KR101055333B1 - 돼지의 히알루로니다제 ｐｈ-20을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지의 체외수정 효율 및 정원줄기세포의 분리 효율을 증진시킬 수 있는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 돼지의 정소세포에서 특이적으로 발현하는 히알루로니다제 PH20의 재조합 단백질을 이용하여 효율적으로 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 제조할 수 있으며, 제조된 항체는 돼지의 체외수정시 발생되는 다정자 침입(polyspermy)을 방지하거나 돼지 정원세포(spematogonia stem cell)를 선별하는데 이용될 수 있다.
PH-20, 정자, 수정, 활성염색, 재조합 단백질
Description
본 발명은 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지의 체외수정 효율 및 정원줄기세포의 분리 효율을 증진시킬 수 있는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
포유동물의 수정의 일련의 과정에서 최종단계인 정자와 난자가 만나기 위해서는 우선 정자는 배란된 난자의 외층인 난구세포층을 분해하여야한다. 난구세포층은 난구세포들을 히알루로닉산(hyaluronic acid)라는 다당으로 이루어진 사슬에 묶여있다. 이 사슬을 정자 머리에 존재하는 PH-20이라는 히알루로니다제(hyaluronidase)로 분해하는 과정이 필수라고 알려져 있다(Yanagimachi, in The Physiology of Reproduction, 189-317, 1994).
PH-20은 생식세포에서만 발현되는 GPI(Glycosyl Phosohatydyl Inositol) anker 단백질로서, 마우스에서 사람에 이르기까지 모든 동물의 정자에 존재하고 있다. 이 분자는 히알루로니다제 도메인과 투명대 결합도메인으로 구성되어 있으며, 분자량은 약 60kDa으로 알려져 있다. 특히, 설치류에서는 hyal5라는 서브타입이 존재하고 있다는 것이 밝혀졌다(Kim, et. al., PNAS., 102: 18028-18033, 2005).
정소 특이적인 히알루로니다제, PH20은 란구세포 분해 효소도메인 뿐만 아니라 난자 표면의 투명대와 결합하는 도메인을 포함하고 있다(도 1). 특히, 수정할 때 필요한 과정의 하나인 정자의 선체반응은 정자가 투명대와 결합하는 것을 인식하여 일으키는 현상으로 투명대를 뚫고 들어가기 위해 가수분해 효소들을 분산시키는 과정이다. 그러므로 돼지의 체외수정의 경우, 정자와 난자가 만나는 과정을 방해하면 돼지 정자가 비특이적으로 난자에 붙는 것을 방지 할 수 있을 것이다.
앞서 기술한 바와 같이, 수정이 성립되기 위해서는 난 주위의 난구세포를 정자가 반드시 분해해야한다. 특히, 생식공학기술을 이용한 체외수정에서 정자와 난자를 결합시킬 때 난자 주변의 난구세포층을 분해하여 IVF (In Vitro Fertilization)를 시행한다.
체외수정 기술은 1980년대 초반에 이미 개발이 시작되었는데, 소의 경우는 체외수정에 의한 개체생산 기술이 체계적으로 확립이 되어 형질전환 젖소 개발 등에 응용되고 있다. 반면, 돼지의 경우 아직 체외수정란 생산 효율이 전반적으로 낮다. 돼지에 있어서 체외성숙 및 체외수정의 성공은 1986년 Cheng 등에 의해서 이루어 졌는데 (Cheng et. al., Therioginology, 25, 146, 1986), 많은 정자가 난자에 들어가는 다정자 침입 (polyspermy)이 체외수정란의 발달장애요인으로 보고되었다 (Niwa, J. Reprod. Fertil., 59, 451-455, 1993).
한편, male 생식세포를 분리 배양하여 줄기세포를 생산하는 기술이 최근에 마우스에서 확립되었다. 이렇게 분리 배양된 줄기세포를 정원줄기세포(spematogonia stem cell)라 하는데, 일반적인 배아줄기세포와 유사하여 자가 재생능력과 정자세포로 분화능력을 갖고 있다. 특히, 정원줄기세포는 난치병 치료 연구와 불임치료 뿐만 아니라 형질전환 질환모델을 개발하는데도 이용되기 시작하였다. 그러나 마우스 이외의 동물에서는 아직 이러한 기술이 많이 연구되지 못했다.
이에, 본 발명자들은 돼지 체외수정시 발생되는 다정자 침입 (polyspermy)을 효율적으로 방지하고, 돼지 정원세포(spematogonia stem cell)를 효율적으로 선별하기 위하여 예의 노력한 결과, 돼지의 정소세포에서 특이적으로 발현하는 히알루로니다제 PH20의 재조합 단백질을 이용하면 효율적으로 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 제조할 수 있다는 것을 확인하였고, 제조된 항체를 이용하면 돼지의 체외수정시 다정자 침입을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 정원줄기세포를 효율적으로 분리할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 돼지의 히알루로니다제 PH-20에 특이적으로 결합하는 항체의 제조방법 및 이로부터 제조된 항체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지의 체외수정시 발생되는 다정자 침입(polyspermy)을 방지하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지 정원세포(spematogonia stem cell)를 선별하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 단백질을 정제한 후, 동물에 주사하여 면역반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 면역반응이 유도된 동물의 혈청으로부터 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 분리하는 단계를 포함하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 돼지 히알루로니다제 PH-20을 코딩하는 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 염기 서열로 표시되는 유전자를 프라이머로 하여 PCR 증폭된 산물을 클로닝한 후, 이를 미생물 또는 세포에 도입시켜 제조한 것임을 특 징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법은 (d) 상기 (c) 단계에서 분리한 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭하는 단계; (e) 상기 증폭된 PCR 산물을 글루타치온 에스 트랜스퍼라제(GST)가 내재된 벡터에 클로닝하고, 상기 클로닝된 벡터를 미생물에 도입하여, 재조합 미생물을 제작하는 단계; 및 (f) 상기 재조합 미생물로부터 글루타치온 에스 트랜스퍼라제(GST)가 융합된 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항체의 제조방법에 의해 제조된 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지의 체외수정시 발생되는 다정자 침입(polyspermy)을 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지의 정원세포(spematogonia stem cell)를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 돼지의 정소세포에서 특이적으로 발현하는 히알루로니다 제 PH-20의 재조합 단백질을 이용하여 효율적으로 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 제조할 수 있다. 제조된 항체는 돼지의 체외수정시 발생되는 다정자 침입(polyspermy)을 방지하는데 이용될 수 있고, 또한 돼지 정원세포(spematogonia stem cell)를 선별하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서는 돼지 히알루로니다제 PH-20 유전자를 클로닝하였으며, 클로닝된 돼지 히알루로니다제 PH-20 유전자를 이용하여, 투명대 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 제조한 후, 이를 이용하여 돼지 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 제조하고자 하였다.
즉, 본 발명에서는, 돼지의 정소 조직으로부터 전체 RNA(total RNA)를 추출하여, cDNA를 합성한 후, 이를 바탕으로 PCR을 수행하여 돼지 히알루로니다제 PH-20 유전자를 클로닝하였다. 그리고, 돼지 히알루로니다제 PH-20 유전자의 투명대 결합 도메인의 일부를 포함한 영역을 His tag이 내재되어 있는 벡터에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입한 다음, 상기 형질 전환체를 배양하여 PH20을 발현시키고, His tag을 이용하여 PH-20이 발현된 형질 전환체(재조합 단백질)를 정제하였다. 그리고, 상기에서 정제된 재조합 단백질을 토끼에 주사하여 항체를 생산하였고, 이를 정제하기 위하여 PH-20에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭한 후, 증폭된 PCR 산물을 글루타치온 에스 트랜스퍼라제(GST)가 내재되어 있는 벡터에 클로닝한 다음, E. coli BL21(DE3)에 도입하였으며, 상기 형질 전환체를 배양하 여 GST 융합 재조합 단백질이 발현된 것을 정제함으로써 돼지 히알루로니다제 PH20을 특이적으로 인식하는 항체를 수득하였다.
따라서, 본 발명은 제 일관점에서, (a) 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 단백질을 정제한 후, 동물에 주사하여 면역반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 면역반응이 유도된 동물의 혈청으로부터 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 분리하는 단계를 포함하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 돼지 히알루로니다제 PH-20을 코딩하는 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 염기 서열로 표시되는 유전자를 프라이머로 하여 PCR 증폭된 산물을 클로닝한 후, 이를 미생물 또는 세포에 도입시켜 제조한 것임을 특징으로 한다.
상기 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 돼지 히알루로니다제 PH-20은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군 에서 선택된 어느 하나이고, 상기 세포는 HEK(Human Embryonic Kidney) 293 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항체 제조에 사용되는 동물은 쥐(mouse, rat), 토끼, 염소(goat), 양(sheep), 당나귀(donkey), 개(canine), 기니아피그, 햄스터, 고양이(feline), 말, 소, 닭, 돼지 등을 예시할 수 있으며, 토끼를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법은 (d) 상기 (c) 단계에서 분리한 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭하는 단계; (e) 상기 증폭된 PCR 산물을 글루타치온 에스 트랜스퍼라제(GST)가 내재된 벡터에 클로닝하고, 상기 클로닝된 벡터를 미생물에 도입하여, 재조합 미생물을 제작하는 단계; 및 (f) 상기 재조합 미생물로부터 글루타치온 에스 트랜스퍼라제(GST)가 융합된 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 미생물은 앞서 기재한 바와 같이, 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 이용할 수 있다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미 한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et. al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et. al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 제조방법에 의해 제조된 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.
상기 항체는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식할 수 있으므로, 돼지의 체외수정시 발생되는 다정자 침입(polyspermy)을 방지하거나 돼지의 정원세포(spematogonia stem cell)를 선별하는데 유용하게 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지의 체외수정시 발생되는 다정자 침입(polyspermy)을 방지하는 방법에 관한 것이다. 즉, 돼지 체외수정은 사정된 정자와 체외성숙으로 얻어진 난자와 시험관내에서 결합시켜 수정란을 얻는 과정을 말한다. 특히, 정자와 난자가 만나는 과정에서 돼지 정자 두부의 PH-20이 난자 투명대와 결합하면서 선체반응을 유도한다고 알려져 있다. 본 발명에서 얻어진 PH-20 항체는 체외수정시 정자와 난자의 결합을 방해시키기 위해서 일정 양을 정자와 결합시켜 정자와 난자와의 결합을 방해시킴으로서 돼지 체외수정에 일어나는 다정자 침입을 효율적으로 막을 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지의 정원세포(spematogonia stem cell)를 선별하는 방법에 관한 것이다. 정원세포는 정자를 만드는 근본이 되는 세포로, 정소내에서 자가분열을 통하여 세포수를 증가시키는 동시에, 그 일부분이 분화하여 정자를 무한적으로 생산하고 있다. 정원세포를 분화시키지 않고 배양하는 기술이 확립되면, 특정 유전자 도입된 정자와 난자를 체외수정시킴으로써 용이하게 형질전환 돼지를 생산할 수 있다. 돼지정원세포는 PH-20 분자를 가지고 있으므로, 본 발명에 따른 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체와 FACS (Fluorescence Activated Cell sorting)을 이용하여 특정한 생식세포만을 분리하고, 이를 배양하면 보다 많은 양의 정원세포를 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.
돼지 PH-20 유전자의 클로닝
돼지 PH-20 cDNA를 제조하기 위하여, 산청 흑돼지의 정소 조직을 적출하여 조직의 10배 부피로 이소젠(isogen, Nippongene)을 넣고, 초음파 파쇄기를 이용하여 조직을 분쇄한 후, 이소프로파놀(isopropanol)을 이용하여 분리된 상층액으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 수득된 전체 RNA 5㎍/㎕ 농도를 취해서 Superscript III RT kit(Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 cDNA를 제작하였다. 즉, 50℃에서 1시간 동안 역전사효소에 의해 제1 가닥 cDNA를 합성한 후, 80℃에서 5분 동안 반응시킨 다음, RNaseH 효소를 처리하여 37℃에서 20분 동안 배양하여 최종적으로 cDNA를 수득하였다.
하기 서열번호 2 및 3의 서열을 갖는 프라이머 세트 및 수득된 cDNA 주형을 포함하는 반응액으로 PCR을 수행하고, PCR 산물을 전기영동을 통하여 확인하였다.
서열번호 2: 5'-AACTCGAGCCACCATGGGAGTACAGAGGCTCCA-3'
서열번호 3: 5'-TTGTCGACTCAGCAGCGGCCCGAACC-3'
다음으로, 1.5kb 부근의 밴드들을 잘라서 DNA만을 순수분리하였고, 분리된 DNA를 pGEM T-벡터(Promega)에 클로닝하였고, 시퀀싱을 통하여 기존에 알려진 PH-20 유전자와 염기서열이 일치함을 확인하였다.
다음으로, 상기 클로닝된 PH-20 유전자를 제한효소로 처리하여 0.8% 아가로오스 겔에 전기영동시키고, 밴드를 잘라내어 진핵생물 발현벡터인 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다.
실시예 2.
돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체 제작
돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 제작하기 위하여, PH20 분자의 투명대 결합 도메인을 포함한 영역인 283~402 아미노산 영역을 하기 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.
서열번호 5: 5'-AAGGATCCAGGAGGCCATTCGTGT-3'
서열번호 6: 5'-TTCTCGAGGTTCAGATGAAGATAGTC-3,
상기 증폭된 PCR 산물을 His tag이 내재되어 있는 pET23d 벡터(Novagen, Co., USA)에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입하였다. 상기 형질전환체(DE3)를 배양한 후, 재조합 PH-20 단백질의 발현 여부를 CBB(Coomassie Brilliant Blue) 염색법으로 확인하였다 (도 2의 A).
도 2의 A에서 S1은 negative control로서 변형되지 않은 대장균의 가용성 단백질이고, S3~S6은 재조합 단백질을 발현시킨 대장균의 가용성 단백질이며, P1 및 P2는 negative control이고, P3~P6은 불용성 단백질이다.
도 2의 A에 나타난 바와 같이, P3~P6 형질 전환체의 불용성 단백질에서 PH20 재조합 단백질이 발현하는 것을 확인하였다(도 2A의 box).
다음으로, 상기 P3번 형질 전환체를 대량 발현시키고, 발현된 재조합 PH-20 단백질을 니켈 레진으로 충진된 His-친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, 정제된 재조합 PH-20 단백질을 SDS-PAGE 하였다. 도 2B에 나타난 바와 같이, 9번 및 10번 레인에서 재조합 PH-20 단백질이 가장 많이 검출되었으며, 이들을 PBS로 투석하였다.
항체를 제조하기 위하여, 정제된 재조합 PH-20 단백질을 10일 간격으로 500㎍씩 5번 토끼에 주사하였다.
토끼에서 생성된 돼지 히알루로니다제 PH-20에 대한 항체를 정제하기 위하여, 먼저, 토끼 혈청을 40% 황산암모늄으로 침전시킨후, 침전물을 1xPBS에 녹여 1xPBS로 투석을 한다. 그후, 돼지 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 코딩하는 유전자의 283~402 아미노산 영역을 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다.
상기 증폭된 PCR 산물을 GST가 내재되어 있는 pGEX4T1(Amersham pharmacia) 벡터에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입하였다. 상기 형질전환체를 배양한 후, GST 융합 재조합 단백질을 발현하는 세포를 웨스턴 블럿으로 확인하였다 (도 3). 상기에서 확인된 GST 융합 재조합 단백질을 GST-친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 다음, PBS로 투석하여 PH20에 대한 항체를 수득하였다.
실시예 3.
돼지 정소 및 HEK 배양세포에서 PH-20의 발현 확인
돼지의 정소 조직을 적출하여, 단백질 억제제, protease inhibitor cocktail (Sigma)가 첨가된 추출용액(1% TX-100)에서 가용화시킨 후, 원심 분리하여 상층액을 수득한 다음, 상기 상층액을 단백질 어세이에 의하여 정량하였다. 상기에서 정량된 돼지 정소 조직 10㎍과 HEK293세포에서 발현시킨 단백질 10ug에 SDS 샘플 버퍼(직접 만들어 사용함)를 넣고 3분간 열 변성하여, 10%의 SDS-PAGE 겔에 전기영동한 다음, 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF)막으로 옮기고, 2% 탈지 분유로 블로킹하였다. 이후, 상기에서 제조된 PH-20 항체를 넣어 반응시킨 후, HRP(Horse-Radish peroxidase)가 연결된 2차 항체(Jackson immunoResearch)를 처리하여 발생하는 신호를 X-ray 필름에 현상하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 돼지 정소 조직과 PH20 유전자를 도입시킨 HEK293 세포에서 PH-20이 발현된다는 것을 확인하였고, 이를 통하여 PH-20이 돼지 정자에 존재함으로써 상기의 항체를 다양한 연구에 이용할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4.
배양세포 (HEK293)에 돼지 PH-20의 발현 확인
실시예 1에서 제조된 벡터를 lipofectin 2000 (invitrogen)을 사용하여 HEK293 세포에 형질도입 시켰다. 5%의 CO2, 37℃의 조건 하에서 48시간 배양후 세포를 수확하여 1% 계면활성제 (TX-100)로 세포를 녹여 10ug과 1ug을 각각 웨스턴 블 롯에 사용하였다. 그 결과, 돼지 PH20은 HEK293 세포에서 발현되었다.
실험예 1.
돼지의 다정자 침입 방지
113.1 mM NaCl, 3 mM KCl, 7.5 mM CaCl22H2O, 20 mM Tris (crystallized free base; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA), 11 mM glucose, and 5 mM sodium pyruvate으로 구성된 IVF 배지에 신선한 사정된 돼지 정자를 넣은 다음, 실시예 2에서 얻어진 30ug의 항체, 2.5 mM caffeine/sodium benzoate와 4 mg/ml BSA (fatty acid-free)를 넣어 37℃에서 30분 간 배양하였다. IVF 배지로 배양된 정자를 깨끗하게 씻은 후, 성숙된 난자와 배양을 시켰다. 상기의 정자와 반응시킨 난자를 1xPBS 로 3번 씻은 다음 난자의 난에 결합된 정자의 수를 확인한 결과 PH-20 항체를 넣지 않는 비교군에서는 평균 10개의 정자가 결합되어 있는 반면, 실험군에서는 평균 4마리의 정자가 난자에 결합되어 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하면, 돼지의 체외수정시, 정자와 난자의 결합을 효과적으로 방해함으로써, 다정자 침입을 방지할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2.
돼지의 정원세포(spematogonia stem cell) 선별
돼지의 정소조직을 100 U/ml penicillin과 100 mg/ml streptomycin이 들어있는 1xPBS (칼슘과 마그네슘 free)로 3번 씻은 다음, 가위로 커팅하였다. 가는 정세관을 0.1% collagenase type I과 10ug DNaseI이 들어있는 배지에 넣어 37℃에서 30 분 간 반응시킨후, 0.25% 트립신과 10ug DNaseI이 들어있는 배지에 10분동안 반응시켰다. 분산된 정소조직을 80um nylon mesh에 통과시켜 최종 정소세포를 얻었다. 그 다음 실시예 2에서 획득한 돼지 PH-20 항체에 FITC를 결합시켜 FACS용 항체를 제조하였다. 정소조직에서 얻어진 정소세포와 FITC가 결합된 FACS용 PH20 항체를 반응을 시킨후, FACS (Fluorescence-activated cell sorting)에 의해서 형광된 세포만을 선별하였다. 선별된 세포들을 PH-20 항체로 웨스턴 블롯을 수행하여 정원세포의 선별이 제대로 이루어졌음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 돼지의 PH-20의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 돼지의 히알루로니다제 PH-20 재조합 단백질의 발현 유무를 CBB 염색법으로 확인한 도면이다((A: 정제되지 않은 재조합 단백질의 SDS-PAGE 사진으로써, S1, 및 S3~S6은 가용성 단백질, P1~P6는 불용성 단백질을 나타냄, B: 발현된 재조합 단백질(PH-20)을 정제한 후 SDS-PAGE한 사진으로써, 1~11번은 정제과정시 사용된 각 fraction을 의미함).
도 3은 돼지의 PH-20 유전자가 형질도입된 재조합 HEK293 세포의 웨스턴 블롯 사진이다 (별표(*): 돼지 PH-20, 화살표(▼): HEK293세포에 발현된 PH20).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Specific Antibody Against Porcine Hyaluronidase PH-20 and
Preparing Method Thereof
<130> P07-B262
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 493
<212> PRT
<213> porcine PH-20
<400> 1
Met Gly Val Gln Arg Leu Gln His Ile Ser Phe Arg Ser Phe Phe Val
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ala Pro Gln Val Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
20 25 30
Cys Leu Ala Leu Asp Phe Arg Ala Ser Pro Ile Ile Pro Asn Thr Thr
35 40 45
Phe Leu Trp Val Trp Asn Ala Pro Thr Glu Ser Cys Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Pro Asp Leu Ser Leu Phe Ser Phe Val Thr Ser Pro Arg
65 70 75 80
Ala Ser Val Thr Gly Gln Phe Leu Thr Leu Phe Tyr Ala Asn Arg Leu
85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro His Val Asp Glu Asn Thr Gly Lys Asn Val Asn Gly
100 105 110
Gly Ile Pro Gln Leu Gly Ser Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Ala Glu
115 120 125
Lys Asp Ile Leu His Tyr Met Gln Ile Asp Lys Val Gly Leu Ser Val
130 135 140
Ile Asp Trp Glu Asn Trp Arg Pro Thr Trp Glu Arg Asn Trp Lys Glu
145 150 155 160
Lys Ala Ile Tyr Arg Arg Gln Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Lys Asn
165 170 175
Ile Lys Leu Thr Pro Ala Ala Ala Thr Lys Leu Ala Lys Arg Glu Phe
180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Thr Phe Met Gln Glu Thr Leu Lys Leu Gly Lys
195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
210 215 220
Tyr Asn His Asn Tyr His Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Leu Asp
225 230 235 240
Ile Glu Lys Arg Arg Asn Asp Ala Leu Asp Trp Leu Trp Lys Glu Ser
245 250 255
Thr Ala Leu Phe Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Arg Leu Lys Pro Ser
260 265 270
Gln Val Ala Leu Phe Val Arg Asn Arg Val Gln Glu Ala Ile Arg Val
275 280 285
Ser Lys Val Ala Asn Ala Gln Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr
290 295 300
Arg Pro Val Phe Ser Gly Ala Ser Ser Arg Tyr Leu Ser Gln Asp Asp
305 310 315 320
Leu Val Asn Thr Ile Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
325 330 335
Val Met Trp Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr Met Gln Ser Cys Met
340 345 350
Asn Leu Gly Ser Tyr Leu Lys Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Leu Ile Asn
355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
370 375 380
Gly Val Cys Thr Arg Lys His Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385 390 395 400
Asn Pro Ala Asn Phe Ala Ile Arg Thr Gly Lys Gly Asn Lys Tyr Ile
405 410 415
Val His Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Lys Glu Phe Ser Lys Asn
420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Phe Ala Asn Phe His Cys Lys Glu Arg Ala Asp
435 440 445
Ile Glu Asn Ile His Ala Ile Asn Val Cys Ile Thr Glu Asp Val Cys
450 455 460
Val Glu Ala Phe Leu Asn Ser Glu Pro Glu Leu Pro Asp Glu Val Gln
465 470 475 480
Gln Asp Asn Gln Pro Pro Cys Gly Gly Ser Gly Arg Cys
485 490
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
aactcgagcc accatgggag tacagaggct cca 33
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ttgtcgactc agcagcggcc cgaacc 26
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> ZP Binding Domain of Porcine PH-20
<400> 4
Gln Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Val Ala Asn Ala Gln Ser Pro Leu
1 5 10 15
Pro Val Phe Val Tyr Thr Arg Pro Val Phe Ser Gly Ala Ser Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ser Gln Asp Asp Leu Val Asn Thr Ile Gly Glu Thr Val Ala
35 40 45
Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Met Trp Gly Ser Leu Asn Leu Ser Leu
50 55 60
Thr Met Gln Ser Cys Met Asn Leu Gly Ser Tyr Leu Lys Thr Thr Leu
65 70 75 80
Asn Pro Tyr Leu Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln
85 90 95
Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Thr Arg Lys His Trp Asn Ser
100 105 110
Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro
115 120
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
aaggatccag gaggccattc gtgt 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
ttctcgaggt tcagatgaag atagtc 26
Claims (11)
- 다음 단계를 포함하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법:(a) 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 제조하는 단계;(b) 상기 재조합 단백질을 정제한 후, 동물에 주사하여 면역반응을 유도하는 단계; 및(c) 상기 면역반응이 유도된 동물의 혈청으로부터 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 분리하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 돼지 히알루로니다제 PH-20의 투명대 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 돼지 히알루로니다제 PH-20을 코딩하는 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 염기 서열로 표시되는 유전자를 프라이머로 하여 PCR 증폭된 산물을 클로닝한 후, 이를 미생물 또는 세포에 도입시켜 제조한 것임을 특징으로 하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 상기 돼지 히알루로니다제 PH-20은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법.
- 제3항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 세포는 인간 배아 신장(Human Embryonic Kidney, HEK) 293 세포인 것을 특징으로 하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, (d) 상기 (c) 단계에서 분리한 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 코딩하는 유전자를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하는 단계;(e) 상기 증폭된 PCR 산물을 글루타치온 에스 트랜스퍼라제(GST)가 내재된 벡터에 클로닝하고, 상기 클로닝된 벡터를 미생물에 도입하여, 재조합 미생물을 제작하는 단계; 및(f) 상기 재조합 미생물로부터 글루타치온 에스 트랜스퍼라제(GST)가 융합된 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체의 제조방법.
- 제1항 내지 제8항에서 선택되는 어느 한항의 방법에 의해 제조된 돼지의 히 알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체.
- 제9항의 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지의 체외수정시 발생되는 다정자 침입(polyspermy)을 방지하는 방법.
- 제9항의 돼지의 히알루로니다제 PH-20을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 돼지의 정원세포(spematogonia stem cell)를 선별하는 방법.
Priority Applications (1)
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| KR1020080116981A KR101055333B1 (ko) | 2008-11-24 | 2008-11-24 | 돼지의 히알루로니다제 ｐｈ-20을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992010569A1 (en) * | 1990-12-14 | 1992-06-25 | University Of Connecticut | Sperm cell surface protein ph-20. use in a contraceptive vaccine |
-
2008
- 2008-11-24 KR KR1020080116981A patent/KR101055333B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992010569A1 (en) * | 1990-12-14 | 1992-06-25 | University Of Connecticut | Sperm cell surface protein ph-20. use in a contraceptive vaccine |
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Also Published As
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|---|---|
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