JPH06503721A

JPH06503721A - 避妊ワクチン

Info

Publication number: JPH06503721A
Application number: JP4503159A
Authority: JP
Inventors: プリマコフ，ポール; マイルズ，ダイアナ・ジー
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・コネチカツト
Priority date: 1990-12-14
Filing date: 1991-12-04
Publication date: 1994-04-28
Also published as: CA2098188A1; US5721348A; EP0567512A1; KR930703443A; WO1992010569A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】避妊ワクチン！二精子全細胞の抽出物を用いて雄及び雌の動物を免疫化すると下前を起こすことが知られている（Ｔｕｎｇ、　Ｋ、　、ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、　ｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１：１４５−１５８（１９７９）及びＭｅｎｇｅ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｌ、　ｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、λＯ：９３１−９３７　（１９７９））。

又、自然に抗精子抗体を製造する男性及び女性は下前であるが他の点では健康である（Ｂｒｏｎｓｏｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｆｅｒｔ。

ａｎｄ　５ｔｅｒｉ１．、旦：１７１−１８３　（１９８４）’）、決定（ｃｒｉｔｉｃａｌ）精子抗原は未知であるが、これらの観察により精子タンパク質が避妊ワクチンの開発に有用であるかも知れないという提案が導かれた。

哺乳類の種の場合、精子タンパク質は卵子の透明帯への精子の接着における役割を有すると提案された。マウスの場合、精子表面ガラクトシルトランスフェラーゼが接着タンパク質であり、透明帯への光体−保存（ｉｎｔａｃｔ）精子結合において機能することが示された（Ｓ　ｈ　ｕ　ｒ。

Ｂ、Ｅ、、Ｇａ１ａｃｔｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ａｓ　ａｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、於：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔ　ｉｏｎ、”　Ｅｄｓ、５ｃｈａｔ　ｔｅｎ、Ｈ，、ａｎｄ　５ｃｈａｔｔｅｎ、Ｇ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐｓ、３７−７１（１９８９））。ラット精子の場合、肝アシアログリコプロテインレセブターに関連するガラクトースレセプター、（ＲＴＧ−ｒ）があり、それがそのレクチン性を介して透明帯オリゴ糖との精子結合において機能することができる（Ａｂｄｕｌｌａｈ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｋｉｅｒｓｚｅｎｂａｕｍ、Ａ、Ｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、上０８：３６７−３７５　（１９８９））。ガラクトシルトランスフェラーゼと異なる雌豚精子形質膜タンパク質（ＡＰ、）、及びうさぎ精子タンパク質も精子−透明帯接着に役割を持つと報告されている（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ｎ。

ａｎｄ　Ｈｕｎｔ、Ｗ、Ｐ、、Ｇａｍ、Ｒｅｓ、、２３：１０３−１１８　（１９８９）及び０°Ｒａｎｄ、Ｍ、Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｄｅｖ。

Ｂｉｏｌ、、１２９：２３１−２４０　（１９８８））。

モルモット精子表面タンパク質ＰＨ−２０は、受精に必要な第１段階である卵子の細胞外皮膜（透明帯）への精子接着に必要な機能を有することが示された。ＰＨ−２０で免疫化した雄及び雌のモルモットの場合、効率１００％の避妊が得られた。免疫化した雌からの抗血清は、高力価で特異的に認識される精子抽出物中のＰＨ−２０を有し、試験管内で卵子の透明帯への精子接着を阻害する。避妊効果は長期継続的であり、可逆的であり；免疫化の後６−１５カ月の間隔をおいて結婚した免疫化された雌は、漸増的に好性（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）を回復した。

避妊免疫原として調べた他の精子タンパク質には、精子の酵素ヒアルロニダーゼ、アクロンン及びラクテートデヒドロゲナーゼＣ−４が含まれる。これらの酵素で雌の動物を免疫化すると、好性への効果がないか、又は好性への部分的効果を有し、それはこれらのタンパク質を避妊薬として適したものとするのに十分な程大きくなかった。モルモットにおけるＰＨ−２０の高い避妊効果は、それが精子表面に存在すること、その強い免疫原性及び受精におけるその不可欠な役割などを含むいくつかのその特殊な性質に依存していると思われる。

哺乳類の精子−透明帯接着はほとんどの場合、種特異的である。他の哺乳類の種からの精子は、それらが光体反応の前又は後に透明帯と結合することができる点でモルモット精子と似ている。モルモット以外の種における受精に不可欠な精子表面タンパク質の同定及び単離は、その種を有効に免疫化し、長期継続的避妊を与えるためのワクチンの開発に有用であろう。精子接着タンパク質の候補の生化学的同定、単離及びクローニングがされていないことが、科学者によるヒト及び他の哺乳類の種のための有効な避妊ワクチンの開発を妨げてきた。

発明の概略本発明は哺乳類の精子上に存在する表面タンパク質の全体又は一部をコードする単離ＤＮＡに関する。この精子の表面タンパク質は哺乳類における受精に不可欠である。表面タンパク質はタンパク質ＰＨ−２０であることが好ましい。そのようなりＮＡ配列は発現可能な形態でＤＮＡ発現ベクターに挿入し、ＤＮＡ発現構築物を創造することができる。そのような構築物を用い、避妊免疫化に用いるためのＰＨ−２０タンパク質を製造することができる。

避妊の現在の方法には、避妊手術及び雌のホルモンの製造を変えて生殖サイクルを妨害する薬剤処置などの物理学的及び化学的方法が含まれる。これらの種類の方法はそれぞれ固有の明確な欠点を与える。外科手術を必要とする避妊は永久的避妊を起こし、一般に１回行われたら変えることができない。遮蔽法は理論的に効果が低く、実際にも効果が低（、多くの潜在使用者に受容されない。化学的方法は一時的避妊を与え、ある年齢前層の女性の場合癌の危険が増すと報告された。それらは有効性を確実にするために繰り返し摂取しなげければならず、実際に又は認識された副作用があり、多（の女性に受容できないものとなっている。化学的方法は男性に使用することができず、他の哺乳類に使用することはできない。

本発明は、まだ避妊手術の場合のような避妊の永久的形態ではない経口避妊薬より長期継続的な避妊ワクチンとして、避妊のための代わりの方法を提示する。従って本発明は、他の避妊法と同等か又はそれ以上に有効であり、より簡単であり、広く受容されている予防接種という医療的実行を用いている。さらにそれは長期継続的であるが永久的ではないという点で、他の種々の代替え法より適している。

図面の簡単な説明図１は、モルモットＰＨ−２０タンパダ質をコードするＤＮＡの部分的制限地図及び５個のｃＤＮＡクローンの相対的位置を示す線図である。

図２は、ＰＨ−２０タンパク質をコードするモルモットｃＤＮＡ配列、及び−文字コードで表したモルモットＰＨ−２０タンパク質の推定アミノ酸配列を示す線図である。

図３は、ＰＨ−２Ｑタンパク質をコードするマウスＤＮＡ配列を示す線図である。

図４は、ヒトＰＨ−２０タンパク質の１つの形態をコードするヒトＤＮＡ配列及び３文字コードで表した推定アミノ酸配列を示す線図である。

図５は、ヒトＰ）（−２０タンパク質の２番目の形態の一部をコードするヒトＤＮＡ配列及び３文字コードて表した推定アミノ酸配列を示す線図である。

発明の詳細な説明ＰＨ−２０遺伝子は精子細胞の表面上にあり、受精に不可欠なタンパク質をコードする。本発明は一部に哺乳類ＰＨ−２０タンパク質をコードするＤＮＡの単離及びクローニング、及びある哺乳類の種におけるＰＨ−２０をコードするＤＮＡが調べた池のすべての哺乳類がらのゲノムＤＮＡと交差反応性（すなわちハイブリッド可能）であることの発見に基づく。哺乳類の精子−透明帯接着がほとんどの場合種特異的なので、他の哺乳類の種におけるこれらの相同染色体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）の存在は予想外であった。

精子表面タンパク質本発明で有用な精子表面タンパク質は、受精に不可欠な表面タンパク質を含む。

精子表面タンパク質は、タンパク質に対するモノクロナール抗体又は精製タンパク質に対して誘起されたポリクロナール抗体が精子と結合した時に試験管内又は生体内受精あるいは試験管内受精のいずれかの段階を阻害したら、受精に不可欠であると定義される。受精の過程は、２個の配偶子（精子及び卵子）の結合又は融合、及びそれに続く新しい生物のゲノムの形成のためのそれらの核の融合として定義される。

表面タンパク質は、精子の形質膜及び／又は内部光体膜中に位置することができる。それはタンパク質又は糖タンパク質であることができる。

免疫化に用いられる単離表面タンパク質は、表面タンパク質全体又はタンパク質の免疫原性のある一部（細胞の外部）を含むことができる。好ましい精子表面タンパク質はＰ　Ｈ−２０表面タンパク質である。

免疫原の製造及び精製避妊免疫原として用いるための精子表面タンパク質の製造の好ましい方法は、組み替えＤＮＡ法による。この方法を用いてタンパク質を製造するために、タンパク質又はその免疫原性部分をコードするクローンＤＮＡを単離する必要がある。

当該技術における熟練者は、問題の遺伝子のクローニングを行うのに用いることができる多様な方法を熟知している。しかし単離された問題のタンパク質以外に何もないので、そのような試みの成功を理論的確実性を以て予想することはできない。

下記の実施例１で、出願人等はモルモットＰＨ−２０遺伝子をコードするＤＮＡの単離及びクローニングを報告する。ＰＨ−２０遺伝子の３′部分をコードするＤＮＡの単離に用いた方法は、ＰＨ−２０タンパク質と反応性のポリクロナール血清を用いたｃＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングを含んだ。遺伝子の５′ 部分の単離に固定ＰＣＲを用いた。

実施例２は、広範囲の哺乳類ゲノムＤＮＡが、記載のハイブリッド形成条件下でモルモットＰＨ−２０配列とハイブリッド形成できるＤＮＡ配列を含むという驚くべき発見を報告している。実際に分析した哺乳類の試料のそれぞれにおいて交差反応性配列が同定された。

実施例１及び２に提示された情報により、当該技術における熟練者はいずれかの哺乳類の種からのＰＨ−２０遺伝子を単離し、クローニングすることができる。

例えば問題の哺乳類（例えばネコ、ウマ、イヌ、ランなど）から単離された精巣又は精原細胞からのｃＤＮＡライブラリが用意される。これは時間のかかる過程であるが技術的には簡単である。

当該技術における熟練者は、この仕事で高い確率で成功することができる。

その後そのようなｃＤＮＡライブラリを、例えば標識モルモットＰＨ−２０ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングする。ＰＨ−２０の全体又は一部をコードするＤＮＡは、実施例２に記載のようなハイブリッド形成条件下でそのようなプローブ配列とハイブリッド形成する能力により特徴づけられる。標識の方法及びハイブリッド形成によるスクリーニングの方法は、当該技術において周知である。

陽性のクローンを分析し、従来の方法で全長遺伝子を構築する。分析した７種類の哺乳類のそれぞれが交差−ハイブリッド形成配列を含むという出願人等の記載を見ると、当該技術における熟練者はすべての哺乳類が交差〜ハイブリッド形成片を含むことを予想するであろう。下記に詳細に記載する通り、出願人等がマウス及びヒトＰＨ−２０遺伝子を単離しクローニングすることを可能にしたのはこの方法である。

ＰＨ−２０タンパク質の免疫原性領域をコードするクローニングされた遺伝子又はその一部は、コード領域を発現ベクターに挿入して発現構築物を製造することにより発現することができる。そのような発現ベクターの多（が当該技術における熟練者に既知である。これらのベクターは問題の遺伝子のためのプロモーターならびに加えられた転写及び翻訳シグナルを含む。真核宿主細胞及び原核宿主細胞の両方のための発現ベクターを広く用いることができる。ＤＮＡ発現構築物を用いて適した宿主細胞を形質転換する。

真核、特に哺乳類宿主細胞が精子表面タンパク質の発現に好ましい。

例えば真核タンパク質は原核細胞中で発現すると多（の場合、折り畳みの問題を示す。さらにクローニングされたＤ　Ｎ　Ａから真性の生物学的活性真核タンパク質を製造するには、多くの場合ジスルフィド結合形成、グリコリル化、リン酸化又は細菌細胞中では行われない特異的タンパク質分解的分裂過程などの翻訳後修飾が必要である。これは特に膜タンパク質の場合特に言える。精子表面タンパク質は、宿主細胞の転写及び翻訳成分を用いて製造する。適した成長及び発現期間の後、宿主細胞培養物を溶菌し、精子表面タンパク質をライセードから精製する。溶菌緩衝液は典型的に非−イオン性界面活性剤、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤などを含む。

超遠心、カラムクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、電気泳動などの物理的及び生化学的方法により、可溶化細胞抽出物から精子表面タンパク質を精製し、単離することができる。代わりの方法として精子表面タンパク質をモノクロナール又はポリクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができるためのそのような方法は当該技術における熟練者に周知である。

上記の通り、全長タンパク質の他に精子表面タンパク質の抗原性部分は、免疫原として有用である。抗原性フラグメントは、例えば全長タンパク質のタンパク質分解的消化及びそれに続（所望のフラグメントの単離により製造することができる。別の場合化学的合成を用い、モノマーアミノ酸残基を用いて出発して所望のフラグメントを生成することができる。

精子表面タンパク質が製造され、精製されたら、精子表面タンパク質を免疫化のために患者に投与するのに適した担体と合わせることによりワクチンを製造することができる。ワクチンは１種類か又はそれ以上の精子表面タンパク質を含むことができる。本発明の精子表面タンパク質は、免疫系の非特異的刺激剤を含むアジュバントと合わせることができる。アジュバントの適した使用により異種抗原（すなわち精子表面タンパク質）に対する強い抗体応答を誘起することができる。アジュバントの作用は十分に理解されていないが、はとんどのアジュバントには２成分が組み入れられている。１つは異化作用から抗原を保護する付着物を形成するように設計された物質である。付着物形成の２つの方法は鉱油又は水酸化アルミニウム沈澱物を用いる方法である。フロインドアジュバントなどの鉱油を用いた場合、免疫原は油−中一水型乳液中で調製する。水酸化アルミニウムの場合、免疫原は予備形成沈澱物に吸着させるか、又は沈澱の間に捕獲される。別の供与系はリポソーム又は合成界面活性剤を含む。リポソームは免疫原が外部脂質層中に挿入されている場合にのみ有効であり；捕獲された分子は免疫系に見られない。

有効なアジュバントに必要な第２の成分は、免疫系を非特異的に刺激する物質である。これらの物質はリンフ才力インとして知られる可溶性ペプチド因子の大きな組みの製造を刺激する。今度はリンフ才力インが抗原−プロセシング細胞の活性を直接刺激し、注射の部位で局所的炎症反応を起こす。リピドＡとして知られるリポ多糖の成分が通常用いられる。リビドＡは多数の合成及び天然の形態で入手することができ、リポ多糖よりずっと毒性が低いが、リポ多糖分子の所望のアジュバント性のほとんどをまだ保持している。リピドＡ化合物は多くの場合リポソームを用いて与えられる。非特異的刺激剤としてアジュバント中で通常用いいる場合、これらは使用前に熱−不活化しなければならない。百日咳菌の免疫調節媒介物（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ　ｍｅｄｉａｔｏｒ）は、リポ多糖成分及び百日咳毒を含む。百日咳毒は精製されて商ルジベブチドに集中し、それは多数の形態で入手できる。

免疫化（接種及び追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ　５ｈｏｔ））免疫化する患者は受容能力のある免疫系を有するいずれの哺乳類であることもできる。患者としての哺乳類の例には、ヒト及び家畜（例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマなど）、ならびに実験又は他の目的のための動物（例えばマウス、ラット、うさぎなど）が含まれる。

−次免疫化のための適した投薬量の決定の場合に考慮するべき２つの異なる基準が重要である。第１に最強の応答を得るための最適投薬量及び第２に有用なポリクロナール抗体の製造を誘起する最小投薬量である。

注射された物質の多くは異化され、適した標的免疫細胞に達する前にクリアランスされる。この過程の効率は宿主由来のタンパク質性補助因子、注射の経路、アジュバントの使用及び注射された表面タンパク質の固有の性質と共に変化する。

従って免疫系に与えられる有効投薬量は、導入された投薬量とほとんど関連性がなく、従って必要投薬量は実験的に決定しなければならない。これらの決定は当該技術における熟練者により容易に行うことができる。二次注射及び後の追加免疫は一次注射と同様か又はそれ以下の量で与えることができる。

注射の経路は３つの実行上の決定に支配される。１）どのくらいの体積を与えなければならないか：２）免疫原と共にいずれの緩衝液及び他の成分を注射しなければならないか：及び３）免疫原をどのくらい迅速にリンパ系又は循環系に放出しなければならないか。例えばうさぎの場合、通常多数の皮下部位に大量の注射を与える。マウスの場合、腹腔内注射を用いないと大量は不可能である。アジュバント又は粒子状物質が注射内に含まれる場合、免疫原は静脈内に与えてはならない。接種材料をゆっくり放出することが望ましい場合、注射は筋肉内又は皮肉で行うべきである。直後の放出の場合は静脈内注射を用いる。

多くの場合、特に異化され易く溶解性の抗原の場合−次抗体応答は非常に弱い。

従って一次免疫化の後に二次又は追加の注射が必要である。

準備された患者にタンパク質を再導入する前に猶予が必要である。最低２−３週間が薦められるが、もっと長い間隔も可能である。二次及びその後の注射への抗体応答はずっと強い。より高い力価の抗体が得られるが、より重要なことに血清中に存在する抗体の性質及び量が変化する。

これらの変化が親和性の高い抗体を与える。二次、三次及びその後の注射の間隔も変えることができるが、通常長くして新しく注射された抗原の急速なりリアランスを防ぐのに十分な程抗体の循環量を下げることが必要である。

減少した循環抗体を避妊の継続のために増加させるために、続いて追加免疫注射が必要であろう。これらの注射の実際の間隔は、種により異なる。しかし精子表面タンパク質抗体のために血清量を監視することにより、当該技術における熟練者が間隔を決定することができる。

池の具体化において、精子表面タンパク質に対するアロ抗血清又はモノクロナール抗体を患者に投与して避妊を行うことができる。アロ抗血清は同種の別の患者中で誘起され、患者の血清から単離され、受容患者中に注射するために適した担体中で調製される。当該技術における熟練者は投与のためのモノクロナール抗体の調製及び配合法を熟知している。

以下の実施例にて本発明をさらに説明する。

衷塵男実施例１０モルモットＰＨ−２０をコードするＤＮＡの単離ライブラリ構築及びスクリーニングパーコール勾配（Ｐｅｒｃｏｌｌ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）上で積厚細胞に関して濃縮されたモルモット精巣細胞の集団を用いて積厚細胞完全ＲＮＡを単離した。ペレット化した細胞を、ｌＱｍＭのトリス（ｐＨ８゜６）、０．５％のＮＰ−４０，０，１４ＭのＮａＣ１，１，５ｍＭのＭｇｃ１２及び１０ｍＭのＶＲＣを含む０．５−１．０ｍｌの溶液中にてバナジル−リポヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）の存在下で界面活性剤を用いて溶菌した。細胞破片を平板培養した後、２Ｘプロテイナーゼに緩衝液（２Ｘ＝０．２Ｍのトリス（ｐＨ７，５）　、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　、０．３ＭのＮａＣ１及び２．０％の５ＤＳ）及び２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを上澄み液に加えた。オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより完全ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを精製した。標準的方法を用いてｃＤＮＡを合成した。ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐｏｒａｔ　ｉｏｎからのキット及び案を用いてサイズ選択ｃＤＮＡ　（０，５−７ｋｂ）をラムダｇｔｌｌアームと連結し、ラムダコートタンパク雪中にパッケージングした。

非増幅（ｕｎａｍｐ　ｌ　ｉ　ｆ　１ｅｄ）ライブラリをスクリーニングのために２０．０００プラ一ク／１５０ｍｍ平板にて平板培養した。各平板からの単一のニトロセルロース濾過を、うさぎ抗−ＰＨ−２０ポリクロナール抗血清を用いて免疫黒染しくｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　ｔｅｄ）　、アフィニティー−精製ＰＨ −２０タンパク質に対して誘起しくＰｒｉｍａり質を含むＴＢＳＴ　（１０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）　、０．１５ＭのＮａＣ］、０．０５％のＴｗｅｅｎ− ２０）中に１１５００で希釈した。

大腸菌タンパク質は、Ｙ１０９０細胞の終夜培養物を平板培養し、細胞を最小体積のＴＢＳＴに再懸濁し、液体窒素中で凍結することにより調製した。解凍した細胞を音波処理し、ＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてタンパク質濃度を決定した。抗−うさぎＩｇＧアルカリホスファターゼ−共役第２抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅＣ）を用いて６個の陽性のプラークを検出した。プラーク−精製陽性クローンにより製造した融合タンパク質の大きさを、融合タンパク質を含む大腸菌抽出物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上における分析により決定して１１８−１５７ｋＤで変化するとした。６個の陽性クローンからの挿入断片をｐＵｃ１９中にサブクローニングし、少なくとも部分的に配列決定した。

挿入断片の２つは、その誘導アミノ酸配列中に２個のＰＨ−２０トリプシンペプチドの配列を突き止めることにより、ＰＨ−２０タンパク質をコードすることが確かめられた。これらの挿入断片の両方共（ｇｐＰＨ−２０−４、ヌクレオチド（ｎ　ｔ）１０１６−２１５２及びｇ　ｐ　Ｐ　Ｈ−２０−２、ｎｔｌｏｌｏ− ２１２５、図１及び２）長い読み取り枠、停止コドン、３′非翻訳領域及びポリＡ尾部を含む。従ってこれらの２つの挿入断片はＰＨ−２０のｃＤＮＡの３′末端を与えると結論された。

他の４つの抗体−陽性ラムダクローンはＰＨ−２０と関連性がなかった。

９００２　（１９８８））の案に従って固定ＰＣＲを用いてクローニングした。

積厚細胞からのポリＡ＋ＲＮＡ　（１０μｌのｄＨ２０中の２μｇ）を６５℃に３分間加熱し、その後４μＩの１０ＸＲＴＣ緩衝液（ＬＸ緩衝液は５０ｍＭのトリス（ｐＨ８，３）　、５０ｍＭのＫＣＩ、４ｍＭのジチオトレイトール、ｌＱｍＭのＭ　ｇ　Ｃ］　ｚである）、及び合計体積４０ｕ１中の各ｄＮＴＰのｌＱｍＭの保存液を４μｌ（最終的に１ｍＭ）、２μｌの８０ｍＭナトリウムピロホスフェート（最終的に４ｍＭ）、１μＩ　（４０単位）のＲＮアシン（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）、４０ピコモルのＰＨ−２０特異的プライマー（ＰＨ− ２０−ＲＴ）　、１８単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）及び４０μＣｉの３２Ｐ−ｄＣＴＰを加えることにより逆転写した。４２℃で１時間培養した後、１μｌの逆転写酵素を追加し、次の１時間培養を続けた。

ＰＨ−２０−ＲＴプライマーは１７ヌクレオチド（ｎｔ）オリゴマー（ｎ　ｔ　１２４２−１２５８、図２）であり、挿入ｇｐＰＨ−２０−１（図１）の５°末端から一２５０塩基下流である。

カラムクロマトグラフィーにより過剰のＰＨ−２０−ＲＴから一重鎖ｃＤＮＡを分離し、ポリＡを用いて尾部形成しくｔａｉｌｅｄ）、１、Ｑｍｌに希釈した。

第２の鎖合成及びＰＣＲ増幅を、１０　ｔｔ　Ｉの逆転写生成物、２０ピコモルの（ｄＴ）１７アダプター、５０ピコモルのアダプター及び５０ピコモルのＰＨ −２０−ＡＭＰプライマーを含む１００μ＋の反応液中でＧｅｎｅＡｍｐ　キット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いて行った。ＰＨ−２０−ＡＭＰプライマーは１７ｎｔオリゴ７−　（ｎｔ１２０２−１２１８、図２）であり、ＰＨ−２０−ＲＴプライマーから上流に位置する。スピンカラムクロマトグラフィー（カラムはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから）により、非挿入プライマー及び遊離のヌクレオチドからＰＣＲ生成物を精製した。続いてそれをＨｇ１Ａ　Ｉ及びＳａｔ　Ｉを用いて消化し、ゲル精製し、Ｐｓｔ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に連結した。主要ＰＣＲ生成物は１．２ｋｂであり、サザン分析によりこのバンドが標識挿入ｇｐＰＨ−２０− １とハイブリ・ソド形成することが確認された。３回の別々の反応からの主要ＰＣＲ生成物をクローニングし、３回の反応それぞれからの１個の挿入断片を配列決定した（ｇｐＰＨ−２０−３、ｎｔｌ−１１７５、ｇｐＰＨ−２０−４、ｎｔ２４−１１７５及びｇｐＰＨ−２０−５、ｎｔ２９５−１１７５）。

側鎖上でその全体を配列決定した５個のｃＤＮＡ挿入断片から完全ＣＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を得た（図２）。ｃＤＮＡ配列は３５４ｎｔの５゛非翻訳領域、１５９０ｎｔの読み取り枠、及び２０８ｎｔの３゛非翻訳領域を含む。誘導アミノ酸配列は、精製ＰＨ−２０から得られるすべてのトリプシンペプチド配列を含み、ｃＤＮＡ力慣性ＰＨ−２０クローンであることを確証した。／％（ブ１ルソド形成実験は、モルモットゲノムＤＮＡがＰＩ−１−２０に関する単一の遺伝子を有することを示した。コンピューター探索により、モルモットＰＨ−２０アミノ酸配列と池の既知の配列に有意な相同性は明らかにされなかった。

実施例２・他の哺乳順接におけるＰＨ−２０相同染色体他の種のゲノムＤＮＡ中にＰＨ−２０遺伝子の相同染色体があるかどうかを決定するために、種交差（ｃｒｏｓｓ　５ｐｅｃｉｅｓ）サザン法を行った。界面活性剤溶菌−プロテイナーゼに消化により、モルモット、ラット、うさぎ、マウス及びハムスターの肺臓からゲノムＤＮＡを単離した。他のＤＮＡ試料（すなわちヒト、さる及び鶏）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃｅｎｔｅｒで他の研究者から得た。鮭の精子及びウシ胸腺からのＤＮＡはＳｉｇｍａから購入し、ＴＥ（１０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）　、１ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　）中に１ｍｇ／ｍｌで再構成した。すヘテノ種のＤＮＡ（１０μ ｇ）を制限酵素で切断し、１％アガロースゲル上で分離した。ナイロン膜上への毛管転移によりサザン法を行った。膜は、６ＸＳＳＣ，ＬＸＸシンート溶液、２５０ｍｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ、１％のＳＤＳ及び５０ｍＭのＮａ２ＰＯ４（ｐＨ７，４）を含む溶液中で６５℃にて１−２時間予備ハイブリッド形成した。予備ハイブリッド形成緩衝液及び２ｘ１０’ｃｐｍ／ｍ＋のプローブ中で５５℃にて終夜、膜をハイブリッド形成させた。プローブはランダムヘキサマー法（ｒａｎｄｏｍ　ｈｅｘａｍｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ）により調製した。黒染を室温にて２ＸＳＳＣ＋ｌ、Ｑ％ＳＤＳ中で３ｘ５分間、５０℃にて２ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で２×１０分間、及び６０℃にてｌＸ５ＳＣ十領　１％ＳＤＳ中で２×１０分間洗浄した。黒染をプラスチックの覆いで包み、−７０℃にて強調スクリーンを用いてフィルムに露光した。

黒染を、標識ｇｐＰＨ−２０−３及びｇｐＰＨ−２０−２の混合物を用いて調べた。ササン法は、鶏のＤＮＡの場合に一１０ｋｂにて弱い／Ｘイブリッド形成ハンドを示し、マウス、ラット、ハムスター、うさぎ及びヒトＤＮＡに場合に強いハイブリッド形成バンドを示した。さらにウシ及びさるのＤＮＡを用いてもハイブリッド形成が観察された。

実施例３・マウスＰＨ−２０をコードするＤＮＡの単離従来の方法を用いてマウス円形精子細胞からポリＡ十ＲＮＡを単離し、ラムダＪにおけるｃＤＮＡライブラリの製造に用いた。ライブラリを、標識全長モルモットＰＨ−２０ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。プローブはモルモットポリＡ＋ＲＮＡの最初の単離により製造した。オリゴ−ｄＴプライマーをポリ（Ａ）領域にハイブリッド形成し、逆転写酵素を用いて第１ｃＤＮＡ鎖を生成した。第１オリゴヌクレオチドがモルモットＰＨ−２０の５°非翻訳領域の一部と相補的であり、第２オリゴヌクレオチドが３°非翻訳領域と相補的である２つのオリゴヌクレオチドを反応混合物に加え、コード領域全体を含む全長二重鎖ＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応により生成した。この反応の生成物は１．５−１．６ｋｂの二重鎖ＤＮＡフラグメントであった。フラグメントをクローニングし、クローニングされたフラグメントを分析してそれが実際にモルモットＰＨ−２０タンパク質をコードすることを確かめた。

従来の方法によりこのクローンから標識プローブを生成した。

上記のモルモットプローブを用いてマウスｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。２つの陽性のクローンが同定された。クローンのいずれもｃＤＮＡの５° 部分からの配列を含んでいなかった。陽性のクローンのひとつの５°末端と相補的な１組のプライマーを用いた固定ＰＣＲを用い、マウス遺伝子の５′末端をクローニングした。ＤＮＡ配列を図ラムダｇｔｌｌにおいてヒト精巣ライブラリをスクリーニングすることによりヒトＰＨ−２０をコードするＤＮＡを単離し、クローニングした。ライブラリを９０ｍｍの平板当たり約３，０００プラークの密度で平板培養した。ファージプラークを二重フィルターに移し、２つの放射線標識ＤＮＡプローブ、マウスＰＨ−２０ｃＤＮＡ及びモルモットＰＨ−２０ｃＤＮＡの混合物を用いてスクリーニングした。さらに特定するとモルモットプローブは上記の標識全長モルモットＰＨ−２０プローブであり、マウスクローンはマウスｃＤＮＡの５′末端からの配列を欠いた２つのマウスクローンの１つである。

２つのプローブの混合物とハイブリッド形成した陽性のプラークを取り上げ、精製した。ｃＤＮＡ挿入断片をサブクローニングし、標準的方法を用いてＤＮＡ配列を決定した。２つのｃＤＮＡクローンが得られた。

２つのそれぞれは異なる形態のヒトＰＨ−２０をコードする。１つのヒトクローンをＨ２Ｓ（図４）と称し、１つをＨ２Ｃ（図５）と称する。

Ｈ２Ｓは５１０アミノ酸の読み取り枠及び短い５′ならびに３′非翻訳領域を含む全長クローンである。Ｈ２Ｓの読み取り枠においてコードされるタンパク質は、モルモットＰＨ−２０と５９％同一であり、７４％類似である（同類置換を含む）。

Ｈ２ＣはヒトＰＨ−２０のカルボキシル末端半分をコードする部分長クローンである。Ｈ２Ｃのヌクレオチド１は、Ｈ２Ｓのヌクレオチド８１４に対応する。Ｈ２Ｃのヌクレオチド１−７８１の配列は、Ｈ２Ｓのヌクレオチド８１４−１５９４の配列と同一であり：ヌクレオチド７８２で始まりヌクレオチド１６７５に続くＨ２Ｃの配列は、ヌクレオチド１５９５で始まりヌクレオチド１６９６に続くＨ２Ｓの配列と異なる。コードされたＰＨ−２０に関して、Ｈ２Ｃによりコードされる部分的タンパク質はＨ２Ｓによりコードされるタンパク質のアミノ酸２３６−４９６と同一である（アミノ酸の番号はＨ１８配列に基づく）。その後Ｈ１６はアミノ酸４９７−５ｉ１をコードし、Ｈ２Ｓはアミノ酸４９７−５１０をコードし、配列は各残基において異なる。

ター１：＋ＭＡＬ−Ｄ及びｐＭＡＬ−ｃ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ　ａｎｄ　Ｂｉ。

ｔａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中にサブクローニングした。両ベクター中でＰＨ−２０は融合タンパク質として作られ、Ｎ−末端融合パートナ−は木星堕のマルトース結合（ＭＢＰ）タンパク質である。ｐＭＡＬ−ｐの場合、コードされるＭＢＰ（通常はべりブラズムタンパク質）は通常のシグナル配列を有しており、その結果ＭＢＰ−ＰＨ−２０融合体は細胞周辺に向かう。細胞周辺への輸出に成功することができた融合タンパク質の場合、この位置がジスルフィド結合が形成されて（ヒトＰＨ−２０中に１２個のシスティンが存在する）おそらく免疫原性のより強いタンパク質を与えるという利点を有する。ｐＭＡＬ−ｃの場合、ＭＢＰに関するシグナル配列が存在せず、融合タンパク質は細胞質中で見いだされ、ジスルフィドを形成しない。ヒトＰＨ−２０はｐＭＡＬ−１）及びｐＭＡＬ− ｃの両方から製造される。しかしひずみを有するｐＭＡＬ−ｐの場合ｈＰＨ−２０の製造量は低いが、ひずみを有するｐＭＡＬＧｃ″ｒＴＴλＣＴＧＴ　ＧＡＧＧＴ’ｒにＣＴｒ　ＧＴｋＣＡＴＴＧｋＴ　ＴτＴＣＣ入ＧＴＴＣ’！’ＣＴＴＡＡＧＡＡＴ　ＣＴＧＴＧfＣτＴＧＦｉｇｕｒｅ　２Ｆｉｇｕｒｅ　２　（ｅ口ｎｔ、）Ｆｉｇｕｒｅ　２（ｃａｎｔ、）Ｆｉｇｕｒｅ　３マウスＰＨ−２０ｃＤＮＡの配列翻訳開始及び停止に下線を引くＦｌｇｕｒｅ　４ＡＤＩＩＡ　配列　１６軸す、ｐ、ＩＩ；ＣＡＡｔｔＣＡＴ’ＴＣＣ、、、σπＣＣ１：ＡＡＴＴＣ直線状Ｆｉｇｕｒ＠５Ｆｉｇｕｒｅ　５　（ｃｏｎｔ、）補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成５年６月１１日

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類の精子中に存在し、哺乳類の受精に不可欠な表面タンパク質全体又はその一部をコードする単離ＤＮＡ。
２．表面タンパク質がＰＨ−２０である、請求の範囲第１項記載の単離ＤＮＡ。
３．哺乳類ＰＨ−２０精子表面タンパク質全体又はその一部をコードする単離ＤＮＡ。
４．単離ＤＮＡがヒトＰＨ−２０精子表面タンパク質をコードする、請求の範囲第３項記載の単離ＤＮＡ。
５．ヒトＰＨ−２０タンパク質全体又はその一部をコードするＤＮＡが、図４又は図５のＤＮＡ配列から選ばれるＤＮＡ配列とハイブリッド形成する能力により特徴づけられる、請求の範囲第４項記載の単離ＤＮＡ。
６．哺乳類ＰＨ−２０タンパク質全体又はその一部をコードするＤＮＡを発現可能な形態で含むＤＮＡ発現構築物。
７．コードされるＰＨ−２０タンパク質がヒトＰＨ−２０タンパク質である、請求の範囲第６項記載のＤＮＡ発現構築物。
８．ヒトＰＨ−２０タンパク質全体又はその一部をコードするＤＮＡが、図４又は図５のＤＮＡ配列から選ばれるＤＮＡ配列とハイブリッド形成する能力により特徴づけられる、請求の範囲第７項記載のＤＮＡ発現構築物。
９．発現可能な形態のＰＨ−２０タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物を用いて細胞を形質転換する段階を含む組み替えＰＨ−２０タンパク質の製造法。
１０．ＰＨ−２０がヒトＰＨ−２０タンパク質である、請求の範囲第９項記載の方法。
１１．ヒトＰＨ−２０タンパク質全体又はその一部をコードするＤＮＡが、図４又は図５のＤＮＡ配列から毒ばれるＤＮＡ配列とハイブリッド形成する能力により特徴づけられる、請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．哺乳類ＰＨ−２０タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な形態で含むＤＮＡ発現構築物を用いて細胞を形質転換することにより製造されたＰＨ−２０タンパク質。
１３．哺乳類ＰＨ−２０タンパク質がヒトＰＨ−２０タンパク質である、請求の範囲第１２項記載の哺乳類ＰＨ−２０タンパク質。
１４．ヒトＰＨ−２０タンパク質をコードするＤＮＡが、図４又は図５の配列から選ばれるＤＮＡ配列とハイブリッド形成する能力により特徴づけられる、請求の範囲第１２項記載のヒトＰＨ−２０タンパク質。
１５．単離ＤＮＡが図２、図３、図４及び図５のＤＮＡ配列から成る群より選ばれるＤＮＡ配列とハイブリッド形成する能力により特徴づけられる、ＰＨ−２０又はその一部をコードする基本的に純粋な哺乳類ＤＮＡ。
１６．同一種の哺乳類の精子中に存在し、該種の受精に不可欠な単離表面タンパク質を含む組成物を用いた該哺乳類の能動免疫化の段階を含む、非モルモット哺乳類の避妊法。
１７．該表面タンパク質が精子−卵子接着に不可欠である、請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．哺乳類がヒト、イヌ、ネコ及びウシである、請求の範囲第１６項記載の方法。
１９．予防接種する哺乳類と同一種の精子中に存在し、該種における受精に不可欠の単離表面タンパク質を含む組成物を含む、非モルモット哺乳類において避妊を起こすためのワクチン。
２０．哺乳類がヒト、イヌ、ネコ及びウシから成る群より選ばれる、請求の範囲第１９項記載のワクチン。
２１．該単離表面タンパク質をアジュバントと組み合わせる、請求の範囲第１９項記載のワクチン。
２２．哺乳類の同一種の精子中に存在し、該種における受精に不可欠の表面タンパク質に対するアロ抗血清を用いて該哺乳類を受動免疫化することを含む、非モルモット哺乳類のための避妊法。
２３．哺乳類がヒト、イヌ、ネコ及びウシから成る群より選ばれる、請求の範囲第２２項記載の方法。