｅ
〔５５） ｎｅでトランスフェクションし、３日間後の培養液６４
０ｍｊ！（直径１０ｃｍの培養シャーレ６４枚分）より
ヒトＢＣＤＦの精製を行った。培養液を遠心後、上清を
ラット抗マウスＢＣＤＦ　（ＩＬ−５）モノクローナル
抗体を担体セルロファイン（チッソ（株））に結合させ
たアフィニティーカラム（３ｍ２ベツド容Ｍ）にかけ、
ヒトＢＣＤＦをカラムに吸着させた（ヒトＢＣＤＦによ
るＢＣＬ、細胞の１ｇＭ産生細胞への変換は、抗マウス
ＢＣＤＦ抗体により完全に抑制されたので、本アフィニ
ティーカラムを精製に使用した）。次いでこのカラムを
次の順序に従って洗浄した。

■　ＩＭ　　ＮａＣ１５０ｍ１゜ ■　０．５％　ＮＰ　　４０．５０ｍ１！■　ＰＢＳ　
（ｐＨ７，２）、５０ｍＲ■　Ｈ２０，’５０　ｍｌ。

次に、４ｍｆｔの１Ｍ酢酸を使って吸着されたヒトＢＣ
ＤＦを溶出し、溶出液をスピードバックコンセントレー
タ−によって１（１６）ｐｊ！まで濃縮した。

この濃縮液を５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（）１ルマシ
ア）を２連結したＨＰＬＣにかけ、ゲル濾過による精製
を行った。カラムは予め、ＰＢＳ（ｐ）１７．２）で平
衡化を行い、同じ緩衝液で溶出した（流速０．３ｍＲ１
分）。溶出液を０Ｄ２１０とバイオアッセイでモニター
し、活性画分を分子Ｍ４０に付近に回収した。その溶出
パターンを第９図に示す。図中、斜線部分はＢＣＤＦ活
性を有する両分を示し、実線は蛋白質を、点線はＢＣＤ
Ｆ活性を各々示し、矢印は標準分子量蛋白質（分子量マ
ーカー）の溶出位置を示す。

この活性画分をセンシューバックＶＰ−３０４−１２５
１（センシュー科学、プロティンＣ４に相当）による逆
相ＨＰＬＣにかけた。吸着されたヒトＢＣＤＦを０．１
％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在下、溶出液のアセト
ニトリル濃度を０％から８０％に直線的に上昇させるこ
とにより溶出した（流速０．５ｍ１．７分）。その溶出
パターンを第１０図に示す。図中、斜線部分は、ＢＣＤ
Ｆ活性を有する両分を示し、点線はアセトニトリルの濃
度を示す。精製されたヒトＢＣＤＦはアセトニトリル５
５％付近の溶出位置に回収された。収量は約３７Ｉｇで
あった。

こうして、精製されたヒトＢＣＤＦについて、０．１５
ｐｇ１５０ｐｌ／レーンで５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量測定を行った。その泳動パタ
ーンを第１１図に示す。図中、４）は分子量マーカーの
レーンであり、１）〜３）のレーンには次の処理を行っ
た精製ヒトＢＣＤＦを泳動させた。

１）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール及
び熱による処理をしていない、２）精製直後のサンプル
、２−メルカプトエタノール処理を行い、熱処理はして
いない、３）精製後溶出液中で、４°Ｃ２週間保存した
サンプル、２−メルカプトエタノール及び熱による処理
をしていない、 第１１図に示すとおり、２−メルカプトエタノール処理
及び熱処理をしないヒ１−ＢＣＤＦサンプルではゲル濾
過の結果と一致して約４０にの単一バンドを示したが、
このサンプルを２−メルカプトエタノール処理をすると
（熱処理はしない）、ゲル上の分子量は約２０にの単一
バンドとなった。

また、溶出液（０，１％ＴＦＡ、約５５％アセトニトリ
ル）中、４°Ｃで２週間保持した後にも酸化的条件にも
かかわらずゲル上の分子量は約２０にの単一バンドとな
った。このことは活性体のヒトＢＣＤＦが単量体の分子
量約２０によりなる２景体（分子量約４０Ｋ）であるこ
とを示す。

精製したヒトＢＣＤＦの２ｐｇ（単量体として約１（１
６）ｐｍ１（１６）ｐを使い、Ｎ末端アミノ酸配列の決
定をＨｅｗｉｃｋ、Ｒ，Ｍ、　ら（Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、、２５６．７９９０−７９９７（１９８
１））に準じて、ガスーフェイズプロテインシークエン
サーを用いて行った。各サイクルで得られたフェニルチ
オヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相系ＨＰＬＣで
分析し、Ｎ末端より２７番目のアミノ酸塩の配列を第２
表に示すとおり決定した。

第２表 サイクル　アミノ酸　回収ＰＴＨ−アミノ酸（ｐｍｏｌ
ｅ）Ｉ　　　　　Ｉ　ｌ　ｅ　　　　　１２．０２　　
　　　Ｐ　ｒ　ｏ　　　　　　　８．３４　　　　　Ｇ
　１　ｕ　　　　　　５．６５　　　　　Ｉ　ｌ　ｅ　
　　　　　６．９６　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　５．
７７　　　　　Ｔ　ｈ　ｒ　　　　　　　１　、６８　
　　　　Ｓ　ｅ　ｒ　　　　　　　１．８９　　　　　
Ａｌａ　　　　　　３．２１０　　　　　Ｌｅｕ　　　
　　　２．５１１　　　　　Ｖａｌ　　　　　　　２．
３１２　　　　　Ｌｙｓ　　　　　　　１．１１３　　
　　　Ｇ’ｌｕ　　　　　　　１．７１４　　　　　Ｔ
ｈｒ　　　　　　　１．（１７）５　　　　　Ｌｅｕ　
　　　　　１．２１６　　　　　Ａｌａ　　　　　　　
１．８１７　　　　　Ｌｅｕ　　　　　　０．８１８　
　　　　Ｌｅｕ　　　　　　　１．２１９　　　　　　
　　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　１．２２０　　　　　
　　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　＋２４　　　　　　
　　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　Ｏ，６２５Ｌｅｕ　　
　　　　　　　０ ．９２６　　　　　　　　Ｉｎ！ｅ　　　　　　　　　
Ｏ，５２７Ａｌａ　　　　　　　　　０ ．５表中、−は検出されなかったことを示し、士は検出
はされたが定量できなかつ ことを示す。

この結果は、実施例（３）で示したヒトＢＣＤＦｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列から予想した１３４個のアミノ酸
からなるヒトＢＣＤＦ前駆体は、動物細胞からの分泌時
にＮ末端より１９番目のアミノ酸であるアラニンのＣ末
端でリーダー配列が切断され（第３図）、Ｃ０３−Ｉ細
胞あるいはおそら（そのナチュラルなソースであるＴｍ
胞からは、イソロイシンをＮ末端アミノ酸に持ち、単量
体が１１５個のアミノ酸からなる２量体の糖蛋白質とし
て分泌されることを示すものである。

なお、７番目、１４番目および２０番目にスレオニン（
Ｔｈｒ）が検出されたにもかかわらず、塩基配列からス
レオニンと判断される３番目のアミノ酸が検出されなか
ったことは、この３番目のアミノ酸残基に糖鎖が付加さ
れていることを強く示している。この糖鎖は０−グリコ
シド結合で付加していると考えられる。

以上よりＣ０３−Ｉ細胞によって発現された成熟した組
換え（ｒｅｃｏｍｂ　１ｎａｎｔ）ヒトＢＣＤＦの性質
を次に示すが、単量体のアミノ酸配列の推定された２次
元的配列を第１２図に示す。

Φ　Ｎ末端アミノ酸配列がイソロイシンより始まる一種
類であること、自然状態での分子量は約４０にであり、
２−メルカプトエタノール処理又は０．１％ＴＦＡ−５
５％アセトニトリルでの長時間処理後では５ＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動ゲル上で約２０Ｋを示すことか
ら、ヒトＢＣＤ：％４３゜ Ｆのペプチド部分はホモダイマーよりなる。

■　成熟したヒトＢＣＤＦのペプチド部分はイソロイシ
ンから始まる１１５個のアミノ酸よりなり、単量体のペ
プチド部分の分子量は１３，１４９である。

■　成熟したヒトＢＣＤＦは２Ｎ体性の１！蛋白質であ
る。このことは、成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ酸配列中Ｎ
末端から２８番目及び７１＠目のアスパラギンがＮ−グ
リコシド化を受ける可能性のある配列であること、又３
番目のスレオニンがアミノ酸配列決定において検出出来
なかったことより、０−グリコシド化を受けていると考
えられること、単量体の分子量が５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動ゲル上で約２０にであり、ペプチド
部分の分子ｉ１３．１４９と開きがあることなどから推
察される。従って、成熟ヒトＢＣＤＦ単量体には分子量
の合計が約７．（１６）０弱の糖鎖が結合していると考
えられる。

■　成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ酸配列中、Ｎ末端から４
４番目及び８６＠目のシスティンの状態は（・々１ 不明であるが、０．１％ＴＦＡ−５５％アセトニトリル
の長時間処理で酸化条件にもかかわらず、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に相当する
分子量を示すことから、２量体の形成は分子間のＳ−３
架橋による。ものではないと考えられる。しかし、２−
メルカプトエタノール処理で速やかにＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に解離することよ
り、Ｓ−３架橋が単量体の分子内に存在し、２Ｎ体形成
に必要なコンフォメーション保持を司っていることが考
えられる。これらの観察より４４番目のシスティンと８
６番目のシスティンは分子内架橋を形成しているのでは
ないかと推察される。

■　ヒトＢＣＤＦ遺伝子の解析から判ったエクソン−イ
ントロン構造より、成熟ヒトＢＣＤＦの第１アミノ酸（
Ｉｎ！ｅ）から第２９アミノ酸（ＧＩＵ）迄が第１エク
ソン、第３０アミノ酸（Ｔｈｒ）から第４０アミノ酸（
Ａｓｎ）迄が第２エクソン、第４１アミノ酸（Ｈｉｓ）
から第８３アミノ酸（Ｌｙｓ）迄が第３エクソン、第８
４７ミノ酸（Ｌｙｓ）から第１１５アミノ酸（Ｓｅｔ）
が第４エクソンに由来している。

■　ヒトＢＣＤＦの精製は、ＣＯ３−１細胞のトランジ
ェント・エクスプレッション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　　
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）による培養液６４０ｍＥから出
発して、純粋なヒトＢＣＤＦを約３　ｐｇ　得り。ＣＯ
３−１細胞のトランスフォーメ一　　ジョンの効率が、
約１０−３であることを考えると、ＣＨＯ／ｐｄＫＣＲ
−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ　　ｄｈｆｒ細胞株の発現量はヒ
トＢＣＤＦの医療等へのより広範囲の利用を目的とした
生産株となり得ると考えられる。

（発明の効果） 本発明によればヒトＢＣＤＰＩ活性を示す物質をコード
するＤＮＡ配列およびそのポリペプチド部分の構造が明
らかにされ、ＤＮＡ組み換え技術を用いたヒトＢＣＤＦ
の大量生産の可能性が提供された。

本発明の方法で得られる組換えヒトＢＣＤＦは、感染症
や免疫不全症などの治療に有用な薬剤として、そのまま
或いは薬学的に許容できる担体とともに薬剤組成物とし
て患者に投与することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローン化されたｐｈ・ＩＬ−５−３０に挿
入されているヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡ遺伝子を含むｃＤ
ＮＡの塩基配列図であり、第２図は、第１図の塩基配列
中のヒトＢＣＤＦポリペプチドをコードする領域を、そ
のコードするアミノ酸配列とともに示す図であり、第３
図は、第２図の下段に示したアミノ酸配列（ヒトＢＣＤ
Ｆ前駆体のアミノ酸配列）中における、成熟ヒトＢＣＤ
Ｆポリペプチド部分およびリーダー配列部分を説明する
ための図であり、第４図は、ヒトＢＣＤＦ遺伝子の塩基
配列解析のストラテジーおよび当該遺伝子の構成を示す
図であり、 第５図（ａ）ないしくｄ）は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝
子（Ｂ　ａ　ｍＨＩ　３．２ｋｂ断片）の全塩基配列を
示す一連の図であり、 第６図は、ｃＤＮＡ発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−
５ｃＤＮＡおよびｐｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｃＤＮＡ
−ｄ　ｈ　ｆ　ｒ構築の過程を示す図であり、第７１２
１は、ファージＭｌ　３ｍｐ　１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ
とＰｓｔＩサイトに挿入されるヒトＢＣＤＦ　　ｃＤＮ
Ａの塩基配列を示す図であり、第８図は、ヒトＢＣＤＦ
発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈ　Ｉ　Ｌ−５ｇ　ｅ　ｎ　
ｅおよびｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆ　ｒ
構築の過程を示す図であり、 第９図は、組換えヒトＢＣＤＦのＳｕｐ　ｅ　ｒ　。 ５ｅ１２ＨＰＬｃカラムでのゲル濾過による溶出パター
ンを示すグラフであり、 第１０図は、組換えヒトＢＣＤＦのセンシューバックＶ
Ｐ−３０４−１２５１カラムでの逆相ＨＰＬＣによる溶
出パターンを示すグラフであり、第１１図は、精製され
た成熟組換えヒトＢＣＤＦのＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動染色パターンを示す図であり、 第１２図は、成熟型組換えヒトＢＣＤＦ単量体のポリペ
プチド部分のアミノ酸配列の推定された２次元構造を示
す図である。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式 I ： 【遺伝子配列があります。】 （ I ） （式中、点線部分は何も存在しないか、またはイントロ
   ンが存在出来ることを表し、そして ５’末端から８４番目のＡまでの配列は一部欠失してい
   てもよい） で表されるＤＮＡ塩基配列またはこの塩基配列がコード
   するアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基
   配列よりなる、ヒトＢ細胞分化因子のＤＮＡ。
2. （２）式 I において、１番のＡから５７番のＣ迄の配
   列が欠失している、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ
   。
3. （３）式 I において、点線部に何も存在しない特許請
   求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
4. （４）式 I において、１４４番のＧと１４５番のＡと
   の間のイントロンが、次式： 【遺伝子配列があります。】 で表され、１７７番のＴと１７８番のＣとの間のイント
   ロンが、次式： 【遺伝子配列があります。】 で表され、３０６番のＡと３０７番のＡとの間のイント
   ロンが、次式： 【遺伝子配列があります】 で表される、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
5. （５）式 I で表されるＤＮＡ塩基配列またはこの塩基
   配列がコードするアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコ
   ードするＤＮＡ塩基配列を含むプラスミド。
6. （６）ｐｈ・ＩＬ−５−３０で表される特許請求の範囲
   第５項記載のプラスミド。
7. （７）遺伝子組換え法で製造され、プロテインＣ＿４型
   の吸着剤を用いた高速液体クロマトグラフィーで単一成
   分として溶出され、かつＳＤＳポリアクリルアミドゲル
   電気泳動により単一のバンドを示す程度に精製されたヒ
   トＢ細胞分化活性因子。
8. （８）ポリペフチドのアミノ酸配列が、次式II：【遺伝
   子配列があります。】 （II） で表される、単量体の分子量が約２万の糖蛋白質である
   、特許請求の範囲第７項記載のヒトＢ細胞分化活性因子
   。
9. （９）少なくとも、アミノ末端の３番目のアミノ酸残基
   （Ｔｈｒ）に糖鎖が結合していることを特徴とする、特
   許請求の範囲第７項記載のヒトＢ細胞分化活性因子。
10. （１０）分子量約４万の２量体を形成している、特許請
    求の範囲第７項記載のヒトＢ細胞分化活性因子。
11. （１１）式 I で表される塩基配列またはこの塩基配列
    がコードするアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコード
    するＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドが導入された形質
    転換細胞。
12. （１２）プラスミドが、ｐｈ・ＩＬ−５−３０である特
    許請求の範囲第１１項記載の形質転換細胞。
13. （１３）式 I で表される塩基配列またはこの塩基配列
    がコードするアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコード
    するＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドが導入された形質
    転換細胞を培養し、この細胞が生産するＢ細胞分化活性
    を有する糖蛋白質を細胞内または培養培地から回収およ
    び精製することからなるヒトＢ細胞分化活性因子の製造
    方法。
14. （１４）プラスミドがｐｈ・ＩＬ−５−３０である特許
    請求の範囲第１３項記載の方法。
15. （１５）イントロンを含む式 I のＤＮＡ配列をヒト染
    色体から取り出し、これをヒトＢ細胞分化活性因子遺伝
    子として発現ベクターに組み込み、該ベクターによって
    トランスフェクションされた動物細胞株の培養物からヒ
    トＢ細胞分化活性因子を抽出・精製する特許請求の範囲
    第１３項記載の方法。
16. （１６）ヒトＢ細胞分化活性因子は、そのポリペフチド
    部分のアミノ酸配列が式IIで表され、またその単量体の
    分子量が約２万の糖蛋白質である特許請求の範囲第１３
    項記載の方法。
17. （１７）発現ベクタ−が、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅ
    ｎｅまたはｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ
    で表される、特許請求の範囲第１５項記載の製造法。
18. （１８）イントロンを含むヒトＢ細胞分化活性因子の遺
    伝子が、次式III： 【遺伝子配列があります。】 （III） （式中、アミノ酸配列を併記した領域はエクソンを示し
    、塩基配列のみを記した領域はイントロンを示す。） で表される塩基配列で示されることを特徴とする特許請
    求の範囲第１５項記載の方法。
19. （１９）動物細胞株が、ＣＯＳ−Ｉ，ＣＨＯまたはＣＨ
    Ｏｄｈｆｒ−で表される細胞である特許請求の範囲第１
    ５項記載の方法。