ES2210514T3 - Conjugados citomoduladores de miembros de pares de union especificos. - Google Patents

Conjugados citomoduladores de miembros de pares de union especificos.

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Abstract

SE APORTAN UNOS NOVEDOSOS CONJUGADOS QUE CONSTAN DE UN NUCLEO CENTRAL CAPAZ DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE A UNA CELULA DIANA UNIDA A UN NUCLEO SELECTIVO PARA UNIRSE A UN AGENTE EFECTOR ENDOGENO, CAPAZ DE OCASIONAR INACTIVACION CELULAR O CITOTOXICIDAD. ALGUNOS EJEMPLOS DE CONJUGADOS SON UN LIGANDO PARA UNA PROTEINA DE LA MEMBRANA DE SUPERFICIE, P. EJ. EL RECEPTOR IL UNIDO UN EPITOPO AL} ENTE CIERTAS CELULAS ASOCIADAS A UN PROCESO PATOGENO.

Description

Conjugados citomoduladores de miembros de pares de unión específicos.
Campo técnico
El campo de esta invención es la terapéutica que emplea compuestos citomoduladores.
Antecedentes
El sistema inmunitario es la principal defensa contra una amplia variedad de enfermedades. Sin embargo, en muchas situaciones, el sistema inmunitario parece ser incapaz de proteger al anfitrión de la enfermedad, o es aberrante y ataca al anfitrión, al ser incapaz de distinguir entre lo propio y lo ajeno. En ambas situaciones, hay interés en ser capaz de modular el sistema inmunitario, activando el sistema inmunitario hacia una diana particular o inactivando el sistema inmunitario para evitar el ataque de una diana.
En gran medida, el éxito en la prevención del ataque del sistema inmunitario ha dependido de la inhibición o supresión total del sistema inmunitario. En esta situación, el anfitrión se vuelve vulnerable a una amplia variedad de infecciones oportunistas. Por lo tanto, aunque se consigue un objetivo, se debe proteger al anfitrión contra patógenos, lo que puede tener como resultado periodos prolongados de hospitalización, mantenimiento con antibióticos con los efectos secundarios resultantes y similares. Por contraste, se cree que el sistema inmunitario es capaz normalmente de proteger al anfitrión de la oncogénesis. Sin embargo, la incidencia sustancial del cáncer es la prueba de la incapacidad del sistema inmunitario para mantener una vigilancia perfecta. En esta situación, hay interés en ser capaz de activar el sistema inmunitario para incrementar su capacidad de atacar células cancerosas.
Por lo tanto, hay interés en proporcionar terapias que pueden ser específicas para activar células particulares para que se dirijan hacia una diana específica, o inactivar células específicas que están dirigidas hacia una diana específica. De esta forma, se pueden activar o inactivar selectivamente miembros del sistema inmunitario para conseguir un objetivo terapéutico.
Bibliografía relacionada
Lorberbaum et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:16311-7 describe una IL-2 modificada con polietilenglicol. Batra et al. (1990), ibídem, 265:15198-202 describe una proteína de fusión que comprende un anticuerpo de cadena única. Garrido et al. (1990) Cancer Res. 50:4227-32 describe anticuerpos biespecíficos para marcar linfocitos T humanos. Pullen et al. (1990) Cell 61:1365-74, describe la región de la cadena beta del receptor de células T que interacciona con el auto-superantígeno Mls.1A. Garrido et al. (1990) J. Immunol 144:2891-8 describe células citotóxicas marcadas. Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50:1495-502 describe un anticuerpo humanizado para el receptor de IL-2. Schroeder et al. (1990) Transplantation 49:48-51 describe la formación de anticuerpo antimurino después de terapia con OKT3. Kaplan y Mazed (1989) Int. J. Artif. Organs 12:79-804 describe la eliminación in vitro de anticuerpos anti-A y anti-B con oligosacáridos sintéticos. Se puede encontrar una reseña de los antígenos de los grupos sanguíneos en FEMS Microbiol. Immunol. (1989) 1:321-30.
Ochi et al. (1993) J. Immunol. 151:3180-3186 describe el uso de un conjugado de los conjugados de anticuerpo SEB-anti-tumor para la inmunoterapia tumoral.
Sumario de la invención
Se usan conjugados de fracciones de unión selectivas para modular la respuesta inmunitaria. Los conjugados, denominados "complexinas", comprenden una primera fracción que se une a una diana, normalmente un receptor celular unido a la membrana de una célula o una molécula soluble, particularmente en la circulación, y una segunda fracción que se une a un agente efector endógeno del anfitrión, que proporciona la citomodulación, normalmente citotoxicidad. La complexina se administra al anfitrión en cantidades suficientes para proporcionar el efecto profiláctico o terapéutico deseado.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra indicios de que se puede demostrar la presencia de complexina y anticuerpos anti-FITC en la superficie celular de células P815, analizadas mediante citometría de flujo sin anticuerpos en la superficie (pico sin tinción), con la adición de F(ab')_{2}ATG-FITC (pico F/P 1), o tras el marcado indirecto de los anticuerpos anti-FITC de conejo con una inmunoglobulina anti-conejo de cabra biotinilada y FITC unido a estreptavidina (pico oscuro).
La Figura 2A y Figura 2B muestran datos de que los anticuerpos anti-FITC unidos a la superficie celular por medio de complexina inducen la lisis en presencia del complemento. La Figura 2A ilustra que no hay efecto del complemento sobre las dos poblaciones en ausencia de anticuerpos anti-FITC. La Figura 2B ilustra que una vez que la complexina de la superficie celular se ha unido a los anticuerpos anti-FITC en presencia del complemento hay lisis de la población marcada, como se pone de manifiesto por la desaparición de la población teñida.
La Figura 3A y Figura 3B muestran que se puede demostrar la presencia de complexina sobre células in vivo. La Figura 3A muestra LSPs separados de la sangre de ratones antes de la inyección de 250 \mug de F(ab')_{2}ATG-FITC, y la Figura 3B muestra LSPs separados de la sangre de ratones 6 hrs después de la inyección de 250 \mug de F(ab')_{2}ATG-FITC. Las células se tiñeron con anti-CD3-PE para identificar la población de células T.
La Figura 4 demuestra que los anticuerpos anti-FITC se pueden detectar circulando en el ratón mucho tiempo después de su inyección. Se inyectó 1 mg de anticuerpos anti-FITC de conejo a cinco ratones (líneas continuas, un símbolo diferente para cada ratón), y 48 hrs después se extrajo sangre y se analizó la presencia de anticuerpos de conejo mediante ELISA. Se usó suero de un conejo inmunizado con BSA-FITC (líneas punteadas, 12/28/93) como control positivo.
La Figura 5A y Figura 5B son gráficos que demuestran que la administración de complexina a ratones transfundidos con anticuerpos anti-FITC conduce a la disminución de LSPs y células T circulantes. Se trataron tres grupos de cinco ratones como sigue: Grp 1 recibió 1 mg de anticuerpos anti-FITC a tiempo 0 y 200 \mul de PBS 24 hrs más tarde. Grp2 recibió PBS y después 250 \mug de F(ab')_{2}ATG-FITC. Los ratones de Grp 3 se transfundieron con 1 mg de anticuerpos anti-FITC a tiempo 0, y 250 \mug de F(ab')_{2}ATG-FITC 24 hrs más tarde. La Figura 5A muestra el número de LSPs circulantes y la Figura 5B muestra el número de células T 24 hrs tras la última inyección.
Figura 6: Las dosis bajas de complexina son efectivas para reducir la población de células CD3+. Dos grupos de cinco ratones recibieron 250 \mug de anticuerpos anti-FITC purificados i.v.. El número de células CD3+ circulantes se evaluó 24 horas después. Estos datos se compararon con el número de células CD3+ tras la inyección de 250 ó 30 \mug de F(ab')_{2}ATG-FITC (t=48 horas; media y desviación estándar mostradas aquí). Se probó que la dosis baja de complexina es tan efectiva como la dosis alta para eliminar la población de células diana.
Figura 7: La complexina elimina células in vivo igual que las terapias convencionales. Para comparar la eficacia del tratamiento con complexina en el modelo en cuestión con los métodos convencionales de reducción celular, se administraron dosis equivalentes de complexina y ATG. Los ratones de Grp 1 recibieron 250 \mug de anticuerpos anti-FITC a t=1 y 50 \mug de F(ab')_{2}ATG a t=24 hrs. A los ratones de Grp 2 se les inyectó la misma dosis de anticuerpos anti-FITC a t=0, y 50 \mug de F(ab')_{2}ATG-FITC a t=24 hrs. Los ratones de Grp 3 recibieron solamente 50 \mug de ATG a t=24 hrs. El número de LSPs circulantes (media y desviación estándar) a t=48 hrs se representa aquí. No hubo diferencia medible entre la disminución en el número de células después de la administración de complexina (Grp 2) y la administración de ATG (Grp 3: p<=0,05, Scheffe ANOVA).
Descripción de las realizaciones especificas
Se proporcionan composiciones para el tratamiento terapéutico de un anfitrión, en el que se modula la acción del sistema inmunitario para proporcionar un efecto profiláctico o terapéutico. El método emplea un conjugado que tiene dos fracciones que tienen actividad fisiológica. Una fracción proporciona la unión a una diana sobre una célula diana o una molécula soluble, particularmente en circulación. La otra fracción proporciona la interacción con un miembro del sistema inmunitario, por medio del cual los agentes endógenos proporcionan el efecto profiláctico o terapéutico. Los conjugados pueden ser el resultado de la unión química, covalente o no covalente, o una proteína de fusión por medio de ingeniería genética. Así, los componentes de la complexina pueden mantenerse unidos por medio de un puente sintético, un puente peptídico, una membrana, p.ej. liposoma, polímero o partícula, etc.
Los conjugados se llaman "complexinas", ya que dan como resultado la formación de complejos con miembros del sistema inmunitario, que proporcionan la modulación de la actividad de una célula diana. Administrando las complexinas a un anfitrión, las complexinas se unirán a un epítopo diana, normalmente una proteína de membrana de superficie de una célula diana o una molécula soluble que tiene efectos fisiológicos adversos, a la vez que se une también a un agente efector endógeno presente en el anfitrión. El agente efector endógeno da como resultado una ruta endógena para la inactivación o eliminación de la diana del anfitrión. En gran medida, se obtiene citotoxicidad en las células, por medio de la cual se destruye una célula diana. En el caso de las moléculas, se forman complejos que se eliminan.
La fracción que se une al receptor de la célula diana o la molécula soluble puede ser cualquiera de una amplia variedad de moléculas, que incluyen inmunoglobulinas, sus fragmentos, que incluyen cadenas pesadas, cadenas ligeras, Fab, F(ab')_{2}, Fc, monoclonales o policlonales, y similares; anticuerpos antiidiotipo, que simulan un ligando; ligandos para receptores de membrana de superficie o sus fragmentos, tales como las interleucinas 1-16, particularmente -2, -4 y -6, o folato, que se une a receptores de alta afinidad expresados a un nivel elevado en muchas células tumorales; moléculas que se unen a proteínas de membrana de superficie de diferenciación de grupos, tales como CD3, -4, -5, -8, -10, -15, -19, -69, etc.; factores de crecimiento, tales como el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento tumoral, (TGF), factor de necrosis tumoral (TNF), interferones, etc.; moléculas que se unen a cualquiera de los miembros del receptor de células T, las subunidades de T_{i} o T_{3}; sIg; moléculas que se unen a agentes infecciosos, etc.; moléculas que se unen a LPS, u otro marcador celular patogénico; moléculas que se unen a receptores bacterianos, etc.; en el caso de trasplante de órganos, moléculas HLA o sus fragmentos derivados de los antígenos HLA del donante, particularmente la región variable, mientras que para trasplantes de médula ósea las moléculas HLA serán de los antígenos del receptor, etc.
Las moléculas orgánicas pequeñas que se unen específicamente al receptor de la célula diana o la molécula soluble son de interés como fracción de unión. Tales moléculas tienen generalmente un peso molecular de más de 100 y de menos de alrededor de 5000 daltons, y comprenden grupos funcionales que interaccionan estructuralmente con las proteínas, particularmente por medio de enlaces de hidrógeno, e incluyen típicamente al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Tales moléculas comprenden a menudo estructuras carbocíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Se obtienen de una amplia variedad de fuentes, que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles o se producen fácilmente. Además, las bibliotecas y compuestos producidos natural o sintéticamente se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y se pueden usar para producir bibliotecas combinatorias. Véase, por ejemplo, Seelig et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:358-363; y Vaughan et al. (1996) Xenotransplantation 3:18-23.
Para dianas de moléculas solubles se pueden usar diversas fracciones de unión de alta afinidad por las moléculas solubles, tales como anticuerpos, mono- o policlonales, sus fragmentos, p.ej., Fab, Fv, F(ab')_{2}, etc., anticuerpos modificados, p.ej. anticuerpos de ratón humanizados o similares, lectinas, enzimas, receptores de proteínas de membrana superficiales, u otra entidad de unión específica. Las dianas pueden incluir interleucinas y citocinas, p.ej. IL-2 y -6, TNF-\alpha, etc., toxinas bacterianas, anticuerpos autoinmunes, hormonas, p.ej. estrógenos, etc.
La otra fracción del conjugado es un miembro selectivo, en el que el miembro se une directa o indirectamente de forma selectiva a un sistema efector, que comprende uno o más agentes efectores endógenos del anfitrión. Mediante endógeno se quiere decir un agente que está presente de forma natural o que se puede administrar o inducir sin peligro en el anfitrión, p.ej. anticuerpos, para poder reaccionar con los miembros selectivos. Son de interés los anticuerpos que se encuentran comúnmente en niveles altos, tales como los anticuerpos específicos para el epítopo \alpha-galactosilo. El miembro selectivo puede ser un antígeno hacia el que el anfitrión ha sido sensibilizado previamente o hacia el cual el anfitrión tiene anticuerpos naturales, para tener células de memoria y/o anticuerpos solubles específicos en la corriente sanguínea, tales como antígenos de oligosacárido A o B, antígenos de vacuna (inmunógenos) que encuentran anticuerpos debidos a una respuesta inmune anterior, p.ej. antitoxina de difteria o tétanos, hemaglutinina del virus de la gripe, antígeno HBs, anticuerpos del virus de la polio, virus de la rubéola o virus del sarampión, tales como anticuerpos hacia ADN, ARN o ribonucleoproteína. El miembro selectivo para una respuesta de células T puede ser tuberculina, VIH, particularmente gp120, un superantígeno, tal como las toxinas derivadas de estafilococo u otras bacterias, p.ej., SEC1, SEA, SEB, ExFT, TSST1, Mls, o antígenos de histocompatibilidad menor de las células de mamíferos. Los superantígenos se unen a una proporción sustancial de las cadenas V\beta del receptor de las células T, Ti. En todos los casos, se pueden usar diversos grupos que proporcionan la misma función, p.ej. unión. Son de interés los anticuerpos antiidiotipo o sus regiones variables, que imitarán la fracción selectiva o se unirán a los anticuerpos presentes en el anfitrión. Los anticuerpos pueden interaccionar con los miembros de la cascada del complemento u otro agente citotóxico, p.ej. CCDA, para destruir la célula diana, o el miembro selectivo se puede unir a una célula T que proporciona una función citotóxica.
El miembro selectivo es el anticuerpo anti-\alpha-galactosilo. Se ha informado que este anticuerpo está en niveles del 1% del porcentaje total de IgG en la sangre humana. Véase Galili et al. (1985) J. Exp. Med. 162:573-582; Galili et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1369-1373; y Galili et al. (1993) Blood 82:2485-2493. El ligando para el anticuerpo es el epítopo Gal \alpha1-3 Gal \beta-1-4 GlcNAc-R, denominado epítopo \alpha-galactosilo. Respecto a "epítopo galactosilo", se quiere decir cualquier compuesto que se une específicamente a un anticuerpo específico para \alpha-galactosilo, que incluye los compuestos miméticos derivados combinatoriamente (véase Vaughan et al., anteriormente). El epítopo se ha conjugado con perlas (Chembiomed, Edmonton Alberta), se puede sintetizar fácilmente y se puede conjugar de forma convencional con la fracción que se une a la célula diana. Debido a que subclases de IgG participan en la cascada del complemento y CCDA, la unión del epítopo \alpha-gal a la fracción de unión de la célula diana da como resultado la citotoxicidad de la célula diana al unirse el conjugado de complexina a la célula diana. Por ejemplo, el epítopo \alpha-galactosilo se puede conjugar a folato, que se une a células tumorales con alta eficacia. Al inyectar una complexina que tiene el epítopo \alpha-gal, la complexina se unirá a la diana y también al anticuerpo de \alpha-gal. Si el miembro diana es una célula, el anticuerpo \alpha-gal iniciará la cascada del complemento o mediará la CCDA, dando como resultado la lisis de la célula diana. Si la diana es una molécula soluble, el inmunocomplejo que comprende al anticuerpo \alpha-gal dará como resultado la eliminación de la molécula diana.
Los miembros del conjugado pueden ser polipéptidos, sacáridos, lípidos, ácidos nucleicos o moléculas orgánicas naturales o sintéticas distintas de las moléculas ya descritas. Los miembros del conjugado se pueden unir directamente o a través de un puente de no más de alrededor de 50 miembros en la cadena, normalmente no más de alrededor de 20 miembros en la cadena, en donde los miembros de la cadena pueden ser carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares. Así, se pueden usar diversas técnicas para unir los dos miembros del conjugado, que dependen de la naturaleza de los miembros del conjugado, los lugares de unión de los miembros del conjugado, la conveniencia y similares. Los grupos funcionales que pueden estar implicados incluyen ésteres, amidas, éteres, fosfatos, aminos, hidroxilos, tioles, aldehídos, cetonas y similares. El puente puede implicar grupos alifáticos, alicíclicos, aromáticos o heterocíclicos. Existe una bibliografía sustancial para combinar grupos orgánicos para proporcionar conjugados estables. Los conjugados que implican solamente proteínas o glicoproteínas pueden ser moléculas recombinantes quiméricas o de fusión resultantes de la expresión de marcos de lectura abiertos ligados de secuencias naturales, secuencias sintéticas o sus combinaciones.
En la realización de la invención que utiliza anticuerpos anti-\alpha-gal naturales, el epítopo \alpha-galactosilo se conjuga con la fracción que se une al receptor de la célula diana o a la molécula soluble. Dependiendo de la naturaleza de la química, el grupo \alpha-galactosilo se puede introducir en asociación con uno o más grupos. Se pueden emplear diversas químicas para unir el epítopo galactosilo a una variedad de grupos funcionales. Véase, por ejemplo, Gobbo et al. (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40:54-61; Wood y Wetzel (1992) Bioconjug. Chem. 3:391-6; Filira et al. (1990) Int. J. Pept. Protein Res. 36:86-96; Kazimierczuk et al. (1985) Z. Naturforsch. 40:715-720; Rademann y Schmidt (1995) Carbohydr. Res. 269:217-25; y Wong et al. (1993) Glycoconj. J. 10:227-234. La manera particular en la que el epítopo \alpha-galactosilo se une a la fracción de unión no es crítica en esta invención, con tal de que el epítopo \alpha-galactosilo esté disponible para unirse a anticuerpos de la sangre.
La proporción de miembro conjugado respecto de la fracción que se une al receptor de la célula diana o a la molécula soluble puede variar. En algunas situaciones, puede ser deseable tener más de un miembro conjugado por fracción de ligando, para proporcionar una avidez o actividad mayor, o para variar la solubilidad in vitro del complejo o para inmunocomplejos aumentados y/o más de una fracción de ligando por conjugado, por razones similares. Generalmente, la proporción de miembro conjugado respecto de fracción de ligando será menor que alrededor de 20, normalmente menor que alrededor de 3, frecuentemente 1. Las proporciones mayores se pueden usar donde los miembros conjugados no interfieren con la actividad fisiológica de la complexina.
Son ilustrativas de complexinas IL-2 o proteína de unión CD69 para unirse a células T, unidas individualmente a antígeno de polisacárido A y polisacárido B en forma de mezcla, en donde la complexina comprende moléculas A y B individuales. Ya que alrededor del 95% de los individuos tienen anticuerpos anti-A y/o anti-B naturales, estas complexinas serán efectivas en alrededor del 95% de los individuos. Así, se podría tener una combinación de IL-2, IL-4 y/o proteína de unión CD69 o combinación de fracciones selectivas, p.ej. Ag de vacuna A + B +.
La complexina multivalente se concibe de forma que cuando se administra intravenosamente es soluble en la circulación, y se unirá a células T que expresan la proteína diana de membrana de superficie. Si se desea destruir células T activadas que tienen un alto nivel de receptor de IL-2 o que expresan CD69, las complexinas en cuestión servirán para unirse por medio de anticuerpos a la fracción selectiva del complemento u otro agente citotóxico, tal como células CCDA, para reducir sustancialmente la población de células T activadas. La unión de los anticuerpos efectores a las complexinas sobre las células diana dará como resultado la activación del complemento y/o la opsonización, que da como resultado la lisis de las células diana. Otros agentes efectores incluyen linfocitos o neutrófilos, tales como células T o células K, células NK, monocitos, macrófagos, basófilos, eosinófilos, mastocitos, eritrocitos, etc. Empleando un superantígeno selectivo para células T citotóxicas, se puede reclutar tales células por su efecto citotóxico.
Las composiciones en cuestión se pueden usar para el tratamiento de una amplia variedad de patologías variando la fracción para la célula diana. Así, los tratamientos pueden incluir inmunosupresión para trasplante de órganos, tratamiento de neoplasias tales como carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas, melanomas, etc., enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, etc.; patógenos celulares, tales como bacterias; y similares. No es necesaria una especificidad única, con tal de que haya una preferencia sustancial por la unión a las células diana.
Un ejemplo es la inmunosupresión asociada al trasplante de órganos. En esta situación, se desearía inactivar o destruir las células T que son activas contra el trasplante de órgano. Así, las células T que se activan y tienen niveles altos de receptor de IL-2 o reconocen el antígeno HLA se pueden marcar selectivamente para su destrucción mediante el uso de una complexina que comprende uno o más ligandos de IL-2 o su porción de unión u otros ligandos, p.ej., otras interleucinas, o uno o más antígenos HLA o sus regiones variables del donante de órganos. El ligando de IL-2 se puede conjugar a una fracción tal como FITC, \alpha-gal, etc. En el caso de una infección bacteriana, se puede usar una lectina o anticuerpo específico para un lugar epitópico del patógeno, unido al antígeno A y/o B, o \alpha-gal, para aumentar la respuesta inmunitaria hacia el patógeno.
Los conjugados en cuestión se administrarán en su mayor parte parenteralmente, particularmente intravascularmente, tópicamente, como un aerosol, oralmente o similares, dependiendo del órgano, sistema o cavidad particular a tratar. La cantidad del conjugado que se administra variará ampliamente, dependiendo de la naturaleza del conjugado, la naturaleza de la enfermedad que se está tratando, si se van a hacer una o más administraciones, el nivel endógeno del efector o el nivel estimulado por la complexina, el nivel citotóxico deseado y similares. Así, para cada conjugado, se determinará empíricamente el nivel a administrarse para una indicación particular. Los conjugados se pueden administrar en cualquier vehículo conveniente, tal como agua destilada, solución salina tamponada con fosfato, solución salina, etanol acuoso, derivado sanguíneo, u otro vehículo convencional. Se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, biocidas, tampones, sales y similares, que son aditivos convencionales y se usan en cantidades convencionales. Por ejemplo, con ratones, las inyecciones de complexinas que comprenden F(ab')_{2}-ATG emplean cantidades en el intervalo de alrededor de 10-500 \mug.
Los siguientes ejemplos son a modo de ilustración de lo anterior, y no a modo de limitación.
Experimental Ejemplo 1 Complexina con antígeno del grupo sanguíneo A
Los trisacáridos sintéticos del grupo sanguíneo A (derivados 8-azidocarboniloctilo de alfaGalNacl, 3-[alfaFuc 1,2]betaGal modificados para incluir un grupo amino C-terminal) se conjugan con interleucina 2 como sigue:
Activación de interleucina 2: Se disuelven 0,2 mg (13 nmoles) de IL-2 en 0,3 ml de fosfato sódico 0,1 M de pH 7,5. Se disuelven 2,3 mg de tioacetato de N-succinimidil S-acetilo en 1 ml de DMSO. Se añaden 10 \mul de tioacetato de N-succinimidil S-acetilo a la disolución de IL-2, y se incuba la mezcla a 25ºC durante 30 minutos. Se desaliniza la mezcla de reacción mediante paso a través de una columna de SEPHADEX G-25 equilibrada con tampón fosfato 0,1 M de pH 6,0. Se forman grupos tiol libres añadiendo 100 \mul de hidroxilamina 0,5 M/fosfato sódico 0,05 M de pH 7,5 que contiene EDTA 0,025 M a la disolución de IL-2. Se agita la disolución durante 120 minutos a temperatura ambiente. La disolución se pasa otra vez a través de una columna de G-25, y se obtiene IL-2 que tiene grupos SH libres. Se cuantifican los grupos SH libres usando el ensayo de Ellman, midiendo la absorbancia a 412 nm.
Activación del trisacárido del grupo sanguíneo A (antígeno A) con grupo maleimido: Se disuelve antígeno A (0,5 respecto de exceso molar 2 x de IL-2) en 1,0 ml de fosfato sódico 0,1 M de pH 7,5. Se disuelve éster de succinimidil N-maleimido-6-aminocaproil (ácido 2-nitro-4-sulfónico) fenilo Na (MAL-SAC-HNSA) (exceso molar de 100) en 20 \mul de dimetilsulfóxido (DMSO). Se añade la disolución de reactivo a la disolución de antígeno A y la mezcla se incuba a 25ºC durante 1 hora. Se monitoriza la reacción diluyendo 10 \mul de la mezcla de reacción en 1,0 ml de fosfato sódico 0,01 M de pH 7 a intervalos cronometrados. Cada alícuota se analiza leyendo la absorbancia a 406 nm (A_{406}) antes y después de la adición de 50 \mul de NaOH 5 N. El porcentaje de éster activo en cualquier momento se calcula usando la fórmula:
[(A_{406}(NaOH)-A_{406})/A_{406}(NaOH)]x100
A partir de la diferencia entre la cantidad de éster a t_{0} y en un momento posterior, se calcula la cantidad de éster usado en ese momento. Eso se corresponde con la cantidad de grupo amino total modificado. La mezcla de reacción se centrifuga brevemente para eliminar el exceso de reactivo precipitado, y el sobrenadante se aplica a una columna de Sephadex G-25 equilibrada en fosfato 0,1 M de pH 6,0.
Conjugación (complexina A): A maleimido-antígeno A (en fosfato 0,1 M de pH 6,0), se le añade compuesto IL-2-SH y se deja agitar a 4ºC durante la noche. La proporción molar final de Mal-antígeno A e IL-2-SH se ajusta de 0,2 a 5. La mezcla de reacción se pasa después a través de Sephacryl-200. Se recogen las reacciones que tienen picos en los intervalos de peso mol. deseados. La reactividad antigénica del conjugado se ensaya mediante transferencia de Western usando suero humano anti-antígeno de grupo sanguíneo y anticuerpo monoclonal anti-IL-2.
Ensayo funcional de complexina A: En este experimento, se determina si se puede usar complexina A in vitro para inducir la destrucción específica de linfocitos que expresan un receptor de IL-2 de alta afinidad, al mezclarlos con suero humano que contiene anticuerpos anti-grupo sanguíneo A y complemento. Se incuban linfocitos CTLL-2 marcados con ^{51}Cr con complexina A (de 40 \mug/ml a 0,1 \mug/ml). Después de 45 min. de incubación a 37ºC, se añade suero humano que contiene anticuerpos anti-grupo sanguíneo A (grupo B) en diversas diluciones, y se incuba durante 30 minutos a 37ºC; después se añade complemento de conejo y se incuba 1 hora a 37ºC. Después se estima la cantidad de ^{51}Cr liberada, y se calcula el porcentaje de lisis celular específica. Se observa la lisis significativa de células CTLL-2 tras incubación con complexina A. El fenómeno es dependiente de dosis (citotoxicidad incrementada, con cantidades superiores tanto de complexina A como de suero positivo de anti-grupo sanguíneo A) y específico, ya que las líneas celulares negativas para receptor de IL-2 (tales como células de ratón DA-Ia) no se destruyen bajo las mismas condiciones de ensayo. Además, no se observa citotoxicidad significativa al usar suero humano de un individuo de grupo sanguíneo AB o A.
Ejemplo 2 Complexina HBs
Se usa un péptido cíclico derivado de la secuencia de aminoácidos (aa 139-147) del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), y que muestra reactividad antigénica con anticuerpos policlonales y monoclonales que definen el epítopo a de HBsAg (péptido Hbs), para la conjugación con interleucina 2. La secuencia del péptido es: NH_{2}-Cys-Thr-Lys-Pro-Thr-Asp-Gly-Asn-Cys-Tyr-COOH. Se sintetiza mediante el método de fase sólida (Merrifield) usando química FMOC. Se purifica mediante HPLC. Se introduce un enlace disulfuro entre los dos residuos de cisteína terminales mediante oxidación con ferricianuro potásico.
Síntesis: El péptido HBs se conjuga con interleucina 2 como sigue:
Activación de interleucina 2: Se disuelven 0,2 mg (13 nmoles) de IL-2 en 0,3 ml de fosfato sódico 0,1 M de pH 7,5. Se disuelven 2,3 mg de tioacetato de N-succinimidil S-acetilo en 1 ml de DMSO. Se añaden 10 \mul de tioacetato de N-succinimidil S-acetilo a la disolución de IL-2, y se incuba la mezcla a 25ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción se pasa a través de una columna de G-25 equilibrada con tampón fosfato 0,1 M de pH 6,0. Se introducen grupos tiol libres añadiendo 100 \mul de hidroxilamina 0,5 M/fosfato sódico 0,05 M de pH 7,5 que contiene EDTA 0,025 M a la disolución de IL-2. Se agita la disolución durante 120 minutos a temperatura ambiente. La disolución se pasa a través de una columna de G-25, y se obtienen grupos SH libres en IL-2. Se cuantifican los grupos SH libres usando el ensayo de Ellman, midiendo la absorbancia a 412 nm.
Activación del péptido HBs con grupo maleimido: Se disuelve péptido HBs (0,50 respecto de exceso molar 2 x de IL-2) en DMSO a 10 mg/ml y se diluye en 1,0 ml de fosfato sódico 0,1 M de pH 7,5. Se disuelve éster de succinimidil N-maleimido-6-aminocaproil (ácido 2-nitro-4-sulfónico) fenilo Na (MAL-SAC-HNSA) (exceso molar de 100) en 20 \mul de dimetilsulfóxido (DMSO). Se añade la disolución de reactivo a la disolución de péptido HBs y la mezcla se incuba a 25ºC durante 1 hora.
Se monitoriza la reacción diluyendo 10 \mul de la mezcla de reacción en 1,0 ml de fosfato sódico 0,01 M de pH 7 a intervalos cronometrados. Cada alícuota se analiza leyendo la absorbancia a 406 nm (A_{406}) antes y después de la adición de 50 \mul de NaOH 5 N. El porcentaje de éster activo en cualquier momento se calcula usando la fórmula:
[(A_{406}(NaOH)-A_{406})/A_{406}(NaOH)]x100
A partir de la diferencia entre la cantidad de éster presente a t_{0} y en un momento posterior, se calcula la cantidad de éster usado en ese momento. Eso corresponde a la cantidad total de grupo amino modificado. La mezcla de reacción se centrifuga brevemente para eliminar el exceso de reactivo precipitado, y el sobrenadante se aplica a una columna de Sephadex G-25 equilibrada en fosfato 0,1 M de pH 6,0.
Conjugación: A maleimido-péptido HBs (en fosfato 0,1 M de pH 6,0), se le añade compuesto IL-2-SH y se deja agitar a 4ºC durante la noche. La proporción molar final de Mal-péptido HBs e IL2-SH se ajusta de 0,2 a 5. La mezcla de reacción se pasa finalmente a través de Sephacryl-200. Se recogen los picos en los intervalos de pesos moleculares deseados. La reactividad antigénica del conjugado se ensaya mediante transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-HBs (específico de HBs) y anticuerpo monoclonal anti-IL-2.
Ensayo funcional de complexina HBs: En este experimento, se determina si se puede usar complexina HBs para inducir in vitro la destrucción específica de linfocitos que expresan un receptor de IL-2 de alta afinidad, al mezclarlos con suero humano que contiene anticuerpos anti-HBs y complemento. Se incuban linfocitos CTLL-2 marcados con ^{51}Cr con complexina HBs (de 20 \mug/ml a 0,1 ng/ml). Después de 45 min. de incubación a 37ºC, se añade suero humano que contiene anticuerpos anti-HBs (recogido de un paciente vacunado usando Hevac B, Pasteur Vaccins y al que se le analizaron los anticuerpos anti-HBs mediante ELISA (Abbott Laboratories)) en diversas diluciones, se incuba durante 30 minutos a 37ºC; después se añade complemento de conejo y se incuba 1 hora a 37ºC. Después se estima la cantidad de ^{51}Cr liberada, y se calcula el porcentaje de lisis celular específica. Se observa la lisis significativa de células CTLL-2 tras la incubación con complexina HBs. El fenómeno es dependiente de dosis: se observa una citotoxicidad incrementada tanto con cantidades superiores de complexina HBs como de suero positivo anti-HBs. La citotoxicidad es específica, ya que las líneas celulares negativas para receptor de IL-2 (tales como células de ratón DA-Ia) no se destruyen bajo las mismas condiciones de ensayo. Además, no se observa citotoxicidad significativa al usar suero humano negativo para anticuerpos anti-HBs.
Ejemplo 3 Preparación de complexinas de folato \alpha-gal Materiales y métodos
Anticuerpos anti-\alpha-gal: purificación y reconocimiento de células murinas: Se purifican anticuerpos anti \alpha-gal humanos a partir de plasma mezclado usando una columna de melibiosa agarosa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Brevemente, se pasa el plasma de donantes de sangre normales por la columna, se lava el soporte con PBS, y se eluyen los anticuerpos unidos añadiendo Tris 0,1 M de pH 4,0. Se mide la concentración de proteína en las fracciones eluidas (ensayo de BCA; Pierce, Rockford, IL), y se mezclan las fracciones que contienen proteína.
Preparación de conjugados de folato: Se une folato a través de grupos carboxilo a grupos amino de anticuerpo anti \alpha mediante un procedimiento de carbodiimida. Se añade un exceso molar de cinco veces de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) a folato disuelto en dimetilsulfóxido. Tras 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, se añade un exceso molar de 10 ó 100 veces del folato activado con EDC a los 0,5-2,0 mg de anticuerpo en MOPS 0,1 M de pH 7,5. Tras 1 hora a temperatura ambiente, se aplica la muestra a una columna de sephadex G-25 equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (NaPO_{4} 10 mM/NaCl 150 mM). Las fracciones de picos excluidas se mezclan y se analizan espectrofotométricamente a 280 y 363 nm. La densidad de epítopo del folato en los conjugados de anticuerpo se determina usando coeficientes de extinción molecular para folato de 6.197 (363 nm) y 25.820 (280 nm). Las concentraciones de anticuerpo se determinan restando la contribución de absorbancia de folato a 280 nm y usando un coeficiente de extinción del anticuerpo de 224.000.
Ensayos de unión de folato: Se llevan a cabo ensayos de unión usando folato marcado con ^{125}I. Se lavan las células con PBS que contiene 0,1% de BSA para eliminar el exceso de folato libre. Se incuban las células, el folato marcado y los competidores en PBS-BSA durante 1 hora. Se separa el ligando unido y libre mediante centrifugación.
Ensayo funcional de complexina folato-\alpha-gal: Se determina si la complexina folato-\alpha-gal se puede usar para inducir in vitro la destrucción específica de células tumorales que expresan un receptor de folato de alta afinidad al mezclarlas con suero humano normal. Se incuban células tumorales marcadas con ^{51}Cr que se sabe que expresan niveles altos de receptor de folato con complexina folato-\alpha-gal (de 20 \mug/ml a 0,1 ng/ml). Tras 45 min. de incubación a 37ºC, se añade suero humano normal a diversas diluciones, se incuba durante 30 minutos a 37ºC; después se añade complemento de conejo y se incuba durante 1 hora a 37ºC. Después se estima la cantidad de ^{51}Cr liberado y se calcula el porcentaje de lisis celular específica. Se observa lisis de células tumorales tras la incubación con complexina folato-\alpha-gal.
Ejemplo 4 Actividad de una complexina in vivo
Se diseñó y se ensayó un sistema de ratones para ilustrar el potencial terapéutico de las complexinas. En estos experimentos, un fragmento F(ab')_{2} de preparación de globulina anti-timocito (ATG) policlonal se une a isotiocianato de fluoresceína (FITC) y se usa como construcción de complexina. La unión de la molécula fluorescente al fragmento F(ab')_{2} como se describe más adelante no impide la unión del anticuerpo a las células. Una preparación de anticuerpo anti-FITC reconocerá la complexina en la superficie de las células. Además, la combinación de anticuerpos anti-FITC y complexina en la superficie conduce a la lisis celular en presencia del complemento in vitro. Para establecer rápidamente un entorno in vivo que contiene anticuerpos anti-fluoresceína de título alto, se transfunde pasivamente a los ratones con anticuerpos anti-FITC. La administración de complexina a estos ratones da como resultado una disminución de más del 50% en el número de sus células T circulantes. Esto demuestra que los conjugados citomoduladores de miembros de parejas de unión específicas en un sistema de mamíferos tienen actividad in vivo.
Materiales y métodos
Complexina: Se preparan fragmentos F(ab')_{2} de ATG (Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N.Y.) mediante protocolos estándar. Los anticuerpos ATG se diluyen hasta 1 mg/ml en citrato sódico 20 mM de pH 3,5 y se escinden durante una incubación de 90 min. a 37ºC con 5 \mug/ml de pepsina (Sigma Chemical Comp., St. Louis MO). Se añade tampón carbonato de pH 9,5 a una concentración final de 0,05 M para parar la reacción. Después se centrifuga la disolución en un filtro en un concentrador centriprep-10 (Amicon, Beverley, MA) hasta una concentración final de proteína de 20 mg/ml.
El fragmento F(ab')_{2} ATG se une después a FITC de la siguiente manera. Se añaden 120 \mug de FITC (isómero 1 de 5-isotiocianato de fluoresceína de Sigma Chemical Comp.:disolución de reserva de 20 mg/ml en DMSO) a 3 ml de la disolución de F(ab')_{2}, y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min. en la oscuridad. Se elimina el exceso de FITC pasando la disolución por una columna de Sephadex G10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). El contenido de proteína de la complexina se mide usando un ensayo basado en ácido bicinconínico estándar (ensayo de BCA de Pierce, Rockford, IL), y se determina una proporción de FITC/proteína (F/P) igual a 1 en el conjugado, como se describió en Goding, J.W., Monoclonal Antibodies, 1986 Academic Press, San Diego, CA.
Anticuerpos anti-FITC: Se conjuga albúmina de suero bovino (BSA: Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) con FITC. Se inmunizan dos conejos blancos neozelandeses (adquiridos, mantenidos y manipulados en EL Labs, Soquel, CA) una vez con 100 \mug del conjugado BSA-FITC en adyuvante completo de Freund (Sigma Chemical Comp.) y dos veces después con 100 \mug de BSA-FITC en adyuvante incompleto de Freund (Sigma Chemical Comp.). Todas las inmunizaciones se administran subcutáneamente en lugares múltiples, y se sangra a los animales mediante punción venosa una vez cada dos semanas.
El suero de los conejos inmunizados se mezcla y se pasa por una columna con FITC unido preparada según las instrucciones del fabricante (equipo de Pharmalink, Pierce). Los anticuerpos de conejo específicos para FITC se eluyen de la columna con tampón de elución de IgG ImmunoPure (Pierce). Después se mide el contenido de proteína de la fracción eluida en el ensayo de BCA (Pierce).
ELISA anti-FITC: Se une hemocianina de lapa californiana (KLH, Pierce) a FITC usando el mismo procedimiento descrito para la preparación del conjugado F(ab')_{2} ATG. Después se reviste con 100 \mug de KLH-FITC por placa en placas de plástico Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Naperville IL) durante la noche a 4ºC. Después se saturan los lugares sin unir del plástico con una disolución de PBS-leche descremada deshidratada del 5% (PBS-leche) durante 1 hr a 37ºC. Tras lavar tres veces con lavado PRA (SangStat Med. Corp., Menlo Park, CA), se añaden diluciones en serie de muestras en PBS-leche 2,5% a cada pocillo y se incuban durante 1 hr a 37ºC. Se lavan otra vez las placas, después se incuban con conjugado anti-conejo-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Después de otra incubación durante 1 hr a 37ºC y lavado, se revela la presencia de anticuerpos anti-FITC de conejo añadiendo una disolución de 3 mg/ml de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (Sigma Chemical Comp.) en tampón de sustrato (SangStat Med. Corp.). Se detiene la reacción enzimática tras 15 min. mediante la adición de 100 \mul de HCl 1N, y se evalúan los resultados a 495 nm usando un espectrofotómetro Emax y soporte lógico SoftMax (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
Análisis FACS: Se separan linfocitos cultivados P815 o de sangre periférica (LSPs) de sangre entera heparinizada en un gradiente de Ficoll (Histopaque, Sigma Chemical Corp.) mediante centrifugación y se lavan en PBS que contiene 5% de suero de cabra. Después se resuspenden las células en 50 \mul del anticuerpo apropiado y se incuban durante 20 min en hielo. El receptor de células T se detecta usando un anti-CD3-PE (Pharmingen, San Diego, CA). La presencia de anticuerpos anti-FITC de conejo unidos a complexina en la superficie celular in vitro se revela mediante la adición de anticuerpos anti Fc 1g de conejo de cabra biotinilados (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), seguida de la adición de FITC unido a estreptavidina (Molecular Probes, Eugene, OR). Se analizan todas las muestras usando un FACScan y el soporte lógico Lysys II (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Lisis mediada por el complemento in vitro: Se marcan células P815 con complexina como para el análisis FACS, y después se mezclan con un número igual de células sin marcar. Después se añaden anticuerpos anti-FITC de conejo, como para la tinción de FACS. Tras lavar en PBS sin suero se incuban las células durante 1 hr a 37ºC en una dilución 1:10 de complemento de clase I de conejo (One Lambda, Canoga Park, CA). Las células se lavan, se resuspenden y después se analiza mediante FACS la disminución en el número de células que tienen FITC.
Ratones e inyecciones: Se usan grupos de cinco ratones hembra BALB/c de 9-10 semanas de edad (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA) a lo largo de los experimentos. Todas las inyecciones se preparan en 200 \mul de PBS y se administran intravenosamente (i.v.). Se inyecta un mg de anticuerpo anti-FITC de conejo y 250 \mug de F(ab')_{2} ATG por ratón en los momentos indicados en la descripción breve de los dibujos.
En cada momento se anestesian los ratones con éter y se sangran por el plexo retroorbital. Se usa una dilución 1:10 de sangre en ácido acético glacial para lisar los glóbulos rojos y dejar los LSPs intactos. El número de LSPs se cuenta después en un hemocitómetro. El número de células CD3^{+} se determina multiplicando el número de LSPs por el porcentaje de células CD3^{+} determinado mediante análisis FACS.
Resultados y comentarios
Unión de complexina y reconocimiento por anticuerpos anti-FITC: Para determinar si la fracción F(ab')_{2} de la complexina podría unirse todavía a marcadores de superficie celular después de haberse conjugado con FITC, se incuban células P815 con la construcción. La Figura 1 muestra claramente que la presencia de F(ab')_{2} ATG solo con un F/P 1 es detectable directamente mediante excitación de la porción de fluoresceína del conjugado durante el análisis FACS. En ausencia de complexina sobre las células, hay unión residual de los anticuerpos anti-FITC de conejo policlonales (pico con-a-FITC). La actividad de fluorescencia de FITC superior vista en las células P815 indica que la complexina se une sola a las células. La presencia de anticuerpos anti-FITC añadidos a las células teñidas con complexina se pudo revelar usando un marcado indirecto con inmunoglobulinas anti-conejo de cabra biotiniladas y estreptavidina-FITC. La señal enormemente incrementada que se ve de esta forma demuestra la asociación de los anticuerpos anti-FITC de conejo con la célula P815 diana por medio del puente F(ab')_{2}ATG-FITC.
El complejo puede iniciar la lisis mediada por el complemento: Las figuras 2A y 2B ilustran el ensayo desarrollado para evaluar el efecto del complemento sobre las células unidas a esta construcción de complexina y los anticuerpos anti-FITC. Las células P815 se dividen en dos grupos. Un grupo se tiñe con F(ab')_{2}ATG-FITC y después se mezcla con el grupo sin teñir. Las células P815, teñidas o no con F(ab')_{2}ATG, se lisan in vitro solamente tras la adición de los anticuerpos anti-FITC y del complemento. La presencia de la complexina o de los anticuerpos anti-FITC solamente no es suficiente para inducir una lisis detectable en este sistema.
Es interesante darse cuenta de que la lisis no ocurre con todos los conjugados F(ab')_{2}ATG-FITC, incluso en presencia de anticuerpos anti-FITC. Se preparan otras proporciones F/P de complexina y se evalúa su capacidad para unir anticuerpos anti-FITC de conejo e inducir la lisis en presencia del complemento. Aunque un conjugado con un F/P de 6,7 podría unirse e inducir la lisis tan bien como la preparación F/P 1, un tercer conjugado con un F/P de 25 es capaz solamente de unirse a los anticuerpos anti-FITC, pero no indujo lisis celular tras la adición del complemento.
F(ab')_{2}ATG-FITC y anticuerpos anti-FITC son detectables in vivo tras inyección: El análisis FACS de LSPs tras la administración i.v. de F(ab')_{2}ATG-FITC permite la visualización de la complexina unida a las células in vivo. La Figura 3 es típica de un perfil de FACS de LSPs de un ratón tratado con complexina teñidos ex vivo con anti-CD3. La complexina se fija sobre los LSPs in vivo. Esto demuestra que aunque el fragmento ATG se une a casi todas las células, se une preferentemente a la población de células T. De esta manera se podría seguir la presencia de complexina sobre la superficie celular in vivo durante más de 48 horas.
Para obtener títulos altos de anticuerpos anti-FITC en ratones sin tener que esperar a la sensibilización y refuerzo de los animales con conjugados hapteno-portador, se elige transferir pasivamente anticuerpos anti-FITC de conejo policlonales. Esto también permitió seguir la presencia de los anticuerpos inyectados mediante ELISA. La Figura 4 presenta los datos de cinco ratones 48 horas tras la inyección de los anticuerpos anti-FITC. Las inmunoglobulinas de conejo todavía están circulando en ese momento, y se pueden detectar durante al menos 120 hrs después de la inyección.
Anti-FITC y complexina in vivo elimina células diana: A los ratones que se transfundieron previamente con anticuerpos anti-FITC se les inyecta subsiguientemente el conjugado F(ab')_{2}ATG-FITC 24 hrs más tarde. Tras un periodo adicional de 24 hr, se evalúa el nivel de LSPs circulantes (véase la Figura 5A). Este dato se correlaciona con la evaluación FACS de los porcentajes de CD3^{+} entre los LSPs y el efecto sobre el número absoluto de células T calculado (véase la Figura 5B). En ambos casos hay una disminución significativa (p<= 0,02 Scheffe ANOVA) en el número de células diana solamente en los ratones que reciben los anticuerpos anti-FITC y la complexina. Esta disminución solo se ve en el grupo de ensayo tras la administración de ambos componentes.
La dosis de complexina necesaria para conseguir la reducción de células T circulantes se puede reducir. Los experimentos de valoración in vivo prueban que la cantidad de F(ab')_{2}ATG-FITC usada se puede disminuir al menos cinco veces, y aún reduce la población CD3^{+} de células tan bien como la dosis de 250 \mug (véase la Figura 6). Además, se demostró que la dosis reducida de complexina es tan efectiva como una dosis equivalente de ATG para reducir el número de células (Figura 7). Esto demuestra que la tecnología de complexinas parece tan efectiva como los medios convencionales para marcar una población celular in vivo.
Para explorar la posibilidad de que los inmunocomplejos circulantes (CIC) podrían estar evitando que una cantidad máxima de complexina alcanzase las células in vivo en presencia de anticuerpos anti-FITC, se diseñó un experimento similar. Sin embargo, en este caso el conjugado F(ab')_{2}-ATG-FITC se administra antes de la transfusión de anticuerpos anti-FITC. Esto aseguró que la construcción de complexina podría unirse libremente a las células in vivo sin ser eliminada por los anticuerpos anti-FITC. Con este tipo de experimento inverso se observa una disminución en el número de células CD3^{+} similar a la observada al dar las inyecciones en la secuencia apropiada. Esto indicó que hay solamente un pequeño o ningún efecto debido a la eliminación del conjugado F/P 1 en presencia de anticuerpos anti-FITC circulantes. La formación y el análisis in vitro de los inmunocomplejos formados entre las inmunoglobulinas anti-FITC y las tres diferentes proporciones F/P de las construcciones de complexina indicaron que la formación de tales complejos es fácilmente demostrable con las preparaciones de F/P 25 y F/P 6,7, pero no con el conjugado F/P 1.
Estos resultados muestran el diseño y la construcción de un conjugado pequeño capaz de unirse a una célula diana y de tener un marcador reconocible por un componente efector inmunitario. Los anticuerpos así unidos por medio de un puente de complexina a la célula diana pueden iniciar la lisis in vitro mediada por el complemento. Cuando la construcción de complexina se ha hecho de forma apropiada para evitar la formación de inmunocomplejos insolubles, puede mediar la eliminación in vivo de una población celular diana.
Según la invención en cuestión, se proporcionan agentes que pueden unirse específicamente una diana, p.ej., célula, humana, bacteria, infectada por virus o parásita, o molécula soluble, por medio de un ligando de unión específico. Se pueden seleccionar agentes que muestran una afinidad baja por las células que no se unen con el miembro de unión complementario de receptor. Cuando se usan agentes específicos que interaccionan con una molécula efectora endógena, se puede conseguir citotoxicidad hacia la célula diana después de la unión del conjugado a la célula diana. Empleando agentes para la fracción de ligando que no inducen una respuesta inmunitaria significativa, tales como moléculas que son sustancialmente endógenas o que tienen una inmunogenicidad baja, se puede evitar una respuesta inmunitaria y así evitar tener agentes de la respuesta inmunitaria que destruyen o inactivan el conjugado terapéutico. Aprovechándose de la respuesta inmunitaria preexistente contra la fracción selectiva y debido a que la fracción de ligando permanece funcional, se pueden usar los agentes en cuestión de forma prolongada.
Ejemplo 5 Prolongación de injertos cardíacos heterotópicos Materiales y métodos
Anticuerpos anti-\alpha-gal: purificación y reconocimiento de células murinas: Se purificaron anticuerpos anti-\alpha-gal humanos a partir de una mezcla de plasma usando una columna de melibiosa agarosa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Brevemente, se pasó plasma de donantes de sangre normales por la columna, se lavó el soporte con PBS y se eluyeron los anticuerpos unidos añadiendo Tris 0,1 M de pH 4,0. Se midió la concentración de proteína en las fracciones eluidas (ensayo de BCA; Pierce, Rockford, IL), y se mezclaron las fracciones que contenían proteínas.
Se incubaron células de ganglio linfático de ratón con 10 \mug/ml de los anticuerpos anti \alpha-gal o con una mezcla de 10 \mug/ml de cada anticuerpo monoclonal humano (IgG IHB-HU-015 específico anti-HLA e IgM IHB-HU-007: SVM-Foundation for the Advancement of Public Health and Environmental Protection, Bilthoven, Holanda) para controlar la unión de receptor Fc durante 20 min en hielo. Después se lavaron e incubaron las células con anticuerpos IgG e IgM anti-humanos de cabra biotinilados (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Tras lavar, se incubaron las células con tándem de estreptavidina (Southern Biotechnologies, Birmingham, AL), ficoeritrina anti-CD8 y FITC anti-CD4 (Pharmingen, San Diego, CA), y después se analizaron mediante citometría de flujo usando ventanas activas en un FACScan y el soporte lógico Lysys II (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Preparación de conjugado de FITC: Se unieron KLH, BSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e IL2 humana (PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ) a FITC como sigue: se añadieron 1,25 mg de FITC (isómero 1 de 5-isotiocianato de fluoresceína de Sigma Chemical Co.: disolución de reserva de 20 mg/ml en DMSO) a 250 mg de KLH o BSA (20 \mug FITC/mg proteína) en paralelo, se añadieron 125 \mug de FITC a 250 mg de IL2 (2 \mug FITC/mg proteína). Se incubó cada preparación a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. El exceso de FITC se eliminó haciendo pasar las disoluciones por una columna de sephadex G10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se midió el contenido de proteína usando un ensayo basado en ácido bicinconínico estándar (ensayo de BCA: Pierce), y se determinó la proporción FITC: proteína (F/P) en cada conjugado como se describió en otra parte (Hudson y Hay, Practical Immunology, Cambridge, MA: Blackwell Scientific Publications, 1989, Fd. 3º pág. 35). Se usaron solamente los conjugados IL2-FITC que tenían una proporción F:P media de 1 para evitar la formación de inmunocomplejos in vivo. Los conjugados KLH/BSA FITC de proporciones F:P de 10 se usaron para la inducción eficaz de anticuerpos.
Ratones, inmunizaciones, inyecciones y aloinjerto cardiaco: Se usaron grupos de 4 ratones macho BALB/c o C57BL/6 de 9-10 semanas de edad (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA) en los experimentos. Los ratones BALB/c se inmunizaron y reforzaron con inyecciones de 20 \mug de KLH-FITC preparadas en CFA o IFA (adyuvantes de Freund completos o incompletos, respectivamente; Sigma Chemical Co.) administradas subcutáneamente en la pata derecha trasera. En cada momento indicado, se anestesió a los ratones con 65% de CO_{2} y se sangraron por el plexo retroorbital. Se separó el suero de la muestra y se ensayó mediante ELISA, o se hizo pasar por una columna con FITC unido preparada según las instrucciones del fabricante (equipo Pharmalink, Pierce). Los anticuerpos anti-FITC se eluyeron de la columna con Tris HCl de pH 4,0 y se dializaron extensivamente con PBS de pH 7,4.
Los ratones C57BL/6 se anestesiaron profundamente con metofano (metoxiflurano, Pittmann-Moore, Mundelein, IL), se extrajeron sus corazones y se lavaron los órganos con lactato de Ringer heparinizado. Se realizó trasplante cardíaco heterotópico a receptores BALB/c según el método de Ono y Lindsey (1969) J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 7:225-229. Se administró un tratamiento con 50 \mug/Kg/día (1 \mug/ratón) de conjugado IL2-FITC o solamente IL2 por las venas de la cola en 200 \mul de PBS. Se evaluó la supervivencia del injerto mediante palpación directa. Se confirmó el rechazo sospechoso abriendo la cavidad peritoneal del receptor y observando directamente el injerto. Todos los animales se trataron y mantuvieron según las directrices de los servicios de salud pública.
ELISA anti-FITC: Se revistieron placas de plástico Maxisorp (Nunc, Naperville, IL) de 96 pocillos con 100 \mug de BSA-FITC durante la noche a 4ºC. Después se saturaron los sitios sin unir sobre el plástico con una disolución de PBS-leche descremada deshidratada al 5% (PBS-leche) durante 1 hora a 37ºC. Tras lavar tres veces con Plate Wash (SangStat Med. Corp., Menlo Park, CA), se añadieron diluciones en serie de muestras en PBS-leche 2,5% a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Se lavaron otra vez las placas, después se incubaron con un conjugado Ig-HRP anti-ratón (Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Después de otra incubación durante 1 hora a 37ºC y lavado, se reveló la presencia de anticuerpos anti-FITC de ratón añadiendo una disolución de 3 mg/ml de dihidrocloruro de 9-fenilendiamina (Sigma Chemical Comp.) en tampón de sustrato (SangStat Med. Corp.). Se detuvo la reacción enzimática tras 15 min. mediante la adición de 100 \mul de HCl 1N, y se evaluaron los resultados a 495 nm usando un espectrofotómetro Emax y soporte lógico SoftMax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Se evaluaron los títulos de las diluciones a punto final como el recíproco de la última dilución de suero para dar densidades ópticas mayores que 0,2 (es decir, por encima del fondo de ratones no inmunizados).
Células CD25^{+} y unión de IL2-FITC: Se mantuvieron células CTLL-2 de ratón (ATCC, Rockville, MD), que necesitan IL2 para crecer, en medio condicionado de EL4. Se lavaron tres veces las células en PBS de pH 5,0 para eliminar IL2 no marcada del receptor. Después se resuspendieron las células en 50 \mul del IL2-FITC 2 \mug/ml durante 20 min en hielo. La presencia de citocina marcada unida se amplificó mediante tinción indirecta con anticuerpos anti-FITC murinos purificados mediante afinidad de ratones inmunizados con KLH-FITC, seguido de Ig anti-ratón de cabra biotinilada (Pharmingen, San Diego, CA) y tándem de estreptavidina (Southern Biotechnologies, Birmingham, AI). Se analizaron todas las muestras usando ventanas activas en un FACScan y el soporte lógico Lysys II (Becton Dickinson).
Histología: Se recogieron los corazones, bazos, riñones y timos heterotópicos de los ratones de ensayo trasplantados y de control en los momentos indicados más adelante. Los órganos se fijaron en formalina al 10% tamponada hasta el análisis. El corte, tinción de H&E y la evaluación bienmascarada de los cortes fueron realizados por CVD Inc. (West Sacramento, CA).
Reacción de linfocitos mixtos: Se prepararon reacciones de linfocitos mixtos (MLR) en sentido C57BL/6 estimuladores hacia BALB/c respondedores según protocolos estándar. Brevemente, se inactivaron células de ganglio linfático C57BL/6 recién aisladas mediante incubación con 25 \mug/ml de mitomicina C (Calbiochem, La Jolla, CA). Tras lavado extenso se mezclaron las células estimuladoras 1:1 con células de ganglio linfático BALB/c respondedoras y se pipetearon en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. Se añadieron diluciones en serie de IL2-FITC o IL2 (PeproTech) al principio del cultivo para evaluar su toxicidad. Tras 5 días, se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina a cada pocillo. Ocho horas más tarde se recolectaron las células y se evaluó la incorporación de isótopo usando un contador de microcentelleo TopCount (Packard, Downers Grove, IL).
IL2-FITC redirige el anticuerpo natural y prolonga la supervivencia del injerto: Los datos demuestran el beneficio terapéutico de redirigir una respuesta de anticuerpos naturales hacia células T diana activadas CD25^{+}. Dos grupos de 4 ratones BALB/c fueron inmunizados dos veces con KLH-FITC y tuvieron títulos de anticuerpo anti-FITC circulante. Los ratones inmunizados recibieron después aloinjertos cardíacos heterotópicos de receptores C57BL/6 en el día 0. El grupo de ensayo recibió inyecciones diarias de IL2-FITC (F:P=1, 50 \mug/Kg) durante 30 días, y se compara directamente con el grupo de control que recibe la misma dosis de IL2 solamente. El grupo de ensayo inmunizado/tratado con IL2-FITC mantuvo sus injertos durante 38,7\pm7,1 días en comparación con el grupo inmunizado/tratado con IL2, que rechazó sus injertos en el día 10\pm1,4. Evidentemente, la presencia del hapteno reconocido por los anticuerpos circulantes fijado al ligando IL2 prolonga dramáticamente la supervivencia del injerto. Los controles de especificidad adicionales mostraron que los controles no inmunizados/sin tratar rechazaron sus injertos en el día 9\pm0,7, los ratones inmunizados/sin tratar rechazaron los injertos en el día 13,6\pm3,6, y los ratones no inmunizados/tratados con IL2-FITC los rechazaron en el día 9,4\pm1,1. Todos los grupos de control rechazaron sus injertos significativamente más rápido que la población de ensayo inmunizada/IL2-FITC (P\leq0,02 en el ensayo de Mann Whitney).
IL2-FITC no es tóxico: La incapacidad de la construcción IL2-FITC para prolongar la supervivencia de injertos en ratones no inmunizados indica que no es tóxico para las células T en proliferación. Para ampliar esta observación, se evaluó el efecto del conjugado sobre células en proliferación en un MLR. Se analizó el efecto correspondiente de IL2 solo como comparación. El conjugado IL2-FITC se comporta de forma muy parecida a la citocina sin marcar. A altas concentraciones (10 \mug/ml) ambas preparaciones aceleran el MLR y la cantidad de incorporación de ^{3}H-timidina en el día 5 de cultivo es menor debido a que el cultivo ya ha alcanzado el valor máximo. A dosis inferiores, las células cultivadas en presencia de IL2-FITC o IL2 solo proliferan igual o mejor (debido al efecto estimulador de la citocina) que los cultivos sin aditivo. Esto confirma la observación in vivo de que IL2-FITC no es tóxico.
Se inmunizaron previamente dos grupos de cinco ratones BALB/c con KLH-FITC y recibieron aloinjertos cardíacos heterotópicos de donantes C57BL/6 en el día 0. El día siguiente y cada día en adelante durante 30 días, o hasta el rechazo, los ratones recibieron 50 mg/Kg de IL2-FITC o IL2 solo. Se evaluó la supervivencia de los injertos mediante palpación a través del peritoneo.
Los controles no inmunizados/sin tratar rechazaron sus injertos en el día 9\pm0,7 mientras los ratones tratados según la invención en cuestión mantuvieron sus injertos durante 38,7\pm7,1 días, un incremento 4 veces mejor. La diferencia entre los dos grupos fue significativa (p\leq0,02). Esto se consiguió únicamente mediante el uso de la invención en cuestión, en ausencia de otros agentes inmunosupresores.
Es evidente a partir de los resultados anteriores que la invención en cuestión tiene aplicación in vivo. La presencia de anticuerpos circulantes específicos para un agente selectivo se explota para eliminar una subpoblación de células T. Los anticuerpos circulantes se pueden elevar para el agente selectivo mediante inmunización, o se puede elegir un agente selectivo para el cual existen niveles altos de anticuerpos endógenos. El agente selectivo se marca para las células T activadas mediante el uso de un conjugado para un ligando tal como IL-2. Los anticuerpos específicos para el agente selectivo se unen después a las células T activadas, activando por ello las rutas de destrucción mediante CCDA y complemento. Eliminando una subpoblación de células T activadas que responden a un injerto alogénico, el periodo de vida del injerto se puede prolongar enormemente. El método en cuestión proporciona un medio de inmunosupresión selectiva, sin comprometer la mezcla de células T no activadas, u otras células del sistema hematopoyético, disminuyendo por ello los efectos secundarios indeseables de la inmunosupresión.
A partir de la invención que se describe completamente, será aparente para alguien de experiencia normal en la técnica que se pueden hacer muchos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado para inactivar una célula diana en un anfitrión mamífero, que comprende dicho conjugado una fracción de marcado específica para un receptor de membrana de superficie de dicha célula diana unido covalentemente a una fracción selectiva, en la que dicha fracción selectiva comprende un epítopo \alpha-galactosilo y es capaz de unirse a un sistema efector citotóxico endógeno del anfitrión para formar un complejo inactivador de células, que comprende dicho sistema efector anticuerpos específicos para dicha fracción selectiva y un sistema citotóxico dependiente de anticuerpo, que comprende al menos un agente efector, por medio del cual cuando dicho conjugado se une a dicha célula diana y dicho agente efector, dicha célula diana se inactiva.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicha fracción de marcado es folato.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dicha fracción de marcado es un ligando para un receptor de membrana de superficie de citocinas.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en la que dicho ligando para un receptor de membrana de superficie de citocinas es IL-2.
5. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado para inactivar una célula diana en un anfitrión mamífero, que comprende dicho conjugado una fracción de marcado específica para un receptor de membrana de superficie de dicha célula diana unido covalentemente a una fracción selectiva, en la que dicha fracción de marcado es folato y dicha fracción selectiva comprende un antígeno hacia el cual el anfitrión ha sido sensibilizado previamente o hacia el cual el anfitrión tiene inmunidad natural, en la que dicha fracción selectiva es capaz de unirse a un sistema efector citotóxico endógeno del anfitrión para formar un complejo inactivador de células, que comprende dicho sistema efector anticuerpos específicos para dicha fracción selectiva y un sistema citotóxico dependiente de anticuerpos, que comprende al menos un agente efector, por el cual cuando dicho conjugado se une a dicha célula diana y dicho agente efector, dicha célula diana se inactiva.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que dicha fracción selectiva comprende un epítopo seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de grupo sanguíneo hacia el cual hay presentes anticuerpos en dicho anfitrión mamífero, un xenoantígeno hacia el cual hay presentes anticuerpos en dicho anfitrión mamífero y al menos una porción de una vacuna de proteína.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que dicha fracción selectiva se une a anticuerpos anti-\alpha-galactosilo.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en la que dicha fracción selectiva es el epítopo \alpha-galactosilo.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que dicha fracción selectiva comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de oligosacárido A, un antígeno de oligosacárido B, un antígeno de vacuna, un anticuerpo antiidiotipo y una región variable de un anticuerpo antiidiotipo.
10. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado para inactivar una célula diana en un anfitrión mamífero, que comprende dicho conjugado una fracción de marcado específica para un receptor de membrana de superficie de dicha célula diana unida covalentemente a una fracción selectiva, en la que dicha fracción de marcado comprende folato y dicha fracción selectiva comprende un epítopo seleccionado del grupo que consiste en \alpha-galactosilo, un antígeno de grupo sanguíneo hacia el cual hay presentes anticuerpos en dicho anfitrión mamífero, un xenoantígeno hacia el cual hay presentes anticuerpos en dicho anfitrión mamífero, y al menos una porción de una vacuna de proteína, en la que dicha fracción selectiva es capaz de unirse a un sistema efector citotóxico endógeno del anfitrión para formar un complejo inactivador de células, que comprende dicho sistema efector anticuerpos específicos para dicha fracción selectiva y un sistema citotóxico dependiente de anticuerpos que comprende al menos un agente efector, por el cual cuando dicho conjugado se une a dicha célula diana y dicho agente efector, dicha célula diana se inactiva.
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