JP4279289B2

JP4279289B2 - リンパ球化学誘引因子およびその用途

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Publication number: JP4279289B2
Application number: JP2006020169A
Authority: JP
Inventors: デイビッド・エム・センター; ウイリアム・ダブリュー・クルークシャンク; ハーディ・コーンフェルド
Original assignee: Boston University
Current assignee: Boston University
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 2006-01-30
Publication date: 2009-06-17
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: EP1203775A3; JP2006182783A; EP0700439A1; EP1203775B1; EP1155700A2; US6159463A; JP4804529B2; EP1203775A2; JP4278710B2; DE69435177D1; WO1994028134A1; EP1155700A3; ES2320090T3; US5807712A; JP2009149651A; JPH08510907A; ATE419356T1

Description

発明の詳細な説明

（技術分野）
本発明はリンパ球化学誘引因子に関する。

（背景技術）
ＣＤ４は、細胞−細胞付着蛋白であり、Ｔリンパ球のサブセット（クリンスキーら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスィズ・ＵＳＡ、７９巻２３６５−２３６９頁(１９８２年)；ビディソンら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン、１５６巻１０６５−１０７６頁(１９８２年)；およびワイルドら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３１巻１５２−１５７頁(１９８３年)）、単核球細胞（スチュワートら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１３６巻３７７３−３７７８頁(１９８６年)）および好酸球（ランドら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン、１７３巻１５２１−１５２８頁(１９９１年)）上に存在する。リンパ球中で、ＣＤ４はＭＨＣクラスII分子との直接的相互作用（ドイルら、ネイチャー、３３０巻２５６−２５９頁(１９８７年)）によって抗原受容体認識（コリンズら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１４８巻２１５９−２１６２頁(１９９２年)；アンダーソンら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３９巻６７８−６８２頁(１９８７年)；アイヒマンら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１７巻６４３−６５０頁(１９８７年)；ウォーカーら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、１７巻８７３−８８０頁(１９８７年)；スレックマンら、ネイチャー、３２８巻３５１−３５３頁(１９８７年)）に寄与する。さらに、天然の可溶性リンホカイン、リンパ球化学誘引因子(ＬＣＦ)、は単球（クルークシャンクら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３８巻３８１７−３８２３頁(１９８７年)）、好酸球（ランドら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン、１７３巻１５２１−１５２８頁(１９９１年)）およびＴリンパ球（クルークシャンクら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３８巻３８１７−３８２３頁(１９８７年)；クルークシャンクら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１４６巻２９２８−２９３４頁(１９９１年)）中に走化活性を誘発するためにＣＤ４の細胞表面発現が必要である。その化学的誘引活性と協力して、ＬＣＦはヒトＴリンパ球の受容能力成長因子として作用する（クルークシャンクら、ジャーナル・オブ・イムノロジー１３８巻３８１７−３８２３頁(１９８７年)）。

ＬＣＦは陽イオン性の、４個の１４−ｋＤ単量体の鎖の４量体で示される５６−ｋＤ糖タンパク質である。ＬＣＦはＴリンパ球によって産生され、具体的にはＣＤ４^＋Ｔ細胞、単球および好酸球のための化学誘引因子である（例えば、バーマンら、セルラー・イムノロジー、９５巻１０５−１１２頁(１９８５年)；ランドら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン、１７３巻１５２１−１５２８頁(１９９１年)参照）。ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＬＣＦの分泌はミトゲン、抗原、ヒスタミンまたはセロトニンによる刺激後に生じる。後者の２つは脱顆粒されたマスト細胞および塩基性染色細胞が遅延型過敏症反応の組織部位に存在することから、特に興味深い。マスト細胞および塩基性染色細胞生成物によるＬＣＦの誘導は免疫応答の初期の仲介物質段階と後期のＴ−リンパ球−支配炎症反応の発達段階の間を連結する。

発明の要約
概して、本発明は組換リンパ球化学誘引因子（ＬＣＦ）ポリペプチド、例えば、原核生物またはバキュロウイルス発現系で産生されるＬＣＦとして特徴づけられる。好ましくは、このポリペプチドは図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１(配列番号１)）と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。「リンパ球化学誘引因子ポリペプチド」とは、ＣＤ４と特異的に結合し、適当な生物学的現象のＬＣＦ−仲介カスケードのきっかけを与えるものであり、例えば、不活性化または活性化ＣＤ４^＋リンパ球、塩基性染色細胞、単球などの遊走を促進または刺激し得るポリペプチドである。「ポリペプチド」とは、長さまたは後−翻訳修飾（例えば、グリコシル化）に関係なくアミノ酸の鎖をいう。「実質的に同一の」アミノ酸配列とは、保存的アミノ酸置換、例えば、１個のアミノ酸を同種の他のアミノ酸（例えば、グリシンに対するバリン、リジンに対するアルギニンなど）による置換、またはポリペプチドの生物学的活性を消失させないアミノ酸配列の部位における１個またはそれ以上の非−保存的アミノ酸の置換、削除または挿入だけが異なるアミノ酸配列を意味する。このような均等なポリペプチドは、天然にこのようなポリペプチドを産生し得るか、またはそのように誘導され得る動物の組織または細胞から、下記に記載の方法またはそれらと均等な方法を用いて抽出によって分離され得るか、または化学的合成法によって、または組換ＤＮＡ技術の標準的な技法、例えば、このようなポリペプチドをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの分離、によって分離され得る。

他の態様としては、本発明はＬＣＦアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すＬＣＦのフラグメントまたは類縁体を特徴とする。すなわち、本発明はＬＣＦポリペプチドの生物学的活性フラグメントまたは類縁体を含む。「生物学的活性」とは、図２（配列番号１）に示される１３０−アミノ酸ＬＣＦポリペプチドの特徴であるなんらかの活性を有することをいう。ＬＣＦポリペプチドは一定の範囲の生理学的特性示し、このような特性はＬＣＦポリペプチド分子の種々の部分に起因し得るから、有用なＬＣＦポリペプチドフラグメントまたはＬＣＦポリペプチド類縁体は、ＬＣＦポリペプチド活性についての生物学的試験、例えば、ここに記載のアッセイにおいて、生物学的活性を示すものである。それはＬＣＦポリペプチド試験において、ＬＣＦポリペプチド（図２；配列番号１で示される）の活性の最も好ましくは１０％、より好ましくは４０％、または少なくとも９０％を有するものである。

好ましい類縁体は、配列が保存的アミノ酸置換、例えば、１個のアミノ酸を他の同様の特性を有する他のアミノ酸（例えば、グリシンに対するバリン、リジンに対するアルギニンなど）との置換、またはポリペプチドの生物学的活性を消失させない１個またはそれ以上の非保存的アミノ酸の置換、削除または挿入のみが、野生型配列と異なるＬＣＦポリペプチド（またはそれらの生物学的活性フラグメント）を含む。他の有用な変異体にはペプチドの安定性を増大させたもの；このような類縁体には、例えば、１個またはそれ以上の非ペプチド結合（ペプチド結合に代替し得る）か、またはペプチド配列中にＤ−アミノ酸を含み得る。

類縁体はアミノ酸配列において天然生成のＬＣＦポリペプチドと異なり得るか、または配列が関与しない方法で修飾され得るか、またはその両方である。本発明の類縁体は、一般に天然生成ＬＣＦポリペプチド配列の２０個のアミノ酸残基、より好ましくは４０個以上のアミノ酸残基のセグメント、さらにより好ましくは完全配列を有する、一般に少なくとも７０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％または９９％の相同性を示す。

最初の配列の変更は天然および誘導の両方の遺伝学的変異体を含む。また、類縁体には天然生成Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然生成または合成アミノ酸、例えば、βまたはγアミノ酸を含むものも含まれる。他方、安定性の増大はペプチド分子の環化によって与えられる。修飾には、ポリペプチドのインビボまたはインビトロの化学的誘導体化、例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、フレミレーション、イスプレミレーション、ミリスチル化、カルボキシル化またはグリコシル化を含む。グリコシル化は、例えば、その合成およびプロセシングまたはさらなるプロセシング工程中の、ポリペプチドのグリコシル化様式を変えることによって、例えば、正常にこのようなプロセシングをもたらす細胞から誘導されるグリコシル化作用酵素、例えば、哺乳動物グリコシル化酵素にこのポリペプチドをさらすことによって変更され得る；リン酸化はリン酸化−修正酵素、例えば、キナーゼまたはホスファターゼその他、にこのポリペプチドをさらすことによって変更し得る。「実質的純粋」とは、本発明によって提供されるＬＣＦポリペプチドが、本来それが結合しているタンパク質および天然−生成有機分子を少なくとも６０重量％含まないことを意味する。好ましくは、調製物の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％および最も好ましくは少なくとも９９重量％のＬＣＦポリペプチドであることである。実質的に純粋なポリペプチドは、例えば、下記に概要を述べる方法を用いて、天然資源（例えば、ヒト周辺血液単核細胞）からの抽出によって；または組換ＤＮＡ技術の標準的な技法、例えば、ＬＣＦポリペプチドをコードする組換核酸の発現による分離、例えば、このようなＬＣＦポリペプチドをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの分離によって、またはタンパク質、フラグメント、またはそれらの類縁体の化学的合成によって得られる。純度は適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定することができる。

別の態様として、本発明は、上記のＬＣＦポリペプチド（またはポリペプチドフラグメントまたはそれらの類縁体）をコードする実質的に純粋なＤＮＡを特徴とする。好ましくは、このＤＮＡは図２（配列番号２）に示されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。さらに、このようなＤＮＡはｃＤＮＡであり、哺乳動物、例えば、ヒトのＬＣＦポリペプチドをコードしている。本発明はまたこの実質的に純粋なＤＮＡを含み、ベクター含有細胞中にこのＤＮＡによってコードされたタンパク質の発現を誘導し得るベクターを特徴とするものである。本発明の特徴は実質的に純粋なＤＮＡを含む細胞である。細胞は原核細胞、例えば、Ｅ．コリ、または真核生物、例えば、哺乳動物細胞または節足動物、例えば、バッタのいずれでもよい。

「実質的に純粋なＤＮＡ」とは、本発明のＤＮＡが誘導される生物の天然生成ゲノム中にその遺伝子の両端に隣接する遺伝子を含まないことを意味する。従って、この用語は、例えば、ベクター中、自律的複製プラスミドまたはウィルス中、または原核細胞または真核細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる組換ＤＮＡか；または他の配列と独立して別の分子（例えば、ｃＤＮＡ、またはポリメラーゼ・チェイン・リアクション(ＰＣＲ)方法論または制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるゲノムあるいはｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換ＤＮＡを含む。この用語はまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換ＤＮＡを含む。

別の態様として、本発明は組換ＬＣＦポリペプチド（またはそれらのフラグメントまたは類縁体）を製造する方法を特徴とする。この方法は（ａ）細胞中での発現のために位置するＬＣＦポリペプチドまたはそれらのフラグメントまたは類縁体をコードするＤＮＡで形質転換した細胞（例えば、Ｅ．コリまたはＳ．フルギデラ）を提供すること、（ｂ）ＤＮＡを発現するための条件下で、形質転換された細胞を培養すること、（ｃ）組換ＬＣＦポリペプチドを分離すること、を含む。「形質転換された細胞」とは、組換技術によって、ＬＣＦポリペプチドをコードするＤＮＡ（この明細書中で用いる場合）を導入された細胞（またはその原型）をいう。このようなＤＮＡ分子は「発現のために位置して」おり、このことは、そのＤＮＡ分子が配列の転写および翻訳を管理するＤＮＡ配列（すなわち、例えば、ＬＣＦまたはそれらのフラグメントまたは類縁体の産生を容易にする）に隣接して位置することをいう。

なおまた、別の態様として、本発明はＬＣＦ（またはそれらのフラグメントまたは類縁体）に優先的に結合する実質的に純粋な抗体を特徴とする。「実質的に純粋な抗体」とは、本来それが結合しているタンパク質および天然−生成有機分子を少なくとも６０重量％含まない抗体を意味する。好ましくは、この調製物の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％および最も好ましくは少なくとも９９重量％の抗体、例えば、ＬＣＦ抗体であることである。実質的に純粋なＬＣＦ抗体は、例えば、組換−産生ＬＣＦポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーおよび標準技術によって得られる。さらに、この精製された抗体は、本来結合している他のタンパク質、炭水化物および脂肪が十分に除去されており、治療的投与が可能である。このような「抗体」がＬＣＦポリペプチド（またはそれらのフラグメントまたは類縁体）に「優先的に結合する」とは、すなわち、他の抗原的−無関係分子を実質的に認識しないことをいう。

好ましくは、この抗体はそれが結合するタンパク質の生物学的活性を中和する。「中和」するとは、部分的または完全に（例えば、ＬＣＦポリペプチドの生物学的活性）を阻害することをいう。
他の態様において、上記のポリペプチドまたは抗体は治療的組成物の活性成分として用いられる。このような治療的組成物において、活性成分は生理学的に許容され得る担体とともに処方される。これらの治療的組成物はＬＣＦ−ＣＤ４相互作用仲介生理学的応答を抑制または擬態する方法に用いられる。具体的には、これらの方法は免疫応答／または炎症を減少させるために用いられる。この方法を実施するのに有用な化合物は、これらに限定されるものではないが、ＬＣＦ抗体、またはＬＣＦフラグメントまたは類縁体、または、例えば、有機化合物などの薬物である。

さらに、他の態様として、本発明は候補化合物のＬＣＦとＣＤ４の相互作用を阻害する能力についてのスクリーニング方法を特徴とする。この方法は、ａ）候補アンタゴニスト化合物とＬＣＦとを混合し；ｂ）ＬＣＦ−ＣＤ４結合を測定し；ｃ）その結合を妨げる化合物をアンタゴニスト化合物として確認することを含む。
なおまた、別の態様として、本発明は候補化合物のＬＣＦ活性を擬態する能力についてのスクリーニング方法を特徴とする。この方法は、ａ）候補アゴニスト化合物とＣＤ４受容体とを混合し；ｂ）上記化合物のＣＤ４受容体に対する結合を測定し；ｃ）ＣＤ４受容体に結合し、細胞遊走を仲介する化合物をアゴニスト化合物として確認することを含む。
別の態様として、本発明は、哺乳動物におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を刺激するための組成物を特徴とし、この組成物はＬＣＦおよび成長因子を含む。この組成物は、例えば、１：１００から１：１（成長因子に対するＬＣＦ）の範囲で相乗作用を生じさせる割合でＬＣＦおよび成長因子を含む。好ましくは、成長因子は、サイトカインであり、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、インシュリン、およびインシュリン−様成長因子Ｉである。

本発明はまた、哺乳動物におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を刺激する方法を特徴とし、この方法は、ＬＣＦおよびＩＬ−２を共に、または相乗作用を生じさせるのに十分な程度に時間的に近接させて、細胞と接触させることを含む。好ましい具体例において、この方法は哺乳動物（例えば、ヒト患者）にＬＣＦおよび成長因子の有効量を投与する方法であって、成長因子と組み合わせたＬＣＦの増殖活性が成長因子の不存在下でのＬＣＦの増殖活性およびＬＣＦ不存在下での成長因子の増殖活性より大きいことを特徴とする方法を含む。好ましい具体例において、成長因子はサイトカインであり、所望により、組成物の投与は１回以上である。

本発明のタンパク質は、免疫応答および炎症の両方の重要な構成要素および仲介体である、例えば、好酸球、単球およびＴリンパ球などの分化免疫細胞に遊走の誘発のきっかけとなる現象に関与していると考えられている。従って、このようなタンパク質は、Ｔリンパ球、単球および好酸球の活性化およびその後の浸潤に関係する過剰反応性免疫反応および炎症の処置、または処置のための治療剤の開発に有用である。本発明のタンパク質および／または方法を用いて治療され得る具体的な疾患として、これらに限定されるものではないが、肉芽腫性免疫反応、例えば、組織−侵入性蠕虫寄生虫によるもの、アレルゲンに対する皮膚性および呼吸性遅延型反応、喘息、ザルコイドーシス、過敏性肺炎、間隙性肺線維症、結核、慢性間接リウマチ、およびエリテマトーデス、同種異系臓器移植拒否反応、接触性（細胞媒介）皮膚炎、および免疫性媒介皮膚病（例えば、類天疱瘡および水泡性類天疱瘡）が含まれる。上記の疾患に関する総合的記載は内科学指針１２版（ウイルソンら、マックグローヒル・インコーポレーション、ニユーヨーク）に見ることができる。好ましい治療剤は、アンタゴニスト、例えば、ペプチドフラグメント、または抗体、または薬物であり、これらはＬＣＦ：ＣＤ４受容体相互作用およびＬＣＦによって生じる付随性生物学的活性を妨げることによって、ＬＣＦまたはＬＣＦ：ＣＤ４受容体機能を阻害する。

組換ＬＣＦはまた、免疫抑制剤としてまたは免疫抑制的治療の一部として用いられ得る。特に、組換ＬＣＦは、結局は組織または臓器移植の免疫学的拒否反応をもたらす現象のカスケードを弱め、妨げまたは阻害するのに役立ち得る。例えば、組換ＬＣＦは、患者の腎臓、肺または心臓−肺同時、または肝臓の移植の拒否反応を弱め、妨げ、または阻害するために用いられ得る。さらに、ＣＤ４受容体との相互作用および結合能力によって、組換ＬＣＦは、ＣＤ４^＋受容体保有細胞を選択的に破壊する免疫毒の設計に有用である。最後に、組換ＬＣＦは、単独でまたは他の化合物（例えば、成長因子）と組み合わせて、ＣＤ４リンパ球数の減少した患者のＣＤ４リンパ球数の活性化および補充に用いられ得る。

なぜなら、ＬＣＦは今や組換技術によって調製され得、また候補のアンタゴニストおよびアゴニストは上記のアッセイによってスクリーニングされ得るからである。本発明は有用な治療剤の確認のための簡単かつ迅速な手段を提供するものである。従来は、不十分なＬＣＦが動物モデルの疾患におけるＬＣＦの役目を確認するのに用いられており、抗体およびＤＮＡおよびＲＮＡプローブは、これまで障害組織中のＬＣＦタンパク質または遺伝子発現の検索に利用されていなかったから、このような手段は不可能であった。
すなわち、確認されて始めて、ペプチド−または抗体−含有治療剤が、大量にかつ安価に、組換および分子生物学的技術および本発明の方法を用いて製造され得る。最後に、合成化合物、例えば、有機化合物はＬＣＦ：ＣＤ４相互作用に対する効果を評価するためにここに概括した方法によって容易にスクリーニングされ得る。
本発明の他の特徴および利点は下記のそれらの好ましい態様および請求の範囲の記載から明らかであろう。

好ましい態様の詳細な説明
ＬＣＦポリペプチド
本発明のＬＣＦポリペプチドは、(図２、配列番号１に記載）完全な長さのＬＣＦポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、任意の資源から得ることができる。これらのポリペプチドは、例えばＬＣＦ：ＣＤ４受容体相互作用またはＬＣＦ：仲介生理学的反応（下記参照）を妨害するアンタゴニストのスクリーニングに使用する。ＬＣＦフラグメントまたは類縁体は、ＬＣＦ：ＣＤ４受容体活性のアンタゴニストの有効な候補でもあり得る。ＬＣＦフラグメントまたは類縁体アンタゴニストの効果は、そのＣＤ４と相互作用する能力に依存する；このような相互作用は、多くの標準的結合法およびＬＣＦ−仲介ＣＤ４受容体機能アッセイ（例えば、下記に記載）を使用して容易に試験し得る。本発明のポリペプチドは、ＣＤ４受容体と相互作用する能力を有し、ＬＣＦ生理学的カスケードを仲介する任意のフラグメントまたは類縁体、即ちＬＣＦアゴニストをも含む。

興味の対象の特異的ＬＣＦポリペプチドフラグメントは、ＣＤ４受容体と相互作用できるＬＣＦポリペプチドの任意の部分、例えば総てまたはＮ末端の一部または、例えば親水性ドメインを含む。親水性分析（図９参照）および生物的阻害データに基づくと、他の可能性のある候補は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ（図５参照）およびＬＣＦ（図２および配列番号１）のアミノ酸９６−９９由来のＦＥＡＷ（Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｔｒｐ）配列を含むが、これらに限定されない。このようなフラグメントは、アゴニストまたは（上記のような）アンタゴニストとして有用であり得、ＬＣＦの活性を中和する抗体を産生する免疫源としてまた有用である（下記参照）。

別法として、アミノ酸一次配列から、タンパク質二次構造、従ってＬＣＦのドメインを、任意の標準的疎水性／親水性計算、例えばチョウ−ファスマン法（例えば、チョウおよびファスマン、Ann.Rev.Biochem. 47:251、1978）を使用して、半経験的に推論し得る。親水性ドメインは、それ自身抗原性の強力な候補として、疎水性領域は結合領域として存在するため、有用なアンタゴニストまたはアゴニストである。

次いで、候補フラグメント（例えば、ドメインＡまたはＤの全部または一部；図９参照）は、本明細書に記載のアッセイで、ＣＤ４受容体との相互作用およびＬＣＦ−仲介生理的反応を誘発する、即ちＬＣＦアゴニストとして役立つ能力について試験される。フラグメントは、本明細書に記載のアッセイを用いて、ＬＣＦとＣＤ４の相互作用と拮抗する能力についても試験される。（上記の）有用なＬＣＦフラグメントの類縁体をも産生され、スクリーニング用成分またはアンタゴニストとしての効果について試験する（本明細書に記載のアッセイを使用）；このような類縁体は、本発明でまた有用であると見なされる。
以下に、本発明で有用なヒトＬＣＦｃＤＮＡのクローニングおよび特徴を記載する。この実施例は、本発明を説明する目的で記載され、限定するものと見なしてはならない。

ヒトＬＣＦｃＤＮＡの単離
ヒトＬＣＦ遺伝子は下記のようにして単離した。
ミトゲン−刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｃＤＮＡライブラリーを、ＣＯＳ細胞発現ベクターｐＸＭ（ウォンら、Science 228:801-815、1985）にライゲートした。プールされたプラスミドでトランスフェクションした細胞由来の上清を、修正ボイデンチャンバーアッセイ（クルークシャンクら、J.Immunol. 128:2569-2574、1982）を使用してリンパ球化学誘引活性についてスクリーニングした。トランスフェクション２４時間後に集めた上清を、マイクロチャンバーの下部ウェルに入れた。これらの上清の存在に反応したヒトＴ細胞の８μｍニトロセルロースフィルターを通した遊走を測定し、疑似（ベクターのみ）トランスフェクションＣＯＳ細胞と比較した。化学誘引活性を有する上清を更に、フルオレセイン結合抗−Ｔac抗体とインキュベーションした細胞をＦＡＣＳ分析することにより、休止Ｔ細胞にＩＬ−２Ｒを発現する能力について、およびこの誘発を阻止するモノクローナルＯＫＴ４抗体のＦａｂフラグメントの能力をスクリーニングした（クルークシャンクら、J.Immunol. 138:3817-3723、1987）。７種の異なったサブクローニングをスクリーニングし、サブクローン化された元の上清中の上清当たり約２００クローンが、陽性であることが判明した。次に、上清を、上清当たり１個のクローンが得られるまで連続してサブクローン化および希釈した。ＬＣＦ含有上清の存在について確立された基準は、両方のアッセイにおける陽性反応および、さらに、ＯＴＫ４抗体（Ortho Pharmac, Raritan, N.J.）から産生されたＦａｂフラグメントと共にインキュベーションして、活性が阻害されることであった。これらの特徴を有する単一クローン（ＬＣＦ−７）を単離し、両方の鎖をジデオキシヌクレオチド鎖停止法（サンガーら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467、1977）で配列決定した。配列分析およびノーザン・ブロット（図１）は、ＬＣＦ−７ｃＤＮＡが完全な長さ（表示の配列のヌクレオチド４４１から１４５０に対応）でないことを示唆した。次いで、バクテリオファージラムダＺＡＰ中にライゲートされた２番目のミトゲン刺激ヒトＰＢＭＣｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに、ＬＣＦ−７ｃＤＮＡを使用した。１２５,０００プラークを完全な長さのＬＣＦ−７でスクリーニングした。スクリーニングにおいて、０.６−から２.２−ｋｂの大きさの範囲の３個のクローンを単離した。最も大きいクローンは、両方の鎖を配列決定した(図２；配列２参照)。２個の短いクローンの部分的な配列決定は、それらがＬＣＦ−Ａと同一であるが、５’方向が不完全な長さであることを明らかにした。

上記のように、ＬＣＦｃＤＮＡは、ミトゲン刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）のＣＯＳ細胞発現ライブラリーから、スクリーニングにより単離された。上清は、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞走化性の誘発によるＬＣＦの存在およびＩＬ−２受容体(ＩＬ−２Ｒ)の上向調節により測定される、細胞周期の変化について試験した（クルークシャンクら、J.Immunol. 138:3817-3823、1987）。以下の４連続スクリーニングにより、１−ｋｂの単一クローン由来の陽性上清を同定した。ヒトＴ細胞から単離された全ＲＮＡのノーザン・ブロットをプローブするためにＬＣＦｃＤＮＡを使用した（図１）。２.２−ｋｂの単一バンドを検出した。完全な長さのクローンを単離するために、１−ｋｂＬＣＦｃＤＮＡを、２番目のミトゲン刺激ヒトＰＢＭＣｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに使用した。３個のクローンを単離し、最も大きいクローンの配列を図２および配列番号２に示す。

ＬＣＦｃＤＮＡ内に、ヌクレオチド７８３から１１７６に存在する３９３塩基対の読み取り枠があり、これは、推定分子量１３,３８５ダルトンの１３０残基タンパク質をコードしている。ヌクレオチド７８３のメチオニンは、フィッケット分析（フィッケット、Nucleic Acids Res. 10:5303-5318、1982）による開始の良い情況にある。他の唯一の可能な開始部位は、下流にあり、枠内であり、推定アミノ酸配列の３８残基に相当する。開始メチオニンの５残基後に位置するセリンに一つの有力なＮ−架橋グリコシル化部位がある。先行技術は、天然ＬＣＦが分泌されたサイトカインであることを示唆しているが（クルークシャンクら、J.Immunol. 128:2569-2574、1982）、推定アミノ酸配列中には、一致する疎水性シグナル配列はないが、有効な膜透過ドメインもない。ほとんどの分泌されたサイトカインはシグナル配列を含むが、シグナル配列の欠如は、分泌ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの両方に報告されている。同じく、ゲンバンク核酸およびタンパク質データベースの検索では、関連配列は発見されなかった。ＤＮＡおよびタンパク質相同性検索は、ゲンバンクおよびＰＩＲデータベースのＦＡＳＴＡ、ＳＥＡＲＣＨおよびＢＬＡＳＴプログラムを使用して行った。

ＲＮＡ単離およびノーザン分析
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、既述のフィコール−パーク密度勾配遠心で調製した（クルークシャンクら、J.Immunol. 138:3817-3823、1987；クルークシャンクら、J.Immunol. 146:2928-2934、1991）。Ｔリンパ球集団を、プラスチック粘着、ついでナイロンウール粘着および最後にヒツジ赤血球ロゼットおよび遠心により精製した。ペレットから回収した細胞は、蛍光分析により測定して、＞９９％Ｔリンパ球であった。単核細胞を、Ｔリンパ球を減少させるためにヒツジ赤血球ロゼット法を行い、続いてロゼット工程の後、上清に残っている細胞のプラスチック粘着を使用してＰＢＭＣから精製した。プラスチックから回収された粘着細胞は、蛍光分析で＞９２％単核細胞であった。全ての細胞を冷４Ｍグアニジウムイソチオシアネートに融解し、ＲＮＡをＣｓＣｌ遠心で単離した（オースベルら、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク、1989）。各サンプル由来のＲＮＡ１０μｇを、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルに電気泳動のために導入し、ナイロン膜上にブロットした。組換ＬＣＦ−７の７０４ｂｐＰｓｔＩフラグメント由来のｃＤＮＡプローブを、ランダムプライマー法（ファインベルグら、Anal.Biochem. 132:6-13、1983）で［^３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識し、ブロットを１×１０^６ｃｐｍ／ｍｌで２４時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズした後、ブロットを０.２×ＳＳＣ（３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム、０.０５％ピロリン酸ナトリウム、０.１％ラウリルサルコシンナトリウム）で５６℃にて洗浄し、オートラジオグラフィーでハイブリダイゼーションを可視化した。図１に示すように、プローブは、約２.２キロ塩基対のリンパ球ＲＮＡと特異的にハイブリダイズした。このことは、ＬＣＦがＴリンパ球内で発現されていることを確認し、クローンが完全な長さであったことを示した。

ＬＣＦポリペプチド発現および合成
本発明のポリペプチドは、好適な発現ビヒクル中の、ＬＣＦコードｃＤＮＡフラグメントの全部または一部（例えば、上記のｃＤＮＡ）で好適な宿主細胞を形質転換することにより製造し得る。

分子生物学の分野の当業者には、任意の広範囲の発現系を組換ＬＣＦタンパク質を提供するために使用し得ることが理解される。使用された正確な宿主細胞は、本発明では重要ではない。ＬＣＦポリペプチドは、原核宿主（例えば、Ｅ.コリ）または真核宿主（例えば、Ｓ.セレビシアエまたは哺乳類細胞、例えばＣＯＳ１、ＮＩＨ３Ｔ３およびＪＥＧ３細胞、もしくは節足動物の細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(ＳＦ９)細胞）中で産生され得る。このような細胞は、広範囲の資源(例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックランド、ＭＤ；例えば、オースベルら、前掲もまた参照）から利用可能である。トランスフェクション法および発現ビヒクルの選択は、選択した宿主系に依存する。形質転換およびトランスフェクション法は、例えば、オースベルら、前掲に記載されている；発現ビヒクルは、例えばクローニング・ベクターズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｐ.Ｈ.パウエルズら、1985、追補1987）に提供されているものから選択し得る。

好ましいＬＣＦ発現系の一つは、オースベルら（前掲）に記載の、原核生物発現系である。すなわち、フランキングＢａｍＨ１およびＮｄｅ１制限部位を伴うＬＣＦｃＤＮＡ読み取り枠を含むＤＮＡフラグメントを、標準法に従ったＰＣＲにより産生させ、Ｅ.コリ発現ベクターｐＴ−１６ｂ（ノヴァゲン）中にライゲートした。次いで、このプラスミド、ｐＥＴ−１６６−ＩＣＦを、Ｅ.コリＪＭ１０９を形質転換するのに使用した。組換ＬＣＦの産生を刺激するために、形質転換細菌をＩＰＴＧで刺激し、培養培地中で成育させ、続いて融解させた。組換タンパク質を、周知の方法の金属キレートクロマトグラフィー（例えば、ステュディール、Meth.Enzymol. 185:60-89、1990参照）により単離した。組換ＬＣＦは、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し（図３Ａ）、プロブロットトランスファーフィルター（アプライド・バイオシステムズ）にブロットした。１７.５ｋＤａの見かけ分子量に見られる顕著なバンドを切り取り、標準法に従ったＮ−末端アミノ酸配列決定に付した。組換ＬＣＦのＮ−末端の２５アミノ酸残基を配列決定し、図２（配列番号１）に示した推定アミノ酸配列と同じであることが分かった。１７.５ｋＤａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ質量は、ヌクレオチド配列に基づいて推定した１３.４ｋＤａより大きいが、^３５Ｓ−標識インビトロ翻訳タンパク質の遊走パターンは同じである(図３Ｂ)。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量と、推定分子量の違いは、ＳＤＳアクリルアミドゲル系における組換ＬＣＦの異常な遊走によるものであり得る。

他の好適なＬＣＦ発現系は、オースベルら（前掲）に記載のバキュロウィルス発現系である。ＬＣＦポリペプチドをコードするＤＮＡを、好適な輸送ベクター、例えばｐＶＬ１３９２（インビトロゲン・コーポレイテッド、サンディエゴ、ＣＡ）に挿入する。次いで、ベクターを野生型バキュロウィルスゲノムＤＮＡと共にスポトプテラ・フルギペルダ（ＳＦ９）細胞（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１７１１）に共形質導入し、組換ウィルスを例えばオースベルら（前掲）のような標準法で単離する。バキュロウィルス系で製造された組換ＬＣＦは、図３Ａおよび図３Ｂに示したＥ.コリ発現系を使用して合成されたタンパク質と同様の見かけの分子量１７.５ｋＤａのタンパク質を産生することが判明した。バキュロウィルス組換ＬＣＦの最初の５個のＮ−末端アミノ酸残基の配列決定を行った。配列は、図２（配列番号１）に示す、７８３位に開始部位としてのメチオニンを有する推定アミノ酸配列と同じであることが判明した。

別法として、ＬＣＦポリペプチドは、安定に形質導入された哺乳類細胞系により産生し得る。哺乳類細胞の安定な形質導入に好適な多くのベクターが、一般に利用可能である、例えば、パウエルズら（前掲）参照；このような細胞系を構築する方法は、また一般に利用可能である、例えばオースベルら（前掲）。一つの例として、ＬＣＦポリペプチドをコード化するｃＤＮＡを、ジハイドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発現ベクター中にクローン化する。プラスミド、即ちＬＣＦコード遺伝子の宿主細胞染色体中への組込みは、細胞培養培地中の０.０１−３００μＭメトトレキサートの包含により選択される（オースベルら、前掲に記載に従う）。この優性選択は、殆どの細胞型で達成できる。組換タンパク質発現は、形質導入遺伝子のＤＨＦＲ−媒介増幅により増加できる。遺伝子増幅を担う細胞系の選択法は、オースベルら（前掲）に記載されている；このような方法は、一般に、メトトレキサートを段階的に増加させた濃度で含む培地中での広範な培養を含む。この目的で通常使用されるＤＨＦＲ−含有発現ベクターは、オースベルら（前掲）に記載のｐＣＶＳＥＩＩ−ＤＨＲＦおよびｐＡｄＤ２６ＳＶ(Ａ)を含む。上記の任意の宿主細胞または、好ましくはＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系（例えば、ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞、ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ９０９６）は、安定に形質導入された細胞系またはＤＨＦＲ媒介遺伝子増幅のＤＨＦＲ選択に好ましい宿主細胞の中の一つである。

一度組換ＬＣＦポリペプチドが発現されれば、それを、例えばアフィニティクロマトグラフィーを使用して分離する。実施例において、組換可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）とＣＮＢｒセファロース４Ｂに、先に記載の方法（例えば、クルークシャンクら、Journal of Immunology 1991）に従って結合させることにより、ＣＤ４アフィニティカラムを製造した。すなわち、ｒｓＣＤ４１００μｇを、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア、ピスキャタウェイ、ＮＪ）と共有結合させた。次に、ＬＣＦのインビトロＲＮＡ転写物を産生させ、ウサギ網状赤血球融解物で、標準法に従って、［^３５Ｓ］メチオニン存在下、インビトロ翻訳するのに使用した。^３５Ｓ−標識インビトロＬＣＦを、３時間、３７℃でカラムに付し、その時点でカラムを洗浄緩衝液（０.０１Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ８.０、０.１４ＭＮａＣｌ、０.０２５％ＮａＮ_３、０.５％トリトンＸ−１００、０.５％デオキシコール酸ナトリウム）で完全に洗浄した。ＬＣＦをトリエタノールアミン溶液（５０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ１１、０.１トリトンＸ−１００、０.１５ＭＮａＣｌ）で、１Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ６.７を含む管に溶出させ分析した。

分離後、組換タンパク質は、所望により、例えば高速液体クロマトグラフィーにより、更に精製し得る。ポリペプチド発現および精製のこれらの一般的な技術も、また有用なＬＣＦフラグメントまたは類縁体（下記参照）を産生および分離のために使用し得る。更に、次いで、溶出物を、所望によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、オートラジオグラフィーで可視化し得る（例えば、図３に示す上記実験の結果参照）。
最後に、ＬＣＦポリペプチド、特に短いＬＣＦフラグメントは化学合成により産生できる（例えば、ソリッド・フェーズ・ペプチド・シンセシズ、1984、第２版、スチュワートおよびヤング編集、ピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、ＩＬに記載の方法により）。

ＬＣＦの結合および機能アッセイ
本発明に有用なＬＣＦポリペプチドフラグメントまたはその類縁体は、ＣＤ４受容体と相互作用をする（たとえばＬＣＦアゴニストまたはアンタゴニストなど）。このような相互作用は、インビトロ結合アッセイ（後記）を行い、次いで機能分析を行うことによって検出される。このように、該フラグメントまたはその類縁体を、機能（すなわちＣＤ４受容体に結合し、Ｔ４^＋リンパ球、単球、好酸球などの遊走を誘発する能力）に関してアッセイすることもできる（後記）。これらのアッセイは、ＬＣＦ（あるいは適当なＬＣＦフラグメントまたはその類縁体）および結合を検出しうる形状の組換可溶性ＣＤ４受容体（ｒｓＣＤ４）またはＣＤ４受容体産生細胞（たとえば好酸球）から構成される。すなわち、本発明はＬＣＦアゴニストとして有用な化合物をスクリーニングする方法を包含する。

このようなアッセイ法の一例を以下に示す。全長ＬＣＦポリペプチド（フラグメントまたはその類縁体）は前述の記載にしたがって生産される。ＣＤ４受容体成分は、組換可溶性成分として生産されるか、またはＴリンパ球、単球または好酸球などによる膜成分生産される。
次に、ＬＣＦ（フラグメントまたはその類縁体）のｒｓＣＤ４またはＣＤ４受容体含有細胞に対する結合の度合を定量するインビトロアッセイを行う。たとえば、全細胞アッセイは、ＣＤ４受容体を発現する細胞（たとえば好酸球）を、当業者に公知の手段［オースベルらの前記文献を参照］によって固相基質（たとえば試験管またはマイクロタイターウエル）に固定し、該基質に標識したＬＣＦポリペプチド（たとえば^１２５Ｉ−標識ＬＣＦ）を接触させることによって行われるのが好ましい。ＬＣＦの標識（たとえば^１２５Ｉで）は当業界における標準法にしたがって行う。結合のアッセイは、受容体成分に結合した標識（すなわち固相基質およびＣＤ４受容体に結合した標識）を検出することにより行う。

該アッセイの形式は、適切な結合検出のための多くの適当な形式のうちのいずれを用いてもよく、たとえばラジオイムノアッセイ形式が挙げられる［オースベルらの前記文献を参照］。ＣＤ４受容体産生細胞を固相基質（たとえばマイクロタイタープレートのウエル）に固定し、^１２５Ｉなどの放射性標識あるいはアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどのアッセイ可能な酵素によって検出可能に標識されたＬＣＦポリペプチドと反応させるのが好ましい。すなわち、^１２５Ｉ標識ＬＣＦを細胞に結合させ、その特異的活性のアッセイを行う；特異的結合は過剰の非標識ＬＣＦポリペプチドの存在下に行った結合アッセイとの比較により測定される。
別法として、ＬＣＦポリペプチド（フラグメントまたはその類縁体）を固相基質に固定（たとえばＥＬＩＳＡアッセイ用に細胞を固定する方法と同様の方法を用いてマイクロタイタープレートに固定[オースベルらの前記文献を参照]）し、標識ｒｓＣＤ４受容体のＬＣＦへの結合能力を利用して、固定化ＬＣＦへのｒｓＣＤ４受容体の特異的結合を検出することができる。

ＬＣＦ：ＣＤ４相互作用の分析に有用なさらに別の方法を以下に具体例を挙げて説明する。この方法では、組換ＬＣＦ含有大腸菌（Ｅ.coli）の粗製上清を１０μｇのｒｓＣＤ４とともに４℃で１時間インキュベートを行った。次に、該組換ＬＣＦ−ＣＤ４複合体を、１μｇのウサギ抗ＣＤ４ポリクローナル抗体とともにインキュベートし、適当な緩衝液で洗浄したプロテインＡセファロースビーズに添加した。次いで混合物を４℃で２時間インキュベートし、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルシステムに付す前に、ＴＳＢ（０.０１Ｍトリス、ｐＨ８.０、０.１４ＭＮａＣｌ、０.０２５％ＮａＳ_３）で４回洗浄した。次いでＳＤＳ−ゲルで分離したタンパク質をプロブロット（Problott）トランスファーフィルターに移し、ウサギ抗ペプチドＤ抗体（１：２００希釈）（後記の抗−ＬＣＦ抗体のセクションも参照）、次いでヤギ抗ウサギ^１２５Ｉ−ＩｇＧ抗体をプローブとして処理した。
この試験の結果を図４に示す。図４に示されるように、組換ＬＣＦとｒｓＣＤ４の間には特異的な物理的相互作用がある。

ＬＣＦポリペプチド(あるいはフラグメントまたはその類縁体)の機能について、Ｔ４^＋リンパ球、単球、好酸球などの遊走仲介能力のアッセイを行う。遊走アッセイは、Ｔリンパ球、単球または好酸球などの適当な細胞のいずれを用いて行ってもよい［クルークシャンク(Cruikshank)らの「J.Immunol.」,１２８：２５６９〜２５７１(１９８７年)；ランド(Rand)らの「J.Exp.Med.」,１７３：１５２１〜１５２８(１９９２年)の記載を参照］。たとえば、大腸菌またはバキュロウイルス発現系などの発現系（前記）で合成された組換ＬＣＦの細胞遊走誘発能力をアッセイする。ひとつの実施例では、修正ボイデン走化性チェンバーを用い、マウス細胞走化性を測定した［クルークシャンクらの「J.Immunol.」,１２８：２５６９〜２５７１を参照］。ＲＰＭＩ１６４０含有１０％ＦＢＳに、５×１０^６細胞／mlの濃度で細胞を懸濁した。１２μｍのニトロセルロース膜を用い、細胞を４時間インキュベートした。次に、該膜をヘマトキシリンで着色し、エタノール、プロパノール、次いで最後にキシレンで連続洗浄を行い脱水し、フィルターを清澄化して細胞を光学顕微鏡でカウントできるようにした。５０μｍ以上遊走した細胞の数をカウントして細胞遊走を定量した。全ての総数を、常に１００％に標準化した対照細胞（非刺激）の遊走と比較した。さらに、全サンプルに対して２回ずつ試験を行い、２回の試験それぞれにおいて５つの高検定力領域（high-powered field）をカウントした。図５に大腸菌発現系（前記）が産生したタンパク質の代表的な用量応答曲線を示す。この用量応答曲線からわかるように、組換ＬＣＦ濃度が１０^−９Ｍのときに最大の遊走が誘発され、ＥＤ_５０は１０^−１１Ｍであった。スチューデントのＴ検定（または多数回の試験からのデータを集めた場合は、分散修正分析）を用いて統計処理を行ったが、対照細胞の遊走とは統計的に異種であるカウント数（ｐ＜０.０５）には、星印を付している。大腸菌産生ＬＣＦの代わりにバキュロウイスル産生ＬＣＦを用いても同様な結果が得られた。

溶液中の組換タンパク質間のこのような物理的関連が、組換ＬＣＦと細胞表面ＣＤ４間の特定の機能的関連に対応することを説明するために、完全あるいは不完全ヒトＣＤ４のいずれかを発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞系における組換ＬＣＦの効果についての試験が行われた（スレックマン(Sleckman)ら,１９８７年および１９８８年）。ここでは３つの細胞系が用いられた：ＣＤ４を発現しない偽感染細胞系；完全(野生型)ＣＤ４発現細胞系；ＣＤ４の細胞質尾部の３１個の最末端残基が欠失している不完全ＣＤ４発現細胞系。ＣＤ４の濃度の比較のために、完全ＣＤ４またはデルタ１３ＣＤ４のいずれかを発現する細胞系を選択した。図６に示すように、完全ＣＤ４発現細胞は組換ＬＣＦ刺激に応答して遊走した。ＣＤ４欠損細胞またはデルタ１３ＣＤ４発現細胞は組換ＬＣＦに応答しなかった。抗体２Ｃ１１は偽形質導入細胞系およびデルタ１３ＣＤ４細胞系に対してそれぞれ１９８％±４％および１９２％±３％の遊走応答を誘発するので、これらの細胞はマウスＴ細胞受容体刺激性遊走に対して応答性があった（図６）。これらの研究から、ＬＣＦ誘発性の細胞運動性応答が起こるにはＣＤ４が発現されなければならず、また細胞質尾部が必要であることがわかる。

ＬＣＦ応答細胞を同定するために、ヒトＴ細胞において、ＬＣＦ刺激に対するＣＤ４特異性を、ＩＬ−２Ｒの発現を用いて実証した。組換ＬＣＦ（１０^−８Ｍ）の存在下に混合Ｔ細胞を２４時間および４８時間培養し、該細胞中のＣＤ４とＩＬ−２Ｒの両方の発現を検出するために、この時点で細胞を標識した。図７に示すように、ＣＤ４^＋である細胞のみが、表面発現ＩＬ−２Ｒを増加した。この試験では、ＣＤ４^＋細胞の１７％にＩＬ−２Ｒの増加が見られた。このことは、ＣＤ４^＋細胞に対するＬＣＦの特異性を示すのみならず、組換ＬＣＦがＣＤ４^＋細胞のサブセットにのみ作用することをも示唆している。

最後に、組換ＬＣＦの分子量篩クロマトグラフィーを行うが、ここでは大部分の化学誘引活性が５０〜６０ｋＤａ領域で溶出することが示される。図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、この化学誘引活性のピークは、^３５Ｓ標識組換ＬＣＦにおいて同じクロマトグラフィーを行った場合の溶出プロファイルに対応する。１４〜１８ｋＤａ領域に、対応する化学活性のない小さい放射活性ピークが存在した。走化性と放射活性の両方に対するピークフラクション（フラクション１３）および放射活性のみを含むフラクション（フラクション１７）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィーに付した。各フラクションからのＬＣＦタンパク質は、１７.５ｋＤａにおいてシングルバンドとして現れた（図８Ｂ）。これらのデータから、生理的条件下ではＬＣＦが非共有的に結合した多量体として優勢に存在するがいくつかのＬＣＦは一量体として存在することが示唆される。しかし、多量体の形体は化学誘引活性をもつと考えられる。

ＬＣＦ：ＣＤ４相互作用を阻害する化合物のスクリーニング
上記で論じたように、本発明の一つの態様は、ＬＣＦとＣＤ４の間の相互作用を阻害し、該相互作用によって仲介される生理的カスケード反応を妨害または減少させる化合物をスクリーニングすることである。応答を誘発することなくＬＣＦまたはＬＣＦ／ＣＤ４受容体もしくはＣＤ４受容体に結合する、ＬＣＦに対する化学アンタゴニストを用いて、ＬＣＦまたは架橋ＬＣＦアゴニストもしくは生物学的に活性なＬＣＦポリペプチドフラグメントまたはその類縁体（これらは免疫応答および炎症などのＬＣＦ仲介生理的反応を刺激あるいは活性化するために働く）の影響を減少させるかまたは妨害することができる。したがって、本発明は、このような有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアンタゴニストとしては、架橋ＬＣＦ、合成ＬＣＦ、抗−ＬＣＦ抗体または他の薬剤（たとえば有機化合物）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

すなわち、ＬＣＦポリペプチドから、その活性を中和または妨害するのに役立つ化合物を製造することができる。その方法の一例は、ＬＣＦポリペプチドの活性部位を同定し、該活性部位内のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換することによってＬＣＦアミノ酸配列中の活性部位を変更することであり、それによって該ペプチドはＣＤ４受容体に対するその結合親和性は失わないけれども、結合しても活性を促進することが不可能となり、ＬＣＦの影響を遮断することができる。抗体（モノクローナル抗体など）またはＬＣＦに対する化学アンタゴニストを用いて、ＬＣＦ活性を遮断、減少あるいは妨害することもできる。このような化学アンタゴニストは、有機化合物またはその他の前述の化合物のいずれでもよく、それらのＬＣＦ：ＣＤ４仲介生理的反応を妨害する能力を、以下の方法によってアッセイまたはスクリーニングすることができる。

該スクリーニング法は、ＬＣＦポリペプチド（あるいは適当なフラグメントまたはその類縁体）、および結合を検出しうる形状にしたｒｓＣＤ４またはＣＤ４受容体発現細胞（たとえばＣＤ４^＋リンパ球、単球または好酸球など）から構成される。全長ＬＣＦポリペプチド（フラグメントまたはその類縁体）およびｒｓＣＤ４は前述の記載にしたがって生産する。

受容体へのＬＣＦの結合アッセイは、適当な方法ならばいずれの方法で行ってもよい（前記参照）。たとえば、前記のように、ＣＤ４受容体を発現する細胞（たとえば好酸球）を、固相基質（たとえばマイクロタイタープレートのウェル）に固定し、検出可能に標識したＬＣＦポリペプチド（フラグメントまたはその類縁体）と反応させる。受容体成分に結合した標識（すなわち固相基質に結合した標識）を検出することによって、結合に関するアッセイを行う。標識した全長組換ＬＣＦポリペプチドのＣＤ４受容体産生細胞への結合を、アンタゴニストアッセイにおける「対照」として用いる。アンタゴニストアッセイでは、まずＣＤ４受容体産生細胞を適当な量の候補アンタゴニスト（たとえば抗体または有機化合物など）とともにインキュベートする。この混合物に、当量の標識ＬＣＦを加える。本発明に有用なアンタゴニストは、標識ＬＣＦが固定化受容体産生細胞へ結合するのを妨害する。別の言い方では、アンタゴニストとは、結合することはできても、生物学的応答を活性化しないものである。

続いて、所望により、アンタゴニストのＬＣＦ機能妨害能力（すなわち、通常全長ＬＣＦポリペプチドによって仲介されるシグナル形質導入を起こすことなく標識ＬＣＦの結合を特異的に妨害する能力）を試験することもできる。

好適な候補アンタゴニストとしては、たとえばポリペプチドＦＥＡＷ（アミノ酸９６〜９９におけるＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ）およびＲＫＳＬＱＳＫＥＴＴＡＡＧＤＳ（アミノ酸１１６〜１３０におけるＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）［例えば、ＬＣＦの配列番号１の類縁体を参照］、および他のペプチドならびに非ペプチド化合物、およびＬＣＦ／ＣＤ４受容体相互作用の分析から設計または誘導された抗ＬＣＦポリペプチド抗体もしくはＬＣＦの一次構造などが挙げられる。

抗−ＬＣＦポリペプチド抗体
ヒトＬＣＦ（あるいはフラグメントまたは類縁体）を用いて、本発明に有用な抗体を産生することができる；このようなポリペプチドは組換またはペプチド合成技術によって生産される（たとえば「固相ペプチド合成」(前記)：オースベルら(前記)を参照）。オースベルら（前記）の記載に準じ、該ペプチドをＫＬＨなどの担体タンパク質とカップリングさせる。ＫＬＨ−ペプチドをフロイントアジュバントと混合し、モルモット、ラットなど、あるいは好ましくはウサギに注射する。ペプチド抗原アフィニティークロマトグラフィーにて抗体を精製する。

予測されるアミノ酸配列について、たとえばカイト−ドゥーリトル（Kyte-Doolittle）分析［カイトの「J.Molec.Bio.」,１５７：１０５〜１３２(１９８２年)を参照］を行うと、４つの主要な親水性領域の存在が示された（図９）。ＬＣＦの親水性プロットに基づき、残基３〜１１、４７〜５８、６８〜８１および１１５〜１３０における４つの主要親水性領域（図９において、それぞれＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄで表示）の合成ポリペプチドに対するウサギ抗体を生産した。ペプチド特異的ポリクローナル抗血清を各ペプチドに対するＥＬＩＳＡによって同定し、次いでプロテインＡセファロースクロマトグラフィーによって精製した。このような抗体を用いた一例では、Ｄ領域に対して産生された抗体が、１９４％±７％（平均±Ｓ.Ｄ.，Ｎ＝４）〜１１２％±５％の組換ＬＣＦ（１０^−９Ｍ）誘発遊走を遮断することが走化性指示計アッセイシステム（前記）において測定された。さらに、抗ペプチドＤ抗体が、ウエスタンブロッティングに適していることがわかり、図３Ａおよび図３Ｂにおけるタンパク質染色によって観察されたものと同じ１７.５ｋＤａバンドが同定された。
別法として、前記ＬＣＦポリペプチドおよび標準的ハイブリドーマ法を用いてモノクローナル抗体を生産してもよい［たとえばコーラー(Kohler)ら「Nature」,２５６：４９５(１９７５年)；コーラーらの「Eur.J.Immunol.」,６：５１１(１９７６年)；コーラーらの「Eur.J.Immunol.」,６：２９２(１９７６年)；ハマーリング(Hammerling)らの「モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ」，エルセヴィア(Elsevier)，ニューヨーク(１９８１年)；オースベルらの前記文献を参照］。したがって、一例を挙げると、精製または部分精製したＬＣＦ(フラグンメントまたはその類縁体)で免疫感作させることによってマウスのＢalb／Ｃまたはその他の同種株にＬＣＦ（フラグンメントまたはその類縁体）に対するモノクローナル抗体を産生させることができる。このようなマウスの脾臓を切除し、そのリンパ球を融合してマウス骨髄腫細胞系が得られる。公知技術によりハイブリッドをスクリーニングした後、ＬＣＦ（フラグンメントまたはその類縁体）に対する抗体を産生する安定なハイブリッドを分離する。このような抗体の活性は、放射標識されたＬＣＦ（たとえば^１２５Ｉ−ＬＣＦ）がＣＤ４受容体へ結合するのを妨害する能力で表わすことができる。したがってＬＣＦの生物学的活性（たとえば前述の細胞遊走など）を妨害するモノクローナル抗体の能力について試験を行う。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生産し、その特異的ＬＣＦポリペプチド認識について、ウエスタンブロットまたは免疫沈降分析による試験を行う（オースベルらの前記文献に記載の方法によって行う）。ＬＣＦ（フラグンメントまたはその類縁体）を特異的に認識する抗体が、有用なアンタゴニストとして有望であると考えられる。またこのような抗体は、哺乳動物(たとえばヒト)に産生したＬＣＦポリペプチドの濃度をモニターするイムノアッセイなどに用いることもできる。ＬＣＦ／ＣＤ４受容体の結合またはＬＣＦの仲介する受容体機能に拮抗する抗体は本発明において有用なアンタゴニストである。

ＬＣＦおよび成長因子を用いる細胞分割の刺激
本発明者らは、組換ＬＣＦが細胞受容体（ＩＬ−２Ｒなど）の発現を誘発し、続いて、該受容体産生細胞(Ｔ細胞など)をその同種の成長因子(ＩＬ−２など)へ応答可能にすることを発見した。ひとつの実施例では、ヒトＴ細胞を組換ＬＣＦで２４時間刺激し、この時点で細胞培養物にｒＩＬ−２（２Ｕ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた（ＬＣＦは１０^−５Ｍ〜１０^−１０Ｍの濃度範囲を用いたが同じ結果が得られたので、１０^−８Ｍのデータを示す）。ｒＩＬ−２またはＯＫＴ３の添加の４日後に、^３Ｈチミジンの取り込みを測定して抗体細胞増殖のアッセイを行った。表１に示す３回の実験結果全部を平均し、抗ＣＤ３およびｒＩＬ−２誘発チミジン取り込みにおける組換ＬＣＦの影響を示すと、組換ＬＣＦとのプレインキュベーションによってＩＬ−２応答性が増強されることがわかった。ヒトＴ細胞は組換ＬＣＦ単独と２４あるいは４８時間インキュベーションを行った後も^３Ｈチミジンの取り込みを増加しないが、組換ＬＣＦとｒＩＬ−２刺激Ｔ細胞とプレインキュベーションを行った後には^３Ｈチミジンの取り込みを１０７９ｃｐｍから１３８１８ｃｐｍへと増加した。しかし、組換ＬＣＦ処理細胞培養物において、抗ＣＤ３抗体に対する増殖応答は、抗ＣＤ３刺激単独時は２１２５７ｃｐｍであるが、組換ＬＣＦ刺激細胞では１２０４７ｃｐｍとおよそ５０％減少した。

このように、該実験においては、得られたヒトＴ細胞を、Ｔ細胞成長因子インターロイキン２で刺激する前に、組換ＬＣＦとともに２４時間インキュベートした。Ｔ細胞を組換ＬＣＦとプレインキュベーションすることによって、７２時間合成の^３Ｈチミジンの取り込み（ＤＮＡ合成）は、組換ＬＣＦまたはｒＩＬ−２それぞれ単独の場合のいずれと比較しても５倍程度増加した。Ｔ細胞を組換ＬＣＦとともにプレインキュベーションすることにより、抗ＣＤ３においては引き続いておこるＴ細胞抗原に応答した^３Ｈチミジン取り込みが減少するので、この相乗作用はＩＬ−２に特異的なものであった(抗ＣＤ３の応答を参照)。

*)抗ＣＤ３抗体またはｒＩＬ−２の添加前に培養物を２４時間ＬＣＦで刺激した。培養は５日間行った。

治療法
過応答性免疫応答および炎症疾患の特に適当な治療剤は、生理的食塩水などの適当な緩衝液剤として製剤した可溶性の前記のアンタゴニストフラグメントである。前記のとおり産生させた抗ＬＣＦポリペプチド（フラグメントまたはその類縁体）抗体を治療剤として用いてもよい。該抗体を医薬的に許容しうる緩衝液（生理的食塩水など）剤として投与される。適当ならば、該抗体製剤を適当なアジュバントと組み合わせてもよい。また、本発明方法は、ＬＣ４：ＣＤ４相互作用を拮抗するのに有用な有機化合物の同定法を提供する。このような化合物を同定し、分離して適当な緩衝液剤に製剤化し、治療剤として用いることができる。

さらに、免疫抑制剤として、またはＣＤ４^＋受容体産生細胞（前記）の増殖を刺激するための治療剤として、ＬＣＦまたはＬＣＦアゴニストを利用するための適当な治療剤を、生理的食塩水などの適当な緩衝液剤として製剤化することができる。これらの製剤は、医薬的に許容しうる緩衝液（生理的食塩水など）剤の形態で投与される。

通常、該治療用組成物は、非経口で投与され、その投与量は、新規ＣＤ４リンパ球集団の活性化を刺激し；アネルギーを誘発して（前記表を参照）移植における拒絶反応を抑制し；および過応答性免疫応答および炎症（喘息など）の緩和するのに有効な量である

別の投与形態としては、該治療剤を一次産物の形態またはＬＣＦｃＤＮＡを運搬するウイルスベクターの形態において、経口、経鼻、または液剤またはスプレー剤などの局所適用剤で投与してもよい。投与量は上記のとおりである。しかし、上述の疾患のいずれかを治療するための該化合物の投与量は、投与方法、患者の年令および体重、および治療を受ける患者の健康状態に応じて変化し、最終的には担当医または担当獣医によって決定されるものである。このような担当医または担当獣医によって決定される有効化合物の量を「医薬的有効量」と称する。本発明化合物は、哺乳動物、たとえばヒトの患者では０.５μｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の投与量で投与することができる。

組換ＬＣＦと成長因子（ＩＬ−２など）間の相乗効果は、組換ＬＣＦ（０.５μｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日）の投与の２４時間後に同量のｒＩＬ−２を投与する連続投与法によって誘発しうる。
本発明方法を用いて、たとえばヒト、家庭のペットまたは家畜などの哺乳動物における前記疾患を減少することができる。ヒト以外の哺乳動物を治療する場合、使用したＬＣＦポリペプチドまたは抗体はその種に対して特定のものであるのが好ましいが必ずしもそうでなくともよい。

その他の具体例
本発明は、ＬＣＦポリペプチド（図２の配列番号１）と実質的に相同なタンパク質のすべてを包含する。ＬＣＦはヒトＴ細胞および外分泌すい臓において発現する。ＬＣＦはヒト単球細胞系ＴＨＰ−１においても発現する。本発明に包含されるタンパク質としては、対立遺伝子変異体；天然突然変異体；誘発突然変異体；高または低ストリンジェンシー条件下で天然の核酸にハイブリダイズするＤＮＡ（たとえば長さが少なくとも４０ヌクレオチドのプローブを用い、４０℃にて２ｘＳＳＣで洗浄する）によってコードされるタンパク質［高および低ストリンジェンシーのその他の定義は、「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」，ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク(１９８９年)を参照］；および抗血清によってＬＣＦポリペプチドに結合したポリペプチドまたはタンパク質（特にＬＣＦポリペプチドの活性部位または結合ドメインに特異的に結合したもの）が挙げられる。ＬＣＦポリペプチドを含むキメラポリペプチドも本発明に包含される。実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明には該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントも包含される。本明細書中で用いる語句「フラグメント」とは、ポリペプチドに適用される場合、通常少なくとも約残基、より特徴的には少なくとも約４０残基、好ましくは少なくとも約６０残基の長さのものを意味する。ＬＣＦポリペプチドのフラグメントは当業者に公知の方法で生産することができる。候補フラグメントの、ＬＣＦポリペプチドの生物学的活性を示す能力は、本明細書に記載されている当業者に公知の方法によって評価できる。該ポリペプチド中の生物学的活性を示すために必要ではない残基などの、該ペプチドの生物学的活性を示すために必要ではない残基を含有するＬＣＦポリペプチド、または別法のｍＲＮＡスプライシングまたは別法のタンパク質プロセシングから得られる残基を含有するＬＣＦポリペプチドも本発明に包含される。

図１はヒトＴリンパ球から調製した全細胞性ＲＮＡ由来のＬＣＦのノーザン分析を示す。エチジウムブロマイド染色により可視化した１８Ｓおよび２８ＳＲＮＡの位置を、各々の矢印で示す。図２はＬＣＦ−ＡｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）およびコード化タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチドは、ｃＤＮＡの最初のヌクレオチドで始まって左端から番号が付されている。ポリＡ末端は、最後の指示ヌクレオチド(2152)の直後に始まり、除去される。推定ＬＣＦコード配列の翻訳は、Ｍｅｔで始まる対応するヌクレオチド配列の下に示されている。各アミノ酸は連続して番号が付されている。Ａｓｎ残基（アミノ酸残基５）は、有効なグリコシル化部位を示す（点線で示す）。２個の候補ポリアデニル化シグナル配列に下線を引いている。図３Ａおよび図３Ｂは、Ｅ.コリ中で発現した組換ＬＣＦおよびＬＣＦｃＤＮＡから合成されたＲＮＡのウサギ網状赤血球細胞インビトロ翻訳のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図３Ａは、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、続いてクマーシーブルー染色した組換ＬＣＦタンパク質を示す。図３Ａにおいて、レーンＡは、ＬＣＦタンパク質を発現するように誘発したＥ.コリの粗上清を示し、レーンＢは、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーで精製したポリヒスチジンリンカーと結合した融合タンパク質として産生されたＬＣＦタンパク質を示し、レーンＣは第Ｘａ因子開裂後のＬＣＦを示す。１７.５ｋＤａのバンドをブロットし、切除し、Ｎ−末端アミノ酸配列決定に付した。図３Ａおよび図３Ｂは、Ｅ.コリ中で発現した組換ＬＣＦおよびＬＣＦｃＤＮＡから合成されたＲＮＡのウサギ網状赤血球細胞インビトロ翻訳のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図３Ｂは、ＬＣＦｃＤＮＡのウサギ網状赤血球インビトロ翻訳を示す：ウサギ網状赤血球で翻訳されたＬＣＦｃＤＮＡの^３５Ｓ−標識タンパク質生産物を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流した。図３Ｂにおいて、レーンＡは、非グリコシル化条件で翻訳されたＬＣＦタンパク質を示し、レーンＢは、グリコシル化条件下で翻訳されたＬＣＦを示す。図４は、ｒｓＣＤ４による組換ＬＣＦの免疫沈降を示す。図４において、レーン１は、組換ＬＣＦ１０μgを示す；レーン２は、ウサギポリクローナル抗−ＣＤ４抗体１０μｇと免疫沈降させたｒｓＣＤ４５０μｇとインキュベーションした組換ＬＣＦを示す；レーン３は、ポリクローナル抗−ＣＤ４抗体と免疫沈降させたｒｓＣＤ４１０μｇとインキュベーションした組換ＬＣＦを示す；レーン４は、ウサギポリクローナル抗−ＩｇＧ（１０μｇ）と免疫沈降させたｒｓＣＤ４（１０μｇ）とインキュベーションした組換ＬＣＦを示す；レーン５は、ｒｓＣＤ４とインキュベーションし、モノクローナル抗−ＣＤ４(１０μｇ）と免疫沈降させた組換ＬＣＦを示す；レーン６は、ｒｓＣＤ４とインキュベーションし、モノクローナル抗ＣＤ８抗体(１０μｇ）と免疫沈降させた組換ＬＣＦを示す；およびレーン７は、モノクローナル抗−ＣＤ８抗体とインキュベーションしたｒｓＣＤ４(１０μｇ）を示す。図５は、ヒト末梢血Ｔリンパ球のＬＣＦ誘発走化性の用量依存曲線を示す。図５において、星印(＊)はｐ＜０.０５の統計的有意性を示す(対照細胞遊走からのスチューデントのｔ検定を使用)。図６は、マウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞におけるＬＣＦ誘発走化性を示す。野生型ＣＤ４(13.13)、切断ＣＤ４（デルタ−13）またはＣＤ４発現を欠く疑似感染細胞（155.16）のいずれかを発現するマウス細胞系は、組換ＬＣＦ（１０^−９Ｍ）（白抜き棒)または２Ｃ１１抗体（１０μｇ／ｍｌ）（横縞棒）により促進され、移動反応を定量した。１００倍過剰の抗−ＣＤ４Ｆａｂフラグメント（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で組換ＬＣＦにより刺激された細胞をも示す(黒塗り棒)。細胞遊走は、１０個の高検定力領域±Ｓ.Ｄ.の平均として示す。対照細胞遊走(１００％とする)と有意に異なる（スチューデントｔ検定でｐ＜０.０５）遊走は星印により示す。図７は、ＦＡＣｓ分析を使用した、ＣＤ４^＋ヒトＴ細胞に対する組換ＬＣＦの特異性を示す。２×１０^６ヒトＴリンパ球を、１０^−８Ｍ組換ＬＣＦの存在下、２４時間および４８時間培養した。フィコエリトリン−結合抗−ＣＤ４抗体およびフルオレセイン−結合抗−ＩＬ−２Ｒ抗体で２重標識した細胞を、ベクトン・ディキンソン・ＦＡＣスキャンフローサイトメーターで分析した。組換ＬＣＦは、４８時間で、対照レベルの３％（最上図）から１７％（最下図）のＣＤ４^＋／ＩＬ−２Ｒ^＋細胞の増大を誘発する。２４時間時点で、細胞の９％増大を示した。どの時点でも、ＣＤ４−細胞は、ＩＬ−２Ｒ発現の増加を示さなかった。これは、３種の異なった実験の代表的ＦＡＣｓ分析である。他の実験は、４８時間の時点で、細胞の１５％および１９％のＩＬ−２Ｒ^＋細胞の増加を示した。図８Ａおよび図８Ｂは、生理的条件下で組換ＬＣＦの凝集を示す。図８Ａは、^３５Ｓ−標識組換ＬＣＦの分子篩ＨＰＬＣを示す（リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ８.０中で流した）。フラクションを集め、シンチレーション計数により分析した（白四角）。平行サンプルを集め、リンパ球走化性の誘発を試験した（黒四角）。図８Ａおよび図８Ｂは、生理的条件下で組換ＬＣＦの凝集を示す。図８ＢのレーンＡおよびレーンＢは、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後の、放射活性および細胞遊走の両方のピークフラクション（図８Ａに記載のフラクション１３）並びに対応する化学誘引活性を有しない放射活性の２番目ピーク（図８Ａのフラクション１７）のオートラジオグラムを示す。図９は、キートおよびドーリトル（キートら、J.Molec.Biol. 157:105-132(1982)）の方法で予想した組換ＬＣＦの親水性プロットを示す。ペプチドを合成し、ウサギ抗−ペプチド特異的抗血清を、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄと名付けた４つの主要な親水性領域について産生させた。

Claims

配列番号１で示されるリンパ球化学誘引因子ポリペプチドのアミノ酸１１５−１３０からなるフラグメントに特異的な抗体であって、該抗体がリンパ球化学誘引因子誘発遊走を遮断する抗体。
請求項１の抗体、および医薬的に許容され得る担体を含む、リンパ球化学誘引因子誘発遊走を遮断するための組成物。