KR100802140B1 - 돼지 유래 신규 ａｄａｍ３ 유전자 및 이를 이용한 돼지정자의 수정능 판별방법 - Google Patents

돼지 유래 신규 ａｄａｍ３ 유전자 및 이를 이용한 돼지정자의 수정능 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생식세포에서 특이적으로 발현하는 돼지 유래 신규 ADAM3(a disintegrin and metalloprotease 3) 유전자 및 이를 이용한 돼지 정자의 수정능 판별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 돼지 정소에서 특이적으로 발현되는 ADAM3를 코딩하는 신규 유전자 및 상기 ADAM3에 대한 항체를 이용하여 ADAM3 유전자의 발현 여부를 확인함으로써 돼지 정자의 수정능을 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 돼지 유래 ADAM3 유전자는 돼지 정자에서만 발현되는 마커로서 정자의 수정능력 여부를 간단하게 검사하는데 유용하다.
ADAM3, 정자, 수정능, 항원, 항체, 재조합 단백질

Description

돼지 유래 신규 ＡＤＡＭ３ 유전자 및 이를 이용한 돼지 정자의 수정능 판별방법{Novel Gene Encoding ADAM3 Isolated from Porcine and Method for Discriminating Fertility of Porcine Sperm Using Thereof}
도 1은 돼지의 ADAM3a 및 ADAM3b의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 2는 돼지 ADAM3a와 다른 포유동물의 ADAM3a의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 3은 돼지의 ADAM3b와 다른 포유동물의 ADAM3b의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 4는 돼지 각 조직에서의 ADAM3a 또는 ADAM3b의 발현양을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 ADAM3a 또는 ADAM3b 유전자가 도입된 형질전환체에서 ADAM3의 발현 여부를 확인한 것으로, A는 돼지 ADAM3a 및 ADAM3b 유전자의 공통영역을 벡터에 클로닝하여 E. coli에서 도입시킨 경우 ADAM3의 발현 여부를 확인한 것이고, B는 ADAM3가 발현된 형질전환체를 정제하여 ADAM3의 검출 여부를 확인한 것이다.
도 6은 돼지 ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 정제한 결과를 나타낸 것으로, A는 돼지 ADAM3a 및 ADAM3b에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 벡터에 클로닝하 여 E. coli에서 도입시켜 GST 융합 단백질을 발현시킨 세포를 확인한 것이고, B는 GST 융합 단백질을 발현시킨 세포를 정제하여 돼지 ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 정제한 것이다 (s1~s6: 수용성 단편, p1~p6: 비수용성 단편).
도 7은 돼지 정자에서 돼지 ADAM3a 및 ADAM3b의 발현 여부를 확인한 것이다.
발명의 분야
본 발명은 생식세포에서 특이적으로 발현하는 돼지 유래 신규 ADAM3(a disintegrin and metalloprotease 3) 유전자 및 이를 이용한 돼지 정자의 수정능 판별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 돼지 정소에서 특이적으로 발현되는 ADAM3를 코딩하는 신규 유전자 및 상기 ADAM3에 대한 항체를 이용하여 ADAM3 유전자의 발현 여부를 확인함으로써 돼지 정자의 수정능을 판별하는 방법에 관한 것이다.
배경기술
ADAM3(a disintegrin and metalloprotease3)은 생식세포에서만 발현되는 막단백질로서, 메탈로프로테아제 도메인(metalloprotease domain), 디스인테그린 도메인(disintegrin domain), 시스테인-리치 도메인(cystein-rich domain), 상피세포 성장인자-유사 도메인(EGF-like domain) 및 세포질 도메인(cytoplasmic domain)으로 구성되어 있으며, 분자량은 약 100kDa으로 알려져 있다. 특히, 정소 생식세포에서는 100kDa 분자로서 존재하나, 정소상체에서 성숙된 정자는 약 45kDa의 막단백질로 존재한다고 알려져 있다.
ADAM3은 마우스에서 인간에 이르기까지 모든 포유동물에 존재할 것으로 추측되며, 인간에서의 ADAM3은 ADAM3a와 ADAM3b의 서브타입으로 존재하지만, 단백질로 발현되지는 않는 것으로 밝혀졌으며, 인간에서도 마우스와 같은 메카니즘에 의하여 정자 세포막으로 이동하는지에 대해서는 아직 알려져 있지 않다.
1999년과 2001년에 독일의 엥겔 그룹과 미국의 니시무라 그룹에 의해서 ADAM3 결손 마우스가 제작되어 ADAM3의 기능이 밝혀지게 되었다. 그 결과, ADAM3 결손 정자는 난자와의 결합능력이 없었다. 더욱이, ADAM2 또는 ADAM1을 결손시킨 마우스에 대한 기능을 해석한 결과, 상기 결손마우스 유래 정자는 난자와의 결합 능력이 없어 불임이 되었고, 상기 결손마우스에는 공통적으로 ADAM3가 존재하지 않았다 (Cho, C. et . al ., Science, 281:1587, 1998; Nishimura H. et . al ., Dev . Biol., 223:204, 2001).
이는 정자 세포막에 존재하는 ADAM3가 난자와의 결합에 필수적인 역할을 하고 있다는 것을 의미한다. 그러나, 돼지에서는 아직 ADAM3의 존재가 밝혀져 있지 않다.
비교적 연구가 많이 진행된 마우스 정자에서 특이적으로 발현하는 마커 단백질은 Izumo, ADAM2, PH20 등으로, 이들에 대한 항체가 제조되어 분자세포생물학적 방법으로 마우스 정자의 특성을 연구하는데 사용되고 있다. 그러나, 돼지 정자에 있어서는 그 특성을 판별하기 위한 특별한 마커 단백질 및 그에 대한 항체가 확인되지 않아, 돼지 정자의 특성을 파악하는데 어려움이 있었다. 또한, 인위적인 조작 또는 자연발생적인 정자세포막 파열의 경우나 정자 첨체 반응이 일어났을 경우, 정자 세포막에 존재했던 ADAM3는 없어지게 된다.
그러므로, 정자 세포막에 존재하는 ADAM3의 선천적인 존재 여부가 난자와의 정상적인 결합능력을 판단할 수 있는 중요한 요인으로 사용될 수 있다. 특히, 연구용 미니돼지와 같이 산란수가 비교적 적은 경우에는 체외수정을 통한 종자생산을 하는데, 이러한 종자생산을 위해서는 효율적인 돼지 정자의 특성(형태 및 상태)을 확인할 필요가 있다.
이에, 본 발명자들은 돼지 정자의 수정능 여부를 판별하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 돼지의 정소세포에서만 발현되는 ADAM3와 이에 대한 항체를 이용하여 ADAM3의 발현 여부를 확인함으로써 정자 수정능력을 판별할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명은 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 돼지 유래 ADAM3a 및 ADAM3b와 여기에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 ADAM3a 및 ADAM3b를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제 공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지 정소에서 상기 유전자의 발현 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 수정능 판별방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 유래 ADAM3a(a disintegrin and metalloprotease 3a)를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 유래 ADAM3b(a disintegrin and metalloprotease 3b)를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 ADAM3a 및 ADAM3b와 여기에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 ADAM3a 또는 ADAM3b를 발현시킨 다음, 정제하는 단계; (b) 상기 정제된 ADAM3a 또는 ADAM3b를 동물(단, 인간은 제외)에 주사하여 면역반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 면역반응이 유도된 동물의 혈청으로부터 ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 분리하는 단계를 포함하는 돼지 유래 ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항체의 제조방법은 (d) 상기 분리된 ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 제조하는 단계; (e) 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제작하는 단계; 및 (f) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여, ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 돼지 정소에서 상기 유전자의 발현 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 수정능 판별방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현 여부 확인은 상기 항체를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 돼지 유래 ADAM3a와 여기에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 제조방법, ADAM3a를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 돼지 유래 ADAM3b와 여기에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 제조방법, ADAM3b를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서는 돼지의 각 조직으로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후, ADAM3 cDNA를 분리하였다. 3' RACE(Rapid Amplification of cDNA, TAKARA)를 수행하여 얻어진 산물을 벡터에 클로닝하여 ADAM3 유전자의 서열을 확인하였다. 3' RACE란 mRNA의 3말단을 함유한 영역을 특이적으로 증폭하기 위한 방법으로, Oligo dT-3site Adapter 프라이머의 뒷부분에 BamHI, KpnI, XbaI의 제한효소가 있어서, 상기 프라이머를 이용하여 cDNA를 제작한 다음, 센스 프라이머(adam6, adam11, adam21)를 제작하여 3site Adapter 프라이머와 PCR를 행함으로써 샘플을 얻을 수 있는 방법이다.
상기 클로닝된 돼지 ADAM3 유전자를 바탕으로 ADAM3a 및 ADAM3b 유전자에 특이적인 프라이머를 제작한 후, PCR을 수행하여 ADAM3a 및 ADAM3b 유전자를 클로닝하였다. 그 결과, 돼지 ADAM3에는 ADAM3a 및 ADAM3b의 서브타입이 존재하고, 상기 ADAM3a 및 ADAM3b 유전자는 돼지에서 유래된 신규 유전자이며, 각각은 서로 79%의 상동성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 또한, ADAM3a 및 ADAM3b 유전자는 돼지 생식세포에서 다량으로 존재한다는 것이 밝혀졌으며, 돼지 ADAM3a는 여성생식세포인 난소에서도 소량으로 발현되었다.
본 발명에서는 돼지 ADAM3에 대한 항체를 제조하기 위하여, 상기 ADAM3a 또는 ADAM3b 유전자를 His tag이 내재되어 있는 벡터에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입한 다음, 상기 형질전환체를 배양하여 ADAM3a 또는 ADAM3b를 발현시키고, His tag을 이용하여 ADAM3가 발현된 형질전환체를 정제하였다.
상기에서 정제된 ADAM3를 토끼에 주사하여 항체를 생산한 후, ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 PCR법에 의해 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 GST가 내재되어 있는 벡터에 클로닝한 다음, E. coli BL21(DE3)에 도입하였다. 상기 형질전환체를 배양하여 GST 융합 재조합 단백질이 발현된 샘플을 정제하여 ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 수득하였다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et . al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et . al ., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 발명에서는 ADAM3a 또는 ADAM3b를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환시킬 미생물로 E. coli를 사용하였으나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 미생물을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 돼지 ADAM3a 또는 ADAM3b에 결합하는 항체를 이용한 돼지 정자의 수정능 판별방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 돼지 정소 조직의 ADAM3a 유전자 또는 ADAM3b 유전자의 발현 여부를 확인하여 돼지 정자의 수정능을 확인할 수 있으며, 일례로 돼지 정소 조직을 적출하고 단백질을 추출하여 전기영동한 후, 상기에서 제조된 돼지 유래 ADAM3a 또는 ADAM3b에 대한 항체를 이용하여 ADAM3a 또는 ADAM3b의 발현 여부를 확인함으로써 돼지의 수정능을 판별할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 돼지 ADAM3 유전자의 클로닝
돼지 ADAM3 cDNA를 제조하기 위하여, 미니 돼지(PWG사)의 뇌, 간, 폐, 심장, 신장, 이자, 자궁, 수란관 및 정소 조직을 적출하여 각 조직의 10배 부피로 이소젠(isogen, Nippongene)을 넣고, 초음파 파쇄기를 이용하여 조직을 분쇄한 후, 이소프로파놀(isopropanol)을 이용하여 분리된 상층액으로부터 전체 RNA를 추출하였다.
상기에서 수득된 전체 RNA 5㎍/㎕ 농도를 취해서 Superscript III RT kit(Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 cDNA를 제작하였다. 즉, 50℃에서 1시간 동 안 역전사효소에 의해 제1 가닥 cDNA를 합성한 후, 80℃에서 5분 동안 반응시킨 다음, RNaseH 효소를 처리하여 37℃에서 20분 동안 배양하여 최종적으로 cDNA를 수득하였다.
3' RACE(Rapid Amplification of cDNA, TAKARA)를 수행하여 얻어진 산물을 1.2% 아가로오스겔 전기영동으로 확인한 후, 0.8kb 부근의 밴드들을 잘라서 DNA만을 순수분리하여, pGEM T-벡터(Promega)에 클로닝한 다음, 염기서열을 결정하였다.
그 결과, 돼지 ADAM3 유전자는 ADAM3a 유전자(서열번호 3) 및 ADAM3b 유전자(서열번호 4)의 서브타입이 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.
상기에서 클로닝한 돼지 ADAM3 유전자를 바탕으로 ADAM3a 및 ADAM3b 유전자에 특이적인 프라이머를 제작하여, AdvatageTM cDNA PCR Kit & Polymerase Mix(Clontech)를 이용하고, ADAM3(서열번호 5), ADAM4(서열번호 6), ADAM5(서열번호 7), ADAM7(서열번호 8), ADAM9(서열번호 9), ADAM10(서열번호 10), ADAM14(서열번호 11), ADAM15(서열번호 12), ADAM16(서열번호 13), ADAM17(서열번호 14), ADAM23(서열번호 15) 및 ADAM24(서열번호 16)를 프라이머로 사용하여 PCR를 수행하였다.
서열번호 5 : 5'-ATG CTG TCT CTC CTG CT
서열번호 6 : 5'-ATG CTG TCT CTC CTG CTG AT
서열번호 7 : 5'-ATC TCC ACA GTC ACA TTG
서열번호 8 : 5'-AAG GAT CCG AGA TGC AGA GAG ATG TAG TC
서열번호 9 : 5'-AAG GAT CCA TGC TGC CTT TCC TGC TGC T
서열번호 10 : 5'-AAC TCG AGC AAT GTG ACT GTG G
서열번호 11 : 5'-AAC TCG AGA TGC TGC CTT TCC TGC TGC
서열번호 12 : 5'-AAG GGC CCT TAG TCT TTA AAT GTA AGA TTG T
서열번호 13 : 5'-AAG GGC CCT CAG TCA CTT TTA CTG CAA GA
서열번호 14 : 5'-GAA CCA TTG GAA TCT TCA GCT
서열번호 15 : 5'-AAG GAT CCT TCT TAT TTA TGT GCA C
서열번호 16 : 5'-TTC TCG AGT CTA TTT CGG TAG TCC TG
상기 PCR 산물을 0.8% 아가로오스 겔에 전기영동한 후, 밴드를 잘라내어 pBS 벡터(Stratagene)에 클로닝하였다.
그 결과, 돼지 ADAM3a 및 ADAM3b 유전자는 79%의 상동성을 가지고 있었다 (도 1). 또한, 마우스, 렛트 및 개의 ADAM3 유전자와의 상동성을 검색한 결과, 마우스 ADAM3와 돼지 ADAM3a는 약 53%, 렛트 ADAM3와 돼지 ADAM3a는 54%, 개 ADAM3a와 돼지 ADAM3a는 약 60%의 상동성을 나타나었고, 마우스 ADAM3와 돼지 ADAM3b는 약 57%, 렛트 ADAM3와 돼지 ADAM3b는 약 56%, 개 ADAM3b와 돼지 ADAM3b는 약 68%의 상동성을 나타내었다 (도 2 및 도 3).
실시예 2. 돼지 ADAM3a 및 ADAM3b 의 발현
상기에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. adam3a를 특이하게 증폭하기 위하여 adam18(서열번호 17) 및 adam20(서열번호 18)을 사용하였고, adam3b를 특이하게 증폭하기 위하여 adam18 및 adam19(서열번호 19)를 프라 이머로 사용하였다. antisense primer는 각각의 유전자에 특이한 부분으로 제작되었다.
서열번호 17 : 5'-TTC TCT GGA GCT CTG GTC AG
서열번호 18 : 5'-TAT GAA TGC AGT TCT CCA CGG
서열번호 19 : 5'-TAT GAC TAC ATC TCT CTG CAT
PCR은 94℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초를 35회 반복하였다. 내부 표준으로는 COXIII(cytochrome oxidase III)라는 미토콘드리아 유전자를 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 20: 5'-ATG ACC CAC CAA ACA CAT GC
서열번호 21: 5'-TTA CCG AAA CTG ATT GAT TGG A
반응이 종료된 혼합액을 1.0% TAE 아가로스 겔에 전기영동한 후, 에티디엄 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 유전자의 발현 패턴을 조사하였다.
그 결과, 돼지 ADAM3a는 돼지의 정소에서 발현되었고, 난소에서도 소량 발현되었다. 또한, 돼지 ADAM3b는 돼지의 정소에서만 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
실시예 3. 돼지 ADAM3a 및 ADAM3b 의 항체 제작
ADAM3의 항체를 생산하기 위하여, ADAM3a 및 ADAM3b 유전자의 공통영역인 392~504 아미노산 영역을 ADAM6(서열번호 22) 및 ADAM8(서열번호 23)을 프라이머로 사용하여 PCR 법에 의해 증폭하였다.
서열번호 22: 5'-AAG GAT CCA AGG ACA AGT TGC ATC TTG
서열번호 23: 5'-TTC TCG AGC TTA TCT GGA TCT CGG CAC
상기 증폭된 PCR 산물을 His tag이 내재되어 있는 pET23d 벡터(Novagen, Co., USA)에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입하였다. 상기 형질전환체를 배양한 후, ADAM3의 발현 여부를 웨스턴 블럿으로 확인하였다 (도 5의 A). 도 5의 A의 1~10번은 각 형질전환체 샘플을 나타낸 것이다. 그 결과, 3~6번 형질전환체에서 ADAM3가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 3번 형질전환체에서 발현된 ADAM3를 니켈 레진으로 충진된 His-친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, ADAM3가 가장 많이 검출된 2번 및 3번 튜브를 PBS로 투석하였다 (도 5의 B). 도 5의 B의 1~10번은 정제과정시 사용된 각 fraction을 나타낸 것이다. 상기 정제된 ADAM3를 10일 간격으로 500㎍씩 5번 토끼에 주사하였다.
상기 토끼에서 생산된 ADAM3a 및 ADAM3b에 대한 항체를 정제하기 위하여, ADAM3a 및 ADAM3b에 대한 항체를 코딩하는 유전자의 421~504 아미노산 영역을 adam12(서열번호 24) 및 adam13(서열번호 25)를 프라이머로 사용하여 PCR 법에 의해 증폭하였다.
서열번호 24: 5'-AAG AAT TCT GCT GTA ATC CTA AAA CTT G
서열번호 25: 5'-TTC TCG AGA GTT CCT CTT TCA GCT ATC
상기 증폭된 PCR 산물을 GST가 내재되어 있는 pGEX4T1(Amersham pharmacia) 벡터에 클로닝한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입하였다. 상기 형질전환체를 배양한 후, GST 융합 재조합 단백질을 발현하는 세포를 웨스턴 블럿으로 확인하였다 (도 6의 A). 상기에서 확인된 GST 융합 재조합 단백질을 GST-친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 다음, ADAM3가 가장 많이 검출된 2번 및 3번 튜브를 PBS로 투석하여 ADAM3a 및 ADAM3b에 대한 항체를 수득하였다 (도 6의 B). 도 6의 B의 1~10번은 정제과정시 사용된 각 fraction을 나타낸 것이다.
실시예 4. 돼지 정소에서 ADAM3a 및 ADAM3b의 발현 확인
돼지의 정소 조직을 적출하여, protease inhibitor cocktail(Sigma)이 첨가된 추출용액(1% TX-100)에서 가용화시킨 후, 원심분리하여 상층액을 수득한 다음, 상기 상층액을 단백질 어세이에 의하여 정량하였다. 상기에서 정량된 돼지 정소 조직 1㎍, 2㎍ 및 4㎍에 SDS 샘플 버퍼를 넣고 3분간 열 변성하여, 10%의 SDS-PAGE 겔에 전기영동한 다음, 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF)막으로 옮기고, 2% 탈지 분유로 블로킹하였다. 이후, 상기에서 제조된 ADAM3a 및 ADAM3b 항체를 넣어 반응시킨 후, HRP(Horse-Radish peroxidase)가 연결된 2차 항체(Jackson immunoResearch)를 처리하여 발생하는 신호를 X-ray 필름에 현상하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 돼지 정소 조직의 농도에 비례하여 ADAM3a 및 ADAM3b의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 ADAM3a 및 ADAM3b가 돼지 정소세포 및 정자의 특이 마커로 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 생식세포에서 특이적으로 발현하는 돼지 유래 신규 ADAM3 유전자 및 이를 이용한 돼지 정자의 수정능 판별방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 과학적으로 부가가치가 높은 돼지를 효율적으로 번식시키기 위하여 인공수정을 하기 전에 미리 돼지 유래 ADAM3에 대한 항체를 이용하여 돼지 정자의 수정능력을 보다 간편하게 판별할 수 있으므로, 농축산업의 생산성을 향상시킬 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 유래 ADAM3a(a disintegrin and metalloprotease 3a)를 코딩하는 유전자.
  2. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 유래 ADAM3a.
  3. 제1항의 유전자를 함유하는 재조합벡터.
  4. 제3항의 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  5. 제2항의 ADAM3a에 특이적으로 결합하는 항체.
  6. 다음 단계를 포함하는 돼지 유래 ADAM3a에 대한 항체의 제조방법:
    (a) 제4항의 재조합 미생물을 배양하여 ADAM3a를 발현시킨 다음, 정제하는 단계;
    (b) 상기 정제된 ADAM3a를 동물(단, 인간은 제외)에 주사하여 면역반응을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 면역반응이 유도된 동물의 혈청으로부터 ADAM3a에 대한 항체를 분리하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는 ADAM3a에 대한 항체의 제조방법:
    (d) 상기 분리된 ADAM3a에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 제조하는 단계;
    (e) 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제작하는 단계; 및
    (f) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여, ADAM3a에 대한 항체를 수득하는 단계.
  8. 돼지 정소에서 제1항의 유전자의 발현 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 수정능 판별방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유전자의 발현 여부 확인은 제5항의 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 유래 ADAM3b(a disintegrin and metalloprotease 3b)를 코딩하는 유전자.
  11. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 유래 ADAM3b.
  12. 제10항의 유전자를 함유하는 재조합벡터.
  13. 제12항의 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  14. 제11항의 ADAM3b에 특이적으로 결합하는 항체.
  15. 다음 단계를 포함하는 돼지 유래 ADAM3b에 대한 항체의 제조방법:
    (a) 제13항의 재조합 미생물을 배양하여 ADAM3b를 발현시킨 다음, 정제하는 단계;
    (b) 상기 정제된 ADAM3b를 동물(단, 인간은 제외)에 주사하여 면역반응을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 면역반응이 유도된 동물의 혈청으로부터 ADAM3b에 대한 항체를 분리하는 단계.
  16. 제15항에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는 ADAM3b에 대한 항체의 제조방법:
    (d) 상기 분리된 ADAM3b에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 제조하는 단계;
    (e) 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제작하는 단계; 및
    (f) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여, ADAM3a에 대한 항체를 수득하는 단계.
  17. 돼지 정소에서 제10항의 유전자의 발현 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 수정능 판별방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 유전자의 발현 여부 확인은 제14항의 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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