JP3240370B2 - 培養細胞または受精卵に外来遺伝子を導入する方法 - Google Patents

培養細胞または受精卵に外来遺伝子を導入する方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物研究分野、医学研
究分野、畜産研究分野、水産研究分野における外来遺伝
子の導入技術に関し、詳しくは、これらの分野において
培養細胞または受精卵に外来遺伝子を導入する方法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、外来遺伝子の導入技術が発展する
につれて、新たに有用な形質を付加させた生物品種の創
出が可能となり、トランスジェニック生物作成として画
期的な研究成果があがりつつある。
【０００３】なお、外来遺伝子の導入技術としては、リ
ン酸カルシュウム法、エレクトロポレーション法、リポ
フェクション法、顕微注入法、ウイルスベクター法など
により、プラスミドベクターにクローニングされた外来
遺伝子を培養細胞または受精卵に導入する操作が行われ
ている。
【０００４】また、外来遺伝子の導入技術としては、パ
ーティクルガン（空気銃のような装置）を用いた遺伝子
導入法も知られている。従来、パーティクルガンによる
遺伝子導入法は、主として細胞壁を持つ植物細胞に適用
され、外来遺伝子の導入が可能となったことで植物の種
類を飛躍的に増大させてきた。さらに最近では、パーテ
ィクルガンを用いて動物卵に外来遺伝子を導入する方法
も提案されている。
【０００５】パーティクルガンを用いて動物卵に外来遺
伝子を導入する方法は、例えば、ウニ卵に外来遺伝子を
導入するときに利用されており、また他の無脊椎動物卵
に外来遺伝子を導入するときにも利用されている。そし
て、多少の改良により堅い卵殻を持つ魚卵にも遺伝子を
導入することが可能であり、多数の卵を同時に処理でき
る点で魚介類の品種改良への道が開かれると考えられて
いる。
【０００６】なお、パーティクルガンを用いて動物卵に
外来遺伝子を導入する方法では、具体的には、遺伝子
（ＤＮＡ）を沈着させた金やタングステンなどの微粒子
をガス圧で加速し、培養細胞または受精卵に打ち込むよ
うにしている。このように外来遺伝子を動物卵に導入し
た後、導入後の遺伝子がプリズム胚でも認められてお
り、金属粒子は何らかの機構で胚から取り除くことが可
能となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ところが、上述した複
数種の遺伝子導入方法を用いた場合には何れも、外来遺
伝子が導入される染色体ＤＮＡ上の位置は、現在の技術
ではコントロールできない。従って、培養細胞または受
精卵内において、導入後の外来遺伝子が周囲（隣接）の
遺伝子の環境にさらされることになり、正常に発現しな
い場合が多い。
【０００８】つまり、図２に示すように、外来遺伝子が
不活性クロマチンＤＮＡ上に導入された場合は、該外来
遺伝子が不活性になってしまう。一方、外来遺伝子が活
性クロマチンＤＮＡ上に導入された場合は、強力なエン
ハンサーの支配を受けるので、外来遺伝子の過剰発現
や、時期特異的、組織特異的な遺伝子の発現がコントロ
ール不能という問題が生じてくる。
【０００９】上述したことから、さらに図２に示すよう
に、外来遺伝子が不活性クロマチンＤＮＡ上に導入され
た場合は、トランスジェニック生物の作成効率が著しく
低くなっている。一方、外来遺伝子が活性クロマチンＤ
ＮＡ上に導入された場合は、導入後の遺伝子がコントロ
ール不能の遺伝子として発現してしまう。結局、所要の
目的に合致したトランスジェニック生物を作成すること
が難しくなる。
【００１０】要するに、上述した複数種の遺伝子導入方
法では何れも、導入された外来遺伝子が正しく機能する
トランスジェニック生物があまり期待できず、期待でき
るとしても、色々な複雑な操作が必要となってくるの
で、トランスジェニック生物の作成に多大な労力と時間
を必要とする。
【００１１】本発明は、上述した問題点を解消するため
になされたものであり、導入された外来遺伝子が正しく
機能し目的に合致したトランスジェニック生物を作成す
るための遺伝子導入方法を提供しようとしている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに本発明は、外来遺伝子の導入方法であって、培養細
胞または受精卵に外来遺伝子を導入する際に、導入後の
外来遺伝子が周囲の遺伝子からの干渉を受けないよう
に、導入しようとする外来遺伝子を、インスレーターで
挟み独立した環境を確保した状態で染色体ＤＮＡに導入
することを特徴とするものである。
【００１３】上記インスレーターは、ウニ・アリールス
ルファターゼ（Ａｒｓ）遺伝子の上流に存在し、詳しく
はウニ・アリールスルファターゼ（Ａｒｓ）遺伝子の上
流−２６８６ｂｐ〜−２１１５ｂｐに存在するインスレ
ーター・フラグメントである。
【００１４】また、培養細胞または受精卵に外来遺伝子
を導入するときに、上記インスレーター・フラグメント
は、導入しようとする外来遺伝子を挟むようにプラスミ
ドに配置される。
【００１５】さらに、上記インスレーター・フラグメン
トは、アリールスルファターゼ遺伝子のエンハンサーと
プロモーターとの間に挿入されると、アリールスルファ
ターゼ遺伝子のエンハンサーの活性を完全に遮断できる
ものである。
【００１６】なお、本発明の方法による遺伝子導入時の
操作も、従来のパーティクルガンによる遺伝子導入法を
使用することが可能である。すなわち、外来遺伝子（Ｄ
ＮＡ）を沈着させた金の微粒子をガス圧で加速して培養
細胞または受精卵に打ち込む方法を利用できる。
【００１７】
【作用】上記した本発明の方法によれば、図１に示すよ
うに、培養細胞または受精卵に外来遺伝子を導入する際
にして、導入後の外来遺伝子が周囲の遺伝子からの干渉
を受けないように、導入しようとする遺伝子を、インス
レーターで挟み独立した環境を確保した状態で染色体Ｄ
ＮＡに導入することから、導入後の外来遺伝子は、導入
先の培養細胞または受精卵内で隣接遺伝子からの干渉を
受けずに済むようになっている。
【００１８】すなわち、図１に示すように、外来遺伝子
が不活性クロマチンＤＮＡ上に導入された場合は、該外
来遺伝子を挟むように位置している両側のインスレータ
ーにより、不活性クロマチンＤＮＡからの影響を遮断す
ることができ、導入後の外来遺伝子が不活性になること
が避けられる。一方、外来遺伝子が活性クロマチンＤＮ
Ａ上に導入された場合は、該外来遺伝子を挟むように位
置している両側のインスレーターにより、強力なエンハ
ンサーの支配を遮断することができるので、外来遺伝子
の過剰発現や、異常な時期特異的、組織特異的な遺伝子
の発現が回避できるようになる。
【００１９】このように隣接遺伝子からの干渉を遮断す
ることで、導入された遺伝子は染色体上の挿入位置に依
存せず、導入後の外来遺伝子が培養細胞または受精卵内
の染色体ＤＮＡ上で安定的に正常発現することが保証さ
れるようになり、トランスジェニック生物作成の効率化
に寄与できる。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。なお、以下の実施例では、バフンウニ・アリー
ルスルファターゼ（Ａｒｓ）遺伝子の上流−２６８６ｂ
ｐ〜−２１１５ｂｐに存在するインスレーター・フラグ
メントを用いる。すなわち、導入される外来遺伝子を挟
むように上記インスレーター・フラグメントをプラスミ
ド上に配置することで、受精卵に導入された外来遺伝子
が周囲の隣接遺伝子からの影響を受けなくて済むという
原理を利用している。なお、実際の遺伝子導入操作で
は、導入される外来遺伝子（ＤＮＡ）とインスレーター
・フラグメントとを同じ制限酵素末端を持つように直鎖
化し、混ぜて受精卵に導入するだけて、インスレーター
の機能が充分に発揮できるようになっている。
【００２１】受精卵の作成 日本近海で取れたバフンウニの卵を海水中で受精させ、
そして受精卵を２回にわたって海水で洗った。その後、
受精卵の胚体積０．１５ｍｌを取り、シャーレの中に敷
いた濾紙上に均一になるように散布した。このようにし
て、受精後のウニ卵は、濾紙の繊維に挟まれて固定され
た。
【００２２】遺伝子（ＤＮＡ）を沈着した金粒子の作成 上記の受精卵に導入される遺伝子（ＤＮＡ）に対し、制
限酵素を用いることで、ある制限酵素末端を持つように
直鎖化し、そして、重量比で８倍量の同じ制限酵素で完
全消化したバフンウニ染色体ＤＮＡと、同じ制限酵素末
端を持つように直鎖化したインスレーター・フラグメン
トと混合させて、１ｍｌあたり０．５ｍｇのＤＮＡを含
む溶液を調製した。そして、２．５ｍｇの乾燥金粒子
（直径約１μｍ、１００％のエタノール中で音波洗浄し
たもの）を上記のＤＮＡ溶液２０μｌに懸濁し、１２μ
ｌのＰＥＧ溶液（ポリエチレングリコールを２０重量％
の濃度になるように２．５ＭＮａＣｌに溶かし、オート
クレーブで滅菌処理したもの）を添加して２０分間氷冷
した。これによって、ＤＮＡが金粒子に沈着した。その
後、軽く遠心分離して上清を取り除いてから、遺伝子
（ＤＮＡ）を沈着させた金粒子を得た。このように遺伝
子（ＤＮＡ）を沈着した金粒子は、ボルテックスミキサ
ーを用いて６２．５μｌの１００％エタノールに懸濁す
ることで更に処理された。
【００２３】受精卵への遺伝子導入 ＤＮＡを沈着した金粒子０．８ｍｇをプロジェクタイル
に載せてパーティクルガンにセットし、０．１気圧程度
の減圧下で初速度３５０ｍ／ｓで発射し、濾紙上に固定
した受精卵に撃ち込んだ。
【００２４】導入後の外来遺伝子の正常発現性に対する
評価 上記インスレーター・フラグメントを用いることによっ
て、受精卵に導入された外来遺伝子が周囲の隣接遺伝子
からの影響を受けなくて済むということが、クロラムフ
ェニコールアセチル基遺伝酵素（chloramphenicol acet
yltransferase,以下CATと称す）および発光生物（例え
ばホタル）由来のルシフェラーゼ（luciferase, 以下lu
cと称す）という２種類のレポーター遺伝子（reporterg
ene）を使用することによって確認されている。
【００２５】ここでCATとlucは、テスト用の遺伝子とし
て用いられており、それぞれウニのヒストンＨ1遺伝
子、アリールスルファターゼ遺伝子のプロモーターの下
流側に連結され、その融合遺伝子の産物の活性を測定す
ることにより、導入された外来遺伝子が正常に発現して
いることを確認できた。
【００２６】
【発明の効果】上記した本発明の方法によれば、インス
レーターで挟まれた外来遺伝子は、培養細胞または受精
卵内に導入された後、周囲遺伝子の影響を受けないた
め、導入された遺伝子は染色体上の挿入位置に依存せ
ず、安定的な発現が保証される。従って、本発明の方法
は、トランスジェニック生物作成の効率化に寄与でき
る。
【００２７】トランスジェニック生物作成の効率化によ
り、基礎研究では種々の遺伝子の機能解析、細胞分化の
分子的メカニズム、発ガン機構の遺伝子レベルでの研究
が促進されると共に、応用研究では遺伝子治療、遺伝子
導入による品種改良が促進される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法におけるメカニズムを説明する原理
図である。
【図２】従来方法におけるメカニズムを説明する原理図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 赤坂 甲治 広島県東広島市八本松南４−20−26 (56)参考文献 国際公開96／4390（ＷＯ，Ａ１) 国際公開94／23046（ＷＯ，Ａ１) 第69回日本生化学会大会・第19回日本 分子生物学会年会・合同年会講演要旨集 （1996．Ｊｕｌ．25）第293頁 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．74，Ｎｏ．３ （1993）ｐ．504−514 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏ ｌ．12，Ｎｏ．２（1992）ｐ．2424− 2431 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 培養細胞または受精卵に外来遺伝子を導
    入する際に、導入後の外来遺伝子が周囲の遺伝子からの
    干渉を受けないように、導入しようとする外来遺伝子
    を、インスレーターで挟み独立した環境を確保した状態
    で染色体ＤＮＡに導入し、上記インスレーターは、ウニ
    ・アリールスルファターゼ（Ａｒｓ）遺伝子の上流−２
    ６８６ｂｐ〜−２１１５ｂｐに存在するインスレーター
    ・フラグメントであることを特徴とする外来遺伝子の導
    入方法。
  2. 【請求項２】 上記インスレーター・フラグメントは、
    導入しようとする外来遺伝子を挟むようにプラスミドに
    配置されることを特徴とする請求項１記載の外来遺伝子
    の導入方法。
  3. 【請求項３】 上記インスレーター・フラグメントは、
    アリールスルファターゼ遺伝子のエンハンサーとプロモ
    ーターとの間に挿入されると、アリールスルファターゼ
    遺伝子のエンハンサーの活性を完全に遮断できるもので
    あることを特徴とする請求項１記載の外来遺伝子の導入
    方法。
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