JPH06502301A - 安定タンパク質コアに結合されたタンパク質ポリリガンド - Google Patents

安定タンパク質コアに結合されたタンパク質ポリリガンド

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JPH06502301A JP3516620A JP51662091A JPH06502301A JP H06502301 A JPH06502301 A JP H06502301A JP 3516620 A JP3516620 A JP 3516620A JP 51662091 A JP51662091 A JP 51662091A JP H06502301 A JPH06502301 A JP H06502301A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 安定タンパク質コアに結合されたタンパク質ポリリガンド関連出願に対するクロ スリファレンス この出ＩＲＥ、１９９０年８月２３日に出願された出願番号第５７５．３９４号 の一部継続出願である。
序論 技術分野 本出願の分野は、生理学的に活性なタンパク質性ポリリガンドである。
背景 曙乳須細胞の多くの活性は、表面膜タンパク質レセプターへのリガンドの結合に より制御される。従って、ＤＮＡ複製及び細胞増殖、分化、成熟、ホーミング、 代謝、ニューロンシグナル及び多くの機能的能力は、細胞上に存在する表面膜レ セプターへの１又は複数のリガンドの結合及びこの結合の結果としてのシグナル のトランスダクションの結果である。いくつかの情況において、たとえば癌性細 胞が自己分泌反応のために増殖する癌の場合、シグナルトランスダクションの阻 害への興味が存在する。他の情況、たとえば同種移植片拒絶において、それは、 拒絶されるべき移植片を主要部分において引き起こす外来性物質としての移植片 のＣＤ４及びＣＤ８Ｔ−細胞による初期認識である。同様に、同種免疫骨髄は移 植片対宿主疾患を生じ、ここで同種免疫Ｔ−細胞か骨髄移植物に含まれ、又は自 己免疫疾患がＴ−細胞を包含する（ここでＴ−細胞増殖の阻害か所望される）。
利用できるリガンドに対する細胞応答を調節することを所望する多（の例が存在 する。時々、リガンド誘発されたシグナルトランスダクションを阻害し、又はそ の効果を無効にすることか所望される。
この方向における努力はモノクローナル抗体を使用し、動物モデルにおける免疫 システムの調節に関しては、文献において多くの報告が存在する。たとえば、イ ンターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２１？）に対する抗体の使用が報告され ている。モノクローナル抗体標的レセプターがまた、ヒトにおいて使用されてお り、ここでＩＬ−２Ｒに対して向けられたブロッキング抗体は同種移植片拒絶工 程を阻害することか示された。５ｏｕｌｉｌｌｏｎなと、　、　Ｌａｎｃｅｔ、 　（１９８７）、　１　：１３３９〜１３４２　；５ｏｕｌｉｌｌｏｎなど、　 、　Ｎ、　Ｅ、　Ｊ、　Ｍ、　、　（１９９０）３２２：１１７５〜１１８１． このアプローチの利点は、ＩＬ−２Ｒがドナー抗原により活性化された移植片受 容体リンパ球上に発現されるが、しかし静止リンパ球（ドナー抗原に対して遺伝 的に言明されていない）上に発現しないことである。
大部分、ヒトの処置に使用される試薬は、膜レセプターに対して向けられたモノ クローナル抗体の結合フラグメント（Ｆａｂ又は（Ｆａｂ’　）ｚ）　、又はキ メラ性又は人体適応化されたモノクローナル抗体である。これらの試薬は、イン ビボにおいていくつかの欠点、すなわちリガンド自体に比較して比較的低い親和 性、通常まったくないか又は低いエフェクター機能（補体−及び抗体−依存性細 胞毒性）を有し、又はさらに、それらのタンパク質が外来性である限り、それら はイソタイプ又はイジオタイプ決定基に対して宿主抗体の合成を誘発することで ある。“人体適応化された′抗体はたぶん、抗イソタイプの出現を回避するが、 しかし後でブロッキング抗体として作用する抗イジオタイブ抗体の出現を回避し ないであろう。さらに、いくつかの独立的なキノクローナル抗体か、交差反応性 の可能性ある不在のために、動物モデルにおいて得られるヒト実験結果における 再現性の適切な機会を付与するために必要とされる。
従って、生理学的機能を阻害し、又は細胞毒性の仲介体として作用するように使 用され得る生物試薬を供給することに実質的な興味か存在する。
関連文献 Ｂａｃｈａなど、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６７；６１２〜６２１（１９８８ ）はＩＬ−２及びジフテリア毒素の融合により調製された試薬を報告し、そして Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｎ＋−Ｇａｌｓｋｉ　Ｈ，など、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ 　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５　：１９２Q〜 １９２６、１９８８）は、プソイドモナス毒素と１シー２との融合を報告する。
これらの試薬は、ｒＬ−２Ｒ結合部位に高い親和性で結合し、そして細胞毒素効 果を有することが示された。Ｔｒａｕｎｅｃｂｅｒなど、、Ｎａｔｕｒｅ　３３ ９：発明の要約 一定種、特にヒトにおいて生理学的に天然に存在する化合物から製造され得る“ シトムライン（ｃｙｔｏｒｎｕＨｎｅｓ）”が供給され、ここで前記シトムライ ンは、個々のＮ−及び／又はＣ−末端を育する、天然において一緒に結合される 多くの鎖を有することによって特徴づけられ、前記側々の鎖は天然に存在するリ ガンドの少なくとも一部に融合により拡張される。特に、　１ｇＭ分子の切断さ れたμ鎖はリガンドの少なくとも結合部分に融合され、ここで前記リガンドはＮ −末端又はＣ−末端領域を提供する。得られるオリゴマー化合物は、生理学的効 果を仲介する。そのような効果は次のようなものを包含する二 （１）問題のリガンドのための表面膜レセプターを担持する細胞におけるシグナ ルトランスダクションの阻害；及び（２）（１）に記載されるような細胞上での 補体−依存性細胞毒性の仲介。この場合、補体結合Ｈｊ！は、“ヒト適合化され た″毒素として挙動するであろう。
図面の簡単な説明 図１はハイブリッドＩＬ２Ｍｕ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号ｌ）及びコー ドされたアミノ酸配列（配列番号２）である。実験セクションに論ぜられるＳａ ｌ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位が示される。
図２は、多くの異なった融合タンパク質により示されるようなＣＴＬＬ２増殖の グラフである。
図３は、多くの異なった融合タンパク質のためのＣ′依存性細胞毒性のグラフで ある。
特定態様の記載 天然に存在する表面膜タンパク質レセプターに結合するリガンドの少なくとも一 部の相補的末端へのそれらのＮ−又はＣ−末端での天然に存在するポリサブユニ ットタンパク質の鎖の融合を含んで成る新規組成物か供給される。これらの融合 タンパク質は、“シトムライン″として言及される。得られた生成物は、天然に 存在するレセプターへの結合のための多くの結合部位を有する。さらに、天然に 存在するポリサブユニットタンパク質を使用することによって、融合の結果とし ての変性されたサブユニットは、そのユニットをアセンブルし、そして所望する ポリサブユニットアセンブリーを提供するために適切な宿主生物において適切に 処理され得る。特に興味ある代表的なポリサブユニットタンパク質は、　ＩｇＭ のμ鎖である。
本発明の組成物は、次の式： ％式％） 〔式中、Ｌは天然に存在するリガンドに特異的結合できるリガンド又はそのフラ グメントであり；Ｓυは直接的に一緒に又は中心コアを通して一緒に結合され得 る、ポリサブユニットタンパク質のサブユニットであり：そしてｎは少なくとも ２、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも６であり、そして１０ 又はそれ以上であり、通常１６よりも大きくなく、より通常には１０よりも大き くない〕により特徴づけられる。
ポリサブユニットタンパク質は次の特徴を有するであろう＝（１）それは少なく とも２つの鎖又はサブユニット、好ましくは少なくとも約４本の鎖、より好まし くは少なくとも約６本の鎖を存するであろう。（２）それは、宿主生物における ポリサブユニットタンパク質のアセンブリーを妨害しないで、Ｎ−又はＣ−末端 で配列に結合され得るであろう。所望には、ポリサブユニットタンパク質の一部 のみが使用され得る。従って、　ＩｇＭμｍ鎖のためには、たとえばＬ＃Ｉとの 相互作用を担当するＨ＠ドメインが除去され得る。
（３）場合によっては、それはエフェクター機能を有するであろう。
これらの特徴は、　ＩｇＭ又は他の天然に存在するポリユニットタンパク質、又 は変性されたタンパク質のμ鎖により示され、ここで前記変性されたタンパク質 においては、システィンが二量体又はそれよりも高いオーダーの分子の鎖中に導 入され、そして次にこのシスティンは、より高いオーダーのオリゴマーを形成す るためにインビ上ｏで一緒に結合される。そのようなタンパク質の例は、ＭＨＣ 抗原、免疫グロブリンスーパーファミリーの種々のメンバー、β−ガラクトシダ ーゼ、等である。μ鎖は、１０本のＨ＠を有するオリゴマー、通常デカマーを形 成することができる。しかしながら、Ｊコアを有するか又は育さないＨ及びＬｊ ｌの適切な使用により、Ｌ、　Ｈ又は同順は、リガンド結合実体への融合のため に使用され得る。
新規の融合生成物において所望される機能を提供するようなそのようなμＨ鎖の 部分が保持されるであろう。従って、ドメインＣＨ２〜ＣＨ，が融合生成物に保 持される場合（ミッシングするドメインＣＨの一部又はすべてを伴って）、後者 は、補体を結合する二とかできる新規の融合生成物の集合体のための適切な情報 を含む。
対象の広範囲の種類のリガンドのいづれかが、本発明において使用され得る。す でに、レセプターに結合し、そしてそれらの生理学的活性のために興味あるもの であるリガンドをコードする遺伝子の配列に関する多くの文献が存在する。これ らのリガンドは、インターロイキン１〜７、特に１．　２．　３及び４のような タンパク質：サイトカイン、たとえば形質転換増殖因子−α及び−β、腫瘍壊死 因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、単球−コロニー刺激因子、顆粒球− コロニー刺激因子、顆粒球、エリトロポエチン、繊維芽細胞増殖因子、幹細胞増 殖因子、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、等：インターフェロン−α、− β及び−γ：インシュリン、ソマトメジン、ソマトトロピン、コリオゴナドトロ ピン及び同様のものを包含する。さらに、主な組織適合性複合体抗原結合配列が リガンドとして作用することができる。
大部分、完全なリガンドを使用することが便利である。しかしながら、多くの場 合、所望する生理学的効果を生成するために十分なレベルの結合を付与するリガ ンドの一部又はその拡張部のみを使用することが所望される。これは、リガンド の大きさく結合するリガンドの部分は知られていても又はいなくても）、その活 性に対するサブユニットへの配列の融合の効果及び同様のものに依存して、場合 次第で変化するであろう。多くの場合、通常約２５個のアミノ酸よ１　りも少な いであろう、結合ユニットにより分子の２つの活性部分を融合することができる 。これらのアミノ酸は、融合部位でより高い親水性又は疎水性を可能にし、結合 実体への接近性を提供し、又は同様のものの種々の機能を提供することができる 。他方、１又は複（、数の変異誘発、たとえば置換、欠失又は挿入、通常３個よ りも多くない変異誘発が導入され得る。たとえば、μ鎖の配列におけるいくつか の変性は、補体結合能力を変性することができる。リガンドは、切断された鎖の Ｃ−又はＮ−末端に結合される場合、高い親和性を有することが可能である。こ の情況において、その対応するリガンドは、適切な末端に結合されるであろう。
本発明の組成物は、（１）本発明の組成物をコードする融合遺伝子の構成により 調製され得る。この目的のためには、本発明の分子の２つの部分のための既知の 遺伝子が使用される。又は、本発明の組成物は、（２）融合遺伝子の細胞におけ る発現により調製され得る。従って、免疫グロブリン融合の場合、免疫グロブリ ン鎖（Ｈ及び／又はＬ［）をコードする遺伝子が、可変領域及び所望１こは第１ の不変領域をコードするそれらの配列を免れ得る。通常、融合遺伝子に存在する 遺伝子配列は、不変領域の第２の部分をコードするものを包含するであろう。結 合実体及びポリサブユニットタンパク質、又は融合生成物に保持されるそれらの タンパク質の一部をコードする配列の囲りに適切な制限酵素部位を導入すること によって、正しい読み取り枠に配列を一緒に結合するための手段が生成され得る 。
得られる融合配列は、その融合遺伝子が発現され得るように、開始コドンを担持 するであろう。その２つの配列は、ＰＣＲ１組換え又は同様の手段を用いて、連 結により一緒にされ得る。そのような技法の使用を記載する報告は、文献に多く 存在する。融合分子の２つの部分か結合される特定の態様は本発明において臨界 ではなく、そして使用される特定の構築ブロックに依存して変化するであろう。
遺伝子の種々の操作は、適切なりローニングベクターにおいて実施され得、ここ でクローニング、単離及び複製の高い効率を提供する容易に入手できるそのよう な多くのベクターか存在する。それらのベクターは、ＰＢＲ３２２、ｐＵＣシク ーズ及びそれらの誘導体により例示され得る。クローニングベクターは、適切な 復製システム、選択のためのマーカー、通常】又は複数の抗生物質制限遺伝子及 びｌ又は複数のポリリンカー（クローンされる配列の導入及び切断の容易さを可 能にする）を存することによって特徴づけられるであろう。
個々の段階の後、配列の組込みは、制限酵素地図、配列決定又は目標の手段１； より調べられ得る。
二量体タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、元来コードされるタンパク質に存 在しない単一のシスティンをコードするようにＣ−近位アミノ酸をコードする領 域におけるインビトロ変異誘発により変性されるであろう。そのようなシスティ ンは、内部ジスルフィド結合を形成することかできないはずである。たとえば、 Ｍ）ＩＣ分子、特にクラス■分子を選択することにより、α−及びβ−鎖をコー ドする遺伝子がシスティンコドンを導入するように変異誘発され得る。
これらの変異誘発された遺伝子から発現されるタンパク質においては、その導入 されたシスティンは、単−鎖内で又は単−ＭＨＣ分子のα−及びβ−鎖間に分子 内ジスルフィド架橋を形成しないであろう。
アセンブリーは、適切な化学変性によりチオール基を活性化することによってイ ンビトロで達成され得る。
活性化されたチオール基は次に、オリゴマーを形成するために分子間ジスルフィ ド架橋と反応するであろう。オリゴマーの調節された結合及び形成のための他の 技法がまた使用され得る。
多くの場合、同じオリゴマーに異なったリガンドを存することか所望される。標 的細胞かレセプターの組合せ（この組合せは他の細胞とは異なる）を育する場合 、混合されたりガントオリゴマーの高い結合活性が高い選択性を提供するであろ う。そのような情況の例は、刺激された細胞に比較して静止細胞、たとえばリン パ球、内皮細胞等、前駆体細胞及び成熟又はより分化された細胞、正常細胞及び 悪性細胞及び同様のものを包含する。
融合遺伝子が調製された後すぐに、それは、発現カセットを作成するために適切 な発現ベクター中に挿入され得る。多くの場合、融合された遺伝子自体は、翻訳 の開始及び停止のための必要なシグナルを担持するであろう（これが事実でない 場合、それらのシグナルは融合遺伝子に付加されるであろう）。
転写及びＲＮＡプロセッシング（キャビング、スプライシング、ポリアデニル化 等）の開始のためのシグナルは、発現ベクターにより供給され得る。
発現／カセットは、転写及び翻訳開始領域及び転写及び翻訳停止領域を含むであ ろう。転写開始領域は、ＲＭＡポリメラーゼ■プロモーター、転写開始部位、場 合によってはエンハンサ−１多くの場合、誘発可能な転写を提供する配列及び適 切な他の機能的配列を含むであろう。翻訳のためには、通常、開始及び停止シグ ナルか融合遺伝子により担持され、そして融合遺伝子を製造するために使用され る天然に存在する遺伝子により担持されるものを表わす。多くの場合、翻訳の効 率を高めるためにそれらの配列の変異か行われ得る。
転写停止領域は、ボリアデルニ化部位及び停止配列を提供する。
発現カセットは、それが宿主に保持され得るような種々の手段で適切な宿主細胞 中に形質転換され得る。他方、それは、発現カセットか宿主のゲノム中に安定し て組込まれるであろう条件下で宿主中に形質転換され得る。いづれの場合におい ても、それは、それを含む宿主の選択のためのマーカーを通常有するであろう。
従って、抗生物質耐性、たとえば０４１８に対して耐性を付与する耐ネオマイシ ン性遺伝子が使用され得る。
発現カセット及びマーカーは、宿主における染色体外維持のための複製システム と共に結合され得る。大部分、哺乳類複製システムは、哺乳類細胞を感染するウ ィルス、たとえばパピローマウィルス、アデノウィルス、ＳＶ４０、ワクシニア ウィルス又は同様のウィルスから得られるであろう。発現カセットの挿入のため にそれらの複製システム、ｌ又は複数のマーカー及びポリリンカーを含む多くの ベクターが入手できる 宿主細胞の形質転換は、便利な技法、たとえばエレクトロポレーシヨン、リン酸 カルシウム沈殿ＤＮＡ、トランスフェクション、プロトプラストの使用又は同様 の技法により達成され得る。哺乳類細胞宿主を形質転換する方法は、文献におい て良く知られており、そして本明細書においては例示する必要はない。
正常又は悪性のいづれかである種々の哺乳類宿主細胞か使用され得る。細胞は、 グリコジル化によるμ又は他の鎖のプロセッシングが興味の対象であるかとうか に依存して、リンパ球、特にＢ−リンパ球又は非リンパ球であり得る。３Ｍコー ド遺伝子を発現する非分泌性骨髄腫細胞系はまた、μ鎖かポリユニットタンパク 質コアである場合に使用され得る。μ鎖の同時発現は、μ鎖ポリユニットによる 補体結合のために必要とされないか、しかしそれを高めることができ、そして大 きな複量体種の形成を促進することができる。適切な宿主中への形質転換の後、 細胞は従来の場合において増殖せしめられ、ここでμ鎖及びリガンドを含む融合 タンパク質か発現され、そしてμ鎖のデカマーを形成するためにアセンブルされ 、合計１０個のリガンドが供給される。この態様において、ＬＨは必要とされな い。使用される宿主細胞は、Ｈ又はμ鎖のいづれも生成すべきでない。
多くの場合、分泌によるアセンブルされた分子のプロセッシングを可能にするシ グナル配列か提供される。シグナル配列は、リガンドに対して天然のものであり 、ポリサブユニットタンパク質に対して天然のものであり、又は両者に対して外 来性のものである。シグナル配列を使用する場合、シグナル配列が除去され、又 はリガンド結合を妨害しないように注意が払われるべきである。シグナル配列の 除去は、細胞内又は細胞外があり得る。分泌が得られる場合、アセンブリーは、 種々のオーダーのオリゴマーを供給することかできる。オリゴマーは、オリゴマ ーのサブユニットの数を高めるためにインビトロで、たとえば酸化又はチオール 活性化（ジスルフィド架橋が包含される）により変性され得る。
本発明の方法論は、いづれかの哺乳類宿主、特に霊長類、より特定にはヒト及び 家畜、たとえばネズミ、ウシ、ヤギ、羊、犬、ネコ、ウマ、ウサギ等に使用され 得る。
発現された生成物は、宿主細胞の溶解、上滑液からの単離、タンパク質の抽出、 電気泳動を用いての精製、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又は同 様の手段により単離され得る。精製された生成物は次に、治療剤としての使用の ために種々の手順で配合され得る。本発明の生成物は、種々の生理学的に許容で きる媒体、たとえば脱イオン水、塩溶液、リン酸緩衝溶液、水性エタノール又は 同様のものにおいて配合され得る。対象化合物の濃度は一般的に、投与量レベル 、生成物の効率、投与の性質、投与の目的及び同様のものに依存して、約０．０ １−１００＋［１Ｍの範囲であろう。一般的に、類似する理由のために、投与量 は広く変化し、約１９ｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ宿主の範囲であろう。
本発明の化合物はまた、インビトロでの細胞の研究、細胞の混合物から特定の細 胞を除去するための泳動、刺激を強め、又は阻害し、そしてその刺激に関与する 方法を分析するために細胞を刺激することに及び同様のことに使用され得る。混 合されたりガントか関与する場合、両レセプターか、拡張された同時結合の効果 が研究され得るように、同時に結合される高い可能性が存在する。
本発明の化合物は、複雑なレセプターリガンドのインターナリセーションを阻害 することによってそのレセプターへのリガンド結合により生成されるシグナルを ブロックし、そして／又は補体仲介細胞毒性又は他のエフェクター機能、たとえ ば抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）又は同様のものにより標的細胞を殺害するこ とかできる。
この場合、広範囲の積項の出来事、たとえば前糸分裂、分化、ホーミング、刺激 及び同様のものが調製され得る。従って、Ｔ−及び／又はＢ−細胞の増殖を妨げ ることによって免疫応答を阻害でき、又はＭＨＣ抗原に結合することによってＴ −細胞の刺激を妨げることか実験 例１ ヒト免疫グロブリンμＨ鎖の全不変領域をコードする配列を含むクローン化され たｃＤＮＡフラグメントが、次のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ Ｒ）増幅のための鋳型として使用される：配列番号３： １　）　５　’　−ＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣ Ｃ−３’配列番号４： ２）　５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧ−３’ これは、ＢａｍＨＩ切断部位とＸｂａ　Ｉ切断部位との間を溶解する、Ｃｕ２− Ｃμ４領域をコードする配列を含むＤＮＡフラグメントの生成を導びく。適切な 配列（ＤＮＡの１つの鎖のみか示される）は次のものである： 配列番号５： ５　’　−ＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　 ＣＣＴＨａ研ローＴ−Ｔ−７ＶＴ’−Ｔ７Ｔ丁Ｆ−１ｇＭ −ＧＣＴ　ＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡ　ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧ−３’下τ τで了−−１＝ このフラグメントは、ＢａｍＨＩ及びＸｂａ　Ｉにより切断され、そしてプラス ミドＰＫＣＲαのＢａｍＨＩとＸｂａ　Ｉ部位との間に挿入される。得られる組 換えプラスミド（ｐＭｕ）を、Ｅ、コリ株ＸＬ・１中で形質転換し、そして定常 期まで拡張され、そして２　ＸＴＹ培地において増殖される形質転換された宿主 の選択のために選択培地において前記細胞を増殖せしめる。次に、細胞を収穫し 、そして生成物を単離し、そして標準塩化セシウム密度グラジェント技法により 精製する。Ｊｕｒｋａｔ細胞からの全ＲＮＡを、プライマーとしてオリゴｄＴを 用いて逆転写のための鋳型として使用する。得られるｃＤＮＡの混合物を、次の プライマーを用いてＰＣＲ増殖のための鋳型として使用する：配列番号６： １　）５　’　−ＣＧＴＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧ−３ ’配列番号７： ２　）５　’　−ＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣ− ３’これは、５ａｌＩ（Ｎ−末端）及びＢａｍＨＩ　（Ｃ−末端）のための切断 部位間を溶解する、ヒトＩＬ−２をコードする配列を含むＤＮＡフラ配列（１本 鎖のみが示される）・ 配列番号８： ５　’　−ＣＧＴＣＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＡＧＧ・・・ ゴ「丁　ｒｒ’Ｆｒ Ｃ−末端アミノ酸 “リンカ−“領域は、ＢａｍＨＩ切断部位配列（ＧＧＡＴＣＣ）によりコートび ポリアデニル化シグナルを用いて、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターカリを用い て溶解し、細胞残骸を有さないタンパク質生成物を単離ＩＬ２と交差反応性であ るので、本発明の組成物の活性をラットにおいて示す。標的細胞を、補体の仲介 により殺害する。
版された“Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ、第２版”ニレ−ジョン液と共にバイアルに入れ、モしてβカウ ンターを用いて、放射能を測定した。
結果及び論議 断配列に結合された。第２プライマーはＩＬ２のカルボキシ末端アミノ酸をコー ドする配列に相補的であり、そしてＢａｍＨＩのための切断配列に結合された。
この場合、ＩＬ２をコードするＳａｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメントを得、そ して停止ゴドンがＢａｍＨＩ部位により置換された。
もう１つの組の実験においては、ヒト免疫グロブリンｍｕＨ４ｌをコードする部 分的ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。使用される１つのプラ イマーは、ＣＨ２ドメインの最初のアミノ酸をコードする配列に対応し、そして ＢａｍＨｒ切断配列に結合された。他のプライマーは、免疫グロブリンのカルボ キシ末端をコードする配列に相補的であり、そしてＸｂａ　Ｉ切断配列に結合さ れる。この場合、ＣＨ２−ＣＨ４ドメインをコードするＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ　 １フラグメントを得た。
２つのＰＣＲ生成物を、それらのＢａｍＨＩ配列を通して組合し、ハイブリッド ｃＤＮＡを生成した。その配列は図１に示される。そのｃＤＮＡは、マルチマー を形成し、［１２レセプターに結合し、そして補体を活性化できる分泌された４ ８３個のアミノ酸融合タンパク質（ＩＬ２−Ｍｕ）の生成を特定するのに必要な 情報のすべてを担持すべきである。ｃＤＮＡの変異形はまた、免疫グロブリンコ ード配列内に含まれるＢｓｔＥ　Ｉフラグメント（図１を参照のこと）の方向を 逆にすることによって生成された。このｃＤＮＡは、ＣＨ２ドメインの一部及び ＣＨ３及びＣＨ４ドメインのすべてを欠く切断された２２１個のアミノ酸融合タ ンパク質（ＩＬ２Ｕｍ） をコードし、そして従って、［Ｌ２レセプターに結合する能力を保持しながら、 マルチマーを形成し又は補体を結合することはできない。
融合タンパク質の発現 ハイブリッドｃＤＮＡを、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターの制御下で箕核発現 ベクターｐＫＣＲａ中に導入した。ＣＯ５−１細胞を、その得られたプラスミド 又はｐＫＣＲαによりトランスフェクトし、そして分泌されたタンパク質を分析 のために収穫した。これらのタンパク質を、抗−１ｇＭ樹脂を用いてアフィニテ ィークロマトグラフィー処理にゆだねた。結合されたタンパク質を溶離し、そし て還元条件下でＳＯ３−ＰＡＧＥにより分析した。ＩＬ　２　Ｍｕ及びｒＬ　２ 　Ｕｍ　ｃＤＮＡを用いての実験からのアフィニティー精製されたタンパク質の この分析は、それぞれ６４ＫＤａ及び３９ＫＤａのタンパク質の検出を可能にし た。ｐＫＣＲαベクターがトランスフェクシタンのために使用される場合、いづ れのタンパク質も検出されなかった。
ＩＬ　２　Ｍｕ及びｒＬ２Ｕｍの両者は細胞増殖を刺激する。
ハイブリッドｃＤＮＡがｒＬ　２　Ｍｕ又は［Ｌ２ＵＩＯのいづれがを生成する ために使用され得ることを示した後、それらのタンパク質がＩＬ２レセプターに 結合するかとうかを決定することが所望された。このために、融合タンパク質を 、ｆＬ２依存性ネズミＴ−細胞系ＣＴＩ、−Ｌ２及びレクチン活性化ヒトＴリン パ球の増殖を促進するそれらの能力について試験した。“空の”発現ベクター１ １ＫＣＲαによりトランスフェクトされた細胞からの上清液とは異なって、［Ｌ 　２　Ｍｕ又はＩＬ２Ｕｍ発現ベクターによりトランスフェクトされたＣＯ５− １細胞からの上溝液は、ネズミ及びヒト活性化Ｔ−細胞の両者の増殖を特異的に 誘発した。
ＩＬ２Ｕｍ結合ではなく、ＩＬ２Ｍｕは補体誘発性細胞毒性を導びく。（図２及 び３；個々の融合タンパク質の２つの異なった調製物が試験される。） 次の研究においては、結合された融合タンパク質が高い親和性のｒＬ２レセプタ ーを発現するリンパ球に対して特異的な補体誘発性殺害をもたらすために使用さ れ得るかどうかを決定した。このために、５１　ＣｒラベルされたＣＴＬ−Ｌ　 ２リンパ球を、試験される試薬と共にインキュベートした（ＩＬ２Ｍｕ及びＩＬ ２Ｕｍ発現ベクター又はｐＫＣＲαベクターによりトランスフェクトされたＣＯ ５−１細胞からの上清液。）ウサギ補体を４５分後に添加し、そしてその細胞を ３７°Ｃてさらに１時間インキュベートした。次に、開放されるＳＩＣ「の量を 評価し、そして特定細胞溶解の百分率を計算した。ＣＬＴ−Ｌ２細胞の有意な溶 解を、ｒＬ　２　Ｍｕ含有上溝液及びウサギ補体と共にインキュベートした後に 観察し、さらに、補体のみにより誘発された細胞の殺害は、ＩＬ　２１Ｊｍ含有 上溝液及びウサギ補体が使用される場合、見出されなかった。
この現象は、ＩＬ２−レセプター陰性細胞系（たとえばＤＡ−１ａマウス細胞） が同じアッセイ条件下で殺害されないように、投与量依存性及び特異性であった 。
上記方法に従って、ＩＬ２リガンドをコードする配列を、いづれか他のリガンド をコードする配列により置換することができる。いくつかの情況において、鎖の いくつかが１つのレセプターのためのりガントを含み、そして他の鎖が異なった レセプターのためのリガンドを含む場合、混合された組成物を可能にすることが 所望される。
選択されたレセプターか、標的１０が特定クラスの細胞に制限されるように、特 定クラスの細胞に対して特異的であるような混合された組成物が適用され得る。
さらに、融合タンパク質は、ヒト受容体からのいづれかの免疫応答を起こさせな い独得な利点を有し、ここでその両成分は天然のヒト起源のものである。従って 、本発明の組成物は、免疫システムにより不活性されないで、しかも免疫応答を 誘発もしないで、くり返して投与され得る。
本発明の化合物は、広範囲の種類の生理学的工程を阻害するための独得な方法論 を提供することは上記から明らかである。従って、マルチ−リガンド化合物が多 くの表面膜タンパク質レセプターに結合することができ、そしてこの態様におい て、リガンドのインターナリゼーションを妨害し、シグナル誘発を妨げ、又は補 体仲介により標的細胞を殺害することができる。この態様において、多（の方法 が哺乳類宿主の予防又は治療処置のために調整され得る。
単独で又は他の薬物と共に本発明の組成物を用いることによって、種々の状態、 たとえば移植片拒絶、自己免疫疾患、移植片ＶＳ、宿主疾患及び腫瘍が処理され 得る。
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、本発明か関与する当業者 のレベルを示すものである。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明細 書に組込まれる。
本発明は現在、十分に記載されて来たが、当業者により、本発明の範囲内で変更 及び修飾を行なうことができることが明らかであろ配列の列挙 （１）一般情報 （１）出願者：　５ｏｕｌｉｌｌｏｕ、　Ｊｅａｎ−Ｐａｕｌ（云）発明の名称 二安定タンパク質コアに結合されたタンノくり質ポリリガンド （ｉｉ）配列の数：１Ｉ （１ｖ）通信住所： （Ａ）住所：　Ｃｏｏｌｅｙ　Ｇｏｄｗａｒｄ　Ｃａ５ｔｒｏ　１（ｕｄｄｌｅ ｓｏｎ　＆　Ｔａｔｕｍ（Ｂ）通り：　５　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ　５ｑｕａｒｅ 、５ｕｉｔｅ　４００（Ｃ）町：　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔ。
（Ｄ）州：　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ （Ｅ）国：　ＬＩＳＡ （Ｆ）　ＺＩＰ　：　９４３０６ （Ｖ）コンピューター読取りフオーム；（Ａ）メジウム型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システ ム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ　−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：　Ｐａｔｅｎｔｌ ｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃　１．０゜Ｖｅｒｓｌｏｎ　＃１．２５ （ｖｉ）現在の出願臼： （Ａ）出願番号＋　ＵＳＯ７／６４６．８７５（Ｂ）出願臼：　２８−　ＪＡＮ −１９９１（Ｃ）分類： （ＶＩＩ）優先出願口： （Ａ）出願番号：　ＵＳＯ７１５７５，３９４（Ｂ）出願臼：　２３−　ＡｔＪ Ｇ−１９９０（ｖｉ　）アトニー／エージェントの情報（Ａ）名称：　Ｒｏｗｌ ａｎｄ　Ｐｈ、Ｄ、、Ｂｅｒｔｒａｔｎ　Ｉ　。
（Ｂ）登録番号：２０．０１５ （Ｃ）参照／ドケット番号：　ＡＴＬＡ−００１１０ＩＵＳ（Ｌｘ）電信情報： （Ａ）電話：　４１５−４９４−７６２２（Ｂ）テレファックス：　４１５−８ ５７−０６６３（２）配列番号ｌの情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ＋　１５４０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｊｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位ｇ／ｌ：　１７．、１５２８ （ｘｉ）配列：配列番号１： ＧＴＣＧＡＣＴＣＣＴ　ＧＣＣＡＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＡＧＧ　ＡＴＧ　ＣＡＡ 　ＣＴＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＧＣＡＴＴ　ＧＣＡ　４９Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ 　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　ＡｌａＣＴＡ　 ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＣＴｒ　ＧＴＣＡＣＡ　ＭＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＣＴ 　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　９７Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ ｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＣＡ Ａ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　’ＩＴＡ　Ｃ ＡＧ　ＡＴf　１４５ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＭｅｔＡＴＴ　ＴＴＧ　Ａ ＡＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＡＴ　ＣＣＣＡＡＡ 　ＣＴＣＡＣＣＡＧＧ　ＡＴＧ　１９３１１ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌ ｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈ ｒ　Ａｒｇ　ＭｅｔＣＴＣＡＣＡ　ｍ　ＭＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣＡＴＧ　ＣＣＣＡ ＡＧ　ＡＡＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＭＡ　ＣＡＴ　２４１Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　 Ａｌａ　Ｔ１１ｒ　Ｇｆｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉ■ ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＡＡＡ　Ｃ ＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＧＧＡＡ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　２W９ Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＴｒＡ　ＧＣＴ　Ｃ ＡＡ　ＡＧＣＡＡＡ　ＡＡＣｍ　ＣＡＣＴｒＡ　ＡＧＡ　ＣＣＣＡＧＧ　ＧＡＣ ＴＴＡ　ＡＴＣＡＧＣ３３７Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ 　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ 　５ｅｒＡＡＴ　ＡＴＣＡＡＣＧＴＡ　ＡＴＡ　ＧＴＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＴ Ａ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣ，ｌ　ＴＴＣ３W５ Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｖａｌ、　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈ■ ＋１０　１１５　１２０ ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　 ＡＣＣＡＴＴ　ＧＴＡ　ＧＭ　ｍ　ＣＴＧ　ＡＡＣ４３３Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌ ｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　、ＡＩａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ■ ］　２５　１３０　１３５ ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＡＣＣｍ　ＴＧＴ　ＣＡＡ　ＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣ Ａ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣ４８１Ａｒｇ　Ｔｒｐ　ｌｉｅ　 Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧＴＧ　ＡＴＴＧＣＴＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＣＴ ＣＣＣＭＡＧＴＧ　ＡＧＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣＣＡ　ＣＣＣＣＧＣ５２９Ｖａ ｌ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅ ｒ　Ｖａｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ＋６０　１６５　１７０ ＧＡＣＧＧＣＴｒＣＴｒＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＡＡＧ　ＴＣＣＡＡＧ　Ｃ ＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＣＣ５７７Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ目ｅ　Ｃｙｓ　 Ｇｉｎ　Ａｌａ１７５　１８０　＋８５ ＡＣＧ　ＧＧＴ　ＴｒＣＡＧＴ　ＣＣＣＣＧＧ　ＣＡＧ　ＡＴｒ　ＣＡＧ　ＧＴ ＧＴＣＣＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣＧＡＧ　ＧＧＧ　６２５Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈ ｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ｌｉｅ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ｓｅｒ　Ｔｒ ｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ＋９０　１９５　２００ ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＧＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＧ　ＧＡＣ ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣ６７３Ｌｙｓ　（：ｄｎ　Ｖａ ｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｖａ ｌ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌ■ ２０５　２＋０　２１５ ＭＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＣＣＣＡＣＧ　ＡＣＣＴＡＣＡＡＧ　ＧＴＧ　 ＡＣＣＡＧＣＡＣＡ　ＣＴＧ　ＡＣＣＡＴＣ７２１Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅＡＡＡ　ＧＡＧ　ＡＧＣＧＡＣＴＧＧ　ＣＴＣＡ ＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧ　ＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＧＴＧ　ＧＡＴ　７６９Ｌ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｍ ｅｔ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＡｓｐＣＡＣＡＧＧ　ＧＧＣ ＣＴＧ　ＡＣＣＴｒＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＣＧ　ＴＣＣＴＣＣＡＴＧ　 ＴＧＴ　ＧＴＣＣＣＣ８１７Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ 　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ 　Ｐｒ。
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Ａｒｇ　Ｇｌｎ　ｌｉｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｌｙ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。
Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＰｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ１１ｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｌ ａ　ｒｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈ ｅ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ 　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ｒｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　 Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＨｉｓ　Ｔｈｒ　Ａ ｓｎ　ｒｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔ ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａ１Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ｓｅｒ　Ｉｌ ｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｕ　Ａｒｇ　ＰｈｅＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ 　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ １１ｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＩｌｅＭｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｉ ｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　、Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌ■ Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　ＩＩｅＬｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖ ａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＶａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌ ｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ 　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ（２）配列 番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二重鎖状 （ｉｉ）配列の種類二合成りＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号３： ＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧ　ＡｎＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣ２８（２）配列番 号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二重鎖状 （ｉｉ）配列の種層コ合成りＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号４： ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧ　ＴＣＡＧＴＡＧＣＡＧ　ＧＴＧＣＣＡＧ　２７（２）配 列番号５の情報： （ｉ）配列の特ｙ１： （Ａ）長さ＝７個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二重鎖状 （ｉｉ）配列の種類・ペプチド （Ｘｌ）配列：配列番号５： Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。
（２）配列番号６の情報： Ｎ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｉｉの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類二合成りＮＡ （政）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：１．．１５ （ｘｉ）配列：配列番号６： ＧＣＴ　ＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＡ　ＧＡＧ　２８Ａｌａ 　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ（２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号７： Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ（２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年２月）＞日

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. １．共有結合された少なくとも２つのサブユニットを含んで成る組成物であって 、前記サブユニットが天然に存在するレセプターに結合できる天然に存在するペ プチド配列の少なくとも一部に融合される、天然に存在するポリ（サブユニット ）タンパク質の少なくとも一部を含んで成り、ここで前記天然に存在するサブユ ニットの一部が発現に基づいて、細胞宿主において自然にアセンブルすることを 特徴とする組成物。
  2. ２．前記サブユニットが免疫グロブリンサブユニットである請求の範囲第１項記 載の組成物。
  3. ３．前記免疫グロブリンサブユニットがμ鎖である請求の範囲第２項記載の組成 物。
  4. ４．前記サブユニットがジスルフィド架橋により結合される請求の範囲第１項記 載の組成物。
  5. ５．前記レセプターが表面膜タンパク質である請求の範囲第１項記載の組成物。
  6. ６．前記サブユニットがμ鎖であり、そしてレセプターインターナリゼージョン の封鎖により、その対応するレセプターへの結合の後、シグナル伝達の阻害を仲 介する請求の範囲第１項記載の組成物。
  7. ７．前記サブユニットがμ鎖であり、そして補体依存性殺害又はｌｇの不変部分 のエフェクター機能を仲介し、そして特異的レセプターを担持する細胞に対して 細胞毒性である請求の範囲第１項記載の組成物。
  8. ８．天然に存在するレセプターに結合することができる１以上の天然に存在する ペプチド配列が存在する請求の範囲第１項記載の組成物。
  9. ９．前記レセプターがホルモン又はサイトカインに結合する請求の範囲第１項記 載の組成物。
  10. １０．請求の範囲第１項記載の組成物をコードするＤＮＡ配列。
  11. １１．細胞宿主の選択のために少なくとも１つの安定複製システム又はマーカー に結合される請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ配列。
  12. １２．前記天然に存在するサブユニットが免疫グロブリンサブユニットである請 求の範囲第１１項記載のＤＮＡ配列。
  13. １３．転写開始領域及び転写停止領域に結合され、そしてそれらの転写及び翻訳 調節下で請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ配列を含んで成る発現カセット。
  14. １４．請求の範囲第１３項記載のＤＮＡ配列を含んで成る細胞宿主。
  15. １５．天然に存在するレセプターに結合できる天然に存在するペプチド配列の少 なくとも一部に融合される、天然に存在するポリ（サブユニット）タンパク質の 少なくとも一部（ここで前記天然に存在するサブユニットの一部が発現に基づい て、細胞宿主において自然にアセンブルする）を含んで成る、共有結合された少 なく一とも２つのサブユニットを含んで成る組成物の製造方法であって、適切な 栄養培地において請求の範囲第１４項記載の細胞宿主を増殖し、それによって前 記組成物が発現され；そして前記組成物を単離することを含んで成る方法。
  16. １６．細胞内シグナルの調節を阻害するための方法であって、ここで前記シグナ ルが細胞上の表面膜タンパク質レセプターへのリガンドの結合に起因し： 前記表面膜タンパク質レセプターを含んで成る細胞を含んで成る細胞組成物と、 天然に存在するレセプターに結合できる天然に存在するペプチド配列の少なくと も一部に融合される、天然に４在するポリ（サブユニット）タンパク質の少なく とも一部（ここで前記天然に存在するサブユニットの一部が発現に基づいて、細 胞宿主において自然にアセンブルする）を含んで成る、共有結合された少なくと も２つのサブユニットを含んで成る組成物とを組合すことを含んで成る方法。
  17. １７．前記天然に存在するポリ（サブユニット）タンパク質が免疫グロブリンサ ブユニットである請求の範囲第１６項記載の方法。
  18. １８．標的細胞の増殖を阻害するために宿主を処理するための方法であって： 請求の範囲第１項記載の組成物を前記宿主に投与し、ここで前記天然に存在する サブユニット及び前記天然に存在するペプチドの配列が前記宿主の生来の配列に 実質的に相同であり、それによって前記組成物が前記標的細胞に結合し、そして 増殖を阻害することを含んで成る方法。
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