JPH11253097A - 非ヒト哺乳動物のミルク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 有用な組換えポリペプチドを含有するミルク
を提供する。 【構成】 組換えポリペプチドを含有する非ヒト哺乳動
物のミルクにおいて、ミルク特異的プロポーターに作動
可能に結合されている組換えポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列及びシグナルペプチド配列を含む発現系を含
む非ヒト哺乳動物によって該組換えポリペプチドが作ら
れ、該組換えポリペプチドが、凝集因子VIIIおよびIX、
組織プラスミノーゲン賦活物質（ＴＰＡ）、ウロキナー
ゼ、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロン、
インターロイキン、ペプチドホルモン、免疫グロブリ
ン、並びにそれらの生物学的に活性な断片より成る群か
ら選ばれるところの、上記ミルク。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物のミルク
における組換えポリペプチドの産生に関するものであ
る。特に本発明は、シグナルペプチドおよび所望の組換
えポリペプチド生産物をコードするＤＮＡ配列に作動可
能に結合した少なくとも1種のミルク特異的蛋白プロモ
ータからなる発現系に関するものである。この種の系を
哺乳動物中にトランスジェニック的（transgenically)
に組込むと、授乳期のトラスジェニック哺乳動物のミル
クに組換えポリペプチドが発現される。さらに本発明
は、所望の組換え生産物をミルク中に産生するトランス
ジェニック哺乳動物に関するものである。本発明の発現
系およびトランスジェニック改変した哺乳動物により産
生される組換え生産物は、慣用の組換えポリペプチド産
生技術によるよりも顕著に低いコストで製造することが
できる。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術は、医学上および農業
上重要な蛋白および糖蛋白をコードする遺伝子のクロー
ン化および発現を可能にした。この種の生産物はたとえ
ばインシュリン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因
子、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン賦活物質、
腫瘍壊死因子、リポコルチン、凝集因子VIIIおよびIX、
インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキ
ンおよびウロキナーゼを包含する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
重要な蛋白の多くは大きく（３０Ｋｄを越える分子
量）、分泌され、適正な折畳みを維持するにはスルフヒ
ドリル結合を必要とし、グリコシル化されておりかつプ
ロテアーゼに対し感受性である。その結果、原核細胞に
おけるこの種の生産物の組換え産生は、所望の組換えポ
リペプチドが不正確に処理され、適正なグルコシル化を
欠如し、或いは不適正に折畳まれるので、満足しうるも
のでないことが判明している。したがって、これらの組
換えポリペプチドは培養された真核細胞にて産生させね
ばならなかった。この技術は、細胞培養法の変動に基づ
き高価となりかつしばしば信頼性がないと判明した。た
とえば、平均収率は培地１ｌ当たり組換えポリペプチド
１０ｍｇであり、その結果コストは典型的には組換えポ
リペプチド１ｇ当たり１０００ドルを越える。したがっ
て、これら組換えポリペプチドは培養された真核細胞に
て産生させねばならなかった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、トランスジェ
ニック改変された哺乳動物のミルクに多量の組換えポリ
ペプチド生産物を産生する効率的手段を提供することに
より、これらの問題を解決する。本発明によれば、所望
の蛋白をコードするＤＮＡ配列は、発現系においてミル
ク特異性蛋白プロモータ或いは乳房組織にて特異的に賦
活される任意のプロモータ配列に、シグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列を介して作動可能に結合され、こ
のシグナルペプチドは乳房組織にて所望蛋白の分泌およ
び成熟を可能にする。より好ましくは、発現系は所望の
組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流に
３'非翻訳領域をも含む。この非翻訳領域をは、発現系
のｒＤＮＡ転写産物を安定化させることができる。必要
に応じ発現系は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列の上流に５’ 非翻訳領域をも含む。

【０００５】この発現系は標準的なトランスジェニック
(transgenic)技術により宿主ゲノム中にトランスジェニ
ック的に導入される。その結果、構造物もしくは系の１
つもしくはそれ以上のコピーがトランスジェニック哺乳
動物のゲノムに組込まれる。発現系の存在は、雌哺乳動
物が組換えポリペプチド生産物を産生すると共にミルク
中へまたはミルクと一緒に分泌することを可能にする。
この種の方法は、所望蛋白の低コストかつ高レベルの製
造を可能にする。

【０００６】従って、本発明は、下記のミルクである。

【０００７】組換えポリペプチドを含有する非ヒト哺乳
動物のミルクにおいて、ミルク特異的プロポーターに作
動可能に結合されている組換えポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列及びシグナルペプチド配列を含む発現系を
含む非ヒト哺乳動物によって該組換えポリペプチドが作
られ、該組換えポリペプチドが、凝集因子VIIIおよびI
X、組織プラスミノーゲン賦活物質（ＴＰＡ）、ウロキ
ナーゼ、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロ
ン、インターロイキン、ペプチドホルモン、免疫グロブ
リン、並びにそれらの生物学的に活性な断片より成る群
から選ばれるところの、上記ミルク。

【０００８】

【発明の実施の形態】本明細書に使用する組換えポリペ
プチドおよび作動可能に結合という用語は次の意味を有
する： 作動可能に結合：所望蛋白（又はポリペプチド）をコー
ドするＤＮＡ配列の発現および所望蛋白の産生を可能に
すると共に制御するような、ミルク特異性プロモータま
たは乳房組織で特異的に賦活されるプロモータの、上記
ＤＮＡ配列への結合。

【０００９】組換えポリペプチド：本発明に従い、ポリ
ペプチドがそのミルク中に産生されるところの哺乳動物
の天然ゲノムに対し内生でないＤＮＡ配列によりコード
されるポリペプチド、或いはポリペプチドがそのミルク
中に産生されるところの哺乳動物の天然ゲノムに対し内
生であるならば、そのミルク中での該ポリペプチドの産
生を、本発明のトランスジェニック哺乳動物がそのミル
ク中にて産生するのと同じレベルではもたらさないとこ
ろのＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド。 〔発明の詳細な説明〕

【００１０】本発明は、組換えポリペプチドを製造する
ための方法、ＤＮＡ配列、組成物およびトランスジェニ
ック哺乳動物に関するものである。より詳細には本発明
は、乳房組織にて所望の組換えポリペプチドの分泌およ
び成熟を可能にするようなシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を介し、所望の組換えポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列に作動可能に結合したミルク特異的蛋
白プロモータ或いは乳房組織にて特異的に賦活されるプ
ロモータ配列を含む構造物の１つもしくはそれ以上のコ
ピーをトランスジェニック的に組込むことに関する。こ
の構造物は哺乳動物の胚中にトランスジェニック的に組
込まれ、次いで組換えポリペプチド生産物を発現して授
乳期のトランスジェニック哺乳動物のミルク中にまたは
ミルクと共に分泌される。

【００１１】本発明には、任意の哺乳動物を有効に用い
ることができる。好ましくは、多量のミルクを産生しか
つ長い授乳期間を有する哺乳動物が好適である。好適哺
乳動物は牛、羊、山羊、ネズミ、牛属動物、ラクダおよ
び豚である。勿論、これら哺乳動物のそれぞれは本発明
の所定の発現配列に関し互いに同じ効果でないかもしれ
ない。たとえば、特定のミルク特異的プロモータまたは
シグナル配列は、ある種の哺乳動物において他の哺乳動
物におけるよりも効果が大である。しかしながら、当業
者は本発明の教示に従ってこの種の選択を容易に行うこ
とができる。

【００１２】本発明の各具体例において有用なミルク特
異的蛋白プロモータとしては、カゼインプロモータおよ
びβ−カゼインプロモータまたはκ−カゼインプロモー
タから選択することができる。好ましくは、カゼインプ
ロモータは牛由来のものであり、かつαＳ−１カゼイン
プロモータである。乳房組織で特異的に賦活されかつし
たがって本発明に有用であるプロモータとしては、マウ
ス乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反復配列
（ＬＴＲ）プロモータがある。乳房組織にて特異的に賦
活されるミルク特異的蛋白プロモータは、ｃＤＮＡ配列
またはゲノム配列のいずれかから誘導することができ
る。好ましくは、これらはゲノム由来である。

【００１３】本発明に有用なシグナルペプチドとして
は、真核および原核蛋白の分泌および成熟に有用なミル
ク特異的シグナルペプチドまたはその他のシグナルペプ
チドがある。好ましくは、シグナルペプチドはミルク特
異的シグナルペプチドまたは所望の組換えポリペプチド
生産物のシグナルペプチド（もしあれば）から選択され
る。特に好ましくは、ミルク特異的プロモータに関連す
る。シグナルペプチドの大きさは、本発明にとって重要
でない。唯一の必要とされることは、乳房組織で発現さ
れる所望の組換えポリペプチドの分泌および成熟を行う
のに充分な大きさをペプチドが有することである。

【００１４】本発明の方法により産生させうるポリペプ
チドは、たとえば凝集因子VIIIおよびIX、ヒトもしくは
動物血清アルブミン、組織プラスミノーゲン賦活物質
（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、α−１アンチトリプシン、
動物成長ホルモン、ミュラー氏阻止物質（ＭＩＳ）、細
胞表面蛋白、インシュリン、インターフェロン、インタ
ーロイキン、ミルクリパーゼ、抗ウィルス蛋白、ペプチ
ドホルモン、免疫グロブリン、リポコルチン、並びにそ
の他の組換えポリペプチド生産物を含有する。

【００１５】所望の組換えポリペプチドは、所望のまた
は天然の蛋白の他にアミノ酸を含有する融合蛋白として
産生することもできる。たとえば、本発明の所望の組換
えポリペプチドは、この所望のポリペプチドを安定化さ
せ或いはミルクからの精製をより容易化しかつ迅速にす
るためより大きい組換えポリペプチドの１部として産生
することができる。次いで、融合を破壊しそして所望の
ポリペプチドを分離する。或いは、所望の組換えポリペ
プチドは天然蛋白の断片もしくは誘導体として産生させ
ることもでき、或いは天然蛋白と類似したアミノ酸配列
を有するよう産生させることもできる。これら代案のそ
れぞれは、単に適正なＤＮＡ配列を選択することにより
容易に実施される。

【００１６】好ましくは、本発明の発現系はもしくは構
造物は、所望の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列の下流に３’非翻訳領域をも含む。この領域は明ら
かに発現系のＲＮＡ転写を安定化させ、したがって発現
系からの所望蛋白の収率を増大させる。本発明の構造物
に有用な３’非翻訳領域としては、ポリＡ信号を備える
配列がある。この種の配列は、たとえばＳＶ４０小型ｔ
抗原、カゼイン３’非翻訳領域またはその他の当業界で
周知された３’非翻訳領域から得ることができる。好ま
しくは、３’非翻訳領域はミルク特異的蛋白から誘導さ
れる。３’非翻訳領域の長さは重要でないが、そのポリ
Ａ転写産物の安定化作用が発現配列のＲＮＡを安定化さ
せるのに重要であると思われる。

【００１７】必要に応じ、本発明の発現制御配列はさら
にプロモータとシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列との間に５’ 非翻訳領域をも含む。この種の非翻訳
領域は、好ましくはプロモータに関連する。しかしなが
ら、これらは他の合成、半合成および天然の供給源から
誘導することもできる。この場合も、特定長さは重要で
ないが、これらは発現レベルを向上させるのに有用であ
ると思われる。

【００１８】上記発現系は、当業界で周知された方法を
用いて作成することができる。たとえば、慣用のリンカ
ー、制限部位等を用いる各種の結合技術を使用して良好
な作用をうることができる。好ましくは、本発明の発現
系はより大きなプラスミドの１部として作成される。こ
の種の作成は、当業界で周知されたように適正な構成の
クローン化および選択を効率的に可能にする。特に好ま
しくは、本発明の発現系は、所望の哺乳動物に組込むた
めの残余のプラスミド配列から容易に分離しうるよう、
プラスミド上の便利な制限部位の間に位置する。

【００１９】このような分離および精製の後、本発明の
発現系もしくは構造物をトランスジェニック改変させる
べき哺乳動物の遺伝子プールに添加する。たとえば、こ
の構造物の１個もしくは数個のコピーを、標準的にトラ
ンスジェニック技術により哺乳動物胚のゲノムに組込む
ことができる。

【００２０】哺乳動物をトランスジェニック改変させる
１つの技術は、受精した哺乳動物卵の前核中に構造物を
マイクロインジェクトして、構造物の１つもしくはそれ
以上のコピーを成長する哺乳動物の細胞に保持させるこ
とである。一般に、注入した卵から成長する哺乳動物の
少なくとも４０％は体組織中に少なくとも１個のクロー
ン化構造物のコピーを含有し、これらの「トランスジェ
ニック哺乳動物」は一般に遺伝子を生殖細胞系を介して
次の世代に伝達する。トランスジェニック的に処理され
た胚の成長体を組織のセグメントのサウザン・ブロット
分析により構造物の存在につき試験することができる。
外生クローン化構造物の１つもしくはそれ以上のコピー
がこの種のトランスジェニック胚のゲノムに安定に一体
化され続ければ、トランスジェニック改変した構造物を
有する永久的なトランスジェニック哺乳動物系統を確立
することができる。

【００２１】トランスジェニック改変した哺乳動物の同
腹子を出産後に子孫のゲノム中への構造物の組込みにつ
き分析することができる。好ましくは、この分析は、所
望組換えポリペプチド生産物をコードするＤＮＡ配列ま
たはその断片に対応するプローブを子孫からの染色体物
質にハイブリッド化させて行われる。ゲノム中に構造物
の少なくとも１個のコピーを含有することが判明した哺
乳動物の子孫を成熟させる。これら子孫の雌は、そのミ
ルク中に或いはミルクと共に所望のポリペプチドを産生
する。或いは、トランスジェニック哺乳動物を育種し
て、ミルク中に所望ポリペプチドを産生させるのに有用
な他のトランスジェニック子孫を得ることもできる。

【００２２】

【実施例】

【００２３】

【実施例１】牛αＳ−１カゼイン 牛αＳ−１カゼインを、コスミドベクターＨＣ７９（ベ
ーリンガー・マンハイム社から供給）中で、Ｂ．ホーン
およびＪ．コリンスによりジーン、第11巻、第291〜98
頁(1980)に記載されたように牛胸腺ＤＮＡのコスミドラ
イブラリーとクローン化した。牛胸は屠殺所から入手
し、かつＤＮＡを当業界で周知された標準技術［Ｔ．マ
ニアチス等、「モレキュラ・クローニング：ラボラトリ
ー・マニュアル］、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、第271頁(1982)］により分離した。コス
ミドライブラリーは、標準技術［Ｆ．グロスベルト等、
ジーン、第13巻、第227〜31頁(1981)］を用いて分離し
た。牛胸腺ＤＮＡをＳａｕ３Ａ（ニュー・イングランド
・ビオ・ラブス社から入手）で部分的に切断し、かつこ
れを塩濃度勾配で処理して30〜40ｋｂ断片を増加させ
た。次いで、部分切断されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ切
断されたＨＣ79コスミドベクターと結合させ、次いで製
造業者の推奨に従いλ抽出物（アニルシャム社）でイン
ビトロパッケージングした。次いで、インビトロパッケ
ージングされた物質を用いてイー・コリＫ−１２菌株Ｈ
Ｂ101に感染させ、ついで50μｇ／ｍｌのアンピシリン
(シグマ社)を含有するＬＢプレートで選択した。

【００２４】４５塩基対オリゴヌクレオチドプローブ、
すなわちＣＡＳ-1を用いて、このライブラリーをスクリ
ーニングした。このＣＳＡ-1配列、すなわち５’ＣＡＴ
ＧＧＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＣＴＣ
ＣＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧ３’は、Ｉ.Ｍ.ウ
ィリス等によりＤＮＡ、第1巻、375〜86頁(1982)に記載
されたようにαＳ−１カゼインの部分ｃＤＮＡ配列から
得られた。この配列は成熟牛カゼインのアミノ酸20〜35
に相当する。

【００２５】このスクリーニングの結果、三種のコスミ
ド（Ｃ９，Ｄ４およびＥ１）が分離された。Ｃ９の部分
サブクローンかおよび配列決定は、このコスミドがαＳ
−１カゼイン遺伝子のゲノム配列の一部であることを示
した。

【００２６】次いで、開示された配列［ Ａ．Ｆ．スチ
ュワート等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第12
巻、第3895頁(1984)；Ｍ．ナガオ等、アグリカルチャル
・バイオロジカル・ケミストリー、第48巻、第1663〜67
頁(1984)］に基づきカゼインｃＤＮＡの領域に相当する
数種のオリゴヌクレオチドプローブを合成した。制限マ
ッピングおよびサウザン・ブロット分析[Ｅ．サウザ
ン、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第98巻、
第503頁(1975)]は、コスミドＤ４およびＥ１が構造遺伝
子および上流の９ｋｂ又は5’フランキング配列を有す
ることを確認した。Ｃ９コスミドはカゼイン構造遺伝子
および下流の８ｋｂもしくは３’配列(第１図参照)を含
有した。カゼイン構造配列の転写開始に相当する領域に
おけるコスミドＥ１およびＤ４を配列決定して、この配
列がＬ.Ｌ.ユーリー等、ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ、第１４巻、第1883〜1902頁(1986)に記載されたと
同じ領域の配列に相当することを確認した。

【００２７】αＳ-1カゼインの制御領域は転写開始部の
上流に位置すると思われる。配列決定後、４０ｂｐエク
ソンＩが存在することを確認すると共に、成熟ＣＡＳの
最初の2種のアミノ酸(アルギニンおよびグルタミン)を
コードする配列といっしょにＣＡＳの信号配列がエクソ
ンに存在することも確認した。

【００２８】ＣＡＳプロモータプラスミドを次にように
作成した：第１図のゲノム地図は、制御領域もしくはプ
ロモータ領域がエクソンＩおよびＩＩと一緒に９ｋｂＫ
ｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片としてクローン化されうること
を示している。したがって、Ｅ１コスミドをＫｐｎＩお
よびＢａｍＨＩで切断し、次いでこれを予めＫｐｎＩお
よびＢａｍＨＩで切断されているｐＵＣ１９（ベセスダ
・リサーチ・ラブス社）に結合させた。得られたプラス
ミドｐＣＡＳ1134(第1図参照)は、ＣＡＳプロモータお
よびクローニングに適するＢａｍＨＩ部位を持った信号
配列とを含有した。

【００２９】真核宿主にてゲノム構造物を機能させる、
すなわちトランスジェニック作業を行ってＤＮＡを前核
中に注入するには、原核配列を最初に除去せねばならな
い。原核配列を除去するべく用いた１つの方法は、Ｓａ
ｌＩ部位が真核ＤＮＡに隣接するようにｐＣＡＳ１１３
４を改変することである。ＣＡＳプロモータの上流に位
置するＫｐｎＩ部位を、ＣＡＳ−１１リンカー５’ Ｇ
ＧＴ ＣＧＡ ＣＣＧ ＴＡＣ ３’を用いてＳａｌＩ部位
に変化させ、これをＫｐｎＩで切断した後にプラスミド
に結合させた。得られたプラスミドｐＣＡＳ１１４１
(第１図参照)は、ＣＡＳプロモータに隣接するＳａｌＩ
部位、及びＢａｍＨＩクローン化部位とを含有した。

【００３０】

【実施例２】ＣＡＳ−組換え生産物の作成 本発明の方法により産生しうる１種の組換えポリペプチ
ドは組織プラスミノーゲン賦活物質、すなわちＴＰＡで
ある。下記するように、カゼインシグナルペプチドを用
いて、本発明による構成物を有するトランスジェニック
・マウスの乳腺からＴＰＡの分泌を指令した。この構成
において、カゼインシグナルペプチドのヌクレオチド配
列をＲＮＡ処理(プロセッシング)により成熟ＴＰＡの配
列に融合させた。ＴＰＡの配列はＤ.ペニカ等によりネ
イチャー、第301巻、第214〜21頁(1983)に記載されてい
る。ＴＰＡ遺伝子においてはＣＡＳ遺伝子におけると同
様に、成熟配列からシグナルペプチドを分離するイント
ロンＩＩにＢａｍＨＩ部位が存在する[Ｒ.フッシャー
等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第26
0巻、第11223〜30頁(1985)] 。ＴＰＡのｃＤＮＡは、成
熟ＴＰＡのアミノ酸No.３にてエクソンＩＩＩ中にＢｇ
ｌＩＩ部位を示す。

【００３１】

【００２５】ＴＰＡのゲノムクローン[Ｒ.フッシャー
等、上記]からの１．７ｋｂ断片を、ＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ｌＩＩを用いてサブクローン化した。この１．７Ｋｂ断
片はイントロンＩＩの1部と3’スプライスアクセプタ部
位とＢｇｌＩＩ部位までのエクソンＩＩＩとを含有し
た。この１．７ｋｂ断片を用いて、ＴＰＡのｃＤＮＡク
ローンに見られるＴＰＡ信号配列を置換し、ＢａｍＨＩ
カセットを得た。実施例１に示したように、成熟蛋白の
配列からカゼインシグナルペプチドのための配列を分離
するイントロンＩＩに位置するＢａｍＨＩ部位が存在す
る。ＣＡＳモロモータプラスミドｐＣＡＳ１１４１をＢ
ａｍＨＩで切断し、かつＴＰＡを含有するＢａｍＨＩカ
セットを第１図に示したように、切断されたプラスミド
に結合させてプラスミドｐＣＡＳ１１５１を生ぜしめ、
これはＴＰＡのｃＤＮＡ配列の上流にＣＡＳプロモータ
を有する。この構成物は、ＴＰＡ構造配列がＲＮＡ処理
によりカゼイン信号配列を受け入れることを可能にす
る。

【００３２】次いで、哺乳動物をトランスジェニック改
変させるために使用するＤＮＡを分離した。ｐＣＡＳ１
１５１ＤＮＡをＳａｌＩで完全に切断した。１％アガロ
ースＴＢＥ［マニアチス等、上記］における電気泳動の
後、真核配列に相当する１３ｋｂ断片をゲルから切除
し、かつＤＮＡを電気溶出させた。次いで、ＤＮＡを平
衡ＣｓＣｌ濃度勾配にて１晩遠心分離した。ＤＮＡバン
ドを除去しかつ緩衝剤ＴＮＥ(５ｍＭトリス(ｐＨ７．
４)５ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１ｍＥＤＴＡ（ｐＨ
８）)に対し徹底的に透析した。

【００３３】

【実施例３】マウス中への構成物のトランスジェニック
組込み 成長しているマウス胚中へ所望の遺伝子情報をトランス
ジェニック的に組込む方法は当業界で確立されている
［Ｂ．ホーガン等、「マウス胚の処理；ラボラトリー・
マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（1986）］。Ｃ５７Ｂ１トＣＢ６［ジャクソン
・ラボラトリース社］との間のＦ１世代（スローン・ケ
タリング）交配を用いた。６週令の雌を、ゲスチル（妊
娠雌マウス血清）の注射に続き２日後にヒトコリオゴナ
ドトロピンの注射により排卵過多にした。処理した雌を
２４時間後にＣ５７Ｂ１マウスと交配させた。移植前受
精した胚を、ＤＮＡのマイクロインジェクションおよび
凝妊娠雌への移植のため交配してから１２時間以内に取
り出した。

【００３４】卵を包囲する卵丘細胞をヒアルロニターゼ
でまず最初に切断することにより、構成物を注入した。
構成物は、寸法が３０％〜５０％膨潤するまで胚の前核
中に注入した。次いで、注入した胚（２６２個）を凝妊
娠Ｆ１雌の卵管に移植した。注入されかつ移植された２
６２個の胚のうち、２３匹の子供が産まれた。これらの
テールブロットを行い、かつニック翻訳されたｐＣＡＳ
１１５１ＤＮＡで試験して、その５匹がＣＡＳ配列を有
することを示した。雌ＧＯ子孫のうち２匹を６週間でオ
スに交配して、Ｇ１世代を得た。ｐＣＡＳ１１５１配列
につき、これら交配体の子孫をテールブロットにより試
験した。次いで、分娩後に得られた雌を育成しかつ授乳
させた。ｐＣＡＳ１１５１ＤＮＡ配列を有するこれらの
雌マウスはそのミルク中にＴＰＡを産生したのに対し、
対照は産生しなかった。

【００３５】トランスジェニック雄ＧＯマウスを対照雌
と交配させた。テールブロットによりＧ１子孫を試験
し、かつｐＣＡＳ１１５１配列を有する雌を搾乳用に育
成した。Ｇ１子孫はそのミルク中に０．２〜０．５μｇ
／ｍｌのＴＰＡを産生した。次いで、これらの雌を野生
型Ｆ１と交配させた。ｐＣＡＳ１１５１ＤＮＡ配列を有
する子孫は同レベルのＴＰＡを産生したのに対し、この
配列を持たない子孫はそのミルク中にＴＰＡを産生しな
かった。

【００３６】

【実施例４】大型哺乳動物中へのヒトＴＰＡ配列のトラ
ンスジェニック組込み 少なくとも１回の事前の発情期間の後、羊を胚ドナーと
する前に排卵過多にした。より詳細には、発情サイクル
のほぼ１０日目に、各羊にプロゲスタゲンを含浸した膣
内スポンジ（各スポンジは６０ｍｇの６α−メチル−１
７−α−アセトキシプロゲステロンを含有する）を移植
した。このスポンジを１２日間にわたり移植状態に保持
した。スポンジを取り出す前の３日間及び取り出した翌
日まで、各動物にゴナドトロピン処理を施し、この処理
は毎日２回の筋肉注射により２．５ｍｇの豚卵胞刺激ホ
ルモンを投与して行った。発情の開始時点で、羊を受精
可能なラムに交配させるか或いは１頭当たり０．２ｍｌ
の洗浄したラム精子を子宮に受精させた。スポンジ除去
してから７２時間以内に、１細胞受精胚および分裂胚を
麻酔された羊の生殖管から外科的に採取し、その際各卵
管のカニューレ挿入した漏斗管端部を介し子宮−卵管接
合部から熱失活胎児牛血清１０％を含有する約６ｍｌの
ハムスＦ-１０媒体で逆行洗浄した。洗浄液を集め、か
つ胚を解剖用顕微鏡の下で剔出した。

【００３７】次いで、この胚を１０％の胎児牛血清を含
有する新鮮なハムスＦ−１０に移し、かつマイクロマニ
ピュレータを装着した倒立顕微鏡の台に載せた。次い
で、各胚には、たとえばＲ.Ｌ.プリンスターン等、セ
ル、第２７巻、第223〜31頁（1981）に示された方法に
より、ｐＣＡＳ１１５１のような複数の構成物をマイク
ロインジェクトした。次いで、胚を１０ｍｌのハムスＦ
-１０と共にガラスピペット先端に吸引し、かつ同期さ
れた受容体羊における卵管の房状端部に1〜３ｃｍ排出
させた。次いで、これらの羊を適当な時間にわたり妊娠
させ、かつその子孫をＴＰＡをコードするＤＮＡ配列の
組込みにつき試験した。これらトランスジェニック子孫
の雌は、そのミルク中にＴＰＡを産生した。

【００３８】プラスミドｐＣＡＳ１１５１を含有する本
発明の構成物は1987年6月23日付でメリーランド州、ロ
ックビル在、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに委託されかつＬＥ３９２／ｐＣＡＳ１１５１と
して同定された培養物により代表され、ここでｐＣＡＳ
１１５１はイー・コリK12中に存在する。これは、受託
番号ＡＴＣＣ６７４５０が付与されている。

【００３９】以上、本発明の多くの実施例につき説明し
たが、この基本的構成を変化させて本発明の方法および
構成物を用いるほかの具体例も与え得ることが了解され
よう。したがって、本発明の範囲は実施例として上記に
説明した特定実施例のみに限定されないことが了解され
よう。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は本発明のプラスミド、ｐＣＡＳ１１５
１の構成を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組換えポリペプチドを含有する非ヒト哺
   乳動物のミルクにおいて、ミルク特異的プロポーターに
   作動可能に結合されている組換えポリペプチドをコード
   するＤＮＡ配列及びシグナルペプチド配列を含む発現系
   を含む非ヒト哺乳動物によって該組換えポリペプチドが
   作られ、該組換えポリペプチドが、凝集因子VIIIおよび
   IX、組織プラスミノーゲン賦活物質（ＴＰＡ）、ウロキ
   ナーゼ、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロ
   ン、インターロイキン、ペプチドホルモン、免疫グロブ
   リン、並びにそれらの生物学的に活性な断片より成る群
   から選ばれるところの、上記ミルク。
2. 【請求項２】 プロモーターがカゼインプロモーターで
   ある請求項１のミルク。
3. 【請求項３】 プロモーターがα−Ｓ１カゼインプロモ
   ーターである請求項１のミルク。
4. 【請求項４】 組換えポリペプチドが免疫グロブリンで
   ある請求項１〜３のいずれか１つに記載のミルク。