JPS611392A - ＩｇＥ結合因子活性を示すポリペプチドをコ−ドするｃＤＮＡクロ−ン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に組換えＤＮＡ技術を使用して哺乳動物の
免疫応答の調節機構を明らかにすることであり、より詳
細には免疫グロブリン結合因子活性を示すポリはゾチド
をコードするｃＤＮＡクローンの単離に関する。

組換えＤＭＡ技術とは一般的に供与源からの遺伝情報を
その後のプロ七ンングのためにベクター内に組み込む技
術のことである。これは外来性ＤＮＡを宿主内に導入す
ることを必扱とし、それによって移入された遺伝情報が
新しい環境内で複製されかつ／また発現される。通常、
その遺伝情報は目的とする蛋白質産物をコードするメツ
センジャーＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）から誘導される相補
ＤＮＡ（ｃ　ＤＮＡ　）の形で存在する。ベクターは大
抵の場合プラスミドであって、そのシラスミドゝはｃＤ
ＮＡを挿入できる特定部位を有し、宿主内で複製され。

そしである場合には実際にｃＤＮＡの発現をコントロー
ルし、そして宿主にそのコード化産物を産生させる。

この技術はここ数年の間にきわめて、＠、速に進展して
各種の外来性蛋白質が各種の宿主内で発現きれた。この
ようにして産生された真核生物蛋白質の例にはプロイン
シュリン（Ｓ、Ｎａｂｅｒ　ラノＧｅｎｅ。

２１　：９５〜１０４（１９８３））；　インターフェ
ロン（Ｌ、Ｓｌ、ｍｏｎらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　、　８０：２０５９〜２０６’２［：１
９８３）およびＲ，ＤｅｒｙｎｃｋらのＮ’ｕｃ１＋　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１　：１８１９〜１８３７
（１９８３））；および成長ホルモン（Ｄ、Ｇｏｅｄｄ
ｅｌらのＮａｔｕｒｅｓ　２８１　：　５４４〜５４Ｂ
（１９７９））が含まれる。（これらの文献およびここ
に掲載の他の文献は関連技術の背景ならびにある場合に
は本発明の実施についてのより詳細な事項を提供するた
めに挿入され、これらは全て参照によりここに引用され
る。） 今や、哺乳動物の免疫応答が一連の複雑な細胞の相互作
用によって仲介されることは認められておシ１　″免疫
網（ｉｍｍｕｎｅ　ｎｅｔｗｏｒｋ）’という新しい用
語が造り出された。免疫応答は２つの異なる作用：すな
わち体液性応答と細胞性応答とからなると考えられてい
る。体液性応答は主に抗体または免疫グロブリンとして
知られる可溶性蛋白質の作用によると思われる。これら
の蛋白質は異物と認められた物質（抗原として知られる
）へその異物上の抗原部位を認識することにより結合し
て。

体液からそれを除くことができる。細胞性応答はその名
が示す通シ細胞が仲介する作用１例えば−クロファージ
の食作用および遅延型過敏症や同種移植片反応における
リンパ味の作用によると思われる。しかしながら１体液
性免疫と細胞性免疫とはそれぞれ免疫応答の最終段階を
示しうるが、全体的な免疫応答はリンパ球、マクロファ
ージおよびその他の細胞の互いとかつ免疫グロブリンと
協働した一連の非常に複雑な網状の相互作用によること
が広範な研究により立証された。さらに、免疫学者は他
の可溶性蛋白質（例えば、リンパ球によって産生される
リンフ才力イン）が一連の免疫化現象をコントロールす
るのに重要な役割を演じるという見解を示している。

リンフ才力インは明らかに種々の方法で細胞作用を仲介
する。それらは各穐のリンパ球の生長および増殖を助け
る能力があるとされ、実際に分化可能な造血幹細胞を非
常に免疫学的に相違する細胞系統の前駆細胞へ分化させ
るのに決定的に演すると思われる。リンフ才力インによ
って部分的にコントロールされると思われる細胞系統に
は２つの型のリンパ味が含まれ、すなわち主な５種類の
免疫グロブリン（α、δ、γ、εおよびμ；それぞれＩ
７Ａ、　Ｉ、９Ｄ、　ＩＦＧ、　ＩｇＥおよびＩ、９Ｍ
アイソタイプとして知られる）を産生じかつ分泌するよ
うに分化されうるＢ細胞と、そのＢ細胞や免疫網を作シ
出す他の細胞をいろいろな手段を介して誘導するかまた
は抑制する種々のサブセット（亜群）のＴ細胞とが含ま
れる。細胞生長がリンフ才力インの部分的支配下にある
と思われる他の重要な細胞系統にはマスト細胞（肥満細
胞）があシ、これは顆粒を含有する結合組繊細胞であっ
て体中の毛細血管の周囲に存在し、特に肺、皮膚、胃腸
および尿生殖器に高濃度で分布する。−スト細胞はアレ
ルギー関連疾患、とりわけアナフィラキシ−において中
心的役割を演じる。簡単忙述べれば、抗原がひとたび一
スト細胞表面の受容体に結合した工ｇＥ免疫グロブリン
に結合すると、でスト細胞は脱顆粒してアナフィラキシ
−や他のいくつかのアレルギー反応を誘発しうる化学伝
達物！［（例えばヒスタミン、セロトニン、ヘノミリン
、キニンなト）を放出する。マスト細胞の脱顆粒をＩｇ
Ｅ　結合の阻止によって抑えることが報告された（米国
特許第４１６１５２２号を参照）が、この実験をくシ返
す試みは成功しなかった（　ＨｏＢｅｎｎｉｃｈらのＩ
ｎｔ、　Ａｒｃｈｓ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　
Ｉｍｍｕｎ、　５３　：４５９〜４６８（１９７７）　
　を参照）。しかしながら、最近になって、アレルギー
、アナフィラキシ−およびその他のＩ、９Ｆ　　関連免
疫疾患をより良く理解するための（そして恐らくは治療
するための）臨床研究はＩｐＥ　　の生成機構に対して
より多く関心を向けるようになった。

リンパ味の個体発生の研究は胎児肝臓および解繊にＢ細
胞が存在することを明らかにした。高山動物ではＢ細胞
は最初表面ＩＪＩＭ　　を有するが、誕生後すぐに一部
分は表面工、ｌ？Ｅ　　を保有する。胎児Ｂ細胞のＩｐ
Ｅ　　保有細胞への分化は抗原またはＴ細胞と無関係で
あると思われる。しかし、工ＩＥ保有細胞の工１１Ｅ　
　分泌細胞へのその後の分化は、Ｂ細胞が特異抗体を作
ることができかつＴ細胞も結合することができる抗原へ
の接触と関係があるよう忙思われる（　Ｋ、　ｌ５ｈｉ
ｚａｋａのＡｎｎａ１８ｏｆＡ１１ｅｒｇｙ　４８：３
２０〜３２４（１９８２）　　を参照されたい）。（こ
の過程は他のアイソタイプに対しても同様に起こシうる
。） それ故、ＩＪＥ　　保有Ｂ細胞の出生後の発生を止める
とわかっている実用的で明らかな方法を用いずに、研究
者達はＩ、９Ｆ　　保有Ｂ細胞または関連したＴ細胞の
抗原特異的不活性によってそのＩＪＩＥ応答を調節しよ
うと試みた。これはアレルギー患者に修飾抗原を注射す
る必要があり、この方法はある患者にとってアナフイラ
キンー／ヨツクまたは他の必要な免疫応答能力の低下を
もたらす危険があった。さらに、多くの人々は様々の異
なる抗原に対してアレルギーをおこし、こうして多数の
修飾抗原の調製および注射が必要とされる。これらおよ
び他の理由のために、抗原特異的不活化はせいぜい中程
度の成功をおさめたにすぎず、探索作業は今なお続いて
いる。

ここ２．３年の間に、２．３の研究グループはＩｇＥ　
　応答に対して選択的に作用すると思われるが抗原特異
的ではない、リンパ球から分泌される可溶性の調節因子
の存在を報告している。これらの因子は部分的にその性
状が決定され、３つの研究グループは分子量が約１５０
００〜２０００００ダルトンの範囲であると報告した。

（Ｄ、　Ｋａｔｚの工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４１　：　
１〜２４　（１９８０）を参照されたい。）現在、これ
らの因子間の関係またはそれらの欠乏についてはあまり
知られていないが、それらは抗原非特異的であってＩＩ
ＩＦ　　応答に対して抑制的または増強的のいずれかで
あると考えられる。不幸なことに、これらの因子の性状
決定の研究は広範な蛋白質分析を行うのに十分な量の因
子が足シないために、また困難で時間がかがシしかもあ
る場合には主観的でありうる検定法のために妨げられた
。これらの障害にもかかわらず、研究は物質が大量に利
用しうる場合よりゆつくシとは言え着実に前進した。最
もよく性状決定がなされた因子はいわゆるＩｇＥ　　結
合因子（工ｇＥ　−ＢＦ’　）であシ、それらは名前が
示すようにＩｇＥ　　に対して親和性を有する。それら
は最初にＩＪＥ　　保有Ｂ細胞へ表面Ｉ、９Ｅ　　を介
して結合し１次いで複雑なまだよくわかっていない一連
の現象によってＩＦＥ分泌形質細胞へのＢ細胞の分化に
影響を及ぼすと推定される。明らかに、ＩＪＥ−ＢＦは
他の免疫グロブリン保有Ｂ細胞には結合しないので、こ
れらの因子はアイソタイプ特異性である。

ＩｇＥ−ＢＦ’　　の少なくとも２つの活性型が決定さ
れた。これらの２つの因子は非常に類似した分子量（約
１５０００ダルトン）と類似したＩＪＥ　　親和性を有
する。それらは主としてそれらの炭水化物部分において
相違すると思われ、一方の工、９Ｅ増強因子は恐らくＮ
−結合したマンノースに富むオリゴ糖を含みかつ末端ン
アル酸をもつが、他方のＩｇＥ　　サプレッサー因子は
恐らく０−グリコンド結合されておりかつ末端ガラクト
ース糖をもつと思われる。おもしろいことに、Ｔ細胞の
１種はどちらか一方の因子を生成する能力があると思わ
れ、産生される個々の因子（または検出可能なＩｇＥ　
　抑制または増強活性をもたない他の工ＪＥ−ＢＦ）は
その細胞の環境に依存している。（Ｋ、工ｓｈｉ　−ｚ
ａｋａのＬｙｍｐｈｏｋｊ、ｎｅｓ　８　：　４１〜８
０（１９８３）を参照されたい。） 前述の研究は工ＩＥ　レベルの調節に刺激的で新しい展
望を与えた。しかし、２つの結合因子間の提案された関
係およびそれらの作用の十分な調査はさらに詳しい構造
データ（例えば問題の分子の実質的に完全な配列分析）
を必要とするだろう。

蛋白質の配列決定はもちろんその問題を解決するための
可能な手段を提供するが、それは特に物質が少量である
場合に実験的にきわめて難しい作業であって、今日では
有益であ′ると考えられていない。哺乳動物のＩｇＥ−
ＢＦ　　活性を示すポＩＪ−Ｚプチドを大量に作シ得る
ことはそれらの因子の作用を理解するうえで不可欠であ
シ、さらにアイソタイプ調節の生物学の研究を太いに促
進させるのに役立ったろう。また、極歯動物の１．９Ｅ
−ＢＦ’　　の正確でかつ完全な配列データはヒ）　Ｉ
ｙＥ−ＢＦ　　蛋白質の探索に役立ち、ＩｇＥ　　によ
って仲介される病気の治療可能性を高めるだろう。最後
に、リンフ才力インのさらに詳しい情報は免疫網の各種
因子および細胞の役割を評価するうえで役立ち、全免疫
系への洞察を厚志、゛、付随的に治療上の利益をもたら
すだろう。こうして、　Ｉ、９Ｅ−ＢＦ　　活性を示す
蛋白質のアミノ酸配列およびそれらの蛋白質をコードす
るＤＮＡの広範なヌクレオチド配列データの必要性が存
在し、同様にこの種の物質を実質的な量で製造するため
の簡県でしかも経済的な方法を提供する必要性が存在す
る。本発明はこれらの必要性をみたすものである。

本発明は哺乳動物の免疫グロブリン結合因子活性、特に
Ｉ、ｊｉｌＥ　　結合因子（ＩｇＥ−ＢＰ’）活性を示
すポリペプチドの少なくとも主要部分をコードするｃＤ
ＮＡクローンを提供する。ｃＤＮＡのうち２つのヌクレ
オチド配列および関連したポリＲゾチドの推定上のアミ
ノ酸配列がこの記述の終シに示される。ｃＤＮＡ配列は
種々のベクター内に組み込むことができ、そのベクター
は真核生物細胞（例えば哺乳動物の細胞培養物）を含む
種々の宿主内での対応するポリペプチドの合成を支配す
ることができる。

より詳細には、本発明は哺乳動物（例えば　肉類）のＩ
ｇＦ　　結合因子活性を示すポリペプチドの産生方法を
提供し、その方法は （ａｌ　　前記のｌすはブチドをコードするヌクレオチ
ド配列を含むベクターを準備する工程（ただしそのヌク
レオチド配列はそのベクターを含む宿主によって発現さ
れ得る）； （ｂｌ　　そのベクターを宿主内に挿入する工程；およ
び ＦＣ＋　　そのばフタ−を含む宿主を、ポリ２プチドへ
のそのヌクレオチド配列の発現に適する条件下に保持す
る工程； から成っている。

好適には、　　ｃＤＮＡ配列はピリはプチドをコードす
るｍＲＮＡを含む細胞（例えばＴ細胞〕・イブリド−で
）から誘導され、そして宿主はそのばフタ−でトランス
フェクトされるかまたは形質転換される真核生物細胞の
ような生物である。さらに、ベクターはポリ４ブチドを
コードするヌクレオチド配列の発現をコントロールし得
る第２のヌクレオチド配列を含むのが好ましい。この第
２のヌクレオチドゝ配列はポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列の転写、スプライシング（より継ぎ、ｓ
ｐｌｉｃｉｎｇ）　およびポリペプチド−ジョンをそれ
ぞれ担うプロモーター配列、１つまたはそれ以上のイン
トロン配列およびポリペプチド−７ヨン配列を含むこと
ができる。

特に、宿主がＣｏｓ７サル細胞のような哺乳動物細胞で
ある場合に、ベクターはサルウィルス４０（ＳＶ４０）
初期領域プロモーターのプロモーター配列およびｓｖ４
０後期領域、６１７アデニレ一シヨン配列のポリペプチ
ド−ジョン配列を含む。このベクターは適当なｃＤＮＡ
クローンの一時的トランスフエク／ヨン後にＣｏｓ７細
胞内でのＩ、９Ｅ−ＢＦ活性の発現を可能にする。

本発明の他の面は他の哺乳動物免疫グロブリン結合因子
をコードする１例えばヒトＣＤＮＡまたはゲノムライブ
ラリーからの、ｃ　ＤＮＡを含む。上記の編歯動物ｃ　
ＤＮＡ配列のうち少数のものは、そのｃＤＮＡが誘導さ
れた細胞系列によっては示されない活性をコードするら
しいことに注意すべきである。

この記述の終シに示した最初のホリハブチドおよび本発
明の数種のｃ　ＤＮＡによってコードされる他のポリペ
プチドは、ＩＪＥ　　保有Ｂ細胞のＴＪＥ分泌細胞への
分化を特にインビトロで高めることができる。この用途
や他の用途のだめの適当な医薬組成物は、Ｏリ６プチド
を治療上適合性の担体へ添加することによって調製され
る。

本発明のさらに他の特徴および利点は、添付の図面を参
照するとともに１本発明を例によって説明する以下の詳
細な記述から明らかになるだろう。

第１図は本発明の４つのｃ　ＤＮＡクローンのＩ、９Ｅ
増強作用の程度を示す。

第２図は本発明の８つのｃＤＮＡの制限エンドヌクレア
ービ切断地図を示す。

第１図において、８３−２はクローン２３）３６ｐ８．
３の単一調製物であシ、そして１０．２はクローン２３
Ｂ６ｐ１０．２の単一調製物であって、これらのクロー
ンはあとでより詳細に説明されるだろう。１０６全細胞
当たシの工、９Ｅ−および工ｇＧ２−生成ρ胞が示され
る。

本発明によれば、相補Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃＤＮＡ）りｏ　
−ｙが哺乳動物ＩｇＦ　結合因子活性を示すポリペプチ
ドに対して準備される。そのｃ　ＤＮＡ配列は複製可能
な発現ベクター内に組み込まれ、そのベクターが適当な
宿主（例えば哺乳動物の細胞培養物）内へトランスフェ
クトされた後１発現したポリペプチドはＩＪＥ　　に結
合する能力を選択的に有する。

さらに５発現したポリペプチドのいくつかはＩ、９Ｅ保
有Ｂ細胞の工ＩＥ　　分泌形質細胞への分化を高めるこ
とができる。２つのｃ　ＤＮＡクローンの実験的に決定
したヌクレオチド配列に基づいた推定上のアミノ酸配列
が例としてこの記述の最後に示される。最初のアミノ酸
配列は分泌されて膜結合した蛋白質に特徴的な疎水性の
リーダー領域で開始する。さらに、Ｎ−グリコシル化の
だめの少なくとも２つの可能な部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈ
ｒ；　ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらのＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ　５　、４５０〜４９’Ｏ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＰｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　〔１９７２
〕　　を参照）、およびＯ−グリコジル化のだめの可能
な部位が存在する。

Ｉ、９Ｅ　　結合因子活性をコードする４つのｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａクローンは全てラット−マウスＴハイプリドーマ
細胞系列から単離された。これらのｃ　ＤＮＡクローン
はまず初めにハイブリッド選択およびアフリカッメガエ
ル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉ日）の卵母細胞内での
ＩｐＥ　　結合因子活性の翻訳により同定され、その後
トランスフェクトしたＣ０８７サル細胞内での直接発現
により同定された。

クローンはＩＪＩＥ−ＢＦ’　　についてのアミノ酸配
列の情報なしに、また検定用の適当な抗血清を用いるこ
となく単離された。意外なことに、　ｃＤＮＡクローン
のためのｍＲＮＡ源として役に立つその・・イノリド−
マはＩ、？Ｔ２　　抑制作用をもつＩ、９Ｅ−ＢＰ　　
または検出可能な抑制もしくは増強作用をもたない工ｇ
Ｅ−ＢＰ”　　のみを（使用条件下に）分泌したが、単
離されたクローンのうち２つはＩｇＥ　　増強因子活性
をもつ工、９Ｅ−ＢＦ’　　をＣｏｅ７細胞内で発現さ
せた。この発見は工ｇＥ−ＢＰ　　の生物学的活性を決
定する１つの規準がグリコジル化の程度および型であシ
うる可能性をかなシ支持する。

本発明のｃ　ＤＮＡを作るためには今やいろいろな方法
が利用できる。例として、全ｍＲＮＡが細胞系列から（
例えば、Ｊ、　ＣｈｉｒｇｗｉｎらのＢｉｏｃｈｅｍｉ
　−５ｔｒｙ　＋８：５２９４〜５２９９（１９７９）
　　に報告されたようにして）抽出され、その細胞系列
は哺乳動物ＩｇＥ−ＢＦ’　　活性を示す、６１７ベプ
チドを産生するハイプリツピ細胞系列でありうる。この
全ｍＲＮＡから、２末鎖ｃ　ＤＮＡはプライマーによっ
て開始される逆転写（１，ｖｅｒｍａのＢｉｏｃｈｉｍ
。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　４７３：Ｉ〜３８Ｃ１
９７７）を参照）を用いてまず第一に各ｍＲＮＡ配列の
相補体を作り１次いで第２鎖の合成を開始させる（Ｈ。

ＬａｎｄらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
＋　　９　：　２２５１′２２６６Ｃ１９８１）を参照
）ことによって作製される。続いて、ｃＤＮＡは適当な
プラスミドまたはバクテリオファージベクター（Ｆ、　
Ｒｏｕｇｅｏｎ　　らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、＋　２　：　２３６５〜２３７８（１９７５）
　　またはＧ、　５ｃｈｅｒｅｒらのＤｅｖ、　Ｂｉｏ
ｌ。

８６：４３８〜４４７（１９８１）を参照）へ、相補的
なホモポリマーチイル（Ａ、Ｅｆｅｔｒａｔｉａｄｉｓ
　らのＣｅｌ１．ＩＯ：５７１〜５８５ＣＩ９７７）　
　を参照）または適切な制限部位を含むリンカ−セグメ
ントを用いて作った接着末端（Ｐ、　Ｓｅｅｂｕｒｇら
のＮａｔｕｒｅ、２７０：４８６〜４９４（１９７７）
　　またはＪ、　５ｈｉｎｅらのＮａｔｕｒｅ、　２７
０　：　４９４〜４９９（１，９７７）　　を参照）を
介してそれらを結合させ、そのちと適当な宿主を形質転
換することによってクローン化される。（一般的には°
Ａ、　Ｅｆｓｔｒａｔｉａ、−ｄｉｓおよびり、　Ｖｉ
ｌｌａ−Ｋｏｍａｒ’ｏｆｆ　の１２本木調　ＤＮＡの
クローニング”、　　Ｊ、　ＳｅｔｌｏｗおよびＡ。

Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　　編集、　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　
Ｅｎｇｊｎｅｅｒｉｎｇ。

Ｖｏｌ、　ｌ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
　Ｃｏｒｐ、　　＝ニーヨーク、ＵＳＡ（１９８２）を
参照されたい。）本発明のクローン化された全長ｃ　Ｄ
ＮＡを得るための好適な方法は、　Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ
およびＰ、　Ｂｅｒｇ（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
ｌ、、　２　：　ｌ　６１〜Ｉ　７０　（１９８２））
によって開発された方法である。この方法はｃ　ＤＮＡ
挿入物を細菌のクロー二／グイクター内の。

ｃ　ＤＮＡが哺乳動物細胞内で直接翻訳されてプロセシ
ングされうる位置へ配置するという利点を有している。

要約すると、第１のｃＤＮＡ鎖は線状のプラスミド９ベ
クターＤＮＡの一方の末端へ共有結合された。＋６１Ｊ
デオキンチミジル酸によって結ばれる。

このプラスミド９ベクターはその一端をｃＤＮＡ　：ｌ
−ディング配列の５′−末端へ結合させるリッカーＤＮ
Ａセグメントを用いてその後環化される。サルウィルス
４０　（ＳＶ４０１初期領域プロモーターおよび修飾Ｓ
Ｖ４０後期領域イントロンを含むＤＮＡ断片を使用する
ことによって％ｃＤＮＡはさらに修飾をうけることなく
インビトロでＣｏｅ７サル腎細胞内で発現されうる。（
一般的にはＨｏＯｋａｙａｍａおよびＰ、　Ｂｅｒｇの
Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｌ、。

３：２８０〜２８９（１９８３）　　およびり、　Ｊｏ
ｌｌｙらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ、　８０　：　４７７〜４８１（１９８３）
を参照されたい。）ｃＤＮＡライブラリーはハイブリッ
ド選択（Ｍ。

ＨａｒｐｏｌｄらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ
、　＋　５　：　２０３９〜２０５３（１９７８）また
はＪ、　ＰａｒｎｅｓらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳへ７８：２２５３〜２２５７（
１９８１）を参照）およびアフリカッメガエル卵母細胞
内での翻訳（Ｊ、　ＡｕｒｄｏｎのＮａｔｕｒｅ。

２３３：１７７〜１８２（１９７１）を参照）によって
スクリーニングされる。（一般的にはり、ｖｌｌｌａ−
Ｋｏｍａｒｏｆｆ　　らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７５：３７２７〜３７３１　［：Ｉ　９７８）
を参照されたい。） ひとたびＯｋａｙａｍａ／Ｂｅｒｇ　　プラスミド８ベ
クター内のｃＤＮＡライブラリーが完成すると、そのｃ
　ＤＮＡクローンは集められ、そしてランダムプールが
ハイブリッド選択、翻訳および検定（例えはマスト細胞
生長因子活性、抗原決足基の存在、または他の生物学的
活性を測定する）によって目的とするｃＤＮＡの存在に
ついて調べられる。その後。

これらの規準に陽性のプールは適当な減じられた（ｓｕ
ｂｔｒａｃｔｅｄ）クローン（例えば誘導されたＴ細胞
系列からのｃ　ＤＮＡ　）を用いてプローブ検出される
。次いで、陽性の、プローブ検出されたプールは個々の
クローンに分割され、それらのクローンは適当な宿主（
例えば哺乳動物の細胞培養物）内でノトランスフエクン
ヨンによって試験され、そして宿主上清かＩ、！９Ｅ−
ＢＦ　　活性について検定される。その後陽性クローン
は配列決定がなされる。

本発明のｃ　ＤＮＡクローンの作製に関する方法をさら
に説明すると、最初にｍＲＮＡ源細胞が考慮され、絖い
てＩｇＥ−ＢＦ　　活性を示す蛋白質をコードするｍＲ
ＮＡのイノビトロ翻訳；　ｃＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡ
ライブラリーの作製；そのライブラリーのハイズリラド
選択；プラスミド（フタ−内の全長ｃＤＮ’ＡＤＮＡク
ローンよび哺乳動物細胞でのその故の発現；ヒトＩＦＥ
−ＢＦ　　の単離；細菌および酵母での発現；ならびに
精製、細胞培養および配合；の各方法が前駅される。全
実験過穆のより詳細な記述を以下に示すだろう。

細胞系列 本発明のｃＤＮＡクローンを単離するのに適当な細胞は
、Ｉ、９ｈニーＢＦ　　をコードするｍＲＮＡを作るこ
とが知られている細胞である。準備された細胞源はアメ
リカン・タイプ・カルチャー　コレクションにＡＴＣＣ
番号ＨＥ８５２１として寄託された２３Ｂ６クロ一ン化
細胞系列（ＨｕｆｆらのＪ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２９：５０！１ｌ−５１４（１
９８２）を参照）であるが、バイブリド−でや細胞培養
物を必ずしも用いる必要はない。免疫グロブリン結合因
子の他の細胞源にはヒトＢリノフオサイトーマＲＰＭＩ
　８８６６　（Ｐ、　ＣｈｅｎらのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ。

Ｍｅｔｈ、５８：５９〜７１（１９８３））、　　ヒト
末梢血リンパ球（ＬｅｔｈｉｂｉｃｈｔｈｕｙらのＥｕ
ｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｌ　Ｏ：　８９４〜８９８（１９８
０））、およびブウスハイブリドーー細胞系列（工、　
ＬｏｗｙらのＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ　　８０：２３２
３〜２３２７（１９８３））が含まれる。

ｍＲＮＡの単離および大きさによる分画化全細胞ｍＲＮ
’Ａは裡々の方法、例えはＣｈｉｒｇｗｉｎらのグアニ
ジニウム−チオンアネート抽出法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　１８：５２９４〜５２９９（１９７９）を用い
ることにより単離できる。この方法を用いる場合、１〜
２ＸＩＯ細胞（例えば２３Ｂ６ハイブリド−マ）から約
ｌＯＯμｇのポリＡｍＲＮＡがオリゴ（ｄＴ）セルロー
スカラムにかけることにより得られる。

フィルターハイプリダイゼーンヨンがＰａｒｎｅｓらの
方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎ’ａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ。

７８：２２５３〜２２５７（１９８１））　を用いるこ
とにより都合よく行われる。溶出したｍＲＮＡのアリコ
ートは当技術分野で周知の方法により個々のアフリカッ
メガエル卵母細胞内に注入される。生存しうる卵母細胞
からの上清を４８時間後に集めてプールし、ＩｇＥ−Ｂ
Ｅ　　活性について検定した。

ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡライブラリーはｍＲＮＡ転写物の非常に富んだ
全長コピーをもたらす方法（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａおよび
Ｐ、　ＢｅｒｇのＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、
　２：　１６１〜１７０〔１９８２〕およびＭｏ１．　
Ｇｅ１１．　Ｂｌｏｌ、。

３：２８０〜２８９（１９８３）を参照）に従って、ｐ
ｃＤＶエベクターープライマーおよびｐＬ１リンカー断
片（ライスコン７）州、ミルウォーキーのＰ　−Ｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅＭｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、から市販されている
）を用いることにより都合よく作製される。

ｓｖ４　Ｑ初期プ０モーターおｊびＳＶ４０ＲＮＡプロ
セシング信号を含むプラスミドベクターは、噛牲動物細
胞内でのクロー／化ｃ　ＤＮＡセグメントの発現を開始
させるように作られている。

ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ　　の方法を用いて、塩
化したベクター−ｃＤＮＡ調製物は大腸菌ＭＣ１０６１
細胞（Ｍ、Ｃａ５ａｄａｂａｎおよびＳ、Ｃｏｈｅｎの
ＪｏＭｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、１３８：１７９〜２０７（１９８０）を参
照）のような免疫感応性の細菌細胞を塩化カル７ウムの
使用（Ｓ、ＣｏｈｅｎらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、６９：２１１０〜２１１４（１９７２）を参照
）により形質転換させる。２３Ｂ６細胞がらのポリＡ＋
ＲＮＡ　５μｌを用いることにより約１×１０５個の形
質転換体が得られる。所望にょシ、ｃＤＮＡ挿入物の大
きさに基づいたサノライブラリーがＨｏＯｋａｙａｍａ
　およびＰ、　Ｂｅｒｇ　（Ｍｏ１．Ｃｏ１．１．、、
Ｂｉｏｌ、、３：２８０〜２８９（１９８３））　　の
方法にょシ全ｃＤＮＡライズラリ−から作られる。全て
のヌクレオチドの配列決定はＡ、ＭａｘａｍおよびＷ、
　’　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、　、　６５　：　４９９〜５６０（１９８０
：］）ならびにＳａｎｇｅｒらの方法（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、１４３：１６１〜１６４（１９８０））に従
って行うことができる。

減じられたｃＤＮＡプローブの調製 ３２Ｐ　−ｃ　ＤＮＡプローブはｌサイクルのｃＤＮＡ
吸着（Ｍ、　Ｄａｖｉｓらの”ＢおよびＴ細胞特異的遺
伝子の単離”、　　Ｅ、ＶｉｔｔｅｔａおよびＣ，Ｆａ
ｘ編集。

ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐ、　、　４８頁（１９８２）を参照
）によってハイノリド−マ特異的配列に対して富化され
る。

放射能ライルした第１鎖ｃ　ＤＮＡは工Ｉ！Ｅ　　とと
もに培養した２３Ｂ６細胞からのポリＡ＋ＲＮＡ約５μ
Ｉの逆転写によって作られる。このｃＤＮ’Ａは適当な
スクリーニノグ細胞系列からのポリＡ”ＲＮＡ約５０μ
！ヘコツト値）１５００でノ・イノリダイズさせ１次い
でヒドロキシルアパタイトカラムにより分画化する。吸
着されない画分（これは）・イブリダイズし得ない物質
と１末鎖ｃ　ＤＮＡを含む）はｃ　ＤＮＡの全量の１０
〜１２％を占める。この物質はその後ｎ−ズタノールで
の抽出を〈シ返すこと忙より１０倍に濃縮し、そしてプ
ラークハイブリダイゼーション用プローブとして用いる
のに先立って４℃で保存される（Ｔ、　Ｍｏｎ１ａｔｉ
ｓらの’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ、Ｈａｒｂｏｒ研究所、ＵＳＡ　　（１９８２
）を参照）。

サル細胞へのＤＮＡ　トランスフェクション約Ｉ　Ｘ　
１０６個のＣｏｓ７サル線維芽細胞をトランスフェクシ
ョンの前日に１００ｍｍの平板上へ播種スる。トランス
フェクンヨノは５０ｍＭ　　トリス・ＨＣｌｐＨ７，４
）および４００４９７ｍ１．　ＤＥＡＥ−デキストラン
（スエーデノ、ウプサラのＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むＤ　Ｍ　Ｅ　４．　Ｑ　
ｍＡ中でプラスミドＤＮＡ５０μｇを用いることにより
都台よく行われる。この溶液はその後除去して７．　Ｑ
　ｍｌＤＭＥ＋４％胎児ウシ血清と取シ替えた。この培
地は７２時間後に集めて前述のとと＜　１．９Ｆ！ニー
ＢＰ活性について検定した。

１．９Ｅ　　結合因子活性の検定 （１）　　■、９Ｅ　　結合因子は初めに工ｇＥ　　で
感作した雄つシ赤血球およびリンパ球によるＩ、９Ｅ−
特異的ロゼツトの形成を阻止するそれらの能力により検
定される（Ｊ、　’Ｙｏｄｏｉおよびに、　ｌ５ｈｉｚ
ａｋａのＪ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２２：２５７７（１９７９）；１
２４：１３２２（１９８０）を参照）。一定のサンプル
の反復検定でのばらつきはこれらの実験の平均値の±１
０％以内であるべきである。未注入の卵母細胞または擬
似トランスフェクトされたＣｏｅ７細胞は陰性の対照と
して用いられる。（Ｉ１１注入卵°母細胞およびトラン
スフェクトされたＣ０６７細胞の上清中のＩ、１９Ｅ結
合因子は、　ＩＪ９Ｆ結合セファロースでのアフイニテ
イクロブトグラフイーによって精製される（　Ｊ、　Ｙ
ｏｄｏｉらのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＊　　ｌ　２５　
：１４３６〜１４４１（１９８０）を参照）。これらの
結合因子のＩ、９Ｋに対する特異性は、ＩＪＧ結合セフ
ァロースまたはＢＳＡ結合セファロースへ結合するそれ
らの能力を示すことにより決定される。（ｌｕｌｌｌ、
９Ｅ−ＢＦ’は抗原感作したリンパ腺細胞のインビト口
培養においてアイソタイプ特異的抑制作用および増強作
用について試験される。ＩＭＥ−ＢＦ　　の抑制作用お
よび増強作用は、抗原感作したラット腸間膜のリンパ腺
細胞のイノビトロ培養における多数の１Ｉ９Ｆ産生細胞
に対するそれらの作用によって定められた（Ｓｕｅｍｕ
ｒａらのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　＋　１２５：Ｉ４８
〜１５４［１９８０）；ＨｉｒａｓｈｉｍａらのＪ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１２５　：　ｉ　４４２〜１４４
８［：１９８０〕；ＹｏｄｏｉらのＪ、工ｍｍｕｎｏｌ
＋　　ｌ　２８　：　２８９〜２９５〔１９８２〕を参
照）。

多くの検定は・旙歯動物Ｉ、ｙＥ−ＢＦ’　　の測定に
ついて述べているが、ヒトＩ！ｑＥ−ＢＰ　　の検定に
も利用できる（Ｋ、工５ｈｉｚａｋａおよびに、　Ｓａ
ｎｄｂｅｒｇのＪ、Ｉｍｎｎｕｎｏｌ、、　１２６：１
．６９２〜１６９６［１９８１）を参照）。実際、ヒト
ｌ９Ｅ−ＢＦ　　のための迅速なスクリー二／グ検定が
利用可能である（　Ｐ、　ＣｈｅｎらのＪ、　Ｉｍｍ、
　Ｍｅｔｈｓ、、　５８　：　５９〜７１　（１９８３
）を参照）。

ヒトＩ７９に−ＢＦ’　ｃＤＮＡの単離偏肉動物遺伝子
のＤＮＡクローノが相同性のヒト遺伝子をコードするＤ
ＮＡを同定してｍ離するのに用いられた。ヒト遺伝子と
１歯動物遺伝子との相同性が比較的低いために、ハイズ
リダイゼーンヨ７条件のストリンジェノン−（＋１ｒｉ
ｎｇｅｎｃｙ）は、７５〜８０％相同であるにすぎない
配列間の父差ハイブリダイゼーンヨノをおこすべく調節
されねばならない。いくつかの異なる実表・・記録がこ
の目的を達成するために用いられた。例えば、ヒトＣｋ
免疫グロブリン軽鎖遺伝子はプローブとして対応するで
ウスＣｋ遺伝子を用いて単離された（Ｐ、　Ｈｉｅｔｅ
ｒらのＣｅＬｌ、　２２　：　ｌ　９７〜２０７（１９
８１）を参照）。またマウス移植抗原遺伝子はそれらの
ヒト同等物をコードするＤＮＡＮコクローンへブリダイ
ズすることによって単離された（ｇ　　Ｓｔｅｉｎｍｅ
ｔｚらのＣｅ１ｌ、２４：１２５〜１３４（１９１Ｎ）
を参照）。

好適な方法ではヒトゲノムＩ）ＮＡのライブラリーから
のλファージクｏ　−７（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓらの
’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ’。

Ｃｏ１ａ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ研究所、ＵＳＡ
〔１９８２〕を参照）が１５０ｍｍの平板あた’）　２
　Ｘ　ｌ　０４　　プラークの密度で適当な宿主株（例
えば大腸菌ＬＥ３９２）の上へ置かれる。一般に１０〜
２０（［１平板で十分である。

３７℃でＩＯ〜Ｊ、２時間インキュ（−ンヨノ後、平板
は２時間冷蔵させ、その後者平板の寒天表面に１３２朋
のニトロセルロースフィルターをｉ＜。

このフィルターは少なくとも５分間平板と接触したまま
にしておき、この間フィルターはインキを満たした２２
ゲージ針を用いて刺すことにより平板に重ね合わせる。

その後、フィルターを平板からはがして、最初は２５０
ｍ１のＱ、　ｌ　Ｎ　ＮａＯＨ。

Ｑ、　５　Ｍ　ＮａＣｌ中で、次に２５０ｍ１の０．５
　Ｍ　トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７，ｓ　）、　　１．５　
Ｍ　ＮａＣｌ中で少なくとも２分間順次インキュベート
する。フィルターはき一パータオル上で乾燥し、８０℃
で４〜８時間焼く。

ハイブリダイゼーンヨ／のために、このフィルターはＩ
　Ｘ５ＦｉＴ（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１，３０ｍＭ　　
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８０）、１ｍＭＮａ２ＥＤＴ八）
中でしめらせ、次いで３ＸＳＥＴ、５Ｘデンハート溶液
（Ｄ、　Ｔ、　ＤｅｎｈａｒｄｔのＢ、　Ｂ、Ｒ，Ｃ，
２３：　６４１〜６４６［１９６６））、　　１０％デ
キストランサルフェート、０１％ＳＤＳ、　および５０
μｐ／ｍｌ　　の各ポリ（ｒＡ）、ポリ（ｒＣ）および
ポリ（ｒＧ）　　の溶液（１５〜２　ｍｌ　／フィルタ
ー）中６５℃で２時間一定に攪拌しながらインキュベー
トする。その後、この溶液を捨てて、フィルターはニッ
クトランスレートされたーウスＤＮへプローブｏ、ｓｘ
、＋Ｄ’ＥＩＩ　Ｑ８ｃｐｍ）と同じ溶液（新鮮なもの
、１．５〜２　ｍｌ／フィルター）中６５℃で１時間、
次に５５℃で１２〜２０時間ハイブリダイズさせる。そ
れからフィルターは３ｘＳＥＴ、ＩＸＸノンート溶液。

０１％ＳＤＳ中で、次にｌＸ５ＥＴ、Ｑ、１％５ＤＳ（
１０〜１５ｍ１／フイルタ）中で各々１時間穏やかに攪
拌しながら順次洗浄する。そのフィルターをＳ−パータ
オル上で乾燥し、適当なフィルムと増感用スクリーンを
使ってオートラジオグラフィーを行う。ハイブリッドプ
ラークは無菌のノξスツールピイットを用いて寒天平板
から採取して、１ｍｌの０．１　ＭＮａ（Ｊ、　　０．
０１　Ｍ　）すｙ、　−ＨＣＩＩ　（ｐＨ７．５）　、
　　１０　ｍＭ　Ｍ９Ｃ１２゜　Ｉ　ＯＯ、ｊ？／ｒｄ
ゼラチンの中へ入れ、５０μ４のＣＨＣｌ３　を添加す
る。

少なくとも４〜８時間冷蔵した後、名プラークからのフ
ァージは前述の方法と同じ方法により低密度（２０００
〜４０００プラーク／１５０朋平板）で再度スクリーニ
ングされる。

原核生物は、グリコジル化を望まない場合に、Ｉ、９Ｅ
−ＢＰ’　　ポリペプチドの発現にとって非常に都合が
よい。大腸菌（Ｆ、λ−１原栄養株、ＡＴＣＣ第２７３
２５号、　　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ。

Ｌｌｃ、第１．００３９号）、犬″腸菌に１２株２９４
（ＡＴＣＣ第３１４４６号、１ｖＩ　　第１００４０号
）、大腸菌ｘｉ　７７６　（ＡＴＣＣ第３１５３７号、
　　ＩＶＩ　　第１００４１号）、枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｕｓ）　のような細菌、およびネズ
ミチフスが宿主として使用できる。

高発現レベルを得るために、β−ラクタマーゼ（−！ニ
シリナーゼ）およびラクトースプロモータ系（Ｃｈａｎ
ｇらのＮａｔｕｒｅ、２７５：６１５（１９７８）；Ｉ
ｔａｋｕｒａらの５ｃｉｅｎｃｅ、　　１９８　：　１
０５６　（１９７７）；ＧｏｅｄｄｅｘらのＮａｔｕｒ
ｅ　２８１　：５４４（１９７９）を参照）！たけトリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ
らのＮｕｃｌｅｉ’ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　８　
：４０５７〔１９８０〕を参照）のようなプロモーター
を使用する方がよい。これらは最も一般的に使われてい
るが、他の微生物プロモーターも利用できる。Ｏｍｐ　
　Ａ蛋白質の信号ペプチドをコードするＤＮＡ断片を含
むベクターなどの分泌クローニング（フタ−も゛また利
用し得る。

原核生物のほかに、当業者は酵母のような真核微生物が
Ｉ、？Ｅ−ＢＦ’　　産生に使用できることを認めるだ
ろう。ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅ−ｖｉｓｉａｅ）　　は好適な真核微生物である。

ビール酵母内での発現のために、プラスミドＹＲｐ７　
（Ｓｔｉｎ　−ｃｈｃｏｍｂらのＮａｔｕｒｅ　２８２
　：　３９　（１９７９）　ｐＫｉｎｇｓｍａｎらのＧ
ｅｎｅ７：　１４１　［１９７９ＬＴｓｃｈｅｍｐｅｒ
らのＧｅｎｅ　１０　：　１５７　（１９８０）　’ｆ
ｃ参照）およびＹＥ　　ｌ　３　（Ｊ、　Ｂｒｏａｃｈ
らのＧｅｎｅ　８：１２１〜１．３３　Ｃ１９７９）　
　を参照）のような２ミクロンの誘導プラスミドが一般
′に強力なプロモーターととも寛使用される。酵母ベク
ターの好適なプロモーター配列には、３−ホスホグリセ
レートキナーゼのためのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａ
ｎらのＪ、Ｂｔｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５５：２０７３（
１９８０：］を参照）、またはエノラーゼ、グリセルア
ルデヒドゞ−３−ホスフエートデヒトゝロゲナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルゴース−６−ホスフェートイソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベー
トキナーゼ、トリオセホスフエートイソメラーゼ、ホス
ホグルコースインメラーゼ、およびグルコキナーゼなど
の他のグルコース分解酵素のだめのプロモーター（Ｈｅ
ｓｓらのＪ、　Ａｄｖ。

Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、＋　７：　　１４９（１９６８
：］；　Ｈｏ１ｌａｎｄらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　　１７　：　４９００　Ｃ１９７８）を参照）が含
まれる。生長条件によって転写がコントロールされると
いう利点をもつ他のプロモーターは、アルコールデヒド
ロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ１酸ホスフアターゼ、
窒素代謝に関連した分解酵素、およびマルトースとガラ
クトースの利用に関連した酵素のための各プロモーター
領域である。酵母適合性のプロモーター、複製開始点お
よび終止配列を含むプラスミド（フタ−はどれも利用し
得る。（Ｌ、　Ｇｕａｒｅｎｔｅの’Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、　Ｖｏｌ、　ｌ　Ｑ　ｌ
　’　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ、ｎｔＤＮＡ”、１８１〜１
９１頁＊　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク［１９８３）　　もまた参照されたい。）
微生物のほかに、多細胞生物（特に哺乳動物細胞）由来
の細胞培養物もまた宿主として使用できる。この種の好
適な宿主細胞系列の例には、ヒーラ細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞系列、およびイイビーハムスター腎
細胞系列が含まれる。

このような細胞のための発現ベクターは通常必要とされ
るリポソーム結合部位、　ＲＮＡ　スプライス部位、ポ
リペプチド−ジョン部位および転写ターミネータ−配列
と共に、複製開始点、発現されるべき遺伝子の前に位置
するプロモーターを含む。

哺乳動物細胞において、その発現ベクターの調節機能は
しばしばウィルス物質によって提供される。

（Ｒ，ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＰ、　Ｂｅｒｇの５ｃｉ
ｅｎｃｅ。

２９９：１４２２〜１４２７（１９８１）およびＷ。

ＤｅｒｙｎｃｋらのＮａｔｕｒｅｓ　　２１５　：　５
４２〜５４７（１９８０）　　を参照されたい。）例え
ば、通常使われるプロモーターはポリオーマ、アテノウ
イルス２、および最も頻繁にはサルウィルス４　Ｑ　（
ＳＶ４０）から誘導される。Ｓ■４０ＩＬ基づいたベク
ターはＣＯ８細胞において特に利用され、とのｃｏｓ細
胞は複製開始点を欠くＳＶ４０のＤＮＡによって形質転
換されているがＴ抗原を含むＣＶ１細胞（アフリカング
リーンモンキーの腎細胞培養物）である（　Ｙ、　Ｇｌ
ｕｚｍａｎのＣｅ１ｌ、　２３　：Ｉ７５〜１８０（１
９１３１）を参照）。

Ｉ、９Ｅ−ＢＦ　　産生のために真核生物系を利用する
場合、宿主のグリコジル化能力はＩ、９Ｅ−ＢＦ　　の
機能に対するグリコジル化の明らかな１要性を与えると
考えられる。

精製および配合 大腸菌、酵母または他の生物内で発現されたＩＩＥ−Ｂ
Ｆ　　Ｊり投ブチトゝは硫酸アンモニウム沈降、分画化
カラムクロマトグラフィー（例えばイオン交換、ゲル濾
過、電気泳動、アフイニテイクロートグラフイーなと）
および最終的な結晶化を含む当技術分野の標準方法に従
って精製される。（一般的には１酵素精製および関連技
術ｓ、　　Ｍｅｔｈｏｄｓｊ、ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、　２２：　２３３〜５７７（１９７１〕を参照され
たい。）ひとたび部分的にまたは均質的に精製されると
、本発明の工ｇＥ　増強因子Ｚ　１７はプチドは１例え
ば寄生虫感染を治療するための医薬組成物（下記を参照
）に利用される。一般に、工ｇＥ−ＢＦ　　は例えばＩ
ＪＥ　　Ｂ細胞の分化に対して特異的な試薬として、検
定系における抗−１，９Ｅ抗体の代替物として、または
免疫検定や免疫蛍光染色に有用な特異的免疫グロブリン
を誘発するための抗原物質として検索目的のために、あ
るいはＩＪＫ　　関連仙究のために使用される。（一般
的には　“　工ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ”、　　Ｖｏｌ、　　Ｉ　　＆　　ＩＩ。

１、　ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＢ、　Ｐｅｒｎｉｓ編
集、　　Ａｃａｄｅ−ｍｉｃ　Ｐｒｅｅｓ、　＝ニーヨ
ーク（１９７９＆　　１９８１）；および”Ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏ
−１ｏｇｙ″、　Ｄ、Ｗｅｉｒ編集、　　Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉ’ｃａｔｉｏ
ｎｓ　、セントルイス（１９７８）　　を参照されたい
。） 本発明のポリＳプチドを含む医薬組成物を製造するため
に、このポリペプチドは薬学的に受容される不活性担体
と混合される。適当な担体おまひ製造方法は当技術分野
でよく知られている（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ＳＰ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＩＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ
、Ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：　’Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｆ’ｏｒｍｕ−１ａｒｙ、　Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉ
Ｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　　イーストン、Ｒンフ
ルバニア州（１９８０）　　を参照）。好適な投与方法
は非経口的であり、様、械的送出系を含みうる。

好ましくは、医薬組成物は単位投与形体をしている。こ
の種の形体において、製剤は適量の活性成分を含む単位
用量に分割される。製剤の嗅位用量あたりの活性成分量
はそれぞれの用途および活性成分の効力により１μ！？
〜１００ｍｇの範囲で変化しうる。組成物（ｄ場合によ
り他の治療用薬剤を含む。

投与量は患者の要求条件、治療をうける状態の程度およ
び用いる個々の化合物に応じて変化する。

特定の場合における適切な投与量の決定は当分野の技術
の範囲内である。一般に、治療は化合物の最適用量より
も少ない用量をもちいて始められ、その移投与量はその
環境下での最適効果が得られるまで少量ずつ増加される
。便宜上、−日の全投与量は分割されてその日のうちに
小分けして投与される。

他の免疫グロブリン結合因子をコードする相同遺伝子の
単離 相同遺伝子の単離は以下の方法によって行うことができ
る。λファージ（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ　　の前掲−１
ｔ（１９８２）　　を参照）またはコスミド（Ｓｔｅｉ
ｎ−ｍｅｔｚらのＣｅ１１．２８：４８９〜４９８（１
９８２）を参照）ベクター内のラットゲノムＤＮＡのラ
イブラリーがクローン２３Ｂ６ｐ８．３（第１図）の＝
ツクｌ−５７ＸＬｙ−）−されｆ４３２Ｐ　５−＜　／
、１５１ｊ　ｌ＋ｆｉ　ｘ　ｙドヌクレアーぜ断片を用
いてスクリーニングされる。ハイブリッドクローンを採
取して精製し、Ｄ　Ｎ　Ａを調製して制限エンドヌクレ
アーゼ地図が作成される。別法として、ｐｃＤ　ｃＤＮ
Ａ　ライブラリーが他のアイソタイプ調節因子を発現す
るＴ２Ｄ４マウスバイブリド’−マ（１，Ｌｏｗｙらの
Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　８０　
：２３２３〜２３２７（１９８３）；Ｊ、Ｙｏａｏｉら
のＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３１：３０３〜３１０〔１９８３〕を参照）のような
細胞系列から作製されて、個々のｃＤＮＡクローンを単
離すべく前述のようにしてスクリーニングされる。

他の免疫グロブリン結合因子をコードするＤＮＡクロー
ンは一般にそれらがコードする蛋白質の活性作用忙よっ
て同定されねばならない。’ｌ’　２　Ｄ　４のような
細胞系列からのｐｃＤ　ｃＤＮＡクローンはＣｏｓ　７
サル細胞内に挿入され、細胞上清か上記文献に記載のご
とくして検足される。λファージまたはコスミトゝベク
ター内のゲノムＤＮＡクローンは、選択しうるｍ−カー
をコードする別のＤＮＡ断片を用いる同時トランスフェ
クション実験において使用される。例えば、Ｒ，Ｓ、　
Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１５　：
　６７７　（１９８２）　）　　はマウスＬｄ移植抗原
遺伝子を−ウスＬｔＫ−線維芽細胞系列内でのこの棟の
ＤＮＡ仲介遺伝子転移によって同定した。こうして得ら
れた安定な形質転換細胞系列はその後Ｔ２Ｄ４細胞系列
に関する上記文献に記載された検定法によって免疫グロ
ブリン結合因子の産生についてスクリーニングされる。

以下の実験情報およびデータは例として提供され、限定
として提供されるものではない。

実験 ド−マ細胞 ラットＭＬＮ細胞とＨＰＲＴ−欠失ＡＫＲ拘腺肺腺腫細
胞Ｗ５１４７）とを、ＫＯｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎの方法（Ｇ、　ＫｏｈｌｅｒおよびＣ，Ｍｉｌ−ｓ
ｔｅｉｎのＥｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６　：　
５１　］−（１９７６）を参照）によって融合した。簡
ｍに述べると、７．５×１０７個のＭＬＮ細胞を２．５
×１０７個のＢ、ＷＳ２４７　（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ４
８）　　細胞と共にＲレット化した。その投レットを穏
やかに分散して、５０％ポリエチレングリコール４００
０（シグマ社製）および５％ジメチルスルホキンドを含
む溶液１ｍｌを１分間にわたって一定に攪拌しながら加
えた。この細胞懸濁液は３７℃で９０秒秒間中かに攪拌
し、続いてＨａｎｋｓ　　らの平衡塩溶液（ＢＳＳＩを
徐々に加えた。融合後、２　Ｘ　１０”個のＭＬＮ細胞
を含む細胞をＨＡＴ含有培地内に再懸濁し、そして９６
−ウェルプレートの各ウェル（穴）の中に播種した。培
地は抗生物乃、１０膜胎児ウソ血清（Ｆ’　ＣＳ、　　
ＦＩＯＷ研究所、マクリーン、バージニア州）、１０％
ＮＣＴＣＩ、３５培地（ＧＩＢＣＯ，グランドアイラン
ド、ニューヨーク州）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、
０２Ｕ／ｍｌウシインシュリン（シグマ社ｇ）、ｓｏμ
Ｍ　１ｍｌピルビン酸、および１５０μ９７ｍ１オキサ
ロ酢［−補足した高ダルコースＤＭＷから取る完全なり
ｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地（ＤＭＥ）であった
。細胞はクローンが現われるまで２〜３週間　。

ＨＡＴ−ＤＭＥ中に保持し、その後ハイブリッド細胞を
完全なりＭＥ中に１週おきの継代培養でもって保持した
。細胞のアリコートは凍結して液体窒素中に保存した。

２）Ｉ、９Ｅ　　結合因子の生成 ハイブリド−マ細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度で５
％ＦＣ８１３ｍＭＬ−グルタミン、５×１０−５Ｍ２−
メルカプトエタノールおよび抗生物質を補足したＲＰＭ
ＩＩ６４０培地中に懸濁し、１０μ９７ｍ１！　　のラ
ツ）　■ＦＤ　　の存在下または不在下に２４時間培養
した。細胞を含まない上清はＤｉａｆｌｏ　ＣＦ’　−
５Ｑ　Ａ膜またはＸＭ−５０膜（カットオフポイント５
００００分子量；　Ａｍ１ｃＯｎＣｏｒｐ、　＋レキシ
ントン、マサチューセツク州）を介して濾過した。必要
により、その培養炉液はＹＭ−５膜を使った限外濾過忙
よって濃縮した。

１）ＩｇＥ　　特異的ロゼツト形成の阻害ａ）固定した
雄つノ赤血球： 燐酸緩衝化良塩水（ＰＢＳｌ中の雄ウシ赤血球（Ｃｏｌ
ｏｒａｄｏ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃｏ−＋デンバー、コロラド
州）の１０％懸濁液１　ｍ、ｌを、ＰＢＳ中０．２　ｍ
ｇ／　ｍｌ　ト’）プシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）等容量と混合し、時
々攪拌しながら３７℃で１回間インキュベートした。Ｐ
ＢＳ中の０．２　ｍｙ　／　ｒｎｌ大豆トリプシン阻害
剤（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ＣＯ２）のアリコート２ｍ、ｌ！を加えた。紹゛胞はＰ
ＢＳｌ　ｍｌずつで５回洗浄し、その後ＰＢＳｌｍｌ中
に１０％となるように再懸濁した。ＰＢＳ中３％ピルビ
ンアルデヒド’　（工Ｎ　Ｃ’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌｓ）のアリコート（ｐＨ７，２）　　１ｍｌを加
え、細胞は３０ｒｐｍ　　の回転器で連続攪拌しながら
室温で２０時間インキュベートした。細胞を上記のよう
にしてＰＢＳで洗い、次いでＰＢＳ中３％ホルムアルデ
ヒド″（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｊ、ｃ　Ｃｏ
、）　　２ｍｌと共に室温で２０時間インキュベートし
た。固定した赤抑味は上記のようにしてＰＢＳで５回洗
い、ＰＢＳ中の１０％慰、濁液として４℃で保存した。

ｂ）　　工！？Ｅ　　で感作した固定赤血球（工、９Ｅ
−ＲＢＣ）またはヒト血清アルブミン（ＵＳＡ）で感作
した固定赤血球（ＵＳＡ−ＲＢＣ）： ■ｇＥ　　はラットＩｇＥ　　骨髄腫（ＩＲ１８３また
はＩＲｌ　６２　；　Ｈ，ＢａｚｉｎらのＩｍｍｕｎｏ
１ｏｇｙ２６：７１３（１９７４））　　またはマウス
ＩｇＥ　　ノ１イブリド−マ（ＡＴＣＣ番号ＴｌＢ１４
１　　およびＴよりＩ４２）腫瘍をそれぞれ有するラッ
トまたはマウスの膨水から調製した。硫酸アンモニウム
沈降、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーおよび
ゲル濾過の技術はこの分野において慣用の技術である（
Ｂ、　ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳ、　Ｓｈｉｉｇｉ　　編
集、’５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ
１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕ−ｎｏｌｏｇ、ｙ’、　Ｗ、　
Ｈ，Ｆ’ｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ＋サンフラン／ス
コ、カリフォルニア州（１９８０）、２７８〜２８０頁
；　　Ｖａｎｄｅｒ−ＭａｌｌｉｅらのＪ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。

１２８；２３０６〜２３１２（１，９８２）　　を参照
）。

偏歯動物工、９Ｅ　　は酸に不安定であるから、これら
の操作中ｐＨ）７．０　　を維持するように注意した。

固定した雄つシ赤血味は０．１　Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５，
０）で１回洗い、そしてこの緩衝液中に４％となるよう
に懸濁した。ホウ酸緩衝化良塩水（ｐＨ８，０）中のｉ
　ｍｔｉ　／　ｍｌのラットまたはマウスＩ、９Ｅ　　
もしくはｌ５Ａ（２Ｘ結晶化したもの、Ｎｕｔｒｉｔｉ
ｏｎａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　０．２５　ｍｌ
に、Ｏ，］、　Ｍ酢酸Ｎａ００２５　ｍｌ、次に固定し
た赤血球の懸濁＊　０．５　ｍｌを加えた。この混合物
を上記のごとく回転器で攪拌しながら室温で２時間イン
キュベートした。感作細胞はＰＢＳｌｍｌずつで３回洗
い、ＰＢＳｌｍｌ中に再懸濁した（２％）。この懸濁液
は４℃で１週間保存できるだろう。

ｃ）Ｆｃ、Ｒ＋リ　ンノξ球ニ ルイス株のラット（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ’ｌ
　Ａｓ５ｏｃｉ−２８００〜３０００匹を皮下経由でＧ
、　０ｇ１１ｖｉｅの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２０４：９
１（１９６４））　　により感染させた。感染後２週間
して腸間膜のリンパ腺細胞を採取し、ＲＰＭ１１６４ｊ
５％胎児つ／血清（全１Ｃ８）中に懸濁させ、そしてＴ
Ｊθｈｉｚａｋａらの方法（Ｃｅｌｌ。Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　２２　：　２４８　（１９７６））によってガラス
ウールカラムに通して死細胞と細胞砕片を除いた。もう
１つの方法として、正常マウスの解繊細胞をＲＰＭ１１
６４０＋５％Ｆ’Ｏ８中の革細胞懸濁液へと分離させ、
そしてセファデックスＧ〜１０に通して付着細胞を除去
した（　ＬｙおよびＭｉｓｈｅｌｌのＪ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｃｌｓ　５　：２３９（１９７４）
；およびＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ。

１７５〜１７９頁を参照）。約３０％のＦＣ，Ｒ＋リン
パ球を含むこれらの調製物は検定に使用する前に１×１
０７細胞７ｍｌへ調整した。

ｄ）阻害試験： ＵＳＡ−ＲＢＣを各回ごとの基底値のだめの陰性対照と
して用いた。ＰＢＳはＩＣＥ　　特異的ロゼツト形成の
阻害剤を含むサンプルの代わシに陰性対照として使用し
た。５ｍｌのポリプロピレン製チューブに、Ｆ　ＣＳ　
６　ａｌ、　１．９Ｅ−ＲＢＣの１％懸濁液１５μｌ、
および試験用サンプル（一般には培地または卵母細胞の
上清）３０μｌをこの順序で添加した。チューブを穏や
かに回して（ｖｏｒｔｅｘ）チューブの底を添加物質で
被俣し、次に氷上へ２時装置いた。ＦｃＲ＋リンパ球（
１’Ｘ１０７細胞７ｍ１）のアリコート１５μｌを加え
た。チューブを穏やかに回して、３７℃で１０分間イン
キュＲ−卜し、その稜角び穏やかに回した。細胞は１０
０×１１４℃で７分間遠心することによりｄレット化し
、そのサンプルは０℃で８〜１０時間インキユベートシ
た。サンプルを０℃の環境から取り出し、穏やかに手で
混合して細胞間レットを分散させた。ＰＢＳ＋１３％Ｆ
’Ｃ８中の０．１３％トルイジンブルーのアリコート９
２μｌを第２のポリプロピレンチューブに入れ、その後
分散したにレット２０μｌを加えた。このサンプルをピ
投ットの先端で３回攪拌することにより混合した。染色
したに［（１胞懸濁液はＦｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａ
ｌ血味旧数器へ移して２〜３分間放置させた。ロゼツト
は少なくとも３〜４個のｌ９Ｅ−ＲＢＣへ結合した単一
のリンパ球として数えた。一般に、陽性対照（阻害剤な
Ｌ）ｉｄ３０〜３５％のロゼツト形成細胞（ＲＦ′Ｃ）
を与えるが、陰性の基底値対照（Ｈ８Ａ−ＲＢＣ）は５
〜１０％のＲＦＣを与える。各サンプルの２つの反復検
定の各々から少なくとも３００個のリンパ球が計数され
た。ＩｐＥ　　特異的ロゼツト形成の阻害は次式： によって決定された。

個々のサンプルの反復検定における変動は平均値の１．
０％以内であった。

Ｉｊ７Ｅ　　結合セファロース４Ｂは臭化シアン−活性
化セファｏ−ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　　５　ｍｌと
ラットマタハマウスＩ＃Ｅ５０〜とを４℃で一晩インキ
ユベートすることにより調製した。この反応は０５Ｍ　
ｘ　タ／　−ル７ミ、／　−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ８，０）
　　４　容’Ｍを加して停止させた。セファロースは３
〜４容量のＰＢＳで洗った。Ｃｏｓ　７細胞上清をＤｉ
ａｆｌｏ　ＵＭ２膜を使った限外濾過により４〜１０倍
に濃縮した。

ａ縮したＣｏｓ７細胞上清またはアフリカツメガニノリ
１母細胞上清のアリコート１ｍｌをＩＪＩＥ　　結合セ
ファロースと混合した。この混合物を室温で９０分回転
し、その後０７×４頌のカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の中
に充填した。流出液はロゼツト阻害検定による試験のた
めに回収し、そのカラムはＰＢＳのアリコート１ｍｌで
４回洗った。カラムに結合した１、ｙＥ　　結合因子は
０．１　Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４，０）４　Ｘ　１　
ｒｎｌを用いて４℃で溶出した。溶出液はその最終ｐＨ
が７０〜８０になるようにＩＭ）リス・ＨＣｌ（ｐＨ８
，４〜８．６　）　０．４　ｍｌの中に集めた。この中
和溶出液は４℃において３０００分子番のカットオフ膜
（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａ１工ｎｄｕＳｔｒｉ
ｅｓ）でＣ１１ｃｋ　　培地に対して透析し、そしてＤ
ｉａｆｌ。

ＵＭ−２ｍを使った限外濾過でｌ　ｍｌになるまで濃縮
した。

ａ）抗原感作したラット腸１１］膜リンパ腺細胞：結晶
質卵７　／ｌ／ｌ／フミンｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ］、）およびＺ４−ジニトロベンゼン
スルホン酸（Ｅａｓｔｍａｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ、　　Ｃｏｒｐ、）　　はＥｉ、ｓｅｎ
　　の方法（Ｍｅｔｈ、　Ｍｅｄ、　Ｒ’ｅｓ、　１０
　：　９４［１９６４））により結合させて、卵アルブ
ミン１分子当ｆｉＤＮＰ基６２個（平均）を有するＤＮ
Ｐ−卵アルブミン（ＤＮＰ−ＯＡ）を得た。ルイス株ラ
ットは完全フロインドアジュバント（Ｓｕｅｍｕｒａお
よびｌ５ｈｉｚａ、ｋａのＩｍｍｕｎｏｌ、　１２３　
：　９１８〜９２４（１９７８）を参照）中のＤＮＰ−
ＯＡ５μｇを用いて４週おきに２回免疫化した。第２回
目の免疫後２〜３週間して腸間膜リンパ腺（ＭＬＮ）細
胞を標準方法（ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ、　
１２〜Ｉ４頁）により採取した。

ｂ）インビトロ培養： ＤＮＰ−ＯＡ感作ラットからのＭＬＮ細胞は、１０％正
常ラット血清、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１
．００１位／ｍ１−ｊ：ニシリンおよび】００μｌ／ｍ
ｅストレプトマイシンを補足したＣ１１ｃｋ　　培地（
Ｒ，Ｃ１１ｃｋらのＣｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

３：２６４（１９７２）を参照）中で培養した。培養物
は平底のＭｉｃｒｏ−Ｔｅｓｔ　ＩＩ　　培養プレート
（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ、、　　オツクスナ
ートゝ、カリフォルニア州）上に伽゛いた。各培養ウェ
ル（ｗｅｌｌ）は全容積０．２　ｍｌ中に２Ｘ１０”　
個の生存しうる核保有細胞、１　ｔｉｌ／ｍ１ｔＤ　Ｄ
　Ｎ　Ｐ　−ＯＡおよびＯ，１ｍｌの透析・濃縮した工
、９Ｅ−セファロース溶出液を包んでいた。これらの培
養物は５％ＣＯ□　および９５％空気からなる湿潤雰囲
気中３７℃で５日間インキュベートした。

ｌｌ９Ｅ　　抑制因子活性はＩＣＥ　　４強因子をも含
む培養物において評価した（Ｈｉ　ｒａｓｈｉｍａらの
Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２５　：１４４２〜１４４８（］
　９８０〕を参照）。この場合、各培養ウェルは透析、
濃縮したＩ、９Ｅ−セファロース溶出液０．　］　ｍｌ
の代わりに、この溶出液０．０５　ｍｌおよびＩ、９Ｅ
　　増強因子調製物０、０５　ｒｎｌを含んでいた。こ
の調製物はニツポストロンギルス感染ラット（感染１４
日目）から単離したＭＬＮ細胞の培養物からの透析上清
として得られた（Ｓｕｅｍｕｒａおよび工５ｈｉｚａｋ
ａ　　の前掲書（１９７８）　　を参照）。

Ｃ）免疫グロブリン含有細胞の検出： ラット１．９Ｅ（ＩＲ］６２；ｌＲ１８３）に対するウ
サギ抗血清を標準方法（Ｍｉｓｈｅ’ｌｌおよびＳｈｉ
ｉｇｉ。

２６１〜２６８頁）により得た。ラット■ｇＧ２に対し
て特異なウサギ抗血清をＭ、　Ｓｕｅｍｕｒａ　　およ
びに、　工５ｈｉｚａｋａの標準方法（前掲拳（１９７
９））によって調製した。ヤギ抗−ウサギエＩＧ　血清
の蛍光化Ｉ、９Ｇ　　画分はバージニア州、スプリング
フィールド８のＭｅｌｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　Ｉｎｃ、から購入した。

免疫グロブリン含有細胞は標準方法を使って免疫学−ｌ
ヒにより数えた（Ｋ、　ｌ５ｈｉｚａｋａらのＣｅ１１
゜Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２２　：　２４８〜２６１（１９
７６）：ＭｉｅｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ、　２９７
〜３０３頁　を参照）。要約すると、１〜３×ＩＯ５個
の培養細胞は５ｈａｎｄｏｎ　細胞遠心分離器（ｃｙｔ
ｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　）を使ってスライドガラス上
に層状化した。スライド゛はアセトンで固定してＰＨ３
中で水和させた。

スライド上のサンプルは抗−ＩＪ７Ｅ　　または抗−■
９Ｇ２、続いて蛍光化抗−ラット■ｇＧ　　で処理した
。強く染色した形質細胞および芽細胞のみ全数えた。染
色細胞の測定上の火影誤差は１１５％であった。

０．２３Ｂ６ノ・イプリド−マ細胞からのｍＲＮＡの単
離 １）全細胞ｍＲＮＡ 非誘導またはＩ、９Ｅ−誘導２３Ｂ６培養物からの細胞
（１５ＸＩＯ９細胞；１リットル培養）を冷ＰＢ８１０
０ｍｌで洗い、冷Ｐ　Ｂ　８５　ｍｌ中にＩＬＩした。

この懸濁液はグアニジニウムチオンアネート細胞溶解溶
液（Ｊ、　Ｍ、　ＣｈｉｒｇｗｉｎらのＢｉｏｃｈｅｍ
ｉ−θｔｒｙ１８：５２９４〜５２９９（１９７９）　
を参照）８０ｍｌ中で細胞を溶解させた。ＤＮ八は１８
ゲージ針で４回突き刺すことにより切断した。リゼイト
（細胞溶解液）を４ｃ）ｍｌのポリアロマ−製遠心分離
α中の５．７　Ｍ　　ＣｓＣｌ、　１０ｍＭ　　ＥＤＴ
−Ａ　Ｉ　４ｍｌの上に積層させ、はツクマン５Ｗ２８
０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、
　ＩｎＣ，、パロアルト。

カリフォルニア州）を使って２５０００　ｒｐｍ。

１５℃で４０時間遠心した。ＤＮＡ１含むグアニジニウ
ムチオシアネート相は頂部から界面までをピにットで取
り出した。遠心分離管の壁および界面は細胞溶解溶液２
〜３ｍｌで洗った。その管はカーミソリの刃を用いて界
面より下で切りとシ、ＣｅＣＩＪ溶液をデカントした。

ＲＮＡ−？レットは冷７５％エタノール１．５ｍｌで１
回洗った。そのＲレットは１．ＯｍＭ）リス（ｐＨ７，
５）、１　ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

０１％５ＤＳ４００μβ中に再懸濁した。この溶液ラフ
エノール／クロロホルム（１：１）の混合溶媒で１回抽
出し、そして２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５，０１４０μｌ
を加えた。ＲＮＡはエタノール１ｍｌで沈殿させた。遠
心分離してＲＮＡを集め、そのはレットは冷７５％エタ
ノールで１回洗った。

２）細胞質ｍＲＮ八 １．５Ｘ１０９個の細胞（１リツトル培養）をにレット
化して冷ＰＢ３１００ｍｌで洗った。次いで、この細胞
を冷０１Ｍトリス・Ｈ（Ｊ（ｐ）（７，６）、０、１５
　Ｍ　　ＮａＣ１１１，５ｍＭ　　Ｍ、９Ｃ１２１０ｍ
ｌ中に懸濁させた。１０％’Ｎ　Ｐ　４０のアリコーｚ
、ｓｍｌを加えて、この懸濁液を穏やかに混合した。細
胞リゼイトは１５％ショ糖、上記緩衝液中の１％Ｎ’　
Ｐ　４０　５　ｍｌを用いて分離した。核は４℃で１０
分間はレット化した。上清を等容量の７Ｍ尿素、１０ｍ
Ｍ　　トリ、ｒ、　・ＨＣｌ（ｐＨ７，６’）、０３５
ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳの中へ取シ出し、反転によりこ
れと混合した。このリゼイトはフェノール／クロロホル
ム（１：、Ｉ　）の混合溶媒で２回抽出し、ＲＮＡを２
５容量のエタノールの添加により沈殿させた。

３）ポリＡ”　ｍＲＮＡ　　の単離 洗浄しかつ乾燥した全ＲＮＡはレットをオリゴ（ａＴ）
溶出用緩衝液（１０ｍＭトリス・Ｈ（Ｊ（ｐＨ７４）、
１　ｍＭ　ＥＥＤＴＡ、　０．５％５ＤＳ）９００μｌ
中に懸濁させた。ＲＮＡを６８℃で３分間加熱した後、
氷上で冷却した。５ＭＮａＣ１１００μｌを加えた。こ
のＲＮＡサンプルは結合用緩衝液（１０ｍＭ１−リス、
Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，４）、１ｍＭＥＤＴＡ、　　０．５　
Ｍ　ＮａＣ１１０，５％５ＤＳ）で平衡化しり１．　Ｏ
ｒｒＬｌのオリ−＋’（ｄＴ）　　セルロースカラム（
タイプ３、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ、ウオルザム、マサチューセツク州）にかけた。カ
ラムから流出したものは２回以上そのカラムに通した。

ポリＡ”ｍＲＮＡは溶出用緩衝液で洗うことにより集め
た。ＲＮＡは通常溶出用緩衝液の最初の２ｄ中に溶出さ
れた。ＲＮＡをＯ，Ｉ容量の２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５
）および２５容量のエタノールで沈殿させた。このＲＮ
Ｉレットは遠心分離により集め、冷エタノールで２回洗
って乾燥させた。その後このベレットは水に再懸濁させ
た。アリコートを希釈して２６０　ｎｍでの吸光度を測
定した。

Ｄ、卵母細胞の注入 卵母細胞は雌アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａ
ｅｖｉｓ）　　から採取して、Ｂａｒｔｈ　　溶液（８
８ｍＭＮ’ａＣ１，１ｍＭＫ（４，０，３３ｍＭＣａ（
Ｎｏ３）２．０．４１ｍＭＣａｃ７２　ｍ　０．８２　
ｍＭＭＪｉｉ’ｓｏ４．２．４　ｍＭＮａＨｃｏ３゜１
０ｍＭＨＥＰＥｓ（ｐＨ７，９））（７）中でインキ：
”’−）した。２〜３個の卵母細胞からなる注入群を用
意した。注入すべきＲＮＡサンプルは注入用緩衝液（４
０ｍＭトリス・ＨＣＡ！（ｐＨ７，４）、０．３５　Ｍ
　ＮａＣ／）に溶解した。全ｙｅ　リＡ＋ｍＲＮＡ　は
注入用緩衝液中に５００μｌ／ｒｎｌ　の濃度で再懸濁
し、一方ノ・イブリッド選択（下記参照）からのＤＮＡ
フィルターから溶出されたＲＮＡサンプルは常にキャリ
アーとしての子ウシ肝臓ｔＲＮＡ５μＩを含み、注入用
緩衝液２μｌ中に再懸濁した。４０　ｎｌのアリコート
はミクロフオージ（ｍｉｃｒｏｆｏｒｇｅ　）を用いて
おし進められる先端をもち手で引き抜かれるミクロピイ
ットを使って各卵母細胞内に注入した。このピＲットは
既知容量の滅菌水で検量した。各ｍＲＮＡサンプルは約
３０〜４０個の卵母細胞に注入させた。注入卵母細胞は
１個の卵母細胞ろたりＢａｒｔｈ　　溶液＋１％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）１０μｌを含む９６−ウェルミ
クロタイター皿の個々のウェル（穴、　　ｗｅｌｌ）　
　中に２〜３個ずつ入れてインキュベートした。卵母細
胞は４８時間１９℃に保ち、その後生存しうる卵母細胞
を含むウェルから上清を集めてプールした。これらの上
清はミクロ遠心分離器で１０分間遠心することにより滅
菌し、その後前述のようにＩｇＥ　　結合因子活性につ
いて検定した。未注入卵母細胞からの上清は対照として
集めた。

表１Ｖｃ示すように、Ｉ、９Ｅ　処理（１誘導１）２３
Ｂ６細胞からのＲＮＡの注入は、その上清に１．９Ｅ　
　特異的ロゼツトの４０〜４６％を阻害する物質の出現
をもたらした。このロゼツト阻害活性物質の全ては１．
９Ｅ　　結合セファロースによって吸着され、そしてこ
の吸着された活性物質は（上記の通り）ｐＨ４，０での
溶出により回収された。活性物質はＩＪ９Ｇ　　または
ＢＳＡ結合セファロースには吸着しなかった。これとは
対照的に、Ｉ、９Ｅ　　なしで培養した（Ｉ非誘導’）
２３Ｂ６細胞からのＲＮＡ、およびＢＷ５１４７細胞か
らのＲＮＡを注入した卵母細胞からの上清は何ら検出可
能なＩ、９Ｆ　　を結合因子を含まず、Ｉ、９Ｋ　　特
異的ロゼツトの５〜７％を阻害したにすぎなかった。

表１ ｘｇｚ特異的ロゼツ）　　　　Ｉ、ＶＦセファロース２
３Ｂ６（誘導）　　　　４０−４６％　　　　３　　２
５１：３希釈物ａ　　　　　２９％ １：１０希釈物ａ　　　　　７％　　　　　−２３Ｂ６
（非誘導）　　　５−７％ ＢＷ５】４７　　　　　　　　５−６％水　　　　　　
　　　　　　３−４％　　　　　　　　　　−ａ　卵母
細胞上清の希釈物もまたロゼツト阻害検定で試験された
。

１）２３Ｂ６由来ＲＮＡのｃＤＮＡ　　ライブラリーは
ラムダファージベクターλ、９ｔｌＯを用いて作製され
た。水中のポリへ＋ＲＮＡ（５，ｚ、９，１０μｌ）を
６５℃で３分間加熱し、その後室温に置いた。

次の試薬をこの順序で加えた：２００μ９７ｍ１　　オ
リ′１（ｄＴ）１２−１８４ｔｌｌｌ；　２５ｍＭｄＮ
ＴＰ８２ｔｔｌに　　α−３２Ｐ−ａＣＴＰ（８００Ｃ
ｉ／　　１７モル）１３μｃｉ；ｉｏｘ逆転写緩衝液（
Ｈ，ＯｋａｙａｍａおよびＰ、　Ｂｅｒｇ、　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２　：　１６１〜１７０（１
９８２）　　を参照）２μｌ；　および精製逆転写酵素
１５μ１０反応は３７℃で１時間インキユベートシた後
０，５ＭＥＤＴＡ　　１μｌの添加にょシ停止させた。

８０％グリセロール（トレーサーとしてブロムフェニル
ブルーおよびキシレンシアツールを添加したもの）３μ
ｌを添加した後、この反応混合物は１ｍＭ）リス・ＨＣ
ｎ　　（ｐＨ７，５）、１゜μＭ　ＥＤＴＡ　　中のＢ
ｉｏ　Ｇｅｌ　Ａ５ＱＭの０．７Ｘ７（ｍカラムの水中
床へ通した。カラムは４滴（〜８゜μｌ〕　の画分て溶
出した。溶出物質の最初の５または６両分をプールし、
シリコン処理したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管内で一晩凍結乾
燥させた。

凍結乾燥したｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは水１８μ
ｌ中に溶解した。これに、ＩＯＸカコジル酸緩衝液（１
５Ｍカコジル酸Ｎａ、　　３００ｍＭ　　）リス・ＨＣ
Ａ（１）Ｈ６，８））　　２．４．ｃｌ；　　１００ｍ
ＭＣ０Ｃ１１２０，６Ａｌｌ　ｙ　　１０　ｍ　Ｍ　　
ａＧＴＰ　Ｏ，５Ｂｌ　、’α−Ｐ−ａＧＴＰ　　１４
μＣ１；および末端デオキシヌクレオチジル転移酵素１
μｌ　（２０単位）を加えた。３７℃で３０分インキュ
ベート後、０１ＭＥＤＴＡ　　Ｏ，！５　ｐＨ；　０．
５＃／１ｎｌデオキシリボヌクレアーゼ不含リボヌクレ
アービＡ０．５μｌ：　およびｌＱｍ、Ｍ、）リス・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７，５）、０．５　ｍＭＥＤＴＡ　　１９μ
ｌ　を加えて反応を停止させた。この混合物を７０℃で
５分間加熱し、１　ｒｑ　／　ｒｎｌオリゴ（ａｃ）　
　＋　　　０．５μｌを加え、その管を９０℃で１分加
熱した後氷上（置いた。第２鎖の合成はＩ　Ｍ　ＭＥＣ
１２０，，７ｐ、ｌｌ、５．、ｍＭ　ａＮＴＰ　１．、
　Ｏμｌｌ、α−３２Ｐ　−ａＣＴＰ　２３μＣ１、お
よびＤＮＡポリメラーゼ１犬型断片０５μ１（２５単位
）の添加により達成した。反応は１５℃で２暢間、次に
３０℃で２０分間インキュイードした。Ｔ４ＤＮＡ、１
リメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のアリコート０５μ１
（２５単位）を加えて、３７℃で３０分反応を続けた。

その後、０．５ＭＥＤＴＡ　　Ｉμｌを添加して７０℃
で１０分間加熱することにより反応を停止させた。２木
調ｃＤＮＡの内部ＥｃｏＲＩ部位はＩｍＭＳ−アデノシ
ルメチオニンＬＯｔｔｌｌおよびＥｃｏＲエメチラーゼ
１μｍ２０１１位）の添加、続く３７℃での３０分イン
キュベーションによりメチル化した。反応混合物はフェ
ノール／ＣＨＣＡ！３（１：　１　）で１回、およびＣ
ＨＣＩＩ　３で１回抽出した。残留ＣＨＣｌ３を３７℃
で１ｏ分間蒸発させることにより除き、８０％グリセロ
ール／染料溶液５μｌを加え、そしてこの物質を前のよ
う１ｃＢｉｏ　Ｇｅｌ　Ａ５０Ｍ　　カラムの水中床へ
通した。

最初の６溶出画分をプールして一晩凍結乾燥させた。

乾燥ｃＤＮＡ（約２ｐｍｏｌ）をホスホリル化ＥｃｏＲ
ニリンカー（７５ｐｍｏｌ）の溶液１５μｌに溶解した
。

この懸濁液はＡＴＰ、ＤＴＴ　　および濃縮リガーゼ緩
衝液の原料溶液の添加により全量１９μｌとした。結合
（１１ｇａｔｉｏｎ　）はＴ、、４ＤＮＡ　　リガーゼ
（ｌ学位）１０μｌの添加により開始させ、室温で２時
間続行した。７０℃で１０分インキュベーション後、反
〔６混合物に水１３ｔｔｌＪ、０．６　Ｍ　ＮａＣｌ２
μｌ、ＩＯｘ　　ＥｃｏＲ工　緩衝液２μ１１　および
ＥｃｏＲＩ　（３０単位）３μｌを補足した。消化は３
７℃で一晩続け、０．５　Ｍ　ＥＤ’ｌ’Ａ　　１μｌ
　を添加して７０℃で１０分インキュ（−卜することに
より停止させた。グリセロール／染刺のアリコート５ｐ
Ｈを加え、前のようにＢｔｏＧｅＩＡ　５０　Ｍカラム
にかけた。最初の５溶出画分をプールして凍結乾燥させ
た。乾燥ｃＤＮＡはＴＥＩＯμｌＶＣ溶解して４℃で保
存した。

ｃＤＮＡのアリコート１　μｌＪ　、！：　ＥｃｏＲ，
：［−切断λＩｔ、１０ＤＮＡ　　１μＩとを、５〃ｌ
ｌの容量（Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼ００１単位）中室温で
２時間績合させた。この混合物はインビトロパッケージ
ング反Ｅｌ　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）において直接
使用した。インビトロパッケージされたＤＮＡは大腸菌
株ＬＥ３９２およびＣ６００ｈｆｌへ上で検定して全フ
ァージ数とｃＤＮＡ挿入物をもつファージ数とを測ボし
た。

ｃＤＮＡ挿入物を保有するファージは全ファージの２〜
８％であった。増幅されたライブラリーファージ原料は
パッケージング反Ｃ５をＣ６００ｈｆｌＡ上で行うこと
により調製した（１〜２　Ｘ　１０５ｐｆｕ／　１５０
ｍｍ平板）。約１０６個の独立ｃＤＮＡりａ−ン／μＩ
ポ！／Ａ＋ＲＮＡがこれらの方法により得られ、この場
合ｃＤＮＤＮＡ物の大きさは６Ｋｂ以下であった。

２）　　ｐｃＤ　　ｃＤＮＡライブラリーａ）×フタ−
プライマーおよびオリ＝７（ＩＧ−ティルト（ｔａｉｌ
ｅｄ）リンカ−ＤＮＡ（７）調製：Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ
およびＰ、　Ｂｅｒｇの方法（Ｍｏｌ。

ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｌ。２：１６１〜１７０（
１９８２））がほんの少し変更することにより　Ｈ，Ｏ
ｋａｙａｍａおよびＰ、　Ｂｅｒｇ　（Ｍｏ１．　ａｎ
ｄ　Ｃｅ１−１．　Ｂｉｏｌ、　３：２８０〜２８９［
’１９８３））Ｋよって述べられたｐｃＤＶｌおよびｐ
Ｌ１プラスミドに対して用いられた。

ｐｃＤＶＩ　ＤＮＡ　　のサンプル８０ｔｔｆ／は６ｍ
Ｍ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、６　ｍＭ　　Ｍ
ＭＣＩ！２．６ｍＭＮａＣ１、６ｍＭ　２−メルカプト
エタノールおよびウシ血清アルブミン０１■／　ｍｌを
含む反応混合物４５０　μｌｌ中３０℃で２０ＵのＫｐ
ｒｎ■エンドヌクレアーゼを用いて消化した。１６時間
後０２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　　４０μＺでその
消化を止めた。

ＤＮＡは水−飽和させたフェノール／　ＣＨ（Ｊ３（１
：１）の混合溶媒（以後フェノール／ＣＨＣｌ３　　と
記す）で抽出しエタノール沈殿させることにより回収し
た。末端あたり平均して６０（しかし８０より多くない
）のデオキシチミジレー）（ｄＴ）残基のホモポリマー
チイルを、ＫｐｎＩエンドヌクレアーぜ一生成末端へ以
下のようにして子ウシ胸腺由来の末端デオキシヌクレオ
チジル転移酵素を用いて付加させた。反応混合物（３８
μｌ）は１ｍＭＣｏＣｌ２．０．１ｍＭ：）チ牙スレイ
トール、０、２５　ｍＭ　ａＴＴＰ　、　ＫｐｍＩ　　
ｘ　ｙ　ト’ヌクレアーぜ一消化ＤＮＡおよび６８Ｕの
末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（Ｐ　−Ｌ　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｉ　ｎ　Ｃｅ　＊　　ミルウオーキー、ウィスコンシン
州）と共に、緩衝液としての１４’ＯｍＭカコジル酸ナ
トリウム−３０ｍＭ）す、ｚ、　・Ｈ（Ｊ　（ｐＨ６，
８）　　を含んでいた。３７℃で３０分後、反応＝　０
．２５　ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）２０μｌおよび１０
％５ＤＳ１０μｌで停止させ、ＤＮＡはフエイール／Ｃ
ＨＣｌ３で数回抽出後エタノール沈殿させて回収した。

次いでこのＤＮＡは５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、　ｌ　Ｏｍ
Ｍ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）、１０　ｍ　Ｍ　
Ｍｊ？Ｃ１２，１ｍＭジチオスレイトールおよびＢＳＡ
Ｏ，１■／ｄを含む反応混合物５０μｌ中で１．５Ｕの
ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼを用いて消化（３７℃、
５時間）した。５Ｖ４０Ｊリアデニレ−シミン部位、ｐ
ＢＲ３２２複製開始点およびアンピアリン耐性遺伝子を
含む大型断片はアガロース（１％）ゲルの電気泳動で精
製し、ガラス粉末法（Ｂ、　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよ
びり、　Ｇ１１ｌｅｅｐｉｅのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ。

Ａｃｉ、ＵＳＡ　　７６：６１５〜６１９（１９７９）
を参照）の変法によりゲルから回収した。このａＴ　−
テイルｈ゛（ｔａｉｌｅｄ）　ＤＮＡはオリゴ（ｄＡ）
　　−セルロースカラムに吸着させ、次いでそのカラム
から溶出することにより次のようにしてさらに精製した
。ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡおよびＩ　Ｍ　ＮａＣ／を含む１
０ｍＭ）リス−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，３）緩衝液１ｎＬｌ
ＶＣＤＮ八を溶解し１．０℃に冷却し、０℃の同じ緩衝
液で平衡化したオリ−１（ｄＡ）−セルロースカラム（
ｏ６Ｘ　２．５　ａｒｔ　）　Ｋ通した。カラムは０℃
の同じ緩衝液で洗い、室温で水により溶出した。溶出Ｄ
ＮＡはエタノール沈殿させて１　ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有
１０ｍＭトリス・Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，３）に溶解した。

オリゴ（ｄＧ）　　−ティルトリンカ−ＤＮＡは、５ｍ
Ｍ）リス・ＨＣＡ！　（１）Ｈ７，４）、６　ｍ　Ｍ　
　Ｍ　／ｌ　Ｃ１１２，６ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、５０ｍＭＮａ（Ｊおよび０．１〜／ｍＪＢｓ　Ａ　
を含む全量４５０μ／ｊ　ＣｐｐＬＩ　　ＤＮＡ　７５
μｇを２０ＵのＰｓｔｌエンドヌクレアーゼで消化する
ことによりｐ＋整した。

３０℃で１６時間後反応混合物をフェノール／ＣＨＣ／
３　で抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。その後
、末端あた＃）１０〜１５のデオキシグアニレート（ｄ
Ｇ）残基のテイルを４６Ｕの末端デオキシヌクレオチジ
ル転移酵素を用いて、ｄＴＴＰ　　０代わりに０．１　
ｍＭａＧＴＰ　ｆ含む上記反応混合物３８μｉ中で付加
させた。３７℃で２０分後混合物をフェノール／ＣＨＣ
／３　で抽出し、ＤＢ４へのエタノール沈殿後そのＤＮ
Ａｔ”２０ｍＭトリス・ＨＣＩＩ　（ｐＨ７，４）　−
７ｍ　Ｍ　　Ｍ、９　ＣＧ　、６０ｍ　Ｍ　ＮａＣ／お
よびＯ，ｌｙ　　ＢＳＡ　　を含む全量５゜μｉ中３５
ＵのＨｌｎｄ　ｍエンドヌクレアーゼで消化（３７℃、
４時間）した。小型のオリゴ（ａＧ）−ティルトリンカ
−ＤＮＡはアガロースゲル（１８％）の電気泳動で精製
し、前述のようにして回収した。

ｂｌ　　ｃＤＮＡライブラリーの調製 工程ｌ　：　ｃＤＮＡ　　の合成 反応混合物ｌＯμｌは５０　ｍ、Ｍ　）リス・ＨＣｉ（
ｐＨ８，３）、８　ｍ　Ｍ　Ｍ　Ｉ　Ｃ１２２，３０ｍ
ＭＫ（Ｊ、０．３ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭずつ
のａＡＴＰ、ａＴＴＰ’、ａＧＴＰおよびａＣＴＰ、２
０μＣｔのａ　−３２Ｐ−ａｃＴＰ　（３００Ｑ　Ｃ１
／ｍｍｏｌ）、ＸＪＥ　　誘導２３Ｂ６細胞由来のポリ
Ａ＋ＲＮＡ　　５μｇ１　　ベクター−プライマーＤＮ
Ａ　　２μ、９（１，１μｍｏ　１のプライマー末端）
、および４５Ｕの逆転写酵素を含んでいた。反応は４２
℃で６０分間インキュベートし１次いで０．２５ＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８０）１μｌおよび１０％　５ＤＳＱ、５μ
ｌの添加により停止させ、フェノール／ＣＨＣ／３４０
μｌを加え、この溶液をＶＯｒｔｅＸミキサーで激しく
混合して遠心分離した。水相に４Ｍ酢酸アンモニウム４
０μｌおよびエタノール１６０μｌを加え、この溶液を
ドライアイス上で１５分間冷却し、冷却中に沈殿した未
反応のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを溶解す
べく穏やかに振とうしながら室温まで暖め、その後Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ　ｍｉｃｒｏ−ｆｕｇｅで１０分間遠心
した。ＲレットはｌＱｍＭトリス、　ＨＣＩ（ｐＨ７，
３）および１ｍＭＥＤＴＡの１０μｌ中に溶解し％４Ｍ
酢酸アンモニウム１０μｌと混合し、エタノール４゛０
μｌで再沈殿させた。この方法は９９％以上の未反応デ
オキシヌクレオシド８トリホスフエートを除いた。この
ベレットはエタノールで洗った。

工程２：オリゴデオキシゾチジレート〔オリゴ（ｄＣ）
）　　の付加 ゛　　　プラスミド’−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを含むイレ
ットは、］　ｍＭ　　ＣｏＣ／？２．０．１ｍＭジチオ
ＸＬ／イトール。

０２μｇのポリ（八）、７０μＭ　　ａＣＴＰ、　５μ
Ｃ１の”Ｐ−ｄＣＴＰ（３ＱＯＯＣ１／ｍｍｏｌｅ）、
および６０Ｕの末端デ庄キシヌクレオチジル転移酵素を
含む１４０ｍＭカコジル酸Ｎａ−Ｎａ−３Ｏリス・ＨＣ
Ｉ　（ｐＨ６，８）緩衝液２０μｌに溶解した。反応は
３７℃で５分間実施して末端あたシ１０〜１５残基のａ
ＣＴＰ　を付加させ、次いで０．２５　ＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８，０）２μｌおよび１０％５ＤＳ１μｌで停止させ
た。フェノール／ＣＨＣ／３２０μｌで抽出後、水相は
４Ｍ酢酸アンモニウム２０μｌと混合し、ＤＮＡを沈殿
させ、そしてエタノール８０μｌで再沈殿させ、この最
終イレットはエタノールで洗った。

工程３：Ｈ１Ωｄｍエンド９ヌクレアーゼによる消化 Ｒレットは２０ｍＭ）リス・ＨＣ／！　（ｐＨ７，４）
、７　ｍＭ　Ｍ！’／ＣＩＪ２．６０　ｍＭ　ＮａＣ／
およびｏ、ｉ■／ｕｇＢＳＡを含む緩衝液３０μｌ中に
溶解し、次に１０ＵのＨｌｎａ　ｍエンドヌクレアーゼ
で３７℃、２時間消化した。反応は０．２５Ｍ　　ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８，０）３μｌおよび１０％５ＤＳＩ、５μ
ｉで止め。

フェノール／　ＣＨ（Ｊ３で抽出した後４Ｍ酢酸アンモ
ニウム３０μｌを加え、ＤＮＡはエタノール１２０μｌ
で沈殿させた。このはレットはエタノールで洗って１０
ｍＭ）リス・ＨＣ／　（ｐＨ７，３）および１ｍＭＥＤ
ＴＡの全量１０ｔｉｌ！中に溶解し、その後−２０℃で
の保存中凍結を防ぐためにエタノール３μｌを加えた。

工程４：オリゴ（ａＧ）−ティルトリンカ−ＤＮＡによ
り仲介された環状化 Ｈ４，ｎａ、　ｍエンドゝヌクレアーゼ消化オリゴ（ａ
Ｃ）−テイルｌ−’ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡプラスミド９の
サンプル９μｌ（サンプルの９０％）は、１０ｍＭトリ
ス、　ＨＣ／　（ｐＨ７，５）、１　ｍＭ　　］１ＥＤ
ＴＡ％０．Ｉ　ＭＮａＣＡおよび１．８　ｐｍｏｌのオ
リゴ（ａＧ）　　−ティルトリンカ−ＤＮＡを含む混合
物９０μｌ中６５℃で５分間１次に４２℃で６０分間イ
ンキュイードし、その後０’Ｃｖｃ冷却した。この混合
物（９０ｔｅｌ）　　は２０ｍＭ　トリス−ＨＣ／？（
ｐＨ７，５）、４ｍＭＭ／１ｃ１１２．１０ｍＭ（ＮＨ
４）２Ｓ０４．０．１Ｍ　　Ｋ（Ｊ。

５０　ａｌｌ／ｍｌのＢＳＡおよび０．１ｍＭ　　β−
Ｎ　ＡＤＤ含む全容量９００μｌへ調整し、大腸菌Ｄ　
Ｎ　Ａ　＋７ガーゼ６μｓを加えてこの溶液を１２℃で
一晩インキユベートした。

工程５：ＤＮＡによるＲＮＡ鎖の置換 挿入物のＲＮＡ鎖を置き換えるために、結合（ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ　）混合物は４種のデオキシヌクレオントゝト
リホスフェート各々４０μＭ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤ
、４μＩの追加の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、１６Ｕの大腸
菌ＤＮＡ＃？リメラーゼｌ、および９Ｕの大腸菌ＲＮア
ーゼＨを含むように調整した。

この混合物（９６０μりは１２℃で１時間次に室温で１
時間インキュベートして、ＤＮＡポリポリーゼｌによる
最適な修復合成およびニックトランスレーションを促進
させた。

工程６：大腸菌の形質転換 形質転換はＣｏｈｅｎ　　らの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　６９　：２１１０〜
２１１４（１９７２）　　を参照）をわずかに変更して
実施された。大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１（Ｍ−Ｃａ
ＭＣ１０６１（およびＳ、　ＣｏｈｅｎのＪ、　Ｍｏｌ
、　Ｂｌｏｌ。

１３８：１７９〜２０７（１９８０）を参照）はＬプｏ
　ス２０　ｍｌ中３７℃において６００　ｎｍで０５吸
光単位となるまで増殖させた。細胞を遠心分離により集
めｓ　５０　ｍＭ　　ＣａＣ／２　　を含む１０ｍＭ）
’）　ス−ＨＣ＊（ｐＨ７，３）　ｚ　ｏｍｌＫ懸濁し
、０℃で５分間遠心した。この細胞を上記緩衝液２ｍｌ
に再懸、濁し、再び０℃で５分間インキュＲ−トし、そ
の後細胞懸濁体０．２ｄをＤＮＡ溶液（工程５）０１ｍ
ｌと混合して０℃で１５分間インキュＲ−トした。

この細胞を２分間３７℃に保ち、そのあと１０分間室温
に保った。ＬノロスＱ、　５　ｍｌを添加してこの培養
物を３７℃で３０分間イ゛ンキュベー卜し、次に４２℃
のＬノロス軟寒天２．５　ｒｎｌと混合し、そして５０
μｇ／ｒｎｌのアンピシリンを含むＬブロス寒天の上に
広げた。３７℃で約１２時間インキュイージョン後、コ
ロニーを平板からＬプロス中へかき取った。この細菌懸
濁体は５０μｊ？／ｍｌ　　のアンピシリンを含むＬプ
ロス１１に接種するために使った。振とり下に３７℃で
約８時間後、培養物のアリコートを７％ＤＭＳＯに入れ
て一７０℃で保存した。この方法により約１×１０５の
独立したｃ　ＤＮ　Ａクローンが生成した。

水３μｌ中の１．９Ｅ　　誘導２３Ｂ６細胞由来のポリ
Ａ＋ｍＲＮＡ　　５ｔｄｌを６５℃で５分間加温し、次
に５０ｍＭ　　トリス・ＨＣ／　（ｐＨ８３）　−８ｍ
　Ｍ　Ｍｌｉ　Ｃ／　２．３０ｍＭ　　Ｋ（Ｊ、０．７
ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭずつのａＡＴＰ、ａＧＴＰ％ａ
ＴＴＰ、５０ｍＭｄＣＴＰ。

１０μ／ｌ／ｒｕｌオリゴ（ｄＴ　）　　−（Ｃｏｌａ
ｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ　）、１００　μｊ
ｉ／ｍｌアクチノマイシンＤ１５００μＣ１のα−３２
Ｐ−ａＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；　　Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）および１５０単位の逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　
５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ＊１　ｄテルプルグ、フロ
リダ州ンを含む全量１００μｌに加えた。

４０℃で２時間インキュベーション後、反応混合物０．
５μｉをとシ出してトリクロル酢酸中で沈殿させ、取り
込まれた３２ｐの量を測定した。その後。

０．２ＮＮａＯＨ１００ｔｔｌｌを加え、サンプルは７
０℃で２０分加熱することによｆｉＲＮＡを加水分解し
た。冷却後、この反応混合物−２１ＮＨｃｊ２０μｌで
中和し、キャリアーとして１　ｍｙ　／　ｍ１ｔＲＮＡ
　４μｌを加えた。サンプルは等容量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１）で２回抽出した。

その後、等容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量の
エタノールで沈殿させた。Ｒレットは水１ＯＯｌｌｌ中
に再懸濁し、沈殿をくり返し、そしてこのにレットは８
０％エタノールで２回洗った。

２）ハイブリダイゼーション ３２Ｐ−ｃＤＮＡ（上述のようにして合成したもの）を
ＢＷ’５１４７由来のポリＡ＋ｍＲＮＡ　　５０　μＭ
とともに沈殿させた。このＲレットは水７μ４．４Ｍ燐
酸Ｎａ（ｐＨ７）　１　ｐｉｌ、２０％ＳＤＳ　　０１
μｍおよびＯ，ｉＭ　　ＥＤＴＡ　　Ｏ，１μｌ中に再
懸濁し、次に全サンプルを毛細管の中に密封した。この
サンプルは９０℃で５分間、続いて６８℃で１４時間加
熱した（コツト値〉５０００）。その後、・・イブリダ
イゼーション混合物は０１２Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７，０）
、０１％ＳＤＳ　　−ｒ：希釈してｌ　ｍｌとし、この
混合物の温度を６０℃に高めた。混合物は同じ緩衝液で
平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム０．４．９の
カラムに通し、６０℃に維持した。

カラムからの流出物を集め、その後６０℃の同じ緩衝液
５ｍｌでカラムを洗った。ｌ　ｒｎｌ：の両分を集め、
そして各両分のアリコート１μｌをシンチレーンヨ７カ
ウンターで計数した。画分２．３および４の１重鎖ｃＤ
ＮＡのピークをプールした。この物質（出発”２Ｐ　−
ｃＤＮＡの１１％を占める）はｎ−ブタノールでの抽出
をくシ返すことによ’）　０．３　ｍｌまで濃縮してハ
イブリダイゼーション用プローブとして使用した。

・・イズリッド選択は次のようにして単離したプラスミ
ド’ｃＤＮＡ調製物を使って行われた。λｑｔ１０　　
ｃＤＮＡ　　ライブラリーからの４×１０　のラノダム
ｃＤＮＡ　　クロー７は減じられたｃＤＮ’Ａプローブ
を用いてスクリーニングした。２７０のλ９ｔ　１０　
　ｃＤＮＡクローンを取り出してプールした。ＤＮＡは
２フアージクローンのこのプールから調製しく　Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓらの’ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉ
ｎｇ、　”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、
　　７６〜８５頁〔１９８２〕　を参照）、とのＤＮ’
Ａ３０μｑをＥｃｏＲＩ　で完全消化した。ｃＤＮＡ挿
入物のＥｃ　ｏＲＩ　断片はアガロース（１％）ゲルの
電気泳動で精製し、そしてＥｃｏＲＩ切断デホスホリル
化ＰＵＣｇ　（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；　Ｈ
，Ｖｉｅｉｒａおよびり、　ＭｅｓｓｉｎｇのＧｅｎｅ
　１９　：　２５９−２６８（］、　９８２　）　　を
参照）内で再クロー／化した。約７００個の形質転換体
を再び３２Ｐ−ｃＤＮＡ　　プローブを用いてスクリー
ニングし、そして１９２個のハイブリッドコロニーを滅
菌したつまようじで１内々に取り出した。シラスミド調
製物はノ・イブリッド選択実験で使用するため個々のク
ローンからおよびそのプールからつくった（　Ｔ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓらの前掲書８６〜９５頁）。

２）ＤＮ八へィルターの調製 全てのプラスミ）ＳＤＮＡはニトロセルロースフィルタ
ーへ結合させるのに先立ってＢａｍ　ＨＩで消化するこ
とにより線状化した。消化は１．０ｍＭト！Ｊ　、ｘ、
　−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，９）、１０　ｍＭ　　ＭｇＣ／１
２．１０μ９ブラスミ）ｓＤ　Ｎ　Ａ　、　　５０　ｍ
Ｍ　ＮａＣ７および１０＃Ｌ位のＢａｍＨＩ　を含む全
量５０μβ中で行った。３７℃で２時間インキュベーシ
ョ７後、サンプルは”’（１０ｍＭトリス・ＨＣ／（ｐ
Ｈ８，０）。

１ｍＭ　　ＫＤＴＡ）で２００　μｌｌに希釈し、そし
てＴＥで飽和したフェノールの等容量（２００μｌ）で
抽出した。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）２０μｌを水
相に加え、Ｄ　Ｎ’　Ａは２容量のエタノールで沈殿さ
せた。このＤＮＡＮレイトを遠心分離により回収して７
０％エタノールで洗った。乾燥はレットはＤＮＡ各１０
μ９を滅菌水１５０μｌ中に再懸濁した。各ＤＮＡす／
ズル（１０μｇＤＮＡ／フィルター）対し２枚ずつの同
じフィルターを用意した。水１５０μβ中のＤＮＡは１
０分間沸騰させ、次にｌ　ＮＮａＯＨ１５０μｍ　ｆ加
えて、この溶液を室温で２０分間イノキュベートした。

サンプルは氷上で冷やし、その後ＩＭＨｃ／、ＩＭＮａ
（Ｊ、０．３　Ｍクエン酸Ｎａおよび０５Ｍトリス・Ｈ
（Ｊ（ｐＨ８，０）　１５０μｉを加えた。

蒸留水でしめらせた０９ｃＩｎのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　
ＨＡＷＰフィルターをミクｏｒ過装働（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ’　ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ　）に配置した。上述
のようにして変性。

中和したＤＮＡ１液は５００　ｒｐｍ　　で５分遠心す
ることにより濾過しだ。フィルターは６×５ＳＣ１ｍ、
ｌで洗い、自然乾燥させた後８０℃で２時間位いた。

３）ＲＮＡ／ＤＮパノ・イブリダイゼーショノハイブリ
ダイゼーンヨノは６５％（容動／容も）再蒸留ホルムア
ミ１．２０　ｍＭ　ＰＩＰＥＳ　（ｐＨ６，４）、０、
４　Ｍ　Ｎ’ａＣ７’、１００パ／ｍ１　　子ウシ肝臓
ｔＲＮＡ、およびＩｇＥ　　誘導２３Ｂ６細胞由来の１
００μ９／ｍｌポリＡ＋ｍＲＮＡを含む全量２００μβ
中で行った。各ハイブリダイゼーションｉｔは７０℃で
３分加熱し、次に２枚のＤ　Ｎ’　Ａフィルター（１０
μ９ＤＮＡ／フイルター）を４分の１に切ってこの溶液
に加えた。ハイブリット９は５０℃で４時間、続いて４
６℃と４２℃で４時間インキュベーションした。この後
上清を除き、フィルターは１０＋ｎＭ〜トリス、　Ｉ（
（Ｊ（ｐＨ７，４）、０．１５　Ｍ　ＮａＣ／Ｌ　　１
　ｍＭＥＤＴ　Ａ、０５％ＳＤＳ１ｍｌで３回洗った。

次イテＳＤＳを含捷ない同じ緩衝液１　ｍｌで３回洗浄
した。

緩衝液は両方とも洗浄のため［６５℃に保った。

ハイノリダイズされたｍＲＮＡを溶出するため、子ウシ
肝臓ｔＲＮＡ　　を含む水４００μｌをフィルタート共
にバイアルに入れた。このバイアルは３分間沸騰させ、
それからすばやくト８ライアイス／エタノールで冷却し
た。その後サンプルを浴かし。

溶出したＲＮＡを２容量のエタノールおよび０１容量の
３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ６）で沈殿させた。このＲＮＡ−ｅ
レットを遠心により集めて７０％エタノールで２回洗っ
た。乾燥ベレットは卵母細胞注入用緩衝液２μｌ中に再
懸濁し、全サンプルを卵母細胞内に注入した（上記参照
）。

１９２クローンのプールを用いて選択したＲＮＡを注入
された卵母細胞からの上清は３３％のＩ９Ｅ特異的ロゼ
ツトを阻害したが、一方同じ実験において、選択されな
かったｌｌ９Ｆ　　誘導細胞ＲＮＡを注入された卵母細
胞からの上清は２３％のＩｇＥ特異的ロゼツトを阻害し
た。無関係なプラスミドゝ（この場合にはラツ１−Ｉ９
Ｅ　　重鎖をコート９するｃＤＮＡであるが、ｐＢＲ３
２２でもよい）もまた陰性対照としてハイズリラド選択
に用いられ、ロゼツト阻害の基底値のみを得た。

プールされた個々のｐＵＣ８クローンはハイブリッド選
択およびインビトロ翻訳により試験された。５つのクロ
ーンが、この検定でのそれらの活性に基づいて、ＩＱＥ
　　結合因子をコート９するｍｌ（Ｎ　Ａと相同（ｈｏ
ｍｏｌｏｇｙ）を共有するｃＤＮＡ　　断片であるとし
て同定された。これらのｃＤＮＡ　　挿入物の太きさは
３ｏｏｂｐ（塩基対）〜１２００　ｂｐの範囲であった
（表■）。

表■ アフリカッメガエル卵母細胞における ＬＥＫ　結合因子活性のハイブリッド選択およびインビ
トロ翻訳８ Ｉ９Ｅ特異的ロゼツト 実験１ （非選択）　　　　　　　　　　　　　　２３％ラット
Ｉ！ｉｌＥ　　ｃＤＮＡ（１４００ｂｐ）　　　　　　
　６％１９２ｐＵＣ８クローンのプール　　　　　　　
　３３％実験２ （非選択）　　　　　　　　　　　　　　３０％Ａ１８
（１２００ｂｐ）　　　　　　　　　　　３５％６（３
００ｂｐ）　　　　　　　　　　　　　３２％５５（３
５０ｂｐ）　　　　　　　　　　　　１９％１０４（５
７５ｂｐ）　　　　　　　　　　　２８％１１２（４２
０ｂｐ）　　　　　　　　　　　２３％ａ　これらの実
験に使ったＲＮＡは工９Ｅ　　と共に培養した′誘導”
２３Ｂ６細胞から単離した。

−ｂ　　ＱＤＮ八断への大きさはかっこ内に記入した。

Ｃ少なくとも２つの実験の平均である。

Ｈ，ｐｃＤ　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングＡ
１８の１２００　ｂｐＥｃｏＲＩ断片（表■）を１％ア
ガロースゲルの電気泳動で精製した。この精製断片はＤ
ＮＡポリポリーゼｌとα−３２ｐ−ａＣＴＰ　　１に用
いてニックトランスレーションにょシ放射能ラベルした
。この３２Ｐ−ＤＮＡズローノを用いてｐｃＤ　ｃＤＮ
Ａ　　ライブラリーの約１０５クローンをスクリーニン
グした。このグローブとハイブリダイズした１０４のク
ローンを取シ出した。

ズラスミ）ＤＮＡは先に述べ゛たようにしてこれらのク
ローンの各々からつくられた。

トランスフェクションの前日に、約１０６　個のＣｏｅ
７サル細胞を１０％胎児ウシ血清および２ｍＭグルタミ
ンを含むＤＭＥの個々の１００ｍ５平板上に播種した。

トランスフェクションを行うために。

培地を各平板から吸い出して、その代ゎ＃）Ｋ５０ｍＭ
トリス・ＨＣＩＩ　　（ｐＨ７，４）、４００　ｐＱ／
ｍ１ＤＥ　ＡＥ　　−デキストランおよび試駆しようと
するプ７スミト？ＤＮＡ　　５０ｔｉ９を含むＤＭＥ　
　４．Ｏｍｌを加えた。平板は３７℃で４時間インキュ
ベートし、次いでＤＮＡ含有培地を除き、そして平板を
血清不含Ｄ　Ｍ　Ｅ　５　ｍｌで２回洗った。４％胎児
ウシ血清および２ｍＭグルタミンを含むＤ　Ｍ　Ｅ　７
．　Ｑｒｎｌを平板に加えて３７℃で７２時間インキュ
（−トした。増殖培地を集め、上記のようにしてＩｇＥ
結合因子活性について検定した。′ これらのｃＤＮＡクローンのうち７ｏクローンを用いた
トランスフェクション実験からの上ｆｆの検定は、ｌ９
Ｆ　　％異的ロゼツト形成を阻害する分泌因子をＣｏθ
７細胞内で合成しうる８つのｃＤＮＡをもたらした（表
ｍ）。これらのクローンのうち４つ（それぞれ２３Ｂ６
ｐ４．２．２３Ｂ６ｐ８．３．２３　Ｂ　６　ｐ　９．
５　オ！び２３Ｂ６ｐ１０．２と呼ばれ。

ＡＴＣＣ第３９６３２．３９６３３．３９６３４および
３９６３５号として寄託されたンを用いた一時的な発現
実験からの上清がさらに詳しい性状決定のために選ばれ
た。これらの上溝に存在するＩ！？Ｅ　　結合因子は全
て工ｇＥ　　結合セファロースに特異的に結合しかつ酸
素ｐＨで溶出することができた（表■）。

４つのクローンを用いた一時的発現実験から誘導された
ｌ９Ｆ−セファロース后出液中の１１７Ｅ　　結合因子
（表■）は、詳細には上述したようにして、抗原感作ラ
ットリンパ味によるｌ９Ｆ　　応答を選択的に抑制する
かあるいは増強する能力についてインビトロで試験され
た。一般に、アフィニティー精製したｌ９Ｆ　　結合因
子を抗原刺激ラット腸間膜リンパ腺細胞の培養物に加え
、培養５日後に工１？Ｅ−およびｌ９Ｇ−含有細胞を免
疫蛍光によって数えた。これらの実験の結果を第１図に
示す。ｃＤＮＡクローン２３　Ｂ　６　ｐ　８．３およ
び２３　Ｂ　６　ｐ　９．５を用いた一時的発現実験か
らのｌｌ１ｌＥ　　結合因子は、これらの培養において
工９Ｅ　　含有細胞の数を約４・ξ味から誘導された工
ｇＥ　　増強因子調製物において得られた（Ｍ、　Ｓｕ
ｅｍｕｒａおよびに、　ｌ５ｈｉｚａｋａのＪ、工ｍｍ
ｕｎｏ１．１２３　：　９１８〜９２４（１９７９）；
Ｍ＋ＳｕｅｍｕｒａらのＪ、工ｍｍｕｎｏ１．　１２５
　：　１４８〜１５４〔１９８０）を参照〕。これとは
対照的に、ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ４．２および２
３Ｂ６ｐ１０．２を用いたトランスフェクショ／からの
ＩｇＥ結合因子はインビトロでＩｇＥ　　抑制因子活性
も工９Ｅ　　増強因子活性も示さなかった。全ての実験
において、　１ｇＧ　　応答は影響を受けなかったから
一観察された活性はＩｇＥ　　応答に特異的であること
がわかった。

表■ Ｃｏｓ　７サル腎細胞における ｌｌ７Ｅ結合因子の一時的発現 ＩｑＥ特異的ロゼツトの １０．２　　　　　　　　　　３３ １０．８　　　　　　　　　　４１ １１．７　　　　　　　　　　１８ １７．５　　　　　　　　　　２４ 表■ ｌ９Ｆ−セファロースへ結合したＣｏｅ　７細胞トラン
スフエクシヨン上清中のＩｑＥ結合因子Ｉ９Ｅ特異的ロ
ゼツト の阻害（％） ４．２　　　　　２４　　　　　　　　　０’　　　　
　　　　２５８．３　　　　　３６　　　　　　　　　
０　　　　　　　　３１９．５　　　　　２０　　　　
　　　　　０　　　　　　　　２４１０．２　　　　　
３３　　　　　　　　　３　　　　　　　　　２１工９
Ｅ−セファロースカラムの溶出は原物質の１：４希釈を
もたらす。それ故、′上清１値は免疫吸着にかけた物質
の１＝４希釈から痔られた。

Ｃｏｓ７細胞内でＩＣＥ　　増強因子活性を発現させる
ｃＤＮＡりｏ−ｙ２３Ｂ６ｐ８．３の実験的に決定され
た完全な配列はこの記述の最後に示す。このｃＤＮＡは
９４位のメテオニンコトゝンから始まって５５６のブト
８ンから成る読み取り枠（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ　ｆ
ｒａｍｅ）　　を含む。この読み取シ枠は下側に示す推
定上のアミノ酸配列をコードする。この翻訳された配列
によって定義される工９Ｅ　　結合因子は、例えばグリ
コジル化によ＃）または翻訳後の蛋白質分解により、さ
らに細胞修飾をうける前駆体蛋白質であることが認めら
れる。

また、この記述の終りにｃＤＮＡクローン２３Ｂ６　ｐ
　１０．２の実験的に決定された完全な配列、ならびに
それから推定されるアミノ酸配列を示す。

このクローン２３Ｂ６ｐ１０．２がＣｏｅ７サル細胞内
へトランスフェクトされる場合、このような細胞からの
上清はｌ９Ｆ　　結合能を示すが、クローン２３　Ｂ　
６　ｐ　８．３を用いてトランス７エク）Ｌ＆Ｃｏｓ　
７細胞からの上清に特徴的な活性の全スＲクトルを示さ
なかった。

２３　Ｂ　６　ｐ　８．３．２３Ｂ６ｐ１０．２おＪ：
び他の６　ツ（Ｄ　ｃＤＮＡ挿入物の制限エノビヌクレ
アーゼ切断地図は第２図に示す。

第２図に示すように、制限地図分析によ４）　ｃＤＮＡ
クローンの全ては広範囲のホモロジー領域を共有するが
、同様に有意な差異を有する。ｃＤＮＡ　　クロー／ズ
ラスミト″ＤＮＡは制限酵素Ｅｃ　ｏＲ工。

ＢａｍＨＩ、Ｓ＋ｓｔＩ、ＸｈｏＩ、Ｂｇ７９ＩＩ、Ｘ
ｈｏＩおよびＨｌｎｄＩＩＩ　　によって切断した。ｍ
−および二重消化物は１％アガロースゲルによる電気泳
動を行った。４つの制限断片がクローン８３から誘導さ
れ、各々は約２０　ｎｇ／ｍｌ　の濃度で他のクロー／
からの種々の断片とノ・イプリダイズした。このノ・イ
ブリダイゼーションは４　Ｘ　ＳＥＴ　、　　２　Ｘ　
Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓおよび０．２％ＳＤＳ中６５℃で１
２時間行われ、次いで最初に１．５　Ｘ　Ｓ　Ｅ　Ｔを
用いて室温で１０分洗い、次に２ＸＳＥＴ、！：Ｏ０５
％ＳＤＳを用いて６０℃で３０分洗い、そして最後に１
ｘＳＥＴと・・０５％ＳＤＳを用いて６０℃゛で３０分
洗った。共有されたホモロジー領域は太い斜線の区域、
縞模様の区域および点描の区域により示される。

クローン２３　Ｂ　６　ｐ　８．３からの６００　Ｊ＋
ｘｈｏ工／　ＢａｍＨＩ断片（プローブ）のラット精子
ゲノムＤＮＡの制限酵素消化物へのノ・イブリダイゼー
ション試験において、このクローン（コーデイノグ配列
の実質的部分を含む）は多数の制限断片へハイブリダイ
ズする。この結果は、このクローンがラットゲノム中の
類似するが区別しうる遺伝子群の１つの族（ｆａｍｉｌ
ｙ）に相同であシうることを示唆している。こうして、
　ＩｇＥ　　結合因子遺伝子は小さな多重遺伝子（ｍｕ
ｌｔｉｇｅｎｅ）族の構成員であシうる。この遺伝子族
の他の構成員は類似の機能をもつ分子、すなわち他の免
疫グロブリン鎖の発現を調節する免疫グロブリン結合因
子をコードするだろう（工、　ＬｏｗｙらのＰｒｏｃ、
　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８０　：２３２３〜２３２７（１９
８３）ｚＪ、　ＹｏｄｏｉらのＪ、■ｍｍｕｎｏ１．　
１３１　：３０３〜３１０（１９８３）を参照）。これ
らの多重遺伝子族の少数の個々の遺伝子は機能的な蛋白
質をコードすることができない偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏ
ｇｅｎｅ）　　。

であることが見出されている。（例えばＭ。

ＳｔｅｉｎｍｅｔｚらのＣｅ１１２５　：　６８３〜６
９２　（１’９８１）；Ｇ、　Ｈｏ１１ｉｓらのＮａｔ
ｕｒｅ　２９６　：　３２１〜３２５（１９８２）　　
を参照されたい。）しかしながら、多重遺伝子膜の大部
分の構成員は通常機能的な関連のある蛋白質をコードす
る。

本発明のｃＤＮＡ　　クローンによってコードされる蛋
白質はレトロウィルスポリメラーゼと相同を示す。詳細
には、２３　Ｂ　６　ｐ　８．３のアミノ酸４３８−４
８８はヒト成人Ｔ細胞白血病つイルスーエ（アミノ酸７
１５〜７６５）、ザル肉腫ウィルスＣｏｏ−１２４）、
Ｍａｌｏｎｅｙ　ネズミ白血病ウィルス（９７４−１０
２９）およびラウス肉腫ウィルス（６９２−７４６）と
約４０〜５０％相同である。しかしながら、Ｎ−末端領
域は何ら比較しうる有意な相同関係を示さなかった。さ
らに、■９Ｅ　−ＢＦ　　クローンは制限地図分析およ
びノ・イブリダイゼーション実験により示されるように
、マウス嚢（のり）内へ粒子（Ｉ’ＡＰＩ遺伝子と広範
囲の核酸相同を共有する。

前述のことから１本発明のｃ　Ｄ　Ｎ’　Ａクローンは
哺乳動物ＩＣＥ　　結合因子に関する正確でかつ完全な
配列データを提供することが認められるだろう。

本発明は当業名にこれらの因子を面意量でガミ生するだ
めの手段を提供する。

ｃＤＮ八クワクローン２３Ｂ６ｐ、３の実験的に決定さ
れた完全な配列、およびそれから推定されたアミノ酸配
列は次のとおりである。

Ａｓｎ　　Ｔｒｐ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　
Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａｖ　　Ｇｌｕ　
　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｈｌｓ　　Ｔｙｒ　
　Ｇｌｎ　　Ｐｒｏ　　ＡｌａＡｌａ　　（ｊｌｙ　　
Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　
Ａｓｐ　　Ｔｒｐ　　Ｐｒ。

Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ　　Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　
Ａｒｇ　　Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　ＡｒｇＳｅ
ｒ　　Ｐｈｅ　　Ｉｃｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｎ　　Ａｒｇ　　ＬｙｓＧｌｙ　　
Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　
ＶａＩ　Ｈｉｓ　　Ａｌａ　　Ｐｒ。

Ａｌａ　　Ｇｌｕ　、Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　
Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　ＡｓｎＡｒ
Ｆ！　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　ＭＥＴ　　Ａｌ
ａ　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　ＡｌａＬｅｕ　　
Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　ＭＥＴ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　
Ｔｙｒ　　ＭＥＴ　　Ｕｌｕ　　ＴｒｐＡｌａ　　Ｇｌ
ｎ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　Ａｈａ　　Ａｓｎ　　Ａｌ
ａ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　ＬｅｕＡｓｐ　　Ｌｅｕ　
　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　
　Ａｌａ　　’ｌ’ｙｒ　　５ｅｒＡｌａ　　Ｔｙｒ　
　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｉ’ｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ
　　’ｌ’ｈｒ　　Ａｌａ　　工］、ｅＧｌｎ　　Ｃｙ
ｓ　　Ａｈａ　　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　’Ｇｌｎ　　Ｃ
ｙｓ　　Ａｈａ　　Ａｓｐｌｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ
　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｍａｌ　　Ｐｈｅ
　　ＧｌｕＶａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　
Ｇｉｎ　　ＩＩｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　ｌ１ｅ−Ａ
ｓｐ　　’Ｉ’ｒｐ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｎ、
Ｍａｌ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　ＡｈａＡｒｇ　　Ａｌ
ａ　　Ｌｅｕ　　Ｔｒｐ　　Ｈｌｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｌ
ａ　　Ａｈａ　　ＧｌｎＴｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　
　Ｇｌｎ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ　
　ＰｈｅＡｌａ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ａ
ｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｒｐ　　ＧｌｙＡｒｇ
　　Ｐｒｏ　　Ｕｌｙ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ、　（ Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　）Ｉｉｓ　　Ｖａｌ　
　ＧＩｎ　　８ｅｒ　　Ｇｉｎ　　ｌｌｅ　　（ｊｌｙ
　　、’＋１ｎ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　ＡｓｐＩ）ｒ
ｏ　　ＭＥＴ　　Ａｒｇ　　Ｔｒｐ　　Ｌｅｕ　　Ａｓ
ｎ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｅ　　ＭＥ’Ｌ’Ｓｅｒ　　Ｌｅ
ｕ　　１１ｅ　　工１ｅ　　Ａｅｎ　　Ｇｌｙ　　ＭＥ
Ｔ　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　Ｉｌｅ　　ＬｅｕＴＣＣＣＣ
ＴＵＡＴＡ　　’Ｉ’ＡＴＣ″ｌ’ｌ’ＧｃＴ　　’Ｉ
’ＡＧＧＣＡＡＴＡＧシ ーαＡ− ＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　Ａ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡｃＤＮＡクロー／２３ｆ３６ｐ１０
．２の実験的に決定された完全な配列、およびそれから
推定されたアミノ酸配列は次のとおりである。

ＡＡＡＡ、ＡＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　
ＡＡＡＡＡ

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の４つのｃＤＮＡクローンに−る工ｇＥ
　　増強作用を示す。 第２図は本発明の８つのｃＤＮＡの制限エンフレアーゼ
切断地図を示す。 （外５イ 手続補正書（方式） 昭和６０年７月ｑ日 昭和６０年特許　願第　５２１５２　　号３、補正をす
る者 事件との関係　　　出　願　人 住所 名　称　　シエリング・バイオチック・コーポレーショ
ン（外１名） ４、代理人 明細書第１１３頁第１行乃至第５行を削除します。 （１）１出願人名を「ザ・ジョーンズ・ホプキンス・ユ
ニバーシティ」と補正すると共に各出願人の代表者名を
記載した願書を提出します。 （２）各出願人からの委任状を補充します。 ８、添附書類の目録 （１）訂正願書　　　　　１通 （２）理　　由　　書　　　　　　　　　　　１通（３
）出願依頼俗耳　　　　　　　　　１通（４）テレツク
扶写　　　　　　　　　　１通（５）宣　　言　　書　
　　　　　　　　　　１通（６）譲渡証書　　　　　６
通

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物ＩｇＥ結合因子活性を示すポリペプチド
   の産生方法であつて、 ａ）前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
   含むベクターを準備する工程、ただし該ヌクレオチド配
   列は該ベクターを含む宿主によつて発現され得るもので
   ある； ｂ）該ベクターを宿主内へ挿入する工程； および ｃ）ベクターを含む該宿主を、該ヌクレオチド配列の前
   記ポリペプチドへの発現に適する条件下に保持する工程
   ； からなる方法。
2. （２）ヌクレオチド配列は前記ポリペプチドをコードす
   るｍＲＮＡ配列から誘導されたｃＤＮＡ配列である、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）宿主は該ベクターで形質転換されるかまたはトラ
   ンスフエクトされる生物である、特許請求の範囲第１項
   または第２項記載の方法。
4. （４）宿主は真核生物細胞である、特許請求の範囲第３
   項記載の方法。
5. （５）ベクターは第２のヌクレオチド配列へ結合した前
   記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
   該第２のヌクレオチド配列が前記ポリペプチドをコード
   するヌクレオチド配列の発現をコントロールできる、特
   許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
6. （６）第２のヌクレオチド配列は前記ポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列の発現を促進するプロモータ
   ー配列を含む、特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）宿主は哺乳動物細胞である、特許請求の範囲第５
   項記載の方法。
8. （８）第２のヌクレオチド配列はプロモーター配列、１
   つ以上のイントロン配列およびポリアデニレーシヨン配
   列を含み、それによつて前記ポリペプチドをコードする
   ヌクレオチド配列が哺乳動物細胞内での翻訳に先立つて
   転写され、スプライシング（より継ぎ）されかつポリア
   デニル化される、特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）プロモーター配列はＳＶ４０ウイルスの初期領域
   プロモーターであり、そしてポリアデニレーシヨン配列
   はＳＶ４０ウイルスの後期領域ポリアデニレーシヨン配
   列である、特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）哺乳動物細胞はサルＣｏｓ７細胞である、特許
    請求の範囲第７〜９項のいずれか１項に記載の方法。
11. （１１）前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列はｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３Ｂ６
    ｐ１０．２のために本明細書中で示した配列をもつか、
    あるいは前記配列の相補鎖とハイブリダイズすることが
    できる、特許請求の範囲第１〜１０項のいずれか１項に
    記載の方法。
12. （１２）前記ポリペプチドはリーダー配列の少なくとも
    一部分を含む、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）前記ポリペプチドはグリコシル化されてＩｇＥ
    結合増強因子活性を示す、特許請求の範囲第１１項また
    は第１２項記載の方法。
14. （１４）本質的に哺乳動物免疫グロブリン結合因子のア
    ミノ酸配列からなるポリペプチドであつて、前記ポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された
    かまたはトランスフエクトされた宿主によつて産生され
    るポリペプチド。
15. （１５）本質的にｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３ま
    たは２３Ｂ６ｐ１０．２に関して本明細書中で示したア
    ミノ酸配列の実質的部分からなるポリペプチド。
16. （１６）前記ポリペプチドはＩｇＥ結合因子活性を示す
    、特許請求の範囲第１４項または第１５項記載のポリペ
    プチド。
17. （１７）実質的に純粋であつて、本質的に他のリンパ球
    型白質を含まない特許請求の範囲第１４〜１６項のいず
    れか１項に記載のポリペプチド。
18. （１８）哺乳動物免疫グロブリン結合因子活性を示すポ
    リペプチドをコードし、かつ哺乳動物ＩｇＥ結合因子を
    コードするヌクレオチド配列とハイブリダイズすること
    ができるＤＮＡ配列。
19. （１９）ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３
    Ｂ６ｐ１０．２に関して本明細書中で示したポリペプチ
    ドの少なくとも一部分をコードする特許請求の範囲第１
    ８項記載のＤＮＡ配列。
20. （２０）本質的に複製可能なプラスミド内に挿入した特
    許請求の範囲第１８項または第１９項記載のＤＮＡ配列
    からなるベクター。
21. （２１）ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３
    Ｂ６ｐ１０．２に関して本明細書中で示したポリペプチ
    ドの実質的部分をコードし、かつ哺乳動物ＩｇＥ結合因
    子をコードする他のＤＮＡ配列とハイブリダイズするこ
    とができるＤＮＡ配列。
22. （２２）前記配列は齧歯動物ＩｇＥ結合因子をコードす
    る、特許請求の範囲第２１項記載のＤＮＡ配列。
23. （２３）下記ベクターを微生物または細胞内に挿入する
    場合、特許請求の範囲第１８、１９、２１および２２項
    のいずれかに記載のＤＮＡ配列を発現することができる
    複製可能なベクター。
24. （２４）特許請求の範囲第２３項記載の複製可能な発現
    ベクターによつて形質転換されたかまたはトランスフエ
    クトされた微生物または細胞。
25. （２５）哺乳動物免疫グロブリン結合因子活性をもつポ
    リペプチドおよび治療上適合性の担体を含む医薬組成物
    。
26. （２６）ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３
    Ｂ６ｐ１０．２に関して本明細書中で示したアミノ酸配
    列の実質的部分に相同性のアミノ酸配列をもつポリペプ
    チド、および治療上適合性の担体を含む医薬組成物。
27. （２７）ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３
    Ｂ６ｐ１０．２に関して本明細書中で示したアミノ酸配
    列の実質的部分をもつポリペプチドとＢ細胞とを接触さ
    せることからなる、免疫グロブリン分泌細胞へのＢ細胞
    の分化を高める方法。
28. （２８）該分化はインビトロで高められる、特許請求の
    範囲第２７項記載の方法。
29. （２９）ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３
    Ｂ６ｐ１０．２のために本明細書中で示したＤＮＡ配列
    の実質的部分を含む発現ベクターでトランスフエクトさ
    れたかまたは形質転換された原核微生物もしくは真核細
    胞を水性栄養培地で培養することからなる、哺乳動物Ｉ
    ｇＥ結合因子活性を示すポリペプチドの産生方法。
30. （３０）哺乳動物免疫グロブリン結合因子活性をもつ１
    種またはそれ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の
    少なくとも一部分もしくは他のヌクレオチド配列を含む
    形質転換微生物または形質転換細胞。
31. （３１）特許請求の範囲第３０項記載の細胞を培養する
    ことによつて産生される哺乳動物ＩｇＥ結合因子活性を
    示す蛋白質。
32. （３２）ＤＮＡ配列が ａ）ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３Ｂ６
    ｐ１０．２のために本明細書中で示したＤＮＡ配列； ｂ）ｃＤＮＡクローン２３Ｂ６ｐ８．３または２３Ｂ６
    ｐ１０．２のために本明細書中で示したＤＮＡ配列とハ
    イブリダイズし、かつ哺乳動物免疫グロブリン結合因子
    活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；およ
    び ｃ）発現の際に哺乳動物ＩｇＥ結合因子活性を示す蛋白
    質をコードするＤＮＡ配列； から選択されることを特徴とする、生細胞の外で末端と
    末端とが結合されたそれぞれ異なるゲノムからのＤＮＡ
    セグメントを含み、かつある宿主に寄生してその中で保
    持される能力をもつ組換えＤＮＡ分子およびその子孫。
33. （３３）ＩｇＥ結合因子活性を示すポリペプチドをコー
    ドするＤＮＡ配列をもち、２３Ｂ６ｐ４．２、２３Ｂ６
    ｐ８．３、２３Ｂ６ｐ９．５および２３Ｂ６ｐ１０．２
    から選択される複製可能なベクター。