JPH06509227A - リンパ球仲介細胞障害の活性を持つタンパク質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リンパ球仲介細胞障害の活性を持つタンパク質をコードするＤＮＡ技術分野 本発明は動物のタンパク質をコードする組替え核酸、特にリンパ球に関連した核 酸に関する。

背景技術 細胞障害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む細胞溶解性リンパ球（ＣＴＬ ）は多種類のウィルスに感染し、あるいは形質転換された標的細胞を認識して排 除することが出来る。これらの細胞が標的細胞の死を招くために用いる分子的機 隣は十分には分かっていない。大量の実験的証拠は、顆粒エキソサイト−シスモ デルを支持し、このモデルでは、標的細胞認識の結果、ＣＴＬがらバーフォリン 及びセリンプロテアーゼのような推定エフェクター分子を含む濃密コアを持つ細 胞質小胞を放出する（Ｍａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔ。

ｄａｙ　１０ニア９−８６．　１９８９；　Ｔｓｃｈｏｐｐ　ａｎｄ　Ｎａｂｈ ｏｌｚ、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８：２７９．　１９９０；Ｙｏ ｕｎｇ　ａｎｄ　Ｌｉｕ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　９：１４０−１４４ 、１９８８）。バーフォリンは直接に細胞障害性であることが証明されている（ Ｈａｍｅｅｄ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６９ニア６５−７ ７７、１９８９：　Ｌｉｃｈｔｅｎｈｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３ ３５：４４８−４５１．　１９８８；　５ｈｉｖｅｒ　ａｎｄＨｅｎｋａｒｔ、 　Ｃｅ１ｌ　６４：１１７５−１１８１．　１９９１）、標的細胞の膜に挿入後 、それは重合して分子内コンパートメントのマーカーが容易に通過出来る非得異 的なイオンチャンネルを形成する（Ｔｓｃｈｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３３７：２７２−２７４．　１９８９；　Ｙｏｕｎｇｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８３：１５０−１５４．　１９８ ６；　Ｙｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎ。

＋、　２４：６４７−６５３．　１９８７）。これらのイオンチャンネルの形成 は、一定の細胞タイプの溶解を誘導するのに十分と思われる。精製したセリンプ ロテアーゼは、直接細胞障害性ではないが、プロテアーゼ阻害剤がリンパ球仲介 の細胞溶解を阻止出来ることは、これらの顆粒の構成成分もまた標的細胞の死に ある役割を演じている可能性を示唆している（Ｌａｖｉｅ　ｅｔａｌ、、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３５：１４７０−１４７６、１９８５；Ｒｏｇｅｒｓｅｔ 　ａＩ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０：５６４−５７０．　１９８８） 。

バー７オリン仲介の細胞溶解に加えて、膨大な証拠が、標的細胞の死はプログラ ムされた細胞死の内在性経路の誘導の結果によっても起こることを示唆している 。自己溶解経路の中心となるのは、内在性エンドヌクレアーゼを活性化し、その 結果、標的細胞のＤＮＡが整数個の２００ｂｐヌクレオソーム大のモノマーに分 解される事である（Ｄｕｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｏｒｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：６３６２−６３６５．　１９８３；　Ｗｙｌｌｉｅ 、　Ｎａｔｕｒｅ　２８４：５５５−５５６．　１９８０）。その結果生しるＤ ＮＡ断片の″はしご（ｌａｄｄｅｒ）”は、このプログラムされた自殺経路の特 徴と考えられている。分離されたＣＴＬ＠粒は、細胞溶解（”Ｃｒの放出により 測定）及びＤＮＡの断片化（ヌクレア−ム大のＤＮＡ断片の出現により＃Ｉ定） の両方を標的細胞に誘導することが証明されている（Ａｌｌｂｒｉｔｔ。

ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７：５１４−５２７．　１９８８ ；Ｐｏｄａｃｋ　ａｎｄ　Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　 １６０：６９５−７１０．　１９８４）。しがしながら、精製バーフォリンを用 いた研究は、それが標的細胞の細胞溶解を誘導することは出来るが、ＤＮＡの断 片化を誘導しないことを証明している（Ｄｕｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７０：１４５１−１４５６．　１９８９）。

発明の開示 本出願でＴｒＡ、−１抗原として引用されているタンパク質は、最初、細胞溶解 性Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の中の細胞１を顆粒との関連で 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ番号 Ｈ８１、０３１．９として登録されているハイブリドーマによって生成される単 クローン抗体（ｍＡｂ　ＴＩＡ−１，）を用いて同定された自然界に生成する物 質である。

最初１５ｋＤと同定されたタンパク質はまた、免疫学的に本発明のｍＡｂと反応 するより大きな種々のイソ型を持っており、４０ｋＤならびに１５ｋＤのイソ型 をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、配列決定されて形質転換された細胞 に発現された。これらｃＤＮＡは本出願では、夫々、配列番号２と配列番号１と して確認されている。本出願で用いられている″免疫学的に反応性がある”とい う語句は、標準状態下、抗原あるいは抗体のイムノアッセイを可能にする程に十 分な特異性を持って抗体と抗原が互いに結合する（即ち、免疫複合体を形成する ）ことを意味する。この語句は必ずしも抗体が他の抗原、例えば、Ｆ記のような 抗原の多重体あるいは関連タンパク質に結合する可能性を除外するものではない 。

本発明は、ＡＴＣＣ番号１０３　］　９と名付けられているハイブリドーマによ って生成される単クローン抗体と免疫学的に反応するポリペプチドをコードする 配列を含む分離されたＤＮＡ　（あるいは精製された核酸）を特徴とする。゛分 離されたＤＮＡ″という語は、遺伝子操作を受け、あるいは合成されたＤＮＡ分 子で、それが含むポリペプチドをコードする配列が、このようなポリペプチドを コードする配列の起源となっている生物の自然に存在するゲノム内で、このよう な配列に通常隣接している遺伝子には隣接されてヒ久！ことを意味する。“精製 された核酸”という語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子て、それが自然界では細胞内 で結合している他の核酸分子を本質的に含まない、即ち、精製された咳酸樟品の ３０％以下がこのような自然界の夾雑分子であることを意味する。精製された核 酸あるいは分離されたＤＮＡは、例えば、ｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを創製する 、あるいはゲノムＤＮＡの断片をクローニングする、あるいは適切な配列の核酸 を合成的に作ることによって生成することが可能である。この分離されたＤＮＡ あるいは精製された核酸によってコードされるポリペプチドは、例えば、５ＤＳ −ＰＡＧＥ上で約４０ｋＤあるいは］　５ｋＤの大きさで、（ａ）ＡＴＣｃ番号 ６８２０２てＡＴｃｃに登録されているプラスミドによってコードされ、（ｂ） 配列番号１、（ｃ）配列番号２、あるいは（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列に本 質的に同等な配列を持つ可能性があり、ＤＮＡは、例えば、配列番号１、配列番 号２、あるいは配列番号３に本質的に同等なヌクレオチド配列を持つことがあり 得る。本発明の分離されたＤＮＡは、高度に厳密な条件下（例えば、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｔｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ；　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、Ｃ。

ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、　１９８９）で、ＡＴＣＣ番号６８ ２０２と呼ばれるプラスミド、あるいは配列番号１．２または３のコーディング 配列中の少なくとも６個のヌクレオチド（好適には、少なくとも１０個のヌクレ オチド、さらに好適には、少なくとも２０個）からなるヌクレオチド切片を含む 核酸プローブとハイブリッド形成する配列を含むことによって特徴づけられるか も知れない。それともまた、本発明の分離されたＤＮＡは、低次の厳密条件下で 、配列番号１．２あるいは３のコーディング配列を含む核酸プローブとハイブリ ッド形成することが出来るものとして特徴づけることも出来る。このような低次 の厳密条件は次ぎのようなものである：前ハイブリッド形成は、５０％ホルムア ミド、５Ｘ　ＳＳＣ，２５ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７，４）　、５Ｘ　デン ハート溶液、及び５０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの中で２０℃で４−１２ 時間、ハイブリッド形成は２０℃で１２−２４時間、洗浄は０．１％ＳＤＳを含 む５Ｘ　５ＳＣ１３２０℃で行う。

本発明の中には、また、ベクター（例えば、ＡＴＣＣ番号６８２０２として登録 されているようなプラスミド）、あるいはそれからの精製標品があり、そのベク ターは本発明の分離されたＤＮＡあるいは精製核酸を含む。このベクターが、一 旦、大腸菌、酵母、あるいは哺乳類細胞に挿入されると、その結果生じた本発明 の分離されたＤＮＡを含む細胞（あるいは、このような細胞の子孫からなる本質 的に均等な細胞集団）は、分離されたＤＮＡ、あるいは精製核酸の発現を許容す る条件下で培養され、そのようにして発現されたタンパク質は培地、あるいは細 胞から挿準法を用いて回収することが可能である。本質的に精製された天然の、 あるいは遺伝子操作によるＴＩＡＲ，あるいはＴＥＡ−１抗原［ヒトのタンパク 質の４０ｋＤ、１．５ｋＤ、あるいは別のイソ型、あるいは別の動物からの関連 タンパク質、あるいは、そのアミノ酸残基の１つ、あるいはそれ以上（しかし２ ０９６以下）が天然のタンパク質と異なるか、あるいは抗体またはリガンドのよ うな別のタンパク質に共役している非天然で遺伝子操作された型］は、細胞（好 適には免疫細胞）内に自殺経路を導入するのに有用である。この細胞死減法は、 細胞内にＴＩＡ、−１抗原あるいはＴＩＡＲを導入し、それが細胞ＤＮＡの崩壊 を誘発するように細胞をＴＩＡ−１抗原あるいはＴＩＡＲと接触させることによ って達成することが出来る。

本発明の分離されたＤＮＡあるいは精製核酸（例えば、配列番号３、配列番号１ あるいは配列番号２の断片、ＡＴＣＣ番号６８２０２として登録されているプラ スミドのコーディング配列）の少なくとも６個のヌクレオチド（好適には少なく とも１０個、さらに好適には少なくとも２０個）からなる切片と同等の配列を含 むプローブは、生物学的拭月（例えば、ヒトからの）中の細胞溶解性リンパ球の 同定法に用いることが可能であり、この方法はプローブが相補的ＲＮＡとハイブ リッド形成が出来るような条件下に、試料からのＲＮＡをプローブとを接触させ 、プローブが細胞のＤＮＡとハイブリッド形成するか否かを決定する段階を含む 。この場合、このようなハイブリッド形成は試料中に細胞溶解性リンパ球が恐ら く存在していることを表すものである。この分野でよく知られている標準の高度 に厳密なハイブリッド形成条件を使うことが可能である。この代わりとして、本 発明の分１１１ＤＮＡあるいは精製核酸の切片に相補的なｍＲＮＡの存在は、本 発明の分離されたＤＮＡあるいは精製核酸の２つの切片をポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）のプライマーとして用いることにより、標準のＰＣＲ技法を使用して 試寧、ｉ中に検出することか出来る。細胞溶解性リンパ球存在を監視することが 出来れば、ＨＩＶウィルスのような感染病原体が患者に存在することに対し早期 警告をりえるであろう。新規のエフェクタータンパク質、ＴＩＡ−１抗原をコー ドする核酸を検出することの出来るｃＤＮＡプローブとＰＣＲプライマーは、こ のような病原体の早期ζｒ在を検出するための特に鋭敏な手段を提供する。

本発明の他の特徴及び１１１点は、以下の詳細な説明、及び請求節回から明らか となるであろう。

発明の詳細な説明 最初に図の説明をする。

図１は２Ｇ９．４　（配列番号１）のヌクレオチド配列、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１ （４０ｋＤ　ＴＩＡ−１抗原）をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓ及びコードされ るタンパク質の推定アミノ酸配列の表示である。

図２はＴ４Ｔ８．９−５　（配列番号２）のヌクレオチド配列、ｒ　ｐｌ　５− Ｔ　ＩＡ−１（組替え１５ｋＤ　ＴＩＡ−１抗原）をコードするｃＤＮＡ、及び コードされるタンパク質の推定アミノ酸配列の表示である。このｃＤＮＡはＡＴ ＣＣにＡＴＣＣ番号６８２０２と命名されたプラスミドとして登録された。

図３は、夫々、ｃＤＮＡ　２Ｇ９．４　（配列番号１）とＴ４Ｔ８．９−５　（ 配列番号２）によってコードされるｒｐ４０−ＴＩＡ−１及びｒｐ１５−ＴＩＡ −１に含まれるタンパク賀領域の略図である。

図４は、ＴＩＡ−１、ＬＡＭＩ”ｌ、及びＩｇｐ１２０のカルボキシ末端部のリ ゾソーム標的指向モチーフを、重要なチロシン残基は太字て示し、同一の残基は 箱で囲んで比較したものである。

図５は、種々の細胞型におけるＴＩＡ−１抗原ｍＲＮＡ発現のノーザンプロット 分析である。

図６は、Ｔ４Ｔ８．９−５ｃＤＮＡ　（配列番号２）を含むベクターでトランス フェクトされたＣｏｓ細胞におけるｒ　ｐ　１５−Ｔ　Ｉ　Ａ　−１発現の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ分析である。

図７は、２Ｇ９．４ｃＤＮＡ　（配列番号１）を含むベクターでトランスフェク トされたＣｏｓ細胞におけるｒｐ１５−ＴＩＡ−１発現の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 である。

図８は、前免疫ウサギ血清（左パネル）あるいはペプチド１　［２Ｇ９．４　（ 配列番号１）のアミノ酸２８８−３０７　、中パネル］またはペプチド２　［２ Ｇ９゜４（配列番号１）のアミノ酸３８４−３６７　；　右パネル１に対する抗 ペプチド抗血清でプローブされた親和精製された天然及び組替えＴＩＡ−１抗原 の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の免疫プロットである。

図９は、２Ｇ９．４　（配列番号１）あるいはＴ４Ｔ８．９−５　（配列番号２ ）ｃＤＮＡてトランスフェクトされたＣｏｓ細胞からの３５８−メチオニン標識 溶解液の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジオグラムである。これら溶解液は、 組替えタンパク質の核酸結合活性を検出するためにポリ（Ｃ）−アガロースある いはポリ（Ａ）アガロースを用いて沈殿された。

図１０は、大腸菌由来のｒｐ４０−ＴＩＡ−１による胸腺細胞ＤＮＡの断片化を 、ＤＮＡ断片を分離するためにアガロースゲル上電気泳動を用いて分析したもの である。

図１１は、ｒｐ１５−ＴＩＡ−１，ｒｐ４０−ＴＩＡ−１によって透過性となっ た胸腺細胞、及び対照の大腸菌溶解液のＤＮＡ断片化を、ＤＮＡ断片を分離する ためにアガロースゲル上電気泳動を用いて分析したものである。

図１２は、ｒｐ１５−ＴＩＡ−１、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１、天然ＴＩＡ−１抗原 、大腸菌由来のｒＬＡＲｌ及びペプシン処理あるいは煮沸処理のｒｐ１５−ＴＩ Ａ−１とｒｐ４０−ＴＩＡ−１によって透過性となった胸腺細胞のＤＮＡ断片化 を、ＤＮＡ断片を分離するためにアガロースゲル上電気泳動を用いて分析したも のである。

図１３は、セファロース固定化単クローン抗体ＴＩＡ−１、セファロースビーズ のみ、固定化ポリ（Ｃ）、あるいは固定化ポリ（Ａ）を用いて予め清澄化したｒ ｐ４０−ＴＩＡ　１により透過性となった胸腺細胞のＤＮＡ断片化を、ＤＮＡ断 片を分離するためにアガロースゲル上電気泳動を用いて分析したものである。

図１４は、透過性胸腺細胞におけるｒｐ１５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４Ｑ−ＴＩＡ −１によるＤＮＡ断片化の用量反応（Ａ）と動力学的分析（Ｂ）である。

図１５は、透過性末梢血中リンパ球（ＰＢＬ）におけるｒｐ１５−ＴＩＡ　１及 びｒｐ４０−ＴＩＡ−１によるＤＮＡ断片化の用量反応（Ａ）と動力学的分析（ Ｂ）である。

図１６は、透過性ＰＢＬとのインキュベージジンによるｒｐ４０−ＴＩＡ−１の ４０ｋＤ及び３８ｋＤ型から１５ｋＤ型への漸進的転換の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 である。

図１７はＴＩＡ−１ゲノムＤＮＡのサザンプロットである。

図１８Ａは、ＴＩＡＲ−ｃＤＮＡのコーディング配列及び３゛非非転写列、なら びに５゛非非転写列、さらにコードされているタンパク質（配列番号３）の推定 アミノ酸配列の表示である。

図１８Ｂは、ＴＩＡＲ（配列番号３）とＴＩＡ−１抗原（配列番号１）の推定ア ミノ酸配列の比較である。

図１８Ｃは、ＴＩＡ−１抗原（配列番号４）　、ＴＩＡＲＣ配列番号５）　、Ｌ ＡＭＰ−１（配列番号６）、ＬＡＭＰ−２（配列番号７）　、ＬＡＭＰ−３（配 列番号８）　、Ｉｇｐ１２０　（配列番号９）の推定リゾソーム標的指向モチー フの比較及び共通配列である。

図１９Ａは、大腸菌溶解液から表示のホモポリマーを用いて沈殿し、ｍＡｂ・Ｉ Ｈｌｏで免疫プロットされた組替えＴＩＡＲ及びＴＩＡ−１抗原の分析である。

図１９Ｂは、対照［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＬＡＲホスファターゼ（ ＬＡＲ）］と比較したＴＩＡ−１抗原及びＴＩＡＲの該溶解活性を示すゲルの写 真である。表示量（μｇ／ｍｌ）の組替えタンパク質あるいは対照を、透過性胸 腺細胞と１２時間インキュベートした後、上清について分解されたＤＮＡを分析 した。

例１：単クり−ン抗体（ｍＡｂ）ＴＩＡ−１及びＴＩＡ−１抗原ｍＡｂ−ＴＩＡ −１の分離法 米国特許第５，０７９，３４３号の主題で、本出願に引用編入されている単クロ ーン抗体ＴＩＡ−１が透過性及び非透過性Ｔ細胞の分別に選択された。ＴＩＡ− １は、１５ｋＤの細胞内タンパク質である１５ｋＤ−ＴＩＡ−１抗原を認識し、 これはナチュラルキラー細胞内ばかりでな（末梢血液の単核細胞からのＣＤ８＋ リンパ球の副次集団にも見出だされる。ＴＩＡ−１抗原は、免疫電子顕微鏡法に より細胞溶解性Ｔリンパ球内の細胞質顆粒の膜に結合していることが観察されて いる。

細胞内抗原と反応性のある抗体生成のためにスクリーニングされるべき適切なハ イブリドーマは、６週齢のＢａ１ｂ／ｃマウスを透過性Ｔリンパ球（２５−３０ Ｘ１０６）で２１日間置きに、９−１２週間にわたって免疫することによって調 製した。抗原は、ヒツジ赤血球をロゼツト形成した血小板フエレーシス残査から 得られたフィコール法によってｔＲ製された末梢血液単核細胞を用いて調製され た（Ｌａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３００：２６７、　１９７１）。

精製ＴＩＪンバ球は、３回ＰＢＳで洗浄して、５ｘｌＯ６細胞／ｍ＋の濃度で再 浮遊し、ジギトニン（１０μｇ／ｍｌ）を加え５分間氷温で透過性化した。透過 性Ｉの濃度で再浮遊してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に注射した。免 疫されたマウスから採取した牌臓細胞を７Ｘイブリドーマ調製のためＮ５−１骨 髄腫細胞と融合した（Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ、ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６： ４９５．　１９７５）。

前記のように調製されたハイブリドーマの各クローンを、フローサイトメトリー 修正法により透過性Ｔ細胞に対する反応性についてスクリーニングした。細胞を 不当な細胞障害、あるいは細胞内構成成分の過度の喪失を起こすことなく透過性 にするため、及び、調製中フローサイトメトリー分析に必要な繰り返し洗浄の間 、透過性部１を崩壊から防御するために、ヒツジ赤血球ロゼツテイングにより精 製されたＴリンパ球は、先ずＰＢＳ中０．０１％ホルムアルデヒドを用いて氷温 で２０分間温和な固定により安定化した。細胞は次いで水冷ＰＢＳで４回洗浄し 、ＰＢＳに５ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度で再浮遊して、ジギトニン（１０μｇ〆遊 した。ハイブリドーマの上清を透過性細胞に１＝１の比で加えた。氷上で３０分 後、細胞は未結合の抗体を除くため０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで ３回洗浄し、さらにヤギ抗マウスＦＩＴＣとインキュベーションして、洗浄、Ｐ ＢＳと１９６ホルムアルデヒドに再浮遊し、Ｅｐｉｃｓ７２０フローサイトメタ −を用いてフローサイトメトリー法で分析した。

はＣＤ８を含むことが出来る。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の精製された集団 は、ＴＩＡ−１抗原を選択的にＣＤ８　サブセットに含むことが見出だされてい る。透過性細胞の抗体結合検査において、ＴＩＡ−１はＣＤ４　細胞の６±２９ ６及びＣＤ８　細胞の５５±７％を染色した。ＴＩＡ−１抗原は、また、ナチュ ラルキラー（ＮＫ）細胞クローンに発現されるが、不死化Ｔ細胞系（Ｊｕｒｋａ ｔ。

ＨＰＢ−ＡＬＬ、　ＣＥＭ、ＨＵＴＬ−７８）やＢ細胞系（Ｄａｕｄｉ、ＢＪＡ Ｂ、　Ｒａ　ｊ　ｉ）には発現されない（以下の表参照）。

透過性造血細胞におけるＴＩＡ−１抗原発現のフローサイトメトリー分析細胞型 　相対的発現 Ｂ細胞　− Ｔ細胞　十 ＣＤ４＋　Ｔ細胞　＋／− ＣＤ８＋　Ｔ細胞　＋＋＋ ＋＋細胞　− ＣｏｎＡによって活性化された胸腺細胞　十ＪＪＩ（ＮＫクローン）＋＋＋ ＣＮＫ６　（ＮＫクローン）＋＋＋ ＋　＋ Ｔ４Ｔ８ＣＩ　（ＣＤ４　、ＣＤ８　クロージン　＋＋＋＋ Ａ２ｐ　（ＣＤ８　細胞系）＋＋ ＋ Ｍ　（ＣＤ４　クロージン　十 ＭＭＣＣＤ４＋クローン）　＋ ＋ Ｎ　（ＣＤ４　クローン）＋／− Ｐ　（ＣＤ４＋クローン）　＋ Ｔ細胞活性化のＴＩＡ−１抗原発現に対する影響末梢血１９２８球を１０％ウシ 胎児血清を補足したＲｏｓｅｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅ　（ＲＰＭＩ）培地で活性化刺激の存在あるいは非存在下に培養する と、未刺激Ｔ細胞は免疫プロット上で単クローン抗体（ｍＡｂ）ＴＩＡ−１と反 応する１５ｋＤのタンパク質を発現する。活性化刺激の非存在下に８（］の期間 にわたって培養された細胞は、１５　ｋ、　Ｄタンパク質を発現する能力を次第 に喪失する一方で、２８ｋＤの免疫反応性タンパク種を獲得する。ホルボールミ リステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下、両型のＴＩＡ〜１抗原の発現は減少 する。■細胞マイトジェン、ＣｏｎＡは、ｉ　５　ｋ　Ｄ及び２８　ｋ、　Ｄの 免疫反応性両型の大量発現を誘導する。

これに加えて、２つのより高分子量の種類がＣｏｎＡとの培養中に６日後現れる 。ＣＤ３反応性の抗体は同様にこれらより高分子量型のＴＩＡ−１反応性抗原の 発現を誘導するが、一方、フィ（・ヘマグルチニンはＴＩＡ−１反応性抗原の発 現を減少する傾向がある。高分子−量の免疫反応性種は１５ｋＤ単量体のジスル フィド結合子置体であると思われる。６１１間ＣｏｎＡて活性化されたＴ細胞か ら調製された細胞溶解液は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより還元条件下に分離され、次 いて単クローン抗体ＴＩＡ−１との免疫プロッティングに掛けられると、２８ｋ Ｄのイソ型は１．５　ｋ　Ｄに還元され、それが１５ｋＤ種を含むジスルフィド 結合の二量体であることを示唆する。

Ｔ　Ｉ　Ａ、−１抗原の細胞内局在 Ｔ１１−１抗原の細胞内局在性は細胞を窒素キャビテーションで破裂し、その溶 解液をパーコール密度勾配で分画］〜で決定した。培養された細胞溶解性Ｔリン パ球を同様に分析し“Ｃ、セリンプロテアーゼ及びパーフォリンのような細胞溶 解性エフェクター分子を含む高密度顆粒が存在することを証明した（Ｐａｓｔｅ ｒｎａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２２ニア４０．　１９８６）ｏ細 胞溶解活性を持つクローン化されたＣＤ８　細胞系（Ｔ４Ｔ８ＣＩ）をこの様式 で分画するとセリ／プロテアーゼ活性を持つ２つのピークが現れた。パーコール 密度勾配画分を免疫プロッティングによりｍＡｂ　ＴＩＡ　１反応性物質の存在 をＪ＝ｆしたところ、大部分は低密度の膜画分に見出だされ、且つ、この両分が セリンプロテアーゼ活性を含んでいた。［低密度画分は、より未熟な細胞溶解性 顆粒を含み、なお形成過程にあると考えられている（Ｈｅｎｋａｒｔ　ｅｔ　ａ ｌ。

、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９：２３９８．　１９８７）］。

免疫電子顕微鏡法で検査したところ、ＴＩＡ−１抗原はＴ４Ｔ８Ｃ１細胞の特定 のコンパートメント内に、細胞表面ではなく、被覆小胞内か原形質膜にそって局 在することが判明した。標識は粗面小胞体あるいはゴルジ装置内には現れなかっ た。強度の標識が第一ゴルン後コンパートメント内に、低電子密度コアを持つ膜 あるいはエンドソーム様構造に、高電子密度リソソーム顆粒の膜周辺に、小多胞 体内に含まれる微小体の膜周辺に見出だされた。低電子密度エンドソーム及び高 電子密度小胞は共にそれらの膜上て標識されていた。細胞質小胞のあるものは、 低電子密度から高電子密度構造への変化過程にあるように思われた。すべての場 合、標識はコンパートメントの膜にのみ結合しているように見えた。ＴＩＡ−１ 抗原は発育途上の細胞實類粒の特異的マーカーであると思われる。

ＴＩＡ、−１抗原と既知タンパク質との比較ＴＩＡ−１抗原は、その組織分布、 細胞上画分及び生化学的構造において幾つかの細胞質エフェクター分子に類似し ている。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びリンホトキシン（ＬＴ）のような構造物（ Ｋｒｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、Ｃｅ１１　５３：４５，１９８８；　Ｙａｍａ ｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７＋１８７８．　１ ９８６；　Ｓｃｈｍｉｄ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、ＵＳＡ　８３：１８８１゜１９８６） は、ＴＩＡ−１抗原とほぼ同じ大きさてあり、その組織分布及び細胞内局在性を 共有することがあると考えられる。しかしながら、ｍＡｂ　ＴＩＡ−１のヒｈ　 Ｔ　Ｎ　Ｆ及びリンホトキシンに対する反応性を免疫プロッティングで検査し！ 二ところ、ＴＮＦもＬＴも共にこの抗体では認識されなかった。ＴＩＡ−１抗原 がこれまで記載されていないセリンプロテアーゼである可能性を確かめるために 、Ｔ４Ｔ８Ｃｌの溶解液をＦｅｒｇｕｓｏｎらの方法（Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、 　１６７・５２８．　１９８８）によって分析した。全細胞溶解液の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥには、３０ｋＤ付近に移動するセリンプロテアーゼ活性を持つバンドが現 れたが、３Ｈ−ジイソプロピルホスホフルオロリン酸標識物質はｍＡｂ　ＴｒＡ −１とは反応せず、ＴＩＡ−１抗原はセリンプロテアーゼではないことを示ＴＩ Ａ−１抗原を高度に発現する（前表参照）細胞溶解性Ｔ細胞クローンＴ４Ｔ８Ｃ Ｉ由来のＲＮＡを２ｇ　ｔ　１．１中にｃＤＮＡライブラリーを構成するのに利 用した。この発現ライブラリーをＴＩＡ−１単クロ一ン抗体を用いてスクリーニ ングして、バクテリオファージが発現する幾つかの免疫反応性融合タンパク質を 確認した。これらのバクテリオファージを、抗体による選別を３回繰り返して精 製し、組替えファージは記載通りにプレートに展開した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、ＮＹ、　１９８９）。挿入ＤＮＡをプラーク法で精製された組替λフ ァージから分離し、ｐＳＰ６５プラスミドベクターを用いてサブクローニングし た。クロスハイブリッド形成分析により関連するｃＤＮＡを含む３つの独立クロ ーンが確認された。次いて最大のｃＤＮＡ挿入断片（１，，６ｋｂ）を用いて、 完全長のｃＤＮＡ分離の目的で元のライブラリーをプローブした。５つの交差反 応性ファージ分離体が確認され、それらは各々１．６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を含 んでいた。これらの分離物は夫々、ポリ（Ａ）尾部の長さは異なっていたが、５ ′末端部では同一であった。この間じｃＤＮＡプローブを用いて、ＰＨＡて活性 化したＴ細胞から調製したもう一つのλｇｔ１１・ｃＤＮＡライブラリーをスク リーニングしたところ、２．２ｋｂの挿入ｃＤＮＡ断片が幾つか分離された。２ ゜２ｋｂのｃＤＮＡ　（２Ｇ９．４　：　配列番号１）のＤＮＡ配列が、１１２ ５塩基対読み取り枠によってコードされている４、２．０００ダルトンのタンパ ク質（その５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の見掛（〕の移動度から、以下ｒ　ｐ４０−Ｔ　 ＩＡ−１として引用）の推定アミノ酸配列と共に図１に示されている。１．．６ ｋｂ−ｃＤＮＡ（Ｔ４Ｔ８．０−５、図２に提示；　配列番号２）は、２．２ｋ ｂ−ｃＤＮＡの終りの１１２５塩基対（図１、配列番号１においてヌクレオチド の５５５番目から始めて）と配列か同一であることが判明した。目下のところ、 １．．６ｋｂ−ｃＤＮＡか、２．２ｋｂ−ｃＤＮＡによって代表されるものとは 異なった種類のｍＲＮＡに由来するか否かは不明である。６８８番目のヌクレオ チドの位置にあるＡＴＧ　（図１、配列番号１）をタンパク質合成開始部位と仮 定すると、１．６ｋｂＯｃＤＮＡ自体、１６．０００ダルトンノタンパク質（＋ の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の見掛けの移動度から以下ｒｐ１５−ＴＩＡ−１として引 用）をコードすることが出来る（Ｋｏｚａｋ、１９８４）。

ｒｐ４０−ＴＩＡ−１（配列番号１）の推定アミノ酸をＮＢＲＦタンパク質デー 少データベースされている既知配列と比較したところ、ある族のＲＮＡ結合タン パク質に有意のｔ＠同性を示した。これらのタンパク質は、タンパク質−タンパ ク質相互作用に関与すると想定されているカルボキシ末端の補助領域と連携して 発現する凡そ９０個のアミノ酸からなる１つから４つのＲＮＡ結合領域を含むこ とが証明されている（Ｂａｎｄｚｉｕｌｊｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｓ　ａ ｎｄ　Ｄｅｖｌ、　３：４３１−４３７．　１９８９）、図３に示されているよ うに、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１はそのアミノ末端に３つのＲＮＡ結合領域を持つ。

夫々のＲＮＡ結合領域は、特にＲＮＡ結合タンパク質に保存されている２つのリ ボ咳タンパク質に共通なオクタペプチド配列（ＲＮＰｌ及びＲＮＰ２）を含む。

ｒｐ４０−ＴＩＡ−１もｒｐｌ、５−ＴＩＡ−１も脂質二重層を貫通すると思わ れる疎水性領域を持たないが、これらに共通のカルボキシ末端領域は、Ｉ　ａｍ ｐ−１及び１ｇ＋１１２０のようなリゾソーム膜タンパク質に保存されているこ とが証明されている共通配列を含んでいる（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：８７５４−８７５８．　１９８８；　Ｈｏｗ ｅｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８５ニア５７ ７−７５８１．　１．９８８）（図４）。カルボキシ末端からアミノ酸４つ離れ た位置にあるチロシン残基は、突然変異分析によってリソソームのｌａｍｐ−１ 標的指向に重要であることが示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｆｕｋ ｕｄａ、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１１１：１５５−９６６、２９９０ ）。前述の如く、免疫電子顕微鏡法によればＴＩＡ−１抗原はＣＴＬ及びＮＫ細 胞内の細胞溶解性顆粒の膜に局在しているので、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１及び「ｐ ｌ、５−ＴＩＡ−１にこの構造モティーフが存在することは興味深い。ｒｐ４Ｑ −ＴＩＡ−１のカルボキシ末端の残り部分、ＲＮＡ非結合領域は、比較的にグル タミン残基に富み、ヒトのブリオン・タンパク質に最も関連が近（（Ｐｒｕｓｉ ｎｅｒ、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４３：３４５−３７４、 １９８９）、これと８４個のアミノ酸領域にわたって２６％の相同性を共有して いる。

ｍＲＮＡの発現は、ｃＤＮＡのｒｐ４０−ＴＩＡ−１（配列番号１）のカルボキ シ末端補助領域をコードする領域をプローブとして用い、ノーザンブロッティン グにより決定した。図５に示す如く、ハイブリッドを形成する２種の顕著なＲＮ Ａ、（２，７ｋｂ及び４．０ｋｂ）がＴ細胞系に、また、それより顕著ではない がＢ細胞系に確認された。Ｔ４Ｔ８ＣＩと呼ばれる細胞障害性Ｔ細胞クローンも またこれら２種類のＲＮＡを発現したが、しかし、さらに、後者の細胞は２つの より小さな種類のＲＮＡ　（１，７ｋｂ及び２．２ｋｂ）を発現し、これらの大 きさはＴ４Ｔ８．９−５及び２Ｇ９．４ｃＤＮＡに類似していた。

組替えＴＩＡ−１抗原の発現と特性認定ｒｐ４０−ＴＪＡ−１及びｒｐｌ５−Ｔ ＩＡ−１をフードするｃＤＮＡは、真横細胞発現ベクター、ｐＭＴ−２（Ｂｏｎ ｔｈｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：２７０−２７３．　１９８ ６）中にクローン化され、（：ｏｓｌｉＥ胞に一過性に発現された。３日後、細 胞はジギトニン溶解緩衝液中で溶解された。

細胞溶解液は直接１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに掛けられるか（図６ ．１及び２列）あるいは、［気泳動による分離前にｍＡｂ−ＴＩＡ−１を用いて 免疫沈降を行った（３及び４列）。５列は末梢血リンパ球の後接ジギトニン溶解 液Ａで継続インキュベーションして現像した。オートラジオグラフの露出は１２ 時間であった。分子サイズマーカーのｔｌｌ　ｉＪ的移動度は図６に示す通りで あり、ここでｒｐｌ５−ＴＩＡ−１（Ｔ４Ｔ８．９−５：　配列番号２）をコー ドする１゜６ｋｂのｃＤＮＡてトランスフェクトされたＣｏｓ細胞は、１５ｋＤ の免疫反応性タンパク質を細胞溶解液（２列）及び免疫沈降物（４列）の両方に 含み、このタンパク質はＴ細胞から調製された細胞溶解液中に確認された天然の １５ｋＤタンパク質と同じ移動度を示す（５列）。ｐ　Ｍ　Ｔ　−２ベクターで のみトランスフェクトされたＣｏｓ細胞にはこの１５ｋＤタンパク質は含まれて ぃなかった（１及び３列）。３及び４列で分離された免疫沈降物のなかで、より 高分子量のバンドはウサギの抗マウスＩｇ現像抗体によって検出された免疫グロ ブリンのＪ［ｒ＃と軽鎖である。図７は、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１（２Ｇ９．４　 ；　配列番号１）をコードする２、２ｋｂゆｃＤＮＡでトランスフェクトされた ｃｏ８細胞が、免疫沈降物（１列）及び細胞溶解液（４列）の両方に確認された ４０ｋＤの免疫反応性タンパク質を発現したことを示す。ｐＭＴ−２ベクターの みでトランスフェクトされた対照細胞（２及び５列）あるいはトランスフェクト されていない細胞（３及び６列）は、この４０ｋＤタンパク質を含んでぃなかっ た。

ＴＩＡ−１抗原をコードするｃＤＮＡは免疫選択法によって同定されたものであ ったから、これらは１５ｋＤ顆粒タンパク質に無関係であるが免疫学的に交差反 応性を示すタンパク質をコードしていたｎ工能性があった。この可能性を除外す るために、ｒｐ４０−４１Ａ−１の２つの異なった領域に相当するペプチドはミ ノ酸２８８−３０７　（ペプチド１、図８の中パネル）及びアミノ酸３８４−３ ６７（ペプチド２、右パネル）］に反応性のあるウサギ抗ペプチド抗体を調製し て１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離された組替え及び天然のＴＩＡ−１抗原のニト ロセルロース・プロットをプローブするのに用いた。免疫プロットは、親和精製 ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ）′：ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ複合体及びＥ ＣＬ＠出試薬（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）を用いて現像した。免疫するペプチ ドに対するこれら抗体の特異性はＥＬＩＳＡによって確認された（不表示）。Ｔ 　Ｉ　Ａ−１抗原と反応性のある元の単クローン抗体はこれら合成ペプチドのい ずれをも認識しなかった。抗ペプチド抗体の調製に用いられた２匹のウサギから プールされた前免疫血清は、免疫プロット（図８、左パネル）において、ｒｐｌ 、５−ＴＩＡ−１（１列）　、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１（２列）、あるいは天然の ＴＩＡ−１抗原（３列）を認識することが出来な力じた。これに対し、両抗ペプ チド血清は共に（図８、中及び右パネル）ｒｐｌ５−ＴＩＡ−１（１列）、ｒｐ ４０−ＴＩＡ−１（２列）及び天然のＴ　ｒ　Ａ−１抗原（３列）を認識した。

この結果は、ＴＩＡ−１単クロ一ン抗体によって認識される天然及び組替えタン パク質の同定に対する有力な証拠を提供するものである。

ｒｐ４０−ＴＩＡ−１のＲＮＡ結合領域の特異性を決定するために、Ｃｏｓ細胞 をＴ４Ｔ８．９−５　（配列番号２）あるいは２Ｇ９．４　（配列番号１．）ｃ ＤＮＡによってトランスフェクトした。３日後、細胞をメチオニン不含培地中で 代謝的に３５５−メチオニンによって標識し、洗浄してジギトニン溶解緩衝液を 用いて溶解した。放射標識溶解液は、次いて、ポリ（Ａ）アガロースあるいはポ リ（Ｃ）ｃ−ｔ＊＊分子量スタンダードの相対的移動度は左側に提示されており 、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１は固定化ポリ（Ａ）によって特異的に沈降するが、固定 化ポリ（Ｃ）によっては沈降しない。ｒｐｌ、５−ＴＩＡ−１は、それが完全な ＲＮＡ結合領域を欠損していることから予想されるようにポリ（Ａ）あるいはポ リ（Ｃ）によっては沈降しなかった。この結果は、ＴＩＡ−１抗原の４０ｋＤイ ソ型がポリ（Ａ）中モポリマーを好適に認識する核酸結合タンパク質であること を証明している。

ＴＩＡ−１（配列番号２）及びｒｐ４０−ＴＩＡ−１（配列番号１）を、原核生 物の発現ベクターｐＴ７−７中にクローニングした（Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉ ｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８２：１０ ７４−１０７８．　１９８５）。次いて実験法の部に記載されているように、各 組替えタンパク質を含む細菌抽出液を、ＴｒＡ−１抗原と反応性がありポリ（Ａ ）−アガロース及び／あるいはセファロースに固定された抗体を用いる親和クロ マトグラフィーによって精製した。天然ＴＩＡ−１抗原は、その組織分布及び細 胞下局在性の点て、幾つかの既知の、あるいは推定の細胞溶解性エフェクター分 子に類似している。そこて、ｒｐｌ５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４０−ＴＩＡ−１が 標的細胞からの５１ｃ、成田を誘導する能力を直接測定した。天然キラー細胞が 効果的に標的細胞溶解を誘導する条件下で、ｒｐｌ５−ＴＩＡ−１及びｐ４０− ＴＴＡ−１はいずれも予め標識された標的細胞に５６２あるいはＭｏ１ｔ−４か らバックグラウンド以上には”’Ｃｒ１ｋ、出を引きおこさなかった。

ＴＩＡ−１抗原による細胞死誘導のもう一つの可能な＃！溝は、感受性細胞系に プログラムされている細胞死の刺激を介するものである。細胞系におけるＤＮＡ 断片化誘導を測定する試みは、未処置の対照細胞にも断片化ＤＮＡが発見されて 挫折した。し力化ながら、プログラム化された細胞死が最初に記載された標的細 胞群（Ｗｙｌｌｔｅ、　１９８０）である胸腺細胞に、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１が ＤＮＡ断片化を誘導する能力を検査した。新たに分離した胸腺細胞を精製した大 腸菌由来ｒｐ４０−ＴＩＡ−１（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間３７℃で処理した 結果、プログラム化された細胞死が進行している細胞の特徴であるヌクレオソー ム大のＤＮＡ断片が出現した（図１０、電気泳動分離は１．４％アガａ−スゲル 上で行われ、ＤＮＡは紫外線下で観察出来るようにエチジュームブロミドで染色 した。ラムダＤＮＡのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ消化物から得られたマーカーＤＮＡの 相対的移動度が提示されている）。ｐＴ７−７ベクターのみで（３，３ｍｇタン パク質／ｍ１））ランスフエクトされた大腸菌の抽出液で処理された胸腺細胞は 、断片化されたＤＮＡを含んでいなかった（図１．０）。

熾損傷の胸腺細胞におけるＤＮＡ断片化誘導に要するインキュベーション時間は 比較的長いので、この結果はこれらの細胞が長期インビトロ培養の間に死滅する 本来の傾向を一部反映した可能性があると考えられた。そこで大腸菌由来ＴｆＡ −１抗原が、ジギトニンで透過性にした胸腺細胞にＤＮＡ断片化を誘導する能力 を検討した。図１１は、ラムダＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌ消化物をサイズマーカー として８んでおり、ｒｐｌ５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４０−ＴＩＡ−１の両者が透 過性胸腺細胞にわずか６時間後にＤＮＡ断片化を誘導することを示している。

さらに、ｐＴ７−７ベクターのみで（３，３ｍｇタンパク質／ｍｌ）トランスフ ェクトされた大腸菌から：ａ架された細胞溶解液中対照溶解液）はＤＮＡ断片化 を誘導しなかった（図１１）。ここには示されていない実験において、セファロ ースに固定されたＴＩＡ−１抗体を用いてこれらの対照溶解液を模擬精製したと ころ、透過性細胞にＤＮＡ断片化を誘導しない物質が生成された。

免疫親和クロマトグラフィーによって抹消血リンパ球から精製された天然のＴＩ Ａ−］抗原もまた、透過性胸腺細胞にＤＮＡ断片化を誘導することが見出だされ た。図１２は、５０μｇ／ｍ！のｒｐｌ５−ＴＩＡ−１、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１ 及び天然のｒｐＴＩＡ−１のＤＮＡ断片化活性の比較である。実験法の部に記載 されているように、ＤＮＡ断片化測定前のインキュベーションは６時間であった 。図１２にはまた、胸腺細胞に添加する前に固定化ペブジンで４時間３７℃で前 処理した、あるいは１０分間煮沸したｒｐｌ５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４Ｑ−ＴＩ Ａ−１を用いて得られた結果も含まれている。この図には、ラムダＤＮＡのＨｉ ｎｄｌｌ！制限酵素断片の相対的移動度がサイズの比較のために含まれている。

天然のＴＩＡ−１標品に存在する少量のタンパク質がこの物質の純度測定を困難 にしているが、この標品のＤＮＡ断片化誘導活性は、組換えＴＩＡ−１の生物学 的活性が細菌の発現系の人工産物ではないことの強力な証拠となっている。図１ ２はまた、ｒｐｌ５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４０−ＴＩＡ−１と同じ細菌発現系に おいて生成される対照タンパク質、ＬＡＲＤ１ポスファターゼにはＤＮＡ分解活 性が欠損していることを示している。アガロース固定化ペプシンを用いてｒｐ１ ’５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４０−Ｔ１．へ−１をタンパク質消化した結果、ＤＮ Ａ分解活性は喪失し、活性成分はタンパク質であることが確認された（図１２） 。「ｐ１５−ＴＩＡＩ及びｒｐ４０−ＴＩＡ−１は共に、煮沸によって同様に不 活性化され、本来のコン“クオーメンヨンが活性に必要なことを示唆した（図１ ２）。

ｒｐ４０−ＴＩＡ−１がそれ自体、ＤＮＡ断片化誘導の原因であることの証拠は さらに、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１含有溶液を４回セファロースビーズのみ、セファ ロース固定化単クローン抗体ＴＩＡ−１、ポリ（Ａ）アガロース、あるいはポリ （Ｃ）アガロースを用いて予め清澄にすることによって得られた。予め清澄化さ れた溶液を、１０％ＦＣ９を含むＲＰ？１４１で希釈し、ジギトニンで透過性に した胸腺と６時間インキュベートした。図１３に示すように、セファロースのみ 、あるいはポリ（Ｃ）アガロースで予め清澄化されたｒｐ４０−ＴＩＡ−１はＤ ＮＡ分解活性を保持していたが、セファロース固定化単クローン抗体ＴｒＡ−１ あるいはポリ（Ａ）アガロースで予め清澄化されたｒｐ４．０−ＴＩＡ−１は不 活性であった。この結果は、ＤＮＡ分解活性が単クローン抗体ＴＩＡ−１あるい はポリ（Ａ）に結合するというｒｐ４．ｃｌ−ＴＩＡ−１に予期される性質を確 認するものである。

図１４Ａは、異なった濃度の精製ｒｐ１５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４０−ＴＩＡ− １が、表示用量と６時間インキュベートされた透過性胸腺細胞に誘導するＤＮＡ 断片化の度合いを示すものである。１列＝０．１μｇ／ｍｌ、２列：１．０μｇ ／ｍｌ、３列：５μｇ／ｍｌ、４列：　１０μｇ／’ｍｌ、５列：２５μｇ／ｍ ｌ。

６列＝５０μｇ／ｍ１０図１４Ｂに示された実験では、断片化ＤＮＡ誘導につい て細胞を分析する前に、精製ｒｐ１５−ＴＩＡ−１、ｒｐ４０−ＴＩＡ　１、あ るいはｒＬＡＲを、５１Ｊｃｚｇ／ｍｉの濃度で透過性胸腺細胞と表示時間イン キュベートした。ｒｐｌ、５−ＴＩＡ−１及びｒｐ４０−ＴＩＡ−１は共にマイ クロモーラ−濃度でＤＮＡ断片化を誘導することが見出だされたが（図１４Ａ） 、動力学的様相は異なり、ｒｐｌ、５−ＴＩＡ−１は透過性胸腺細胞にＤＮＡ断 片化を１時間以内に誘導したが、ｒｐ４．ｏ−ＴＩＡ−１は、固定度のＤＮＡ断 片化を４時間のインキュベーション後にようやく誘導した（図１４Ｂ）。

胸腺細胞の大部分はアボトーンス死を予定されていると考えられているので、こ れらの細胞は、内在性エンドヌクレアーゼの活性化に至るプログラム化過程をす てに開始していたことが可能であると考えられた。ＴＩＡ−１によって誘導され るＤＮＡ断片化が他の細胞型に一般化されるか否かを決定するために、透過性末 梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いて用量反応及び動力学実験を反復した。胸腺細胞 においてと丁度間しように、透過性ＰＢＬにＤＮＡ断片化が、ｒｐｌ、５−ＴＩ Ａ−１及びｒ　ｐ４０−Ｔ　ＩＡ−１の両者によって（図１５Ａ）、前者は後者 に比べて著しく遅延した動力学て（図１５Ｂ）誘導されることが見出だされた。

これらの結果は、ＴＩＡ−１抗原がリンパ球にプログラムされている細胞死を誘 導出来ることを示唆するものである。

ｒｐ４０−ＴＩＡ−１によって誘導されるＤＮＡ断片化の遅延動力学は、「ｐ４ ０−ＴＩＡ−１がタンパク質分解的プロセスを受け、ＴＩＡ−１抗原の１５ｋＤ イソ型に相当する生物学的に活性な１．５　ｋ　Ｄのカルボキシ末端領域を放出 する可能性を示唆した。ポリ（Ａ）アガロースで精製されたｒｐ４０−ＴＩＡ− １（１０μｇ）を、９６ウ工ル丸底組織培養プレートの各ウェルに入れたジギト ニンで透過性化されたＰＢＬ　（１００μｌのＲＰＭＩ中に５ｘ１０６個の細胞 ）と図１６に示すように時間を変えてインキュベーションした。細胞を溶解緩衝 液中で溶解後、上清を５ＤＡ−ＰＡＧＥおよび免疫プロッティングで分析したと ころ、ｒｐ４０−ＴＩＡ−１の４０ｋＤ及び３８ｋＤ型が漸次消失することが判 明した（図１６、左パネル）。同時に、これらの免疫プロットには天然のＴｌ１ −１抗原（ＰＢＬ溶解液のみを含む対照列に示されている）と移動度が等しい１ ５ｋＤのタンパク質の量が増大して現れて来た。同様の結果が、　Ｉ−標識ｒｐ ４０−ＴＩＡ−１を透過性標的細胞とインキュベートした時に得られ、１５ｋＤ タンパク質の出現は透過性ＰＢＬによるその新合成の結果ではないことを示唆し たくデータは提示せず）。図１６の右パネルは、細胞のみ、あるいはｒｐ４Ｑ− Ｔ［Ａ−１のみを含む対照試料を示す。これらの結果は、ＰＢＬがｒｐ４０−Ｔ ＩＡ−１をある一点て特異的に切断することの出来るプロテアーゼを発現し、そ の結果、１５ｋＤカルボキシ末端ベブヂドを放出することを示唆する（図１６、 左パネル）。同時に、これらの免疫プロットには天然のＴ１１−１抗原（ＰＢＬ 溶解液のろを含む対照列に示されている）と移動度が等Ｌ２い１５ｋＤのタンパ ク質の量が増大して現れて来た。同様の結果が、　■−標識ｒｐ４０−ＴＩＡ− １ヲ・透過性標的細胞とインキュベートした時に得られ、１５ｋＤタンパク質の 出現は透過性ＰＢＬによるその新合成の結果ではないことを示唆した（データは 提示せず）。図１６の右パネルは、細胞のみ、あるいはｒｐ４０−ＴＩＡ−１の みを含む′ｉ１照試料を示す。これらの結果は、ＰＢＬ力悄゛ｐ４０−ＴＩＡ− １をある一点て特異的に切断することの出来るプロテアーゼを発現１２、その結 果、１５ｋＤカルボキシ末端ペプチドを放出することを示唆する。

実験操作 細胞 細胞系は１００６ウン胎児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ中で生育した。末梢血リンパ 球は白血球フ寸し−ンス残渣からフィコール−１＼イバツク（ｆｉｃｏｌｌ−ｈ ｙｐａｑｕｅ）（Ｐ＋１ａｒｍａｃｉａ）上の遠心分離によって分離した。正常 の胸腺は、心臓ｆ術の間に胸腺部分切除を受けた６歳以下の患者から採取した。

単細胞浮遊液は、胸腺の一部を滅菌した鋏を用いてみじん切りにし、次いて細片 をステンレスの網目を通ずことによって得た。これらの細胞はフィコ−ルーツ＼ イパツク上で遠心分離し、胸腺細胞の生きた中細胞浮遊液を分離した。

抗体 甲クローン抗体ＴＩＡ−１，（ＩｇＧ］、）は上記のように調製され、特性が認 定された。親和精製ウサギ抗マウスＩｇは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅ ｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡか ら購入した。ホースラディツシュ中ペルオキシダーゼを接合したヤギ抗ウサギを 及びヤギ抗マウスＩｇはＳ　ｉ　ｇｍａから購入した。

ウサギ抗ペプチド抗体は、当該２０アミノ酸のペプチドをキーホールリンペット ヘモシアニン（ＫＨＬ）と８−１のモル比でグルタールアルデヒイドを最終濃度 ７ｍＭまで滴ドして連結し、さらに２４時間室温でインキュベーションして調製 した。十分に透析後、ＫＬＨ−ペプチド複合体をウサギを免疫するのに用いた（ 完全フロインドアジュバント中１ｍｇペプチド当量を２１日間隔で３ケ月にわた って注射）。前免疫血清は、最初の免疫前に各ウサギから採取された。

ＣＴＬｃＤＮＡライブラリーの調製 細胞の総ＲＮＡは５ｘ１．０８個のＣＴ■、細胞（Ｔ４Ｔ８Ｃ１）からプロテイ ナーゼに抽出法を用いて分離された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８９）。ポリ（Ａ、）＋　ＲＮＡは、オリゴｄＴセルロース・クロマトグラフィ ーによ、て分離された。ｃＤＮＡは製造集菌の指示書に従い、ｅＤＮＡ合成系（ ＢＲＬ）を用いて合成された。簡単に言えば、ｃＤＮＡはポリ（Ａ）ＲＮＡ鋳型 から逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを用いて転写された。ＥｃｏＲＩメチ ラーゼで処理後、ｃＤＮＡはＥｃｏＲ，Ｔリンカ−に結合され、ＥｃｏＲＩによ って消化された。過剰のリンカ−を分子ふるいクロマトグラフィーによって除去 した後、ＣＤＮＡはホスファターゼで処理されたλｇｔｌｌアームに連結された 。その結果生した組替え体はインビトロのパッケージング系を用い、供給者（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）によって記載されているようにファージ頭部内にパッケージさ れた。その結果得られたライブラリーは、ｍｇＲＮＡ当たり約２ｘ１０６個のプ ラークで、平均挿入サイズ１．．１．ｋｂ（範囲０．４−２．　９）の複雑度を 持っていた。

ｃＤＮＡクローニング及び配列決定 前記のＴ４Ｔ８Ｃｌライブラリー、あるいは、ＰＨＡで活性化されたＴ細胞から 調製されたライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）からの２ｇ１１１組替え体を、１ ５０ｍｍベトリ皿当たり３０．０００個プラークの濃度で大腸菌Ｙ２Ｏ２Ｓ株の 菌叢上に散布した。４２℃で４時間インキュベーション後、プレートを、本質的 に記載のように（Ｓｎｙｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　１５４：１０７．　１９８７）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ クトシドで飽和したニトロセルロースフィルターで覆った。さらに−晩インキュ ベーシ町ン後、フィルターは位置をマークして取り外し、３％ＢＳＡを含むＰＢ Ｓで１−２時間固定した。次いでフィルターは、単クローン抗体ＴＩＡ−１でプ ローブし、１２５■−プロティンＡで現像して、オートラジオグラフィーにかけ た。−次スクリーニングからの陽性クローンは、プラーク法で精製してＹ２Ｏ２ Ｓ株のプレート上に展開した。ファージＤＮＡは、プレート溶解液から抽出され 、ＥｃｏＲＩで消化して挿入断片を遊離し、ｐＳＰ６５プラスミドＤＮＡにサブ クローニングされた。シークエナーゼ（ＵＳＢ）を用いるジデオキシ配列決定は 、オリゴヌクレオチドプライマー及び当該挿入断片を含むアルカリ変性プラスミ ドＤＮＡを使用して供給者による記述の如く施行した。

ｕｇ／ｍｌジギトニンを含む冷ＲＰＭＩに浮遊して透過性にした。氷上で５分間 インキュベーション後、細胞を１０倍過剰の冷ＲＰＭＩで希釈し、１１０００ｒ ｐて１０分間遠心した。細胞ベレットをＲＰＭ目こ再浮遊し、９６ウエルＵ型底 プレートにおいて、指示された付加物の非存在下あるいは存在下に３７℃で５％ ＣＯ□岬卵器内で指示された時間培養した。細胞は次いで等容量の２０ｍＭトリ ス（ｐＨ７，４）　、０．４ｍＭＥＤＴＡ、０．４％トリトンＸ−１００を加え て溶解した。各ウェルの内容物はミクロフユージ管に移し、１４．０００ｒｐｍ で５分間遠心した。上清を集め、０．５ＭＮａＣ＋と同容のイソプロパツールを 含むように調整した。−晩、−７０℃でインキュベーション後、試料を融解、１ ４゜０００ｒｐｍで１０分間遠心、７０％エタノールで一回洗浄してスピードバ ックで乾燥した。ベレットをＯ，１ｍｇ／ｍ１ＲＮａｓｅを含むＴＥ緩衝液２０ μＩに再浮遊し、３７℃で３０分間インキュベートした。ローディング緩衝液を 加えた後、試料をアガロースゲル（０，８−１，２％）上で分離し、ＵＶ光線下 で目で観察した。

大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を、２Ｇ９．４　（配列番号１）あるいはＴ４Ｔ８ ゜９−５（配列番号２）挿入ＤＮＡを含むＰＴ７−７プラスミドベクター（Ｔａ ｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９８５）でトランスフェクトした。

細菌培養ハ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で０Ｄ６ｏｏＯ， ４５まで培養して、０．４％グルコース及び０．４ｍＭＩＰＴＧを含むように調 整し、次いてさらに３０℃で４時間振盪培養した。細胞を４０００ｒｐｍで１０ 分間遠心して採集し、水冷ＰＢＳで一回洗浄した。溶解液をＣｕ１ｌとＭｃＨｅ ｎｒｙの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８２：１４７ −１５４、１９９０）に従って調製した。

細菌溶解液（２０ｍｌ）をセファロース固定化単クローン抗体（ｍＡｂ）ＴＩＡ −１（３ｍｌの詰めたビーズ）と４℃で２−１２時間、振盪下にインキュベート した。セファロースビーズをカラムに移し、２０倍のベッド容の結合緩衝液（５ ０ｍＭｌ−リス、ｐＨ８，０，１０ｍＭのＥＤＴＡ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ ０％ショ糖）で洗浄して、５ベツド容の０．１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ１２゜ ０）で溶出し、１００μｍのＩＭＩ−リスＭＣＩ、ｐＨ６，８を含むチューブ１ こ１ｍｌの両分を集めた。タンパク質を含む画分を貯留し、ＰＢＳに対し４℃で ４回透析した。ｒ　ｐ　１５−Ｔ　ＩＡ−１の精製標品をクマシー染色電気泳動 １こよって分析したところ、１５ｋＤのバンド一本がこれら調製品の主要タン／ 々り質として現れた。同様にｒｐ４０−ＴＩＡ−１を分析すると、４０ｋＤ、３ ８ｋＤ及び１５ｋＤに移動する３つの主要成分が現れた。３８ｋＤ型と１５ｋＤ 型はｍＡｂ＠ＴＩＡ−１によって認識され、これらが４０ｋＤタンノくり質の分 解産物であることを示唆した。これら標品の純度は、デンシトメーター分析によ って６０〜８０％の間にあると推定された。

親和マトリックスとしてポリ（Ａ）アガロースを用いるｒｐ４０−ＴｒＡ　１精 製の別法はいくつかの実験で用いられた。上記の如く調製された細菌溶解液を先 ず非特異的に結合している物質を除去するためにポリ（Ｃ）アガロースカラムに 通した。前清澄化溶解液を次いてポリ（Ａ）アガロースカラムに通し結合緩衝液 で徹底的に洗浄し、次いで同じ結合緩衝液で調製した１、３ＭグアニジンＨＣ１ で溶出した。透析して濃縮後、精製されたｒｐ４０−ＴＩＡ−１を５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで分析した。ｒｐ４０−ＴＩＡ−１をクマシーブルー染色すると、４０ｋＤ と３８ｋＤに２本の顕著なバンドが現れ、両方ともＴＩＡ−１抗原反応性の抗体 によって認識された。抗体親和クロマトグラフィーを用いて精製された標品に含 まれている１５ｋＤの分解産物は、ポリ（Ａ）で精製された物質には存在せず、 １５ｋＤタンパク質が４ＱｋＤタンパク質のカルボキシ末端に由来することを示 唆した。これら製品の推定純度は６０−９０％の範囲であった（ｐ４０及びｐ３ ８の両方を含んで）。

Ｃｏ５１ｌＢ胞のトランスフェクションＣｏｓ細胞を、当該挿入ＤＮＡを含むｐ ＭＴ−２プラスミド（Ｂｏｎｔｈｒ。

ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：２７０−２７３．　１９８６）によ り、記載の如＜ＤＥＡＥデキストラン法を用いてトランスフェクトした（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１．９８９）ｏ　３日間培養後、トランスフェク トされた細胞をメチオニン不含借地（ＧＩＢＣＯ）中、３５Ｓ−メチオニンで代 謝的に標識するか、あるいはジギトニン溶解緩衝液で氷上３０分間直接溶解した 。溶解細胞はエッペンドルフ・ミクロフユージ中で３０分間遠心し、次いでその 上清をウサギ抗マウスＩｇに結合したプロティン（Ａ）−セファロースを用いて 予め清澄にした。免疫沈降は２５ｔｔＩのｍＡｂ−ＴＩＡ−１−セファロース、 ポリ（Ａ）アガロース、あるいはポリ（Ｃ）アガロースを用いて４時間、４℃で 行った。次いて、ビーズを、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析前にジギトニン溶解緩衝液で ４回洗浄した。

免疫プロッティング 免疫プロッティング分析はＡｎｄｅｒｓｏｎらによる記載のようにして行った（ Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４４：５７４−５８２．　１９９０）。単クローン 抗体ＴｒＡ−１を用いて現像した免疫プロットを、ウサギ抗マウスＩｇＤａｃｋ ｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に続いて＋２５　Ｉ−プロティンＡ （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いるか、ヤギ抗マウス：アル カリ性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）に続いて５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルりん酸（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＣＴ、　Ｓ　 Ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ　ｌ　Ｃｏ）を用いて検出した（Ｋｉｎｇ　ｅｔ　 ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８２：４７１７−４７２１゜１ ９８５）。ウサギ抗体を用いて現像した免疫プロットは、ヤギ抗ウサギ：ホース ラディツシュ・ペルオキシダーゼに続いてＥＬＣ光依存試薬（Ｅ　Ｌ　Ｃ）を、 供給者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）による記載のように使用して検出した。

ノーザンブロツティング 細胞の総ＲＮＡは表示細胞からＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載さ れているようにして分離された。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースク ロマトグラフィー（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて精製した 。等量のポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ　（５μｇ）を１．４％ホルムアルデヒド・アガ ロースゲル上で、記載通りに分離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）。受動拡散によりニトロセルロースに転移した後、プロットは、５０ ？６ホルムアミド、５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ−２５ｍＭ　ＫＨＰ　０４　、ｐＨ７， ４，５Ｘ　デンハート溶液、５０ｍｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ中、４時 間、４２℃で前ハイブリッド形成を行った。プローブＤＮＡはニックトランスレ ーションによって３２Ｐで標識し、前記溶液で希釈してニトロセルロース・プロ ットに１２−２４時間、４２℃でハイブリッド彰成をした。プロットを次いで、 オートラジオグラフィー露出前に、０，１％ＳＤＳを含むＩＸ　ＳＳＣで２回洗 浄した。プロットを次いでＨ２Ｏ中で１０分間煮沸してはがし、アクチンをコー ドする直鎖ＤＮＡを用いて再プローブした。

ＴＩＡ−１抗原関連ｃＤＮＡの分子クローニングＴＩＡ−１抗原特異的プローブ でプローブしたゲノムＤＮＡのサザンプロットは予想外に複雑であった（図１７ ）。この結果は、ＴＩＡ−１抗原の遺伝子が非常に大きいか、あるいはＴＩＡ− １抗原関連遺伝子が交差１１イブリツド形成によって検出されていたかを示唆す るものである。そこで我々は、ＰＨＡで活性化されたＴ細胞由来のλｇｔｌｌ　 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、３２Ｐ−標識ＴＩＡ−１抗原のｃＤ ＮＡと／ｈイブリッド形成を行った。いくつかのＴＩＡ−１関連のくしかし明瞭 ではない）ｃＤＮＡがこの方法で確認された。これら変異νｃＤＮＡをＴＩＡ− １ゲノム配列と比較したところ（未発表の結果）、１つを除いてすべてが、ＴＩ Ａ−１遺伝子のスプライス変異型（保持されたイントロン、あるいは明らかに別 のスプライス産物）であるらしいことが示唆された。

このようにして確認されたＴＩＡ−１抗原関連遺伝子（ＴＩＡＲ）のコーディン グ配列を図１８Ａ（配列番号３）に示す。ＴＩＡＲ（配列番号３）とＴＩＡ−１ 抗原（配列番号１）の推定アミノ酸配列の比較を図１８Ｂに示す。ＴＩＡ−１抗 原のように、ＴＩＡＲはＲＮＡ結合タンパク質ファミリーの一員で、３つのＲＮ Ａ結合領域及び１つのカルボキン末端補足領域を持っている。両タンパク質のＲ ＮＡ結合領域において、ＴｌＡｌ抗原とＴＩＡＲとは高度に相同である（８５９ ６以上のアミノ酸同一性）。両タンパク質のカルボキシ質末端補足領域の関連は 低いが（６０％以下の相同性）、両分子はリゾソーム標的指向モチーフ（図１８ Ｃ）を持も、ＴＩＡ−１抗原のように、ＴＩＡＲが細胞障害性の顆粒に結合した タンパク質であるかも知れない。

ＴＩＡ、Ｈの発現と特性認定 Ｔｌ１−１抗原とＴＩＡＲ間の構造相似性は、ＴＩＡＲが恐らく１つのＲＮＡ結 合タンパク質であることを示唆した。これを確認するために、ＴＩＡＲをコード するｃＤＮＡをｐＴ７−７ベクター中にサブクローニングして大腸菌ＢＬ２１を 形質転換するのに用いた。ポリ（Ｕ）セファロースあるいはポリ（Ａ）セファロ ースを用いる細菌溶解液の親和沈降によって、ＴＩＡ、−１抗原及びＴＩＡＲの 両者を特異的に分離することが可能となった（図１９Ａ）。ＴＩＡ−１抗原がポ リ（Ａ）ホモポリマーに結合するがポリ（Ｃ）ホモポリマーには結合しないこと は以前に証明されているが、これらの結果は、ＴＩＡ−１抗原及びＴＩＡＲの両 者が１種以上のホモポリマーに結合出来ることを示唆（、−〇いる。興味あるこ とに、ＴＩＡ、−１及びＴＩＡＲ両者の２−〕の０勺子が大腸菌に発現されてい る。優勢な４（’）ｋｄ’ａ＋１恐らく完全長の組替えタンパク質であり、一方 、３８　ｋ、　ｄ型は、恐らく完全長の組み替えタンパク質のタンパク分解産物 か、内部のメチオニンから開始された組替えタンパク質てあろう。単クローン抗 体１Ｈ１ｏがＴＩＡＲを認識するので、ＴＩＡ−１抗原の精製に用いられた２段 階親和クロマトグラフィー法を利用してこの組替λタンパク質を精製することが 可能となった。

ＴＩＡ、−１抗原とＴＩＡＲ間の構造を目録性は、これらの分子が類似した機能 活性を持つ可能性を示唆した。そこで我々は、ジギトニンで透過性にされた胸腺 細胞を用いて精製ＴＩＡＲの核分解活性を測定した。図１−９Ｂは、ＴＩＡ−１ 抗原及びＴＩＡＲが共に透過性胸腺細胞にＤＮＡ断片化を誘導することを示す。

ＴＩＡＲの調製に用いられたのと同じ発現系がら精製された組替え白血球共通抗 原関連ホスファターゼ（ＬＡＲ）の等量では、これらの細胞にＤＮＡ断片化は誘 導されなかった。同様に、等量のラン血清アルブミンもこれらの細胞にＤＮＡ断 片化を誘導しなかった。

実験操作 免疫プロッティング 免疫プロッティングは前記のように行われた。単クローン抗体ＩＨＩＯを用いて 現像した免疫プロットは、アルカリ性ホスファターゼに共役したヤギ抗マウス免 疫グロブリン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈ　ｅｍ、　Ｃｏ、　）に続きＢＣＩＰ及び ＮＣＴ（Ｓｔｇｍａ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、）を用いて検出した。単クローン抗体 １．　Ｈ１０は、標準ハイブリドーマ操作により、マウスを組替え４０ｋＤのＴ ＩＡ−１抗原で免疫して生成した。Ｉ　Ｈ１，Ｏは単クローン抗体ＴＩＡ−１に よって認識されるものとは異なったＴＩＡ−１抗原上の抗原決定基を認識する。

親和沈降 大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）をＴＩＡ、−１抗原あるいはＴＩＡＲをコードする 挿入ＤＮＡを含むｐＴ７−７プラスミドベクターで形質転換した。細菌溶解液は 前記の☆０＜調製した。組替えタンパク質は、大腸菌溶解液からポリ（Ａ）セフ ァロースあるいはポリ（Ｕ）セファロース（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）を用い て親和沈降した。１ｍｌの細菌培養（ＯＤ６ｏｏ−０，４５）由来の大腸菌溶解 液を５０７１Ｉのセファロースビーズの５０％（容量比）浮遊液と１時間４℃で インキュベートした。セファロースビーズは次いてＰＢＳで３回洗浄し、５ＤＳ −試料緩衝液で溶出して、１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した 。ニトロセルロース（Ｓ　ａｎｄ　Ｓ）への転移に続いて免疫プロットは前記の 如く現像されｔ二。

ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定 フィトヘマグルチニンで活性化したＴ細胞（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）由来のλｇｔ１ ．１ｅＤＮＡライブ−１ｙ’Ｊ−を１５０ｍｍベトリ皿当たり３０，０００個の ブリーり濃度で大腸菌Ｙ　１．０９０株の菌叢上に配布した。３７℃で１２時間 インキュベーンヨシン後ハイブリッド形成操作前にプレートをニトロセルロース フィルターで１分間被覆した。各フィルターは、５０％ホルムアルデヒド、５Ｘ 　ＳＳＣ。

２５ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐＨ７，４）　、５Ｘデンハート溶液、及び５０μ ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中で４−１２時間、４２℃で前ハイブリッド形成 をした。プローブＤＮＡはニックトランスレーンヨンによって３２Ｐ−標識し、 前記溶液で希釈してニトロセルロースフィルターに１２−２４時１１１．４２℃ でハイブリッド形成した。フィルターは次いて、オートラジオグラフィー露光前 に、０゜１？６ＳＤＳをａむ５Ｘ　ＳＳＣで２回、そしＴｏ、１％ＳＤＳを含む １．Ｘ５ＳＣて２回洗浄した。陽性のプラークは、各別個に選別し、大腸菌Ｙ］ 、０８８株のプレートに展開する前に、３回サブクローニングした。ファージＤ ＮＡをブレート溶解液から抽出し、Ｅ　ＣＯＲＩて消化して挿入断片を遊離し、 ｐｓＰ６５プラスミドＤＮＡ中にサブクローニングした。シークエナーゼ（ＵＳ Ｂ）を用いるジブ；・ギシ配列決定は、オリゴヌクレオチドプライマー及びアル カリ変性プラスミドＩ）　Ｎ　Ａを用いて行った。

サザシブロ・ノティング ヒトゲ、ツムＤＮＡ　（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を、０，７％アガロースゲル上の 電気泳動分離前に掲示された制限酵素で４時間、３７℃で消化した。アルカリ変 性後、ＤＮＡを、室温で１２時間のキャピラリブロッティングによりニトロセル ロースに転移した。ニトロセルロースフィルターは、次いて、前ハイブリッド形 成及びＴｒＡ−１抗原をコートする３２Ｐ　、識プローブを用いるハイブリッド 形成の前に、８０℃で２時間、真空オーブンで焼乾した。

組替えタンパク質の精製 組替えＴＩＡ−１抗原及び組替えＴＩＡＲは両方とも、ＴＩＡ−１抗原精製のた めの上記２段階親和クロマトグラフィーの修正法を用いて精製された。免疫親和 クロマトグラフィ一段階において、我々は単クローン抗体ＴＩＡ−１の代わりに 中クローニング１Ｈ１０を使用した。

ＤＮＡ断片化 ＴｌＡｌ抗原及びＴＩＡＲが、ジギトニンで透過性にしたヒトの胸腺細胞にＤＮ Ａ断片化を誘導する能力を上記のようにして検査した。

使用試薬 ＴＩＡ−１抗原あるいはＴＩＡＲをコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）検出用プ ローブは、２Ｇ９．４　（配列番号１）　、Ｔ４Ｔ８．’１５　（配列番号２） あるいはＴＩＡ、ＲｃＤＮＡ（配列番号３）、あるいはそれらの部分を用いて標 準方法によって調製することが可能である。この様なプローブは、例えば、与え られたｇｆ４中に相補的核酸の存在を示唆するためのＰＣＲあるいはｉｎ　５ｔ ｔｕハイブリツド形成法を用いる検査に使用することが出来る。

ＴＩＡＲあるいはＴｒＡ−１抗原、またはそれらの生物学的に活性な断片を、化 学的に、あるいは組替え体的に、細胞標的指向性リガンド［成長因子（例、ＩＬ −２）、ホルモン（例、インスリン）、あるいは細胞表面受容体に対して特異的 な抗体］に結合し、Ｍｕｒｐｈｙ、米国特許番号４，６７５．３８２に記載され 、本願に引用参照されている方法を用いて標的細胞死滅に使用することが可能量 Ｆの登録が、ブダペスト条約の必要条件に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに登録されている。

登録品目　凹　受託番号 大腸菌株 Ｔ４Ｔ８．９−５　１．９９０年１月５日　６８２０２ハイフリドー−ｖ　ＴＩ Ａ−１，１，９９０年１月５日　ＨＢ　１０３１．９申請者の指定代理人、ダナ ・ハーバ−癌研究所はＡＴＣＣが、もし特許が許可されたならば、登録の永久性 及び公衆によるその容易な入手を提供する登録所であることを表明する。そのよ うに登録された物質の公衆に対する入手可能性に関するすべての制限は、特許の 許可とともに撤去され改変されることはない。特許申請未決の間、コノ物質は、 ３７ＣＦＲ１，，１４及び３５ＵＳＣ１，２２１＝従い、特許局長官によって資 格があると決定された者に対して入手可能である。登録された物質は、それを生 きた状部て且つ汚染されないように保つためにすべての必要な注意をはらって、 登録微生物試ｆ４提供に対する最も最近の要請後生なくとも５年間、そしていか なる場合も登録の日付から少なくとも３０年の期間、あるいは特許の実施期間、 そのいずれか長い方の期間、維持されるであろう。申請者の指定代理人は、もし 、登録所が、請求があった場合に登録物質の状態のために試料を提供出来ないな らば、登録物質を取り替える義務を認めるものである。

配列明細書 （１）一般情報 （＋）申請者：　Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、 　Ｉｎｃ。

（ｉ　ｉ）発明の名称：　ＤＮＡ５　ＥＮＣＯＤＩＮＧ　ＰＲＯＴＥｒＮＳＡＣ ＴＩＶＥ　ＩＮ　ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ　ＣＹＴＯＴＯＸＩ ＣＩＴＹ（ｉｉ＋）配列の数：　９ （ｉｖ）通信宛名： （Ａ）宛名人：　Ｆｉｓｈ　＆　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｂ）通り：　２２５　 Ｆｒａｎｋｌｉｎ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市：　Ｂｏｓｔｏｎ （Ｄ）州：　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｄ）国＋　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

（Ｅ）郵便番号：　０２１１０−２８０４（Ｖ）コンピュータ読取りフオーム。

（Ａ）　ミディアム　タイプ： （Ｂ）コンピュータ： （Ｃ）操作系： （Ｄ）ソフトウェア： （ｖｉ）最新の申請データ・ （Ａ）申請番号： （Ｂ）申請の日付： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）以前の申請データ： （Ａ）申請番号：　０７／７２６，６０７（Ｂ）申請の日付・　１９９２年２月 １９日（Ａ）申請番号：　０７／８４３，９４９（Ｂ）申請の日付：　１９９２ 年２月１９日（ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）弁護士、代理人の情報：（Ａ）姓名：　Ｆｒａ ｓｅｒ、　Ｊａｎｉｓ　Ｋ。

（Ｂ）登録番号：　３４，８１９ （Ｃ）認可証番号：　００５３０１０２１ＷＯ３（ｆｘ）テレコミュニケーショ ン情報 （Ａ）ｍ話 （Ｂ）テレファックス （Ｃ）テレックス （２）配列番号１に対する情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ＋　２２２８ （Ｂ）型：　鎖酸 （Ｃ）鎖状：　二本鎖 （Ｄ）トポグラフィ−；　直鎖 （ｘｉ）配列の記述：　配列番号１： 入ＣττＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴにτττ　τ入＾入＾ＡにＡＡＡ　ＣＡ＾Ｇ ＾丁ＧＣＴＧ　ＧＡＴＧτＣＴＧＣＣ＾Ａτ丁ＴＴτＣＣＣP３９１ ’！’ＴＣＡＴＴＡＣＣＴ　ｅＡ？ＡＪ、ＡＯτ〒〒ＣτＣ＾Ｇ八τＣζ＝℃Ｔ ！ＴへＣｋＡＡＣＡＣＡＡＡ　’ｌ’ＧｃＡＧＧＧＡＴＴ１S５１゜ ？ＡＡ１１：ｍττｉ　ＧＣ入τＧＴＣλ＾ＡＡτＣ＾入入τ入Ｃ入　τλＣτ ττＧＧτ入　ＧτＣτフ〒Ｃ入＾入　入Ａ＾Ａ＾＾＾　２Q２８ （２）配列番号２に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　’　１６１８ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖状；　二本鎖 （Ｄ）トポゲラフィー：　＠鎖 （ｘｉ）配列の記述：　配列番号２： ＴＡＡＧＴＴにＴＴＴ　ＧＣｋＴＧＴＧ入入Ａ　ＡＴＣ入八Ａへ八ＣへＴ八Ｃへ Ｔ丁ＧＧＴＡ　ＧτＣτＴτＣ＾Ａ＾　入へ＾へＡ＾Ａ　１U１１１ （２）配列番号３に対する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　１４０１ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖状：　二本鎖 （Ｄ）トポゲラフィー：　直鎖 （ｘｉ）配列の記述：　配列番号３： ＾ＣＣＣＴＧＣＣＣＴ　ＣＧＧＣＣ〒ＴＯ〒ＣＣＣＧＧＧ入τＣＧＣ丁ＣＣＣτ ｃｃｃ入ＣＣＣＡＣＣＡτＧｋ丁ＧＧ入Ａ　５４Ｍｔ　Ｍ＠ｔ　ＧＬｕ 丁ＡτＧτ入Ｃ入ＡＡ　Ａ　１４０１ （２）配列番号４に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝　６ （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖状： （Ｄ）トポゲラフィー：　直鎖 （ｘ　ｉ）配列の記述：　配列番号４：ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＧＬｕ　？ｈ ｒ　Ｇｉｎ（２）配列番号５に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；　６ （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖状： （Ｄ）トポゲラフィー：　直鎖 （ｘｉ）配列の記述、配列番号５： （２）配列番号６に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝　６ （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ） （Ｄ）トポゲラフィー：　直鎖 （ｘｉ）配列の記述；配列番号６ｚ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　６ （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖状： （Ｄ）トポグラフィ−；　直鎖 （ｘ　ｉ）配列の記述：配列番号７ （２）配列番号８に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；　６ （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖状 （Ｄ）トポゲラフィー：　直鎖 （ｘｌ）配列の記述：配列番号８： （２）配列番号９に対する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　６ （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖状 （Ｄ）トポゲラフィー：　直鎖 （ｘｉ）配列の記述：配列番号９： す塗１・目・Ｅ＞　Ｈ＜　’ｉｉＺ召・ヨ・ヨ・Ｈ・型トトトトヨ・トヨ・ト目 ・ ８８０′　七′　＝８　四″ニーＷ　足“　む１　仁“　乏２冒トトヨ・Ｌ−ト ドトロ・ト 馨トトヨ・ｉ、ｈ　５ｚ仝・Ｅ−５・輯・ＴＩＡ−１のカルボキシ末端における リゾソーム膜モティーフの発現 ×　！ ｃｖ’＋　の 噂　へ ｑフ ！　！ ＦＩＧ、１３ 時間 Ｍ　Ｏｏ、５１２４６８ ＦｆＧ、　ｉ５ａ 時間 ６　４　２　末梢血リンパ球　「ｐ４０ＦＩＧ、　１７ ＦＩＧ、　１８ａ−１ ＦＩＧ、　１８ａ−２ ＦＩＧ、　１８ａ−３ ＡＧＡ　Ｔ’ｒＴ　ＧＣＴ　ｍ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＣに　’Ｉ’ＧＴ　 ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＧＴＴ　ＣＴＧ　００７７貫ＴＡＡ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＧＴＴ 　ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　にＡＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ 　ＴＴＡ　ＴＧＴＦＩＧ、　１８ａ−４ リソソームを標的指向するモチーフ ＴｔＡ−Ｉ　Ａ　Ｇ　Ｙ　Ｅ　Ｔ　Ｏ−０００８ｍ日　Ａ　Ｓ　Ｙ　Ｑ　Ｔ　Ｑ 　−ＣｏｏＨＬＡＭＰ−Ｉ　Ａ　Ｇ　Ｙ　Ｑ　Ｔ　Ｉ　−ＣＯＯＨＬＡＭＰ−２ Ａ　Ｇ　Ｙ　Ｅ　ＯＦ　−ＣＯＯＨＬＡＭＰ−３Ｓ　Ｇ　Ｙ　Ｅ　Ｖ　Ｍ　−Ｃ ＯＯＨＩｇｐ１２０　Ａ　Ｇ　Ｙ　Ｑ　Ｔ　ｌ　−ＧＯＯＨ輩　９ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、ＪＰ （７２）発明者　シュロスマン　スチュアート　エフアメリカ合衆国　マセチュ ーセッツ州　ニュートンセンター　ワンフォックスプレイス

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＴＣＣ番号ＨＢ１０３１９と命名された（イブリドーマによって生成され る単クローン抗体に免疫学的反応性を持つポリペプチドをコードする配列を含む 分離されたＤＮＡである。
2. ２．請求項１記載の分離されたＤＮＡであって、ここで上記ポリペプチドがＡＴ ＣＣ番号６８２０２と命名されたプラスミドによってコードされる配列と本質的 に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とする方法。
3. ３．請求項１記載の分離されたＤＮＡであって、ここで上記ポリペプチドが配列 番号１、２あるいは３に示されているものと本質的に同一のアミノ酸配列を持つ ことを特徴とする方法。
4. ４．ＡＴＣＣ各号６８２０２と命名されたプラスミドの１０個のヌクレオチドの 断片からなる核酸プローブと巌密条件下にハイブリッドを形成する分離されたＤ ＮＡを特徴とする方法。
5. ５．配列番号２あるいは３のコーディング配列からなる核酸プローブと低次厳密 条件下にハイブリッド形成をする分離されたＤＮＡを特徴とする方法。
6. ６．ＡＴＣＣ番号６８２０２と命名されたプラスミドによってコードされている ポリペプチドをコードする配列を含む分離されたＤＮＡを特徴とする方法。
7. ７．あるベクターの精製標品であって、当該ベクターが請求項１に記載されてい る分離されたＤＮＡを含むことを特徴とする方法。
8. ８．ＡＴＣＣ番号ＨＢ１０３１９と命名されたハイブリドーマによって生成され る抗体と免疫学的に反応性のあるポリペプチドをコードする配列からなる分離さ れたＤＮＡを包含する細胞を特徴とする方法。
9. ９．ＡＴＣＣ番号ＨＢ１０３１９と命名されたハイブリドーマによって生成され る単クローン抗体と免疫学的に反応性のあるポリペプチドの本質的に精製された 標品を特徴とする方法。
10. １０．タンパク質を生成する方法であって、当該方法が前記の分離されたＤＮＡ の発現を可能にし、前記の分離されたＤＮＡによってコードされているタンパク 質を回収するような条件下に、請求項８記載の細胞の培養を含むことを特徴とす る方法。
11. １１．生物学的試料中の細胞溶解性リンパ球存在を決定する方法であって、当該 方法が以下のことからなることを特徴とする。 請求項１記載の分離されたＤＮＡの少なくとも１０個のヌクレオチドからなる断 片と同一の配列からなるプローブに前記試料から採取したＲＮＡを接触させるこ と、及び 前記のプローブが前記のＲＮＡとハイブリッドを形成するか否かを決定すること 、ここで、前記プローブの前記ＲＮＡとのハイブリッド形成は、当該試料中に細 胞溶解性リンパ球が恐らく存在することを示唆するものである。
12. １２．細胞死滅に用いる組成を特徴とする方法であって、前記の組成は、製剤上 許容される希釈剤中に、ＡＴＣＣ番号ＨＢ１０３１９と命名されたハイブリドー マによって生成される単クローン抗体と免疫学的に反応するタンパク質を含んで いる。