JPH04505710A - ポリペプチドの改良された発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドの　された 及朋ヱＩし１土亙 本発明は、組換え宿主における所望のポリペプチドの製造のレベルを改良するた めの方法および中間生成物に関する。さらに詳細には、本発明は、「発現の島」 、すなわち、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメント 、および宿主へトランスフェクトするための発現の島の側層に関する。この発現 の島を含む宿主は、驚くほどに所望の異種ポリペプチドを高レベルに製造する。

発現の島の宿主への取り込みは、宿主ゲノム中の組み込み位置には実質的に依存 せずに発現させ、そして実質的には、その宿主ゲノムへ取り込まれる発現の島の コピー数に依存して、所望の異種ポリペプチドを発現させ得る。

１１茨！ ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換あるいはトランスフェクトされ た宿主によって、ポリペプチドが発現され、そして分泌されることは公知でる。

例えば、Ｇ１１ｂｅｒｔら、米国特許第４．５６５．７８５号（１９８６）、お よびり、　Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら、−Ａ　Ｂａｃｔｅｒｔａｌ　Ｃ１ ｏｎｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ　Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７５．　ｐｐ、３７２７−３１　 （１９７８）に、選択されたポリペプチドが細菌宿主で合成され、そして宿主の 細胞膜を通って排出される得ることが示されている。類似の方法が動物細胞で行 われ得る。Ｊ、　Ｄｏｅｈｍｅｒら、−Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｒａ ｔ　Ｇｒｏｖｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｇｅｎｅ　Ｉｎｔｏ　Ｍｏｕｓｅ　Ｆｉｂ ｒｏｂｆａｓｔｓ　Ｖ（ａ　Ａ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ＤＮＡ　Ｖｅｃｔｏｒ ：　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ″、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ｔｌｓＡ、　７９．　ｐｐ、２２６８−７２　 （１９８２）。組換えタンパク質は、発現系を授精胚の前核へのトランスジェニ ックな取り込みで、哺乳類でおいてでさえ発現された。Ｄ、　Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ら、−Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈｕ＋＊ａｎ　Ｉ ｎ５ｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｉｎ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｍｉｃｅ”、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、ＵＳＡ、　８３．　ｐｐ、　２５１１ −１５　（Ｌ９８６）、に、Ｇｏｒｄｏｎら、−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　 Ｈｕｍａｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐｌａｓｒｓｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｙａｔｏｒ　 Ｉｎ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｍｏｕｓｅ　Ｍｉｌｋ”、　肛ｕ−■匹包肛、　 ５　（１１）、　ｐｐ、　１１８３−８７　（１９８７）。

しかしながら、異種ポリペプチドのコーディング配列をゲノムに組み込んだ宿主 によって、所望の異種ポリペプチドが大量に発現され得ることが確実に成功する 技術は今日までなかった。天然環境下にまさに同一の発現制御配列により生じる 天然のタンパク質の生産が高レベルであることを考えると、このことは特に驚き である。例えば、ミルク特異的発現制御配列は、天然のタンパク質、例えばカゼ インを大量に生産し、そして乳腺から分泌し得る。しかしながら、このまさに同 一のミルク特異的発現制御配列が、異種ポリペプチドのコーディング配列に作動 可能に結合されたときに、異種ポリペプチドが大量に誘導されることは実証され なかうた。例えば、Ｃ１１Ｆ、Ｐｆｔｔｉｕｓら、−Ａ　Ｍｉｌｋ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　Ｄｉｒｅｃｔｓ　ＴｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖ ａｔｏｒ　ｃＤＮＡＴｏ　Ｔｈｅ　Ｍａｍ＋５ａｒｙ　Ｇｌａｎｄ　Ｉｎ　Ｔｒ ａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｍｉｃｅ−、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．　ｐｐ、５１１７４−７８　（１９８８ ）を参照。後者の構築物による発現レベルもまた、宿主ゲノムに組み込まれる異 種ポリペプチドのコーディング配列のコピー数には依存しない。

さらに、この発現のレベルは、位置の効果を条件とする、すなわち異種ポリペプ チドのコーディング配列が、ゲノムに組み込まれるのがどこであるかに依存する 。Ｋ、Ｆ、　Ｌｅｅら、”Ｔｉ５ｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｒａｔ　Ｂｅｔａ−Ｃａｓｅｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｉｎＴｒａ ｎｓｇｅｎｉｃ　Ｍｉｃｅ−、Ｎｕｃｌｅｆｃ　Ａｃｆｄｓ　Ｒｅｓ、、　１６ （３）、　ｐｐ、１０２７−４１　（１９８ｇ）。

従って、宿主ゲノムでの組み込み位置に依存しない、異種タンパク質あるはポリ ペプチドをコードするＩ）ＮＡ配列の発現を増す方法の必要性が存在する。さら に、このような方法は、宿主ゲノムに組み込まれるコピー数に依存する発現を提 供し、その結果発現レベルを制御し得る。

主五二！玉 本発明は、所望の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列’ｅ含む「発現の島 」を提供することにより、これらの問題を解決する。本発明の発現の島は、まず 、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の、位置に依存しない、そしてコピ ー数に依存する、高レベルな発現を提供する。

図１に示されているように、本発明の発現の島は、５′から３′方向に、５′フ ランキング領域、異種ポリペプチドのコーディング配列（所望の異種タンパク質 あるいはポリペプチドをコードする）、および３′フランキング領域を含んでい る。５′フランキング領域は、５″から３”方同に、５′発現制御配列、および ５′非翻訳領域を含んでいる。この発現制御配列は、異種ポリペプチドのコーデ ィング配列ニ作動可能に結合されている。５′非翻訳領域は、異種ポリペプチド のコーディング配列の転写開始部位に始まり、そして翻訳開始部位に終わる。３ ′　フランキング領域は、５′から３′方向に、３′非翻訳領域および３′発現 制御配列を含んでいて、これらの制御配列は異種ポリペプチドのコーディング配 列に作動可能に結合している。最後に、本発明の発現の島の５′および３′フラ ンキング領域は、宿主ゲノムに組み込まれる発現の島のコピー数に実質的に依存 し、そしてその組み込まれる位置に実質的に依存しない、所望のタンパク質ある いはポリペプチドの生産レベルを担うのに効果的である、十分な大きさおよび構 造に特徴づけられる。

本発明は、さらに宿主をトランスフェクトするための発現の島の使用、およびそ れらのトランスフェクトされた宿主に関する。ゲノムにこの発現の島を組み込ま れた宿主は、発現の島内のＤＮＡ配列によってコードされる異種ポリペプチドを 高レベルで生産する。さらに、本発明の発現方法は、宿主ゲノムに組み込まれる 発現の島のコピー数に実質的に依存し、そして組み込まれる位置には依存しなく て、有利に発現のレベルを操作し得る。

本発明の好ましい実施態様において、さらに、発現の島はシグナルペプチドをコ ードするＤＮＡ配列を含む。このシグナル配列のコーディング領域は、リーディ ングフレームが合うよウニ、！！ポリペプチドのコーディング配列の５′末端に 結合される。このシグナル配列のコーディング領域は、さらに、好ましい発現の 島をゲノム内に有する宿主が、組み合わされたシグナル−異種ポリペプチドのコ ーディング配列によってコ°　−ドされるプレタンパク質あるいはプレポリペプ チドから所望のタンパク質あるいはポリペプチドを、生産し、分泌し、そして好 ましくプロセスするように、発現制御配列に作動可能に結合される。

区画二！星二凰皿 図１は、本発明に従った典型的な「発現の島」　（Ａ）および好ましい「発現の 島」　（Ｂ）の概略図である。

図２は、ウシαＳ−ｔカゼインの５′および３′フランキング領域を含むプラス ミド（ＣＡＳ１２Ｂｇ）の構築を示す。

図３は、ＣＡＳ１２９５発現の島を得るための、ウロキナーゼ構造遺伝子のＣＡ Ｓ１２８８への導入を示す。

１豆旦１鼠工晟皿 本明細書に記載の発明がさらに十分に理解されるために、以下に詳細に説明する 。

説明には下記の用語が用いられる。

発現制御配列とは、構造遺伝子（ポリペプチドをコードするＤＮＡ）に作動可能 に結合されたときに転写および翻訳レベルの両者で、遺伝子産物の発現を制御お よび調節するＤＮＡ配列である。これらには、プロモーターおよびエンハンサ− 領域、リポソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、および遺伝子の発現に有 用な他の配列が含まれる。

作動可能に結合されたとは、５′および３′発現制御配列を異種ポリペプチドの コーディング配列に結合し、その発現制御配列が異種ポリペプチドの発現および 生産を制御および調節し得ることである。

異種ポリペプチドのコーディング配列とに、宿主ゲノムに挿入される、所望のポ リペプチドあるいはタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列 は、宿主またはフランキング配列のいずれかと、あるいは両者とは異種であるポ リペプチドをコードする。異種ポリペプチドのコーディング配列は、必要に応じ て５′末端に自身の翻訳開始シグナルを、そして３′末端に自身の翻訳終止コド ンを有する。この異種ポリペプチドのコーディング配列は、さらに自身のシグナ ル配列コーディング領域を有し得る。

シグナル配列コーディング領域とは、シグナルペプチドと呼ばれる典型的な疎水 性アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列である。シグナルペプチドは、それが 付いているポリペプチドを、生体膜を通過させる。

発現の島とは、５′から３°方向に、５°　フランキング領域、異種ポリペプチ ドのコーディング配列、および３′　フランキング領域を含むＤＮＡ構築物であ る。５′および３′　フランキング領域は、宿主ゲノムに取り込まれる発現の島 の構築物のコピー数に実質的に依存し、宿主ゲノムでの発現の島の位置には実質 的に依存しない、所望のタンパク質あるいはポリペプチドの生産レベルを担うの に十分な大きさおよび構造である。

５′　フランキング領域とは、異種ポリペプチドのコーディング配列の５′側に ある発現の島の部分である。これには、５°から３′方同に、５°発現制御配列 および５′非翻訳領域を含んでいて、この発現制御配列は、異種ポリペプチドの コーディング配列に、作動可能に結合されている。５°非翻訳領域は、典型的に は異種ポリペプチドのコーディング配列の転写開始部位から翻訳開始部位に至る 。

３″　フランキング領域とは、異種ポリペプチドのコーディング配列の３″側に ある発現の島の部分である。これには、５′から３′方同に、３′非翻訳領域お よび３′発現制御配列が含まれる。３′フランキング領域は、さらに、３′　フ ランキング領域がもともと連結されている構造遺伝子由来のコーディング配列の 全て、あるいは一部を含み得る。

ｌ五２１亙１塁皿 理論に捕られれることを望んではいないが、我々は、この発現の島の５′および ３′フランキング領域にまだ不明瞭な要素が含まれているが、発現制御配列で作 動し、異種ポリペプチドのコーディング配列を高収量で発現し得ることを信じて いる。発現は、また宿主のゲノムに取り込まれる発現の島のコピー数に依存し、 従って、ポリペプチドの生産レベルを操作し得る。

本発明の発現の島の大きい５′および３°　フランキング領域は、さらに緩衝域 を提し得る。そして発現制御配列を、発現の島が組み込まれた周囲のＤＭＡによ って及ぼし得る宿主の発現制御から離されるようになる。従って、宿主のゲノム のどこにこの発現の島が組み込まれるかによらず、異種ポリペプチドのコーディ ング配列は高レベルで発現される。これは、「発現の島」として、自身のゲノム の環境を有する。

理論に捕られれることを望んではいないが、我々は、発現制御配列の発現を促進 し得るＤＮＡ配列の大部分を、与えられた構造遺伝子の５′および３′フランキ ング配列に見いだされることを信じている。従って、５′および３′フランキン グ領域を含む構造遺伝子の単離の後、本発明の１つの実施態様においてその構造 遺伝子は、その全部あるいは一部が、任意の異種ポリペプチドのコーディング配 列で置換され得て、もともとの構造遺伝子のレベルに一致したレベルで発現され 得る。他方、異種ポリペプチドのコーディング配列は、続いて構造遺伝子の除去 しないで、構造遺伝子の５′末端に挿入され得る。その実施態様においては、異 種ポリペプチドのコーディング配列は、またもとの構造遺伝子の発現レベルとに 相当するレベルで発現される。

発現制御配列のうち、本発明の種々の実施態様に有用なのは、特定の型の細胞で 、あるいは特定の細胞増Ｍｕあるいは分化、あるいは特定の培養条件下化で発現 を指令するものである。組織特異的な発現制御配列は、本発明のトランスジェニ ック宿主に好ましい。

哺乳類の宿主細胞が用いられる場合には、有用な発現制御配列は、宿主細胞自身 から高度に発現された産物をコードする天然の配列から由来し得るか、あるいは βアクチン、コラーゲン、ミオシン、アルブミン、メタロチオネイン、およびヒ ト成長ホルモンなどの、他の高レベル発現を伴う、真核生物の遺伝子から由来し 得る。

本発明の好ましい実施態様は、トランスジェニックｒＪｍ乳Ｈでのタンパク質の 生産を提供する。この実施態様では、好ましくは、カゼインプロモーターおよび βラクトグロブリンプロモーターに対応する発現制御配列などの、哺乳類組織で の遺伝子産物発現を制御および指令する発現制御配列が用いられる。例えば、カ ゼインプロモーターは、αカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、あ るいはにカゼインプロモーターから選択され得る。さらに好ましくは、カゼイン プロモーターおよび関連の発現制御配列はウシ源である、そして最も好ましくは 、αＳ−Ｌカゼインプロモーターおよび関連の発現制御配列である。

発現制御配列は、発現の島の構築物のための宿主として用いられるべき細胞から 直接に得られ得る。宿主での所望の活性レベルをａする、プロモーターおよび関 連の発現制御配列は、まず同定されるべきである。その発現の島は、宿主ゲノム に組み込まれる各々の発現の島の構築物が、コピー数依存であって位置に依存し ない様式で発現されるように設計されなければならない。

我々は、ここに発現制御配列の同定の方法、これらの配列を含む所望のフランキ ング領域のクローニング、異種ポリペプチドのコーディング配列の付加、および 、得られた構築物が本発明に従った「発現の島」であるかどうかの試験をここに 記載する。

最初の工程は、宿主決定およびその宿主に同種の遺伝子が、所望のレベルである いは特定の時期に発現される条件の決定である。組織培養の場合、好ましくは、 ＶＥＲＡＸＴ”　システムでのコラーゲンピーズ上で生育するＣＨＯ細胞が用い られる。

選択された条件下に宿主細胞で高レベルに発現される同種の遺伝子に対する発現 制御配列を単離するために、多量に発現されるＲＮＡ種が同定されるべきである 。このことは、誘導および生育の選択された条件下に、選択された宿主細胞から 単離されたポリＡ（７）ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製することによっ て達成され得る。次に、このｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーが 生産された同じＲＮＡの標識物を用いてスクリーニングされる。最も陽性のシグ ナルは、誘導および生育の選択された条件下に、宿主細胞でＲＮＡが最も多いｃ ＤＮＡの指標である。次に、選択されたｃＤＮＡは、最も多くのＲＮＡに対応す るゲノムＤＮＡ配列を選択するために、選択された宿主細胞から調製されたゲノ ムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。次に、典型的 にはフスミドにクローン化されているこれらのゲノム配列は［Ｔ、　Ｍａｎｊａ ｔｆｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　（Ａｏｎｉｎ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍ ａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 （１９８２）］、制限部位の決定、ニスミド中のフランキング配列の量、および これに含まれるポリペプチドのコーディング領域を分析され得る。

一方、好ましくないが、発現制御配列は、選択された条件および誘導の下に生育 された宿主細胞において、多く生産されるタンパク質あるいはポリペプチドをス クリーニングすることによって単離され得る。このことは、ＳＯＳポリアクリル アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）、あるいは二次元ゲル電気泳動のいず れかを用いて、宿主から生産された総ポリペプチドを分析することによって成し 遂げられる。最も多くのポリペプチドが、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの最も強いバン ドあるいは二次元ゲルの最も大きいスポットに検出される。−星検出されると、 そのバンドあるいはスポットは、ゲルから切り出され、溶出され、そして自動タ ンパク質分析にかけられる。タンパク質分析から得られたアミノ酸配列に基づ（ オリゴヌクレオチドが合成される。次に、これらのオリゴヌクレオチドは標識さ れ、宿主細胞ＤＮＡから構築されたコスミドライブラリーの、これらに対応する ゲノム配列を同定するためのプローブとして用いられる。

この多（発現された遺伝子の十分に解明された制限マツプが、一旦決定されると 、構造遺伝子のコーディング配列および介在配列は、例えば、適当な制限酵素に よってコスミドから取り除かれ、異種ポリペプチドのコーディング配列で置換さ れる。あるいは、異種ポリペプチドのコーディング配列は、構造遺伝子の５′側 に挿入され得る。この実施態様において、構造遺伝子は切り出される必要はない 。好ましい実施態様に従って、異種ポリペプチドはウロキナーゼであり、これら のＤＮＡはプローブとして確立された配列を用いてゲノムライブラリーから単離 され、そしてクローン化された。Ａ、　Ｒｉｃｃｉｏら、−Ｔｈｅ　Ｈｕ＋ａａ ｎ　Ｕｒｏｋｊｎａｓｅ−Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　Ｇｅ ｎｅ　Ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ｓ、、１３（８）、　ｐｐ、　２７５９−７１　（１９８５）。

得られた構築物は、もとは宿主細胞から単離された、多く発現される遺伝子のゲ ノム配列によって、両側に隣接される異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 を育する。種々の長さの５′および３′フランキング領域を含む構築物は、コピ ー数に依存的で位置に非依存的な様式で、異種ポリペプチドのコーディング配列 の発現を指令するのにどのような大きさのフランキング領域が必要とされるかの 決定が試験されるべきである。

挿入された異種ポリペプチドのコーディング配列が、高発現される同種のＤＮＡ 配列のそれと、実質的に同じレベルで発現され得るように、単離コスミドが十分 な５′および３゛フランキング領域を含むことを決定するために、選択されたＤ ＮＡ配列が、組織培養の細胞にトランスフェクトされるか、あるいはトランスジ ェニック動物を生産するために胚のゲノムに導入される。好ましくは、最終的な 生産に用いられる細胞あるいは胚が、この工程に用いられる。次に、形質転換さ れた宿主は、任意の多くの公知の分析によって、異種タンパク質の発現が試験さ れる。これらの分析には、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、イムノプロット 法および所望のポリペプチドの活性を測定する分析が含まれる。′しかし、これ らには限定されない。一方、そして好ましくは、種々の生育条件下の、ｍＲＮＡ レベルが用いられる。このことは、前述のオリゴヌクレオチド（ポリペプチドの 配列に対応する）あるいはプローブとして前もって同定されたｃＤＮＡを用いた ノーサンプロット法によって達成され得る。

宿主細胞から選択された発現制御配列は、公知の条件（例えば、ＶＥＲＡＸ”シ ステムでコラーゲンビーズ上で生育するＣＨＯ細胞）下に、高レベルで同種の遺 伝子の発現を指令する能力を示すので、異種ポリペプチドの実質的に同じ発現レ ベルが、それらの同じ条件下に認められることが期待されている。もしコスミド 由来のＤＮＡ配列が、このようなレベルの発現をもたらさないのであれば、異な る長さの５′および３゛フランキング領域を含む他のコスミドが、実質的に同じ 方法で、適当なりＮＡ配列が決定されるまで分析されるべきである。

この配列によって提示された異種タンパク質の生産レベルは、次に、挿入された 発現の島のコピー数に比較される。コピー数は、適当な制限酵素分析によって解 る。位置非依存的であって、コピー数に依存的な発現を示す発現構築物は、本発 明に従う最善の「発現の島」である。

好ましい実施態様に従って、所望のポリペプチドが、本発明の発現の島を含む宿 主によって分泌される。ポリペプチドの分泌は、シグナル配列をコードするＤＮ Ａ配列を、リーディングフレームが合うように、異種ポリペプチドをコードする ＤＮＡ配列に結合することによって達成される。シグナルペプチドの大きさは、 本発明には重要ではない。望まれる全てのことは、シグナルペプチドが異種ポリ ペプチドの分泌を果たすのに十分な大きさおよび配列であることである。シグナ ルペプチドをコードするシグナル配列には、発現制御配列に天然で結合するシグ ナル配列、所望の異種タンパク質あるいはポリペプチドに天然で結合するシグナ ル配列、宿主に対して天然のシグナル配列、異種ポリペプチド源に対する天然の シグナル配列、発現制御配列源に対する天然のシグナル配列、およびｓ＃Ｉ性シ グナルペプチドをコードする他のあらゆる配列が例として挙げられる。

発現されるべき多くのタンパク質は、通常は分泌されて、そして分泌を指令する のに十分である自身のシグナルペプチドを有する。この場合には、そのシグナル をコードするＤＮＡ１！、発現の島に挿入される異種ポリペプチドのコーディン グ配列に含まれ得る。正ｆ＋こは分泌されないポリペプチドを生産するために、 宿生細胞から正常に分泌されたポリペプチド、あるいは池の分泌されたポリペプ チドからのシグナル配列を用い得る。本発明の好ましい実施態様では、ミルク特 異的シグナルペプチド、あるいは哺乳類組織でのタンパク質の成熟化あるいは分 泌に有用な他のシグナルペプチドをコードする配列が用いられる。これらにはα Ｓ−ｔカゼイン由来のシグナル配列が含まれる。発現されるべき異種ポリペプチ ドがそれ自身のシグナル配列と天然で結合されている場合には、その異種ポリペ プチドコーディング配列と天然で結合しているシグナル配列がより好ましいシグ ナル配列である。

必要な５′および３′　フランキング領域は、発現の島の構築物から、位置に依 存せずコピー数に依存的に発現させる能力によって特徴づけられる。フランキン グ配列の長さは、これらの性質が発現構築物に与えれる限りには重要ではない。

大きさの上限は、ＤＮＡを操作する容易さで決められる。発現制御配列起源（動 物あるいは細胞系で）において、発現制御配列は、理論的には全染色体によって 隣接される。現在の技術では、４０−５０　ｋｂのＤＮＡセグメントを簡単に操 作することが可能である。このことには公知のコスミド技術が必要とされる。

さらに、胚を操作するのに用いられる針を介して注入され得るＤＮＡの大きさに 制限が有り得る。好ましい方法は、コピー数依存性および位置非依存性を与える のに十分な隔離領域を確保し得るほどの大きな５′および３′フランキング領域 領域の使用である。

所望のＸ［ポリペプチドのコーディング配列は、ｃＤＮＡ、ゲノム配列、合成り ＮＡあるいは半合成りＮＡのいずれかから由来し得る。本発明の方法によって生 産され得るポリペプチドの生産物には、例えば、凝固因子Ｈ１ｌおよびＩＸ、ヒ トあるいは動物血清アルブミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、 ウロキナーゼ、α−１抗トリプシン、動物成長ホルモン、ミュラー阻害物質（Ｍ ｉｓ）　、細胞表面タンパク質、インシュリン、インターフェロン、インターロ イキン、ミルクリパーゼ、抗ウイルスタンパク質、ペプチドホルモン、免疫グロ ブリン、リポコルチンおよび他の異種タンパク質産物が含まれる。

所望の異種ポリペプチドは、所望のタンパク質あるいは天然のタンパク質のアミ ノ酸に付加されるアミノ酸を含む融合タンパク質として生産され得る。例えば、 本発明の所望の異種ポリペプチドは、所望のタンパク質を安定させるために、あ るいはそのタンパク質の精製を容易にするおよび／または速やかにするために、 より大きい異種タンパク質あるいはポリペプチドの一部として生産され得る。こ のことは、もともと発現制御配列に連結されている構造遺伝子あるいはその一部 ノｓ　’　（ＩＩ　）位１に、異種ポリペプチドのコープインク配列を、リーデ ィングフレームに合うように、発現の島に挿入することによって成し遂げられる 。このような構築物には、発現の島に挿入される前に、異種ポリペプチドの終止 フドンの除去が必要とされることは明白である。

他方、融合タンパク質のコーディング配列は、発現の島の挿入される前に構築さ れ得る。融合タンパク質構築物は、配列が同じリーディングフレーム内にある限 り、２あるいはそれを越える異種ポリペプチドのコーディング配列あるいはその 一部を有し得る。このような構築物は、当分野に公知の技術を用いて作成し得る 。次に、融合タンパク質は、所望であれば開裂され得て、そして所望のタンパク 質が単離され得る。

所望の異種ポリペチドが、断片として生産され得るか、あるいはもともと発現制 御配列に連′結されているポリペプチドの誘導体として生産され得る。これらの 選択の各々は、単に適当なりＮＡ配列を選択することおよび操作することによっ て容易に生産され得る。このような操作は、当分野には公知である。

上記の発現の島の構築物は、当分野の公知の方法を用いて調製され得る。例えば 、従来のリンカ−１制限酵素部位などを用いる様々な連結反応法が、良い結果を 得るために用いられ得る。好ましくは、本発明の発現の島は、より大きいプラス ミドの一部としてａｍされ得る。このような調製は、当分野では公知の効果的な 様式で適当な構築物のクローニングおよび選択を可能にし、そして発現の島の構 築物の都合のよい天童生産を可能にする。

特定のプラスミドは本発明の実行には重要ではない。むしろ、複製、選択され得 てそして大きいＤＮＡの断片を宵し得る、当分野に公知の任意のプラスミドが、 本発明の発現の島を挿入するための適切な担体であるべきである。最も好ましく は、本発明の発現の島は、所望の宿主に取り込まれるために残りのプラスミドか ら容易に単離され得るように、プラスミドの都合のよい制限酵素部位の間に位置 する。

本発明の発現の島のための適切な宿主の選択は、当分野で認識されている多くの 要素によって制御されている。これらには、例えば、選択ベクターとの適合性、 ポリペプチド産物の毒性、所望の異種ポリペプチドの回収の容易さ、発現の特徴 、異種ポリペプチドの要求に応じる特定のプロセッシング、生物安全性およびコ ストが含まれる。いずれかのこれらの要素のみによって、特定の所望のタンパク 質あるいはポリペプチドのための宿主の絶対的な選択は行えない。その代わりに 、全ての宿主が特定の異種ポリペプチドの発現に等しく効果的であり得るのでは ないことを認識しながら、これらの要素をバランスよく取り選ぶべきである。

有用な哺乳類の宿主細胞には、Ｂおよび’［’　ＩＪンパ球、白血球、繊維芽細 胞、肝細胞、膵臓の細胞、および未分化細胞が含まれる。好ましくは、不死化哺 乳細胞系が用いられる。例えば、有用な哺乳類細胞系には、３Ｔ３．３Ｔ６、Ｓ ＴＯ。

ＣＨＯ，Ｌｔｋ−１ＦＴ０２Ｂ、Ｈｅｐ２Ｂ、ＡＲ４２Ｊ。

およびＭＰＣＩ　Ｌが含まれる。最も好ましい哺乳類細胞系には、ＣＨｏ、３Ｔ ３、およびＬｔｋ−が含まれる。

種々の哺乳類の胚が、本発明でトランスジェニック動物を生産するのに用いられ 得る。宿主の胚の選択は、異種ポリペプチドの、動物での所望の最終目的のよう な要素に依存し得る。例えば、哺乳類のミルク中での異種ポリペプチドの発現の 好ましい実施態様において、好ましい宿主の胚は、大量のミルクを生産するため に繁殖された、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタなどの動物由来である。

動物細胞に発現構築物のＤＮＡを導入する標準法がある。一般に用いられるトラ ンスフェクション法には、エレクトロボレー　シ＊　７　［Ｈ，Ｐｏｔｔｅｒら 、−Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈ ｕｍａｎ　Ｋａｐｐａ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅｓ　Ｉｎｔｒ ｏｄｕｃｅｄ　Ｉｎｔｏ　Ｍｏｕｓｅ　Ｐｒｅ−Ｂ　Ｌｙｍｈｏｃｙｔｅｓ　Ｂ ｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８１（２２）、ｐｐ、７１６１−６５　（１９８４）；　Ｇ、 Ｕｒｌａｕｂら、−Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅ ｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｕｔａｎｔｓ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｒｎ　Ｄｉｈｙｄｒｏｆ ｏｌａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７（７）、　ｐｐ、４２１６−４２００　（１９８０） ］、プロトプラスト融合［Ｒ，Ｍ、　５ａｎｄｒｉ−Ｇｏｌｄｉｎら、Ｍｏ１． 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１．　ｐｐ、７４３−５２　（１９８１）］、リ ン酸カルシウム共沈澱法［Ｆ、Ｌ、　ＧｒａｈａｍおよびＡ、Ｊ、　ｖａｎ　ｄ ｅｒ　Ｅｂ、　−Ａ　Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　Ａｓ５ａ ｙ　Ｏｆ　Ｉｎｆａｃｔｔｖｉｔｙ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ 　５　ＤＮＡ−、■ユ垣肛、　５２（２）。

ｐｐ、４５６−６７　（１９７３）；　Ａ、Ｄ、Ｍｉｌｌｅｒら、”　ｃ−ｆｏ ｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃａｎ　Ｉｎｄｕｅｓ　Ｃａ１ｌｕｌａｒ　Ｔｒａｎｓｆ ｏｒｒａａｔｉｏｎ：　Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｔａ　Ｏｆ　Ａｃｔ ｉｖａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ａ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ−、Ｃｅ１ｌ 、　３６（１）、　ｐｐ、　５１−６０　（１９８１）］、および］ＤＥＡＥ− デキストラン硫を用いるプロトコールが含まれる。さらに、ＤＥＡＥ−デキスト ラン硫酸およびリン酸カルシウム法の変法には、ある程度有利であり得る、［Ｃ ，Ｑｕｅｅｎおよびり、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、−［ｍ＋ａｕｎｏｇｌｏｂｕｌ ｉｎ　Ｇａｎｇ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｔｏｎ　Ｉｓ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｂ ｙ　Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｅｌｅｔａｅｎｔｓ”、　ｃｊ ｉＬ　３３（３）、ｐｐ、７４１−４８　（１９８３）：　Ｃ，Ｍ、Ｇｏｒｍａ ｎら、”　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅｓ　Ｗｈｉｃｈ　Ｅｘｐｒｅ ｓｓ　Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 　ｌｎ　Ｍａｌｌｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ−、Ｍｏ１．　Ｃａ１１．　Ｂｉｏ ｌ、２（９）、ｐｐ。

１０４４−１１　（１９８２）；Ｒ，Ｓ、Ｍｃｌｖｏｒら、−Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ　Ｏｆ　Ａ　ｃＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｈｕｉｌａ ｎ　Ｐｕｒｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｉｎ　 Ｒｏｄｅｎｔ　Ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｅ１ｌｓ−、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、、５（６）、ｐｐ、１３４９−５７　（１９８５）］がある。例えば、 リン酸カルジム共沈澱法は、ＣＨＯ細胞を含む哺乳類細胞に特に効率的である。

選択可能なマーカーは、別のＤＮＡ断片として、通常は発現の島の構築物と共に 哺乳類の細胞に導入され、それによって発現の島を取り込むこれらの細胞は、容 易に単離され得る。有用な選択可能なマーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ 、メタロチオネイン、ｎｅｏ、ｇＪｉｓ　およびＬ−が含まれる。次に、選択さ れた細胞は、異種タンパク質の発現の試験がなされる。

哺乳類の胚のゲノムに発現構築物を導入する標準的な方法もある。哺乳動物をト ランスジェニック的に改変する方法の１つは、発現の島の構築物を授精した哺乳 類の卵の前核にマイクロインジェクションして、構築物の１つあるいはそれ以上 のコピーをゲノム内に組み込ませ、そして発生した哺乳動物の細胞に保持させる 方法である。要するに、マイクロインジェクションには、授精卵の分離、前核の 可視化、そして、次にＤＮＡを前核への注入が含まれる。ＤＮＡの注入は、先の 平滑な保持ピペット（ａ径が約５０μｍ）で卵を保持して、そして先の尖ったピ ペット（直径が約１．５μｍ）でＤＮＡを含む緩衝液を前核へ注入する。例えば 、Ｄ、Ｘｒａｅ−〇ｒら、”Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｉｎｔｏ　Ｐｒｏｒ ｉｕｃｌｅｉ　Ｏｆ　Ｃａｔｔｌｅ　Ａｎｄ　５ｈｅｅｐ　Ｚｙｇｏｔｅｓ”、 　Ｇｅｎｅｔｉｅ　Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅａｒｌ　Ｍａ ｍｍａｌｉａｎ　Ｅｎ＋ｂｒ　ｏ、ｐｐ、２２１−２７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８５）；　Ｒ，Ｅ、ＨａＩ ＩＩＩＩｅｒら、−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒａ ｂｂｉｔｓ、５ｈｅｅｐ　Ａｎｄ　ＰｉｇｓＢｙ　Ｍｉｃｒｏｊｎｊｅｃｔｆｏ ｎ−、Ｎａｔｕｒｅ、　３１５．　ｐｐ、６８０−８３　（１９８５）；および Ｊ、Ｗ、　ＧｏｒｄｏｎおよびＦ、Ｈ，Ｒｕｄｄｌｅ、　−Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎ ｓｆｅｒ　Ｉｎｔ。

Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏｓ：　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｒａｎｓｇｅ ｎｉｃ　Ｍｉｃｅ　Ｂｙ　Ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ”、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｍｂｒ　ｏｌｏ　、１０１．ｐｐ、４１１−３３　（１９ ８３）を参照。

マイクロインジェクションは、好ましくは、１細胞の胚で、注入されたＤＮＡが 、全動物細胞に取り込まれるような、およびその動物の子孫もトランスジェニッ クであるように、生殖細胞にそのＤＮＡが取り込まれるような、両方の可能性を 最大限にするように行われる。通常は、注入された卵から発生した哺乳動物の少 なくとも４０％が、体細胞組織にクローン化された構築物のコピーを少なくとも １個含んでいて、そしてこれらの「トランスジェニック哺乳動物」は、通常、次 世代に生殖細胞系を介してその遺伝子を伝える。得られたトランスジェニック哺 乳動物の組織から単離されたＤＮＡは、サザンプロット法によって発現の７島の 存在を試験され得る。このようなトランスジェニック哺乳動物のゲノムに、１個 あるいはそれ以上の発現の島のコピーが安定に組み込までいれば、発現の島の構 築物を有する永久的なトランスジェニック哺乳動物系を確立するのは可能である 。

トランスジェニック的に改変された哺乳動物の子孫は、生後に、ゲノムへの発現 の島の構築物の取り込みがアッセイされ得る。好ましくは、このアッセイは、異 種ポリペプチドのコーディング配列の一部に対応するプローブを用いて、その子 孫の染色体材料のサザンハイブリダイゼーションによってなされる。ゲノム中に 、構築物の少なくとも１コピーを有することが認められるこれらの哺乳類子孫は 成熟まで育つ。本発明の好ましい実施態様では、これらの子孫の雌は、所望の異 種ポリペプチドをミルク中、あるいはミルクとともに生産スル。あるいは、トラ ンスジェニック哺乳動物は、所望の異種ポリペプチドを生産するのに有用な他の トランスジェニックな子孫を生産するために繁殖させられ得る。

（以下余白） 爽立皿 実施例１　ウシαＳ−ｔカゼイン　の　築この技術の一例は、無処置の動物の特 定の組織あるいは器官の系で異種のタンパク質を生成するために、発現構築物の 島を使用することである。この場合では、我々は、哺乳動物ここで述べる遺伝子 構築物は、ウシαカゼイン遺伝子のゲノム配列の５°および３゛の大きなフラン キング領域がヒトウロキナーゼのゲノムクローンの発現を制御している、「発現 の島」を有する。５゛フランキング領域はαカゼイン配列の上流２１ｋｂからな り、これは最初の非コードエキソンおよび２番目のエキソンの非コード部分を含 む。９ｋｂの３°フランキング領域は、αカゼインのＣ０ＯＨ末端側半分をコー ドするエキソン、ポリアデニル化シグナルおよびさらに下流２ｋｂのフランキン グ配列からなる。

我々は、Ｂ、　ＨｏｈｎおよびＪ、Ｃｏ１１ｉｎｓ、　−Ａ　Ｓｍａｌｌ　Ｃｏ ５ｍ１ｄ　Ｆｏｒ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｏｆ　Ｌａｒｇｅ　 ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ−、Ｇｅｎｅ、　１１（３−４＞、　ｐｐ、　２９ １−９８　（１９８０＞に記載されているように、ウシαＳ−１カゼイン遺伝子 （ＣＡＳ）を、仔ウシ胸腺ＤＮＡのコスミドライブラリーからとり、コスミドベ クターＨＣ７９（ポーリングマン八イムより）に入れてクローン化した。胸腺を 屠殺場から入手し、ＤＮＡを、当業者の周知の標準法で単離した（Ｔ、Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、鼠ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｔｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ 　Ｍａｎｕａｌ、　ｐ、２７１．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）。我々は、標準法を用いてコスミドライブラリ ーを構築した（　Ｆ、　Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、−ＩｓｏｌａｔｉｏｎＯｆ　Ｂｅ ｔａ−Ｇｌｏｂｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　Ｆｒｏｍ　Ａ　Ｈｕｍａｎ 　Ｃｏ５ｍ１ｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ”、　Ｇｅｎｅ、　１３（３）、　ｐｐ、　２ ２７−３　（１９８１））。我々は仔ウシ胸腺ＤＮＡｙｆ−Ｓａｕ３Ａ　（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ）で部分的に消化し、３０ｋｂから４０ ｋｂのフラグメントを集めるためにＮａＣ１の濃度勾配（ＩＭから５Ｍ）にかえ た。次に、部分的に消化したＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化した■Ｃ７ ９コスミドベクターにライゲートし、その後製造者の指導に従って、インビトロ でラムダの抽出物（Ａｗｅｒｓｈａ＋ｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ａｒｌｉ Ａｒｌｌｎ、　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）でパッケージした。インビトロでパッケ ージした材料を、次に、Ｌｃｏｌｔ　Ｋ−１２のＨ８１０１株をトランスフェク トするのに使用した。

このベクターを導入したクローンを、５０μｇ／＋＊　ｌのアンピシリン（Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を含有する ＬＢプレートで増殖させることにより、選択した。

得られたライブラリーを、４５塩基対のオリゴヌクレオチドプローブＣＡＳ−１ を用いてスクリーニングした。このｃＡｓ−１配列５°−ＡＴＧＧＣＴＴＧＡ　 ＴＣＴＴＣＡＧ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＣＡ　ＣＴ　ＣＣＣＡＡ　ＴＡ　ＴＣＣＴＴ ＧＣＴＣＡＧ−３°を、ＬＭ、直１１ｆｓら、“Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｆｏｎ　Ａ ｎｄ　ｆｄｅｎｔｆｆｆｃａｔｆｏｎ　Ｂｙ　Ｐａｒｔｉａｌ　Ｎｕｅｌａｏｔ ｆｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｃａ５ｅ ｉｎ　Ａｎｄβ−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｃＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｅｓ−、Ｄ ＮＡ、　１（４）、　ｐｌ）、　３７５−８６（１９８２）に記載されているα Ｓ−ｔＳｉインの部分的なｃＤＮＡ配列に基づいて合成した。この配列は、成熟 ウシカゼインの２０−３５位のアミノ酸に［する。このスクリーニングの結果、 コスミドを含有する３個のクローン（Ｃ９、Ｄ４およびＥｌ）を単離した。

５゛および３゛フランキング配列を、コスミドベクーンＥｌおよびＣ９から得た 。制限酵素部位マツピングおよびカゼインｃＤＮＡの配列が分かッテイる領域（ Ａ、Ｆ、５ｔｅｖａｒｔら、”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏ ｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ａｌｐｈａ　Ｓｌ−Ａｎｄ　Ｋａｐｐａ−Ｃａｓｅｉｎ　ｃ ＤＮＡｓ−。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１２（９）、　ｐｐ、３８９５−３９０ ７（１９８４）；　Ｍ、Ｎａｇａ。

ら、−Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｆｓ　Ｏ ｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ａｌｐｈａ　５ｌ−Ｃａｓｅｉｎ　ｃＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｅ− 、Ａ　ｒ＋ｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４ｇ（６）、　ｐｐ、１ａ６３− ６７（１９８４））に相当するオリゴヌクレオチドプローブを用いての、サザン ブａ　ット分析（Ｅ、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐ ｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ａ＋ｍｏｎｇ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇ＋ａｅｎ ｔｓ　５ｅｐａｒａｔｅｄ　Ｂｙ　Ｇｅ１Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ’、 　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８（３）、　ｐｐ、５０３−５１７（１９７５ ））によって、フスミドＤ４およびＥｌが、カゼイン構造遺伝子（カゼインタン パク質をコードするＤＮＡ配列）の一部および上流２１ｋｂの５゛フランキング 配列を含むことが確立された。Ｃ９コスミドは、カゼイン構造遺伝子の一部、お よびポリアデニル化配列から７ｋｂ下流におよぶ配列を含んでいた。我々は、コ スミドＥ１およびＤ４の、カゼイン構造配列の転写開始部位に相当する領域の配 列決定を行い、発表された同部位の配列（Ｌ、　Ｙ、　Ｙｕ−Ｌｅｅら、’Ｅｖ ｏｌｕｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｃａ５ｅｉｎ　Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　Ｆａｍｉ ｌｙ：　Ｃａｎ５ｅｒｖｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｓ’Ｆ１ａ ｎｋｉｎｇ　Ａｎｄ　ＥｘａｎＲｅｇｉｏｎｓ−、！Ｌｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ 　Ｒｅｓ、、　１４（４）、　ｐｐ、　１８８３−１９０２　（１９８Ｂ））に 相当することを決定した。

本発明の、この発現の島の構築を図２に示す。Ｃ９コスミドから、αカゼインの ９８位のアミノ酸に続くイントロン内のｈミ旧部位に始まり、αカゼインのポリ アデニル化シグナルの２ｋｂ下流に位置する別の抛旧部位までの９ｋｂのＢａｍ ＨＩフラグメントをサブクローン化した。このフラグメントは図２で「Ｃ末端」 と記した。この９ｋｂフラグメントを肋！旧で切断したｐＵｃ１９に挿入してｐ ＣＡＳ９４７を作製した。ｐＣＡＳ９４７を石旧で部分消化し、続いて、５−Ｇ ＡＴＣＧ丁ＣＧＡＣ−３°の配列を有する５ａｉｌリンカ−１ＣＡＳ　１０をラ イゲートして、下流の勧！旧部位を５ｄｓ１部位に転換した。その結果得たプラ スミドをｐｃＡｓ１２３８と名づけた。この９ｋｂのＢａｍ旧−５ａｌ　！フラ グメントを「島」の３゛フランキング配として使用した。これは３゛非翻訳領域 および３゛発現制御配列およびαＳ−ｔＳｉインの構造遺伝子の一部を含有する 。

次の工程は、５゛フランキング領域の設計であった。転写開始部位、非コード二 キソンおよび一部がやはり非コードである第２二キソンを含有する部位をサブク ローン化した。コスミドＥ１から４ｋｂの３１３［／Ｂａｄｌフラグメントを単 離し、シ倶■ｒ／Σｍａｒで切断したｐＵｃ１９に挿入してＩ）ＣＡＳ１１７６ を作製した。プラスミドをＩＩＪＬＬＩ　［で切断して第２エキソンのコード部 位を除き、旦ＩＬＬ［部位を５°−ＧＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡ−３゛配列を 育するリンカ−１ＣＡ１２をライゲートすることにより、ＢａｗＨ１部位に転換 した。その結果得たプラスミド、ｐｃＡｓ１１８１を、次に、５ｅａｌおよびＢ ａｓ＋ＨＩで消化してコスミドＥＩＤＮＡの３ｋｂ片を切除した。これを単離し 、ｐｃＡｓ１２３８からの９ｋｂのＢａｇ旧−むユ１フラグメントにライゲート し、５ｅａｌ／む１１で消化したｐＵｃ１９に挿入してｐｃＡｓ１２７ｇを作製 した。

その結果得た構築物は、転写開始部位を間に、唯一のＢａｍｌ１クロ一ニング部 位を有するゲノム配列の下流と連結し、これに、異種ポリペプチドをコードする 配列に挿入し得る。最終構築物は、ゲノム配列に他のいくつかのＢａｍＨｆ部位 を有するので、異種のポリペプチドをコードする配列を挿入した部位を、５−Ｇ ＡＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴ−３°の配列を有するリンカ−１Ｃ ＡＳ３０を加えることにより、匹］部位およびＮｏｔ［部位の両方に変えた。そ の結果得たベクター、ｐｃＡｓ１２７７は、αカゼインの転写開始部位とαカゼ インのゲノム配列のＣ末端部位との間にクローニング部位としてＸｈｏ　１部位 およびＮｏｔ１部位を有する。

次にｐｃＡｓ１２７７の転写開始部位およびＣ末端部分を、コスミドＥ１にある それらに相当するゲノムαカゼイン配列部分を置き換えるのに使用した。構築物 は３９ｋｂの長さなので、プラスミドを変えるためにコスミド技術を使用した。

元のＥｌｌススッドを迦］で部分消化し、その後、このフスミッドに含マれてい るαカゼインの３°側のほとんどの部分を除（ために、５ａＩＴで完全消化した 。Ｘｍａｒが５′オーバハングを残すのに対して、５ｔａｒが平滑末端を残すこ と以外は、Ｓｗａ　Ｉと石１の認識部分は同じである。ｐｃＡｓ１２７７からの 次に、除かれた部分を置換するために、ｐＣＡＳ　１２７７からの１２ｋｂのＸ ｍａ［−５ａｌｔフラグメントをｂ旦１／Ｓａｔ　Ｉで切断したコスミッドに挿 入した。

インヒドロハフケージングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ）を用いて、ライゲートされた生成物をインビトロでパッケージし、パッケージ されたＤＮＡでＥ、ｃｏｌｔ　ＤＨ５細胞をトランスフェクトし、続いて、５０ μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｒｓａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）を含有す るＬＢプレートで選択した。アンピシリン耐性コロニーからのプラスミドを、カ ゼインの３゛末端に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニン グした。

転写開始部位上流２１ｋｂおよびゲノムカゼイン遺伝子（Ｄ３゛末端ニ伴’）　 Ｘｈｏｌ／Ｎｏｔｌクローニング部位を有するプラスミドを同定し、特徴を調べ た。次に、プラスミドの１つ、ＣＡＳ１２８ｇをＸ［ＤＮＡ配列を発現させるの に使用した。

発表された配列（Ａ、Ｒｉｃｃｆｏら、上述）をプローブに用いて、ゲノムライ ブラリーから、ヒトウロキナーゼのゲノムクローンを単離した。発表された配列 によると、その遺伝子の翻訳開始部上流に、また、ポリＡ転写シグナルの下流に 組！部位があることがわかる。これらの２つの隣接ＡＩ！ｉ１部位に、オリゴヌ クレオチドアダプター（５°−ＣＧＴＣＧＡＣＧ−３°の配列を有するＵＲＯ８ 、および５°−ＧＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＧＧＣＣ−３°の配列を有するＬＴＲ Ｏ９）を用いて、Ｓａｌ１部位を付加した。これは、ゲノムクローンを動物細胞 発現ベクターの５Ｖ４Ｑ早期プロモーターの下流に配置して、αカゼイン発現の 島に挿入する前に発現を試験することを可能にした。その結果得たプラスミドｐ ＵＫＯ４０９は、トランスフェクトされた組成培養細胞中での真正のヒアルロニ ダ−ゼの発現を制御した。従って、我々はゲノムクローンが機能することを知っ た。次の工程は、ＣＡＳ１２８ｇの鞄！クローニング部位にウロキナーゼのゲノ ムクローンを挿入することであった。これらの工程を図３に示す。

ｐＵＫＯ４０９からウロキナーゼのゲノムクローンを８ｋｂの虱！フラグメント として単離した。Ｓａｌ　Ｉのオーバーハング末端は、ＣＡＳ１２８Ｂにある鞄 ！クローニング部位にライゲート可能である。

しかし、αカゼインの２１ｋｂの上流に別の迦【部位がある。従って、我々はＸ ｈｏｌで部分消化を行い、続いて、単離したＳａｌ　Ｉウロキナーゼフラグメン トをライゲートした（図３を参照）。

プラスミドをコロニーから単離し、ウロキナーゼＤＮＡ配列の存在および方向を スクリーニングした。プラスミドの１つ、ＣＡＳ１２９５は、制限酵素分析によ り、正しい方向のウロキナーゼ遺伝子を冑することが判明した。このプラスミド は５°から３°の方向に、２１ｋｂの上流部分、カゼイン配列の最初の非コード エキソンおよびイントロン、ウロキナーゼをフードするゲノム配列、９ｋｌ）の ３°側αカゼイン領域を有する。

トランスジェニック実験を行うために、　ＣＡＳ１２９Ｓに存在する原核細胞ベ クター配列を、胚に注入する前に除いた。これは、ＣＡＳ１２９５を江およびシ 注ｌで消化し、続いて、１％アガロースＴＨＥゲルで電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、上述）することにより達成された。発現の島の構築物の真核綿゛胞配列に 相当する４１ｋｂのフラグメントをゲルから切除し、ＤＮＡを電気溶出により単 離した。次に、ＤＮＡを平衡ＣｓＣｌ勾配中で一晩遠心した。我々は勾配からＤ ＮＡのバンドを取り、ＴＮＥ緩衝液（ＳｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４，５ｍＭ ＮａＣ１および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８）でよく透析した。

所望の遺伝子情報の発育中のマウスの胚へのトランスジェニック導入の方法は当 該分野で確立されている。我々はＢ、　Ｈａ従った。我々はＣ５７ＢｌとＣ８４ ７ウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）との交配によるＦ１世代 （Ｓｌｏａｎ　Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）を使用した。ゲスタイル（Ｇｅｓｔｉｌｅ ）　（妊馬血清）の注射と、それに続いて、２０後にヒト絨毛性ゴナドトロピン を注射することにより、６週令の雌に過剰排卵させた。処置した雌を、２４時間 後に、ｃ５７Ｂｌ繁殖用雄と交配させた。ＤＮＡをマイクロインジスクシ１ンし 、偽妊娠した雌に移植するために着床前の受精卵を交配後１２時間以内に採取し た。

胚を単離したあと、我々はヒアルロニダーゼで、卵周囲の管圧細胞を消化して除 去した。次に胚の大きさが３ｏ％から５０％膨張するまで、発現の島の構築物を 胚の前核に注入した。次に我々は、注入された胚を、偽妊娠しているＦｌｌ雌管 管移植した。発現の島の構築物を有する動物を同定するために、得られた生存し ている仔の尾から採取したＤＮＡを、ニックトランスレーションしたＣＡＳ１２ ９５　ＤＮＡでプローブした。３匹のトランスジェ三ツク動物を同定した。これ らの動物を交配させ、その子孫に、発現の島の構築物が存在するかを、上記のよ うに調べた。

２−３コピーの発現の島の構築物を有するトランスジェニック系統の１つは、メ ンデルの法則の通りに遺伝子物質を継代した。ＣＡＳ１２９５挿入物を宵するト ランスジェニック系統の雌は、酵素によるアッセイで測定した結果、すべて、そ のミルクに約１冒ｇ／ｍ１のヒトウロキナーゼを産生じた。ウロキナーゼは、ヒ トウロキナーゼ特異的モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎａ　Ｄｔａｇｎｏ ｓｔｉｃａ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ）によって抑制された。

他の２つのトランスジェニック系統は２０−５０コピーの構築物を有したが、次 の世代のマウスにＤＮＡを継代しなかった。多数のコピーを有する系統が遺伝子 を継代しなかったのは、胚形成時のウロキナーゼの基礎レベルが高いからである と、我々は考える。ウロキナーゼは通常、胎組織［胚幹細胞（ｅ＋＊ｂｒｙｏｎ ｉｃ　ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）］中に発現し、発育中において機能する。カゼイン 発現制御配列からのウロキナー４発現の低い基礎レベルは、２コピーの遺伝子を 遺伝する胚の発育を妨げないであろう。しかし、もし発現が、コピー数に依存す るならば、２０−５０コピーを有するそれらの系統は、２０−５０倍高い基礎レ ベルを持ち、従って、適当な発育を妨害するに充分な量のウロキナーゼを発現す るであろう。これらの結果は、発現されたウロキナーゼのレベルはコピー数に依 存することを示す。

実施例３　の　の　中への トランスフェクシ言ン 発現の島の構築物および、哺乳動物細胞でジヒドロ葉酸リダクターゼ産生をコー ドする選択可能なマーカーｐｓＶ２−ＤＨＦＲ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ３７１４６）から入手可能 ）をエレクトロポレーションにより、ＤＨＦＲ−ＣＨＱｌｉＢＦｉニ共に導入し た。この方法は、安定して統合されている多数のコピー数の外来ＤＮＡを特徴と する宿主細胞を作製する能力があるので選ばれた。ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、０ ３４３７８３はこの方法を十分に記載しており、これをここに引用文献として加 える。

エレクトロポレーションの前に、ｐＳＶ２−ＤＨＦＲプラスミドをΔａｔ［Ｉで 、３７℃で一晩消化することにより、線状化した。発現の島配列を、実施例２で 述べたように制限酵素で切断することにより、ベクター配列から単離し、続いて 、分離および精製のために、ゲル電気泳動にかけた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記 ）。

予め３００−１０００ｂｐのフラグメントに超音波処理したサケ精子ＤＮＡ　（ ２０＊Ｉｇ）を、２０＊Ｉｇ（７）線状化したｐｓＶ２−ＤＨＰＲおよび０．５ ＋＊ｇ／ｌａｒの発現の島の構築物の混合物に加えた。　ＤＮＡ混合物を沈澱さ せるため、最終濃度が０．１ＭとなるようにＮａＣ１を加えた。次に、２．５容 量のエタノールを加え、混合物をドライアイス上で１０分間インキュベートした 。４℃で１０分間遠心後、エタノールを吸引し、ＤＮＡのベレットを、組織培養 フード中で１５分間風乾した。

次ｉｉ：、ＤＮＡベレットを、エレクトロボレーシコンの前に、６００μｌのＩ Ｘ　ＨｅＢ５　（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ，ｐＨ７，０５；　１３７ｍ Ｍ　ＮａＣ１；　５ｍＭＫＣｌ；　０．７＋＊Ｍ　ＮａａＨＰＯ４；　６ａ＋Ｍ デキストロース）に少なくとも２時間再懸濁した。

約２Ｘ１０７個のＤＨＰＲ−ＣＩＯ細胞（ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｆｓ、”ｌ５ ｏｌａｔｉｏｎＯｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａ＋ｍ５ｔｅｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｕｔａ ｎｔｓ　Ｄｅｆｉｃｔｅｎｔ　Ｉｎ　Ｄｉｈｙｄｒｏｆ。

１ａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ″、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｓ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ。

７７、　ｐｐ、　４２４６−２０　（１９８ｆ））でＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂｌと 名付けられタフローンからサブクローン化された）を各エレクトロボレーシコン に使用スる。ＤＩ（ＦＲ−ＣＨＯ細胞はエレクトロポレーションの前日に継代さ れ、エレクトロポレーションのために収集した時には、ｌｏｃ＋ａのプレートの 約５０％フンフルエンドである。ＤＨＰＲ−ＣＨＯ細胞をトリプシン処置により プレーから剥し、続いて、トリプシンを１つのプレートにつき８．０ｍｌのα“ 培養液（リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド（アデノシン、シチ ジン、グアノシン、ウリジン、２°−デオキシアデノシン、２°−デオキシグア ノシン、および２°デオキシチミジンを各々１０ａｇル；２°−デオキシシチジ ンＨＣＩをｆ１ｍｇ／Ｌ）を補充したＭＥＭ−α、（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）、１０％ウシ胎仔血清＜ Ｈａｚｅｌｔｏｎ、　Ｌｅｎｅｘａ、　ＫＳ）および軸Ｍグルタミン（Ｍ、Ａ、 Ｂｉ。

ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）を加えてトリプシン を不活化した。次に、プレートから剥した細胞を集め、ｌｏｏｏｒｐｍで４分間 遠心した。細胞のベレット上の大部分の培養液を吸引し、チューブを振ることに より細胞を残留している培養液中に再懸濁する。

次に、８００μｍのｌＸＨｅＢ５に懸濁させた発現の島、ｐｓＶ２−ＤＨＦＲお よびサケ精子ＤＮＡをＤＨＦＲ″′Ｃ■０細胞懸濁液に加える。得られた混合物 をすぐにエレクトロポレーション用キュベツトに移す。

エレクトロボレーシコン装置の電気容量器を９６０μＦに調節し、電圧を３００ ｖに合わせる。約１０ミリ秒間続くパルスを１回、室温でキコベットの内容物に 与える。次に細胞を室温で８−１０分間インキュベートし、次に１４＊Ｉのα１ 培養液を含む１５＊Ｉのチューブに移す。細胞を上述のように遠心する。培養液 を吸引した後、湿った細胞ベレットを振って再懸濁し、新鮮なα４培養液を加え る。次に、懸濁させた細胞を培養プレートに撤き、非選択培地で２日間培養し、 エレクトロボレーシコンから回復させ選択遺伝子を発現させる。生存しているＣ ＨＯ細胞の約２０−３０％が発現の島／ｐｓＶ２−ＤＨＦＲを導入し、従って、 選択過程で生き残ると考えられる。従って、ＬＯｃｍのプレートに約ＬＸ　１０ ７個ノ細胞を撤き、３７℃、５，５％ＣＯ２のインキ二ベーターで培養した。

２日間の回復期間後、細胞を培養プレートから上述のようにトリプシン処置によ り剥し、細胞数を数え、１プレート当たり約１ｘｔｏ’個の細胞密度で６枚のｉ ｏａｍプレートに、α−培養液（Ｓｉｇ＋ｎａ　Ｃｈｅ＋ｇｆｃａｌ　Ｃｏ、） 中に撒く。発現の島およびｐｓＶ２−ＤＨＦＲを有する細胞を、α゛培養液で４ 日間インキュベートした後、選択した。次に、選択した細胞のウロキナーゼの発 現を標準的方法、即ち、市販の比色テスト、５ｐｅｃｔｒｏｚｙｔａｅ　ＵＫ　 （Ａｍｅｒｉｃａｎａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｉｎｃ、）によって％調べ る０種々のレベルにウロキナーゼを発現しているいくつかのクローンを選択する 。これらのクローンからＤＮＡおよびＲＮＡを単離し、転写レベルおよび発現の 島の構築物のコピー数を調べるために、ノーザンおよびサザン分析を行つた。こ の分析はウロキナーゼのメツセージの発現はコピー数によるものであり、組み込 まれた構築物の組み込み位置に依存しないかどうかを示す。

プラスミドＣＡＳ１２８ａを有する本発明による構築物はＩｎ　Ｖｌｔｒｏ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、、Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、　Ｍａｒｙｌａｎ ｄに１９９０年２月１日に寄託された培養物により、例証され、プラスミドＣＡ Ｓ１２８８がＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５中にＣＡＳ１２１ｔ８として同定される。そ れは、受託番号ＩＶ１１０２３２をと呈された。

プラスミドＣＡＳ１２９５を有する本発明による第２の構築物は、Ｉｎ　Ｖｉｔ ｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、、Ｌｉｎｔｈｆｃｕ＋ｅ、　Ｍａ ｒｙｌａｎｄに１９９０年２月１日に寄託された培養物により例証され、プラス ミドＣＡＳ１２９５のＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５中にあるＣＡＳ１２９５として同定 される。それは受託番号ＩＶ１１０２３１を指定された。

本文中にい（つかの我々の発明の実施態様を示したが、我々の基本的構築物は、 本発明の工程および組成物を使用する他の実施態様を提出するように変化させ得 ることは明きらかである。従って、本発明の範囲は実施例によって本文に示した 特定の実施例よりもむしろここに添付する請求の範囲によって定義されると認識 される。

５゛７ラシヤ〉７°°↑楔工奴　３゛７ラン↑シフ”＠１ＫＦＩＧ、た ５°　７ラン１ン７″Ｉ？ｂ５　３’プラン〒ン１°々東割仇。

Ｆ／θＬ 要約書 本発明は、組換え宿主において所望のポリペプチドの生産レベルを改良するため の方法および中間生成物に関する。この組換え宿主のゲノム中に、５′から３′ 方向に、５′　フランキング領域、異種ポリペプチドのコーディング配列、およ び３゛　フランキング領域を含有する発現の島が組み込まれた。

本発明の発現の島は、実質的に発現の島のコピー数に依存して、そして実質的に 宿主ゲノム中の組み込みの位置に依存せずに、この組み込まれた異種ＤＮＡ配列 の発現を可能にする。

受託番号変更届

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．所望の異種ポリペプチドを宿主中に高レベルで生産する方法であって、該方 法が、下記の工程（ａ）および（ｂ）を包含する方法： （ａ）該宿主のゲノムに少なくとも１個の発現の島を組み込む工程であって、 該発現の島が、５′から３′方向に、５′フランキング領域、異種ポリペプチド のコーディング配列、および３′フランキング領域を含有し； 該５′フランキング領域が、該異種ポリペプチドのコーディング配列に作動可能 に結合されている５′発現制御配列、および５′非翻訳領域を含有し： 該３′フランキング領域が、３′非翻訳領域および該異種ポリペプチドのコーデ ィング配列に作動可能に結合されている３′発現制御配列を含有し；そして 該発現の島の５′および３′フランキング領域が、該宿主ゲノムに組み込まれる 該発現の島のコピー数▽に実質的に依存し、そして該宿主ゲノム中の該発現の島 の組み込み位置に実質的に依存しないで、該所望の異種ポリペプチドの生産レベ ルを与えるのに有効である、十分な大きさおよび構造である；および （ｂ）該所望の異種ポリペプチドが発現され得る条件下に該宿主を培養する工程 。
2. ２．前記異種ポリペプチドのコーディング配列が機能性シグナル配列のコーディ ング領域を含有する、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記シグナル配列のコーディング領域が、ミルク特異的タンパク質遺伝子由 来である、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記ミルク特異的タンパク質遺伝子がカゼインである、請求項３に記載の方 法。
5. ５．前記宿主が、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびプタからなる群より選択さ れる授乳期の哺乳動物であり、そして５′および３′フランキング配列がミルク 特異的タンパク質遺伝子由来である、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
6. ６．前記異種ポリペプチドのコーディング配列が、ｔＰＡ、ウロキナーゼ、ミュ ラー阻害物質、インターフェロン、凝固因子ＶＩＩＩおよびＩＸ、動物成長ホル モン、インシュリン、インターロイキン、免疫グロブリンおよびリポコルチンか らなる群より選択されたポリペプチドをコードする配列から選択される、請求項 １に記載の方法。
7. ７．ＤＮＡ配列発現の島であって、該発現の島は、５′から３′方向に、５′フ ランキング領域、異種ポリペプチドのコーディング配列、および３′フランキン グ領域を含有し； 該５′フランキング領域が、該異種ポリペプチドのコーディング配列に作動可能 に結合されている５′発現制御配列および５′非翻訳領域含有し； 該３′フランキング領域が、３′非翻訳領域、および該異種ポリペプチドのコー ディング領域に作動可能に結合されている３′発現制御配列を含有し； 該発現の島の宿主ゲノムヘの組み込みにおいては、該発現の島の５′および３′ フランキング領域が、該宿主ゲノム中の該発現の島のコピー数に実質的に依存し 、そして該宿主ゲノム中の該発現の島の組み込み位置に実質的に依存しないで、 該異種ポリペプチドのコーディング配列にコードされるポリペプチドの生産レベ ルを与えるのに有効である十分な大きさおよび構造である。
8. ８．前記異種ポリペプチドのコーディング配列が、機能性シグナル配列のコーデ ィング領域を含有する、請求項７に記載の発現の島。
9. ９．前記５′および３′フランキング配列が、ミルク特異的タンパク質遺伝子由 来である、請求項７に記載の発現の島。
10. １０．前記シグナル配列のコーディング領域が、ミルク特異的タンパク質遺伝子 由来である、請求項８に記載の発現の島。
11. １１．前記ミルク特異的タンパク質遺伝子がカゼインである、請求項９に記載の 発現の島。
12. １２．前記異種ポリペプチドのコーディング配列が、ｔＰＡ、ウロキナーゼ、ミ ュラー阻害物質、インターフェロン、凝固因子ＶＩＩＩおよびＩＸ、動物成長ホ ルモン、インシュリン、インターロイキン、免疫グロブリンおよびリポコルチン からなる群より選択されたポリペプチドをコードする配列から選択される、請求 項７に記載の発現の島。
13. １３．組み込まれた発現の島を含むゲノムによって特徴づけられる形質転換され た宿主であって、該発現の島が請求項７から１２のいずれかに記載の発現の島で ある、形質転換された宿主。