JPS63146798A - ヒト多機能性免疫因子及びその突然変異タンパク - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に哺乳動物の免疫系のタンパク及び突然変
異タンパク因子と、それをコードする核酸に関する。よ
り詳細には、本発明はＢ細胞分化因子活性及び好酸球コ
ロニーの形成と成長の促進を含む、免疫系への多機能的
刺激作用を示す新しい種類の哺乳動物のリンホカイン（
ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　）及びそｎをコードしている核
酸に関するものである。

（従来の技術） 数多（の可溶性糖タンパク因子が哺乳動物免疫系の細胞
性成長及び分化応答を仲介している。これらの因子は、
リンホカイン、サイト力イン、モノ力イン、ヘモポエチ
ン（ｈｇｍｏｐｏｉｇｔｉｘ　）のように呼ばｔで（・
る。例えばＭｅｔ　ｃ　ａげ　「ヘモポニチ７　：ｚ　
ｏ　ニー刺激因子Ｊ　（Ｅｌｓａｖｉｇｒ、　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ。

１９８４）、及びＳｏｒｇら、編「リンホカインの細胞
及び分子生物学Ｊ　（Ａｃａｄｓｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、
　ｈｈｗＹｏｒｋ、１９８５）。

これら因子の検出、単離及び精製は非常に困難である。

なぜなら、これらの因子が典型的に存在している上清部
分の性質、混合物中の各種の組成分がもつ活性の多様性
や交錯、これら因子の性質の確認に用いるアッセイの感
度（あるいはその欠損）、これら因子の分子量の範囲及
び他の特徴がしばしば似かよっていること、さらに、通
常の状態ではこれら因子の濃度が非常に低いこと、など
によって複雑化されることが、しばしばたからである。

主に分子のクローニングによってリンホカインの利用が
より可能になってくると、これらを臨床に応用すること
に関心が高まってきた。ホルモンとの生理的類似性（例
えば、可溶性因子、成長の仲介因子、細胞レセプターを
介しての作用）のために、リンホカインの利用の可能性
は、現在のホルモンの利用と類似してきた、例えばＤｅ
ｚｔｅｒ。

Ｎａｔｒｂｒａ、　３２１巻、１９８ページ（１９８６
）。

１つの期待は、患者のリンホカインのレベルヲ好都合な
免疫応答をひきおこすように、直接又は間接的に操作で
きることであり、例えば炎症、アレルギーや組織拒絶を
抑制したり、あるいは、感染や悪性成長の場合の刺激や
相乗作用などである。

他に潜在的なリンホカインの臨床への利用として、人の
ある種の免疫系細胞の一群を試験管中（ｉｒ＋τ１ｔｒ
ｏ）で維持し、増殖させて最終的に好都合な効果を期待
して、同一人あるいは別の人に再導入することが含まれ
る。例えば患者のリンホカインによって活性化されるキ
ラーＴ細胞の数を、患者の体外で増大させることができ
るかどうか、あるいは、抗腫瘍応答の増強をひきおこす
ために、さらに再注入することが可能かどうかを探るた
めの研究が現在進行中である。別の潜在的なリンホカイ
ンの臨床への利用として、顆粒球−マクロファージコロ
ニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ）のような、特にコロニー
刺激性の因子、及びそのよっな活性を増強する因子が、
血液細胞の生産を刺激する現象があり、例えば、腫瘍に
対する前後の化学療法や照射療法、又は、骨髄酸形成症
（ｍｙａｌｏｉｄｈｙｐｏｐｌａｓｉａｓ　）の治療、
あるいは、好中球減少症候群（ｎｇｕｔγｏｐｈｉｌ　
ｄｔｒｆｉｃｉｇｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療な
どがある。例えばＤｇｘｔａｒ、　Ｎａｔｗｒｇ。

３２１巻、１９８ページ（１９８６）を参照。

このような因子が有用であろうと思われる他の分野とし
ては、骨髄移植療法があり、無形成貧血（αｐｉα５ｔ
ｉｃαｎ５ｍ１ａ）やある種の白血病の治療に次第に利
用されてきつつある。

そのような臨床への応用に重要な結果をもたらすリンホ
カインには、２つの性質がある：個々のリンホカインは
しばしば多機能性である。しかも、１つのリンホカイン
の生物学的作用は、通常少なくとも１つの他のリンホカ
インによって阻害をうげたり、あるいは増強されたりし
て、調節されることが可能である。例えば腫瘍壊死因子
（ｔｕｍｏｌ”ｎｔｃ、ｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　）
は、ガンマインタフエロンと協調して、インターロイキ
ン−１（ＩＬ−１）の生産を増強し、さらに、好中球の
食作用を活性化することができる。ＩＬ−１は、活性化
されたマクロファージが生産するタンパクであるが、こ
れはインターロイキン−２（ＩＬ−２）の放出を誘導す
ることにより胸腺細胞の増殖を刺激したり、８９７８球
の成熟化と増殖の刺激、又、肝細胞による急激なタンパ
ク合成の誘導や、さらに線維芽細胞成長因子活性を示す
など、広範な生理活性を仲介している。ＩＬ−２は以前
はＴ−細胞成長因子と呼ばれていたが、これはレクチン
又は抗原によって活性化されたＴ細胞によって生産さ汎
るリンホカインである。

今までに報告されているＩＬ−２の生理活性としては、
活性化されたＴ細胞のクローンを長期間試験管内（１ｔ
Ｌｖｔｔｒｏ　）で刺激すること、胸腺細胞の有糸分裂
の増強、ヌードマウスの培養牌細胞における細胞毒性Ｔ
細胞の反応性とプラーク形成細胞（ｐＬａｑｗａ−ｆｏ
ｒｍｉ％ｇ　ｃｅｌｌ）の応答性の誘導、Ｂ細胞成長因
子活性などがある；さらに、ＩＬ−２は、インターフェ
ロン（ＩＦＮｓ）と同様にナチュラル・キラー（ｎαｔ
ｕデαｌ　ｋｉｌｌｓデ）Ｔ細胞の活性を増大すること
が示されており、新生物（腫瘍のような異常組織の発生
）症の治療への潜在的な利用が示唆される：ＩＩｔｒｎ
ｎｅｙら、Ｎａｔｗｒｇ　、　２９１巻、３３５−３３
８ページ（１９８１）、及びＥｏｓｇｎｂｅｒｇとＬｏ
ｔｚｅ、　　ｒインターロイキン−２及びインターロイ
キン＝２により活性化されたリンホカインを利用する癌
の免疫療法」、Ａｎｎ。

Ｒｅ　ｖ　、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、　、　４巻、６８
１−７０９ページ（’１９８６）。

近年Ｂ細胞の成長と分化を制御する因子に対する関、シ
・が高まってきている：例えばＢｉａｌｙ＋Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　４巻、６１４−６２１　ページ、
（１９８６）及び息下の総説：　Ｇｒｔｔｒｎｂｌａｔ
ｔとＨｏｗａｒｄ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐ
ｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ（、Ｗａｒｃｅｌ　　Ｄ
ｅｋｋｔｒｒ　編、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、１９８７　
　）、及びＨｏｗａｒｄとＰａｎ１　＊　Ａｎｎ、　Ｒ
ｅｖ、　Ｉｍｍｗｎｏｌ　、　１巻、３０７−３３３ペ
ージ（１９８３年）、Ｈｏｗａｒｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　Ｒｅｖ、　、　１９８４年、　７８号、１８５−２
１０ページ、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、ＩｍｍｕｔＬｏｌ
　Ｒｅｖ、　１９８４年、７８号、９７−１１８ページ
、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍ
ｗｎｏｌ、　３巻、１３３−１５７ページ（１９８５年
）など。こうした関心の実際的な狙いは、１つあるいは
それ以上の成長又は／あるいは分化因子を、単独である
いは、抗生物質とともに用いることにより、抗体の生産
を選択的に刺激して、感染に対処させる１つの治療法を
発展させることにある。

原材料の違い、精製の困難さ、生理活性を定義するのに
用いられるアッセイ法の違いなどのために各種のＢ−細
胞因子の命名に用いられる名称については幾分の混乱が
ある。

Ｂ細胞成長因子（ＢＣＧＦ）活性とは、抗ＩＱＭあるい
はそれと同様な抗原にさらされることによりともに刺激
を受けたＢ細胞中にＤＮＡ合成をひきおこすことができ
るということを特徴とする。

少な（とも、低濃度のＢ細胞の存在下でアッセイが行わ
れた時にはインターロイキン−１も、ＢＣＧＦ活性を表
わすために要求されると信じられている。別のヒトＢｃ
ＧＦのアッセイ法が、例えば、ＭａｉｚｅＬらＰｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、８０巻、５
０４７−５０５１ページ（１９８３年）に記述されてい
る、（長期間のヒトＢ−ｍ胞の培養を要する）。

前者のアッセイに関連した、ＢＣＧＦ活性もまたいろい
ろと名称がつけられてきており、Ｂ細胞刺激因子−１（
ＢＳＦ−１）活性とか、それを同様なおよび／あるいは
関連した活性と区別するためにＢＣＧＦ−１などと呼ば
れている。現在では、ＢＳＦ−１（ＢＣＧＦ　　Ｉ）は
、ＬｇａらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃ、ａｄ、　Ｓｃｉ、　、　８３巻、２０６１−２０
６５ページ（１９８６年）、及びＹｏｋｏｔａらＰｒｏ
ｃ、ＮｔＬｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３巻、５８９４−５８９８ペ
ージによって最近クローニングされ、特性を記述された
、インターロイキン−４（ＩＺ、−４）と名づけられた
因子と同一のものであると信じられている。

ＢＣＧＦ−ＩＩと命名された活性もまた記述されている
。これはマイトジェン（分裂促進因子）で刺激を受けた
Ｂ−細胞あるいは形質転換を受けた株化Ｂ細胞において
、ＤＮＡ合成をひきおこすことができることを特徴とす
る。ＢＣＧＦ　　Ｉｔ活性と関連したマイトジェンには
、硫酸デキストラン、リポ多糖、ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｌＬｓ−）の抽出物などが含まれる。

これらのアッセイでは、ＢＣＧＦ　　Ｉは何の応答もひ
きおこさない。ヒトでは、ＢＣＧＦ　　Ｉｔは分子量約
５０キロダルトン（ＫＤ’）であり、ＢＣＧＦ−■（即
ちＢＳＦ−１）と協同的に作用して、免疫応答における
Ｂ−細胞の増殖を促進するものと信じられている；　Ｙ
ｏｓｈｉｚａｋａら、Ｊ、　ｌｍｍ１Ｌｎｏ１．　１３
０巻、１２４１−１２４６ページ（１９８３年）。ネズ
ミでは、ＢＣＧＦ−ｎは、ゲルろ過クロマトグラフィー
によると分子量約５５ＫＤ、平均等電点５．５をもつも
のと信じられている：ＤｗｔｌｏｎらＪ、　ｌｍｍ５ｎ
ｏ１　、１３２巻、２４５１ページ（１９８４年）。

最近、ＢＣＧＦ　　ｎは、成長誘導因子ばかりでなく、
ポリクローナルな、抗原特異的なり細胞の分化において
も役割を演じてし・ることか報告さ九ている。例えばＳ
ｗａｉｎ、　Ｊ、　Ｉｍｍｘｎｏｌ　、　、　１３４巻
、３９３４ページ（１９８５年）によると、部分精製さ
れたＢＣＧＦ−１１は、ＢＣｌ、リンパ＠細胞によるＩ
ＱＭの分泌の増大をひきおこすが、一方、組み換えＩＬ
−２、組み換えガンマ−インターフェロン及び精製した
ＩＬ−４は、そのような活性をもたないことが示されて
いる。同様に、ＴａｋａｔｓｔＬら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏＬ　、　１２５巻、２６４６ページ（１９８０年）及
びＱｆＬＯら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７巻、１
８７ページ（１９８６年）では、Ｂ１５ｌ−ＴＲＦ、（
ＴＲＦはＴ−ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｌａｃｉ？Ｌｇ　Ｆａｃ
−１ｏｒを意味する）と命名されたＢ−細胞分化因子（
ＢＣＤＦ）を同定している。これは後にＢＣＧＦ活性を
もつことが示された：　Ｈａｒａｄａら、Ｊ。

Ｉｍｍｗｎｏ　ｌ　、　　１３４巻、３９４４ページ、
（１９８５年）及びＨａｒａら、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｇ
　Ｒｓｓ、、　４巻、２４３ページ（１９８５年）。Ｂ
１５ｌ−ＴＲＦ、についてのＢＣＤＦＣＤ上イは、ＤＮ
Ｐ−キイホールリンペット血球凝集素（ＫＬＨ）で感作
したＢＡＬＢ／ｃマウス由来で、Ｂ１５ｌ−ＴＲＦ、　
　とＴＮＰ−オブアルブミンを含む上清とともに培養し
たＢ細胞の、ＩＱＧ抗ＤＮＰに特異的なプラーク形成細
胞（ＰＦＣ）応答を測定される。ＢＣＧＦ　　Ｉｔ活性
は、ＢＣｌ、ＩＪンパ腫細胞による増殖と免疫グロブリ
ン分泌の誘導、及び硫酸デキストランで活性化した正常
なり　、＜（Ｂ胞の増殖によってアッセイされる。

さらに他の分化因子活性はＢＣＧＦ−Ｉｔに帰属されて
きた。５ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ、
　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　８３巻、４３７ページ（１９８６年）及び
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｌｌｄ、　、　１６２巻、６０ペー
ジ（１９８５年）では、付加的なりＣＧＦ　　［活性を
示していると思われる、好酸球分化因子（ＥＤＦ）を同
定している。ＥＤＦは、メゾセストイデス・コルチ（Ｍ
ｅｓｏｃｇｓｔｏｉｄｇｓ　ｃｏｒｔｉ　）で感作した
マウス由来の骨髄細胞を試料の上清とインキュベートし
、５日間における好酸球の成長を好酸球パーオキシダー
ゼを比色定量することにより、アッセイされる。ＢＣＧ
Ｆ　　Ｉｔ活性は、前述の短期間のＢＣｌ、増殖アッセ
イにより決定された。ゲル濾過クロマトグラフィーによ
ると、双方の活性とも見かけの分子量は、４５−４６　
Ｋ　Ｄである。これらの活性を等電点フォーカンノブお
よび／またはレンチル・レクチン、フェニル−セファロ
ース、ＤＥＡＥ−セファロース、及び逆相クロマトグラ
フィーによって分画する試みは、成功していない。ＥＤ
Ｆは、Ｂ細胞成長促進活性なり細胞分化活性から分離し
ようと試みた際に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　によって分画さ
れている。双方の活性とも分子量４４ＫＤに相当する同
一の両分にともに移動した。ＥＤＦはｐ１５．５である
と報告されている。好酸球は抗寄生虫（ａｎｔｉｐａｒ
ｃＬｓｉｔｇ　）の免疫において役割を演じているもの
と信じられている：　Ｋｌ　ｇ　ｉｎ、　１ｍｍ−ｗｎ
ｏｌｏｇｙ　　（Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｇｙ　　＆　　５
ｏｎｓ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ。

１９８２年）。少なくとも好酸球分化因子は哺乳動物の
中で洗物異的（１特異的ではな（）であるように思われ
（Ｍａｔｃａｌｆら、Ｂｌｏｏｄ、　６１巻、９９９−
１（１０５ページ（１９８３））、それゆえ、各種の哺
乳動物種の因子の間には、大きな類似性があると思われ
る。

Ｂ細胞分化因子（ＢＣＤＦｓ）、即ち活性化したＢ細胞
にＩＱＭおよび／又はＩＱＧの分泌を誘導することがで
きる因子についての報告は数多くある：例えば、Ｍｕｒ
ａｇｗｃｈｉら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｓｏ　ｌ　、　、　１
２７巻、４１２ページ（１９８１年）、Ｙｏｓｈｉｚａ
ｋａら、Ｊ、　Ｉｍｒｒｎｂｎｏｌ　、　、　１２８巻
、１２９６ページ（１９８２年）、Ｔｇｒａｎｉｓｈｉ
ら、Ｊ、　ｌｍｍ１Ｌｎｏ１．　、１２８巻、１９０３
ページ（１９８２年）などを参照。

ネズミのＢＣＤＦがヒトのＢＣＤＦと生物学的及び生化
学的な性質で類似していることは、い（つかの研究室で
確められている。例えばＰｕｒｅ　ら、Ｊ、　ｌｍｍ５
ｎｏｌ　、　、　１２７巻、１９５３ページ（１９８１
年）及びＮａｋａｎｉｓｈｉら、Ｊ、　Ｅｚｐ、　Ｍａ
ｄ、　、　１６０巻、１６０５ページ（１９８４年）。

この因子の生化学的な性状の記述から、ゲル濾過分析に
よる分子量は３Ｏ−３５ＫＤであり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
では約３２ＫＤということである。上述のものとは明ら
かに異なる別のＢＣＤＦについても報告がある。例えば
、Ｏ？Ｌｏら（先に引用）、Ｓｉｄｍａｎら、Ｊ、　Ｉ
ｍｔｎｕｎｏ　ｌ　、　、　１３２巻、２０９ページ（
１９８４年）、Ｊ、　ＩｍｔｎｌＬｎｏｌ　、　、　１
３２巻、８４５ページ（１９８４年）。

さらにインクイブ−特異的な作用をもつ他のＢＣＤＦも
報告されている。例えば、Ｈａ　ｇ　ｇ　ｒら、Ｊ、　
Ｅｘｐ、　ｌ１ｔｒｄ、　、　１５６巻、１８６０−１
８６５ページ（１９８２年〕では、ＩＱＡに特異的なり
ＣＤＦについて報告している。

これらの各種Ｂ細胞因子と、特異的な免疫グロブリン・
インタイブの生産との関係については、現在のところ明
らかでない。しかしながら、Ｂ細胞によってどのイソタ
イプが生産されるのかを決定する因子についてさらに知
識を得てい（ことにより、感染に対する重要な新しい治
療のアプローチへと導（ことが可能であろう。例えばＩ
ＱＡはヒトで外分泌される主要な免疫グロブリンである
。

特異的にＩｇＡを生産する細胞は、体中の特に呼吸器、
尿性器ならびに消化管粘膜の上皮に存在して、空中（α
ｅｒｏｓｏｌｓ　）、環境、食餌中に生じる病原体に対
する前線の防御として体ｉ件の保護の役割を担っている
。こうした器官でのＩＯＡの重要な役割は、侵入してき
た微生物に結合して、その動きを抑え、上皮表面に固着
できなくすることにあると信じられている。それ罠よっ
てＩＱＡは微生物に粘膜の自然浄化作用を受けやすくさ
せてしまう。適肖なリンホカインを投与して、ＩＱＡ　
の分泌を刺激することができるということは、呼吸器、
尿性器、や胃腸系に生じた広範な感染性の病気にたちう
ちする有効な方策となりつるであろう。

これはまた、生まれつきＩＱＡを合成できないといつ、
０．１２５−０．２パーセントの割合でおこり、もつと
もしばしばみられるヒトの免疫グロブリン欠乏症に対し
ても有効であろう。特にそのような欠乏症は、子供時代
の感染やアトピー、それに食餌抗原に対する循環性抗体
などとよい相関関係がある：　Ｕｎｄａｒｄｏｗｎ、　
Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｖｔ＞ｏｌ　、　、　　４
巻、３８９−４１７ページ（１９８６年）。

（発明が解決しようとする問題点） 前述した見地から、Ｂ細胞の成長と分化を刺激する因子
の開発および／または発見は、体液性の免疫応答が最初
の生体防御であるような病気の治療に対する新しいアプ
ローチに導（可能性がある。

とりわけ、ＩＱＡを増強させる因子の利用は、呼吸器及
び胃腸系の感染病の治療に対する新しいアブローチに導
くことができるであろう。

本発明は、ヒトの病気または／家畜病の治療における免
疫制御物質の応用に関連した問題にかかわっている。よ
り詳細には、Ｂ細胞の免疫グロブリンの分泌及び好酸球
の増殖を刺激することのできる化合物を提供するもので
ある。

本発明は、新しい因子であるヒト多機能性免疫因子（Ｐ
ＩＦ）及びその新規芙然変異タンパクに関する。ヒトＰ
ＩＦには、下記の式ｌで定義される一連の配列から選択
されたアミノ酸配列からなり、標準アッセイ法で定義さ
れるような、Ｂ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）活性及び好酸
球コロニー刺激因子（Ｅ；ｄ−Ｃ３Ｆ）活性をもつ。ポ
リペプチドが含まれる。本発明にはまた、式Ｉで定義さ
れるポリペプチドをコードすＳことができる核酸、及び
本発明の核酸を用℃・てそのようなポリペプチドを合成
する方法、さらに本発明のポリペプチドを用いて免疫グ
ロブリン欠乏症に関連した病気を治療するための方法、
が含まれる。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、より具体的には、下記の式Ｉで定義される一
連の配列から選択したアミノ酸配列からなる一連の糖化
（グリコシル化）あるいは非糖化（非グリコシル化）ポ
リペプチドである。

Ｘ（ＧｉｌＬ）　　−Ｘ（ｆｉｇ）　　−Ｘ（Ｐｒｏ）
Ｘ（Ｌａｕ）−Ｘ（Ｖａｌ）　　−Ｘ（Ｌｙｓ）Ｘ（Ａ
ｌａ）−Ｘ（Ｌｇｗ）　−Ｘ（Ｌａ１Ｌ）Ｘ（Ａｒｇ）
　　−Ｘ（Ｔｈｒ）　　−Ｘ（Ｌｔｒｓ）Ｘ（Ｇｌｕ）
−Ｘ（Ｇｌｕ）　　−Ｘ（Ｉｌｔｔ）Ｘ（Ｉｔｓ）−Ｘ
（Ｇｌｔｔ）　　−Ｘ（Ｔｈｒ）Ｘ（Ｇｌｎ）　　−Ｘ
（Ｌｙｓ）　　−Ｘ（Ｌｙｓ）Ｘ（Ｉｌｇ）−Ｘ（Ｉｌ
ｅ）　　−Ｘ（Ｇｌｕ）（弐′エン −Ｘ（Ｔｈｒ）　　−Ｘ（Ｓｅｒ）　　−Ｘ（Ａｌａ）
　　−−Ｘ（Ｇｌｗ）　　−Ｘ（Ｔｈｒ）　　−Ｘ（Ｌ
ａｗ）　−一　Ｘ（Ｓｇｒ）　　−Ｘ（Ｔｈｒ）　　−
Ｘ（Ｈｉｓ）　　−−Ｘ（Ｌａ１Ｌ）　　−Ｘ（Ｉｔｓ
）　　−Ｘ（Ａｌａ）　　−Ｘ（Ｌｅｗ）　　　　Ｘ（
Ａｒｙ）　−Ｘ（Ｉｒｅ）　　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（
Ｈｉｓ）　　−Ｘ（Ｌｙｓ）　　−Ｘ（Ｌｓｕ）　　−
Ｘ（Ｃｙｓ）　　−Ｘ（Ｔｈｒ）　　−−Ｘ（Ｐｈｅ）
　　−Ｘ（Ｇｌｎ）　　−Ｘ（Ｇｌｖ）　　−−Ｘ（Ｌ
ｇｕ）　　−、Ｙ（Ｇｊａ）　　−Ｘ（Ｓｕｒ）　　−
Ｘ（ＧＬｎ）　　−Ｘ（Ｇｌｙ）　　−Ｘ（Ｇｌｙ）　
　−Ｘ（Ａｒｇ）　　−Ｘ（Ｌｇｕ）　　−Ｘ（Ｐｈｉ
）　−−Ｘ（Ｌｙｓ）　　−Ｘ（Ｃｙｓ）　　−Ｘ（Ｇ
ｌｙ）　　−Ｘ（Ａｒｇ）　　−Ｘ（Ａｒｇ）　　−Ｘ
（Ａ’ａｌ）　　−ｘ（ｒ、ｇｕ）　　−ｘ（Ａｓｐ）
　　−ＸＣＴｙｔｒ）　　−−Ｘ（Ｓｇｒ） ここで、Ｘ（Ｘａα）とは、同義のアミノ酸のグループ
を表わし、上注の数字は相当するアミノ酸の配列順序を
表わす。１つのグループの中の同義アミノ酸は、そのグ
ループ中の他のアミノ酸と置換しても、分子の生理機能
を実質的に保つのに十分類似した物理化学的性質をもち
あわせている：Ｇｒａｎｔｈａｍ、　５ｃｉｅｎｃｅ　
、　１８５巻、８６２−８６４ページ（１９７４年）。

先に定義した配列中で、生理機能を変化させることなく
、アミノ酸を挿入あるいは欠落させることもできよう。

特に、例えば１０個以下の少数のアミノ酸を挿入又は欠
落させただけでは、仮にシスティン残基のように機能的
なコンホーメーションをとるうえで重要なアミノ酸が除
かれたり、置換されたのでなげれば、そのようなことも
可能であろう：　Ａｎｆｉｎｓｅ？Ｌ、　　ｒタンパク
鎖の折りたたみを支配する原則」、Ｓｉｃｇｎｃｅ、　
１８１巻、２２３−２３０ページ（１９７３年）。その
ような欠落および／又は挿入によって生産されるタンパ
ク及び突然変異タンパクは本発明の範囲内である。式Ｉ
のタンパクのアミノ酸残基をここで数字によって特定す
るときは、タンパクのＮ末端からの順番で示すこととす
る。

同義アミノ酸のグループは表Ｉのように定義する。さら
に表■で下線を施した同義アミノ酸がより好ましく、そ
して最も好ましいのは、それぞれの同義アミノ酸のグル
ープがＸααそれ自体の単一のアミノ酸からなることで
ある。

Ｓｅｒ　　　　　Ｓａｒ、Ｃｙｓ −４ｒ　ｇ　　　　　Ａｒ−ｇ　、Ｈｉ　ｓ　、　Ｌｙ
　５Ｌｅ１ｔ　　　　　Ｌａｗ、ｌ１ｔｒ、Ｍｇｔ、Ｐ
ｈｅＰｒｏ　　　　　Ｐｒｏ、Ａｌａ Ｔｈｒ　　　　　　　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　　　　Ａｌａ、Ｐｒ。

Ｖａｌ　　　　　Ｖａｌ、Ｍｇｔ、ｌ１ｔｒＧｌｌ　　
　　　Ｇｌｙ Ｐｈｅ　　　　　　　Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ
、ＬｇｕＴｙｒ　　　　　　Ｔｙｒ、Ｐｈ１ Ｈｉｓ　　　　　　Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇＧｌｎ　　
　　　　　Ｇｌｎ、ＧＩＸＬ、ＨｉｓＡｓｎ　　　　　
　Ａａｎ、Ａｓｐ Ｌｙｓ　　　　　　Ｌｙｓ　、Ａｒｇ Ａｓｐ　　　　　　Ａｓｐ、Ａｓｎ Ｇ　ｌ　ｕ　　　　　　Ｇｌｕ、ＧｌｎＴ　７　ｐ　　
　　　　Ｔ　ｒ　ｐＣ ｙｓ　　　　　　　Ｃｙｓ 本発明は、式Ｉのアミノ酸が１つ、あるいは多数の位置
で置換したポリペプチド（下記の式■（推定される天然
配列）で定義されるポリペプチドのアミノ酸と同義アミ
ノ酸の間での置換）を含むものである。本明細書におい
て、”Ｎ−残基の置換”とは、式Ｉで定義されるポリペ
プチドのうち、本来の配列のＯ−４個のアミノ酸が、Ｏ
−Ｎ個の同義アミノ酸で置換されたポリペプチドのグル
ープを記述するのに用℃・られる。例えば、式Ｉの１残
基置換のポリペプチドのグループとは、好ましい同義ア
ミノ酸についてみれば１８２通りのポリペプチドのグル
ープのことであり、より好ましい同義アミノ酸について
みれば５０通力ということである。

ヒトＰＩＦのポリペプチドのグループは、式Ｉのポリペ
プチドが１０残基置換されたものからなるのが好ましい
。又、式Ｉのポリペプチドが５残基置換されたものから
なるのはさらに好ましく、式Ｉのポリペプチドが１残基
置換されたものは同好ましい。最も好ましいのは、本発
明のポリペプチドが次式で定義される元来のアミノ酸配
列からなるものである。

Ｇｌｕ−１１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−８ａｒ−Ａｌａ−Ｌ
ａｗ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｇｕ−Ａｌ
ａ−Ｌｇｕ−Ｌａｗ−８ｉｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ
−Ｔｈｒ−Ｌｇｕ−Ｌｇμｍ１１ｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−ＬｇｌＬ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−Ｈｉ　５−Ｌｙｓ−ＡｓＴ
Ｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｇｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｗ
−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−１１ｅ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌａ１Ｌ−Ｇｌｓ−Ｓｇｒ−Ｇｌｎ−
Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇ１７Ｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
ＶａＬ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｌｇｕ−１１ｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−１１ａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｘ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｍｔｒ　
ｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−１１ｇ
１０ｌ１ｅ−１１。

（式■） 同様に式Ｉのポリペプチドに関して″Ｎ−残基の挿入”
とは、式Ｉによって定義さｎる配列に１個からＮ個のア
ミノ酸が挿入された一連のポリペプチドを記述するのに
用いられている。挿入するアミノ酸は、挿入部位に隣接
するどちらか一方のアミノ酸の、好ましい同義アミノ酸
（表Ｉ）のなかから選択するのが好ましい。さらに好ま
しいのは挿入部位に隣接するどちらか一方のアミノ酸の
、より好ましい同義アミノ酸（表１）のなかから選択し
て挿入するときである。例えば、１残基挿入ペプチドグ
ループの１つのサブグループとして、Ｎ末端のＸ　（Ｇ
　ｌ　１Ｌ）とそれに隣接するＸ（ＩＩｇ）の間にアミ
ノ酸を挿入したものがある。このサブグループに挿入さ
れるものとしては、ＧＬｕ、Ｇｌｎ。

Ｍｅ　ｔ　、Ｐｈｅ、　ＩＩ　ｍ　、ＶａｔおよびＬｇ
ｕ　の中から選択するのが好ましく、Ｍｔｒｔ、Ｌｔｒ
ｕ、ＩＬｅおよびＧｌｕから選択するの１；さらに好ま
しい。最も好ましいのはＩｔｓとＧｌｕから選択するも
のである。挿入は式Ｉの隣接する何れのアミノ酸の間に
も可能である。１１１個の挿入可能部位があり、同じ部
位で多（の挿入が可能であるから、式Ｉの２残基挿入ペ
プチドとしては、１１１Ｘ１１１＝１２，３２１通りの
ペプチドのグループが生じ、それぞれの大きさは、挿入
部位に隣接するアミノ酸の同義アミノ酸グループの大き
さに左右される。

式ｌのポリペプチドに関して″Ｎ残基の欠落゛とは、式
■で定義される配列から１個からＮ個のアミノ酸が欠落
した一連のペプチドのグループな記述するのに用いられ
る。従って式Ｉの１残基欠落のポリペプチドとは、それ
ぞれ長さ１１１個のアミノ酸（１１１−残基）、１１２
通りのサブグループからなる。そして、それぞれのサブ
グループはすべて１１１−残基からなり、置換の多様性
によって、好ましい、あるいはより好ましい、又は最も
好ましい同義アミノ酸のグループとして定義される。

式１の配列に関する欠落及び式Ｉの配列に関する挿入と
いう点で一連のポリペプチドを定義するときは、まず、
挿入によって定義される一連のポリペプチドを形成し、
次にそのそれぞれについて欠落によって定義される一連
のポリペプチドを形成する。これらのペプチドをすべて
あわせたものが挿入及び欠落によって定義される一連の
ポリペプチドになる。

本発明はさらに、式Ｉのポリペプチドをコード可能な核
酸配列、及び式Ｉの好ましい、より好ましい、又は最も
好ましい同義アミノ酸グループからなるポリペプチド部
分をコード可能な核酸カセットをも含むものである。こ
こで”核酸カセット。

とは、１０−１２０塩基の核酸であって、（１）その中
に式Ｉで定義されるポリペプチド部分をコードする核酸
配列をもち、（１１）その終末に、該核酸とその相補鎖
を含むクローニング又は発現ベクターに関してユニーク
な制限酵素エンドヌクレアーゼ認識部位を持つことによ
って定義される核酸を意味する。以下により詳細に説明
するように、核酸カセットはＰＩＦの突然変異体を構築
するのに用いられる。

本明細書全体を通して、アミノ酸、核酸、エンドヌクレ
アーゼなどの命名には標準的な標記法を用いる二例えば
Ｃｏｈｎ、“α−アミノ酸の命名と標記法″、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｔＬＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０６巻、３
−１７ページ（１９８４年）ＩＷｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　；　Ａ　Ｐｒｏｂｌｅｍｓ　Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ、第２版（Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｍｇｎ１　ｏ
　Ｐａｒｋ、　１９８１年）及びＲｏｂｅｒｔｓ　、″
制限エンドヌクレアーゼの指針”、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６８巻、　２７−４０ペ
ージ（１９７９年）。

本発明をさらによく理解するために、図面に基づいてよ
り具体的に説明する。

第１図は、ｐｃＤ発現及びクローニングベクターを構築
するために用いられる、ｐ、Ｌｌ及びｐｃＤＶ１プラス
ミドの制限酵素認識部位と、主要なコード領域を示す図
である。

第２図は、マウスＰＩＦの核酸配列と、予想されるアミ
ノ酸配列を示す図である。

本発明には、Ｅｏ−Ｃ８Ｆ活性及びＢＣＤＦ活性を示す
ヒト多機能性免疫因子が含まれる。これらの因子は１１
４と命名したｐｃＤ発現ベクターのプールから標準的な
トランスフェクションのテクニックを用い、さらに生化
学的に精製して直接生産されるか、ある（・は、プール
１１４のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａから、まず上記の活性をコード
する単一のｃＤＮＡクローンを単離し、次に、単離した
ｃＤＮＡを増殖させ発現させるか、又は、単離したｃＤ
　ＮＡを突然変異タンパクを生産できるように修飾する
か、あるいは、単離したｃＤＮＡ又はその突然変異体を
利用して、他の哺乳動物種の遺伝子又はｃＤＮＡライブ
ラリーで、本発明の因子をさらにコードすることのでき
る類似配列をもったｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをさがすなどして生
産されるのである。

プール１１４はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）のもとに孕託番号６７２６７とし
て保管されており、これは５３７±２３のｃＤＮＡクロ
ーンを含んでおり、少なくともそのうちの１つが本発明
の多機能性免疫因子をコードしている。

本発明のポリペプチドと核酸を合成、利用、同定するテ
クニックについては以下に概括して論じである。！Ｖｆ
殊な細胞種、ベクター、試薬などを利用して一般的なテ
クニックの応用がなされているいくつかの特殊な例につ
いては後述する。

１、デ・ノボ（ｄｇ　ｎｏｖａ　）でのＰＩＦｃＤＮＡ
の調製 現在、ｄｅ　？ＬｏｖｏでのｃＤＮＡの調製とクローニ
ング、及びｃ　Ｄ　ＮＡライブラリーの構築については
（・ろいろな方法が利用できる。例えば最近の総説とし
て、Ｄｅｈｅｒｔｙ、　”　ｃＤＮＡのクローニングと
発現”、Ｇｏ　ｔ　ｔ　ｇ　ｓｍａｎ編、Ｍｏ１ｓｃｕ
ｌｏｒ　ＣｇｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ、第１０章（Ｊｏｈ
ｎ　ＷｉＬｇｙ　＆　５ｏｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５年）及びＢｒａｘｄｉｓ
ら、”ｃＤＮＡライブラリーの調製と特異的遺伝子配列
の検索”Ｓｅｔｌｏｗら編、Ｇｇ？Ｌｇｔｉｃ、　Ｅｎ
ｇｉｎｇｇ−ｒｉｎｇ、　８巻、２９９−３１６ページ
（ＰｌｇｎｗｍＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１
９８６年）。

例として希望する活性を示すポリペプチドを生産する細
胞（例えば形質転換していないヒトＴＩｆＩ１３胞のソ
ース）から全ｍ　ｎ　Ｎ　、４を抽出する（例えばＢｅ
ｒｇｅｒ、　Ｓ、、らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１
８巻、５１４３−５１４９ページ（１９７９年）に報告
されている）。

２本領ｃＤＮＡはこの全ｍ　Ｅ　Ａ’　Ａからブライマ
ー開始の逆転写を用いることにより、（Ｖｅｒｍｓ　、
　Ｉ。

Ｅｉｏｃｈｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　　４
７３巻、１−３８ページ（１９７７年）、まずはじめに
それぞれのｍ　ＲＮ　Ａ配列の相補鎖を合成し、次に、
ブライミングにより２番目の鎖を合成して（Ｌａｎｄ　
、　Ｈ，ら、ｈｈｔｃｌｇｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｇｓ、
　９巻、２２５１−２２６６ページ、（１９８１年））
構築することができる。

次に、このｃＤＮＡは、適当なプラヌミド又はバクテリ
オファージのベクターに相補的な相同性末端（Ｅｆｓｔ
ｒａｔｉａｔｉａｄｉｓ、　Ａ、らＣｅ１ｌ、　１０巻
、５７１−５８５ページ（１９７７年））あるいは、適
当な制限酵素認識部位を含む連結部分でつくった結合末
端（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｎｌａｒ　Ｃ１ｏ
？Ｌ−ｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ
ｕａｌ　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、、　Ｎ、Ｙ、　１９８２年）を使
って組み込み、それから適当な宿主を形質転換すること
により、クローニングできるのである。

（一般的には、Ｅｆａｔταｔｉａｄｉｓ、　Ａ、とＶ
ｉｌＬα−ＫｏｒｍＯ，ｒｏ　ｆｆ　、　Ｌ、　、　”
　２本領ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローニング、Ｓｅｔｌｏｗ
、　Ｊ−とＨｏ１ｌａａｎｄｅｒ、　Ａ、編、ＧＩ＋ｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｓｎｅｇｒｉｎｇ、　１巻、ＰＬｇｎ
ｕｔｎ　Ｐｕｂｌ−ｉ８んｉｎｇ　　Ｃｏｒｐ、Ｎ、Ｙ
、、Ｕ、Ｓ、Ａ　　（１９８２年）を参照せよ。

希望するポリペプチドをコードするｍ　ＲＮ　Ａの好ま
しい材料としては、上清にＥｏ−ＣＳＦ及び／又はＩＱ
Ａ増強因子（ＩＱＡ−ＥＦ）活性、あるいは、本発明の
ポリペプチドに関連した他の活性を含む細胞がよい。そ
うしたものの１つの系列として、マウスＴ細胞系列Ｃ１
，Ｌｙｔ＋２−１９（ＡＴＣＣ模帆番号ＡＣＲＬ８１７
９）がある。（Ｎａｂｍｌ、Ｇ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　
２９１巻、３３２−３３４ページ（１９８１年））。一
般に適当なＴ細胞は、哺乳動物（例えばヒト）の肺臓、
扁桃腺、や、末梢の血液のような、いろいろな材料から
手に入れることができる。

末梢血液の’１’−＋）ンパ球から単離したよ５なＴ−
細胞クローンもまた利用できよう。（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　　ｉｒＬ　ＩｒｎｍｕｎｏＬｏ
σｙ、ＤＯ，んｍａｒ、Ｈ，とＨａａｆ、　Ｖ、編；セ
クションＤ：′″ヒトＴ細胞クローン″、第８巻、２４
３−３３３ページ：Ｅｌｓａ−ｖｉｇｒ　５ｃｉｅｒｎ
ｃａ　ＰｌＬｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎ、Ｙ、　（１９８５
年）を参照せよ。） こうした細胞による、ＰＩＦをコード可能なｍ　ＲＮ　
Ａの生産は、抽出したｍ　ＲＮ　ＡをＸｅｎｏｐｕｓｌ
　ａ　ｅ　ｖ　ｉ　ｓ　ノ卵母細胞ヘマイタロインジエ
クションすることにより確認することができる。このマ
イクロインジェクションのテクニックはより詳細には以
下に記述があり、一般的に開示されている、Ｃｏｌｍａ
ｒｓら、”　ＸｇｎｏｐｌＬｓ　ｌａｇｖｉｓの卵母細
胞からのタンパク輸送”、Ｃｅ１ｌ、１７巻、５１７−
５２６ページ（１９７９年）及びＭａｎｉａｔｉｓら、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏ？Ｌｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

３５０−３５２ページ（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１
９８２年）。

もし希望するＰＩＦをコードするｍ　ＲＮＡが全ｍ　Ｒ
Ｎ　Ａのほんの少数部分であるときは、目的とするｃＤ
ＮＡクローンを検出するスクリーニング伍が実際的なも
のになるよう、その分画の濃度をふやしてやる必要があ
るかもしれない。そのような方法は技術的には標準的な
ものであり、いくつかの論文や文献に開示されている。

例えばＭａｎｉａｔｉｓら、２２５−２２８ページ、先
に引用；　５ｗｇｇ５ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　７８巻、６６１３−６６１７ページ（
１９８１年）　；　Ｐａｒｎｅｓら１Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
Ｌ、Ａｃａｄ、Ｓ、ｔ、、　７８巻、２２５３−２２５
７ページ（１９８１年）；Ｄαシイ８ら、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１巻、２１９４−２１９
８ページ（１９８４）など。

ＰＩＦ　　ｃＤＮＡのｄｇ　ｎｏｖａで調製する好まし
い方法は、　ＯｋａｙａｍαとＢｅｒｇによって開発さ
れたｐｔＤ発現系（”機能的クローニング′）における
ｃ　Ｄ　Ａ’　Ａの機能的発現に依存している。この系
についてはＭａ’１．Ｃｅ１１．Ｅｉｏｌ、第２巻、１
６１−１７０ページ（１９８２年）及び第３巻、２８０
−２８９ページ（１９８３年）に開示がらジ、ファル７
ンア（Ｐｉａｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、　）から大手可
能である。

ｐｃＤ発現ベクトルにはＳＶ４０初期プロモーター、後
期スプライシング連結部位及び複製開始点が含まれる。

このベクターはｐｃＤプラスミドの複製にＴ抗原を供給
するＣ０８７サル細胞に挿入するｃ　Ｄ　Ａ’　Ａの発
現をもたらす。　ｃＤＮＡライブラ１ノーのスクリーニ
ングは、ＤＥＡＥ−７キストラ／を用いたプラスミドＤ
ＮＡプールのＣＯ３７細胞へのトランスフェクションを
含んでいる。リンホカインと、とりわけＰＩＦは、分泌
タンパクであるので、トランスフェクションを受けた細
胞の上清は、数日のインキュベーノヨンの後生理活性を
アッセイすることができる。トランスフェクションの後
生理活性をもつ単−ｅＤＮＡクローンを同定するため、
陽性のプールはさらに分画される。

簡単には、ＯｋαｙａｍαとＢ　ｅ　ｒ　ｇ　　の発現
ベクターは以下のように構築される。ポリアデニル化し
たｍ　ＲＮ　Ａは、ｋｐｆＬＩで切断された？；Ｖ４０
初期プロモータ一部位を含むｐＢＲ３２２プラスミドの
はみでた鎖につけたポリデオキシチミジン酸Ｃｐｏｌｕ
−ｄｅｏｚｙｔｈｙｍｉｄｉｃ　ａｃｉｄ　）　（オリ
ゴｄＴ）末端に結合する。即ちベクター全体がｃＤＮＡ
合成のプライマーとして作用する。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合
成した後、３′−ポリデオキシシチジン（ｐｏｌｙｄｅ
ｏｚｙｃｙｔｉｄｙ−ｌαｔｅ）ＣオリゴｄＣ）末端を
つけ、できたＤＮＡをＨｉｎｄｌＪｆ　　で切断する。

このＨｉｎｄ　Ｉｌｌは一方のオリゴｄＣ末端のついた
５Ｖ４０ＤＮＡ部分を（憔。

■特異的な部位で）切断する。ＳＶ４０初期プロモータ
ーはそのまま残り、偶然生じた挿入部分のＨｉｎｄ■部
位はｃＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドがＨｉｎｄ■によ
る切断に対し、抵抗性を示すため、最小限の影響しか受
けない。別に構築した３′−ポリグアニジルｉ＊　（ｐ
ｏｌｙｇｍｎｉｄｙｌｃＬｔｇｄ　）　（オリゴｄＧ）
末端をもつＨｉｎｄｆｊｌ断片は、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩに
よる切断で残されていた粘着末端と結合する。ベクター
を環化させ、Ｅ、ｃｏｌｓ　ＲＮａｓｇ　Ｈ，ＤＮＡポ
リメラーゼ１１及びＤＮＡリガーゼで処理してＲＮＡ鎖
をＤＮＡでおきかえる。ベクターをＥ、ｃｏｌｉでクロ
ーニングし、ＣＤＮＡライブラリーを作成する。ＳＶ４
０成分がベクターを原核細胞中と同様に、有核細胞中で
も発現させることになり、特に、Ｃ０８７サル細胞ある
いはチャイニーズ・ノ・ムスター・卵細胞（Ｃｈｉｎａ
ｓｅ　ｈａｍｓｔｇｒ　ｏｖａｒｙ）　（ＣＨＯ）のよ
うな唾乳動物の細胞でのベクターの発現を可能にする。

一度、Ｏｋａｙａｍα／Ｂ　ｅ　ｒ　ｇプラスミドにお
けるｃ　Ｄ　ＮＡライブラリーが完成すると、ｃＤＮＡ
クローンは集められ、無作為に、プールについて、例え
ば・・イブリッド選択、発現生成物の抗原決定基の検出
及び／又は機能的なアッセイなど標準的な手順により、
希望するｃＤＮＡが存在しているか、を検査する。陽性
のプールについては、次に、誘導Ｔ細胞系列由来のｃＤ
ＮＡで探索することができる。

そのようにして、陽性の探索されたプールを凹々のクロ
ーンに分画し、さらに、（培養哨乳動物細胞のような）
適当な宿主をトランスフェクションさせて試験をしたり
、さらに宿主の上清についてその活性をアッセイしてみ
る。

ここで開示されたｃ　Ｄ　Ｎ　ＡはＰＩＦをコードすＳ
核酸のｄａ　ｎｏｖｏでの単離及びクローニングに代わ
るものとして、異なる細胞種において類似配列を同定す
るプローブとして用いることができる。標準的なテクニ
ックとして、例えばＣａ１ｌａｈａｎら、四マウス唾乳
動物腫瘍ウィルス・ゲノム（ＭｏｕｓｇＭａｍｔｎａｒ
ｙ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｓｓ　Ｇｇｓｏｍｇ）に関した
ヒトＤＮＡ配列の検出とクローニング″Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　７９巻、５５０３−５５０７ペ
ージ（１９８２年）及び、特にＢｇｌｔｚら、７フイル
ター・ハイブリダイゼーション法による、多重遺伝子族
の単離及び類似構造の決定”、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏＬｏｇｙ、１（１０巻、２６６−２８５ペー
ジ（１９８３年）に従った。

簡単には、本発明のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを（例えばＭａｆＬ
ｉａｔｉｓら、（先に引用）のような標準的なテクニッ
クを用いて）プローブを構築するのに用いて、ＰＩＦ生
産をして（ハるものと思われる細胞種のゲノム又はｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー（これも標準的なテクニックに
より構築する）とのハイブリダイゼーションをそれほど
厳重でない程度でスクリーニングする。

例えばＧｒｕｎｓ　ｔ　ｅ　ｉｎ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｅｉ。

７２巻、３９６１−３９６５ページ（１９７５年）又は
ＢａｎｔｏｔＬら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０
−１８３ページ（１９７７年）の標準的なスクリーニン
グ方法に従う。

■、タンパク工学によるＰＩＦ突然変異タンパクの調製 天然のタンパクについて、いったん核酸配列ヤアミノ酸
配列についての情報が利用できるようになると、天然の
配列に事実上いかなる突然変異をも生じさせる、いろい
ろなテクニックが利用できるようになる（、　Ｓｈｏｒ
ｔｌｇ、５ｃｉｅｎｃ＃、２２９巻、１１９３−１２０
１ページ（１９８５年）には、本発明に応用可能な核酸
に突然変異を生じさせるテクニックを総括している。天
然ＰＩＦの突然変異体、即ち、ＰＩＦ突然変異タンパク
は、部位特異的オリゴヌクレオチド配向性の突然変異に
よって生産するのが好ましい。特に、ＺｏｌｌｇｒとＳ
ｍ１ｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｘｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、１０　０巻、４６８−５（１０ページ（１９８
３年）、及びＭατにら、Ｕ、Ｓ、特許４，５１８．５
８４″ヒト組み換えインターロイキン−２突然変異タン
パク”を参照せよ。

るるいは、Ｗａｌｌｓら、Ｇｅｎｇ、３４巻、３１５−
３２３ページ（１９８５年）、Ｅｓｔｇｌｌら、５ｃｉ
ｅｎｒ：ｅ＋２３３巻、６５９−６６３ページ（１９８
５年）、及びＭｓｌｌｇｒｂａｃｈら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、２６１巻、７１９−７２２ページ（１９８
６年）　、Ｆｅｒｇｔｔｉら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、８３巻、５９７−６０３ページ（１９
８６年）などに記述されているいわゆる゛カセット”突
然変異により生産するのがよい。

以下では、突然変異タンパクを同定するのにＥｓｔｇｌ
ｌら（先に引用）による用いられている命名法に従い、
−膜化する。

例えば、′ヒトＰＩＦ突然変異タンパクＬａｊｔ２”（
あるいは文脈上、天然のタンパクがわかる場合には単Ｋ
　”　Ｌ　ｅ　ｕ２″と記すが）とは、Ｎ末端から２番
目の残基、ＩｌａがＬａｗに置換された以外は天然のタ
ンパクと同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドを示し
ている。同様に１個以上の置換をもつ突然変異タンパク
は、例えば２位のＶｇｌがＬａｘに、１２位のＬｇｕｆ
Ｊ″−Ｉｒｇに置換されたものは、ヒトＰＩＦ突然変異
タンパク（Ｌｇｓ２．１１ｇ＋２）のように呼ぶ。欠落
については“△′Ｓ″のよりに示す。

例えば、４位のＴｈｒが欠落した突然変異タンパクは、
ヒトＰＩＦ突然変異タンパク△４のように呼ぶ。

挿入については、”ＩＮ（Ｘａα）′８”のように示す
。

例えば６位のＡｌａのあとにＬ＋ｕが挿入した突然変異
タンパクは、ヒトＰＩＦ突然変異タンパクＩＮ６（Ｌａ
ｗ）のように呼ぶ。このようにして、ヒトＰＩＦ突然変
異タンパク（Ｓｕｒ”、△’、　、ＩＮ６（Ｌａｗ″３
は、天然ヒトＰＩＦの配列の１１位のＴｈｒをＳａｒで
置換し、４位のＴｈｒが欠落し、６位のＡｌａの直後に
Ｌｇｓが挿入して修飾した配列を表わしている。

同一部位に複数のアミノ酸が挿入したものは、ＩＮ’（
ＸａａＩ　Ｘαα２−Ｘαα３＝、−−）のように示し
、ここでＸαα１−Ｘαα２−Ｘαα３・・・・・はｉ
位のあとに挿入された配列を示している。Ｎ−末端への
付加は、例えばＩＮｏ（Ｘαα）のように０”を使って
表わし、例えば６−１０位のアミノ酸が欠落した配列に
ついては、△６−１０又は（△６、△７、△８、△９、
△１０）のように命名する。

ζトＰＩＦ突然変異タンパクを生産するには、カセット
突然変異を用いるのが、最も好ましい。以下により詳細
に記述するように遺伝子にそって大体規則的に位置して
いる特異的なエンドヌクレアーゼ認識部位により、合成
ヒトＰＩＦ遺伝子を構築する。”特異的”ということは
、遺伝子を適当なベクターに挿入したとき、これらの制
限酵素認識部位がその捷ま保存されることを示している
。特異的制限酵素認識部位により、遺伝子の一部を、簡
便に削除したり、希望する突然変異タンパクをコードす
る合成オリゴヌクレオチド（即ち６カセント”）で置換
することができるのである。

特異的制限酵素認識部位の数と分布を決定する上で、（
１）　　発現に用いるベクター中にもとから存在した制
限部位、（２）希望する種又は属に特異的なコド／の使
用、（３）　　制限エンドヌクレアーゼが切断しないも
ので、合成遺伝子中、いくつの制限部位をもっているか
、さらに＋４１　　％異的な制限部位の間で、遺伝子部
分を合成し、そして／又は配列をきめる上での簡便性と
信頼性、などといったいくつかの要因を考、意に入れな
ければならない。

ｉｆ的に、１式では、仮想的天然ヒトＰＩＦ配列に関し
て保存的なアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠落によ
る一連のポリペプチドを定義している。ここで用いた”
保存的な”と、いうことには、（１）ソのｆ化がコンホ
ーメーションに関して、できるだけ中立であるというこ
と、即ち、突然変異体ポリペプチドを天然のヒトＰＩＦ
と比較して、その三次構造における変化を最小なものに
すること、そして、（ｌｆｌ　　抗原性に関してできる
だけ中立であるということ、即ち、突然変異体ポリペプ
チドを天然のヒトＰＩＦと比較してその抗原決定基にお
ける変化を最小なものにすることを、意味している。

コンホーメーションに関して申立であることは、その生
理活性を維持する上で望ましいことであり、また抗原に
関して中立であることは、患者の免疫応答をひきおこさ
せないという点で望ましい。

絶対的確実性を°もって、コンホーメーションと抗原性
に関して申立な改変アミノ酸残基な選択することは困難
ではあるが、この分野に精通した者が、扁い確率でコ／
ホーメーションと抗原性に関して中立な改変を行５上で
指針となる法則がある。

例えばＡ７＞ｙｉｓａ？Ｌ（先に引用）、及び１３ｇｒ
ｔｏｆｓｋｙ＋５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９巻、９３２−
９４０ページ（１９８５年）。

やや重要な法則のいくつかを次に記す。山　疎水性残基
はタンパク分子の内部に位置していることが多いため、
これらを置換しても、抗原性に関してそれほど変化を与
えそうにない。（例、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、先に引用）
。（２＋　　同様な物理化学的性質をもつ、即ち、同義
の残基で、置換ビても、置換したアミノ酸ともとのアミ
ノ酸は、同様な構造的な役割を演じることができるため
、コンホーメーションに関して、それほど変化を与えそ
うにない。（３）進化的に保存されているということは
、その配列が憬能的に重要であることを示唆しており、
それ故、これらの配置を変化さセることは、有害なコン
ホーメーション変化をひきおこす可能性がある。

突然変異タンパクの配列を選択する際のこのように基本
的な法則に加え、生理活性及び設計された分子のコンホ
ーメーションを確認する上で、アッセイが利用できる。

本発明のポリペプチドの生物学的アッセイについては、
以下により詳細に記述する。コンホーメーショ／の変化
は、少なくとも２つの有名なアッセイにより試験するこ
とができる。１つは、タンパクの三次荷造の進化の研党
ニ広く利用されている、ミクロ補体固定法（ｍｉｃｒｏ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏ
ｄ　）、例えば、　Ｗａａｓｇｒｍａｎら、Ｊ　、Ｉｍ
ｍｕｎｏ　ｌ　、　＋　８７巻、２９０−２９５ページ
（１９６１年）又は、Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｆｒ７Ｌｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　１１巻、９２８
−９３６ページ（１９６７年）；１つは、一連のコンホ
ーメー７ヨン特異的なモノクローナル抗体に対する親和
性をみるものである。例えばＬｅｗｉ　ｓら、Ｂｉｏｃ
ｈｇｍｉｇｔｙ、　　２２巻、９４８−９５４ページ（
１９８３年）。

■、生理活性のアッセイ Ａ、　　ＩＱＡ−増強因子活性 ＩｇＡ−ＥＦ活性は標準的なインタイブ特異的酵素結合
イムノンルベントアツセイ（ｉｓｏｔｙｐｅ−ｇｐｇｃ
ｉｆｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｒｎｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔα５ｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）テクニッ
クを用いてアッセイすることができる。これは、免疫グ
ロブリン分泌細胞に増殖、分化するように刺激を受けた
一定数の精製Ｂ細胞によって生産される各種インタイブ
の量を定量的に測定するものである。インタイブの増強
は、増強物質と思われる物質の存在下、あるいは非存在
下に刺激を受けたＢ細胞によって生産される。例えばＩ
ＱＨのような１つのイソタイプの相対量を比較して決定
する。ＣｏｆｆｍａｎとＣａｒｔｙ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ　、１３６巻、９４９−９５４ページ（１９８６年）
は、そのような測定を意図した重要なＥＬＩＳＡアッセ
イを開示している。このアッセイには、イソタイプ特異
的な抗体の利用ヲ必要としており、これは商品として利
用できるし、又は、以下に記述する標準的なテクニック
により手に入れることができる。又、このアッセイでは
、一定数の精製Ｂ細胞が必要であり、これは標準的なテ
クニックを用いることにより入手できる。例えば、Ｃｏ
ｆｆｍａｎとＣａｒｔｙ　（先に引用）ｏＢａ胞はアッ
セイするＰＩＦと同一の種から入手するのが好丑しい６ イノタイプの抗血清は、例えばウサギのような宿主動物
を、Ｆｒｅｕｎｄのような適当なアジュバント（αｄｕ
ｖａｎｔ　）　ｌＰｓ希望するイノタイプのモノクロー
ンとともに、感作することにより得られる。

抗血清は、希望しないイノタイプの免疫グロブリンを結
合させた５ｅｐｈａｒｏｓａ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、）又は、ＡＩｆｔ−Ｑ
ｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）のアフィニティー・カラムを
通すことにより、重鎖特異的なものに精製するのが好マ
シい。抗血清から得た抗イソタイプの抗体は、次に、希
望するイソタイプのモノクローナルな免疫グロブリンを
結合させたアフィニティー・カラムに結合させ、さらに
溶量させる。この後者のモノクローンは、宿主動物を感
作させるのに用いたモノクローンとは異なる結合特異性
をもつことが好ましい。こうすることでイソタイプ特異
的な抗体に、イデ゛イオ・タイプ（１ｄｉｏ　ｔｙｐｅ
）％異的な抗体が混入するのを避けることができる。

イノタイプ特異的な抗体は、標准的なテクニック知よる
インタイブ特異的ＥＬＩＳＡ法の２段階目の試薬として
用いるように誘導される。例えば、年）。例えば抗体は
、ＮＩＰにトロヨード・フェニル（ｒＬｉｔｒｏｉｏｄ
ｏ−ｐｈｇｎｙｌ）　）−スクシンイミドエステル（ｓ
ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ　）　、ビオチン（
ｂｉｏｔｉｎ）スクシンイミドエステル（Ｅｉｏｒｅｓ
ｇａｒｃん。

Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ　）などによって誘導でき
る。

精製Ｂ細胞は、非Ｂ細胞上の表面マーカーに特異的なモ
ノクローナル抗体て非Ｂ細胞を選択的に殺すことにより
得るのが好ましい。Ｂ細胞の材料としては末梢血液、牌
滅及び扁桃が含まれる。

ネズミ白米のＴ細胞個渇牌細胞懸濁液は、肺臓片を２（
１０−メツシュのワイヤー・スクリーンに通すことによ
ジ調製する。次に、細胞懸濁液を洗浄し、氷上、抗−Ｔ
ｈｙｌ、２（例えば、ＡＴＣＣにＴｌＢ１０７の愛耗番
号で保管されているハイブリドーマ３０−Ｈ−１２が生
産する）を１５分間インキュベートする。細胞を、次に
遠心にかけ沈澱させ、１０％ウサギ補体（Ｌｏ−Ｔａｘ
　Ａ／　。

Ｃｅｄａｒｌａｎｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ
ｏｒｎｂｙ、０ｎｔａｒｉｂ。

Ｃａｎａｄａ　）甲に再び懸濁させ、２５　ｍＡ（ＨＥ
ＰＥＳ。

ｐＨ７，２及び０３％ウシ血清アルブミンを含むＰＲＭ
Ｉ５６４０培地中に稀釈する。細胞は、補体と３７°Ｃ
４５分間インキュベートする。死んだ細胞はＦｉｃ、ａ
ｌｌ　（８度１．１１９　Ｓ’　／　ｒｎｌｌＳｉｇｍ
ａ。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
で遠心をして取り除く。

別の方法として、精製Ｂ細胞は、例えばＴｈシー１　、
Ｌ３Ｔ４　（例えばハイブリドーマＧ　Ｋ　１．５から
；　ＡＴＣＣ魂耗番号ＴＩ’Ｂ２０７）、Ｌｙｔ−２（
例えば、ハイブリドーマ５３−６．７２から；ＡＴＣＣ
層屁番号ＴＩＥ１０５）１．ｒｖＡｃ−ｘ（例えばハイ
ブリドーマＭｌ／７０　；　ＡＴＣＣ傍託番号ＴｌＢ１
２８）などのモノクローナル抗体の混合物とインキュベ
ートし、さらに、上述したような補体処理及び最終的に
遠心をして死細胞を取９除く、ことによって調製するこ
とができる、 アッセイのための細胞数をふやしたヒトＢ細胞は、Ｔ細
胞を分離するために、２−アミノエテル−イソチオウロ
ニウム・ブロマイド（２−ａｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ−ｉ
ｓｏｔｈｉｏｕｒｏｎｉｌＬｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）で処
理した１ヒツジ赤面球とくり返しロゼツト形成させるこ
とにより生産できる。例えば５ａｘｏｎら、Ｊ　、　Ｉ
ｍｎｕｔｎ　ｏ　ＩＭｅｔｈ、、　１２巻、２８５ペー
ジ（１９７６年）。

次にロゼツトを５ａｘｏｎら（先に引用）により開示さ
れたようにして、Ｆｉ　ｃ　ｏ　ｌ　ｌ−Ｈｙｐａｑｗ
ｓのグラジェントにかけ取り除く。Ｂ？ｆｍ胞の精製度
は、例えばＣｏｗｌｔｅｒ（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ　）
のＥｌ（Ｂ細胞特異的）とか、　Ｅｅｃｔｏｎ−Ｄｉ、
ｋｉｎｓｏ？Ｌ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ。

ＣＡ）のＬｅｕ−１（Ｔ細胞特異的）とか、０ｒｔｈ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＨＡ　）
の０ＫＴＩＬ（Ｔ細胞特異的）などのフベルした七ツク
ローナル抗体を使うことにより、Ｂ細胞やＴ細胞特異的
な抗原に対して陽性の細胞分画を決定することにより、
アッセイすることができる。こうしたアッセイにおいて
は、Ｔ細胞の混入は、１％以下であることが好ましい。

別の方法としてＴ細胞は、例えば−ジ（１９８２年）に
記述されているように、抗Ｚ、ｇｓ−１及びウサギ補体
で処理することにより取り除くことができる。

精製したＢ細胞は、Ｂ細胞を免疫グロブリン分泌細胞に
させるよった物質あるいは、物質の組み合わせ（ここで
は総称して刺激物質とよぶ）で、刺激してやる。（ここ
で、そのようにして刺激物質にさらされたＢ細胞を刺激
を受けたＥ？ｆｆＢ胞とよぶ）。ある化合物のインタイ
ブ増強又は抑制活性は、刺激を受けたコントロールのＢ
細胞とその化合物にさらされて刺激を受けたＢ細胞によ
って生産される各種イソタイプの相対量を比較すること
により決定する。マウスＢ細胞では、リポポリサンカロ
イド（ｌｉｐｏｐｏｔｙｓａｃｃｈａｒｉｄｇ）　（Ｌ
ＰＳ　）が好ましい刺激物質である（例えばＳａ１ｍｏ
ｎｅｌｌαｔｙｐｈｉｍｗｒｉｗｔｎのＬＰＳはＳｉｇ
ｍａから利用できる）。

ヒトＢ細胞では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｗｓ　ａｕ
ｒｓｕｓＣｏｗａｎ（（ＳＡｃ　）　（例えばＣａ１ｂ
ｉｏｃｈｅｎｒｌＰらＰａｎ５ｏ−ｒｂ　ｉｎの商品名
で（１０１％溶液が利用できるし、Ｆａ　ｌ　ｋ　ｏ　
ｆｆら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２９巻、９７−１０
２ページ（１９８２年）が記述した方法により調製でき
る）、それと、Ｂ細胞分化因子（ＢＣＤＦ　）の標準量
が好ましい刺激物質である。ＢＣＤＦは、例えば末梢血
液から単離されたヘルパーＴ細胞をマイトジェンで刺激
したものの培養液上清、あるいは、Ｍａ　ｙ　ａ　ｒら
、　Ｊ、Ｅｚｐ、Ｍｇｄ、　、１５６巻、１８６０−１
８６５ページ（１９８２年）に記述があるように、本質
的に生産されたー・イブリドーマの培養液上清から供給
することができる。

精製したマウスＢ細胞は丸底の、９６−ウェルプレート
（例えばＦｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｌｌｉａｓ、Ｍｃ
ＣＬｅａｎＶＡから利用できる）あるいは、コンテナー
のようなものの中で、ＲＰＭＩＩ６４０培地（ＧＩＢＣ
Ｏ）にペニシリン、ストレプトマイシン、クルクミン、
２−メルカプトエタノール（５ｘ　１０−’　Ｍ　）、
１０係胎児ウシ血清（例えば、Ｈｙｃｌｏｎａ、Ｌｏｇ
ａｎ、ＵＴ）、さらに約４マイクログラム／　ｍｌのＬ
ＰＳを加えたものを、濃度が約０．５−１．　ＯＸ　１
０’　セル／ｍｅになるようにして培養する。精製した
ヒトＢ細胞は、同様なコンテナー中で、Ｙｓｓｇｌの培
地（Ｙｓｓｇｌら、Ｊ　、　Ｉｍｒｒｕｂｎ　ｏ　ｌ　
、Ｍｅ　ｔ　ｈ　、　６５巻、５５−６３ページ（１９
８４年）に０．０１％ＳＡＣ及び約５　Ｘ　１０’セル
／　ｒｎｌの標準量のＢＣＤＦを加えたもので培養する
。いずれの場合も、−８後、アッセイする試料の稀釈し
たものを、例えばＱ、　ｌ　ｍｅづつ培養プレートに加
え、５−７日インキュベートした後、培養液上清を収穫
してＥＬＩＳＡにかける。

イソタイプ特異的なＥＬＩＳＡは以下のようべして行う
。ポリビニルクロライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ　）　９６−ウェル・プレート（Ｄｙｎａｔａ
ｃｈ。

Ａ１ｇｚａ？５ｄｒｉａ、　ＶＡ）を１時間、適当な濃
度０．５−２．０μｆ／ｒｒＬｌの１段階目のイソタイ
プ特異的な抗体でおおう。これらのプレートは、リン酸
で緩衝化した食塩水に０１％ウシ血清アルブミンと０．
０４％ＴｗａｍｆＬ２０を加えたものでふさぐ。標準曲
線溶液と試験する上溝とを（ｌ　ｌ　ｍｉになるよう加
える、ここですべての稀釈は、ＲＰＭ１１６４０に５％
胎児ウシ血清を加えたもので行う。室温で３時間後に、
プレートを一度、リン酸で緩衝化した食塩水に（１０４
％Ｔｗａｇｎ２０を加えたもので洗浄し、さらに、適当
な、濃度０．２５−２．ＯｐＹ／ｍｅのＮＩＰ又はビオ
チンと結合した２段階目の抗体で洗浄する。（ＮＩＰと
は、４−　ｈｙｄｒｏｚｙ　−３−１ｏｄｏ　−５−ｎ
１ｔｒｏｐｈａｎｙｌ　ａｃｅｔｉＣａｃｉｄのことで
ある）。

室温で１時間インキュベートした後、これらのプレート
は前のように洗浄し、さらに最適濃度のホースラディツ
シュ（西洋わさび）　（ｈａτｓｒｒαｄｉ−ｓＡ）パ
ーオキシダーゼを結合したモノクローナル抗ＮＩＦある
いはホースラディツシュ−パーオキシダーゼの結合した
アビジン（ατ１ｄｉｎ　）　（Ｖｍｃ−ｔｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＢｌＬｒｌｉｎｇａｔｎａ、
　ｃ　Ａ　）を加える。１時間後、プレートを洗浄し、
０．１ＭＮａ２ＨＰＯ４と０．０５Ｍクエン酸中、ｌ！
ｎ９／ｄ２，２’−アジ／ビス（３−エチル−ベンゾチ
アゾリン硫酸）　（２、２’　−ａｚｉｎｏｂｉｓ　（
３−ａｔｈｙｌ−ｂｇｎｚｏ−１ｈｉαｚｏｌ　ｉｎｇ
ｓ、ｘｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　）　（Ｓｉｇｍａ　）
と０．（１０３％Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を０．１ｍｌ
加える。

反応を０．２　Ｍクエン酸０．０５−を加えて止め、次
にプレートをＤｙｎａｔｔｃｈ　ＥＬＩＳＡ　読み取り
機などで読み取る。

Ｂ、ＢＣＤＦ活性 ＢＣＤＦ活性は、精製し増殖しているＢ細胞に免疫グロ
ブリンの分泌を誘導させる、その程度を測定することに
よりアッセイする。アッセイのいくつかの形式は、精製
Ｂ細胞が（先に定義した）刺激物質にさらされるかわり
に、分化させる（即ち免疫グロブリンを分泌するように
なる）のではなく、細胞周期を通して細胞の発達の開始
を誘導させるような物質に、精製Ｂ細胞をさらすという
点を除いては、ＩｇＡ−ＥＦアッセイと類似している。

例えば、Ｅｕｔｌａｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａ
、ａｄ。

Ｓｅｉ、　８１巻、２４７５−２４７８ページ（１９８
４年）。そのような物質をここでは、ＢＩＢ胞マイトジ
ェンとよぶことにする。分泌された抗体はＥＬＩＳＡ又
はＧｒｏｎｏｗｉｃｚらＥｕｒ　、　Ｊ　、　Ｉｍｍｕ
ｘｏ　Ｌ　。

６巻、５８８ページ（１９８６年）に開示されているリ
バース・ヘモリティック・ブレーク・アッセイ（ｒｅｖ
ｅｒｓｅ　ｈｔｒｒｎｏｌｙｔｉｃ　ｐｌａｑｕｓ　ａ
ｓｓａｙ　）によって決定することができる。ヒトの細
胞では、Ｂ細胞マイト−ジエンとして５ＡＣ（約０．０
１−０．（１０１％（９／ｖ）の濃度のもの）、ヒツジ
抗ヒトＩＱＭ鎖のＦ（ａｈ’）２フラグメント（例えば
Ｃａｐｐａ　１Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏｃｈ
ｒａｎｖｉｌｌａ、　ＰＡ　、から利用可能）などが含
まれる。使用する実際の濃度は用いる特定の実験系に対
して調整されなければならない。他のＢＣＤＦＣＤ上イ
は、Ｂ細胞マイト−ジエンを必要としない。例えば、以
下に示すネズミＢＣＤＦをアッセイするプロトコールで
は、Ｂ細胞マイト−ジエンは必要としていない。プロト
コール中、用いられる材料は以下の通りである。

細胞毒性培地（ＣＴＭ）は、全容積ＬｏｏｒｎｌのＲＰ
ＭＩ培地中（ＲＰＭＩ培地についての記述と文献につい
ては、ＡＴＣＣＣａｔａｌｏｇｕｔｒ　ｏｆ　Ｃｔｒｌ
Ｌ　Ｌｉｎｍ５＆　ＨｙｂｒｉｄｏｍｃＬｓ、第５版（
１９８５年）を参照せよ）、３．０２分画Ｖウシ血清ア
ルブミン及び６．０？ＨＥＰＥＳ　（双方ともＳｉｇｎ
α　より利用可能）を含む、１０倍貯蔵液を稀釈する。

最終的に稀釈する前に、１０　Ｎ　Ｎ　ａＯＨでｐＨ７
，２に調整する。以下に記すＣＴＭ及び他のすべての溶
液は、ペニシリン（５０Ｕ／ｄ）、ストレプトマイシン
（５０ｍｇｃ／ｍ／り、さらに硫酸ゲンタミシン（ｇａ
ｎｔａｍｉｃｉｎ　ｓｌＬｂｆａｔｇ　）　（５μ７／
−）を含み、０．２２マイクロメーターのメンブレン（
膜）を通して殺菌消毒する。ＭＤ培地はＲＰ　Ｍ　Ｉ中
、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（例えばＨｙｃｌｏｎ
ｇ　から）、５０マイクロモルβ−メルカプトエタノー
ル、１０ｍＭグルタミン及び１．　Ｏｍ　Ｍピルビン酸
ナトリウムである。プロトコールのすべてのステップは
４℃又は４℃付近の、滅菌状態で行うことが好ましい。

遠心は、２５０？で７分間行う。

Ｂ細胞は例えばＣ３Ｈ／ＨａＪメス・マウスなどの膵臓
で、できれば生後６〜８週間のものから入手する。

Ｂ細胞は以下のようにして精製する。膵臓細胞懸濁液は
、膵臓を焼結した２枚のガラス・スライドの間ですりつ
ぶすことにより、得る。１０％ＦＢＳを含む３５〜４５
づのＲＰＭＩを６〜１２個の膵臓を懸濁するのに用いる
。こうして懸濁した細胞は、遠心により集める。その結
果得た沈澱を１７０ｍ、Ｖ　ＮＨ４Ｃｔ、　４％ＦＢＳ
４０ｍ１．に再び懸濁させ、混在する赤血球細胞を破壊
する。その晋濁液をすぐに２．０−のＦＢＳに加え遠心
する。沈澱をＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳで洗浄し、懸濁し
な（なった細胞破壊物を注意深（取り除く。存在する細
胞の総数は、ヘモサイトメーター（ＡｇｍｏＣｙ−ｔｏ
ｍｇｔｇｒ）を用い、牌細胞懸濁液を既知の濃度に稀釈
して計測することにより決定する。上述の洗浄した沈澱
を、濃度を計算して１．０Ｘ１０７セル・−−１になる
よう細胞毒性培地（ＣＴＭ）中に再懸濁させる。

ウサギ補体によりＴ細胞を選択的に溶解させるには、上
述のＣＴＭ中の牌細胞懸濁液に、Ｔ細胞マーカーＴｈｙ
　１．２及びヘルパーＴ細胞マーカーＬ３Ｔ４に対する
モノクローナル抗体を加える。

抗−Ｔｈｙｌ、２及び抗Ｌ３Ｔ４はそれぞれ細胞系列３
０Ｈ１２及びＧＫｌ、５により供給される。使用するモ
ノクローナル抗体の量は３０Ｈ１２−又はＧＫｌ５の生
産する抗体を、次に以下に記述するＴ細胞を溶解させる
ステップで、ウサギの補体で処理するのであるが、その
とき殺すことのできる牌細胞の最大量に基いてきめられ
る。牌細胞−モツクローナル抗体の混合物を６０分、氷
上、インキュベートした後、細胞を遠心し、−回ＣＴＭ
で洗浄する。

使用するウサギ補体のそれぞれのバイアルに、内容物を
再懸濁させるため、１０−の滅菌ミル（ｍｉ　ｌ　ｌ　
）　−Ｑ　Ｈ２Ｏを加える。使用するバイアルを次にプ
ールし、等容量のＣＴＭで稀釈し、次にＭｉ　ｌ　ｌ　
ｓｚ　ＨＡとＭｉｌｌａｚＧＶのそれぞれ０．４５１１
ｍと０．２２μｍの２紙を重ねて濾過する。濾過したウ
サギ補体を次に、ＣＴＭで５倍稀釈し、全部で１０倍稀
釈になるようにする。この溶液を、上述の一度洗浄した
細胞ペレットが１．０Ｘ１０’セル・ｍｌ、−１の密度
になるよう再懸濁させるのに用いる。

抗体でインキュベートした細胞をウサギ補体を含むＣＴ
Ｍで再懸濁した後、３７℃で６０分間溶解をおこさせる
。

溶解のステップの後、生存能力のない細胞を取り除くた
めに、細胞懸濁液を遠心し、一度ＣＴ　Ａ／で洗浄し、
密度が２．５Ｘ１０’セル・づ−１になるようＣＴＭ中
、再懸濁させる、次にもはや再ヱ濁させることのできな
くなった、可視できるＩ細胞の残片を一回目の遠心にか
けた後、取り除く。この懸濁液の一部４．０罰をそれぞ
れ４．　Ｑ　ｍｌのＨｉｓｔｒ）ｐａｑｕａｌ　１１９
　（ＳｉｇｍａからＦｉｃｏｌｌタイプ４（１０）の上
に静かに重ねていき、類似しているが分離した不連続な
グラジェントを形成させる。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを含
むポリスチレン・チューブを、１１（１０ｘｒで２０分
間、室温で、プシーキをはずして、遠心する。それぞれ
のｆｉｃｏｌｌグラジェントから、界面をとりだし別々
にＣＴＭで５０ｍ１に稀釈し、遠心する。細胞ペレット
をあわせ、ＭＤ培地で二度洗浄する。最終的にＴａ胞を
涸渇させた肺細胞なＭＤ培地で密度が１．ｌＸ１０’か
ら１．５Ｘ１０５セル・ｍｅ−’の中間になるよう稀釈
する。最終的な収率は通常用いた細胞の１０％から２０
％の間になる。

この最終的な懸濁液から、９０μｔをＣｏｇｔａｒ　Ａ
／２９６−ウェル組織培養プレートに加える。細胞は、
テスト・サンプルとして加える前に、５％ＣＯ２インキ
ュベーター中、３７°Ｃで一晩培養する。

１．０〜５０μｔの容量のテスト・サンプルを加え、上
述したように、３〜４日間、培養液をインキュベートす
る。その後、培養液の上清を収穫し、５％ＦＢＳを含む
ＲＰＭＩ甲１（１０〜２２０倍に稀釈し、上述したＥＬ
ＩＳＡによって分泌される免疫グロブリンを試験する。

別にもう１つの、ヒト因子のＢＣＤＦＣＤ上イでは、ヒ
ト・リンパ芽球細胞系列ＣＦ、；Ｓにおける１？Ｇ　生
産の増加を測定するが、これは、ＡＴＣＣから入手番号
ＴｌＢ１９０により入手可能で、Ｂｒ１ｔ。

Ｊ、Ｈａｅｒｎａｔｏｌ、、５１巻、５９５−６０４ペ
ージ（１９８２年）、及び、Ｊ、Ｉｍｍｗ？Ｌｏ１．、
　１２７巻、４１２ページ（１９８１年）に記述されて
いる。

Ｃ，Ｅｏ−Ｃ３Ｆ活性 ヘモボエテン（ｈａｍｏｐｏｉｇｔｉｃ）前駆細胞から
の好酸球の成長と発達は、標準的な、コロニー刺激因子
（Ｃ８Ｆ）アッセイによって測定する。即ち、前駆細胞
をＣＳＦ活性をもつと思われる化合物を含む標準ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ培地にうつす。コロニーを成長させ、発達さ
せた後、形成されたコロニー眩、形成されたコロニーの
大きさ、さらに、例えばマクロファージとか巨核球とか
好酸球などのコロニー中に存在する細胞の種類を決定す
る。いろいろな細胞の種類を測定するのに明瞭に定義さ
れた範ちゅうを用いる。例えば、グルタルアルデヒド（
ｇｌｕ、ｔａｒａｌｄｓｈｙｄｅ　）で固定した後、好
酸球はＬｌＬｚｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂ１５（Ｑ特異的に染
色する。

Ｃ３Ｆ活性を決定するには、例えば骨髄細胞又は胎児素
状組織血液細胞などのへモボエチン細胞は単一細胞懸濁
にしておく。個々の細胞は、次に栄養分及び通常胎児つ
７血清を含む準固形（寒天）又は粘性の（メチルセルロ
ース）培地に゛固定”する。適当な刺激因子（例えばテ
スト・サンプルに含まれるもの）の存在下で個々の細胞
は増殖し、分化していく。はじめに細胞を固定してから
、細胞が増殖し成熟するにつれ、コロニーが発達してい
く。これらのコロニーを７〜１４日後に、記録すること
ができる。Ｅｕｒｇｅｓｓ、Ａ、、ＧｒｏｗｔｈＦａｃ
ｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｓ１ｌｓ、（成長因子
と幹細胞）、５２−５５ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８４年〕。（顆粒球
とマクロファージの成育への特殊な応用については、Ｂ
ｒａｄｅｌｙ、Ｔ、　トＭｅｔｃａＬｆ、Ｄ、Ａｕ５ｔ
、Ｊ、Ｅｚｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍ’ｇｄ、Ｓｃｉ、４４巷、
２８７−３（１０ページ（１９６６年）、さらに、一般
的Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｂｅｒｌｉｎ　（
１９７７年）を参照せよ。）もし希望するなら、個々の
コロニーを抽出し、顕微鏡のスライド上にうつし、Ｗｒ
ｉｇｈｔとＨｇｎｒｙｆｆ！（１９７４年））で＝Ｗし
、染色することができる。単一コロニーあたりに存在す
る、細胞の種類の形態的な分析は次に決定することがで
きる。非血液病患者から採集した骨髄細胞をＦｉｃｏｌ
ｌ（タイプ４（１０、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ。

Ｓｔ、Ｌｏｘｉｓ、ＭＯ）上ＶＣＭｔ２、遠心Ｌ（６（
１０Ｘｒ）、さらに界面の辿施をとｐ除く。こｎらの細
胞を、１０％胎児ウシ血ｍ（ＦＣ３）ｙ含むｌ５ｃｏｕ
ｅの痔飾Ｄｗｌｂｅｃｏ　　培地で２度洗浄し、同一培
地に再懸濁させる。さらに固着した細胞はプラスチック
のペトリ・ディツシュに固着させて取り除く。非固着細
胞は、２０％ＦＣＳ、　　５０μＭ２−メルカプトエタ
ノール、０．９％メチルセルロースサラに、いろいろな
濃度のコロニー刺激活性を含むことを知られている上清
か、あるいは、テスト上清を含むｌ５ｃｏｖｅの培地に
１０！ｌセル／　ｍｌになるようにして加える。ｌ　ｍ
ｅを３５藺ペトリ・ディツシュにとり、３７°Ｃで、十
分湿り気を帝びた６％ＣＯ２を言む気流中で培養する。

培養をはじめてから、３８後Ｋ、ｌユニットのエリスロ
ボエチン（ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｏｉｅｔｉｎ）をそれぞ
れのプレートに加える。顆粒球・マクロファージ・コロ
ニー及び赤血球の破裂は、１０〜１４日目に、反転顕ｇ
説を用いて記録する。

ヘパリン中に採集した素状組織血液細胞は６（１０×１
で遠心する。血漿と赤面液細胞のピークの間の界面の白
血球細胞を０．１７＃塩化アンモニウムと６％ＦＣ３を
含むチューブにうりす。氷上、５分後に懸濁液を４ｍ１
ＦＣＳを下層に加え、６（１０×７で遠心する。細胞ペ
レットをＤｗｌｂｅｃｃｏのリン酸で緩衝化した食塩水
で洗浄し、Ｆｉｃｏｌｌを通して、骨髄細胞について上
述したようにプラスチックに固着させる。低密度の非固
着細胞を集め、上述した準固形培地中１０’セル／培地
になるようにする。

アッセイの終わりに、個々のコロニーをガラス・スライ
ドにのせ、Ｗデミ　ｇｈ　ｔ　−Ｇｇ　１ｒｎｓ　ａで
染色したあと、細胞組成を決定する。上述したように、
好酸球については、Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ　
（Ｊｏｈｎｓｏｓ。

Ｇ、とＭｇｔｃａｌ　ｆ　、　Ｄ、　Ｅｚｐ、　Ｈｇｍ
ａｔｏｌ　、　８巻、５４９−５６１ページ（１９８０
年））で染色して決定する。

Ｄ、ＢＣＧＦ　　ｎ活性 マウスでは、Ｂ細胞成長因子Ｉｆ　（ＢＣＧＦ　　ｎ）
として知られるＢ細胞成長因子は、次の２つの別々のア
ッセイに基いて定義されてきた。（１）次の硫酸デキス
トラン（ｄｇｘｔｒａｎ　ｓｘげａｔｅ　）にさらした
とき正常な精製Ｂ細胞の増殖を刺激する能力、及び（２
）　ｉｎ　ｖｉτｏ−ｐＣＬｓｓαｇｇｄ　ＢＣＬｌ−
リンパ腫細胞の増殖をｉｎτ１ｔｒｏで増大させる能カ
ニＳｗｃＬｉｎとＤｕｔＬｏｎ、　Ｊ、　Ｅｚｐ、　Ｍ
ｅｄ、　１５８巻、２１ページ（１９８２年）、及びＳ
ｗａｉｎら、Ｊ、Ｅ：ｐ。

Ｍｇｄ、　１５８巻、８２２ページ（１９８２年）。こ
れらはＢＣＧＦＩ［アッセイを記述した重要な文献であ
る。ＢＣｔ、細胞は、ＡＴＣＣからやに番号ＴｌＢ１９
７で入手可能であり、Ｎａｔｕｒｅ　、　２７２巻、６
２４−６２６ページ（１９７８年）、ｌｍｍ１Ｌｎｏ、
　Ｒｅｖ、　４８巻、１６９−１９５ページ（１９７９
年）及びＪ、　Ｉｍｒｒｎｂｎｏｌ　、　１２５巻、９
７６−９８０ページ（１９８０年）に記述されている。

硫酸デキストランに基＜　ＢＣＧＦ　■アッセイでは、
上述したようにして、正常のＢ細胞を調製し、次に５ｅ
ｐｈαｄａｚＧ−１Ｏカラムを通す。細胞を次に一連の
稀釈したテスト・サンプルとともに濃度が（ミクロ稀釈
プレートの）ウェルあたり０．１−巾約５　Ｘ　１０’
セルになるようにして（上述したように）培養する。増
殖の度合は、例えば収穫６時間前に、１２５Ｉ−ウリジ
ン（１Ｌｒｉｄｉｎｅ　）を添加するなど、放射性前駆
体でパルス・ラベリングすることによりいろいろな時間
経過後に決定する。細胞は放射性前１駆体を添加する前
に少なくとも７２時間は成育させておくことが好ましい
。

ＢＣｌ、に基くアッセイではマウス（ＢＡｒ、Ｂ／ｃＢ
ｙＪ又はＢＡＬＥ／ｃＪが好ましい）から肺臓をとり除
き、ＢＣｌ、腫瘍をつくらせ、（細胞の回収率は、マウ
スあたり８Ｘ１０’から１．３Ｘ１０’まで変動がある
）、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで正常のＢ細胞にしたのと同じ様
にしてＴｈ１１−１．２モノクロ一ナル抗体と抗Ｌｙｔ
−２．２モノクローナル抗体に補体を加えたもので処理
する。その結果得られる細胞を５Ｘ１０５／ｒｎｌにな
るよう再懸濁し、５　Ｘ　１０’の細胞を０．１　ｍＺ
の培地中、ミクロ８沢培養液に加えていく。テスト・サ
ンプルは１０又は２０μを容加える。増殖については、
正常ＢＮａ胞について上述したのと同じようにして、い
ろいろな時間で決定する。ＢＣｌ、細胞は、また、ヒト
ＢＣＧＦ　ｎａに対しても応答するものと信じられてお
り、それゆえ、ヒ）ＥＣＧＦＩ［のアッセイについても
用いることができる。

■、精製及び薬剤の組成 Ｅ、ｃｏｌｉ、酵母（イースト）あるいは他の細胞中で
発現させた本発明のポリペプチドは、硫安沈澱、カラム
クロマトグラフィーによる分画（例えば、イオン交換、
ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィ
ーなと）、さらに究極的な結晶化などといった標準的な
技術手段に従って精製することができる。（一般的には
”酵素の精製と関連テクニック”、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ＥｆＬｔｙｍｏ−１ｏｙｙ、　２２巻、２３３−５
７７ページ（１９７７年）ｌａｇ、　）Ｊｒｗ　Ｙｏｒ
ｋ　（１９８２年）を参照せよ。）いったん部分精製又
は均一なものにまで精製された本発明のポリペプチドは
、例えば細胞成育培地の補助剤（例えば最小必須Ｅαｇ
ｌｅ培地、Ｉｓｃ、ｏｖｇの修飾Ｄｕｌｂｇｃｃｏ培地
又はＲＰＭ１１６４０、これらはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｓｔ、　Ｌｏｗ−ｉｓ、
ＭＯ）、ＧＩＢＣＯＤｉｖｉｓｉｏｎ　（Ｃｈａｇｒｉ
ｎＦａｌｌｓ、ＯＨ）から購入できる）や、イムノ・ア
ッセイや免疫螢光染色などに有用な特異的免疫グロブリ
ンの誘導抗原物質として、研究目的に利用することがで
きるであろう。（一般的にはＩｍｍｕ　ｎ　ｏ　−１ｏ
ｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１巻、第■巻、Ｌｅｆ
ｋｏｖ−ｉｔｓ、　１．とＰｇｒｎｉｓ　、　Ｂ、編、
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、＃ｇｗ　Ｙｏｒｋ、　
Ｎ、Ｙ、　　（１９７９年、１９８１年）及びＨａｎｄ
ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｃｐａｒｉｔｎｅｎｔａｌ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｗｅｉｘ、Ｄ、編、ＢＬａｃｋｗａｌｌ　５ｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ　Ｐｕｂ　−１ｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｓｔ、　
Ｌｏｗｉｓ、　Ｎｏ　（１９７８年）を参照せよ。

本発明のポリペプチドは、また、例えば各種の感染に対
する自然防御を増強させるといった薬剤の組成にも用い
られよう。こうして、リウマトイド関節炎や移植を必要
としている患者、あるいは、がんの化学療法、老齢、免
疫抑制物質などにより免疫不全に陥いった患者をそのよ
うなポリペプチドで治療することができるがもじれない
。その組成は単独で、又は、その分野に精通した者には
よ（知られている他の物質と併用することにより、選択
的に免疫系の各種構成系を刺激することができる。

本発明により記述されるポリペプチドを含む薬剤の組成
物を調合するには、これらポリペプチドは望むらくは活
性をもたない、薬剤として用いることのできるキャリア
ーと混合し、化合するのである。その調合に用いる適当
なキャリアーと工程については、その技術分野において
はよく知られている。（例えばＲａｍｉｎｇｔｏｎ、ζ
ｓ　Ｐｈａｒｍａｃａｕｔｉ−ｃａｔ　　　５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ　　　αｎｄ　　Ｕ、Ｓ　　Ｐｈ　ατｍａｃｏ
ｐａｉａ　　：Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｆｏｒｍｗｌａｒ
ｙ、Ｍａｃｋ　　ＰｕｂｌｉｓんｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ
、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｆ　Ａ　（１９８４年）を参照せ
よ。）投薬の方法としては、非経口のものが好ましくメ
カニカル・デリバリ−・システム（ｍｓｃｈ−ａｎｉｃ
ａＬ　ｄｇｌｉｖｇｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　）の利用も含
められる。

好ましくは薬剤の組成は単位用量の形をとるのがよい。

そのような形では、調剤は適量の活性組成物を含む単位
用量づつに小分けするのである。

調剤の単位用量あたりに含まれる活性化合物の量は、個
々の適用例や活性成分の強さに応じて１μ２から１（１
０１１９の間で変化させ、又は調整する。

もし望まれるなら、その組成にまた、他の治療物質を含
めることができる。

用量は、患者の要求や、治療している状態の厳しさや、
用いている個々の化合物に応じて変動することもあろう
。ここで使っている“有効量パとはこれらの要因を考慮
したときの用量をし・う。個々の状況について適当な用
量を決定するのは、技術の熟練度の範囲内の問題でちる
。一般的に治療は、化合物の最適用量エリも少ない小用
量で始められる。それから、その状況で最適な効果があ
られれるようになるまで少量づつ用量を増やしていく。

簡便のため、−日あたりの総用量を１日あたり何回かに
分けて投与する。

■１発現系 いったん、本発明のｃ　Ｄ　Ａ’　Ａがクローニングさ
れると、本発明のタンパクの生産に広範な発現系（即ち
宿主−発現ベクターの組み合わせ）が利用できる。宿主
細胞として可能なものには別に制限があるわけではない
が、バクテリア、イースト、昆虫、＠乳動物などが含ま
れる。発現系を選択し、それによるタンパク生産の最適
化を図るためには、数多くの要因を考慮し、比較する必
要があり、その要因には以下のものが含まれる。

（１）発現されるタンパクの性質、例えばそのタンパク
が宿主となる生物にとって有毒な場合もあるかもしれな
い、又、宿主のプロテアーゼ（ｐｒｏ−ｔａαｓｇ）に
よって分解を受けやすいかもしれない、あるいは、宿主
によっては不活性型のコンホーメーションや不溶性の形
をとって発現するかもしれない。（２）目的とするタン
パクに相当するメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の性
質、例えばｍ　ＲＮ　Ａが宿主のエンドヌクレアーゼに
よって特に分解を受けやすい配列をもっていて、そのた
めにｍ　ＲＮＡの機能的な寿命が大幅に減少したり、あ
るいは、ｍ　ＲＮ　Ａが開始コドンやリボンーム結合部
位を隠してし捷うような２次構造をとって、それにより
ある種の宿主で、イニシェーションやトランスレーショ
ンを阻害してしまうかもしれない。

（３）プロモーター、５’−、３’−保護配列、リホソ
ーム結合部位、転写ターミネータ−、エンノ・ンサー、
ポリＡ付加部位、キャップ部位、イントロン・スプライ
シング部位など、コドン領域に隣接する３／−、Ｓ／−
領域において、発現をコントロールする宿主と両立する
配列をどのように選択し、利用し、配置するか。

（４）　　タンパクが、宿主によって加工可能な、分泌
シグナル配列をもっているか、又は、宿主に固有のシグ
ナル配列をコードしている発現コントロール配列が、成
熟タンパクをコードしている領域の上にスプライシング
されなければならないか、どうか。

（５）宿主のトランスフェクション又はトランスホーメ
ーションの利用用式と効率、あるいは、一時的な発現と
安定な発現のどちらが望ましいか、（６）タンパクの発
現に望ましい宿主培養系のスケールとコス）、（７）ｌ
−ランスレージョンの後に望まれる修飾のタイプ、例え
ば、望まれる糖化（ｇＬｙｃｏ−ｓｙｌａｔｉｏｎ　）
の程度と種類により宿主の選択が影響されるかもしれな
い。ＵｙとＷｏｌｄ、　ＳｃｉｇｆＬｃｇ。

１９８巻、８９０−８９６ページ（１９７７年）参照。

（８）発現タンパクを宿主細胞及び／又は培地のタンパ
クや他の物質から容易に分離できるか、例えば、ある場
合では、後での精製段階を楽にするため、特別なシグナ
ル配列をもつタンパクを一緒に、発現させてやるのが望
ましいこともある。

（９）選択した宿主中における、特定のプラスミドの安
定性とコピー数、例えばＨｏｆｓｃｈｎｅｉｄａｒら１
９８２年）、（１０）さらに、本分野に精通した者に知
られている要因、などが挙げられる。

以上列挙した要因に関して、特定の発現系を選択し、（
又は）修飾する際に助けになる総説は数多い。例えばそ
のうちの少しを挙げると、いくつかのＥ、ｃｏｌｉ発現
系に関する総説としてｄａ　Ｂｏ−ｇｒと５ｈａｐａｒ
ｄ、　　”大腸菌における外来遺伝子の発現を最適化す
る戦略゛、２０５−２４７ページＫｒ　ｏ　ｏ　ｎ編、
Ｇｇｎｇｓ　：　５ｔｒｕｃｔｖｒｅ　ａｎｄ　Ｅｘｐ
ｒｇ−ｓｓｉｏｔＬ　（Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｇｙ　　＆
　　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ。

１９８３年）；原核生物のプロモーター一般に関する総
説としてＭｃＣ１ｕ７ｇ″原核生物における転写開始の
メカニズムとコントロール”、　Ａ？Ｌ？Ｌ　Ｒｇ−ｖ
−Ｂｉｏｃｈｇｍ、　５４巻、１７１−２０４ページ（
１９８５年）；原核生物と真核生物の転写の終了に関す
る総説として、Ｆｌａｔ　ｔ　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　。

５５巻、３３９−３７２ページ（１９’８６年）；哨乳
動物細胞のトランスフエクショ／とトランスホーメーシ
ョンの方法に関する総説として、ＫｌＬｃｈｇｒＬａｐ
ａｔｉら、Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１６巻、第４号、３１１９
−３７９ページ（１９８４年）、及びＢａｔｓａｒｊｉ
ら、ジ（１９８３年）　；　Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるタ
ンパク分泌に関する総説として０１ｉｖｓｒ、　Ａｎｆ
Ｌ、　Ｒｅｖ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３９巻、６１５−６４８ペー
ジ（１９８５年）；真核生物宿主と両立できるいくつか
のベクターのＤＮＡ’Ｊ製に関する総説として、Ｃａｍ
ｐｂｅｌｌ　、Ａ？Ｌ％、Ｒｅｖ、Ｅｉｏｃんｇｍ、、
５５巻、７３３−７７１ページ（１９８６年）などが挙
げられる。

同様にして、特定のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを連結し又操作する
上での技術や条件、そして本発明に利用する上で適当な
発現ベクターを作成し、又、修飾する発現ル制御配列に
ついて記述した数多くの総説が利用ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、　、　１９８２
年）、ｒｏａｃｈ、第１巻及び■巻（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ、　０ｘｆｏｒｄ。

ｌａｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎ、Ｙ、　、　１９８４年）な
どで、これはと（少数にすぎない。一般的に発現ベクタ
ーの中で、本発明のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの挿入に際し、いろ
いろな部位を選択できよう。これらの部位は通常、これ
を切断する制限エンドヌクレアーゼによって命名し、こ
れらは技術に熟凍したものにとってはよ（認識されてい
る。ＤＮＡ配列をこれらの部位に挿入し、組み換えＤＮ
Ａ分子を作成する方法についても、いろいろな方法がよ
く知られている。これらには例えばｄＧ−ｄＣ又はｄＡ
−ｄＴ末端法、・直接ライゲーション、合成連結配列、
エキソヌクレアーゼとポリメラーゼと連結し、つづけて
ライゲーションさせる修飾反応、あるいはＤ　Ｎ　Ａポ
リメラーゼによるＤＮＡ鎖の伸長、さらに適当な単鎖の
鋳型に、つづけてライゲーションさせる方法、などが含
まれる。

本発明のｃＤＮＡを含むベクターは、宿主培養細胞にト
ランスフェクションと／又はトランスナーメーションを
おこさせる前に大量に獲得しておかなければならないこ
ともしばしばである。この目的のために、ベクターは、
最終的に発現に用いるもの以外の生物（クローニング・
宿主）中で顕著に発現させることなく複製することもし
ばしばであるゎそのような場合には、繁殖させた後、例
えばＭａｎｉａｔｉｓら（先に引用）により開示される
ような標拳的なテクニックを用いてクローニング宿主か
らベクターを分離しておく。

適当な原核生物の発現ベクターとして、例えば、ＣｏＩ
Ｅｌ、ｐＧＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＡｆＢ９などのＥ、
　ｃｏｌｉ由来のプラスミドやその誘導体、ＲＰ４のよ
うな広範な宿主に適したプラスミド、さらにラムダ、フ
ァージのようなファージＤ　Ｎ　Ａやその誘導体などが
含まれる。さらに真核生物のタンパクな原核生物のペプ
チドと融合させずに、又は融合させて発現させるＥ、ｃ
ｏｌｉのベクターについてＭａｎｉＬＬｔｉｓら（先に
引用）の１２章に記述がある。

Ｒｉｇｇｓらは、さらにＥ、ｃｏｌｉの発現系を米国特
許４，４３１，７３９で開示している。

通常、用いられる原核生物のプロモーターにはβ−ラク
タマーゼ（β−１ａｃｔａｍａｓｓ　）　（ペニシリナ
ーゼ（ｐａ？Ｌｉｃｉｌｌｉｎａｓｅ　）　）及びラク
トース　プロモーター系が含まれる。（ＣｈａｎｇらＮ
ａｔｕｒｅ。

２７５巻、６１５ページ（１９７８年）；Ｉｔａｋｗｒ
ａら、Ｓｃｉｔｒｎｃｇ、　１’９８巻、１０５６ペー
ジ（１９７７年）　；　Ｇｏａｄｄｔｒｌら、Ｎａｔｕ
ｒｇ、　２８１巻、５４４ページ（１９７９年））。さ
らにトリプトファン・（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏ
ｇｄｄｓｌら、Ｎｕｃｌｇｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、　　８巻、４０５７ページ（１９８０年）　；　ＥＰ
ＯＡｐｐｌ　Ｐｕｂｌ、　／Ｗｘ（１０３６７７６）も
含まれる。これらは最も普通に用いられているのである
が、他の微生物のプロモーターも発見され、利用されて
いる。その核酸配列の詳細についても報告があり、熟練
した研究者はそれらを機能的にプラスミド・ベクターと
連結させたりしている。例えばＳｉｓｂｇｎｔｉｓｔら
、Ｃａ１ｌ、２０巻、２６９ページ、（１９８０年）。

Ｅ、　ｃｏｌｉ中で高度に発現させる特に有用な原核生
物のプロモーターは、ｔａｃプロモーターであり、ｄｓ
　Ｂｏｅｒにより米国特許４，５５１，４３３に開示さ
れている。Ｅ、ｃｏｌｉ宿主については、分泌発現ベク
ターもまた利用できる。特に有用なものはｐｌＮ−■−
ｏｍｐＡベクターで、ＧｈｒａｙｅｂらＫより、ＥＭＢ
ＯＪ、３巻、２４３７−２４４２ページ（１９８４年）
に記述があり、ここで転写すべきｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、成
熟したタンパクをバクテリアの原形質中への分泌をひき
おこす。ｍｐＡタンパクのシグナル・ペプチドをコード
するＥ、　ｃｏｌｉ　ＯｍｐＡ遺伝子部分へ融合させる
。同様にして米国特許４．３３６，３３６及び４，３３
８，３９７では原核生物の分泌発現ベクターとして特に
有用なものを開示している。

数多くのバクテリアの菌株が原核生物の発現ベクターの
宿主として適当であり、これには、Ｗ３１１０　（ＡＴ
ＣＣ％２７３２５）、ＪＡ２２１、Ｃ６（１０、ＥＤ７
６７、ＤＨｌ、ＬＥ３９２、ＨＢ１９１、ＸＬ７７６（
ＡＴＣＣＡ６３１２４４）、Ｘ２２８２、ＲＲＩ　（Ａ
ＴＣＣ／１６３１３４３　）ＭＲＣＩのようなＥ、ｃｏ
ｌｉの株、ＥａｃｉｌｌｕａＳｗｂｔｉｌｕｓ　（枯草
菌）の株、他にＳａｌｍｏｎｏｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉ−やＳｇｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓ−Ｃａｎｓのよ
５な腸内細菌の株、さらに各種ＰｓｇｕｄｏｍαＳなど
が含１れる。例えばＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２Ｘｌ　７
７６のような有核生物のタンパクの発現に有用なバクテ
リアの菌株を誘導する一般的な方法がＣ１Ｌｒｔｉｓ　
ｍにより米国特許４，１９０，４９５に開示されている
。

酵母（イースト）のような有核微生物もまた、本発明の
タンパクを発現させるのに用いることができる６　５ａ
ｃｃｈａｒｏｌｒＬｙｃｓＪｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又
は通常のパン酵母は、有核微生物のうちで最も普通に用
いられている、一方、数多くの他の菌株も普通に用いら
れている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｇｓ中で発現させる
には、プラスミドＹＲｐ７を使うことができる、例えば
Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８２巻、
３９ページ（１９７９年）　、　Ｋｉｎｇｓｒｎａｎら
、Ｑ　ｇ　ｎ　ｅ　＋７巻、１４１ページ（１９７９年
）、及びＴｓｃｈ−ａｍｐｓｒら、Ｇ　υ！　、　１０
巻、１５７ページ（１９８０年）。このプラスミドはす
てにｔｒｐｌ遺伝子を含んでおり、これは例えばＡＴＣ
Ｃ／１６４４０７６又はＤＥＰ４−１　（Ｊｏｎｅｓ、
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　８５巻、　１２ページ（１９７
７年））のようにトリプトファン中では成育する能力を
欠いた酵母の突然変異株の選択マーカーとなっている。

酵母の宿主細胞ゲノムに特徴的なｔｒｐ　１障害が存在
することで、ドリフトファン非存在下で成育させトラン
スホーメーショ／を検索する上で有効な状況をもたらし
てくれる。さらに他の酵母のベクターとしては、ｐＧＡ
Ｌプラスミドが含まれ、これはＭｉｙａｊｉｍｃら、Ｎ
ｌＬｃｌｇｉｃ　Ａｃｉｄｇ　Ｒｇｓｔｒａｒ：ｈ、　
１２巻、６３９７−６４１４ページ（１９８４年）に開
示されており、また２μｍプラスミドがＢｅ　ｇｇ８．
　Ｎａ　ｔｌＬｒｎ　。

２７５巻、１０４−１０９ページ（１９７８年）に開示
されている。

酵母ベクター中の適尚なプロモーター配列には、３−ホ
スホグリセレートキナーゼ（３−ｐｈｏｓｐｈ−ｏｇｌ
ｙｃｓｒａｔｅ　ｋｉｘａｓｇ　）に対するプロモータ
ー（Ｈｉ　ｔ　ｚ　ｅｍａｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｒｎ、　、　２５５巻、２０７３ページ（１９８０
年））、或いは、エノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ　）、グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌ
ｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　）、ヘキソキナーゼＣ
ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ　）、　ピルビン酸デカルボキシ
ラーゼ（ｐｙｒｒｂｖａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｚｙｌａ
ｓｅ　）、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｆ
ｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ　）、グルコース−６−リン酸
インメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ　−６−ｐｈｏｓｐんａ
ｔｅ　ｉｓｏｍａｒａｓｇ　）、３−ホスホグリセリン
酸ムターゼ（３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｔｒａｔｅ　
ｒｎｕ−１ｃＬ８ｇ　）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒ
ｕｖａ　ｔ　ｇ　ｋ　１ｎ−ＬＬＳ＋）、）リオースー
リン酸インメラーゼ（ｔｒｉｏｓｇ−ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ　ｉｓｏｍａｒａｓｇ　）、ホスホグルｒ−ス＝イソ
メラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇＬｌＬｃｏｓｇｉｓｏｍｇ
ｒａｓｇ　）、グルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓ
ｇ）などの糖分解酵素のプロモーターなど（Ｈｅ　ｓ　
ｓら、１７巻、４９（１０ページ（１９７８年））が含
まれる。適当な発現プラスミドを構築する上で、これら
の遺伝子に関連した末端配列もまた、発現ベクターの配
列の３′末端に隣接して連結し、ポリアデニル化して末
端とする。さらに成育状態によって制御された転写とい
った利点をもつ、他のプロモーターとしてアルコール　
デヒドロゲナーゼ２　（ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｔｒｈｙｄ
ｒｏｇｅｎａｓｅ　２　）、イソチトクロームＣ（ｉｓ
ｏｃｙｔｏｃＰＬｒｏｍｅ　Ｃ）、酸ホスファタ−ゼ（
ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　）、窒素固定に関
連した分解酵素、前述のグリセルアルデヒド−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ、マルトースやガラクトースの利用
に関連した酵素ＣＨｏＬＬａｎｄ、先に引用）などのプ
ロモーター領域がある。また、別の制御可能なプロモー
ターとしては、メタロチオネイン（ｍａｔａｌｌｏｔｈ
ｉｏｆＬｅｉｎ　）プロモーターが重要で、ＦｏｇｓＥ
らにより米国特許４，５１１，６５２に開示されている
。実質的には、すべて酵母と両立しうる。

プロモーター、複製の開始点及び終末点配列を含むプラ
スミドベクターであればどんなものでもよい。

分泌発現ベクターもまた、例えばＭｉｙａｊｉｍａら、
Ｇａｎｇ、　３７巻、１５５−１６１ページ（１９８５
年）に開示されるｐＭＦ２８　：Ｈｉｔｚ−ｇ　ｍ　ａ
　ｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、　　２１９巻、６２０−６２
５ページ（１９８３年）に開示されるＹＥｐｌＲＴ：４
６４２−４６４６ページ（１９８４年）及びＢｒａｋｅ
によりＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ０１１６２０１により開示されるｐＹ（ＩＥ
ＧＦ−２１：ＳｉｎｇｈによりＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａ
ｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ０１２３５４４に開
示されるプラスミドなどＳ、　ｃｇｒｔｒｖｉｓｉａｇ
宿主について利用可能である。

原核生物と真核生物の微生物に加え、多細胞生物由来の
細胞で構成される発現系もまた、本発明のタンパクを発
現するのに用いることができる。

とりわけ興味深いのは哺乳動物の発現系であり、これは
、トランスレーション後のプロセシング機構が、生理活
性哺乳動物タンパクをより生産しやすいものであると思
われるからである。いくつかのＤＮＡＱ焉ウィルスが哺
乳動物宿主に対するベクターとして利用されている；例
えばＴｏｏｚｔら、ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ、第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ−ｔｓｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ　、Ｙ、　、　１９８
１年）をその生物学の総説として参照せよ。特に重要な
ものには、例えばＯｋａｙａｍαとＥｇｒｇにより開発
さ３巻、２８０−２８９ページ（１９８３年）Ｋ開示さ
れているｐｃＤベクター；　ＨａｆｒＬａｒによりＧｇ
ｎｇ−（１９８０年）及び米国特許４，５９９，３０８
　　に開示されているＳＶ４０ベクター；さらに、Ｋａ
ｌＬｆｍａｎと３ｈａｒｐによりＭｏ１．　Ｃｔｒｌｌ
、　Ｅｉｏｌ、　。

２巻、１３０４−１３１９ページ（１９８２年）及びＫ
ａｕｆｍａｎらによりＥｌＬｒｏｐａａｎ　Ｐａｔｅｎ
ｔ　Ａｐｐ−１ｉｃａｔｉｏｎ　８４０６１０７に開示
されているアデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　）
制御要素を含むベクターなど、バクテリアの複製制御配
列と組みあわせた５Ｖ４０−複製、トランスクリブ７ヨ
ン、と又はトランスレーション制御配列から構成される
故多くのベクターがある。サル細胞が上記のベクターに
対して通常宿主として好まれる。さらに、そのようなベ
クターは完全ｔＡ遺伝子を欠いたＳ　Ｖ　４０　ｏｒｉ
配列を含んでおり、これは、ＧｌｕｚｍａｎによりＣｅ
１ｌ、　２３巻、１７５−１８２ページ（１９８１年）
に記述されて（・るようにＣ０８７サル細胞中で自動的
に多コピー数（しかしながら安定ではない）に複製する
ことができる、ＡＴＣＣ（受託番号屑ＣＲＬ１６５１）
から入手できる。上述したＳＶ４０に基くベクターは、
また、宿主細胞ＤＮＡ中に挿入することにより、マウス
Ｌ細胞のような他の哺乳動物細胞を形質転換させること
ができる。

ＳＶ４０に基くベクターの他に、本発明の使用に適した
発現系として以下のものが含まれる（ただしこれらに制
限されるわけではない）。（１）例５巻、１７３−１９
０ページ（１９８３年）ＤｉＭａｉｏらによりに開示さ
れるＢＰＶ−ｐＥＲ３２２ハイブリッドのようなウシ乳
頭腫ウィルス（ＢＰＶ）配列から構成されるベクター、
Ｐｒｏｃ。

計−−− ページ（１９８２年）これは、ウシやマウスの細胞の形
質転換を行うベクターである。（１１）例えばＥ：ＥＶ
ｏｒｉＰ配列をもつプラスミド（核抗原ＥＢＮＡ−１の
配列をコードも含んでいる）のように、Ｅｐｓ　ｔ　ｇ
　ｉｎ　−Ｂａｒｒウィルス（ＲＥＶ）配列から構成さ
れるベクター。これについてはＹａｔｇｓらＮａｔｓｒ
ｇ、　　３１３巻、８１２−８１５ページ（１９８５年
）　：　ＲｔｒｉｓｍａｔＬら、Ｍｏ１．Ｃｇｌｌ。

Ｂｉｏｌ、　５巻、１８２２−１８３２ページ（１９８
５年）　；　ＹａｔｇｓらＰｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃ、ｉ、　８１巻、３８０６−３８１０ペ
ージ（１９８４年）により開示されており、さらにＳｕ
ｇｄａｔＬら、Ｍｏ１．Ｃａ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　５巻、４１０−４１３ページ（１９８５
年）、ヒトやサル則胞を含む各１重哺乳動物、細胞の安
定な形質転換を行うベクターであるｏ（ｉｉｉ）マウス
やノ・ムスターの細胞の形質転換に用℃・るネズミ、ポ
リオーマ（ｐｏｌｙｏｍα）ウィルスで構成されるベク
ター；例えばＯ’Ｈａｒａ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
Ｌ、　、　１５１巻、２０３ページ（１９８１年）、（
ｉｖ）ジヒドロ葉酸（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌｃＬｔｔｒ
　）還元酵素（ｄｈｆｒ　）遺伝子を含むベクター（例
えばＡｌｔ　ら、１三μ遼（・ｃｈ綿、、２５３巻、１
３５７−１３７０ページ（１９７８年））、これはメト
トリキセート（ｍｇｔｈｏｔｒｅｚａｔｇ　）で処理す
ると、ネズミゲノム中に、−緒に統合されていた隣接コ
ード領域（例えばｄｈｆｒ活性を欠損したチャイニーズ
・）・ムクター。卵巣（ＣＨＯ）細胞系列のもの）と、
ともに複製される、例えばＵｒｌａｍｂらＰｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃ（Ｌｄ、　Ｓｃｉ、　７７巻、４２１６ページ（１
９８０年）に記述がある。さらに（Ｖ）　Ａｚａｌ　ら
により米国特許４，３９９，２１６号に開示されるよう
な、コトランスホーメーション（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ　）系である。さらに加えて補乳動物の発
現ベクターは例えば複製開始点（ラウス肉腫ウィルスの
長い末端反復配列（ＲＥＶ−ＬＴＲ）のような）エンノ
・ンサー配列、（これについてはＧｏτフルαｎら、６
７８１ページ（１９８２年）に開示されている）、イン
トロン−スプライス部位、ポリアデニル化部位などのよ
うな、利用可能なりＮＡｎ瘍ウィルスやレトロウィルス
由来の各種要素を用いることにより、構築したり、現存
するものを修飾したりすることができる。

転化発現系もまた本発明に使用できるよう構築すること
ができ、例えばカイコ、Ｂｏｍｂｙｘ　フルｏｒｉ　、
の幼虫を、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　１３１５巻、
８９２−８９４ページ（１９８５年）及び５ａｉｂｏ　
Ｋｏ東＆１Ｌ、４巻、７６７−７７９ページ（１９８５
年）に記述されるように厚状ウィルス（ｂａｃｌＬｌｏ
ｖｉｒｕｓ　）ベクター、ＢｍＮＰ　Ｖで感染させたり
する。

実施例 以下に示す実施例は本発明を明解なものとする上で役に
立つ。ベクター及び宿主は、試薬の濃度、温度及び他の
変数などと同様に、本発明の応用を例示するためだけの
ものであり、その制限については考慮されていない。

プール１１４のｅＤＮＡクローンはネズミＴ細胞系列Ｃ
１，Ｌｙｔ＋２−７９から構築されたｃＤＮＡライブラ
リーから単離したが、これはＡＴＣＣにＣＲＬ８１７９
の入手番号で保管され、ナベル（ＮｃＬｂｇｊ）ら、Ｃ
ａ１ｌ、２３巻、１９−２８ページ（１９８１年）及び
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７８巻、１
１５７−１１６１ページ（１９８１年）に記述されてい
るものである。簡単にはｐｃＤ　　ｃＤＮＡライブラリ
ーはコンカナバリンＡ　（ｃｏｎＡ　）で誘導したＣ　
Ｌ　、Ｌｙｔ＋２−／　９　Ｊ胞由米のメツセンジャー
ＲＮＡを前述したオカヤマ（Ｏｋａｙａｍα）とノく一
グ（Ｂｅｒｇ）の方法に従い構築した。

Ａ、ＰＩＦ生産の誘導 Ｃ１，Ｌｙｔ＋２７９細胞に、以下のように、Ｃ０ｆＬ
ＡによるＰＩＦ　　ｍＲＮＡの生産を誘導した。熱変性
した胎児ウソ血清４％、５ｘｌＯ−’Ｍ　　２−メルカ
プトエタノール（２−ＭＥ）、２ｍＭグルタミン、非必
須アミノ酸、必須ビタミン及びＣｏｎＡ　２ｐ　ｆ／ｒ
ｎｌを含む。ドルベコ（ＤｌＬｌｂｅｃｏ）の修飾イー
グル培地（ＤＭＥ）９、細胞を５　Ｘ　１０５／ｒ！Ｌ
ｌとなるよう培養した。１０％ＣＯ２中３７°Ｃて１２
−１４時間インキュベーションを行った後、細胞懸濁液
を１５０Ｏｒｐｍｌｌ　０分間遠心する。細胞ペレット
を果めすぐに一７０℃に凍結した。

Ｂ、情ＥＮＡの単離 チャブライン　Ｊ、　（Ｃｈｉｒｇｗｉｓ、Ｊ、　）ら
（Ｂｉｏｃｈａ−雷１ｓｔｒｙ、　１８巻、５２９４−
５２９９ページ（１９７９年）の、グアニジン、イソチ
オシアネート法を用いて、細胞から全細胞ＤＮＡを単離
した。ＣｏｎＡで誘導したＣ１．Ｌｙｔ＋２−７９ｍ胞
（刺激後１２時間のもの）由来の凍結細胞ペレットをグ
アニジン・インチオシアネート溶解液に懸濁した。１．
５Ｘ１０８細胞あたｐ１２ｍｇの溶解液を用いた。ペレ
ットをピペットで再懸濁し、次にＤＮＡを１６ゲージの
針を使ってシリンジを４回通して、剪断した。その溶液
を４Ｏｍｔ、のポリアロマ−遠心チューブ知、ＣｓＣｌ
３．７Ｍ％ＥＤＴＡ　　１０ｍＭからなる溶液２０　ｍ
ｉの上にのせる。この溶液をベックマン（Ｂｇｃｋｍａ
ｎ　）　Ｓ　Ｗ　２８０−ター（ベックマンインストル
メント（Ｅｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ＋Ｉ
ｎｃ　、　）、ＰａＬｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）Ｏ？１５°
Ｃ１４０時間、２５．（１０　Ｏｒｐｍで遠心した。Ｄ
ＮＡを営むグアニジン・インシアネート相を上からピペ
ットを使ってその界面１で取り除いた。チューブの壁と
界面を２−３Ｎのグアニジン・イノシアネート溶解液で
洗浄した。界面から下のチューブをはさみで切りとり、
Ｃ５ＣＬ溶液を静かに流出させる。ＲＮＡペレットは冷
やした７０％エタノールで２回洗浄する。次にペレット
をｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｐＨ７、’４１　ｒ
ｎＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ｓ　０．０５％　ＳＤＳ　浴’
Ｑ５（１０μｔに再び懸濁させる。３Ｍの酢酸ナトリウ
ム５０μｔを加え、ＲＮＡをｌ　ｒｎｌのエタノールで
沈澱させる。遠心によりＦＪｏ、　３■の全ＲＮＡが集
められ、このペレットを一回、冷エタノールで洗浄した
。

洗浄し乾燥した全ＲＮＡペレットをオリゴ（ｄＴ）溶出
バッファー（１０ｍＡ／　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ１ｐＨ７，
４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％５ＤＳ）９（１０　μ
を中に再懸濁させる。ＲＮＡを６８°Ｃで３分加熱し、
次に氷で冷やす。５Ａ／　ＮａＣ１１（１０ｉｌｌを加
える。ＥＮＡサンプルを吸着バッファー（１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、５
Ａｆ　ＮａＣＬ、０．５％ＳＤＳ　）で平衡化させたオ
リゴ（ｄ’７’）セルロースカラム（Ｔｙｐｅ　３　＋
　ＣｏＬＬｔＬｂｏｒａｔｉｖｇ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｗαｌ　ｔｍａｎ　、ＭＡ　）　１．０舵の上にのせる
。カラムを素通りしてくる溶液をさらに２回カラムに逍
す。矢にカラムを２０ｒｎｌの吸着バッファーで洗浄す
る。

Ｐｏ　ｌ　ｙ　Ａ＋ｍＲＮＡは、溶出バッファーで洗浄
し集める。ＲＮＡは通常、最初の２ｍｌの溶出バッファ
ーで溶出してく、る。ＲＮＡは、３Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ６）　０．１容とエタノール２容で沈澱させる。Ｒ
ＮＡペレットを遠心して集め、２回冷エタノールで洗浄
し、乾燥する。次にペレットを水に再懸濁する。適量を
稀釈し、２６０ｎｍの吸光度を測定する。

Ｃ，ｐｃＤ　　ｃＤＮＡライブラリーの構築１）ベクタ
ー・プライマーとオリゴ（ｄＧ）末端をもつリンカ−Ｄ
　Ｎ　Ａの調製、オカヤマ（Ｏｋａｙａ常α）とバーブ
（Ｂｇｒｇ）の方法（Ｍｏ１．＆　Ｃｅ１ｌ　、Ｂｉｏ
ｌ、第２巻、１６１−１７０ページ（１９８２年））を
わずかだけ修飾した方法を用いた。ｐｃＤＶｌとｐＬｌ
　　プラスミドは、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍα）とバー
ブ（Ｂｅｒｇ）により記述されており、（Ｍｏｔ、＆Ｃ
ｅ１ｌ　Ｅｉｏｌ、、３巻、３８０−３８９ページ（１
９８３年））、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（
Ｐｉｓｃａｔａｕｘｘｙ。

Ｎ、Ｊ、）がら入手できる。特に、Ｋｐｎ（部位の前の
位置に笠ｓｉｉ部位を含む修飾ｐｃＤＶ１プラスミドを
用いた。

ｐｃＤＶＩＤＮＡ　のサンプルｇ　ｏ　Ｉｌｆを６ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣＬ（ｐＨ７，５）、６　ｐＭ　　ＭｇＣ
ｌ２．６ｍｕ　ＮａＣ１１６ｍＭ　２−ＭＥ及びｌ　ｍ
ｅあたり０．１　’ＩＱノ牛血清アルブミンを含む反応
液４５０μを甲、３０°Ｃで、２０ＵのＫｐｎｆエンド
ヌクレアーゼで切断する。１６時間後、０．２５　Ｍ　
ＥＤＴＡ　　（ｐＨ８，０）４０μｔと１０％硫酸ドデ
シルナトリウム（ＳＤＳ）２０μｔで反応を中断し、Ｄ
ＮＡを水飽和１：１フェノール−ＣＨＣｌ３　（以後フ
ェノール−ＣＨＣｌ３　と呼ぶ）で抽出した後、エタノ
ールで沈澱させて回収する。末端あたり、平均６０１し
かも８０以下の、デオキシチミヂレート（ｄＴ）残基か
らなるホモ・ポリマー末端を、ウシ胸腺ターミナル・ト
ランスフェラーゼを用いて、以下のように、芒ｓｉＴ工
／ドヌクレアーゼ処理で生成した終末につけ加える：反
応液は、１　ｍｕ　ＣａＣｌ２、Ｑ、］、ｍＭジチオス
レイトール、０．２５　ｍｕ　ｄＴＴＰ１Ｎｓｉｒエン
ドヌクレアーゼで切断したＤＮＡ及びターミナルデオキ
シヌクレオチチゝル・トランスフェラーゼ（Ｐ　−Ｌ　
　ＢｉｏｃｈｇｍｉｃａＬｓ、Ｉｎｃ、。

Ｍｉｌｗａｕｋｅｓ、ＷＩ　）　６８　Ｕを含むカコジ
ルナトリウム３０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ　　ｐＨ６，
８バツフアーからなる。３７°Ｃ１３０分後に、０．２
５　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）２０μｔと１０％　Ｓ
ＤＳ　１０μＬで反応を中断し、数回フェノール−ＣＨ
ＣＡ３”Ｃ’油抽出た後、ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せて回収する。

次にＤＮＡをＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ１５Ｕで１
０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ７，４，１０ｍｕ　Ｍｇ
　Ｃ７２，１ｍＭ　　ジチオスＬ／イトール及びｌ　ｍ
ｌあた。！：ｌ　０．１　ｍ９のＢＳＡを含むバッファ
ー５０μを甲、３７℃で５時間反応、切断する。ＳＶ４
０ポリアデニル部位、ｐＢＲ３２２由来の複製及びアン
ピシリン抵抗注遺伝子を含む大きなフラグメントをアガ
ロース・ゲル（１％）電気泳動によって精製し、ゲルか
ら修飾ガラス粉末法（ホーケルスタインＢ　、（Ｖｏｇ
ｅｌ　−ｓ　ｔｔｉｎ、　Ｅ　、）とギレスピーＤ、（
Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ、Ｄ　）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　７６巻、６１５−
６１９ページ（１９７９年））により回収する。ｄＴ末
端をもつＤＮＡは、さらに以下のようにしてオリゴ（ｄ
Ａ）−セルロースカラムに吸着、溶出させて精製する。

ＤＮＡを１ｙ＋ｚＡ／　ＥＤＴＡ、　Ｉ　Ａ／　ＮａＣ
１を含む１０ｍ、Ｗ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　　ｐＨ７，３
バツフアーｌ　ｍｌ。

に溶解し、次にＯ′Ｃで同じバッファーで平衡化したオ
リゴ（ｄＡ）−セルロースカラム（Ｑ、　６　Ｘ　２．
５ｃｍ）にかけ、室温で水で溶出させる。溶出したＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、ＩｍＭ　Ｈ：ＤＴＡを含む
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　　ｐＨ７，３に溶解する
。

オリゴ（ｒｔＧ　）末端の連結したＤＮＡは、ｐＬＩＤ
ＮＡ７５μ７を６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４ｐＨ７，４，
６ｒｒＪｙｆ　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ　２−ＭＥ、　５０
　ｍｕ　ＮａＣ１及びｌ　ｍｌあたり（１０１ｍ９のＢ
ＳＡを含むバッファー４５０μを中、Ｐｓｔ■エンドヌ
クンアーゼ２．ＯＵで反応・切断する。３０°（：、、
１６時間後、反応液をフェノール−ＣＨＣｌ３　で抽出
し、ＤＮＡをアルコールで沈澱させる。次に、末端あた
り１０かも１５のデオキングアニレー）　（ｄＧ）残基
を、ｄＴＴＰを０．１　ｍｕ　ｄＧ　Ｔ　Ｐで置きかえ
た以外向−の反応１（３８μｇ甲、ターミナル・デオキ
ンヌクレオチジル・トランスフェラーゼ４６Ｕで付加さ
せる。

３７℃、２０分後、フェノール−ＣＨＣＡ３　　で抽出
し、次に２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｐＨ７，４，
７ｍＡ／Ｍｇ　（：’　Ａ２．６０　ｍｕ　Ｎ　ａ　Ｃ
４及びＢ　Ｓ　Ａ　Ｑ、　１ｍ９を含むバッファー５０
ｐｔ中、３７℃で４時間、Ｈｉｎｄ■エンドヌクレアー
ゼ３５Ｕで切断する。同じオリゴ（ｄＧ）末端の連結し
たＤＮＡをアガロースゲル（１，８％）電気泳動で精製
し、上述したような方法で回収する。

２）　　ｃＤＮＡライブラリーの調製 ステップ１　：　ｃＤＮＡの合成。反応液（１０μｔ）
には、５０　ｍｕ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｐＨ８，３，８
ｍＭＭｇＣ１ｚ　、３０ｍＡ／　ＫＣＬ、０．３ｍＭジ
チオスレイトール、ｄＡＴＰｌｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰをそれぞれ２　ｍＭ、　２０　ｔｌｃｉ３２Ｐ　
−ｄＣＴＰ　（３（１００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）、Ｃｏｎ
Ａで誘尋したｒ−ａｍ胞由米のｐｏｌｙＡ十ＲＮＡ　３
μ２、ＲＮアシン（ＲＮａｓｉル）６０ユニツト（プロ
メガバイオチック（Ｐｒｏｍｇｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ。

Ｉｎｃ　、　）、Ｍａｄｉｓｏｎ　、　Ｗｌのりボヌク
レアーゼ・インヒビターの商品名）、及び逆転写酵素４
５Ｕが含マレる。４２°Ｇ　　６０分間インキュベーシ
ョンを行い、Ｏ２５，ν／　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）
１μｔと１０％５ＤＳ０．５μｔを加え反応を止め、フ
ェノール−ＣＨＣｌ３４０μｔを加え、ボルテツクス（
Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサーで激しく撹拌後遠心する。４Ｍ
酢酸アンモニウム４０μｔとエタノール１６０μｔを水
層に加えた後、溶液をドライアイスで１５分冷却し、室
温にもどして冷却中に沈澱してきた未反応のデオキシヌ
クレオシド３リン酸が溶解するようゆっくり振盪しエペ
ンドルフ（Ｅｐｐｅｎ−ｄｏｒｆ）ミクロチューブ申、
１０分間遠心する。ペレットを、１０　ｍｕ　Ｔｒｉｍ
−ＨＣＩ　　ｐＨ７，３と１　ｍｕＥＤＴＡ　１０ｙと
４Ｍ酢酸アン′モニウムｌＯμｔの混液に溶解し、エタ
ノール４０μｔを加え再び沈澱させる。この操作で未反
応のデオキシヌクレオチド３リン酸の９９％以上が取り
除かれる。ペレットをエタノールで洗浄する。

ステップ２：オリゴデオキシンテチル−ト〔オリゴ（ｄ
Ｃ））の付加。プラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを含む
ペレットを、ｌ　ｍＭ　ＣｏｃＬ２．０．１ｍＡｆジチ
オスンイトール、ポリ（Ａ）　０．２μ？、７ｃｋＭｄ
ｃＴＰ、５　ｐＣｉ”Ｐ−ｄｃＴＰ（３（１００Ｃｉ／
ｍｍｏ１ｇ）及び、ターミナル・デオキシヌクンオチド
・トランスフェラーゼ６０Ｕを含む１４０　ｍｕカコジ
ルナトリウム−３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　　ｐＨ６
，８バツフアー２０μｔに溶解する。末端あたり１０か
ら１５残基のｄＣＭＰがけ加するように反応は３７°Ｃ
で５分間行い、０．２５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０
）２μｔ　と１０％ＳＤＳ　１μｔを加え反応を止める
。

フェノール−ＣＨＣ１３２０μｔで抽出後、水層に４Ｍ
酢酸アンモニウム２０μｔを加え、エタノール８０μｔ
でＤＮＡを沈澱させ、再度沈澱させた後、ペレットをエ
タノールで洗い流す。

ステップ３　：　Ｈｉｎｄ　ｌ［エンドヌクレアーゼに
よる切断。ペレットを、２０　ｍｕ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
　　ｐＨ７，４，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６０　ｍＭ　Ｎ
ａＣ１，及び、ｌ　ｒｎｌあたり０１ｍ９０ＢＳＡを含
むバッファー３０μｔに溶解し、次にＨｉｎｄ　ＩＩＩ
エンドヌクレアーゼで３７°Ｃ１２ｈｒ反応させ切断す
る。　０．２５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）３μｔ
と１０％ＳＤＳ　１．５μｔを加え反応を止め、フェノ
ール−ＣＨＣ１３で抽出した後、次に４Ｍ酢酸アンモニ
ウム３０　ｐＬを加え、エタノール１２０μｔでＤＮＡ
を沈澱させる。ペレットをエタノールで洗い、次Ｋ　１
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，３）１　ｍＭ　
ＥＤＴＡ　　１０μｔに溶解し、−２０℃で保存中凍結
を防ぐためにエタノール３μｔを加えておく。

ステップ４：オリゴ（ｄＧ）を末端にもつリンカ−ＤＮ
Ａにより仲介される環化。

Ｈｉｎｄ　［［エンドヌクレアーゼで切断したオリゴ（
ｄＣ）を末端にもつｃＤＮＡ：ｍＲＮＡプラスミドのサ
ンプル９μｔ（サンプルのＦＪ９０％）を、１゜ｍｕ　
Ｔｒｉｍ−ＨＣＬ　　ｐＨ７，５，１ｍｕ　ＥＤＴＡ、
　０．　Ｉ　ＭＮａ　ＣＬｓオリゴ（ｄＧ）を末端にも
つリンカ−ＤＮＡＬ、８ｐｍｏｌを含む混合液（９０μ
ｔ）甲、６５℃で５分間、次に４２°Ｃで６０分；さら
に０℃に冷やし、インキュベートする。混合液（９０μ
ｔ）を、２０　ｍｕ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐＨ７，５
，４ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ（ｉＶＨ４）２ＳＯ４
、Ｑ、ＩＭ　ＫＣＬ、１ｍｅ；９たり５０μ？のＢＳＡ
及び０．１　ｍＭβ−ＨＡＤ　を含み容積９（１０μｔ
になるように調整し、Ｅ　、　ｃ　ｏ　ｌ　ｉのＤＮＡ
リガーゼ６μ７を塀え、溶液を１２°Ｃで一晩インキユ
ベートする。

ステップ５　：　ＲＪＶＡ鎖をＤＮＡＶＣ置換する。

挿入されたＲＮＡ鎖を置換するためて、先程のりガーゼ
の混合液を４つのデオキシヌクレオシド３リン酸をそれ
ぞれ４０ｙＭｓ　０．１５　ｍＭβ−ＮＡＤ。

さらにＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ４μ？、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　ＣＰｏｔ　ｒ　）　１６
ｔｙ１及びＥ、ｃｏｌｉＲＮアーゼＨ９Ｕを含もように
調整する。この混合液（９６０μｔ）を１２℃及び室温
でつづけて一時間づつインキュベートシ、Ｐｏｌ■によ
る４ｉ％埋合成とニック・トランスシー７ヨン（ｎ１ｃ
ｋ　ｔｒａ？Ｌｓ−１ａｔｉｏｎ）が最適に促進される
ようにする。

ステラ７’６　：　Ｅ、ｃｏｌｉのトランスフォーメー
ション。トランスホーメーションは、コーエン（（’ｏ
ＡｇｆＬ）Ｓｃｉ　、Ｕ、Ｓ　、Ａ、　、　６９巻、２
１１０−２１１４ページ（１９７２年））を少し修飾し
た方法を用いて行った。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ａ’　−１２株
ＭＣ１０６１（Ｃａｓａｄａｂａｎ＊Ｍ、とＣｏｈｅｎ
、Ｓ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１３８巻、１７９
−２０７ページ、（１９８０年））を３（１０ｍＪのＬ
−肉汁中、３７℃、６（１０　ｎｍで吸光度０．５　ユ
ニットまで培養する。遠心により細胞を集め、１０　ｍ
Ｍ　　Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ７）、６０ｍＭ　　ＣａＣ１ｚ
　、１５％グリセロール３０ｒｎｌに懸濁させ、ｏ’ｃ
て５分間遠心する。細胞を再び上述のバッファー’１４
ｍ１に懸濁させ、もう一度Ｏ℃で５分間インキュベート
する。次に、細胞愁濁液ｌ、Ｑｍｌを、ＤＮＡ溶液（ス
テラフ５　）　Ｏ，Ｉ　Ｉｌｌと混合し、０℃で２０分
間インキュベートする。次に細胞を４２℃に２分間保ち
、その後、室温に１０分間保つ。さらにＬ−肉汁１リツ
トルを加え、３７℃で６０分インキュベートする。

アンピシリ／を５０マイクログラム／ｍｅの濃度になる
よう茄え、培養液をさらに３７°Ｃで１０時間振盪する
。次にサンプルを培地からとりだし、ＤＭＳＯ甲凍結保
存する。それとは別に培地の一部を４３（１０ａｔ胞／
　ｍ１ｉＣなるように稀釈する（０．１九のサンプルを
プレートにのせ、コロニーの数を数えることによって決
定する）。この一部の０１２５ｍ１のサンプルから約３
０のプールが確立され、次に、標準偏差２３で５３７の
クローンを含ムコロニーを形成するよう増幅させる。プ
ラスミドＤＮＡは標準的なテクニック（例えばマニアチ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら、先に引用）を用いてそれ
ぞれのプールから増幅させた培地から単離され、以下の
ようにしてＣ０８７細胞をトランスフェクションするの
に用いられる。トランスフエフ・ンヨンの日に先だって
、約１０’のＣＯＳサル細胞を、１０％胎児ウシ血清と
２ｍＭグルタミンを含む。ＤＭＥ甲の１（１０朋の個々
のプレートにまく。トランスフェクションを行うために
、それぞれのプレートから培地を吸い出し、５０　ｍＭ
　？”ｒｉ８−ＨＣ６ｐＨ７，４，４（１０１１１／ｍ
ｅ　ＤＥＡＥ−デキストラ／及び試験するプラスミドＤ
ＮＡ５０μｍを含むＤ　Ｍ　Ｅ４ｍｌで置きかえる。プ
レートを３７℃で４時間インキュベートし、次にＤＮＡ
を含む培地をとり除き、プＶ−）を血清フリーのＤＭＥ
で２度洗浄する。１５０μＭクロロキンを含むＤ　Ａｆ
　Ｅを再びプレートに加え、さらに３７℃で３時間イン
キュベートする。プレートを一度ＤＭＥで洗浄し、次に
４％胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミン、ペニンリン及び
ストレプトマイシンを含″ｉＪＤＭＥを加える。次に雅
胞を３７℃、７２時間インキュベートする。成育培地を
集め、Ｅ　ｏ　−ＣＳ　ＦとＩ　ｆＡＥＦ活性を測定す
る。プール１１４由来のプラスミドは双方のアッセイで
陽性の応答を水子。

実施例２゜ ＰＩＦ活性を示すポリペプチドをコード可能な個々のｃ
ＤＮＡクローンは、プール１１４から約１６０種のクロ
ーンを含む２０のサブ・プールに分画することにより単
離された。サブ・プールは増幅され、そのそれぞれから
プラスミドＤＮＡを調製した。単離したプラスミドＤＮ
Ａは、上述のように、Ｃ０８７細胞をトランスフェクシ
ョンするのに用いられ、Ｃ０８７培養液の上清について
ＩＹＡ−ＥＥとＢ　ｏ　−ＣＳ　Ｆ活性をアッセイし、
陽性のサブ・プールを１司定した。陽性のサブ・プール
はさらに分画を行い、最終的に、クローン４Ｇと呼ぶ単
一クローンが得られた。クローン４Ｇでトランスフェク
ションしたＣＯ３７細胞の上清はＥｏ−ＣＳＦ活性及び
ＩＹＡ−ＥＦ活性の双方を示した。クローン１１５が挿
入したｃＤＮＡはＡ／１３プラスミドに再びクローニン
グし、ジブオキ／・チェイン・ターミネー／ヨン法（ｄ
ｉｄｅｏｚｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍ
ｅｔｈｏｄ　）を用いて配列を決定した；例えばサンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、。

７４巻、５３６３−５３６７ページ（１９４４年）。

その配列を図２に示す。

実施例３゜ 実施例１に記述したようにプール１１４由来のプラスミ
ドでＣ０８７細胞をトランスフェクションし、上清を集
め、ＹＭ−１０アミコン（，４ｍｉ　ｃｏｎ　）メンブ
レ／で（タンパク濃度がＦＪｌ　２　ｍｑ　／　ｍｌに
なるよう）濃縮し、５０　ｍＭＨｅｐｅｓ　ｐＨ７，０
１１０予グリセロール、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１　ｍ
Ａｆ　ＥＧＴＡ。

Ｑ、　５　ｐ　？　／ｍｅペフ０スタチンＡ　、０．５
　ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭ
ＳＦ）及び０，０４％ツウイーン２０かもなる透析バッ
ファー（ＤＢ）中２０ｍＭ　ＮａＣ１に対して透析を行
う。

２０ｍＭＮαＣｔ　を加えたＤＢ甲透析したものを、カ
ラム容１３２５０ｍｌあたりタンパク約３（１０■の割
合で、ヘパリン−アガロースカラム（ファルマシア（Ｐ
ｈａｒｍａ　ｃ　ｉα））にかける。その前に、カラム
を、２　Ｑｍｕ　ＮａＣＬを加えたＤＢで平衡化してお
く。ＰＩＦは、上述した（Ｂ細胞マイトジェンを必要と
しない）アッセイ法により定義されるＢＣＤＦ活性で追
跡する。カラムにかけたあと、２０　ｍｕ　ＮａＣＬを
加えたＤＢで洗浄し、ＰＩＦを１５０　ｍｕ　Ａ’αＣ
ｔを加えたＤＢで段階的にカラムから溶出させる。溶出
したタンパクなＹＭ−１０アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）
メンブレンでタンパク濃度１０Ｉｎ９／ｌｉ＋と１で譲
縮し、４（１０ｍＭＮａＣＬを加えたＤＥで前もって平
衡化させておいた。プレパンクされたスペロース−１２
（Ｓｗｐｅｒｏｓｅ−１２）カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　
ｉα）を２つ連結したものに通し、クロマトグラフィー
を行う。活性物質は、見かけの分子量８キロダルトン（
ｋＤ８）に溶出する。しかしながら、この見かけの分子
量はＰＩＦがカラム・マトリックスと疎水性相互作用す
ることによる人為的なものであると信じられている。さ
らに、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析では分子量は約４０
−４８　ｋＤの範囲にあることが示されている。活性画
分は再び、ＹＭ−１０アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ）メ／ブ
どンにより濃縮し、次に、Ｃ−４逆相カラム（Ａｌｔ＠
ｅ）にかける。カラムを流速０．７５ｍ１／分で０１％
（′ｖ／／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で断片的
なアセトニトリルのリニアー・グラジェントをかける。

注入後、カラムをＨ２０甲０，１％ＴＦＡで１０分間洗
浄し、次に、アセトニトリルの濃度を２分間にわたって
０％から４０％（Ｚ）へ直線的に増加させ、５分間一定
に保つ。４０％アセトニトリルで５分流したあと、今度
はアセトニトリルの濃度を４０分にわたって４０％から
８０％へ増加させ、次にアセトニトリルの濃度を一気に
１（１０％に増加させる。ＰＩＦは約６０％のアセトニ
トリルで溶出し、活性を維持するために、すぐに５０　
ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ８，０，２０％グリセロール、
０１％ソウイーン２０の混合液に移す。溶出したＰＩＦ
のサンプルはＥＣＤＦの活性に関して約２Ｘ１０’倍に
精製される。

実施例４ ＰＩＦをコードするｃＤＮＡクローンは誘導末梢血液リ
ンパ球（ＰＢＬｓ）から構築されたＣＤＮＡライブラリ
ーより単離された。他のＣＤＮＡライブラリーの細胞材
料には、例えばヨコタ（Ｙｏｋｏｔα）ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８３巻、５８９４−５８
９８ページ（１９８６）に記述のある２Ｆ１、又はフオ
レイ（Ｆｏｌｅｙ）ら、Ｃａｎｃｅｒ、１８巻、５２２
−５２９ページ（１９６５年）及びＩＪングラー（Ｌｉ
ｎｇｌｅｒ）、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｘｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
、ｈ、　３巻、１８３−１９１ページ（１９８４年）に
記述されており、ＡＴＣＣからＣＣＬｌ　１９ＣＲＬ８
４３６、ＴｌＢ１９５の入手番号で入手１ｌｉＴ熊なＣ
ＥＭ系列の変種のような、ヘルパーＴＩｆ［ｌｌ胞クロ
ーンが含まれる。

ＰＢＬは、３％胎児ウシ血清を加えたイスコベ（ｌ５ｃ
ｏｖｅ）の培地中で成育した。ＰＢＬはその培養液に１
μ″？／ｍｌのｃｏｎＡを加えることてより誘導された
。ＣｏｎＡ添加後約１０時間の細胞を収穫した。

ｍ　ＲＮ　Ａの抽出及びｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの
構築は実施例１に記述したようにして行った。ネズミＰ
ＩＦ　　ｃＤＮＡを含むＮｃｏ（断片（図２に示す）は
、ネズミｐｃＤ−ｍＰＩＦより単離され、ニック・トラ
ンスレーションにヨｔ）ラヘルＩ、　（Ｉ　Ｘ　１１０
８ｃｐ／μグ）、ＰＢＬ　　ｃＤＮＡ　　ライブラリー
からそれぞれ大体ｌＸＩＯ３のクローンの１０のプール
から調製したプラスミドＤＮＡを含むニトロセルロー２
１紙のプローブとして用いた。それほど厳重でないハイ
プリダイゼーンヨン（４２°Ｃ１−晩）の榮件を用いた
。即ち、６　Ｘ５ＳＰＥ　　１　×５ＳＰＥ−１８０ｍ
Ｍ　Ｎａ　ＣＬ／　１０　ｍｋｆす７６ナトリウム、ｐ
Ｈ７、４／　１　ｍｕ　ＥＤＴＡ　）　（７＝アテスＴ
、（、’ｙｌａｎｉａ−ｔｉｓ、Ｔ、）ら、分子クロー
ニングニ実験手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｖＭａｎｗａｌ）（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｎ、Ｙ、。

１９８２））、２０％（／／ｖ）ホルムアミド、０．１
％ｆＩＬｍドデシルナトリウム、イースト・キャリアー
ｔＲＮＡを１（１０μｔｏ　　濾紙は、２ＸＳＳＰＥ１
０１％（ＡＨドデシルナトリウムで３７℃で洗浄した０ ヒトＰＩＦ　　ｃＤＮＡは濾紙上に検出され、”クロー
ン１１５”と名づけだそれに相当するクローンを培養プ
レートから単離した。クローン１１５はＥ、ｅｏｌ　ｉ
−ＭＣＩ　Ｏ６１甲で増幅され、ＣＯ３７サル細胞をト
ランスフェクションした。トランスフェクションを受け
たサル細胞の上清は、（ヒトのプロゲニター細胞を用い
たとき）Ｅｏ−ＣＳＦ活性及び（ＳＡＣで活性化した精
製マウスＢ細胞を用い、標準的なＥＬＩＳＡ法でＩｇＭ
　の生産を測定したところ）ＥＣＤＦ活性を示した。

クローン１１５の挿入したｃＤＮＡは、ジブ万キシ・チ
ェイン・ターミネーション法を用いて配列をきめ、マウ
スのＰＩＦのアミノ酸配列と比較することにより、おそ
らく天然のであろうと思われるＰＩＦのアミノ酸配列を
決定した。さらにポリペプチドの分泌シグナル配列の決
定ては、バールマン（Ｐｅｒｌｍａｒｓ　）ら、Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１６７巻、３９１−４０９ページ
（１９８３年）により報告されている経験則を適用した
。

天然のヒトＰＩＦアミノ酸配列を■式に示す。

実施例５゜ 発現 本実施例の合成遺伝子の小条及び発現のテクニックは、
分子生物学の技術としては標準的なものであり、例えば
、特にスプロート（Ｓｐｒｏａｔ）ガイ）（Ｇａｊ　ｔ
　）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅ
ａｒ　ｃｈ、１　３Ｍ＋２９５９−２９７７ページ（１
９８５年）、フェンエチ（Ｆｅｒｒｇｔｔｉ）ら、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

８３巻、５９９−６０３ページ（１９８６年９、さらに
ムレンバソク（，１１／ｍｌ　ｌ　ｅｎｂａｃｈ　）ら
、Ｊ。

Ｅｉｏｌ　、Ｃｈｇｍ、　、　２６１巻、７１９−７２
２ページ（１９８６年）、ウェル（Ｗｅｌｌ）ら、Ｇａ
ｎｇ、３４巻、３１５−３２３ページ（１９８５年）及
びエステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２
３３巻、６５９−６６３ページ（１９８６年）である。

簡単には、ヒトＰＩＦ遺伝子は化学的に合成した複数の
２重鎖ＤＮＡ断片から組みたてられる。合成された遺伝
子の塩基配列は組みたてられた合成遺伝子が、遺伝子を
担うベクターに関して、一連の特異的な制限酵素認識部
位を含むようなものが選択される。

一連の特異的な制限酵素認識部位は、塩基配列の変化し
た部位を容易に削り取れ、置換できるような一連の部分
を定義する。合成した断片は直接挿入するか、あるいは
、ｐｃＤプラスミドなどの適当なベクターの甲に、他の
断片とともに連結したあとに挿入する。上述の部分が、
ウェル（Ｗｅｌｌ）ら（先に引用）のいう゛カセット”
′に相当する。

合成断片は標準的なテクニックを用いて合成する、ψり
えばガイド（ＧｃＬｉｔ）、オリゴヌクレオチド合成：
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ、ｈ）（ＩＲＬ　
　Ｐｒｅｓｓ　、０ｘｆｏｒｄ＋ＵＫ、１９８４年）。

アプライドバイオ／ステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　）社（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ。

ＣＡ）のモデル３８０Ａのような自動合成装置を使うの
が好ましい。ｐｃＤ　　プラスト及び他の適当なベクタ
ーは、例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉα）な
どから商品として購入可能である。例えばｐｃＤについ
ては、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＡｆＣｌ　０６１又はＨＢ１０１
甲でクローニングできるし、その発現はＣＯｓサル細胞
、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はマウスＬ細胞で
行うことができる。

本実施例において、合成ヒ）　　ＰＩＦ遺伝子はｐｃＤ
プラスミドに挿入するよう構築する。簡単には、ｐＣＤ
ベクターは、ｐＢＲ３２２ｏｒｉとＡｍｐ’を含むｐｃ
ＤＶ１白米の大きなＨｉｎｄ　［／ＥａｍＨｆ断片、Ｓ
Ｖ４０初期領域プロモーター及び後期領域イントロンを
含むｐＬ１由米のＨｉｎｄｔＪｌ／ろ工Ｉ断片、及び以
下に記述する合成したＩＡ／Ｂと２Ａ／Ｂという４つの
断片をＴ４ＤＮＡ　リガーゼとともにまず、連結するこ
と例より侮榮する。

次に増幅、＠製、挿入というさらに一連の３つのステッ
プで、残りの合成３Ａ／Ｂから７Ａ／ＢをｐｃＤベクタ
ー中に完全な合成ＰＩＦ遺伝子が存在するようになるま
で加えていく。

制限エンドヌクレアーゼによる切断およびリガーゼによ
る反応を、標準的な手法により行う。例えばマニアテス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら、分子夕ロー二ｔｏｒｙ、Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２年）０アルカリ法（マニア
チス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、先に引用）は、小さなス
ケールでのプラスミドの調製に用いる。大きなスケール
での調製には、アルカリ法を一部修飾した方法を用い、
透明な溶解液から杉酸を沈澱させるのに等容量のインプ
ロパツールを用いる。塩化セシウム平衡密度勾配遠心に
より分画し、臭化エチジウムで検出する前にＲＮＡをと
り除いておくために、冷２．５Ｍ酢酸アンモニウムによ
り沈澱させておく。

クローニングする合成りＮＡの相補ｇ（それぞれ約４０
　Ｏｎ？）を混合し、５０μｔの反応溶液中ポリヌクレ
オチド・キナーゼでリン酸化する。このＤＮＡを適当な
制限酵素で切断したベクターＤＮＡ　　１μ２と連結さ
せ、この連結は５０μｔの容積中、室温で４〜１２時間
行う。リン酸化、制限酵素による切断、ポリメラーゼ反
応、連結及びバクテリアをトランスフェクションさせる
条件についてはすでに記述した。（マニアチス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）ら、先に引用）。

ステップ１では、ｐｃＤＶｌを増幅、単離、さらにＨｉ
ｎｄ■とＢａｍＨ（で切断する。ｐＥＲ３２２ｏｒｉと
Ａｍｐ’領域を含む断片を、例えばマニアチス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　）ら（先に引用）のような標準的な技術を
用いて、ゲル電気泳動により単離する。

ｐＺ＋１を増幅、単離、さらにＨｉｎｄｔｍとＰｓｔｌ
で切断する。ＳＶ４０初期領域プロモーターを言む断片
をゲル電気泳動により単離する。次に単離された２つの
ｐｃＤＶｌとｐＬｌ　断片を標準的なＴ４ＤＮＡリガー
ゼ溶液中で、合成ＩＡ／Ｂ及び２　Ａ／Ｂ（以下に説明
あり）と混合する。合成Ｉ　Ａ／Ｂと２Ａ／Ｂは新しく
作成したｐｃＤ　ベクターの挿入部位を形成し、これを
Ｅ、ｃｏｌｓ中、増幅し、単離する。

ステップ２では、ステップ１で単離したｐｃＤベクター
をＮｈｇＩとＳａｃ　（で切断する。大きな断片を分離
し、標準的なＴ４　　ＤＮＡリガーゼ溶液中合成３Ａ／
Ｂ及び４Ａ／Ｂと混合し、ステップ２のｐｃＤ　ベクタ
ーを作成する。これをＥ、ｃｏｌｉ、Ｖ　Ｃ１０６１で
増殖し単離する。

ステップ３では、ステップ２で単離したｐｃＤベクター
をｘｂα■とＳａｔ　ｌで切断する。大きな断片を分離
し、標準Ｔ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ溶液中、合成５　Ａ　／
　Ｂ及び６Ａ／Ｂと混合し、ステップ３のｐｃＤベクタ
ーを作成する。これをＥ、ｃｏｌｉ、　　ＭＣ１０６１
で増幅し単離する。

ステップ４では、ステップ３て単離したｐｃＣベクター
をＭｌｌＬ（と５ｃＬｃ■で切断する。大きな断片を分
離し、標準Ｔ４ＤＮＡ＋）ガーゼ溶液中合成７Ａ／Ｅと
混合し、完全な合成ヒトＰＩＦ遺伝子を営むｐｃＤベク
ターを作成する。このｐｃＤベクターをＥ、ｃｏｌｉ　
ＭＣ１０６１で増偏し、単離し、ＣＯ；　７サル細胞を
トランスフェクションしてＰＩＦを発現させる。

合成したＩ　Ａ／Ｂから７Ａ／Ｅまでの配列を以下に記
す。特異的制限酵素認識部位の位置とタイプを配列の上
部に示す。小文字で記したものは、塩基が天然のヌクレ
オチド配列から変化していることを示している。

（ＰｓｔＴ＞Ａｐα■ ＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧ−ＡＣ
ＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＡＣＧＡＡＧＡＣ−
ａｒｆ ＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴａＣＴＡＧＣＴＣＴＴＧＧｃＧ
ｃ−ＧＴＡＡＡＣＴＣＡＡＡｔＧＡＴＣＧＡＧＡＡＣＣ
ＱＣＧ−ｃＧＣＣＴＡＣＧＴＧＴＡＴ ＣＧＧ 合成Ｉ　Ａ／Ｂ ＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴ−ＡＴＧＣＡＣ
Ａ、ＴＡＣＧＧＴＡＧＧＧＧＴＧＴＣＴＴＴＡＡ　−Ｓ
ｐｅｉ ＣＣＣＡＣｔＡＧＴＧＣＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡ
Ｃｇ−ＧＧＧＴＧａＴＣＡＣＧＴＡＡＣＣＡＣＴＴＴＣ
ＴＣＴＧ　Ｃ−Ｎｈｅ　ｒ　　　　５ａＣ７（Ｈｆｆｌ
ｎｄ［［）ｃＴａＧＣＧＡＧＣＴＣＡ ｇＡｔＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡ 合成２　Ａ／Ｂ ｈｅｌ ｃＴａＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＧＡＡ
ＣＴ−ＧＴＧＡＣＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧＣＴＴＧ
Ａ−８外αＢＩ ＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＡＧＡＣＴＣＴａ　
ＣＧ　ｔ−ＧＡＣＣＡＣＴＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧ
ＡＧＡｔ　ｇＣα−ＡＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴ ＡＡ 合成３　Ａ／Ｂ ＧＴＡＣＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＡ−ＧＧＡＣＡＡ
ＧＧＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴ−Ｑｌｆ
Ｊ ＣＴＧＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡＱＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧ
ＧＡ−ＧＡＣＡＣＧＴＧＡＣＴＴｑＴ　ｃＴＡＧＡＡＡ
ＧＴＣＣＣＴ−Ｘｂａｉ　　　　（ＳｃＬｃｌ） ＡＴＡＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣｔＴＡＴＣＣＧ
ＴＧＡＧＡＴＣＴＣ 合成４　Ａ／Ｂ ｘｂα■ ＣＴαＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＧＧ−
ＴＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＴＣＣＣ−ＧＧＴＡ
ＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＣＡＡＡ−ＣＣＡＴ
ＧＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＡＡＧＴＴＴ　−Ｂｔｌ
（ ＡＡＣＴＴＧＴＣＣＴＴｇ ＴＧ ｅｌｌ ＡＴ　ｃＡＡＧＡＡＡＴＡｃＡＴＴＧＡｃ−ＡＡＣＡＧ
ＧＡＡｃＴＡｇＴＴＣＴＴＴＡＴＧＴＡＡＣＴＧ　−Ｇ
ＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡ
Ａ−ＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＣＴ
ＴＣＴＴ−Ｍｌｗｌ　　　（Ｓａｃｋ） ＡＧＡＣＧａ　ｃＧｃ、ＧＴＧＡＧｃＴＴＣＴＧＣｔ　
ｇＣｇＣＡＣ 合成６Ａ／Ｂ 、’ｖｌ　ｌ　ｕ　１ ｃＧｃＧＴＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＣＣ
ＴＧ−ＡＴＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡ
Ｃ−ｃｏＲｒ ＣＡＡＧＡａＴＴｃＣＴＴＧＴＴＧＴＡＡＴＧＡＡＣＡ
ＣＣ−ＧＴＴＣＴｔＡＡｇＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＴ
ＴＧＴＧＧ−（ＳｃＬＣｒ） ＧＡＧＴＧＧＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＴＴＡＧＧＡＧＣ
ＴＣＴＣＡＣＣＴＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣ実施
例６゜ ヒトＰＩＦ突然変異タンパクＩ　ｌ　ｇ７を作成するた
めには、７位のＬｇｕをＩｒｇに変化させる。完全な合
成ＰＩＦ遺伝子を含む実施ｆｌＪ　５のｐａＤプラスミ
ドをＳｐａ　ＩとＮｈｇ（で切断する。大きな断片を単
離し、標準Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶筬中、次の合成りＮＡ
と結合させる。

ＣＴＡＧＴＧＣＡａＴａＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＡＣ
ＧＴ　ｔＡ　ｔＣＡＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣその
結果得られたｐｃＤベクターをＥ　＊　ｃ　ｏ　ｌ　ｉ
　ｒ’ｌ　Ｃ１０６１で増偏、単離し、上述した手法に
従ってＣ０８７サル細胞ヲトランスフエクシヨンスル。

３−４日間インキュベートした後、Ｃ０８７培養液上清
を収穫し、ＰＩＦ活性をアッセイする。

笑施例７゜ ヒトＰＩＦ突然変異タンパクＶａ１２３を作成するため
には、２３位のＩｌｅをＶａｌＫ変化させる。完全な曾
成ＰＩＦ遺伝子を含む実施例５のｐｃＤベクターをＮｈ
ｅ（と５ａｎＢＩ　で切断する。大きな断片を単離し、
標準Ｔ４　　ＤＮＡ’）ガーゼ溶液中、次の合成りＮＡ
と結合させる。

ＣＴＡＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＧ−Ｇ
ＴＧＡＣＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧ、Ａ、−ＡＡＣＴ
ＣＴＧＣＴＧｇＴＡＧＣＣＡＡＴＧＡＧＡＣＴ−ＴＴＧ
ＡＧＡＣＧＡＣｃＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧＡ−ＴＡ
Ｃ ＡＴＧ その結果得られるｐｃＤベクターをＥ、ｃｏｌｉＭＣ１
０６１で増幅、単離し、上述の手法に従いＣ０８７サル
細胞をトランスフェクションスル。３−４日インキュベ
ートした後、Ｃ０８７培養液上清を収穫し、ＰＩＦ活性
をアッセイする。

実施例８ ヒトＰＩＦ突然変異タンパクＧ　Ｅ　１Ｌ４７の構築と
発現ヒトＰＩＦ突然変異タンパクＧ　ｌ　ｕ４７を作成
するには、４７位のＧｌｎをＧｌｕに変化させる。完全
な合成ＰＩＦ遺伝子を含む実施例５のｐｃＤベクターを
ジｄ■と諷ヱＩで切断する。大きな断片を単離し、標準
Ｔ４ＤＮＡ＋）ガーゼ溶液中法の合成りＮＡと結合させ
る。

ＧＡＴＣＴＴＴＱＡＧＧＧＡＡＴＡＧＧＣＡＣＴＡＡＡ
ｃＴｃｃｃＴＴＡＴｃｃＧＴＧＡＧＡＴｃその結果得ら
れるｐｃＤベクターをＥ、ｃｏｌｉＭＣ１０６１で増幅
、単離し、上述の手法に従ってＣ０８７サル細胞をトラ
ンスフェクションする。３−４日インキュベート後、Ｃ
０８７培養液上溝を収穫し、ＰＩＦ活性をアッセイする
。

実施例９ ヒトＰＩＦ突然変異タンパクＬｅ１ＬＩ０４を作成する
ためには、１０４位のＭｅｔをＬａｗに変化させる。

完全な合成ＰＩＦ遺伝子を含む実施例５のｐｃＤベクタ
ーをＥｃｏＲ（と５ａａＩで切断する。大きな断片を単
離し、標準Ｔ４　　ＤＮＡ　　リガーゼ溶液中、次の合
成りＮＡと結合させる。

ＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡｔＴＧＡＡＣＡＣＣ−Ｇ
ＧＡＡＣＣＡＣＡＴａＡＣＴＴＧＴＧＧ−ＧＡＧＴＧＧ
ＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＴＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣ
ＣＴＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣその結果得られる
ｐｃＤベクターをＥ、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１で増幅
、単離し、上述の手法に従いＣ０８７サル細胞ヲトラン
スフエクシヨンする。３−４ロインキュベート後Ｃ０８
７培養液上溝を収穫し、ＰＩＦ活性をアッセイする。

以上の、本発明の具体例の記述は説明及び描写の目的で
提示されたものである。これは本発明を徹、底内に検討
したり、あるいは、開示された正確な形式に限定したり
することを意図したものではなく、上述の説明について
は明らかに多くの修飾や変法が可能である。具体例は本
発明の原理を最もよく説明するために選択し、記述した
ものであり、これを実際に応用することにより、この分
野の技術に精通した者が、いかなる特別な使用にも適し
たいろいろな具体化や修飾を施し、本発明を非常に巧み
に利用することも可能となろう。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプール１１４はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｕ１ｔ１ＬｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ　、　ＵＳ　Ａ　（ＡＴＣＣ）に、
６７２６７の入手番号で保管されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐｃＤ発現及びクローニングベクターを構築
するために用いる、ｐＬｌ及びｐｃＤＶ１プラスミドの
制限酵素認識部位と、主要なコード領域を示す図であり
、 第２図は、マウスＰＩＦの核酸配列と、予想されるアミ
ノ醒配列を示す図である。 （外４名）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式で定義される一連の配列から選択された
   １−１０残基を置換した糖化（グリコシル化）又は非糖
   化ポリペプチドからなる、好酸球コロニー刺激因子活性
   又は、Ｂ細胞分化因子活性を示すタンパク： 【アミノ酸配列があります】 ここで： Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒであり； Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表わし；Ｘ
   （Ｌｅｕ）はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔを表
   わし； Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏ又はＡｌａを表わし；Ｘ（Ｔｈｒ
   ）はＴｈｒであり； Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ又はＰｒｏを表わし；Ｘ（Ｖａｌ
   ）はＶａｌ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅを表わし；Ｘ（Ｇｌｙ
   ）はＧｌｙであり； Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、又は
   Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、又は
   Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒ又はＰｈｅを表わし；Ｘ（Ｈｉｓ
   ）はＨｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ｇｌｎ
   ）はＧｌｎ、Ｇｌｕ、又はＨｉｓを表わし；Ｘ（Ａｓｎ
   ）はＡｓｎ又はＡｓｐを表わし；Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ
   又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ又はＡｓｎ
   を表わし；Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ又はＧｌｎを表わし；
   Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又は
   Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｃｙｓ）はＣｙｓであり；および Ｘ（Ｔｒｐ）はＴｒｐである。
2. （２）上述のポリペプチドが５−残基置換された特許請
   求の範囲第１項記載のタンパク。
3. （３）上述のポリペプチドが２−残基置換された特許請
   求の範囲第２項記載のタンパク。
4. （４）各記号が次の意味のものである特許請求の範囲第
   １項記載のタンパク： Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇであり； Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔを表わし；Ｘ
   （Ｐｒｏ）はＰｒｏであり； Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａであり； Ｘ（Ｖａｌ）はＶａｌであり； Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕを表わし；
   Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅであり； Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒであり； Ｘ（Ｈｉｓ）はＨｉｓであり； Ｘ（Ｇｌｎ）はＧｌｎであり； Ｘ（Ａｓｎ）はＡｓｎであり； Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓであり； Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐであり； Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕであり；および Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕを表わす。
5. （５）上述のポリペプチドが５−残基置換された特許請
   求の範囲第４項記載のタンパク。
6. （６）上述のポリペプチドが２−残基置換された特許請
   求の範囲第５項記載のタンパク。
7. （７）上述のポリペプチドが次式で定義されるアミノ酸
   配列からなる特許請求の範囲第６項記載のタンパク： 【アミノ酸配列があります】
8. （８）下記の式で定義される一連の配列から選択された
   アミノ酸配列をもつ、０−５残基を挿入、０−５残基を
   欠落そして１−５残基を置換した糖化又は非糖化ポリペ
   プチドからなる、好酸球コロニー刺激因子活性又はＢ細
   胞分化因子活性を示すタンパク： 【アミノ酸配列があります】 ここで： Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒであり； Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓを表わし；Ｘ
   （Ｌｅｕ）はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔを表
   わし； Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏ又はＡｌａを表わし；Ｘ（Ｔｈｒ
   ）はＴｈｒであり； Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ又はＰｒｏを表わし；Ｘ（Ｖａｌ
   ）はＶａｌ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅを表わし；Ｘ（Ｇｌｙ
   ）はＧｌｙであり； Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、又は
   Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、又は
   Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒ又はＰｈｅを表わし；Ｘ（Ｈｉｓ
   ）はＨｉｓ、Ｇｌｎ、又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ｇｌｎ
   ）はＧｌｎ、Ｇｌｕ、又はＨｉｓを表わし；Ｘ（Ａｓｎ
   ）はＡｓｎ又はＡｓｐを表わし；Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ
   又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ又はＡｓｎ
   を表わし；Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ又はＧｌｎを表わし；
   Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又は
   Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｃｙｓ）はＣｙｓであり；および Ｘ（Ｔｒｐ）はＴｒｐである。
9. （９）上述のポリペプチドが２残基挿入、２残基欠落そ
   して２残基置換された特許請求の範囲第８項記載のタン
   パク。
10. （１０）上述のポリペプチドが１残基挿入、１残基欠落
    そして１残基置換された特許請求の範囲第９項記載のタ
    ンパク。
11. （１１）下記の式で定義される一連の配列から選択され
    、１０残基置換したポリペプチド部分をコード可能な核
    酸配列から選択された核酸配列からなる、長さ１０から
    １２０塩基の核酸カセット： 【アミノ酸配列があります】 ここで： Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒであり； Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを表わし；
    Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔを
    表わし； Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏ又はＡｌａを表わし；Ｘ（Ｔｈｒ
    ）はＴｈｒであり； Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ又はＰｒｏを表わし；Ｘ（Ｖａｌ
    ）はＶａｌ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅを表わし；Ｘ（Ｇｌｙ
    ）はＧｌｙであり； Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ又はＬ
    ｅｕを表わし： Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒ又はＰｈｅを表わし；Ｘ（Ｈｉｓ
    ）はＨｉｓ、Ｇｌｎ、又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ｇｌｎ
    ）はＧｌｎ、Ｇｌｕ、又はＨｉｓを表わし；Ｘ（Ａｓｎ
    ）はＡｓｎ又はＡｓｐを表わし；Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ
    又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ又はＡｓｎ
    を表わし；Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ又はＧｌｎ表わし； Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｌｅ、Ｖａｌ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｃｙｓ）はＣｙｓであり；および Ｘ（Ｔｒｐ）はＴｒｐである。
12. （１２）下記の式で定義される一連の配列から選択され
    、２残基置換されたポリペプチド部分をコード可能な一
    連の核酸配列から選択された核酸配列からなる、特許請
    求の範囲第１１項記載の核酸カセット： 【アミノ酸配列があります】 ここで： Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒであり； Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを表わし；
    Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔを
    表わし； Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏ又はＡｌａを表わし；Ｘ（Ｔｈｒ
    ）はＴｈｒであり； Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ又はＰｒｏを表わし；Ｘ（Ｖａｌ
    ）はＶａｌ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅを表わし；Ｘ（Ｇｌｙ
    ）はＧｌｙであり； Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒ又はＰｈｅを表わし；Ｘ（Ｈｉｓ
    ）はＨｉｓ、Ｇｌｎ、又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ｇｌｎ
    ）はＧｌｎ、Ｇｌｕ、又はＨｉｓを表わし；Ｘ（Ａｓｎ
    ）はＡｓｎ又はＡｓｐを表わし；Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ
    又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ又はＡｓｎ
    を表わし；Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ又はＧｌｎを表わし；
    Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｃｙｓ）はＣｙｓであり；および Ｘ（Ｔｒｐ）はＴｒｐである。
13. （１３）下記の式で定義されるポリペプチド部分をコー
    ド可能な一連の核酸配列から選択された核酸配列からな
    る特許請求の範囲第１２項記載の核酸カセット： 【アミノ酸配列があります】
14. （１４）下記の式で定義されるポリペプチド部分をコー
    ド可能な一連の核酸配列から選択された核酸配列からな
    る核酸： 【アミノ酸配列があります】
15. （１５）（ａ）下記の式で定義される１０残基置換され
    たポリペプチドをコード可能な一連の核酸配列から選択
    された核酸配列であって、下記のベクターをとりこんだ
    宿主によって発現されうる核酸配列を含むベクターを構
    築すること： 【アミノ酸配列があります】 ここで、 Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒであり； Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇ、Ｈｉｓ、又はＬｖｓを表わし；
    Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔを
    表わし； Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏ又はＡｌａを表わし；Ｘ（Ｔｈｒ
    ）はＴｈｒを表わし； Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ又はＰｒｏを表わし；Ｘ（Ｖａｌ
    ）はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＩｌｅを表わし；Ｘ（Ｇｌｙ）
    はＧｌｙを表わし； Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒ又はＰｈｅを表わし；Ｘ（Ｈｉｓ
    ）はＨｉｓ、Ｇｌｎ、又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ｇｌｎ
    ）はＧｌｎ、Ｇｌｕ、又はＨｉｓを表わし；Ｘ（Ａｓｎ
    ）はＡｓｎ又はＡｓｐを表わし；Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ
    又はＡｒｇを表わし；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ又はＡｓｎ
    を表わし；Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ又はＧｌｎを表わし；
    Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又は
    Ｌｅｕを表わし； Ｘ（Ｃｙｓ）はＣｙｓであり；および Ｘ（Ｔｒｐ）はＴｒｐであり； （ｂ）宿主にベクターを取り込ませること；そして、 （ｃ）核酸配列から上述のポリペプチドを発現させるの
    に適した条件下で宿主を培地中で維持すること； のステップからなる、Ｂ細胞分化因子活性又は好酸球コ
    ロニー刺激因子活性を示すポリペプチドを生産する方法
    。
16. （１６）核酸配列が、下記の式によって定義されるポリ
    ペプチドをコードすることが可能な核酸配列から選択さ
    れる特許請求の範囲第１５項に記載した方法： 【アミノ酸配列があります】
17. （１７）上述のペプチドを上述の培地と上述の宿主から
    分離するステップも含む特許請求の範囲第１６項記載の
    方法。
18. （１８）治療上許容される担体及び特許請求の範囲第１
    項ないし第１０項記載の何れかの式によって定義される
    アミノ酸配列をもつ糖化又は非糖化ポリペプチドからな
    る、有効量のタンパクを含有して成る、免疫グロブリン
    の生産を刺激するための薬剤組成物。
19. （１９）ポリペプチドが下記の式で表わされる、特許請
    求の範囲第１８項記載の組成物： 【アミノ酸配列があります】
20. （２０）特許請求の範囲第１項で定義された配列を０−
    １０残基置換した糖化又は非糖化ペプチド、又は特許請
    求の範囲第２項ないし第１０項で定義されたタンパクの
    有効量を哺乳動物に投与することよりなる、上述の哺乳
    動物における免疫グロブリンのイソタイプＩｇＡのレベ
    ルを増加させる方法。