JPH03502571A - 不妊と避妊のための透明帯抗原と抗体の調製法及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （２９）組織適合性のある動物の中に細胞を注入し、インビボでモノクローン抗 体を作り、該抗体は動物の腹水症の体液から回収できるようにしている請求の範 囲第２８項に記載の連続的細胞系統。

（３０）透明帯に結合する抗体であって、透明帯抗原で免疫が与えられた嘔歯類 の牌臓細胞と嗜歯類の骨髄腫細胞の融合ハイブリッドを有する、連続的細胞系統 から作られた反透明帯モノクローン抗体。

（３１）透明帯に結合する抗体であって、ＡＴＣＣＨＢ　９６６５と同一の特性 をもった細胞系統によって作られた反透明帯モノクローン抗体。

（３２）避妊に必要な量の反透明帯モノクローン抗体を個体に投与することによ る、個体の避妊方法。

（３３）請求の範囲第１項又は第２項のポリペプチドであって、避妊に必要な量 のポリペプチドを個体に投与することによる、個体の避妊方法。

（３４）個体は、ウシ、ブタ、ネコ及びイヌからなる群から選択される請求の範 囲の範囲第３３項に記載の方法。

（３５）個体は人間である請求の範囲第３３項に記載の方法。

明細書 発明の名称 不妊と避妊のための透明帯抗原と抗体の調製法及び使用 ［発明の分野］ 本発明は、個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）の避妊又は不妊のための透明帯（Ｚ Ｐ）抗原及びモノ（単）クローン抗体についての製法及び使用に関する。本発明 は免疫学的避妊にも関する。より具体的には、本発明は、組換えＤＮＡ技術によ って作られた透明帯（ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）抗原を用いて妊娠しない ように個体に自動釣又は活性的（Ｂｃｔｉｖｅｌｙ）免疫を与え、又は透明帯抗 原に抗する又は反する作用を行なうようにモノクローン抗体を作り個体に受動的 （ｐａｓｓｉｖｅｌｙ）免疫を与える免疫学的避妊に関する。更に、本発明はＺ Ｐ抗原に擬態（ｍｉｍｉｃ）する抗遺伝型又は反遺伝型（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔ ｙｐｅ）のモノクローン抗体を用いて、妊娠しないように個体に自動免疫を与え る技術に関する。

本発明は、更に又、透明帯抗体に反する作用又は抗する作用をする、モノクロー ンの抗透明帯抗体又は反透明帯抗体（ａｎｔｉ−ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ 　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、かかる抗体をエクスプレス（ｅｘｐｒｅｓｓ）する新規 なハイブリドーマ細胞、並びにかかるハイブリッド細胞（交雑細胞）及び反透明 帯抗体（抗透明帯抗体）を作る方法に関する。

［背景技術の簡単な説明］ 透明帯は細胞外の複合的な糖タンパク質基質であって、哺乳動物の卵母細胞を取 り囲んでいる。この基質は、卵母細胞の成長初期段階、及び卵胞（濾胞）の細胞 分化の初期段階で形成され、子宮壁に着床するまでの間、卵母細胞及び胎児を保 護する役割を果たす（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、ケンブリ ッジ、英国（１９８２）、オースチン他、「ｒＩＭ乳類の生殖：生殖細胞と受精 」）。更に、受精は精子が最初に透明帯に固着し透明帯に侵入するのであるから 、透明帯は受精過程で重要な役割を果たす。卵母細胞の透明帯に結合した後、精 子は透明帯に侵入しなければならない。精子が透明帯へ侵入できるのは、おそら く、アクロシンのような精子酵素によって、透明帯要素が限定された範囲で加水 分解されるためと考えられる（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４３：　７７？（１９７４）、マクローリ−他；　Ｂｆｏｌ 、　Ｒｅｐｒｏｄ、３２：６１９（１９８５）、ダンパー他）：Ｇａｍ、　Ｒｅ ｓ、　１：６５．１９７８、スタンバラ）。透明帯は、受精した後、無傷状態が 維持されるため、胎児がうまく成育し、卵管中で胎児の融合が防止される（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ　１３８：５９４．１９６２、ミンッ）。

最後に、透明帯は多数の精子が受精するのを阻止する役割を果たす。哺乳類の中 には、受精すると、透明帯に結合する精子を変質させ、タンパク質分解消化に抵 抗するものもある（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　３３：３５８．１９５６、オ ースチン及びプレイトン）。

人間に近い霊長類及び人間を含むその他の種（ｓｅｐｃｉｅｓ）と比べて、嘔歯 類の透明帯の場合、その特性は、主として生物学的、形態学的、生理学的及び免 疫化学的に変わる。これについては、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、 １３９　（１９８３）ニューヨーク、ダンパー「受精のメカニズムとコントロー ル（Ｊ、　Ｈａｒｔｍａｎｎ、　ｅｄ、）Ｊ　；　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、　 Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、５０５　（１９８３）、ロンドン、ダンパー「生殖免疫に おける国際会議（Ｗｅｇｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｇ１１ｌ　ＩＩＩ、　ｅｄｓ、）Ｊ 　）　；　Ｍｏｄｅｒｎ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ　３　（Ｓａｔｉｒ、　ｅｄ 、）　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　ｐｐ、７７（１９８４）。

ニューヨーク、ダンパー他、等を参照することができる。

哺乳類の透明帯は、主要な糖タンパク質が、限られた数から構成されるけれども （Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　７６：１８５　（１９８０）、プレイル他；　Ｂｉｏ ｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　２４：１１１１　（１９８１）、ダンパー他；　Ｂｉｏ ｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　（１９８７）ティモンス及びダンパー）、種が異なれば 、透明帯の構造的及び機能的な関係は変動する。

精子による卵母細胞の受精を抑制したり、受精卵の着床を防止したり、又は卵巣 の発育を防止するワクチンを作り出すのに必要な抗原及び抗体を相当量作るため の材料（物質）が十分でないため、免疫避妊を有効に１７かも経済的に行なうこ とはできなかった。初期の免疫避妊法は、はとんどうまく行かなかった。この方 法は、絨毛性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）や濾胞成熟ホルモンのように自然発 生の循環ペプチドを使用していた（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（Ｇ、Ｐ。

Ｔａｉｗａｎ）、　１９８６　ニューヨーク、グリフイン「避妊の免疫考察及び 受精率の促進」）。通常、免疫避妊において［循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ） Ｊ抗原に抵抗する抗体を用いると、免疫複合体が組織を損傷するという好ましく ない問題が生じる。さらに、「循環」抗原を用いて免疫を与えても、受精抑制効 果があまりないこともわかった。

免疫学をベースにした避妊方法は、一般的に利用されている外科的不妊法又は受 胎調節ピル（人間及びペットの場合）よりも望ましい。ピルの場合、一定間隔で 購入し服用せねばならないため、薬代に絶えずコストがかかり、また、その効果 もほんの一時的なものにすぎない。

このため、安全で、信頼性が高く、しかも経済的にも安価に提供され、一時的又 は永久的に個体の避妊を行なえる抗原が要請されている。

［発明の概要］ 本発明者は、免疫学的に不妊又は避妊させるために、清浄化又は純化（ｐｕｒｉ ｆｉｅｄ）された透明帯抗原を用いることに着目した。透明帯抗原を用いて免疫 性を与えることは、他の免疫学的避妊法よりも明らかに利点がある。透明帯抗原 による免疫は、だ胎作用によるのではなく、受精を抑制するのである。この免疫 避妊法は、人間にとって特に好ましい。さらに、この方法は卵巣の濾胞の発育を 抑えて、永久的に不妊とするようにもできる。ペットやその他動物をこのように 永久的に不妊とする場合にも、非外科的で行なうことができるので、これまでの ような外科手術による危険性を伴ったり、費用がかかることもない。

透明帯のタンパク質免疫避妊におけるその他の利点として、数リットルの透明帯 で受精を阻止できることが挙げられる。これは、免疫避妊抗体の作用がその部位 で局部的に特有の性質を発揮すること、及び受精を阻止しようとする個体中での 透明帯タンパク質の自然発生量を限定することによるものである。帯層抗原の組 織特性に関するこれまでの研究は、卵巣についてのものであり、抗原は循環しな い。これに対して、ホルモンタンパク質は個体の中を循環して、はるかに高いレ ベルで生じる。また、循環する抗原のレベルは個体の生理学的な状態によっても おおいに変動する。

さらに、精子抗原の免疫避妊を有効ならしめるために必要な精子抗原のレベルは 、腟管及び子宮腔の精子量によって変化する。

種々の動物のＺＰタンパク質は、免疫学的に交叉反応性（ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔ ｉｖｅ）であるため、避妊させたい動物の免疫抗原を発育させる必要性はない。

本発明の１つの目的は、免疫学的な方法で効果的に避妊させる方法を提供するこ とにある。この方法によれば、１回（又は最少）の投与を行なうだけですむから 、医師（人間の場合）又は獣医（動物の場合）に絶えずかかわる必要はなくなる 。また、永久的に不妊又は去勢（ペットの場合に望ましい）とすることもできる し、一時的に不妊（人間や飼育ベットの場合に望ましい）とすることもできる。

また、免疫避妊に使用するための透明帯抗原及び抗体の供給が限られていること が、従来法の不利な点の１つであった。これに対し、本発明は、免疫避妊を行な うための透明帯抗原及び抗体は、組換えＤＮＡ技術によって作られた透明帯抗原 、モノクローン透明帯抗原及びＺＰ反遺伝型抗体のように、入手源がきわめて豊 富である。

抗原及び抗体は、組換えＤＮＡ技術及びハイブリドーマ技術を用いて多量に作る ことができるため、コストが安いという追加の利点がある。

本発明は抗原の調製、及び透明帯抗原中に見い出されるエピトープの決定因子と 反応する抗体を誘発（ｉｎｄｕｃｅ）させるために動物に免疫を与える方法に関 する。本発明は、さらにまた、モノクローンの反透明帯抗体、かかる抗体をエク スプレスする新規なハイブリドーマ細胞、並びにかかるハイブリッド細胞及び反 透明帯抗体を作る方法に関する。さらに、本発明は反遺伝型透明帯のモノクロー ン抗体、及び該抗体の使用による自動又は活性免疫避妊に関するものである。

個体の抗原（例えば、糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ））は、多くの 抗原決定因子、即ち「エピトープ」を有していてもよく、この因子は抗体によっ て認識（ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ）される。エピトープには、アミノ酸配列、炭水化 物残分、配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）又は「形状（ｓｈａｐｅ）Ｊの 決定要素、或は２つの異なる分子又はペプチドが相互作用する部位が含まれる。

透明帯構造の糖タンパク質には、これら種類の決定要素がすべて含まれる（Ｂｉ ｏ、　Ｒｅｐｒｏ、　３０：４４５　（１９８４）　、　　ドレルとダンパー： 　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏ、　３６：１２７５　（１９８７）。

ティモス）。

本発明の第１の実施例では、組換えＤＮＡ技術を用いることにより、透明帯タン パク質抗原のポリペプチド部を含む抗原を作るものである。本発明のタンパク質 の実施例では、透明帯タンパク質のポリペプチド決定因子部を含む抗原を、組換 えＤＮＡ技術を用いて作るものである。なお、これらの組換えポリペプチド、及 びその同族体（ａｎａｌｏｇｓ）は、ここではこれらを総合的に、組換え透明帯 タンパク質と称するものとする。

「透明帯（ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）タンパク質」の用語には、天然的に 自然発生する透明帯タンパク質、組換えによる透明帯タンパク質及びその同族体 と、同じアミノ酸配列をもったポリペプチドを含むものとする。「同族体」とい う用語には、ポリペプチドが透明帯タンパク質の抗原的及び生物学的活性が実質 的に同じならば、１種又は２種以上のアミノ酸の添加、削除又は置換による透明 帯タンパク質とは異なるタンパク質又はポリペプチドを含むものとする。これら の同族体は、透明帯タンパク質の選択された決定因子の部位を含んでいる。これ らの抗原剤を用いて、動物を免疫し、抗体を作ることができる。

本発明にあっては、本発明の抗原剤（抗原ｇｓ製物）及び免疫反応高揚要素を有 する薬組成物も又、薬学的に適当なキャリヤと共に、本発明に包含されるもので ある。このように、一実施例において、本発明は、透明帯タンパク質又はそのパ ーツのアミノ酸配列を含むほぼ純化されたポリペプチド、透明帯タンパク質の暗 号をもったＤＮＡ配列を含むエクスブレラシコン運搬体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｖｅｈｉｃｌｅｓ）、かかるエクスブレラシコン運搬体で改質した宿主、宿主 中に透明帯タンパク質を作る方法、及び透明帯の組換えタンパク質を有する薬組 成物で動物に免疫性を与えることにより動物の体内に透明帯抗原に対する抗体の 生成を誘発する方法を包含するものである。

他の実施例において、本発明はモノクローンの反透明帯抗体、かかる抗体をエク スプレスする新規なハイブリドーマ細胞、及びかかるモノクローン抗体を用いて 免疫学的に避妊する方法を含むものである。

免疫性がもらされたた供球体（ｄｏｎｏｒｓ）からの骨髄腫細胞と胛臓細胞を融 合することにより、均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｅ。

ＵＳ）抗体を得ることに成功した。このようにして、遺伝学的に安定なハイブリ ドーマ細胞であって、悪性腫瘍及び特異性ビールス及びそれらの抗原決定因子に 抗するモノクローン抗体を大量に作ることができるハイブリドーマ細胞の連続的 な細胞系統（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）を開発した。

コブロウスキー及びその他の物に付与された米国特許第４１７２１２４号には、 悪性腫瘍に特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す抗体は、体細胞ハイブリッ ドによって、ヒポキサンチン燐リボスチルトランスフェラーゼが欠乏する悪性腫 瘍と、先に腫瘍細胞が注入された動物から得た牌臓又はリンパ細胞との間に作ら れることが記載されている。さらにまた、コブロウスキー及びその他の物に付与 された米国特許第４１９６２６５号には、遺伝学的に安定な融合細胞ハイブリッ ドであって、特定のビールス及びそれらの抗原決定因子に抗するモノクローン抗 体を大量に作ることができるハイブリッドの連続的な細胞系統を作ることができ ることが記載されている。

このような細胞融合技術を用いることにより、反透明帯抗体、例えば免疫避妊抗 体を、安定して供給することができ、信頼性も高い。

個体の免疫は活性的（自動釣）又は受動的に行なうことができる。「活性（自動 ）免疫」という用語は、抗原又は免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）が個体に投与さ れ、個体の免疫系統が抗原に抗する個体を作ることを意味する。免疫抗原は、個 体が抗体を作ることのできるものであればどんな物質を用いることもできる。本 発明にあっては、個体を避妊又は不妊とするために、個体を自動免疫するために 有効な抗原には、グリコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）　しているが否か に拘らず、組換えによって作られたＺＰ抗原（ｒ　Ｚ　Ｐ）と、反遺伝型ＺＰ抗 体が含まれる。「受動免疫」という用語は、個体の外部のインビトロで作られた 抗体が、免疫避妊のために個体に投与されることを意味する。本発明のＺＰモノ クローン抗体は、個体に投与されると、このような受動免疫を作り出す。

モノクローン抗体でＺＰ抗原に受動免疫することにより、一時的（望ましくは数 か月間）に不妊状態となる。反ＺＰモノクローン抗体は、透明帯に結合又は侵入 する精子に干渉することにより、受精を抑制するもので、このとき卵巣機能に悪 影響を及ぼすことはない。このように、本発明の免疫避妊方法は、透明帯抗原に 反作用するモノクローン抗体を投与することにより受動的に行なうことができる し、或は組換えＤＮＡ技術により作られた透明帯抗原又は反遺伝型モノクローン 抗体を投与することにより自動釣に行なうこともできる。

均質な抗体（例えば、モノクローンの抗体）を抗原として用いるとき、分子の部 分は、免疫をもった宿主が応答し、抗原決定因子として認識される。抗原性決定 因子を認識する均質抗体の特有の組合せ部位は「遺伝型」と称される。このため 、抗体のこれらの部位に抗して作られた抗体は、「抗遺伝型又は反遺伝型」と称 される。これらの抗体は「内部像（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｉｍａｇｅｓ）Ｊを有し てもよく、もとのインミュノジエンに擬態する活性を有することもできる（Ｐｒ ｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７５：２ ４４３　（１９７８）、セージ、ケイとピーターソンＰ、Ａ、：　Ｐｒｏｃ、　 Ｓ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　？７：　７３８５　（ １９８０）、シュライパー他）。

モノクローン抗体（ＰＳＩ）は、第８図に示すように、精子が透明帯の表面に結 合するのを抑制するＺＰの炭水化物成分を認識する。ＰＳＩのモノクローン抗体 は、反遺伝型抗体を作るための免疫原として用いることができる。抗体は免疫学 的に不妊又は避妊とするために用いることができる。

モノクローンの反透明帯抗体に結合する決定因子は、クローン化し、組換えＤＮ Ａ技術を用いて改質（ｍｏｄｉｆｙ）することにより、ＺＰ抗原性決定因子に抗 する「単一鎖抗体」を作ることができる（Ｐｒｏｃ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８１：３２７３　（１９８４）、キャビリー他；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２：３７９１　（１９８４）、ボス他）。

［図面の簡単な説明］ 第１図は２Ｄ−ＰＡＧＥゲル免疫プロット法により、ライブラリのスクリーニン グを行なうために用いられた抗体認識ＺＰ抗原を表わしている。

第２図はブタＺＰタンパク質とラビットＺＰタンパク質のＮ−ターミナルアミノ 酸配列を示している。

第３図はλｇｔｌｌベクターであって、ＺＰのｃ　ＤＮＡをクローン化すること を目的としてエクスプレッションライブラリを発展させるために用いられるベク ターの制限エンドヌクレアーゼの分割マツプ（ｃｌｅａｖａｇｅ　ｍａｐ）ヲ示 でいる。

第４図はＺＰ抗原をエクスプレスする３つのクローンのＤＮＡ配列を示している 。

第５図は卵巣にＺＰ　　ＲＮＡは存在するが、その他の組繊には存在しないこと を表わしたノーザンプロット分析を示している。

第６図はクローンＰ１からのλｇｔｌｌＤＮＡの５ＤＳ−ＰＡＧＥ免疫プロット を示している。

第７図はラビットの卵巣機能に対する活性免疫の結果を示している。

第８図は精子がＺＰに血清結合するのを、モノクローン抗体が抑制することを示 している。

［望ましい実施例の簡単な説明コ その最も基本的なレベルにおいて、発明は、透明帯抗原を遺伝学的に設計調製す ることを明らかにすると共に、受精、着床（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ＞、卵胞 の発育及びそれに引き続く卵巣のホルモン形成機能を防止することを目的として 、動物の免疫系統を刺激し、透明帯抗原に対する抗体の形成を誘発させるために 前記の抗原を利用する方法を明らかにするものである。

発明者は、組換えＤＮＡ技術を用いて、透明帯抗原をコード化したｃＤＮＡを作 る方法を考案した。ＺＰ　　ｃＤＮＡは、エクスブレフシ３ンベクターλｇｔｌ ｌの中に挿入される。このエクスプレッションベクターを用いて大腸菌（Ｆ並１ ｉ、）を形質変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｎ＋）させる。クローンをエクスプレスす るＺＰタンパク質又はその決定因子は、ＺＰ抗体結合によって識別される。一本 鎖ファージから分離したＤＮＡを、ＺＰ抗原をエクスプレスするために、ＤＮＡ のコピー（転写物）及びｃＤＮＡを作り出すための鋳Ｌ２　（ｔｅｍｐｌａｔｅ ）として用いる。ＺＰ　ＤＮＡ配列をコード化したλｇｔｌｌファージＤＮＡを 、ｐＥＸベクターの中に挿入する。ｐＥＸを用いて、ＤＮＡがエクスプレスされ る細菌宿主に形質転換させ、免疫避妊に使用できるＺＰ抗原を大量に作るもので ある。

親和純化した（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ）　Ｚ　Ｐ抗体でλｇｔ１ １圧出ライブラリをスクリーニングすることによって選択された３つの９　　ｃ ＤＮＡエクスプレッションクローンの部分的ＤＮＡ配列を求めるのに、Ｍ１３ク ローン化法（Ｐｒｏｃ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３　（ １９７７）、サンガー他）が用いられていた。すなわち、クローン法はジデオキ シ連鎖停止反応法であって、透明帯ＤＮＡは糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔ。

ＵＳ）のバクテリオファージＭ１３の中にクローンが形成される。

透明帯の遺伝子が、原子核をもつ宿主大腸菌の中でエクスプレスされると、作り 出されるポリペプチドはグリコシド化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）　していな い。このため、主なブタのＺＰポリペプチドの分子重量は、約３５．５５及び８ ０Ｋｄである。また、主なラビットのＺＰポリペプチドの分子重量は、５０．７ ５．８５Ｋｄ（第１表）であり、グリコジル化した分子（第１表）に対して観察 される値よりも低い。例えば、原核生物の中で、透明帯ポリペプチドの暗号をも つ透明帯ＤＮＡから生産された透明帯タンパク質は、［ｒＺＰＪ又は「組換え透 明帯タンパク質」として称される。

更に、透明帯タンパク質の暗号をもつ遺伝子が真核生物の中で作られると、タン パク質はグリコスチル化され、このグリコスチル化したタンパク質は［ｒｇＺＰ Ｊと称される。［免疫学的に関連ある抗原」とは、透明帯タンパク質に対して、 重要なゲノム相同関係を有する抗原を意味しており、これらのＤＮＡによってエ クスプレスされた生産物は、免疫学的に交叉反応性をもち意義のあるレベルを示 す。このような免疫学的に関連ある抗原の例として、自然発生するＺＰ抗原より も多少のアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。これは、透明帯ポリペプチ ドと免疫学的又は生物学的に重要な性質である交叉反応性を有している。

本発明の中で使用される「宿主」には、原核生物だけではなく、植物細胞及び動 物細胞と同じように、酵母（イースト）及び糸状の菌類をも含むものとする。

「原核生物」には、透明帯をエクスプレスするためのＤＮＡ又はｒＺＰタンパク 質で形質転換され得る細菌をすべて含むものとする。

「真核生物」には、透明帯をエクスプレスするためのＤＮＡ又はｒＺＰタンパク 質で形質転換され得る酵母、菌類、動物細胞及び植物細胞のすべてを含むののと する。

透明帯タンパク質のＤＮＡは、どんな哺乳類からでも得ることができる。糖タン パク質の遺伝子配列が原核有機体又は真核有機体の中でエクスプレスされること が必要とされるすべてである。透明帯ＤＮＡの配列が、哺乳動物類（例えば、ブ タ、ラビット、イヌ、ネコ又は人間等）の間で免疫学的に交叉反応性を有するこ とが特に望ましい。

いわゆる当業者であれば周知のどんな技術を用いて宿主を変化する場合にも、透 明帯タンパク質の暗号をもつ組換えＤＮＡ分子を使用することができる。なお、 原核生物の変換のためには、透明帯の暗号をもった配列を含むベクターを使用す ることが特に望ましい。

本発明の透明帯組換えタンパク質（ｒＺＰ）は、自然発生、すなわち天然の透明 帯タンパク質のアミノ酸配列と比較して、その端部側面（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｅ ｎｄｓ）において多少のアミノ酸を有することができる。

「実質的にピュア（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｐｕｒｅ）Ｊという用語を、 本発明の透明帯タンパク質に適用する場合、ポリペプチドは、その天然の状態で 透明帯タンパク質と正常な関連性を有したり、定常的に増殖可能な電気泳動又は クロマトグラフ応答、溶離プロフィール（ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅＳ） 、及び抗原活性を呈する、といったその他の卵巣タンパク質を含まないことを意 味する。「実質的にピュア」という用語は、透明帯タンパク質とその細化合物と の人工又は合成混合物を排除するものではない。

融合によって、リンク作用する遺伝子を作り、これら遺伝子を細菌の中にエクス プレスする方法は知られており、例えば米国特許第４３６６２４６号に開示され ている。ここに記載した遺伝子の製造及び方法は、原核生物又は真核生物宿主中 の透明帯タンパク質のエクスプレスを行なうために利用することができる。

原核生物の宿主は、ダラム陰性細菌又はグラム陽性細菌でもよく、例えば、大腸 菌、Ｓ、　Ｔ　ｍ　ｈｉｍｕｒｆｕｍ、セラチア属マルセッセン、枯草菌が挙げ られる。

真核生物の宿主は、ピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）又は 哺乳類の細胞のような酵母でもよい。

一般的には、エクスプレッションベクターは、挿入されたＤＮＡ断片の転写を効 率良く行なわせるためのプロモータ配列を含んでおり、そのベクターが宿主と共 に使用される。エクスプレッションベクターは、通常、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔ ｉｏｎ）の原体（ｏｒｉｇｉｎ）、プロモータ、ターミネータを含み、さらに、 トランスフオームすなわち形質転換された細胞の中で表現選択を行なう能力のあ る特異遺伝子を含んでいる。トランスフオームされた宿主は、当該分野で知られ た手段により、発酵及び培養させることにより、最適な細胞に成長させることが できる。

本発明で使用することができるプロモータの例として、ｒｅｃ　ＡＳｔｒｐ、　 １ａｃＳｔａｃ、及びバクテリオファージラムダｐＲ又はｐＬが挙げられるが、 これらに限定されるものではない。本発明で使用することができるプラスミド又 はバクテリオファージの例として、モニアティス他によるｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ 　ＣｌｏｎｉｎｇＪ　（コールドスプリングハーバ−ラボラトリーズ、　１９８ ２年）の中に掲げられたものが挙げられるが、いわゆる当業者であればこれ以外 にも適当なものを用いることができる。

本発明は、前述した方法によって変質させた（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）どんな宿主に 対しても、また当業者であれは一般的に知っている方法によって変質させたどん な宿主に対しても適用することができ、透明帯タンパク質の遺伝子をエクスプレ スする原核生物又は真核生物を産生できる。なお、当業者が知っている方法とし て、例えば、溶原性ファージを用いて遺伝性物質をトランスファーする方法が挙 げられる。

遺伝子は、その鋳型または伝令ＲＮＡを通じて、特異ペプチドに対して特徴的な アミノ酸配列を暗号化したＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡという用語には、介在配 列が除去された遺伝子を含むものとする。ｒＤＮＡという用語は、ｃＤＮＡ又は ゲノムのＤＮＡ配列を試験官内（インビトロ）でスプライシングして組み換えら れた分子を意味する。

クローンを作る運搬体、すなわちクローニング運搬体は、プラスミド又はファー ジＤＮＡ又は、宿主細胞内で複製することができるその他のＤＮＡであり、１つ 又は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられる。その部位にて 、かかるＤＮＡ配列等は、ＤＮＡの本質的生物学的機能を損なうことなく、決定 因子が備わるように切り取ることができる。また、運搬体には、形質変換された 細胞の識別に使用される適当なマーカーを含んでいる。マーカーは、例えばテト ラサイクリン抵抗体又はアンピリジン抵抗体が挙げられる。「ベクター」の用語 は、クローニング運搬体として使用することもある。

エクスプレッション運搬体は、クローニング運搬体と同様な運搬体であるが、通 常の場合、制御配列のコントロールを受けながら、宿主の中で構造遺伝子をエク スプレスする能力を有する。

透明帯タンパク質を透明帯ゲノムで形質変換した宿主は、透明帯ポリペプチド及 びタンパク質の製造に特に有用であり、動物の免疫に使用することができる。既 に説明したように、透明帯タンパク質のゲノムがバクテリア内でエクスプレスさ れると、グリコシレージョンは起こらない。このため、全長組換え透明帯タンパ ク質の分子重量は、天然又は自生の分子よりも小さい（第１表参照）。

組換え透明帯タンパク質は、透明帯タンパク質のアミノ酸配列全体でもよいし、 特異な決定因子だけでもよい。

透明帯紐換えタンパク質で免疫を与えられた動物は抗体を作り、この抗体が組換 えポリペプチド又は天然ポリペプチドに存在するエピトープに結合する。このよ うに、透明帯を含有する組換えタンパク質を商業的規模で作ることができる。

本発明で使用される「免疫学的な有効量」とは、動物の中で透明帯エピトープに 結合する抗体を作るのに必要な透明帯抗原の量を表わすものとする。

「個体」という用語は、−切の動物を含むが、望ましくは哺乳動物、最も望まし くは、ネコ、イヌ、ウシ又は人間を含むものとする。

本発明の透明帯組換えタンパク質は、動物の免疫系統を感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚ ｅ）するのに特に有効である。このため、その１つの結果として、透明帯に存在 するエピトープと反応する抗体が作られる。

個体の免疫は自動釣又は受動的に行なうことができる。

「自動（活性）免疫」という用語は、抗原又は免疫原が個体に投与され、個体の 免疫系統が抗原に抗する個体を作ることを意味する。免疫抗原は、個体が抗体を 作ることのできるものであればどんな物質を用いることもできる。

本発明にあっては、個体を避妊又は不妊とするために、個体を自動免疫するため に有効な抗原には、グリコシド結合しているか否かに拘らず、組換えによって作 られたＺＰ抗原（ｒＺＰ）と、反遺伝型ＺＰ抗体か含まれる。

「受動免疫」という用語は、個体の外部のインビトロで作られた抗体が、免疫避 妊のために個体に投与されることを意味する。本発明のＺＰモノクローン抗体は 、個体に投与されると、このような受動免疫が作られる。

個体が卵巣の熟成前にＺＰ抗原又は反遺伝型抗体で免疫が与えられると、卵巣の 発育は著しく阻止され、取戻し不可能な永久不妊にすることができる。この方法 によって、免疫を与えて動物を避妊させることができ、特にネコやイヌのような 生殖させたくないベットなどの動物に適用することが望ましい。このようなｚＰ 免疫避妊法の場合、コストが高くて潜在的な危険を伴う外科的処置は不要となる 。

免疫避妊には、他の種に対しても免疫学的に交叉反応する透明帯ペプチドが望ま しい。ブタ又はラビットの卵巣から得た透明帯を暗号化し７たＤＮＡが望ましい 。

他の実施例においで、本発明は透明帯のモノクローン抗体をエクスプレスする新 規な連続ハイブリドーマ細胞系統を明らかにし、さらに抗体の製造にかかる細胞 系統の使用、及びかかる細胞系統の製造を明らかにする。本発明は、さらに受動 避妊に使用される反透明帯抗体を大量に獲得する方法を明らかにする。

本発明によれば、反透明帯抗体をエクスプレスする新規な連続ハイブリドーマ細 胞系を得るには、透明帯タンパク質、望ましくは透明帯の組換えタンパク質、最 も望ま（７くは天然の透明帯抗原で動物に免疫を与え、抗体生産細胞の間に、融 合したハイブリッド細胞を免疫が与えられた動物及び骨髄腫細胞から形成し、ハ イブリッドのクローンを作り、反透明帯抗体をエクスプレスするクローンを選択 することにより行なわれる。より具体的には、マウスその他の動物に、精製した 透明帯抗原が注入され、動物の牌の抗体生産細胞は、癌型のマウス細胞又は骨髄 腫の細胞と融合される。そのような抗体を生産する細胞のクローンは、連続細胞 系統として選択され、成長する。

これから、大量の反透明帯抗体を得ることができる。

或は又、クローンのハイブリッド細胞を、組織適合性（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔ ａｂｌｅ）のある動物の中に注入して増殖させ、高レベルの反透明帯抗体を作る ことができる。細胞は、動物の腹水症流動体（ａｓｃｉｔｅｓ　ｆｌｕｉｄ）か ら再生（ｒｅｃｏｖｅｒ）できる。

このように、本発明は、免疫避妊に使用される反透明帯抗体を、かなり大きな規 模で、高い信頼性をもってし。

かも安定して供給することを可能ならしめるものである。

「免疫避妊」という用語は、免疫学的介在法によってもたらされるものであって 、後で受精可能な一時的避妊、再び受精ができない永久避妊、又は不妊を含むも のである。

本発明は、一時的な不妊症をもたらすために行なう受動免疫のためのモノクロー ン抗体抗体の使用、又は作動免疫のための天然抗原（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ ｌ　Ｒｅｖ、　９４：　２５．１９８６、アーランジャー他）の構造に擬態する 反遺伝型抗体の使用を含むものである。

透明帯紐換えタンパク質とモノクローン抗体への投与は、注入、長いインブラン トを用いる方法（ｌｏｎｇ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｍｐｌａｎｔｓ）、迅速注入（ ｒａｐｉｄ　１ｎｆｕｓｉｏｎ）、静脈又は鼻腔からの吸収（ａｂｓｏｒｐｔｉ ｏｎ）、皮膚吸収等の非経口的投与、及び経口投与により行なうことができる。

非経口投与の調製物として、無菌又は水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジ ョンが挙げられる。非水性溶剤の例として、プロピレングリコール、ポリエチレ ングリコール、オリーブ油の如き野菜油、オレイン酸エチルの如き注入可能な有 機エステル等が挙げられる。閉鎖包帯（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ　ｄｒｅｓｓｉｎｇ ｓ）用キャリヤを用いて、皮膚の浸透性を高め、抗原の吸収を高めることができ る。経口投与するときの液体の形態は、一般的には、液体の投与形態を含んだリ ポソーム溶液である。液体投与の適当な形態として、エマルジョン、懸濁液、溶 液、シロップ、及びエリキシル等を挙げることができる。なお、これらには、例 えば清浄水のように、当該分野で一般的に知られている不活性の希釈剤が含まれ る。不活性の希釈剤の他に、補助薬すなわちアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｓ ）、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味剤及び香料等も更に含めることがで きる。

本発明にかかる透明帯の組換えタンパク質を含有する抗原性調製物の場合も、ア ジュバントを含めることができる。アジュバントは、特異な免疫応答を非特異的 に促進するために使用される物質である。通常の場合、アジュバントと抗原は、 免疫系統に与えられる前に混合されるか、又は別個に与えられる。但し、免疫を もたせるべき動物の同じ部位に与えられる。アジュバントは、それらの組成に応 じて、幾つかのグループにばらばらに（ｌｏ。

５ｅｌｙ）分割される。これらのグループには、油アジュバント（フロイントの 完全アジュバント及び不完全アジュバント）、鉱物塩（例えば、ＡＩＫ（ＳＯａ ）ｓ、ＡＩＮａ（ＳＯａ）＊、ＡＩＮＨ，（Ｓｏ、）、シリカ、アラム、Ａｌ（ ＯＨ）３、Ｃａｎ　（ＰＯ４）　！、カオリン及びカーボン）、ポリヌクレオチ ド（例えば、ポリＩＣ酸及びポリＡＵ酸）、及び天然物質（例えば、結核菌から のワックスＤの他、コリネバクテリウムパルブム（釦り肪仲ａｃｔｅｒｉｕｍ　 Ｂ■朋）の中に見い出される物質、百日咳菌及びプルセラ属の一部）が含まれる 。

本発明にかかる透明帯抗原の調製物を動物の体内で使用することにより、透明帯 のエピトープ決定因子に結合する抗体を作ることができる。透明帯に対する抗体 の生産を向上させる上で特に有用な方法は、先ず動物に、本発明にかかる透明帯 の抗原性調製物で第１の免疫を与え、その後、第２の免疫を与える方法である。

最初の免疫は、動物の年齢が重要なものとなる。永久的に免疫避妊又は不妊とす るには、動物の青春期が始まる２〜３か列前の年齢の時に免疫を与えるのが最も 望ましい。この時が、卵巣の成熟に最も著しく干渉するからである。受精を回復 ならしめるように避妊するには、卵巣の濾胞が発達した後でエクスプレスしたＺ Ｐ抗原を用いればよい。

動物に免疫が与えられたか否かは、透明帯抗原に対する動物の免疫状態を判断す ることによって知る方法がある。この評価は、本発明にかかる透明帯の組換えタ ンパク質を免疫検定（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いて、透明帯に対する抗体 を検出することができる。免疫検定として、例えばＥＬｒＳＡ検定（Ｂｉｏｌ、 Ｒｅｐｒｏｄ、３０：４４５．１９８４、ドレルとダンパー）が知られている。

その場合において、透明帯に対する個体抗体のタイター（ｔｉｔｅｒ）が十分に 高い時、すなわち、確実に免疫がもたらせれて妊娠を予防できる時を判断するこ とが可能である。

多くの免疫養生法（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｍｅｎ）が利用される とき、免疫法のタイミングによって異なる多くの技術がある。本発明にかかる抗 原性調製物を２回以上用いることが可能であり、これによって、免疫が与えられ た動物によってエクスプレスされた免疫グロブリンのレパートリ−のエクスプレ ッションのレベルを高め、多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を増すことができる。

複数免疫法による場合、一般的には、１〜６か月間の間隔があけられる。

動物に投与された透明帯の組換えタンパク質の適量は、年齢、状態によっても異 なる。また、免疫の目的が避妊するためか、または卵巣を去勢するためかによっ ても異なるし、それ以外のその他の要因によっても異なる。しかし、当該分野の 専門家であれば、投与すべき量は容易に確認できるし、調節することもできる。

本発明にかかる抗原性調製物の投与は、１回でもよいし、複数回でもよい。透明 帯抗原の投与量は、１回につき、０．０１〜５ｇ／ｍｌの範囲で変えることがで きる。なお、より望ましくは、０．０５〜１．０ｇ／ｍｌであり、最も望ましく は０．１〜０．５ｇ／ｍｌである。

本発明の詳細な説明したが、以下の具体的の実施例を参照することにより、本発 明をより完全に理解することができる。なお、これらの実施例は、例示的なもの であって、特に指定しない限り、本発明を限定するものと解すべきではない。

大犯胴ユ ＺＰタンパク　の　　と　クローン　　　の　１Ａ、透明帯（ＺＰ）の分離（ｉ ｓｏｌａｔｉｏｎ）透明帯（ＺＰ）を、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒ、２５（２）：４ ３９（１９ｇりに記載されたウッド他による方法に基づいて分離した。

２つのホイール（直径１０ｃｍ）を備え、５０列にそろえたカミソリ刃の間をス テンレス鋼のワッシャー（２ｍｍ）で夫々仕切った装置を用いた。２つのホイー ルのうち一方は固定し、他方のホイールはチェーンを介して回転ハンドルに取り 付けた。樹脂ガラス製タンク内に浸漬したカミソリ刃のホイール間に、卵巣を落 とした。なお、タンク内には、ｐＨ７，２の０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ ）を６リツトル、クエン酸ナトリウム２ｍＭ、及びＥＧＴＡ２ｍＭが入れられて いる。約３００個の卵巣をカミソリ刃のホイールを通過させた後、破裂した卵巣 を樹脂ガラスのタンクの底部の１０００μｍメツシュの着脱式ナイロンスクリー ン上に沈積させた。スクリーンを取り外して卵巣を緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）から 分離し、十分に洗浄を行なって卵巣に付着した卵母細胞を取り除いた。卵母細胞 と透明帯は、次に種々サイズのナイロンメツシュスクリーンを通し、ふるい分け して分離した。卵母細胞は、均質化され、５０ミクロンメツシュのナイロンスク リーンを通して洗浄し、帯層を保持した。この方法を用いたとき、８時間で約１ ００゜０００〜３００，０００のＺＰを分離することができた。

Ｂ、ＺＰタンパク質の清浄化（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）分解力（ｒｅｓｏｌ ｕｔｉｏｎ）の大きい二次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ） を用いて、ＺＰタンパク質を清浄化（ピュア化）した。ＰＡＧＥは、前述したよ うに、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒ、　２４：１１１１（１９８１）の中にダンパー他 が記載している。この方法は、第１の次元では等電集束法によってタンパク質を 分離し、第２の次元ではポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）を用い て、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を分離する。

約３０，０００の帯層のベレットを、３００μｌの可溶化緩衝剤、２％のＳＤＳ 、２％のβ−メルカプトエタノール、及び１％のシクロへキシルアミノスルホン 酸（ＣＨＥＳ）を含み、ｐＨ９，５〜９．６の水中にて再び懸濁させた。４％Ｐ ＡＧＥ　（１，８％のビスアクリルアミド交差結合剤（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｅ ｒ）を含む）ゲル毎に４０マイクロリットル加えた。ｐＨ範囲が３．５〜１０と 広いアムフォライン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ）　（Ｌ　Ｋ　Ｂ　）をＰＡＧＥゲ ルに添加した。ゲルは、２００　Ｖで２時間予備集束した後、２５℃、４００■ にて１６時間集束させた。

第２の次元のＳＤＳ　　ＰＡＧＥに対しては、スラブゲル（ｓｌａｂ　ｇｅｌ） （１０−２０％勾配のポリアクリルアミド及び０゜８％ビスアクリルアミド交交 差台剤）を用いた。ゲルは、室温にて染料（ｄｙｅ）の先端がゲルの底部に達す るめで、約３アンペアで電気泳動を行なった。タンパク質は、染色法により、ク マシーブルー又はシルバーの何れかにより識別することができる。ＺＰ抗原は、 グリコシレージョンの進行によって、電荷及び分子重量の両方において異質を呈 する独特のタンパク質プロフィールを有している。ＺＰ抗原は、以下に記載する ように、電気泳動によってニトロセルロースにトランスファーした後、第１図に 示すように、免疫プロット（ｉ＋＋ｕｎｕｎｏｂｌｏｔ）により識別した。ｚＰ タンパク質は、電気泳動によりゲルから溶離した。ＺＰタンパク質のＮターミナ ル配列は、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９１：２２７　（１９８３）にバンク ピラー他が開示した方法により求めた。

主なブタのＺＰポリペプチドの分子重量は、約３５．５５及び８０Ｋｄである。

また、主なラビットのＺＰポリペプチドの分子重量は、５０．７５．８５Ｋｄ（ 第１表）であり、グリコジル化した分子（第１表）に対して観察される値よりも 低い。

第１表 ブタ及びラビットのＺＰタンパク質のグリコジル化及びデグリコシル化した分子 重量の概算値 ＺＰ　Ｉ　　　　４Ｏ−１１０Ｋ　　　　　４２Ｋ　　　　　　　３５ＫＺＰＩ Ｉ　　　７Ｏ−１１０Ｋ　　　　　６０Ｋ　　　　　　　５５ＫＺＰＩＩＩ　　 　９５−１１８Ｋ　　　　　８０Ｋ　　　　　　　８０に几Σ Ｉ　　　　６８−１２５Ｋ　　　　　６５Ｋ　　　　　　　５０Ｋｎ　　　　８ ｌ−１００Ｋ　　　　　８０Ｋ　　　　　　　７５ＫＩＩＩ　　　１００−１３ ２Ｋ　　　　　９０Ｋ　　　　　　　８５に夫ｈＡユ クローン　ＺＰ　　　の　１ 多クローン性抗体を酸ラビット又は去勢した雄ヒツジに、すべて熱で可溶化した ３００〜５００μｇの透明帯（ＨＳ　ＺＰ）（０，０１Ｍの炭酸ナトリウムの緩 衝剤中６０〜６５℃、ｐＨ９゜５で１〜２時間）にて、免疫を与えることによっ て調製した。或はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥゲルで分離した精製ＺＰタンパク質約５ ０〜２００μｇを用いて免疫化した。タンパク質のすべての試料を１ｍｌの水中 で懸濁し、注入前にフロイントの完全アジュバントを用いて乳化した。動物の皮 層内の肩甲骨の下の多くの部位に注入し、４週間後、初期免疫の使用量の半分の ＺＰタンパク質を用い、フロイントの不完全アジュバントの中でブーストした。

幾つかのものについては、フロイントの完全アジュバントを用いて毎月、追加の ブーストを行ない、より高い抗体のタイターを得ることができた。

抗体は、酵素結合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）法又は免疫プロット法を用いて、分析 し特徴づけた。ＥＬＩＳＡ検定では、ベクターラボラトリ−から入手したベクタ 染料キット（Ｖｅｃｔａ　５ｔａｉｎ　Ｋｉｔｓ）を用いて、ラビット、ヒツジ 又はマウスの免疫グロブリンを検出した。この検定のために、０．ＩＭのＮａＣ Ｏ５、ｐＨ９，０のＨＳＺＰタンパク質５０−１００μｇを９６のくぼみ付滴定 トレイのくぼみ内に添加した。

次に公知の方法により、キットの指示に基づいて検定を行なった。免疫プロット 法では、前述したＢｉｏｌ、　Ｒｅｐｒ。

３６　：１２７５にティモンズ他が開示した方法を用いて、特異なＺＰ糖タンパ ク質とペプチドの識別をした。未染色、未固定の２Ｄ−ＰＡＧＥゲルをニトロセ ルロース紙（Ｂｉ針Ｒａｄ）のカソード側に載せ、Ｅ−Ｃ電気プロットトランス ファーユニットを用いて、１．３Ａにて２，５時間トランスファーを行なった。

ニトロセルロース紙は次に１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン （トリス）−塩水（ｓａｌｉｎｅ）、ｐＨ７，２の中で、３重量％ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）と０．０１％のアジ化ナトリウムを用いて、１晩中閉塞（ｂｌ ｏｃｋ）　Ｌ、た。その後、トリス−塩水−アシド（Ｂ　Ｓ　Ａなし）を２回交 換して洗浄した。多クローン性血清（１−５ｍｌ）又はモノクローン抗体の上澄 （１００μｇ／ｍｌの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、５０ｍ１のトリス−塩水 −アシド（ＢＳＡ）の中で希釈し、２５℃にて１晩中揺すりながら、ニトロセル ローストランスファーで培養した。その後、トリス−塩水−アシド（Ｂ　Ｓ　Ａ なし）を２回交換して洗浄した。

次に、ニトロセルローストランスファーを、多クローン性血清用１１８１−タン パク質Ａ又はモノクローンの上澄用Ｌ２８１−ヤギ、アンチマウスＩｇＧで培養 した。５０ｍ１のトリス−塩水−アシト中の合計１０’ｃｐｍを各トランスファ ーに添加し、揺すりながら１晩中培養した。空気乾燥前に、トリス−塩水−アシ ド（ＢＳＡ）の中で十分洗浄し、コダックＸＡＲ−５のエックス腺フィルムに露 出して放射能写真を撮影した。

抗体は、ＺＰタンパク質に接合したＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ）を用いて親和清浄化を行なった。

ＣＮＢｒ活性化セファローズ４Ｂ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて親和カラ ムを調製した。樹脂は熱可溶化Ｈ８ＰＺ又はＨ８ＲＺ（ラビットの熱可溶化透明 帯タンパク質）のどちらか一方に結合した。約１　ｍｇ／ｍｌのＺＰ調製物を、 前述したように、ｐＨ９，６の可溶化緩衝剤の中で作った。ＺＰは、結合緩衝剤 （０，１Ｍ　ＮａＨＣＯｓ；　０．５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ８，３）の中で懸濁さ せた。樹脂を洗浄し、１ｍＭ　Ｈｃｌの中で膨張させ、ＺＰを結合緩衝剤の中に 入れる前に、結合緩衝剤で速やかに洗い落とした。緩衝剤には、０．５　ＮａＣ １が含まれており、タンパク質同士の相互反応を最少にすることができる。混合 物は室温で、約２時間ゆっくりと回転した。結合緩衝剤は未反応のＺＰ溶液と共 に取り除き、樹脂はＩＭのエタノールアミンの中で、ゆっくりと回転しながら４ ℃にて１晩中培養し、残留する活性グループを閉塞させた。次に樹脂は、１ｍＭ 　ＮａＨＣＯｓ（ｐＨ８，３，０，５Ｍ　ＮａＣ１）で３回洗浄し、その後０， １Ｍのアセテート緩衝剤（ｐＨ４，０，５Ｍ　ＮａＣ１）で洗浄した。

抗血清は、４℃にて１晩中ゆっくりと回転しながら、結合された樹脂で培養した 。溶離を行なう前に、樹脂を室温まで暖め、硼酸塩／塩水緩衝剤（１００ｍＭ硼 酸、７５ｍＭ硼酸ナトリウム、７５ｍＭＮａＣ１、ｐＨ８，４）ｒ十分に洗浄し 、未結合のタンパク質を完全に取り除いた。結合したＩｇＢの溶離は２００ｍＭ のグリシン（ｐＨ２，７，０，８％ＮａＣ１）を用いて行なった。酸のフラクシ ョンは、０．２Ｍのトリズマ塩基（Ｔｒｉｚｍａ　ｂａｓｅ）の中に直接集めら れ、最終溶液のトリズマ：グリシンは１：２であり、ｐＨ７，５であった。この 中和作用によって、溶離して清浄度の高い抗体への損傷を最小にすることができ る。

抗体を含有したフラクションの部分標本を作り（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）、分析を 行なうために冷凍した。免疫親和性抗体の清浄化は一次元の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分 析により明らかにされた。

裏五桝１ ｃＤＮＡクローン　エクスプレス　るＺＰタンパク　の分屋 いわゆる当業者であれば、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８：５２９４　（１９７９）に チルブライン他が開示した方法を用いて、６週のラビット、１２週のラビット、 及び６か列置上のラビットの卵巣からＲＮＡを調製できることは認識できるであ ろう。

卵巣は多量の結合組織を含んでいるため、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏ ｎ）する前に、液体窒素の中で冷凍した後、微細な粉末に砕くのが望ましい。４ 〜８の卵巣を、メルカプトエタノールの存在下にて、４Ｍのチオシアン酸グアニ ジニウム（０，０２５Ｍのクエン酸ナトリウム、０．５重量％のナトリウムラウ リルサルコシン、ｐＨ７，０）の中で均質化した。均質物（ｈｏｍｏｇｅｎａｔ ｅ）は、ＪＡ−２０のロータの中で、１０　、００Ｏｒｐｍにて、１０℃で１０ 分間、遠心力作用を受けた。

すべてのＲＮＡは、塩化セシウムを通して、エタノール析出又は沈降により、タ ンパク質から分離した。上澄み層は、３．８ｇ／１００　ｍｉｓのＥＤＴＡをに ナトリウム塩）を含有する５、７ＭのＣｓＣ１であり、５Ｗ−４０のロータの中 で、３２　、００Ｏｒｐｍにて、２０℃で２０時間遠心作用を与えた。ペレット は、塩酸グアニジンの中で再び懸濁させた。ＲＮＡは、３Ｍの酢酸ナトリウム（ ｐＨ５，２）０．３ｍｌと９５％エタノール２゜２容積で、沈降（ｐｒｅｃｉｐ ｉｔａｔｅ）させる。−２０’Ｃにて１晩中、・培養した後、ＲＮ　Ａ　ハ、１ １５００ｒｐｍ、−５℃、１ｏ分間ノ遠心力作用により回収（ｒｅｃｏｖｅｒ） する。ＲＮＡは、９５％エタノールで２回の洗浄を行ない、水中に溶解した。Ｒ ＮＡのりカバリ−は、２６０／２８０の吸光度比率を測定することによりモニタ ーされる。ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ）　ＲＮ　Ａは、オ リゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーを用いて分離した。このクロマトグ ラフィーは、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（ １９８２）、ｐ、　１９７のマニアティス他による「分子クローニング」に記載 されている。

クロマトグラフィーのカラムのフラクションは、ｌ５ＣＯ分光光度計を用いてＡ 、６゜でモニターした。

細胞型の特異ｃＤＮＡプローブは、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　８１：２１９４（１９８４）にデービス他、及びＰｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：１１９４　（１９８３ ）にヤング他が記載している。エクスプレッションライブラリーの調製に用いた グラムｇｔｌｌベクターを第３図に示している。ｃＤＮＡのライブラリーを作る ため、卵巣組織がら分離したポリＡ−ｍＲＮＡを２マイクログラム用いて、各ｃ ＤＮＡを合成した。最初の鎖のｃＤＮＡは、オリゴｄＴのプライミング及び逆転 写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の添加によって合成し た。逆転写酵素の添加し、４３℃にて６０分間、培養した後、ＥＤＴＡの添加に よって反応を終了させる。試料は、フェノール：クロロフォルム：イソアミルア ルコール（２５：２４：１）を用いて抽出する。水性相（ａｑ、ｕｅｏｕｓ　ｐ ｈａｓｅ）を取り除き、有機相を１ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ８，０）を含 有する１０ｍＭのトリス−ＨＣｌを含む０．１Ｍ　ＮａＣ１で再び抽出した。水 性相をプールした後、ＤＮＡを２Ｍの酢酸アンモニウムで沈降させた後、９５％ エタノールを添加した。冷凍・解凍後、溶液に遠心作用を与え、２５μｌの１０ ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（Ｔ　Ｅ　）の中で再 び溶解させた。７．５Ｍの酢酸アンモニウムを１０マイクログラム、９５％のエ タノールを５０μ１１添加する。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは大腸菌ＲＮＡａ ｓｅＨにより切り開かれた（ｎＬｃｋｅｄ）＋第２の鎖（ｓｅｃｏｎｄ　５ｔｒ ａｎｄ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの合成は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにより行なった 。

二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ　５ｔｒａｎｄ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、Ｔ４ＤＮＡポリメ ラーゼにより、プラント終端させた（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）。ＣＤＮＡは、 ＥｃｏＲＩリンカ−（ｌｉｎｋｅｒｓ）に結紮する前に、ＥｃｏＲ１部位でメチ ル化した。リンクしたｃＤＮＡは、次にＥｃｏＲＩ酵素で処理し、ＢｉｏＧｅｌ 　Ｐ２Ｏ（ＢｉｏＲａｄ）のクロマトグラフィーで清浄化し、ここに記載した方 法に基づいて、ストラテジェン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ）から得たλｇｔｌｌの腕 （ａｒｍｓ）に結紮した。この方法によれば、６週のラビット及び８か月ラビッ トのライブラリに対しては約５ｘ１０個の斑が得られ、１２週ラビットのライブ ラリに対しては１ｘｌＯ’個の斑が得られた。

ライブラリをスクリーニングした場合、１００ｍｍのプレートにつき５　ｘ　１ ０”個の斑が得られた。次に、斑はＩＰＴＧを含浸させたニトロセルロース紙に トランスファーされ、プローブは、実施例２で記載の容量にて調製した抗血清を 用いた。

タンパク質配列は多くの種の中で類似しているため、ｃＤＮＡをエクスプレスす るタンパク質配列を分離する必要がある。このため、ウサギのＺＰタンパク質に 抗する多クローン性抗体が、ブタのＺＰカラム（実施例２の如く、臭化シアン活 性化セファローズに結合したＺＰタンパク質）上で親和清浄された。０．１Ｍグ リシン（ｐＨ２）で溶離した抗体は、ラビットとブタのＺＰタンパク質に関連す る抗原を認識できるものである。

ＺＰ抗原をエクスプレスしたλｇｔｌｌ−Ｓｌ、λｇｔ１１−ＰＬ、λｇｔｌｌ −Ｐ２及びλｇｔｌｌ−Ｐ３のクローンは、サブクローンが作られた。これらの サブクローンは、サンガーのジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーション法を用 いて、Ｍ１３ファージの中でクローンを作り、ＣＤＮＡの配列を形成する（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４５４６３、１９７？ 、サンガー他）。ＺＰ抗原をエクスプレスする３つのｃＤＮＡクローンに対して 、この方法を用いて得られた配列を第４図に示す。

ノーザンブｏ−）ト（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析を用いて、２つのｃＤ ＮＡクローン（Ｐ２及びＰ３）により認識されたＺＰタンパク質のＲＮＡは、卵 巣に存在するが、他の組織には存在しないことが実証された。第５図はこれらの 分析の一つを示しており、分析は、「ノーザンプロット」及び「ドツトプロット 」を用いてラベル付プローブをＲＮＡ試料に交雑させて行なったものである。す なわち、ノーザンプロット分析の場合、すべてのＲＮＡ卵巣から分離するととも に、同じように、肝臓、腎臓、脳及び筋肉を含む他の組織とも分離した。ＲＮＡ は、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で変性し、電気泳動させた。次に、アガ ロースゲルからビオシン膜（ｂｉｏｄｙｎｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）の固形支持体 にトランスファーした。膜はトランスファーするために２つの紙フィルターの間 に置き、空気乾燥させ８０℃にて２時間ペイキングした。λｇｔｌｌの中に挿入 された特異なＺＰｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩによって消化（ｄｉｇｅｓｔ）された 。次に、挿入物は、１％の低融点アガロースの電気泳動により、クローニングベ クターから分解（ｒｅｓｏｌｖｅ）　ｔ、た。ＵＶ光の下で、挿入ＤＮＡ分子は 、臭化エチジウムで識別し、放射性ラベリングのためにゲルから削り取った。Ａ ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２：６　（１９８３）の中にファインバーブ 及びフォーゲルスタインが記載したランダムオリゴ−プライミング方法によって 、ｃＤＮＡにラベリングを行なった。ラベリング反応は、変性したｃＤＮＡを試 剤（ｒｅａｇｅｎｔｓ）に添加することにより行なった。

なお、試剤には、”Ｐ−ｄＣＴＰ、クレノー（ｋｒｅｎｏｗ）断片、ＢＳＡ、混 合ブライマー、及びオリゴラベリング緩衝剤が含まれている。ラベリングされた ＤＮＡは、クロマトグラフィーによりセファデックスＧ−５０のカラム上にて、 ｄＣＴＰから分離した。ＤＮＡ−ＲＮＡの交雑は、ＲＮＡがトランスファーされ たビオシン膜を熱シール可能なポリエチレン袋の中に別々に入れた。予備交雑（ ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）溶液を袋内に加え、袋は４２℃の水槽の中 に１晩中浸漬した。予備交雑溶液を取り除き、■ｐをラベリングしたＤＮＡプロ ーブを含有する交雑溶液と交換し、４２℃の水槽の中に１晩中浸漬した。最終的 に、膜は数回洗浄し、暗幕を施してＸ線フィルムに光を当てた。

フィルムは現像する前に、７０℃にて４８時間、光を当てた。

夾癒孤１ えＤＮＡによるＺＰタンパク　のエクスプレツシヨ組換えＺＰタンパク質（ｒ　 Ｚ　Ｐ）は、原核エクスプレッション系統又は真核エクスプレッション系統の中 でエクスプレスされる。

実施例３にて調製した、組換えλｇｔｌｌファージ、λｇｔｌｌ−８ｌ、λｇｔ ｌｌ−ＰＩ、λｇｔｌｌ−Ｐ２及びλｇｔｌｌ−Ｐ３は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２ を含有するルリアブロース（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）　（Ｌ　Ｂ　）媒体内に て、３２℃にて２０分間、大腸菌Ｙ　１０８９とともに培養することにより、大 腸菌Ｙ１０８９を感染させた。集団（ｃｏｌｏｎｉｅｓ）は３２℃にて発育させ た。

なお、温度敏感性を調べるために１つの集団だけは４２℃にて発育を行なった。

３２℃では発育するが、４２℃では発育しない集団は、溶解性（ｌｙｓｏｇｅｎ ｉｃ）であると考えられ、集団全体の約１０〜７０％を占める。組換えレゾゲン の１個の集団を分離し、これを用いてＬＢ媒体を接種し、３２℃にて発育させた 。０．Ｄ、６００が約０．５のとき、培養温度を４２℃に変更し、さらに２０分 間培養した。クローンが作られた遺伝子の転写は、イソプロピルβ−Ｄチオガラ クトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって刺激し、最終濃度を１０　ｍ　Ｍと し、３７℃にて６０分間培養した。形質転換した大腸菌は、遠心作用により得る ことができ、５０ｍＭ　トリス（Ｐｈ　７．５）の中で再び懸濁させ、冷凍した 。細胞の解凍によって、細胞溶解作用が起こり、融合ＺＰタンパク質を解放する 。

ＺＰＤＮＡで設計されたλｇｔｌｌ−Ｐ］及びλｇｔｌｌ−Ｐ３を含有するバク テリオファージは、１９８７年１０月８日付にて、アメリカ合衆国メリーランド 、ロックビルにあるアメリカン　タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に 寄託した。寄託番号は、４０３７７及び４０３７８である。

寄託したバクテリオファージは、米国特許法及び規則に基づき、人手できる。ま た、対応出願の申請がされた米国以外の国の国民も同様に入手できる。なお、寄 託したバクテリオファージを入手できるがらといって、本出願及びこれに基づく 分割出願等に対し、て付与される特許の実施権まで与えるものでない。

他の実施例におイテ、ＥＭＢＯ３（６）：１４２９　（１９８４）＋；：テスタ ンレーとルジオが開示したｐＥＸプラスミドを用いて、大腸菌Ｙ　１０９０を形 質転換させることができる。ｐＥＸベクターは不溶解のハイブリッドタンパク質 をエクヌプレスする。バクテリオファージλ　ＤＮＡの分離は、ＣｏｌｄＳｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２ン、ｐ、　１９７の マニアティス他による「分子クローニング」に記載された方法に従って、組換え １ｇ　ｔ　１１フアージの上で実行できる。ＩｏｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．２％マ ルトース及ヒ５ｏＡ１ｇ／ｌｌ１１ノアンヒシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉａｎ） で補足した（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）　Ｉ、Ｂ媒体の中で発育させた大腸菌 Ｙ２（１９０は、組換え１ｇ　ｔ　１１フアージで感染させ、３７℃にて２０分 間培養した。感染した大腸菌は、０．７％アガロース、ＭｇＣｌ２及びアンピシ リンとともに、ｌ、　Ｂ媒体内のＬＢプレート上に載せ、４３℃にで一晩中、培 養した。ファージはＳＭ媒体（０，０２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５；　０． ０１Ｍ　ＮａＣｌ；　０．００１Ｍ　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０）（ｐＨ７，５）及 び１リツトル水の０．０１％ゼラチン）の中に集められ、細菌は、８，０ＯＯｘ 　ｇにて、４℃で１ｏ分間遠心カ作用を与えることにより除去される。ＲＮ　ａ ｓｅＡとＤ　Ｎ　ａｓｅ　Ｉは、最終濃度が１μｇ／ｍｌのファージを含有する 上澄みに添加し、３７℃にて３０分間培養した。２０％ポリエチレングリコール 及び２ＭＮａＣ１を含有するＳＭの等量を添加し、０℃にて１時間懸濁液を培養 し、１０，００（ｌｘ　ｇにて、４℃で２０分間遠心作用を与える。上澄みを除 去し、ファージを含むベレットは、０．５０１１Ｍ媒体の中で再び懸濁させた。

残留物を除去するため、溶液は、８，０００ｘ　ｇにて、４℃で２分間遠心作用 を受け、５μｍの１０％ＳＤＳと０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐ）＋８）を上澄みに加 え、６８℃にて１５分間、培養した。

その結果、フェノール、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２ ５°２４：１）、及びクロロホルム：イソアミル“ｒルニコール（２４：１）が 抽出され、各段階で水性相を得ることができた。等量のイソプロパツールを水性 相に添加し、溶液は一７０℃にて２０分間、貯蔵した。４℃で１０分間遠心力作 用与えた後、ベレットは７０％ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥し、５０ＩｚｌのＴＥの 中で再び懸濁させた。ＥｅｏＲＩの制限酵素の消化をおこなった後、標準の方法 により分離Ｄ　Ｎ　Ａの部分標本を作った。消化完ｒ後、トリス硼化物（Ｔｒｉ ｓ　ｂｏｒｏｎａｔｅ）　Ｅ　Ｄ　’１”　Ａ　ａ−ディング緩衝剤（ＴＢＥ　 ）９０ｍＭ　）リス硼酸塩、９０ｍＭ硼酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡを１．１の比率で 添加し、１．４％アガロースゲルに負荷した。ゲルは、キシレンシアノ−・ルの 前部（ｆｒｏｎｔ）がゲルの中程になるまで、１ｏｏｙでラン（ｒｕｎ）する。

ＤＮＡのバンドは紫外線により視覚的に認識され、予想サイズのバンドが除去さ れる。ＴＢＨのエルトラップ（Ｅｌｕｔｒａｐ）装置の中で、電気的溶離（ｅｌ ｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）を行なう。分離したＤＮＡフラグメントは、次に、 ｐＥＸプラスミドの中に挿入される。

プラスミドの調製は、マユティアス（１９８２）の方法に基づいて実行できる。

細菌クローンを一晩中かけで発育させた後、１　、５ｍｌの培養をエッペンドル フ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔｕｂｅ）の中にいれ、上澄みを吸引に取り除いた 。ベレットは、１００μｍの水冷溶液の中で再び懸濁させた。溶液には５０ｍＭ グルコ−・ス、１０ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　２５ｍＭ　トリス（ｐＨ８゜０ ）、及び４ｍｇ／’ｍｌのりゾヂーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）が含まれる。懸濁後 、２２℃にて２０分間培養し、水冷した０、２Ｍ　Ｎ’ａＣ１及び１％ＳＤＳを ２００μｍ、さらに追加した。５分間、氷の」ユで培養後、１５０μｍ０）　３ 　Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４，８）を添加した。溶液は水の上で５分間培養し、そ の後、遠心力作用を与え、上澄みを別の新１．い間に移（７た。６００μｌのフ ェノール：クロロホルム：イソアミルフルコール（２５：２４：Ｘ）を加え、溶 液を混合し、遠心作用を与えてＬ澄ろを節約する。次に１．２容量（ｔｗｏ　ｖ ｏｌｕｍｅｓ）の冷たいエタノールを上澄みに添加し、上澄みを混合し、２２℃ にて２分間培養する。」＝澄みを取り除き、ベレットは、管を反転させて乾燥さ せる。ベレットは７０％ＥｔＯＨで洗浄し、遠心作用を受け、再び排出する。２ ０Ｍｇ／ｍｌのＤ　Ｎ　ａｓｅ−ｆｒｅｅの膵臓ＲＮａｓｅを含有する５０μｍ のＴ　Ｅ　（ｐＨ８，０）を添加し、軽く混合し、ＥｃｏＲＩによる消化のため の部分標本を取り除いた。消化の分析は、アガロースゲルの電気泳動により行な われる。

プラスミドは、製造者が指定する条件の下に、ＥｃｏＲＩ（ＰｒＯＭｅｇａ　Ｂ ｉｏＴｅｃｈ）で線状化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅ）される。２００ｎｇの線状化し たプラスミドＤＮＡを、３倍（３−ｆｏｌｄ）のモル過剰の分離ｃＤＮＡに添加 する。ＤＮＡはＥｔａ！（で沈降させられ、８μｍのＴ　Ｅ　（ｐＨ８，０）の 中で再び懸濁させる。

１μｌのＮＯｘ結紮６６ｍＭ　　トリス−Ｃ１（ｐＨ７，６）、６．６ｍＭ　Ｍ ｇｃ１２．１０ｍＭ′）チオティトル、６６ｍＭＡＴＰの緩衝剤を添加し、その 後、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）をｌＯユニット添加した。混合物 は、１２℃にて、８時間培養する。

１μｌの部分標本を、アガロースゲルにより分析し、結紮する。２４μｍを用い て、ＣａＣ１，技術により、細菌の形質変換を行なう。

組換えプラスミドを運ぶ集団は、多クローン性抗血清で細菌をスクリーニングす ることにより識別できる。形質変換された細胞は、３０℃にて２０時間発育させ る。ニトロセルロースがその上に形成され、フィルターを取り除き、１００μｇ 　Ａｍｐ／ｍｌを含有するＩ、Ｂメディアの中に予め浸された３ＭＭの紙フィル ターの２層の下に集団を並べて載せる。４２℃にて２時間、培養することにより 、交雑タンパク質の転写が開始する。フィルターはＴＢＳの中で３０分毎に３回 洗浄し、２％の乾燥ミルクで補足したＴＢＳの中で一晩中閉塞する。フィルター は、次に親和清浄された抗体でプローブされる。陽性集団（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　 ｃｏｌ。

ｎ１ｅｓ）を３２℃にて培養する。ＺＰタンパク質のエクスプレッションは、温 度を４２℃に変え、２時間培養することによってもたらされる。この時、組換え ＺＰタンパク質は、すべてのＳＤＳが抽出されたタンパク質の約２５％でである 。エクスプレスされた交雑ＺＰタンパク質は不溶解性であり、従来のクロマトグ ラフィー法により容品に清浄化することができる。

或は又、組換えＺＰ　ＤＮＡを酵母の中に挿入することができる。ピチアバスト リスの如きメチル萎縮性の酵母を用いることにより、遺伝学的に設計したタンパ ク質を効率良くしかも大規模にエクスプレスすることができる（Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｗｅｅｋ、マクグロウヒル社、（１９８６）　エム、ブルーストーンとピー 、サベージ）。これらの酵母は、醸造（ｂｒｅｗ）ベースとして、メタノールを 用いるもので、酵母は、アルコール酸化酵素の助けを受けてホルムアルデヒドの 中に新陳代謝する。第２の酵素は、次に、ホルムアルデヒドをジヒドロキシアセ テートに変換し、次の段階の酵母細胞の合成を行なう。ｃＤＮＡは、アルコール を酸化させる遺伝子の位置に挿入される。ＺＰタンパク質からの組換えＤＮＡは 、アルコール酸化酵素遺伝子が通常存在する部位で置換される。この部位は酵母 内で変更されるため、メタノールに応答する。従って、エタノール又は炭水化物 への切換えを行なうだけで、挿入された遺伝子がエクスプレスしたり、エクスプ レスしないようにすることができる。２つのメタノール−調節されたラックＺ　 （ｌａｃＺ）遺伝子は、ビチアバストリスの中でエクスプレスすることができる （Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５（９）：　３８５９　 （＋９８７）、チョップ他）。

Ｋ度舅至 え′日　タンパク　の゛ ＺＰタンパク質の組換えは実施例４に記載のようにしてエクスプレスされる。

λｇｔｌ１組換えリゾゲンを用いて大腸菌Ｙ　１０８９を感染させた。大腸菌は 、０．２％マルトースを３２℃にて補足して最適密度（６００ｎｍ）の０．５と したＬＢ媒体の中で発育させた。次に培養温度を４２℃に変え、その温度で２０ 分間さらに培養した。この培養の終りに、Ｉ　ＰＴＧを添加してラックリプレッ サーを低下させた。この結果、組換えたものを含むラック２方向の遺伝子がエク スプレスされる。

細胞は３７〜３８℃で６０分間培養され、液体窒素の中で冷凍し、解凍して細胞 を溶解させる。溶解質（ｌｙｓａｔｅ）は、０゜ＩＭ）リス緩衝剤（ｐＨ７，５ ）の中に集められ、セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）カラムを通過させた。分子 重量が１００Ｋｄよりも大きいタンパク質を含む空隙（ｖｏｉｄ）の容積をもつ ものが集められた。エクスプレスされたタンパク質は、この場合、β−ガラクト シダーゼタンパク質に融合されるため、このタンパク質を部分的に清浄化する迅 速な方法であるといえる。このタンパク質フラクションは、５ＤＳ−ＰＡＧＥに よって分析され、免疫プロット法によりエクスプレスされた抗原を検出する。第 ６図はＰ１クローンによってエクスプレスされたＺＰ抗原融合タンパク質の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥで免疫プロットしたものを示している。ニトロセルロースのトラン スファーはラビットの抗ＨＳＰＺでプローブした。低分子重量の細菌タンパク質 はたくさんのものが、あらゆる細菌の中で認識されるが、Ｐ１挿入の場合、２つ のレーンがＺＰに特異な融合タンパク質のエクスプレッションを示す。

タンパク質は、タンパク質を細菌から抽出することにより、ｐＥＸプラスミドか ら分離する。組み換えたクローβ−ガラクトシダーゼの交雑タンパク質は、硫酸 ドデシルナトリウムで抽出したタンパク質の約２５％であるため、セフ７セルと イオン交換カラムにより、または電気泳動により、沈積させることができる。こ のため、動物の免疫に必要な清浄度が十分に得られるようにタンパク質を清浄に することができる。酵母培養媒体から分離した組換えタンパク質も、これらの方 法によって清浄にすることができる。

裏ｈガ１ ４肌散Ω見蓋 透明帯タンパク質の活性免疫又は自動免疫が、動物の受精を抑制する上で効果の あることが見いだした。ラビットに活性免疫を与えることにより、卵巣の卵胞に おける受精機能を損なわせ、ステロイドホルモンの生産を停止させることができ る（第７図参照）。

ＺＰタンパク質（３００，ｃｚｇｌｏ、５ｍｌ；　０．ＩＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ）を、 ０゜５ｍｌのフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）の中で乳化させる。投与 量の半分を皮内の多くの部位に投与し、残りの半分は０．５ｍＬＰ　Ｂ　Ｓで乳 化した０、５ｍ１ＣＦ　Ａのエマルジョンで注入した。この注入により、動物は ４週間後に免疫高揚作用を受ける。この免疫作用は、最初のものと比較した場合 、最初のものがフロイントの不完全アジュバントを用いている点を除くとその他 は全く同一である。卵巣の機能をひょかできるようにするため、動物はｈ　Ｃ， Ｇ処理を行ない、血清プロゲステロンのレベルを判断した。各グループの中で何 匹かの動物を、ｈＣＧの投与後生なくとも１２時間で殺し、卵巣の重量を測定し 、排卵部位を調べた。また一方では、ｈＣＧの前に、動物にブタのＦ　Ｓ　Ｈ（ Ｒｅｈｅｉｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、アリシナ州フェニックス；　０． ５Ｂ７１匹、毎日２回、３日間）を与え、排卵過度にした。これらの研究結果に より、卵巣機能の変化原因は、卵胞細胞の分化の欠乏及びステロイド生産の欠乏 であることが明らかになった（第７図参照）。ブタのＺＰで免疫をもたせたラビ ットの血清プロゲステロンのレベルを求めた。５０１ＵｈＣＧが与えられた動物 の応答は、プロゲステロンレベルのｔＡにより求めた。テストした血清試料は、 ２１日間定期的に採取した。このｈｃＧ処理の後に通常の場合、偽妊娠が生じる 。各ヒストグラムは血清プロゲステロン濃度（血清１ｍｌにつきナノグラムのプ ロゲステロン）の平均±Ｓ、Ｄ、を表わす。

パネルＡ及びＤは、前者が対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）動物（アジュバントだけ）、 後者が実験（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ、ｅｄ　）動物（ＺＰで免疫）の、夫々免疫 前におけるプロゲステロンのプロフィールを示している。Ｂ及びＥは、第１の免 疫処理後、２０週間経過後の状態を示している。Ｃ及びＦは、増強していない動 物のプロゲステロンのプロフィールを示しており、これは、第１の免疫後、２８ 週後にＦＳＨ／ｈＣＧ処理した後のものである。モノクローン抗体Ｒ５とＲ７を 受動免疫のために用いることにより、ラビットの受精率は低下した。ＰＳＩで指 定されるモノクローン抗体は、シルバー染色されたブタのＺＰタンパク質に抗し て作られる。なお、タンパク質は２Ｄ−ＰＡＧＥにより清浄化されている。

このモノクローン抗体は、ブタ血清がインビトロのぶたＺＰに固定されるのが抑 制される（第８図参照）。

火Ｉ皿ユ Ｂ”モノクローン　遵μｍ玉 反透明帯モノクローン抗体を生産するハイブリッド細胞系統を調製するもので、 ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞を、透明帯タンパク質でプライムしたＢＡＬＢ／ ｃマイスの牌臓細胞に融合するものである。この方法では、骨髄腫細胞及び反透 明帯抗体生産細胞は、人間、イヌ、又はネコのような他の供給源を利用すること ができる。

Ａ、融合のための牌臓細胞の調製 透明帯タンパク質は、卵巣又は分解度の高い２Ｄ−ＰＡＧＥによる分離したもの を、熱可溶化したすべてのマトリックスとして清浄にするものである。透明帯抗 原は、２Ｄ−ＰＡＧＥ分析では、約９５％ピュア（熱可溶化したＺＰ）であり、 シルバー染色分析では１００％ピュアであった。透明帯抗原は、フロイントの完 全アジュバント約３０μｇの中で乳化させたものを、大人のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃ 又はＣ５７Ｂ４６の雄マイスに皮下投与して免疫を与えるために使用される。マ ウスは２週間後、さらに不完全アジュバントのタンパク質３０μｇで、再び免疫 を付与したさらに６週間経過後、２０〜４０μｇのタンパク質を静脈内に投与し た。２〜４日後、マイスは死亡し、稗臓細胞の懸濁物を、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ １ｌ　Ｇｅｎｅｔｆｃｓ　３：２３１．１９７７にゲッター他が開示した方法に 基づいて作った。赤血球を溶解し、ＮＨ□Ｃ１（０，１＋３％）の中で、４０℃ で１５分間培養した。得られた懸濁物は、遠心力作用（８００ｘｇ）によって熱 不活性の子牛血清を通して洗浄し、その後、タンパク質なしの媒体（ＲＲＭＩ　 １６４０．７．５ＤＭ　ＨＥＰＥＳで緩衝、ｐＨ７，２）の中で遠心力を作用さ せた。

Ｂ、融合するための稗臓の調製 牌臓細胞は、Ｐ３Ｕ１系統から得たが、Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、　Ｉｍｍｕｎａｌ、　８１：１−７　（１９７８）にイニルトン他が記載 しているようにＨＰ　ＲＴ　（Ｅ、Ｃ，２，４，２，８）が不足している。この 細胞をイーグルの最小必須媒体（ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｒｎｅ ｄｉｕｔｎ、　ＭＥＭ）の中に維持した。この媒体は子牛血清１０％とウマ血清 １５％を含んでいる。骨髄腫細胞の成長は、ヒボキサンチンーアミノベテリンー チミジン（ＨＡＴ）媒体の選択により抑制される。

Ｃ，ハイブリッドの生産 ハイブリッドの生産は、１０’Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃ骨髄腫細胞と、透明帯の免疫 が与えられたＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７Ｂ１／６マイスから得られた１０’牌臓細 胞を混合することにより行なわれた。細胞の混合物は８００ｘｇの遠心力作用を 受け、細胞は、ゲッター他（Ｉ９７７）の方法に基づき、血清を含まない最小必 須媒体（ＭＥＭ）の中に希釈したポリエチレングリコール（ＰＥＧ　１０００） の５０％溶液の中で再び懸濁させた。

得られたハイブリドーマ細胞は、ガルフレとミルスタインがＭｅｔｈ、　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　７３：３．１９７５に記載しているように、希釈剤を制限すること により、ヒボキサンチンーアミノベテリンーチミジン（ＨＡＴ）媒体の中にクロ ーンを形成した。２つのハイブリドーマ細胞系統Ｒ５とＰＳＩを選択した。その 理由は、細胞系統Ｒ５は、多くの動物のＺＰ抗原のタンパク質部分を認識する抗 体を作るためである。また、ＰＳＩは、ＺＰの多くの種の炭水化物決定因子を認 識し、この抗体は精子がＺＰの表面に結合するのを抑制するためである（第８図 参照）。

Ｒ５及びＰＳＩで指定されるハイブリドーマ細胞系統は、１９８７年１０月８日 付にて、アメリカ合衆国メリーランド、ロックビルにあるアメリカンタイプカル チャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。寄託番号は、４０３７７及び４０ ３７８である。寄託したバクテリオファージは、米国特許法及び規則に基づき、 入手できる。また、対応出願の申請がされた米国以外の国の国民も同様に入手で きる。なお、寄託したバクテリオファージを入手できるからといって、本出願及 びこれに基づく分割出願等に対して付与される特許の実施権まで与えるものでな い。

Ｄ１反透明帯抗体を生産するクローンのテストリンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ、　Ｆｌ ｏｗ　Ｌａｂ）のマイクロタイター用の９６個のくぼみ付プレートを、ラビット 又はブタのＺＰタンパク質の５０〜１００μｇで蔽い（ｃｏａｔｅｄ）、２０℃ にて一晩培養した。くぼみは、５％カーネーションインスタントミルク（Ｃａｒ ｎａｔｉｏｎ　Ｉｎ５ｔａｎｔ　Ｍｉｌｋ）及び０．０８５％アジ化ナトリウム を含有する０、１Ｍ　）リス（ｐＨ７，５）−１％ノンイデット（ｎｏｎｉｄｅ ｔ）　Ｐ−４０で洗浄した後、０　、０５＋ｏｌの培養上澄みを添加し、４０℃ にて培養した。上澄みはＲＩＡ緩衝剤で３回洗浄した後に除去し、ハイブリドー マスクリーニングキット（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）を 用いて抗体を検出した。非特異的結合の対照は、第２の抗体又は培養上澄みのど ちらか一方が含まれていない。

Ｒ２、Ｒ５、Ｒ７及びＰＳＩとよばれるノ１イブリドーマ細胞は、ブリスタン処 理した（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｔｒｅａｔｅｄ）マイスの中に腹腔内注射をするこ とにより、腹水症の形態として発育させた（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７３ 　（パートＢ　）　１　（１９８１）、ガルフレとミルスタイン）。腹水症の体 液を採り、これを免疫プロット及び生物検定のためのモノクローン抗体源として 用いた。

本発明の詳細な説明した。当該分野の専門家であれば、添付した請求の範囲にお ける発明の精神又は発明の範囲から逸脱することなく変形をなすことができるこ とは明らかであろう。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ◆　　　　　←９．４９ ａ龜　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−−１ ，３５・、　　　　　　　　　　　　　　　　←０．３３ＦＩＧ、６ ブタの精子数／ブタｚｐ δ　　　Ｏｏｏｏ 国際調査報告 ＰＣＴ／υ５８１３１０３２１３５ 八ｔｔａｃｈ＋ｍｅｎｔ　　ｔｏ　　ｐｃ丁ｌＩＳ入／２１゜Ｐａｒｔ　　ＶＬ 　　Ｏｂｓ＠ｒｖａｔｉｏｎｓ　Ｗｈ＠ｒｅ　　υｎ１ｔｙ　ｏｆ　　！ｎｖｓ ｎｔｉｅｎ　　ｉｓ　　ＬａｃｋｉｎｇＧｒｏｕｐ　　ＸＸ、　　ｃｌａｉｎ＋ ｓ　　２４−２６．　　ｄｒａｗｎ　　ｔｏ　　ａ　　ｐｈａｒ＋ａａｃｓｕｔ ｉｃａＬ　　ｃｏｗ＝| ｐｏｓｉｔｉｏｎ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　４２４／ａｌｌ。

Ｇｒｏｕｐ　ＶＸ、　ｃｌａｉｍｓ　３２−３５．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍ ｅし）ｏｘｌ　ｏｔ　ｃｏｎｔｒａｃ＊ｐ−ヒｉｏｎ、　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ 　４２４／８５゜Ｂ＊ａｓｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｏｌｄｉｎｇ　１ａｃｋ　ｏｊ！ 　ｕＪｌｌｔｙ　ｏｔ　１ｎｔｎｎｔｉｏｎｓτＬ＋ａ＠Ｌｉ＋ｍｉｔ　ｒｏｔ 　Ｆｉｌｔｎ　　八ｐｒｏｔｅｓｔ０１２Ｎ　　５１００　　　　　　　　　Ｂ

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. （１）透明帯抗原のアミノ酸配列からなる組換えポリペプチド。
2. （２）天然グリコシレーションを実質的に含まない透明帯タンパク質のアミノ酸 配列からなる組換えポリペプチド。
3. （３）実質的にピュアな形態である請求の範囲第１項又は第２項に記載のポリペ プチド。
4. （４）透明帯タンパク質は哺乳動物の卵巣のＤＮＡによって暗号化される請求の 範囲第１項又は第２項に記載のポリペプチド。
5. （５）アミノ酸配列は第４図に示された核酸配列によって暗号化される請求の範 囲第１項又は第２項に記載のポリペプチド。
6. （６）透明帯抗原の暗号をもったＤＮＡ配列を有するエクスプレッション運搬体 。
7. （７）エクスプレッション運搬体は宿主内で複製する能力を有するファージ又は プラスミドであって、ａ）複製の原体、 ｂ）プロモーター、及び ｃ）透明帯抗原の暗号をもったＤＮＡ配列、とリンクして作用する請求の範囲第 ６項に記載のエクスプレッション運搬体。
8. （８）エクスプレッション運搬体は原核生物の宿主内で複製する能力を有するフ ァージ又はプラスミドであって、ａ）原核生物の複製原体、 ｂ）原核生物のプロモーター、及び ｃ）透明帯抗原の暗号をもったＤＮＡ配列、とリンクして作用する請求の範囲第 ６項に記載のエクスプレッション運搬体。
9. （９）エクスプレッション運搬体は、λｇｔ１１−Ｓ１、λｇｔ１１−Ｐ１、λ ｇｔ１１−Ｐ２及びλｇｔ１１−Ｐ３からなる群から選択される請求の範囲第８ 項に記載のエクスプレッション運搬体。
10. （１０）透明帯タンパク質の暗号をもったＤＮＡ配列を備えているベクター。
11. （１１）ベクターは、プラスミド、ファージ及びコスミドからなる群とは分離し ている請求の範囲第１０項に記載のベクター。
12. （１２）ベクターはλｇｔ１１−Ｐ１であり、取得番号がＡＴＣＣ４０３７７で ある請求の範囲第１０項に記載のベクター。
13. （１３）ベクターはλｇｔ１１−Ｐ３であり、取得番号がＡＴＣＣ４０３７８で ある請求の範囲第１０項に記載のベクター。
14. （１４）透明帯抗原の暗号をもったＤＮＡ配列を備える組換えＤＮＡで形質転換 された宿主。
15. （１５）宿主は原核生物である請求の範囲第１５項に記載の宿主。
16. （１６）宿主は真核生物である請求の範囲第１５項に記載の宿主。
17. （１７）透明帯抗原は第４図に示された核酸によって暗号化される請求の範囲第 １４項又は第１５項に記載の宿主。
18. （１８）組換えＤＮＡ分子はファージである請求の範囲第１４項乃至第１７項の 何れかに記載の宿主。
19. （１９）宿主は大腸菌である請求の範囲第１４項に記載の宿主。
20. （２０）宿主は酵母である請求の範囲第１４項に記載の宿主。
21. （２１）透明帯タンパク質の暗号をもったＤＮＡ配列で宿主を形質転換し、 ＤＮＡ配列をエクスプレスし、及び 透明帯タンパク質を回収する、 工程から構成される、透明帯タンパク質を作る方法。
22. （２２）宿主は真核生物である請求の範囲第２１項に記載の方法。
23. （２３）宿主は原核生物である請求の範囲第２１項に記載の方法。
24. （２４）個体に透明帯の抗体を作るのに有用であり、請求の範囲第２１項の方法 により作られた透明帯抗原を、免疫学的な有効な量を有している薬組成物。
25. （２５）抗原は組換え透明帯タンパク質である請求の範囲第２４項に記載の薬組 成物。
26. （２６）薬理学的キャリヤはアジュバントを含有している請求の範囲第２４項又 は第２５項に記載の薬組成物。
27. （２７）請求の範囲第２４項乃至第２６項の何れかに記載の薬組成物で個体に免 疫を与えることにより、個体の透明帯に抗体を作る方法。
28. （２８）透明帯抗原で免疫が与えられた個体からの脾臓細胞及び骨髄腫細胞の融 合細胞ハイブリッドを有する透明帯抗原に特異的に結合するモノクローン抗体を 作る連続的細胞系統。
29. （２９）組織適合性のある動物の中に細胞を注入し、インビボでモノクローン抗 体を作り、該抗体は動物の腹水症の体液から回収できるようにしている請求の範 囲第２８項に記載の連続的細胞系統。
30. （３０）透明帯に結合する抗体であって、透明帯抗原で免疫が与えられた噛歯類 の脾臓細胞と噛歯類の骨髄腫細胞の融合ハイブリッドを有する、連続的細胞系統 から作られた反透明帯モノクローン抗体。
31. （３１）透明帯に結合する抗体であって、ＡＴＣＣＨＢ９６６５と同一の特性を もった細胞系統によって作られた反透明帯モノクローン抗体。
32. （３２）避妊に必要な量の反透明帯モノクローン抗体を個体に投与することによ る、個体の避妊方法。
33. （３３）請求の範囲第１項又は第２項のポリペプチドであって、避妊に必要な量 のポリペプチドを個体に投与することによる、個体の避妊方法。
34. （３４）個体は、ウシ、プタ、ネコ及びイヌからなる群から選択される請求の範 囲の範囲第３３項に記載の方法。
35. （３５）個体は人間である請求の範囲第３３項に記載の方法。