JPH06506358A - ナチュラルキラー細胞に特異的なｄｎａおよびアミノ酸配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ナチュラルキラー細胞に特異的なりＮＡおよびアミノ酸配列本発明は、米国国立 予防衛生研究所によりＲＯＩＡ１１９００７の下に授与された政府の部分的援助 によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

本発明は、通常ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に、または幾つかのＴ細胞に転写 されるＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列、該ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列を含むベクター 、および該ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列によりコードされている蛋白に関するもの である。該ＤＮＡ配列は、分別ハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡサブトラ クション法の組合せを用いて検出することができる。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、主要組織適合遺伝子複合体の蛋白による制限 を受けない反応においてＮＫ感受性標的を溶解することのできる状態で、末梢血 中に存在する。この細胞は、典型的には末梢血リンパ球の約５％を構成し、通常 、巨大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）形態を有する。人間の系においてＮＫ活性は、通 常、前骨髄球様白血病の細胞に５６２を溶解する能力として定義される。多（の 場合において、インターロイキン２　（ＩＬ−２）にょるＮＫ細胞の刺激は、こ れらに、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性、即ち、より広範囲の腫瘍標 的細胞を溶解する能力を付与する。ＬＡＫ活性を有する細胞を抗腫瘍療法に使用 するための多（の研究の試みが進行中である。

ヒトＮＫ細胞から分離されたｍＲＮＡがら、ｃＤＮＡライブラリーを作成するこ とができ、ここから、新規な哺乳類の遺伝子ファミリーを構成する４つの関連す る新規な遺伝子が分離された（以後ＮＫＧ２と称する）。標準的選択性基準、な らびにスイスプロットを探査するためのインテリジェネティクスソフトウエアプ ログラムおよびＰＩＲＩ−タベースを使用した配列相同性の探査において、ＩＩ 型型膜膜蛋白成員とＣ型の動物レクチンのドメインにのみ有意な相同性が検出さ れ、他のいずれの配列とも有意な相同性は検出されなかった。総合的な配列相同 性は低いものの、これらはおよそ１２０のアミノ酸全体に相同性を共有しておリ 、最も著名な特徴は、６個の非変異システィン残基が一定の位置に存在すること である。既知の貫層蛋白において、この領域は、該蛋白をＣａ←およびｐＨに依 存して炭水化物と結合させることを可能にする、炭水化物結合ドメインに対応す る［ドリッケイマー、１９８８、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミスト リー（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ）　２６３．９５５７］、故に、本発明に係る新 規な遺伝子ファミリーは、炭水化物結合ドメインを有する貫層蛋白をもコードし ていると信じられる。

本発明は、４つの特異的ＮＫＧ２貫膜蛋白の細胞外部分、および完全な貫層蛋白 をコードしている遺伝子を提供する。さらに本発明は、以後ＮＫＧ２−Ａ、−Ｂ 、−Ｃおよび−Ｄと称する対応蛋白を提供する。

ＩＩ型膜蛋白の遺伝子ファミリーに属するマウスの分子がヨコヤマにより記載さ れている［ヨコヤマ等、１９８９、ジャーナル・オフ・イミュノロジー（Ｊ、　 Ｉｍ■ｕｎｏ１．　）　１４３］。マウスのＬｙ−４９アロ抗原は、Ａ１モノク ローナル抗体により認識され、また、その発現が専らマウスＮＫ細胞のサブセッ トに限定されるＩＩ型膜蛋白である。この遺伝子は、これもまた殆ど限定的にＮ Ｋ細胞上に発現される一般に使用されるマウスＮＫ細胞マーカーであるＮＫ１． １に対する遺伝子と同じマウスの第６染色体上の位置に位置付けられることが判 明している。Ｌｙ−４９はＮＫ１．１陽性細胞の約２０％にしか発現されず、Ｎ Ｋ１．１と識別できる。

特別なモノクローナル抗体により最初に同定されたさらなる分子がチャンバーに よって記載されている［チャンバー等、１９８９、ジャーナル・オフ・エクスベ リメンタル・メディスン（Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ）　１６９．１３７３］。この分 子は抗原ＮＫＲ−ＰＩに対応し、殆ど限定的にラットのＮＫ細胞上で発現される 。この抗体の、標的抗原との反応は、適当なＦｃレセプター陽性標的細胞の逆抗 体依存性の細胞性細胞障害性を仲介する能力によって立証される貫層信号を産む 。対応するｃＤＮＡは、２２３個のアミノ酸を有する１１型膜蛋白をコードして いる［ショルダ等、１９９０、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２４９．１２ ９８］　、Ｌｙ−４９およびＮＫＲ−Ｐ１抗原遺伝子はＮＫＧ２との類似性を有 するものの、これらは非常に限られたアミノ酸配列相同性を示し、ＮＫＧ２−Ａ 蛋白配列との相同性は、Ｌｙ４９に対しては３３％、モしてＮＫＲＰＩに対して は２３％である。したがって、ＮＫＧ２は、単にこれらマウス遺伝子のヒトにお ける等価物である（この場合、アミノ酸相同性はおよそ７０％またはそれ以上が 期待される）とは全く考えに（（、新規な遺伝子ファミリーを表わすものである 。

この新規な遺伝子は、哺乳動物、好ましくは霊長類、そして最も好ましくは人間 のＮＫ細胞およびＴ細胞中で専ら発現される。ノーサンプロット技術のような標 準的方法を使用することにより、本発明に係る遺伝子に対応するｍＲＮＡは、幾 つかのＴ細胞中に検出されるが、Ｂ細胞、ＥＢＶ−形質転換Ｂセルライン（ＥＢ Ｖ＝エプスタイン−バーウィルス）または他の細胞には検出され得ない。

本発明は、新規なりＮＡまたはｃＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を有す る新規な蛋白を提供し、これらは全て単離された純粋な形状である。「単離され た純粋な形状」とは、哺乳動物起源の他のＤＮＡまたは蛋白を実質土倉まない形 状である（〉９０％、好ましくは〉９５％）ことを意味する。

特に本発明は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞中で翻訳される、本明細書中 （ａ）ＮＫＧ２−Ａ、、（ｂ）ＮＫＧ２−Ｂ、、（ｃ）ＮＫＧ２−Ｃ，および（ ｄ）ＮＫＧ２−Ｄ、（ｆ＝フラグメント）と呼称される貫層蛋白の細胞外部分を コードしている単離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子であって、該分子が、ａ） 番号４５８ないし８６３（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番号１に 示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号３に示される配列の全体）：または、 ｂ）番号５０３ないし８６３（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番号 １に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号４に示される配列の全体）；また は、 Ｃ）番号２９６ないし７００（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番号 ５に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号７に示される配列の全体）；また は、 ｄ）番号５８５ないし９８６（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番号 ８に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号１０に示される配列の全体）、よ り成る群から選ばれるＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列を含む分子を提供するものであ る。

さらに本発明は、上記ａ）−ｄ）のいずれかによりコードされるのと同一のアミ ノ酸配列をコードし：そして／または、緊縮条件下で上記ａ）−ｄ）のいずれか とハイブリダイズし；そして／または、上記ａ）−ｄ）のいずれかのＤＮＡ配列 と８０ないし１００％の相同性を有する、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列を含む。

９０ないし１００％の相同性が好ましく、より好ましいのは９５ないし１００％ の相同性であり、特に好ましいのは９８ないし１００％である。

この蛋白の細胞外部分の活性は、とりわけ細胞表面のりガントの認識を含み、該 リガンドは、例えば癌細胞およびウィルス感染細胞上で発現される炭水化物構造 であるという証拠がある［ドリッケイマー、１９８８、ジャーナル・オフ・バイ オロジカル・ケミストリー（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ）　、２６３　：　９５５ ７］。

さらに本発明は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞中で翻訳される、本明細書 中ａａ）ＮＫＧ２−ＡＳｂｂ）ＮＫＧ２−Ｂ、ｃｃ）ＮＫＧ２−Ｃおよびｄｄ） ＮＫＧ２−Ｄと呼称される完全な貫層蛋白をコードしている単離されたＤＮＡま たはｃＤＮＡ分子であって、該分子が、ａａ）番号１６５ないし８６３（この数 を含む）のヌクレオチドからなる配列番号１に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝ 配列番号１１に示される配列の全体）；または、 ｂｂ）番号１６５ないし８６３（この数を含む）のヌクレオチドからなり、番号 ４４９ないし５０２のヌクレオチドが欠失している、配列番号１に示されるＤＮ Ａ配列の一部分（＝配列番号１２に示される配列の全体）、または、ＣＣ）番号 ８ないし７００（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番号５に示される ＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号１３に示される配列の全体）；または、 ｄｄ）番号３３９ないし９８６（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番 号８に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号１４に示される配列の全体）、 より成る群から選ばれるＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列を含む分子を提供する。

（ｂ　ｂ）で述べられている欠失は二つのコドンＴＣ，，，Ｔ　（Ｓ　ｅ　ｔ） およびＧＣ，、、Ａ　（Ａ　Ｉ　ａ）を中断させているが、欠失後に形成される コドンＴＣＡもやはリセリンをコードしているため、翻訳への影響はない。

さらに本発明は、上記ａａ）−ｄｄ）のいずれかによりコードされるのと同一の アミノ酸配列をコードし：そして／または、緊縮条件下で上記ａａ）−ｄｄ）の いずれかとハイブリダイズし；そして／または、上記ａａ）−ｄｄ）のいずれか のＤＮＡ配列と８０ないし１００％の相同性を有する、単離されたＤＮＡまたは ｃＤＮＡ配列を含む。９０ないし１００％の相同性が好ましく、より好ましいの は９５ないし１００％の相同性であり、特に好ましいのは９８ないし１００％で ある。

完全な貫層蛋白は、その機能が特に、 １）該リガンドが、例えば癌細胞およびウィルス感染細胞上で発現される炭水化 物構造であってよい（しかしながら他の構造も除外されない）、細胞表面のリガ ンドの認識； ２）細胞外空間から細胞質への信号の伝達：３）細胞障害性および／または増殖 の誘導をもたらす、係る信号によるＮＫまたはＴ細胞の活性化、 を含む、レセプター分子であると考えられる。

好ましいＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列は、コード化領域中の全ヌクレオチド変化数 に基づいて算出された対照ＤＮＡ配列との相同性の程度が上記のごとくである配 列である。アミノ酸配列の変化を生じさせるヌクレオチドの変化のみを基にして 算出した場合に、相同性の程度が上記の範囲内にある配列は、好ましさがより小 さい。

本発明は、さらに、ａａ）　、ｂｂ）　、ｃｃ）またはｄｄ）からのコード化配 列ならびにさらなる非コード化配列を含むＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列を包含する 。

本発明に係る完全な配列は、配列番号１．５．８、および１５に示す。示された ＤＮＡ配列は人間の蛋白をコードしている。他の哺乳動物種に見いだされる対応 蛋白をコードしているホモローガスなりＮＡ配列もまた好ましい配列である。

本発明に係るＤＮＡ配列は、宿主細胞または人間以外の生物の遺伝学的材料中に 存在し得るｃＤＮＡ組み替えＤＮＡ配列であってよい。本発明に係るＤＮＡは、 原核細胞または真核細胞中に移すことができる。配列番号１．５．８、または１ ５のうち一つの配列を、ｔａｃプロモーターのような適当なプロモーターと合し 、ｐＧＥＸ−２ＴまたはｐＫＫ２３３−２のような適当なベクター中に導入し、 次いでこれを使用して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　（例えばＭＯ１４２菌株）のよ うな原核細胞を形質転換する。配列番号１．５．８、または１５のうち一つの配 列を直接真核細胞中に導入することもできる。好ましい細胞はＣＨＯ細胞または ＣＯ８のような霊長類の細胞であり、何故ならこれら後者の細胞は正しい型のグ リコジル化を保証するからである。哺乳動物における最適な転写のためには、適 当なプロモーターをこれと両立し得るベクターと共に使用しなければならず、例 えばｐＣＤＭ８ベクター中にＣＭＶプロモーターを使用する。

さらに本発明は、この新規な遺伝子ファミリーによりコードされる４つの貫層蛋 白の細胞外部分であって、 ａ’）番号９９ないし２２３のアミノ酸からなる配列番号１および２のアミノ酸 配列の一部分（＝配列番号１７のアミノ酸配列の全体）；または、ｂ’）番号１ １４ないし２３３のアミノ酸からなる配列番号１のアミノ酸配列の一部分（＝配 列番号１８のアミノ酸配列の全体）；または、ｃ’）番号９７ないし２３１のア ミノ酸からなる配列番号５のアミノ酸配列の一部分（＝配列番号１９のアミノ酸 配列の全体）、または、ｄ’）番号８３ないし２１６のアミノ酸からなる配列番 号９のアミノ酸配列の一部分（＝配列番号２０のアミノ酸配列の全体）、より成 る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、ａ’）ＮＫＧ２−ＡＩ、ｂ’）ＮＫＧ ２−Ｂ、、ｃ”）ＮＫＧ２−Ｃ，およびｄ’）ＮＫＧ２−Ｄ、（ｆ＝フラグメン ト）と呼称される細胞外部分を提供する。

さらに、本発明は、 ａ　ａ’）配列番号２（または配列番号２１）のアミノ酸配列；または、ｂｂ’ ）番号９６ないし１１３のアミノ酸が欠失している配列番号２（または配列番号 ２２）のアミノ酸配列； ｃｃ’）配列番号６（または配列番号２３）のアミノ酸配列；または、ｄ　ｄ’ ）配列番号８（または配列番号２４）のアミノ酸配列、より成る群から選ばれる アミノ酸配列を有する、ａａ’）ＮＫＧ２−Ａ、、ｂｂ’）ＮＫＧ２−Ｂ、ｃｃ ”）ＮＫＧ２−Ｃおよびｄｄ’）ＮＫＧ２−Ｄと呼称される新規な遺伝子ファミ リ・−によりコードされる単離された完全な貫層蛋白を提供する。

本発明に係るヌクレオチド配列を知ることにより、当業者は、ＰＣＴ公開ＷＯ９ ０１０７８６１号に記載の一般的方法に従ってこのＤＮＡを合成することができ る（オリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ反応による増幅、および完全なりＮＡ配 列を作るためのスプライシング）。いったんこのＤＮＡ配列が得られると、これ はさらに増幅させて転写および蛋白への翻訳のために宿主細胞中に導入すること ができる。この蛋白は、標準的方法によ７て発現させ、単離しそして精製するこ とができる。

本発明に係る蛋白は、かなりの程度の類似性を示す。この蛋白は各々細胞外、貫 層、および細胞内セグメントを含む。貫層セグメントは以下のアミノ酸を含んで いる：配列番号２＝７１ないし９８（この数を含む）または７１ないし９５（こ の数を含む）、配列番号６＝７１ないし９６（この数を含む）および配列番号８ ；５２ないし８２（この数を含む）。

蛋白ＮＫＧ２−Ｂ　（欠失を含む配列番号１、または配列番号１５）は、貫層領 域のすぐ外側に１８のアミノ酸セグメントが無いことを除けばＮＫＧ２−Ａ　（ 配列番号１）と同一である。ＮＫＧ２−Ｃ（配列番号５）は、ＮＫＧ２−Ａの細 胞外セグメントに対し最も強い相同性（９４％）を示し、細胞内および貫層セグ メント全体ではより小さな相同性（５６％）を示し、通算の相同性は７６％であ る。

ＮＫＧ２−Ｄ　（配列番号８）は、ＮＫＧ２−ＡＳＮＫＧ２−ＢおよびＮＫＧ２ −Ｃに対し、遠くはあるが有意な相同性（２１％）を示す。図１は、転写物のＤ ＮＡ配列における相同領域の図式を示すものである。陰を付した領域は、隣接す る転写物の開の相同性のパーセントを意味する。ＮＫＧ２−Ａ、ＮＫＧ２−Ｂお よびＮＫＧ２−Ｃ転写物内部の点刻領域は、ＮＫＧ２−Ｄの５゛末端と９５％ホ モローガスである。

本発明に係る蛋白は、既知の内在性膜蛋白ＩＩ型と類似の機能を有する。この蛋 白は貫層信号を発する。細胞外のＣ末端および細胞内のＮ末端は、貫層ドメイン としての機能を有する疎水性領域により結合している。細胞外セグメントは、特 異的分子、例えば該細胞外セグメントを特異的に認識するモノクローナル抗体に よって活性化し得る。誘導分子と本発明に係る蛋白との間に複合体が形成される ことにより、本発明に係る蛋白の三次元構造が変わる。細胞内セグメントはその 立体配置を変え、溶菌活性が増大する。本発明に係る蛋白が誘導分子により認識 される時、キラー機能が活性化する。

本発明は、上記アミノ酸配列と全く同じアミノ酸配列を有する蛋白のみならず、 上記蛋白の配列変異体である蛋白をも包含する。「配列変異体」とは、蛋白ａ’ ）−ｄ′）のうちの一つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、よ り好ましくは少なくとも９０％、とりわけ少なくとも９５％の相同性を有する二 または、蛋白ａａ’）−ｄｄ’）のうちの一つと少なくとも８０％、好ましくは 少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。そして 、蛋白ａ’）−ｄ’）またはａａ’）−ｄｄ’）のうちの一つの蛋白と本質的に 同じ生物学的性質を有する蛋白として本明細書中定義される。

「本質的に同じ生物学的性質」とは、貫層蛋白の細胞外ドメインに対応する、ま たは完全な貫層蛋白に対応する配列変異蛋白が、ＮＫ標的細胞上のリガンド分子 に結合可能でなければならないこと、そして、完全な貫層蛋白が、膜を横断した 信号の伝達ができなければならないことを意味する。

本発明に係る蛋白のアミノ酸配列変異体は、例えば、非修飾アミノ酸配列内の残 基の欠失、挿入または置換を含む。最終組み立て物が所望の活性を有する限り、 欠失、挿入および置換の任意の組合せを行なって最終組み立て物に到達すること もできる。明らかに、変異体をコードしているＤＮＡになされるいかなる突然変 異も、その配列を読み取り枠外に位置させてはならない。

アミノ酸配列の欠失は、一般に約１ないし３０残基、より好ましくは工ないし１ ０残基の範囲であって、典型的には隣接している。アミノ酸配列の挿入は、１残 基から本質的に無制限の長さのポリペプチドまでのアミノ−および／またはカル ボキシ−末端の融合、並びに単一のまたは多数のアミノ酸残基の配列内挿入を含 む。配列内挿入は一般に約１ないしｌＯの残基、より好ましくは１ないし５の残 基の範囲であってよい。

本発明に係る蛋白は、非常にしばしば、本発明に係る／−フェンス・アイデンテ ィファイア−（アミノ酸に関して）のアミノ酸配列と比較して少なくとも１個の アミノ酸残基が変化している配列から成っている。好ましくはただ１個が除去さ れてその位置に異なった残基が挿入されている。一般にこのような置換は、本発 明に係る蛋白の性格をうま（調製することが望まれる場合に、以下の第１表に従 ってなされる。

機能上の実質的な変更は、第１表に記載の置換より保存性の低い置換を選択、即 ち、（ａ）置換領域における、例えば平面またはらせんフンフォメーションのよ うなポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）レセプター結合部位における分子 の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の体積、の維持に及ぼす効果をより有 意に変える残基を選択することによってなされる。

第１表 元の残基　置換例 Ａｌａ　ＧｌｙＳＳｅｒ Ａｒｇ　Ｌｙｓ Ａｓｎ　Ｇｉｎ、、Ｈｉｓ Ｇｉｎ　Ａｓｎ Ｇｌｕ　Ａｓｐ Ｇｌｙ　Ａｌａ、Ｐｒ。

Ｈｉｓ　Ａｓｎ５Ｇｉｎ ｌｉｅ　Ｌｅｕ、Ｖａｌ Ｌｅｕ　Ｉ　ｌｅ、Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ａｒｇ、Ｇｉｎ、、Ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ｌ１ｅ Ｐｈｅ　ＭｅｔＳＬｅｕ、Ｔｙｒ Ｖａｌ　Ｉｌｅ、Ｌｅｕ 殆どの欠失および挿入、ならびにとりわけ置換は、本発明に係る蛋白の性格に根 本的な変化をもたらすとは予想されない。しかしながら、置換、欠失または挿入 が行なわわる前に、例えばレセプター結合ドメインを修飾する際に、それらの正 確な影響を予測することは困難である。

ＮＫＧ２蛋白は、その機能がＮＫ細胞を活性化する信号を伝達する事である貫層 蛋白として作用するのであるから、ＮＫ細胞表面のＮＫＧ２蛋白分子の数が増加 すれば、ＮＫ免疫応答は増強されると信じられる。

発現されるＮＫＧ２分子の数を増やすために、癌またはウィルス疾患に罹患して いる患者のナチュラルキラー細胞を分離し本発明のＤＮＡによって形質転換する ことができる。ＮＫ細胞は、患者の血液、リンパ節または膵臓細胞から入手でき 、これらの細胞をインビトロで形質転換し、患者に再注射することができる。

単離されたＤＮＡ配列は、例えばレトロウィルスベクターによる既知のトランス フェクション技術を用いて患者由来のＮＫ細胞に導入する。このような導入され たＤＮＡによりコードされる蛋白は、他の多くの細胞蛋白と違って人によって異 なることが無い（主要組織適合性遺伝子抗原）。故に、自己抗原に対する形質転 換細胞の抑制されない攻撃が排除され、形質転換細胞自身が免疫系により攻撃さ れることが無い。

本発明に係る蛋白は、上に概説し下記により詳細に述べられているように、本質 的には標準的方法を用いて、組み替え発現の産物として得られる。この蛋白は、 例えば単離が望まれる蛋白の特性を示している特異的ペプチド配列に対して作製 されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体の使用により精製することがで きる。

単離された本発明に係る蛋白、好ましくは細胞外ドメインは、標的リガンド、例 えば癌細胞および幾つかのウィルス感染細胞上に存在する炭水化物群を検出する 診断的手段として有用である。

単離された完全な貫層蛋白は、ＮＫ細胞の調節機構を研究する好適な手段である 。さらに、合成または天然の膜の一部である、該蛋白の天然三次元構造は、貫層 蛋白の機能の誘発を遮断または促進するコンフィギユレーションの変化に影響を 及ぼす相異なる化学的化合物の試験を可能にする。

さらに、本発明に係る蛋白、好ましくは該蛋白の細胞外部分は、細胞障害性分子 、例えばリシンに結合して、癌およびウィルス感染細胞を溶解することのできる キメラ蛋自分子を形成することができる。

本発明に係る精製された蛋白は、さらに、当業者に良く知られる標準的方法を用 いて、該蛋白に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を作製するため の抗原としても有用である。別法として、精製された抗原によりマウスのような 動物を免疫する代わりに、膜」二に該蛋白分子を有する細胞を免疫原として使用 することもできる。これらの方法を用いて該蛋白のエピトープに対する抗体が確 立されるが、細胞外エピトープが好ましい。この蛋白は異なる種の細胞上の抗原 として提示さね（例えばマウスの同遺伝子型の細胞上のヒト蛋白）、該抗原に対 する抗体を産生ずる特異的Ｂ細胞の数を増加させる。マウスの細胞は、好ましく は適当なプロモーターに結合させた本発明に係るヒトＤＮＡのコード化部分を、 マウスの細胞の遺伝学的物質中に導入することにより、形質転換される。次いで 、この形質転換した細胞を、高閲に特異的な免疫原として、同遺伝子型のマウス に注射する。標準的方法に従う融合によってハイブリドーマを生成させた後、ハ イブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を、例えば元の（ヒト）ＮＫ 細胞または純粋な蛋白を使用するＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。

さらに、本発明に係る蛋白を特異的に認識するモノクローナル抗体またはドメイ ンを、癌細胞またはウィルス感染細胞上の特異的構造を認識する第二のモノクロ ーナル抗体または結合ドメインと合することができる。結合ドメインは、本発明 に係る蛋白の一部（例えばエピトープ）を認識する少なくとも一つの蛋白の一部 である。典型的な結合ドメインは、抗体の重鎮または軽鎖の可変領域である。

このような合した分子または結合ドメインは、特定の型の癌の処置に有用である 。

二価抗体の産生は、例えばＪパン・ディジュク等（１９８９）、インターナショ ＋ルー　ン＋　−＋／Ｌ／　・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ　Ｊ　ｏｆ　Ｃａｎｃ ｅｒ）　、４４　：　７３８　７４３に記載されている。

特に、ａ−ＮＫＧ２−ｍＡｂｓまたはαＮＫＧ２−ａ−癌−ｍＡｂ−複合体は、 プラナ−等（１９８１）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン ＯＥｘｐＭｅｄ）１５４　：３６２−３７３に記載されている６１［（：ｒ］放 出試験で示されるように、ヒト腫瘍細胞に対するヒトナチュラルキラー細胞の活 性の増大をもたらす。５１［（：、］で標識された標的細胞としての腫瘍細胞を 、ＮＫ細胞の存在下で４ないし６時間インキュベートする。ＮＫ細胞の有効性を 、培養基中への５１［（、］標識の放出によって測定する。！ｌＩ［Ｃｒ］の放 出は、本発明に係る抗体または抗体複合体の存在下で増加する。キボンのＮＫ細 胞を使用する外は同じインヒドロの系で、ギポンの腫瘍細胞に対する活性を試験 する。

本発明に係る遊離の細胞外蛋白、即ち蛋白ａａ’）−ｄｄ’）は、ＮＫ標的細胞 上のリガンド分子をブロックするための有用な物質であり、故に、臓器移植およ び自己免疫疾患のような状況における免疫抑制剤として有用である。

これらの適応において、適当な用量は、例えば宿主、投与方式、ならびに処置さ れる状態の性質および重篤度に応じて変わる。一般に、動物において満足できる 結果は、体重１ｋｇあたり１日に約２０μｇないし約１５ｍｇ、好ましくは１５ ０μｇないし２ｍｇの日用量において得られる。この用量を一回投与または１日 ４回までの分割投与で投与する。

本発明化合物は任意の常套的経路で、特に薬学上許容し得る希釈剤または担体中 の溶液または懸濁液を注射することによって投与する。このような組成物は常法 によって製造する。

図面の説明： 図１は、本発明に係る蛋白、即ちＮＫＧ２−ＡＳＮＫＧ２−Ｂ、ＮＫＧ２−Ｃお よびＮＫＧ２−ＤのＤＮＡ配列における相同領域の図式である。陰を付けた部分 は、隣接する転写されたｍＲＮＡの間の相同性のパーセントを意味する。ＮＫＧ ２−Ａ、ＮＫＧ２−ＢおよびＮＫＧ２−Ｃ転写物内部の点刻領域は、ＮＫＧ　２ −Ｄの５゛末端と９５％ホモローガスである。ｍＲＮＡを表わす４本の線の上に 、分子の細胞外、貫層および細胞内部分を含む翻訳された蛋白を示す。

実施例 細胞培養。

クローニングされたヒト腫瘍細胞Ｂ２２　（ＣＤ３−１ＣＤ１６−１ＣＤ５６＋ ）、ならびに、ＮＫ細胞白血球増多症患者由来のＮＫ細胞集団ＥＤＦ　（ＣＤ３ −１ＣＤ１６＋、ＣＤ５６−）および２２１７０７　（ＣＤ３−１ＣＤ　１６＋ 、ＣＤ５６＋）を、ストレプトマイシンおよびペニシリンを添加した、１５％の プールされたヒト血清、２０％Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）（バイオテスト、Ｆ ＲＧ）、２ｍＭＬ−グルタミンを含有するＲＰＭ１１６４０培地中で培養する。

この細胞を、照射（１００００Ｒａｄ）ＬＣＬ支持細胞（ＬＣＬ＝リンパ芽球様 細胞セルライン）で弱く刺激する。

細胞を収穫し、ＲＮＡを、増殖サイクルの６または７日目に単離する。患者由来 の凍結ＰＢＬ（＝末梢血リンパ球）を、０ＫＴ３およびウサギの補体による処理 によりＣＤａ＋細胞（元の試料の１５％未満を構成している）を涸渇させる。

ＥＤＦ培養をＬＣＬ支持細胞により２週間間隔で処理し、培養の３週間後に細胞 を収穫する。２２１７０７は支持細胞により処理せず、培養の２週間後に収穫す る。ＣＤ３＋細胞の補体涸渇およびＴＣＧＦ含有培地中での２ないし３週間の増 殖の後、細胞集団中事実上１００％の細胞がＮＫ表現型を有する。同種異系の細 胞障害性Ｔ細胞クローン（Ｔｃ）をＮＫセルラインと同じ培地で培養し、ＬＣＬ 支持細胞で弱く刺激する。ＴｃｌおよびＴｃ２はＣＤ４＋でありＴｃ３はＣＤＳ ＋である。リンパ芽球様細胞セルラインＦＪＯ，および白血病Ｔ細胞セルライン 、ジャーカットを、１０％牛脂児血清、グルタミンおよび抗生物質を含有するＲ ＰＭｌ　１６４０中で培養する。

ＣＤ４−陽性の同種異系Ｔ細胞クローン、ＫＤ１５１．３−７８、ＫＤ３３およ びＣＤ４−陽性サイトメガロウィルス特異的ヘルパーＴ細胞クローン、ＷＲＣ− １６を、ＮＫクローンと同じ培地で培養する。慢性骨髄性白血病ラインに５６２ 、組織球型リンパ腫ラインＵ９３７、ジャーカットセルライン、およびＦＪＯセ ルラインを、１０％牛脂児血清、グルタミンおよび抗生物質を含有するＲＰＭ１ １６４０で培養する。Ｔ細胞リンパ腫うインＨｕｔ７８を、１０％ＴＣＧＦを添 加した上と同じ培地で培養する。前骨髄球白血病ラインＨＬ６０を、培地に２０ ％牛脂児血清を含有させる外は上と同じ培地で培養する。このＨＬ６０の半分を １日目および３日目に１２５％ＤＭＳＯで刺激し、７日目に収穫する。ＤＭＳｏ （ジメチルスルホキシド）による刺激は、この細胞のおよそ５０％に対し、より 成熟した骨髄細胞の形態への分化を誘発する。単球ラインＴＨＰ−１を１０％牛 脂児血清および２ｘｌＯ−’Ｍ　β−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭ１ １６４０で培養する。

ＮＫ細胞の活性化。

通常は２０％ＴＣＧＦ中に維持するＢ２２を、細胞は生存し続けるが増殖しない ５％ＴＣＧＦを含有する培地に再懸濁する。２日後に、この細胞を２０％ＴＣＧ Ｆを含有する培地に戻す。全部の細胞質ＲＮＡを様々な時点で抽出し、ノーサン プロット分析に付す。

ＮＫＧ２　ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定。

１２の独立したｃＤＮＡクローンを、以下に記載する分別ハイブリダイゼーショ ンを用いてＢ２２　ｃＤＮＡライブラリーから単離する。

ｃＤＮＡライブラリーの調製。

ｃＤＮＡライブラリーの調製、ノーサンプロット、またはｃＤＮＡプローブに使 用されるメツセンジャーＲＮＡを、ＪＥ・バドレー等（１９８８）：バイオテク ニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）６．１１４の方法を用いてオリゴｄＴ セルロースから溶出する。Ｂ２２およびＦＪＯのｃＤＮＡライブラリーを、バラ ツォーロおよびメイエロウィッツ（１９８７）　・ジーン（Ｇｅｎｅ）　、５２ ．１９７の方法を用いて調製する。簡単に述べると、第一の鏑の合成を、５゛末 端にＸｂａｌクローニングサイトを有し３°末端にホモポリマー１尾を有するオ リゴヌクレオチドで開始する外は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・ｃＤ ＮＡ・シンセシス・システムを使用して、２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを二本鎖ｃ ＤＮＡに変換する。この二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼによりメチル化 し、ＥｃｏＲＩリンカ−にライゲーションし、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ で消化する。次にこのｃＤＮＡをバイオゲルＡ３０Ｍカラム上でサイズ分画して 最少４００ｂｐの大きさを持つ全ての両分を合し、ラムダ（λ）ＯＥＭ−２ベク ター（プロメガ・バイオチク）のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌのアームにライゲーショ ンし、ギガパック・ゴールド（ストラタジーン）を用いてパッケージングする。

１０６の一次プラークのライブラリーを増幅する。最終的ライブラリーは、メツ セージの３′末端にあるＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに隣接するＸ ｂａｌサイト、および５°末端のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの隣の Ｅｃ。

ＲＩサイトを有するｃＤＮＡ挿入物から成る。

ライブラリーまたはクローンからのλ−ＤＮＡを、Ｔ、マニアティス等（１９８ ２）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング ・バーバー、ＮＹに記載されるポリエチレングリコール／ＮａＣ１沈澱法を用い て、プレート溶菌液から調製する。この後Ｂ２２およびＦＪＯライブラリーから のＤＮＡ調製物を使用し、ＭＪ・パラツォーロ等（１９８９）：ニューロン（Ｎ ｅｕｒｏｎｅ）　３．５２７の方法に従って、サブトラクトされたｃＤＮＡライ ブラリーを作製する。ライブラリーＤＮＡをＸｂａｌで消化した後、Ｔ７ＲＮＡ ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）ＲＮＡ　（以後合成ＲＮＡと称する）を合成 し、これを直ちにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにロードし、およそ８０％の 新規に合成されたＲＮＡを含有する結合した両分を回収する。

３２　［Ｐ］−標識された第−鎖のｃＤＮＡを、上記と同じプライミングオリゴ マーを使用してＢ２２合成ＲＮＡから調製し、このＲＮＡを引続き塩基加水分解 する。２または６μｇのＢ２２第−鎖ｃＤＮＡから出発して、アニーリング操作 およびこれに続く工程を２回実施する。このｃＤＮＡを、４０％ホルムアミド、 ０゜５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ６，８）　、１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．２％ ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下で、１０−２０倍過剰のＦＪＯ合 成ＲＮＡに４２°て７２時間２回アニーリングする。各アニーリングの後に、試 料を、６０゜て１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６，８）で平衡化したバイオラド ＨＰＨＴ　ＨＰＬＣカラムに適用する。アニーリングしていない一本鎖ｃＤＮＡ を１５４ｍＭ燐酸緩衝液で溶出し、ｃＤＮＡを含有する画分を合する。２サイク ルのサブトラクションの後、およそ０２μｇの一本鎖ＮＫ　ｃＤＮＡを回収する 。このサブトラクトされた第−鎖ｃＤＮＡの３′末端における短いベクターのコ ード化された部分に対しホモローカスなオリゴヌクレオチドを使用して、第二鎖 の合成を開始する。次に二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌで開裂し、 バイオゲルＡ３０Ｍカラム上でサイズ分画し、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ　λＧＥＭ −２のアームにライゲーションする。インビトロのパッケージングおよびプレー トへの播種の後に、計１１００のプラークが２回の試行から得られる。各プラー クをガラス製毛細管で拾い、プラークを５Ｍ緩衝液１００μｌを入れた９６ウエ ルの平板のウェルに移す。

プラークハイブリダイゼーションの研究。

ニトロセルロース膜上で調製したプラークのリフトに分別ハイブリダイゼーショ ンを実施する。全ライブラリーの最初のスクリーニングの間に、５００−８００ のプラークを含む１．５０ｍｍの平板からリフトを調製する。滅菌したステンレ ススチールの移動器具を用いて調製された序列化したプラークに対し、これに続 く全てのスクリーニングを実施し、その結果９６ウエルの平板の序列化した列は 二倍となる。ｄＣＴＰを２５μＭ１そして（α−３２［Ｐ］　）ｄＣＴＰを３． ５μＣ１／μｌ存在させる外は上記ｃＤＮＡ合成と同じ条件を用いて、第−鎖３ ２　［ｐ］−標識ｃＤＮＡプローブをｍＲＮＡから調製する。ＲＮＡを塩基加水 分解し、ＣＤＮＡを小型セファデックス０５０カラム上で、取り込まれなかった 標識から分離する。前述の遺伝子プローブを、ニック翻訳キットまたはアマーノ ヤム由来のマルチプライム・ラベリング・システムのいずれかを用いて標識する 。クロスハイブリダイゼーション研究のために個々のクローンから調製されるプ ローブには幾つかの型がある。幾つかの場合においては、ＤＮＡ挿入物を個々の クローンから切取り、１．３％の低融点アガロースゲル上で電気泳動し、この挿 入物のバンドをゲルから回収し、アマーノヤムのマルチプライム・ラベリング・ システムを用いて標識する。別法として、クローンからｌｎｇのλ−ＤＮＡをパ ーキン・エルマー・シータス由来のシーンアンプ・システムを用いるＰＣＲによ って増幅する。増幅された生成物は、やはり１．３％の低融点アガロースゲル上 で精製し、マルチプライム・システムを用いて標識する。全ＤＮＡプローブとの ブラークハイプリダイゼーンヨンをマニアティス等［Ｕ、Ｂ、ンレンンユタイン およびＨ，Ａ。

エーリッヒ（１９８８）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）、８５．７６５２］の記載に従って実施する。非対照ＰＣ Ｒを使用して挿入物を増幅し、５゛末端配列（長さ４５０ヌクレオチドまで）を ７個のクローンについて決定する。ＮＫＧ２挿入物全体を含んでいるＰｓｔｌフ ラグメントをＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングすることにより、全長のｃＤ ＮＡ配列を決定する。

ＮＫＧ２　ｃＤＮＡプローブ。

ＮＫＧ２　ｃＤＮＡフラグメントをアマーンヤム由来のマルチプライム・システ ムを用いて標識する。標識されたＮＫＧ２　ｃＤＮＡフラグメントをノーサン・ ブｏ＝ｙト・ハイブリダイゼーションおよびプラーク・ハイブリダイゼーション におけるプローブとして使用する。

ノーサン・プロット研究。

ＲＮＡ試料を前記のように単離する。２０％ＴＣＧＦに暴露させた後適当な時点 で細胞を低濃度のＮＰ４０で溶解し、核をベレット化し、水相をフェノール／ク ロロホルムで抽出する。ノーサン分析をＰ　トーマス（１９８０）、プロシーデ ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・１ −　！−７，エイ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）、７７． ５２０１による記載に従って実施する。簡単に述べると、ＲＮＡ試料を変性させ 、ホルムアルデヒド−アガロース変性ゲルに適用する。このＲＮＡを毛管プロッ ティングによってゲルからシーンスクリーン・プラス（デュポン）に移す。プロ ットを１２−１６時間４２℃で前ハイブリダイゼーションする（ＬＭ　ＮａＣ１ ，５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、５Ｘデンハートおよび１％５ ＤＳ）。標識された変性ＤＮＡプローブを、１ｘｌＯ’ｃｐｍ／ｍｌ　（ｃｐｍ ＝１分当りノカウント）ハイブリダイゼーション緩衝液の濃度でプロットに添加 し、ハイブリダイゼーションを４２℃で２４時間継続する。次いでプロットを洗 浄し、オートラジオグラフィーに暴露させる。

標識されたＮＫＧ２　ｃＤＮＡプローブを、変性した鮭精子ＤＮＡ　（３５μｇ ／ｍｌハイブリダイゼーション溶液）と混合し、次いで１−５ｘｌＯ’ｃｐｍ／ ｍ１ハイブリダイゼーション緩衝液の濃度でプロットに添加する。４２℃で一部 ハイブリダイズさせた後、プロットを２ＸＳＳＣ中で室温下に５分間２回洗浄し 、次いで２ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中５０℃で３０分間２回洗浄する。

ササン・プロット・ハイブリダイゼーション。

ゲノムＤＮＡを指定の制限酵素で消化し、消化されたＤＮＡ１０μｇ／列を０゜ ７％アガロースゲル上で電気泳動する。このＤＮＡを、２０ｘＳＳＣを用いる毛 管プロッティングによりニトロセルロース膜に移す。ハイブリダイゼーションお よび洗浄を、Ｊ、Ａ、二クラス等（１９８５）、ヒユーマン・イミュノロジー（ ｆｌｕｍａｎ　Ｉ關曲ｏ１．）１３．９５に記載のように実施する。

ＤＮＡ配列決定。

配列決定用−木端ＤＮＡ　（ジエンシュタインおよびエーリッヒ）を調製するた めに用いられるポリメラーゼ連鎖反応増幅は、最終用量１００μｍ中に、ｌｎｇ λ−ＤＮＡ、５０ｍＭトリス／ＨＣＩ　ｐＨ８，８，１０ｍＭ　ＭｇＣ＋２．１ ０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４，１，５ｍＭの各ｄＮＴＰ　（＝デオキシヌクレオ チド三燐酸）、ＳＰ６ポリメラーゼプロモータープライマー１００モル、Ｔ７ポ リメラーゼプロモータープライマー１ピコモル（共にプロメガより）、およびＴ ａｑポリメラーゼ２．５単位（パーキン・エルマー・シータス）を含有する。試 料は、９４℃での変性１分間、４９℃でのアニーリング２分間、および７２℃で の伸長３分間のサイクルを３５回実施する。増幅の後、ミリポア・ウルトラフリ ー−ＭＣ低結合フィルターユニット（１００００モル重量のカットオフ）を用い て試料を精製する。次に、増幅された試料のおよそ半分をＤＮＡ配列決定に使用 するが、これは、シークエナーゼ（ＵＳＢ）に対して標準プロトコルで実施し、 または二次構造の問題が出現する場合はＴａｑトラック（プロメガ）に対して行 なう。４５０ヌクレオチドまでの長さのＤＮＡ配列がこの方法によって得られる 。シーンバンクおよびＥＭＢＬデータベースとのＤＮＡ配列の比較をインテリジ エネティクス・ファストＤＢプログラムによって実施する。

蛋白に対する抗体の形成。

ａ）ＮＫＧ２−Ｃの１５のＣ末端アミノ酸およびｂ）ＮＫＧ２−Ｃの１５７−１ ７１位の１５のアミノ酸に対応するペプチドを合成する。この後者の配列はレク チンドメインの一部を形成し、表面露出へリックスを構成すると予想される。

両ペプチドはこれらのＮ末端にシスティンを付加して合成し、ＫＬＨと複合体形 成させ、標準法に従って数羽のウサギの免疫に使用する。これらのペプチドに対 して作製された抗体を、ペプチドカラムを介してこのウサギの血清から精製する 。

組み替え蛋白の生成。

昆虫細胞における完全な蛋白の発現。

組み替えＮＫＧ２−Ｃ蛋白を、公表されている方法（インビトロジエン・マニュ アル）に従ってバキュロウィルス系で産生ずる。ＮＫＧ２−ＣｃＤＮＡをｐＶＬ １３９３バキュロウィルス発現ベクター中にクローニングし、Ｓｆ９昆虫細胞を 該プラスミドおよび野生型ウィルスＤＮＡによって同時トランスフェクトさせる 。野生型ウィルスＤＮＡを用いたプラスミドのホモローガスな組み替えによりウ ィルスゲノム中に統合されたＮＫＧ２−ＣＤＮＡを含む組み替えウィルスを、４ 回のプラーク精製によって選択する。感染細胞から得られたフィルターのレプリ カ上に組み替えウィルスの印が付けられる。組み替えウィルスを野生型ウィルス から精製した後、Ｓｆ９細胞の感染を、異なったウィルス対細胞比で実施する。

１％トリトンｘ−ｉｏｏを含有する緩衝液中で感染細胞を溶解させた後に、組み 替えＮＫＧ２−Ｃ蛋白の産生を測定する。同量の蛋白をポリアクリルアミドゲル 上で分離し、この蛋白を電気泳動によってイモピリオン−Ｐ膜に移し、モしてＮ ＫＧ２−Ｃをポリクローナル抗ペプチド抗体を用いるウェスタン・プロットにお けるその反応性によって検出する。野生型ウィルスにのみ感染した対照において は、この方法では生成物は検出されない。ＰＡＧＥにおいて判断された分子量は 、予測された値２６ｋＤと一致する。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）における細胞外ドメインの発現。

ＮＫＧ２−Ｃに対するｃＤＮＡを、細胞外ドメインをコードしている領域の始点 でＢｓ　ｔＮＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断し、このフラグメントをｐＦ ＩａｇｌプラスミドのＥｃｏＲＩサイトにクローニングする。この組み立て物は 、ｏｍｐＡシグナルペプチドの助けを借りて周辺腔にｆ　Ｉ　ａ　ｇ−ＮＫＧ２ −Ｃ融合蛋白の分泌をするよう指令する。ｆｌａｇは、容易な精製の目的のため だけに付加されたアミノ酸８個の標識配列である。細胞に浸透圧ショックを与え た後に得られたＥ、ｃｏｌｉ由来の抽出物を、上記抗体を用いた蛋白移動プロッ トに使用する。抗体と反応するおよそ１７ｋＤの蛋白は、トランスフェクトされ た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来の抽出物には見いだされるが、ＮＫＧ２−Ｃ挿入 物の無い発現ベクターによってトランスフェクトされた平行培養から得られた対 照抽出物には見いだされない。

組み替え蛋白の精製。

トランスフェクトされた細胞の大規模発酵から得られるＳｆ９細胞の溶解によっ て単離された粗製蛋白を、固定相が上に記載の二つの抗ＮＫＧ２−Ｃペプチド抗 体のうち一方に結合している免疫親和カラム上で精製する。次にこのカラムをｐ Ｈ３−４で溶出して所望蛋白をカラムから除去し、そしてこの蛋白を、標準技術 、例えばイオン交換および逆相クロマトグラフィーを用いてさらに精製する。生 成物の純度は５ＤＳ−ＰＡＧＥによって評価することができる。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の発酵由来の粗製蛋白を、市販品を入手し得るフラッグ ペプチドに対するＭＡｂを免疫親和カラム上で使用する同様の方法で、精製する 。溶出した蛋白を、エンテロキナーゼによりフラッグペプチドから特異的に開裂 し、常法により精製する。

（２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ＋１３８７塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎮：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）アンチセンス：無し くｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：１６５．．８６３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： Ｃ人Ａ　ＣＧ入　入為入　ＣＣＴ　入為入　ＧＧＣ入入Ｔ　入λ入　＾ＧＣＴｅ ｅ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＣＴ　Ｇ入為　ＣＡＧ　２V２ Ｇｌｎ　ｋｒｑ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＬｙＳ　Ｓａｒ　 Ｓａｒ　Ｉｌ＠　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇ１ｎ２５　コＯコ５ ゜い　１１＠７ （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の性格； （Ａ）長さ・２３３のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二線状 （ｉ　ｉ）分子の型：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Ｍ＠ｔ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　ＧＩＹ　Ｖａｌ　Ｘ１ｍ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　 Ａｌｐ　Ｌａｕ　＾鰯ｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ？１：ｏ　Ｌｙｓ　 八ｒｇ　Ｇｉｎ　（、ｉｎ　ｋｘｑ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　入Ｉｎ 　ｂｙｓ　５４１ｒ　Ｓａｒ　Ｘｌ＠　kｓｕ 人１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　工１１１　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　入１ａ 　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　Ｌ＠ｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　ＡＬ■ コ５　４０　４５ ｓａｒ　Ｇｉｎ　ＡＬＰ　ｐｈｔ　Ｇｉｒｔ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌｐ　Ｌｙｓ 　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　ｃｙｓ　ｒ、、ｙｓ　入’ｐ　kｓｕ Ｐｒｏ　５ＩＩｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌ＠ｕ工Ｌ＠しＶａ工Ｇ ｌｙ工ｌ＠Ｌ＊ｕ　ｃｌｙ工１＠工１ｍ　Ｃｙｓ６５　７０　７５　＠０ Ｌｅｕ　工１＠　Ｌ＠ｕ　Ｍｔ　Ａｌｍ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　工 Ｘ＠　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｉｌｇ　Ｐｒｏ　５＊ｒ　丁ｈｒＬａｕ　Ｈｌｓ　Ｇｉ ｎ　ｋｒｑ　Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ｓ＠ｒ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｔｈ ｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓｌｏｏ　ｌｏ５　１１０ Ａｌ＆　入ｒｇ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　工Ｌ＠　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　５＋＠ｒ　Ａｓ■ Ｓｉｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　工ｌ＋ａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ 　入ｒ９　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｌａ■ ｌコ０　１コ５　１４０ Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　工１・　八ｓｐ　入ｓｎ　ＧｌｕＧｌｕ　ＧＬｕ　Ｍ ａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ工１ｅ工Ｌｍ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｓｕｒ 　Ｓｕｒ　Ｔｒｐ　Ｘ１＊　ｃｌｙｖａｌ　Ｐｈ＠　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　 Ｓｉｒ　）ｌｉｓ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ 　Ｇｌｙ　Ｌａ■ ＾１ａ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｍｓ　Ｇｌｕ　）ｌｅ　Ｌｙｓ＾ｓｐ　５Ｉｌｒ　Ａ ｓｐ　Ａｓｎ　Ａｉｍ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ１９５　２００　２Ｑ ５ ＾１ａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　入！ｎ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ｅｅｌ’ｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ｓ翌■ ２１０　２工５　２２０ １１ａ　Ｉｌ＠Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　ＣＹｓ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ（２ ）配列番号３の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ＝４０５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニー木端 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）アンチセンス・無し くｘｉ）配列の記載：配列番号３゜ （２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ：３０６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニー木端 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉ　ｉ　ｉ）仮説、無し くｉｖ）アンチセンス・無し くｘｌ）配列の記載；配列番号４・ ＴｋＣＡＴＴＧＧＴ入　λＧＣ；ＡＡＡＧ入入Ｇ　入為Ｃ入為ＧＧＧ入Ａ　ＧＡ Ｇ入Ｇ？ｌ’ＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧ’Ｔ入Ｃ丁丁ＣＧＡ入Ｇ■■メ@ｇ。

（２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ＋１２２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鏑：二本鎖 （Ｄ）トポロジー・線状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉ　ｉ　ｉ）仮説：無し くｉｖ）アンチセンス　無し く１ｘ）特徴・ （Ａ）名称／キー・ＣＤ５ （Ｂ）位置：８．．７００ （ｘｌ）配列の記載：配列番号５゜ 入ＡＧＣＴ＾τＣＣＡ　ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡ　１２２２（２）配列番号 ６の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ＝２３１のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉ　ｉ）分子の型、蛋白 （ｘｉ）配列の記載、配列番号６゜ Ｍａｔ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｓａｔ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　５＠ｒ　ＸＡｕ　入１ａ　Ｇｉｎ　入ｓｐ（２）配列番号７の 情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ＝４０５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖・−木端 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉ　ｉ　ｉ）仮説：無し くｉｖ）アンチセンス：無し くｘｉ）配列の記載：配列番号７： （２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ　１７５５塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖、二本鎖 （Ｄ）トポロジー・線状 （ｉ　ｉ）分子の型・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：無し くｉｖ）アンチセンス：無し くＩＸ）特徴。

（Ａ）名称／キー：　ｃｐｓ （Ｂ）位置：３３９．．９８６ （ｘ　ｉ）配列の記載：配列番号８： （ｘｉ）配列の記載・配列番号９： ）ｌａｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｉｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓａｒ 　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｓａｔ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　５ａ■ Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｈｌｓ　Ａ＄ｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓａｔ　入＊ｐ　ｆ’ｈｓ　Ｓａｗ　Ｔｈ■ ２ｏ　２５　コＯ 入ｒｑ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　入ｒｇ　Ｃｙｓ　ｌ’ｒｏ　Ｖａｌ 　Ｖａｌ　Ｌｙｇ　Ｓａｔ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　入ｒｇ　Ｇｌ■ コ５　４０　、　４５ ＾ｓｎ　入１ａ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　 Ｐｈ−工１・入１ａ　Ｖａ工＾ｌａ　Ｍｔ　Ｇｌｙ１１ｅ　入ｒｇ　Ｐｈａ　工 １・　工ｉｓ　Ｍ＠ｔ　Ｖａｌ　入１ａ　工１ｍ　Ｔｒｐ　Ｓａｒ　λｌａ　Ｖ ａｌ　ＰＭ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ６５　７０　７５　ｆｌ。

ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｉ／ａｌ　Ｇｉｎ　工ｌａ 　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙ@ ８５　、　９０　９５ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｉｌ＠　ｃｙｓ　 Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇ１ｎＰｈ＊　Ｐｈａ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｇ ｉｎ　＾１＄１　Ｓｉｒ　Ｃｙｓ　Ｍａ■ Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　入ｓｎ　入１ａ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　ｖａｌ　 Ｔｙｒ　Ｓｉｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｇｉｎ　入ｓｐ１コ０　１コ５　１ ４０ ｔ＠ｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｈ１ｓτ ｒｐ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｈ１ｓ工１・Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓ＋ ’＋　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓ ｉｒ　ＩＩ＠　Ｌ＠ｕ　Ｓａｔ　Ｐ秩B １６５　１フ０　１７５ ｘｓｎ　Ｌｌｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　工１吐　工ｉｔ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｇｉｎ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｔｙ■ ｌｌｌｏ　１Ｊ５　１９０ 人１ａ　Ｓｉｒ　５ＩＩｒ　ＰＭ　Ｌｙｓ　ＧＡＹ　Ｔｙｒ　Ｉｌａ　Ｇｌｕ　 Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　入１１ｎ　Ｔｈ■ （ｘｌ）配列の記載：配列番号１０゜ （２）配列番号１２の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ：６４５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖ニー木端 （Ｄ）トポログ−二線状 （１１）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮説・無し くｉｖ）アンチセンス：無し くｘｉ）配列の記載・配列番号１２： （２）配列番号１３の情報 （ｉ）配列の性格 （Ａ）長さ、６９３塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖　−木端 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子の型　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉ　ｉ　ｉ）仮説：無し くｉｖ）アンチセンス：無し くｘｉ）配列の記載：配列番号１３： ＴＣＴＴＣ入入ＴＧ入為　Ｔ入τ入ＴＣ入ＴＴＧ　ＴＡＡＧＣＡＴ入λＧ　（Ｔ Ｔ　６９コ（２）配列番号１４の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ二６４８塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎮ニー木端 （Ｄ）トポロジー・線状 （１１）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉ　ｉ　ｉ）仮説、無し くｉｖ）アンチセンス、無し くｘｉ）配列の記載・配列番号１４゜ 入ＴＡＡＴＴＧ　入為入　ＴＧＣＡＧ入入ＧＧ入為　ＡＧＡＣＴＧＴにＣＡ　Ｃ ＴＣＴ入ＴＧＣＣＴ　ＣＧＡＧＣＴＴＴ入＾　入ＧＧＣ丁入囀■sＡ　６００ Ｇ入入＋ＬＡＣＴＧＴ’ｒ　ＣＡＡＣＴＣＣ入入入　ＴＡ入為Ｔ＾ＣＡＴＣＴＧ ＣＡＴＧＣ入入λ　ＧＧ入為ＴＧＴＧ　６４Ｂ（２）配列番号１５の情報 （ｉ）配列の性格 （Ａ）長さ・１３３３塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖　−木端 （Ｄ）トポロジー・線状 （Ｉ］）分子の型　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説；無し くｉｖ）アンチセンス：無し くｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：１６５．．８０９ （ｘ　ｉ）配列の記載：配列番号１５：（２）配列番号１６の情報 （ｉ）配列の性格 （Ａ）長さ・２１５のアミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （１１）分子の型、蛋白 （ｘｉ）配列の記載　配列番号１６ Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　工ｉｓ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　ＣｙｓＬａｕ　工１ｍ　Ｌ ａｕ　Ｍａｔ　入１ｍ　Ｓａｔ　Ｖａｌ　ＶａＬ　Ｔｈｒ　工ｌ＠　ＶＩＬＬ　 Ｖａｌ　工ｌｅａ　Ｐｒｏ　Ｓｕｒ＾１Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　ｃｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　工１ｍ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ａｓ ｎ　５ｌｌｒ　ＣＹr ｌｏｏ　１０５　１１０ ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ｃｌｕ　Ａｒｇ　入ｒｇ　Ｔｈｒ　 Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　入１ｍＣｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓ ａｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｈｌｓ　Ａ ｓｐ　八ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ１コｏ　１コ５　１４０ Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｉｌ＠　Ｚｌ＠　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　 Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　工１ｍ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＰｈａＬｙｓ　１４ｉｓ　 Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ａｌｐ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　 Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｌｍ　Ｖａ■ ｌ！１０　１１１５　１９０ （２）配列番号１７の情報 （ｉ）配列の性格・ （Ａ）長さ：１３５のアミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｉ　ｉ）分子の型：蛋白 （ｉ　ｉ　ｉ）仮説　無し く１ｖ）アンチセンス：無し くＶ）フラグメントの型：Ｃ末端 （ｘｉ）配列の記載・配列番号１７・ Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｌｍ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５ Ｃｙ＊　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　λＳｎ　Ｓａｒ　５ｌｌｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ 　Ｓａｒ　工１ａ　Ａｓｐ　入ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌ■ Ｈａｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　５唸ｒ工１ａ　Ｘ１＠Ｓｍｒ　Ｐｒｏ　Ｓａ ｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ工ｌ＠　ＧＩＹ　Ｖａｌ　Ｐｈａ６５　７０　７５　１ｌ１ ０Ａｒ　Ａｓｎ　Ｓｉｒ　Ｓａｒ　Ｈｉｓ　）Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａ１ 丁ｈｒ　Ｍｅｔ＾Ｓｎ　ＧＩＹ　Ｌａｕ＾Ｌａ　ｔｈｅ＠５　９０　９５ Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　 Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｌｍ　Ｖａｌｌｏｏ　１０５　１ １０ Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ａｌａ　 （ｔｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｕｒ　Ｓｅｒ　工１・　Ｅｌ■ Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｌ＠ｕ（２）配列番号１８ の情報 （１）配列の性格： （Ａ）長さ・１０２のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　線状 （ｊｉ）分子の型・蛋白 （ｉ　ｉ　ｉ）仮説　無し くｉｖ）アンチセンス：無し くｖ）フラグメントの型、Ｃ末端 （ｘｌ）配列の記載・配列番号１８゜ Ｔｙｒ　工１ａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　入ｒ９　丁ｈｒ　丁ｒｐ　 Ｇｌｕ　にｌｕ　５ａｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｌｍ　ＣｙｓＬ　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ｓｅｘ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　 Ｘｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　）ｌｅ■ ２ｏ　２５　コ０ Ｌｙｓ　Ｐｈ＠Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｉｌａ　Ｉｌａ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｓ ａｒ　Ｔｒｐ工ｌ＠　ＧＡＹ　ＶａＬ　Ｐｈｔλ；ｑコ５　４０　４５ Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｈｉｓ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｐｈ＠　ＬｙｓＨ１ｓ　Ｇｌｕ　Ｉ ｌ＠　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　ｋｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａ ｓｎ　Ｃｙｓ　、＾、ｌａ　ＶａＬ　Ｌ■■ ＧＬｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｓｉｒ　ＡＬａ　Ｇｌｎ　 Ｃｙｓ　ＧＬｙ　５ｅｒ　Ｓｕｒ　Ｚｌ＊工１ｍ　’１ｒ（２）配列番号１９の 情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ：１３５のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー；線状 （ｉ　ｉ）分子の型・蛋白 （ｊｊＤ仮説：無し くｉｖ）アンチセンス：無し くＶ）フラグメントの型・Ｃ末端 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１９゜ （２）配列番号２０の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ、１３４のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉ　ｉ）分子の型・蛋白 （ｉ　ｉ　ｉ）仮説：無し くＸ】）配列の記載、配列番号２１ Ｈａｌｔ　Ａｓｐ　Ａｍｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　工１ｍ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ 　入ｓｐ　Ｌａｕ　Ａｍｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　＾１■ １ｓ　ｘｏ　１５ （ｉｖ）アンチセンス：無し くＶ）フラグメントの型二〇末端 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２２・ 八ｒｑ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｈｊ、ｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ 　Ｔｈｒ　Ｍ＠ｔ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　入Ｌａ　Ｐｈ■ （２）配列番号２３の情報 （Ａ）長さ　２３１のアミノ酸 （ｉ　ｉ　ｉ）仮説　無し くｉｖ）アンチセンス：無し くｖ）フラグメントの型：Ｃ末端 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２３： Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ｓ＠ｒ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｋ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　八ｓｐ１　５　’　１０　 １５ Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ工１＊　５ｅｒ２０　２５　コ０ ａｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｃｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　ＶａＩ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　）ｌｉｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ 　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　入ｓｐ　ｃｙｔ、Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ｔａ■ Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧＷ　Ｌｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ｇ ｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　工１ａ　工１ｅ−Ｃｙｓ６５　７０　７５　！ １０ 工１億　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｈｅ仁　Ａｌａ　丁ｈ【　Ｖａｌ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　 Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｖａｌ　Ｉ−＠１１　Ｘｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐ■■ Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　５ｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　入ｓｎ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　＾ｒｑ１ｆｉｓ　ｃｙｓ　 ｃｌｙ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　工１−　Ｔｈｒ　 Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙ■ Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　工ｉｔ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　 Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＣＹＳ　入１ｍ　Ｖａ１Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖ ａｌ　入ｓｎ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ｓ＠ｒ　５＊ｒ　Ｈａ仁　１１ｅ（２）配列番号２４の情報 （ｉ）配列の性格： （Ａ）長さ＝２１６のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉ　ｉ）分子の型：蛋白 （ｉｉＤ仮説：無し くｉｖ）アンチセンス：無し くＶ）フラグメントの型・Ｃ末端 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２４゜ Ｍ＠ｔ　ｃｌｙ　Ｔｒｐ　Ｘ１＠　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　 Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｓ＠ｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｍ＠ｔ　５ｉｒＧｌｕ　Ｐｈａ　Ｈ ｌｓ　入ｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｍｐ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓａ ｒ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｓａｒ　τｈｒ人ｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ 　Ａｒｑ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ 　Ａｒｇ　Ｇｌｕ図１ コード化領域 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　 Ｕ　９２８４−４ＣＡＢＢ　Ｄ　９２８４−４Ｃ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４Ｂ ／／　Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　尾部　登志雄 東京都板橋区高島平１丁目５６番３号　サニーヒルズ高島平２０１号 （７２）発明者　マツクシエリ−、シンシア・エムアメリカ合衆国５５３６９ミ ネソタ州メイプル・グローブ、ティンバー・フレスト・ドライブ６６７６番 Ｉ （７２）発明者　バッハ、フリマツ・エイチアメリカ合衆国１０５３８ニューヨ ーク州、ターチモント、ペイ・アベニュー７番 （７２）発明者　ホーフェル、エルハルトオーストリア国アー−１２３０ヴイエ ナ、ルドルフ・ツエター・ガッセ４８／３０番

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞において翻訳される、本明細書中（ａ） ＮＫＧ２−Ａ１、（ｂ）ＮＫＧ２−Ｂ１、（ｃ）ＮＫＧ２−Ｃ１および（ｄ）Ｎ ＫＧ２−Ｄ１（１＝フラグメント）と呼称される貫膜蛋白の細胞外部分をコード している単離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列であって、（ａ）番号４５８ない し８６３（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番号１に示されるＤＮＡ 配列の一部分（＝配列番号３に示される配列の全体）；または、 （ｂ）番号５０３ないし８６３（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番 号１に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号４に示される配列の全体）；ま たは、 （ｃ）番号２９６ないし７００（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番 号５に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号７に示される配列の全体）；ま たは、 （ｄ）番号５８５ないし９８６（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番 号８に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号１０に示される配列の全体）、 （ｅ）上記（ａ）−（ｄ）のいずれかによりコードされるのと同一のアミノ酸配 列をコードし；そして／または、緊縮条件下で上記（ａ）−（ｄ）のいずれかと ハイプリダイズし；そして／または、上記（ａ）−（ｄ）のいずれかのＤＮＡ配 列と８０ないし１００％の相同性を有する、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列、より成 る群から選ばれるＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列。
2. ２．ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞において翻訳される、本明細書中ａａ） ＮＫＧ２−Ａ、ｂｂ）ＮＫＧ２−Ｂ、ｃｃ）ＮＫＧ２−Ｃおよびｄｄ）ＮＫＧ２ −Ｄと呼称される完全な貫膜蛋白をコードしている単離されたＤＮＡまたはｃＤ ＮＡ配列であって、 ａａ）番号１６５ないし８６３（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番 号１に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号１１に示される配列の全体）； または、 ｂｂ）番号１６５ないし８６３（この数を含む）のヌクレオチドからなり、番号 ４４９ないし５０２のヌクレオチドが欠失している、配列番号１に示されるＤＮ Ａ配列の一部分（＝配列番号１２に示される配列の全体）；または、ｃｃ）番号 ８ないし７００（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番号５に示される ＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号１３に示される配列の全体）；または、 ｄｄ）番号３３９ないし９８６（この数を含む）のヌクレオチドからなる配列番 号８に示されるＤＮＡ配列の一部分（＝配列番号１４に示される配列の全体）ま たは、 ｅｅ）上記ａａ）−ｄｄ）のいずれかによりコードされるのと同一のアミノ酸配 列をコードし；そして／または、緊縮条件下で上記ａａ）−ｄｄ）のいずれかと ハイブリダイズし；そして／または、上記ａａ）−ｄｄ）のいずれかのＤＮＡ配 列と８０ないし１００％の相同性を有する、単離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ配 列、 より成る群から選はれるＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列。
3. ３．ａ′）番号９９ないし２２３のアミノ酸からなる配列番号１および２のアミ ノ酸配列の一部分（＝配列番号１７のアミノ酸配列の全体）；または、ｂ′）番 号１１４ないし２３３のアミノ酸からなる配列番号１のアミノ酸配列の一部分（ ＝配列番号１８のアミノ酸配列の全体）；または、ｃ′）番号９７ないし２３１ のアミノ酸からなる配列番号５のアミノ酸配列の一部分（＝配列番号１９のアミ ノ酸配列の全体）；または、ｄ′）番号８３ないし２１６のアミノ酸からなる配 列番号９のアミノ酸配列の一部分（＝配列番号２０のアミノ酸配列の全体）；ま たは、ｅ′）ここに定義される上記いずれかの配列変異体、より成る群から選ば れるアミノ酸配列を有する、ａ′）ＮＫＧ２−Ａ１、ｂ′）ＮＫＧ２−Ｂ１、ｃ ′）ＮＫＧ２−Ｃ１およびｄ′）ＮＫＧ２−Ｄ１と呼称される、貫膜蛋白の単離 された細胞外部分。
4. ４．ａａ′）配列番号２（または配列番号２１）のアミノ酸配列；または、ｂｂ ′）番号９６ないし１１３のアミノ酸が欠失している配列番号２（または配列番 号２２）のアミノ酸配列；または、ｃｃ′）配列番号６（または配列番号２３） のアミノ酸配列；または、ｄｄ′）配列番号８（または配列番号２４）のアミノ 酸配列、または、ｅｅ′）ここに定義される上記いずれかの配列変異体、より成 る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、ａａ′）ＮＫＧ２−Ａ、ｂｂ′）ＮＫ Ｇ２−Ｂ、ｃｃ′）ＮＫＧ２−Ｃおよびｄｄ′）ＮＫＧ２−Ｄと呼称される単離 された完全な貫膜蛋白。
5. ５．請求項３または４に記載の蛋白の少なくとも一つのエピトープを認識するポ リクローナルまたはモノクローナル抗体。
6. ６．ａ）請求項３または４に記載の蛋白の少なくとも一つのエピトープ、および 、ｂ）癌−またはウイルスー特異的抗原を認識する二価抗体。
7. ７．請求項６に記載の二価抗体の有効用量を投与することによる、係る処置を必 要とする人間における癌またはウイルス感染の処置。
8. ８．細胞障害性蛋白に連結させた請求項３に記載の蛋白からなるキメラ蛋白分子 。
9. ９．請求項８に記載のキメラ蛋白の有効用量を投与することによる、係る処置を 必要とする人間における癌またはウイルス感染の処置。
10. １０．ａ）処置されるべき患者からＮＫ細胞を除去し、ｂ）この細胞をインビト ロで請求項２に記載のＤＮＡ配列によって形質転換し、そして、ｃ）この形質転 換された細胞を患者に再注射する工程からなる、係る処置を必要とする人間にお ける癌またはウイルス感染の処置方法。