JP2000300115A - 非ヒト哺乳動物のミルク - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Dairy Products (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 組換生産物が、慣用の組換えポリペプチド産
生技術によるよりも簡便に、かつ顕著に低いコストで製
造すること 【解決手段】 組換えポリペプチドを含有する非ヒト哺
乳動物ミルクであって、該組換えポリペプチドが該哺乳
動物によって該ミルクとともにか、またはその中に産生
される、ミルク。
生技術によるよりも簡便に、かつ顕著に低いコストで製
造すること 【解決手段】 組換えポリペプチドを含有する非ヒト哺
乳動物ミルクであって、該組換えポリペプチドが該哺乳
動物によって該ミルクとともにか、またはその中に産生
される、ミルク。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳動物のミルク
における組換蛋白の産生に関するものである。特に本発
明は、シグナルペプチドおよび所望の組換蛋白生産物を
コードするＤＮＡ配列に作用結合した少なくとも１種の
ミルク特異性蛋白プロモータからなる発現系に関するも
のである。この種の系を哺乳動物中にトランスジェニッ
ク的（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ）に組込むと、授
乳期のトランスジェニック哺乳動物のミルクに組換蛋白
が発現される。さらに本発明は、所望の組換生産物をミ
ルク中に産生するトランスジェニック哺乳動物に関する
ものである。本発明の発現系およびトランスジェニック
改変した哺乳動物により産生される組換生産物は、慣用
の組換蛋白産生技術によるよりも顕著に低いコストで製
造することができる。
における組換蛋白の産生に関するものである。特に本発
明は、シグナルペプチドおよび所望の組換蛋白生産物を
コードするＤＮＡ配列に作用結合した少なくとも１種の
ミルク特異性蛋白プロモータからなる発現系に関するも
のである。この種の系を哺乳動物中にトランスジェニッ
ク的（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ）に組込むと、授
乳期のトランスジェニック哺乳動物のミルクに組換蛋白
が発現される。さらに本発明は、所望の組換生産物をミ
ルク中に産生するトランスジェニック哺乳動物に関する
ものである。本発明の発現系およびトランスジェニック
改変した哺乳動物により産生される組換生産物は、慣用
の組換蛋白産生技術によるよりも顕著に低いコストで製
造することができる。
【０００２】
【従来の技術】組換ＤＮＡ技術は、医学上および産業上
重要な蛋白およびグリコ蛋白をコードする遺伝子のクロ
ーン化および発現を可能にした。この種の生産物はたと
えばインシュリン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因
子、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン賦活物質、
腫瘍壊死因子、リポコルチン、凝集因子ＶＩＩＩおよび
ＩＸ、インターフェロン、コロニー刺戟因子、インター
ロイキンおよびウロキナーゼを包含する。
重要な蛋白およびグリコ蛋白をコードする遺伝子のクロ
ーン化および発現を可能にした。この種の生産物はたと
えばインシュリン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因
子、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン賦活物質、
腫瘍壊死因子、リポコルチン、凝集因子ＶＩＩＩおよび
ＩＸ、インターフェロン、コロニー刺戟因子、インター
ロイキンおよびウロキナーゼを包含する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
重要な蛋白の多くは大きく（３０Ｋｄを超える分子
量）、で分泌され、適正な折畳みを維持するにはスルフ
ヒドリル結合を必要とし、グリコシル化されておりかつ
プロテアーゼに対し感受性である。その結果、原核生物
細胞におけるこの種の生産物の組換産生は、所望の組換
えポリペプチドが不適正に処理され、適正なグリルシル
化を欠如し、或いは不適正に折畳まれるので、満足しう
るものでないことが判明している。したがって、これら
の組換蛋白は培養された真核細胞にて産生させねばなら
なかった。この技術は、細胞培養法の変動に基づき高価
となりかつしばしば信頼性がないと判明した。たとえ
ば、平均収率は培地１ｌ当たり組換蛋白１０ｍｇであ
り、その結果コストは典型的には組換蛋白１ｇ当たり１
０００ドルを超える。したがって、これら組換えポリペ
プチドは培養された真核生物細胞にて産生させねばなら
なかった。
重要な蛋白の多くは大きく（３０Ｋｄを超える分子
量）、で分泌され、適正な折畳みを維持するにはスルフ
ヒドリル結合を必要とし、グリコシル化されておりかつ
プロテアーゼに対し感受性である。その結果、原核生物
細胞におけるこの種の生産物の組換産生は、所望の組換
えポリペプチドが不適正に処理され、適正なグリルシル
化を欠如し、或いは不適正に折畳まれるので、満足しう
るものでないことが判明している。したがって、これら
の組換蛋白は培養された真核細胞にて産生させねばなら
なかった。この技術は、細胞培養法の変動に基づき高価
となりかつしばしば信頼性がないと判明した。たとえ
ば、平均収率は培地１ｌ当たり組換蛋白１０ｍｇであ
り、その結果コストは典型的には組換蛋白１ｇ当たり１
０００ドルを超える。したがって、これら組換えポリペ
プチドは培養された真核生物細胞にて産生させねばなら
なかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、トランスジェ
ニック改変された哺乳動物のミルクにて多量の組換えポ
リペプチド生産物を産生する効率的手段を提供すること
により、これらの問題を解決する。本発明によれば、所
望の蛋白をコードするＤＮＡ配列は、発現系においてミ
ルク特異性蛋白プロモータ或いは乳房組織にて特異的に
賦活される任意のプロモータ配列に、シグナルペプチド
をコードするＤＮＡ配列を介して作動可能に結合され、
このシグナルペプチドは乳房組織にて所望蛋白の分泌お
よび成熟を可能にする。より好ましくは、発現系は所望
の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流に
３′非翻訳領域をも含む。この非翻訳領域は、発現系の
ｒＤＮＡ転写産物を安定化させることができる。必要に
応じ発現系は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列の上流に５′非翻訳領域をも含む。
ニック改変された哺乳動物のミルクにて多量の組換えポ
リペプチド生産物を産生する効率的手段を提供すること
により、これらの問題を解決する。本発明によれば、所
望の蛋白をコードするＤＮＡ配列は、発現系においてミ
ルク特異性蛋白プロモータ或いは乳房組織にて特異的に
賦活される任意のプロモータ配列に、シグナルペプチド
をコードするＤＮＡ配列を介して作動可能に結合され、
このシグナルペプチドは乳房組織にて所望蛋白の分泌お
よび成熟を可能にする。より好ましくは、発現系は所望
の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流に
３′非翻訳領域をも含む。この非翻訳領域は、発現系の
ｒＤＮＡ転写産物を安定化させることができる。必要に
応じ発現系は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列の上流に５′非翻訳領域をも含む。
【０００５】この発現系は標準的なトランスジェニック
（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）技術により宿主ゲノム中にト
ランスジェニック的に導入される。その結果、構造物も
しくは系の１つもしくはそれ以上のコピーがトランスジ
ェニック哺乳動物のゲノムに組込まれる。発現系の存在
は、雌哺乳動物が組換えポリペプチド生産物を産生する
と共にミルク中へまたはミルクと一緒に分泌することを
可能にする。この種の方法は、所望蛋白の低コストかつ
高レベルの製造を可能にする。
（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）技術により宿主ゲノム中にト
ランスジェニック的に導入される。その結果、構造物も
しくは系の１つもしくはそれ以上のコピーがトランスジ
ェニック哺乳動物のゲノムに組込まれる。発現系の存在
は、雌哺乳動物が組換えポリペプチド生産物を産生する
と共にミルク中へまたはミルクと一緒に分泌することを
可能にする。この種の方法は、所望蛋白の低コストかつ
高レベルの製造を可能にする。
【０００６】本発明は、組換えポリペプチドを含有する
非ヒト哺乳動物ミルクであって、該組換えポリペプチド
が該哺乳動物によって該ミルクとともにか、またはその
中に産生される、ミルクに関する。
非ヒト哺乳動物ミルクであって、該組換えポリペプチド
が該哺乳動物によって該ミルクとともにか、またはその
中に産生される、ミルクに関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本明細書に使用する組換えポリペ
プチドおよび作動可能に結合という用語は次の意味を有
する： 作動可能に結合：所望蛋白をコードするＤＮＡ配列の発
現および所望蛋白の産生を可能にすると共に制御するよ
うな、ミルク特異性プロモータまたは乳房組織で特異的
に、賦活されるプロモータの、上記ＤＮＡ配列への結
合。
プチドおよび作動可能に結合という用語は次の意味を有
する： 作動可能に結合：所望蛋白をコードするＤＮＡ配列の発
現および所望蛋白の産生を可能にすると共に制御するよ
うな、ミルク特異性プロモータまたは乳房組織で特異的
に、賦活されるプロモータの、上記ＤＮＡ配列への結
合。
【０００８】組換ポリペプチド：本発明に従い蛋白又は
ペプチドがそのミルク中に産生されるところの哺乳動物
の天然ゲノムに対し内生でないＤＮＡ配列によりコード
される蛋白もしくはペプチド、或いは蛋白又はペプチド
がそのミルク中に産生されるところの哺乳動物の天然ゲ
ノムに対し内生であるならば、そのミルク中での該蛋白
もしくはペプチドの産生を、本発明のトランスジェニッ
ク哺乳動物がそのミルク中にて産生するのと同じレベル
ではもたらさないところのＤＮＡ配列によりコードされ
るポリペプチド。
ペプチドがそのミルク中に産生されるところの哺乳動物
の天然ゲノムに対し内生でないＤＮＡ配列によりコード
される蛋白もしくはペプチド、或いは蛋白又はペプチド
がそのミルク中に産生されるところの哺乳動物の天然ゲ
ノムに対し内生であるならば、そのミルク中での該蛋白
もしくはペプチドの産生を、本発明のトランスジェニッ
ク哺乳動物がそのミルク中にて産生するのと同じレベル
ではもたらさないところのＤＮＡ配列によりコードされ
るポリペプチド。
【０００９】［発明の詳細な説明］本発明は、組換えポ
リペプチドを製造するための方法、ＤＮＡ配列、組成物
およびトランスジェニック哺乳動物に関するものであ
る。より詳細には本発明は、乳房組織にて所望の組換え
ポリペプチドの分泌および成熟を可能にするようなシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を介し、所望の組
換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に
結合したミルク特異性蛋白プロモータ或いは乳房組織に
て特異的に賦活されるプロモータ配列を含む構造物の１
つもしくはそれ以上のコピーをトランスジェニック的に
組込むことに関する。この構造物は哺乳動物の胚中にト
ランスジェニック的に組込まれ、次いで組換えポリペプ
チド生産物を発現して授乳期のトランスジェニック哺乳
動物のミルク中にまたはミルクと共に分泌される。
リペプチドを製造するための方法、ＤＮＡ配列、組成物
およびトランスジェニック哺乳動物に関するものであ
る。より詳細には本発明は、乳房組織にて所望の組換え
ポリペプチドの分泌および成熟を可能にするようなシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を介し、所望の組
換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に
結合したミルク特異性蛋白プロモータ或いは乳房組織に
て特異的に賦活されるプロモータ配列を含む構造物の１
つもしくはそれ以上のコピーをトランスジェニック的に
組込むことに関する。この構造物は哺乳動物の胚中にト
ランスジェニック的に組込まれ、次いで組換えポリペプ
チド生産物を発現して授乳期のトランスジェニック哺乳
動物のミルク中にまたはミルクと共に分泌される。
【００１０】本発明には、任意の哺乳動物を有効に用い
ることができる。好ましくは、多量のミルクを産生しか
つ長い授乳期間を有する哺乳動物が好適である。好適哺
乳動物は牛、羊、山羊、ネズミ、牛属動物、ラクダおよ
び豚である。勿論、これら哺乳動物のそれぞれは本発明
の所定の発現配列に関し互いに同じ効果を有するもので
ない。たとえば、特定のミルク特異性プロモータまたは
シグナル配列は、或る種の哺乳動物において他の哺乳動
物におけるよりも効果が大である。しかしながら、当業
者は本発明の教示にしたがってこの種の選択を容易に行
なうことができる。
ることができる。好ましくは、多量のミルクを産生しか
つ長い授乳期間を有する哺乳動物が好適である。好適哺
乳動物は牛、羊、山羊、ネズミ、牛属動物、ラクダおよ
び豚である。勿論、これら哺乳動物のそれぞれは本発明
の所定の発現配列に関し互いに同じ効果を有するもので
ない。たとえば、特定のミルク特異性プロモータまたは
シグナル配列は、或る種の哺乳動物において他の哺乳動
物におけるよりも効果が大である。しかしながら、当業
者は本発明の教示にしたがってこの種の選択を容易に行
なうことができる。
【００１１】本発明の各具体例において有用なミルク特
異性蛋白プロモータとしては、カゼインプロモータおよ
びβ−ラクトグロブリンプロモータがある。たとえばガ
ゼインプロモータはα−カゼインプロモータ、β−カゼ
インプロモータまたはκ−カゼインプロモータから選択
することができる。好ましくは、カゼインプロモータは
牛由来のものであり、かつαＳ−１カゼインプロモータ
である。乳房組織で特異的に賦活されかつしたがって本
発明に有用であるプロモータとしては、マウス乳房腫瘍
ウィルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プ
ロモータがある。乳房組織にて特異的に賦活されるミル
ク特異性蛋白プロモータは、ｃＤＮＡ配列またはゲノム
配列のいずれかから誘導することができる。好ましく
は、これらは性質上ゲノム性である。
異性蛋白プロモータとしては、カゼインプロモータおよ
びβ−ラクトグロブリンプロモータがある。たとえばガ
ゼインプロモータはα−カゼインプロモータ、β−カゼ
インプロモータまたはκ−カゼインプロモータから選択
することができる。好ましくは、カゼインプロモータは
牛由来のものであり、かつαＳ−１カゼインプロモータ
である。乳房組織で特異的に賦活されかつしたがって本
発明に有用であるプロモータとしては、マウス乳房腫瘍
ウィルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プ
ロモータがある。乳房組織にて特異的に賦活されるミル
ク特異性蛋白プロモータは、ｃＤＮＡ配列またはゲノム
配列のいずれかから誘導することができる。好ましく
は、これらは性質上ゲノム性である。
【００１２】本発明に有用なシグナルペプチドとして
は、真核および原核蛋白の分泌および成熟に有用なミル
ク特異性シグナルペプチドまたはその他のシグナルペプ
チドがある。好ましくは、シグナルペプチドはミルク特
異性シグナルペプチドまたは必要に応じ所望の組換えポ
リペプチド生産物のシグナルペプチドから選択される。
特に好ましくは、ミルク特異性シグナルペプチドは本発
明の発現系に使用されるミルク特異性プロモータに関連
する。シグナルペプチドの大きさは、本発明にとって臨
界的でない。唯一の必要とされることは、乳房組織で発
現される所望の組換えポリペプチドの分泌および成熟を
行なうのに充分な大きさをペプチドが有することであ
る。
は、真核および原核蛋白の分泌および成熟に有用なミル
ク特異性シグナルペプチドまたはその他のシグナルペプ
チドがある。好ましくは、シグナルペプチドはミルク特
異性シグナルペプチドまたは必要に応じ所望の組換えポ
リペプチド生産物のシグナルペプチドから選択される。
特に好ましくは、ミルク特異性シグナルペプチドは本発
明の発現系に使用されるミルク特異性プロモータに関連
する。シグナルペプチドの大きさは、本発明にとって臨
界的でない。唯一の必要とされることは、乳房組織で発
現される所望の組換えポリペプチドの分泌および成熟を
行なうのに充分な大きさをペプチドが有することであ
る。
【００１３】本発明の方法により産生させうる蛋白生産
物は、たとえば凝集因子ＶＩＩＩおよびＩＸ、ヒトもし
くは動物血清アルブミン、組織プラスミノーゲン賦活物
質（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、α−１アンチトリプシ
ン、動物成長ホルモン、ミュラー氏阻止物質（ＭＩ
Ｓ）、細胞表面蛋白、インシュリン、インターフェロ
ン、インターロイキン、ミルクリパーゼ、抗ウィルス蛋
白、ペプチドホルモン、免疫グロブリン、リポコルチ
ン、並びにその他の組換えポリペプチド生産物を包含す
る。
物は、たとえば凝集因子ＶＩＩＩおよびＩＸ、ヒトもし
くは動物血清アルブミン、組織プラスミノーゲン賦活物
質（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、α−１アンチトリプシ
ン、動物成長ホルモン、ミュラー氏阻止物質（ＭＩ
Ｓ）、細胞表面蛋白、インシュリン、インターフェロ
ン、インターロイキン、ミルクリパーゼ、抗ウィルス蛋
白、ペプチドホルモン、免疫グロブリン、リポコルチ
ン、並びにその他の組換えポリペプチド生産物を包含す
る。
【００１４】所望の組換えポリペプチドは、所望のまた
は天然の蛋白の他にアミノ酸を含有する融合蛋白として
産生することもできる。たとえば、本発明の所望の組換
えポリペプチドは、この所望の蛋白を安定化させ或いは
ミルクからの精製をより容易化しかつ迅速にするため大
型組換えポリペプチドの１部として産生することができ
る。次いで、融合を破壊しかつ所望の蛋白を分離する。
或いは、所望の組換えポリペプチドは天然蛋白の断片も
しくは誘導体として産生させることもでき、或いは天然
蛋白と類似したアミノ酸配列を有するよう産生させるこ
ともできる。これら代案のそれぞれは、単に適正なＤＮ
Ａ配列を選択することにより容易に実施される。
は天然の蛋白の他にアミノ酸を含有する融合蛋白として
産生することもできる。たとえば、本発明の所望の組換
えポリペプチドは、この所望の蛋白を安定化させ或いは
ミルクからの精製をより容易化しかつ迅速にするため大
型組換えポリペプチドの１部として産生することができ
る。次いで、融合を破壊しかつ所望の蛋白を分離する。
或いは、所望の組換えポリペプチドは天然蛋白の断片も
しくは誘導体として産生させることもでき、或いは天然
蛋白と類似したアミノ酸配列を有するよう産生させるこ
ともできる。これら代案のそれぞれは、単に適正なＤＮ
Ａ配列を選択することにより容易に実施される。
【００１５】好ましくは、本発明の発現系はもしくは構
造物は、所望の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列の下流に３′非翻訳領域をも含む。この領域は明ら
かに発現系のＲＮＡ転写を安定化させ、したがって発現
系からの所望蛋白の収率を増大させる。本発明の構造物
に有用な３′非翻訳領域としては、ポリＡシグナルを備
える配列がある。この種の配列は、たとえばＳＶ４０小
型ｔ抗原、カゼイン３′非翻訳領域またはその他の当業
界で周知された３′非翻訳領域配列から得ることができ
る。好ましくは、３′非翻訳領域はミルク特異性蛋白か
ら誘導される。３′非翻訳領域の長さは臨界的でない
が、そのポリＡ転写産物の安定化作用が発現配列のＲＮ
Ａを安定化させるのに重要であると思われる。
造物は、所望の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列の下流に３′非翻訳領域をも含む。この領域は明ら
かに発現系のＲＮＡ転写を安定化させ、したがって発現
系からの所望蛋白の収率を増大させる。本発明の構造物
に有用な３′非翻訳領域としては、ポリＡシグナルを備
える配列がある。この種の配列は、たとえばＳＶ４０小
型ｔ抗原、カゼイン３′非翻訳領域またはその他の当業
界で周知された３′非翻訳領域配列から得ることができ
る。好ましくは、３′非翻訳領域はミルク特異性蛋白か
ら誘導される。３′非翻訳領域の長さは臨界的でない
が、そのポリＡ転写産物の安定化作用が発現配列のＲＮ
Ａを安定化させるのに重要であると思われる。
【００１６】必要に応じ、本発明の発現制御配列はさら
にプロモータとシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列との間に５′非翻訳領域をも含む。この種の非翻訳領
域は、好ましくはプロモータに関連する。しかしなが
ら、これらは他の合成、半合成および天然の供給源から
誘導することもできる。この場合も、特定長さは重要で
ないが、これらは発現レベルを向上させるのに有用であ
ると思われる。
にプロモータとシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列との間に５′非翻訳領域をも含む。この種の非翻訳領
域は、好ましくはプロモータに関連する。しかしなが
ら、これらは他の合成、半合成および天然の供給源から
誘導することもできる。この場合も、特定長さは重要で
ないが、これらは発現レベルを向上させるのに有用であ
ると思われる。
【００１７】上記発現系は、当業界で周知された方法を
用いて作成することができる。たとえば、慣用のリンカ
ー、制限部位等を用いる各種の結合技術を使用して良好
な作用をうることができる。好ましくは、本発明の発現
系は大型プラスミドの１部として作成される。この種の
作成は、当業界で周知されたように適正な構成のクロー
ン化および選択を効率的に可能にする。特に好ましく
は、本発明の発現系は、所望の哺乳動物に組込むため残
余のプラスミド配列から容易に分離しうるよう、プラス
ミド上の便利な制限部位の間に位置する。
用いて作成することができる。たとえば、慣用のリンカ
ー、制限部位等を用いる各種の結合技術を使用して良好
な作用をうることができる。好ましくは、本発明の発現
系は大型プラスミドの１部として作成される。この種の
作成は、当業界で周知されたように適正な構成のクロー
ン化および選択を効率的に可能にする。特に好ましく
は、本発明の発現系は、所望の哺乳動物に組込むため残
余のプラスミド配列から容易に分離しうるよう、プラス
ミド上の便利な制限部位の間に位置する。
【００１８】このような分離および精製の後、本発明の
発現系もしくは構成物をトランスジェニック改変させる
べき哺乳動物の遺伝子プールに添加する。たとえば、こ
の構成物の１個もしくは数個のコピーを、標準的トラン
スジェニック技術により哺乳動物胚のゲノムに組込むこ
とができる。
発現系もしくは構成物をトランスジェニック改変させる
べき哺乳動物の遺伝子プールに添加する。たとえば、こ
の構成物の１個もしくは数個のコピーを、標準的トラン
スジェニック技術により哺乳動物胚のゲノムに組込むこ
とができる。
【００１９】哺乳動物をトランスジェニック改変させる
１つの技術は、受精した哺乳動物卵の前核中に構成物を
マイクロインジェクトして、構成物の１つもしくはそれ
以上のコピーを成長哺乳動物の細胞に保持させることで
ある。一般に、注入した卵から成長する哺乳動物の少な
くとも４０％は体組織中に少なくとも１個のクローン化
構成物のコピーを含有し、これらの「トランスジェニッ
ク哺乳動物」は一般に遺伝子を生殖細胞系を介して次の
世代に伝達る。
１つの技術は、受精した哺乳動物卵の前核中に構成物を
マイクロインジェクトして、構成物の１つもしくはそれ
以上のコピーを成長哺乳動物の細胞に保持させることで
ある。一般に、注入した卵から成長する哺乳動物の少な
くとも４０％は体組織中に少なくとも１個のクローン化
構成物のコピーを含有し、これらの「トランスジェニッ
ク哺乳動物」は一般に遺伝子を生殖細胞系を介して次の
世代に伝達る。
【００２０】トランスジェニック的に処理された胚の成
長体を組織のセグメントのサウザン・ブロット分析によ
り構成物の存在につき試験することができる。外生クロ
ーン化構成物の１つもしくはそれ以上のコピーがこの種
のトランスジェニック胚のゲノムに安定に一体化され続
ければ、トランスジェニック改変した構成物を有する永
久的なトランスジェニック哺乳動物ラインを確立するこ
とができる。
長体を組織のセグメントのサウザン・ブロット分析によ
り構成物の存在につき試験することができる。外生クロ
ーン化構成物の１つもしくはそれ以上のコピーがこの種
のトランスジェニック胚のゲノムに安定に一体化され続
ければ、トランスジェニック改変した構成物を有する永
久的なトランスジェニック哺乳動物ラインを確立するこ
とができる。
【００２１】トランスジェニック改変した哺乳動物の同
腹子を出産後に子孫のゲノム中への構成物の組込みにつ
き分析することができる。好ましくは、この分析は、所
望組換えポリペプチド生産物をコードするＤＮＡ配列ま
たはその断片に対応するプローブを子孫からの染色体物
質にハイブリッド化させて行なわれる。ゲノム中に構成
物の少なくとも１個のコピーを含有することが判明した
哺乳動物の子孫を成熟させる。これら子孫の雌は、その
ミルク中に或いはミルクと共に所望の蛋白を産生する。
或いは、トランスジェニック哺乳動物を育種して、ミル
ク中に所望蛋白を産生させるのに有用な他のトランスジ
ェニック子孫を得ることもできる。
腹子を出産後に子孫のゲノム中への構成物の組込みにつ
き分析することができる。好ましくは、この分析は、所
望組換えポリペプチド生産物をコードするＤＮＡ配列ま
たはその断片に対応するプローブを子孫からの染色体物
質にハイブリッド化させて行なわれる。ゲノム中に構成
物の少なくとも１個のコピーを含有することが判明した
哺乳動物の子孫を成熟させる。これら子孫の雌は、その
ミルク中に或いはミルクと共に所望の蛋白を産生する。
或いは、トランスジェニック哺乳動物を育種して、ミル
ク中に所望蛋白を産生させるのに有用な他のトランスジ
ェニック子孫を得ることもできる。
【００２２】
【実施例】（実施例１ 牛αＳ−１カゼイン）牛αＳ−
１カゼインを、コスミドベクターＨＣ７９（ベーリンガ
ー・マンハイム社から供給）にてＢ．ホーンおよびＪ．
コリンスによりジーン、第１１巻、第２９１〜９８頁
（１９８０）に記載されたように牛胸腺ＤＮＡのコスミ
ド保存物とクローン化した。胸腺は屠殺所から入手し、
かつＤＮＡを当業界で周知された標準技術［Ｔ．マニア
チス等、「モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・
マューアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、第２７１頁（１９８２）］により分離した。
コスミド保存物は、標準技術［Ｆ．グロスベルト等、ジ
ーン、第１３巻、第２２７〜３１頁（１９８２）］を用
いて分離した。牛胸腺ＤＮＡをＳａｕ３Ａ（ニュー・イ
ングランド・ビオ・ラブス社から入手）で部分的に切断
し、かつこれを塩濃度勾配で処理して３０〜４０ｋｂ断
片を増加させた。次いで、部分切断されたＤＮＡ断片を
ＢａｍＨ Ｉ切断されたＨＣ７９コスミドベクターと結
合させ、次いで製造業者の推奨に従いλ抽出物（アメル
シャム社）でインビトロパッケージングした。次いで、
インビトロパッケージングされた物質を用いてイー・コ
リＫ−１２菌株ＨＢ１０１に感染させ、次いで５０μｇ
／ｍｌのアンピシリン（シグマ社）を含有するＬＢプレ
ートで選択した。
１カゼインを、コスミドベクターＨＣ７９（ベーリンガ
ー・マンハイム社から供給）にてＢ．ホーンおよびＪ．
コリンスによりジーン、第１１巻、第２９１〜９８頁
（１９８０）に記載されたように牛胸腺ＤＮＡのコスミ
ド保存物とクローン化した。胸腺は屠殺所から入手し、
かつＤＮＡを当業界で周知された標準技術［Ｔ．マニア
チス等、「モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・
マューアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、第２７１頁（１９８２）］により分離した。
コスミド保存物は、標準技術［Ｆ．グロスベルト等、ジ
ーン、第１３巻、第２２７〜３１頁（１９８２）］を用
いて分離した。牛胸腺ＤＮＡをＳａｕ３Ａ（ニュー・イ
ングランド・ビオ・ラブス社から入手）で部分的に切断
し、かつこれを塩濃度勾配で処理して３０〜４０ｋｂ断
片を増加させた。次いで、部分切断されたＤＮＡ断片を
ＢａｍＨ Ｉ切断されたＨＣ７９コスミドベクターと結
合させ、次いで製造業者の推奨に従いλ抽出物（アメル
シャム社）でインビトロパッケージングした。次いで、
インビトロパッケージングされた物質を用いてイー・コ
リＫ−１２菌株ＨＢ１０１に感染させ、次いで５０μｇ
／ｍｌのアンピシリン（シグマ社）を含有するＬＢプレ
ートで選択した。
【００２３】４５塩基対オリゴヌクレオチドプローブ、
すなわちＣＡＳ−１を用いて、この保存物をスクリーニ
ングした。このＣＳＡ−１配列、すなわち５′ＣＡＴＧ
ＧＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＣＴＣＣ
ＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧ３′は、Ｉ．Ｍ．ウ
ィルス等によりＤＮＡ、第１巻、第３７５〜８６頁（１
９８２）に記載されたようにαＳ−１カゼインの部分ｃ
ＤＮＡ配列から得られた。この配列は成熟牛カゼインの
アミノ酸２０〜３５に相当する。
すなわちＣＡＳ−１を用いて、この保存物をスクリーニ
ングした。このＣＳＡ−１配列、すなわち５′ＣＡＴＧ
ＧＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＣＴＣＣ
ＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧ３′は、Ｉ．Ｍ．ウ
ィルス等によりＤＮＡ、第１巻、第３７５〜８６頁（１
９８２）に記載されたようにαＳ−１カゼインの部分ｃ
ＤＮＡ配列から得られた。この配列は成熟牛カゼインの
アミノ酸２０〜３５に相当する。
【００２４】このスクリーニングの結果、３種のコスミ
ド（Ｃ９、Ｄ４およびＥ１）が分離された。Ｃ９の部分
サブクローン化および配列決定は、このコスミドがαＳ
−１カゼイン遺伝子のゲノム配列の１部であることを示
した。
ド（Ｃ９、Ｄ４およびＥ１）が分離された。Ｃ９の部分
サブクローン化および配列決定は、このコスミドがαＳ
−１カゼイン遺伝子のゲノム配列の１部であることを示
した。
【００２５】次いで、開示された配列［Ａ．Ｆ．スチュ
ワート等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第１２
巻、第３８９５頁（１９８４）；Ｍ．ナガオ等、アグリ
カルチャル・バイオロジカル・ケミストリー、第４８
巻、第１６６３〜６７頁（１９８４）］に基づきカゼイ
ンｃＤＮＡの領域に相当する数種のオリゴヌクレオチド
プローブを合成した。制限マッピングおよびサウザン・
ブロット分析［Ｅ．サウザン、ジャーナル・モレキュラ
・バイオロジー、第９８巻、第５０３頁（１９７５）］
は、コスミドＤ４およびＥ１が構造遺伝子および上述の
９ｋｂまたは５′フランキング配列を有することを確認
した。Ｃ９コスミドはカゼイン構造遺伝子および下流の
８ｋｂもしくは３′配列（第１図参照）を含有した。カ
ゼイン構造配列の転写開始に相当する領域におけるコス
ミドＥ１およびＤ４を配列決定して、この配列がＬ．
Ｌ．ユーリー等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、
第１４巻、第１８８３〜１９０２頁（１９８６）に記載
されたと同じ領域の配列に相当することを確認した。
ワート等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第１２
巻、第３８９５頁（１９８４）；Ｍ．ナガオ等、アグリ
カルチャル・バイオロジカル・ケミストリー、第４８
巻、第１６６３〜６７頁（１９８４）］に基づきカゼイ
ンｃＤＮＡの領域に相当する数種のオリゴヌクレオチド
プローブを合成した。制限マッピングおよびサウザン・
ブロット分析［Ｅ．サウザン、ジャーナル・モレキュラ
・バイオロジー、第９８巻、第５０３頁（１９７５）］
は、コスミドＤ４およびＥ１が構造遺伝子および上述の
９ｋｂまたは５′フランキング配列を有することを確認
した。Ｃ９コスミドはカゼイン構造遺伝子および下流の
８ｋｂもしくは３′配列（第１図参照）を含有した。カ
ゼイン構造配列の転写開始に相当する領域におけるコス
ミドＥ１およびＤ４を配列決定して、この配列がＬ．
Ｌ．ユーリー等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、
第１４巻、第１８８３〜１９０２頁（１９８６）に記載
されたと同じ領域の配列に相当することを確認した。
【００２６】αＳ−１カゼインの制御領域は転写開始部
の上流に位置すると思われる。配列決定後、４０ｂｐエ
クソンＩが存在することを確認すると共に、成熟ＣＡＳ
の最初の２種のアミノ酸（アルギニンおよびグルタミ
ン）をコードする配列と一緒にＣＡＳのシグナル配列が
エクソンＩＩに存在することも確認した。
の上流に位置すると思われる。配列決定後、４０ｂｐエ
クソンＩが存在することを確認すると共に、成熟ＣＡＳ
の最初の２種のアミノ酸（アルギニンおよびグルタミ
ン）をコードする配列と一緒にＣＡＳのシグナル配列が
エクソンＩＩに存在することも確認した。
【００２７】ＣＡＳプロモータプラスミドを次のように
作成した：第１図のゲノム地図は、制御領域もしくはプ
ロモータ領域がエクソンＩおよびＩＩと一緒に９ｋｂ
Ｋｐｎ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ断片としてクローン化されう
ることを示している。したがって、Ｅ１コスミドをＫｐ
ｎ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断し、次いでこれを予め
Ｋｐｎ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断されているｐＵＣ
１９（ベセスダ・リサーチ・ラブス社）に結合させた。
得られたプラスミドｐＣＡＳ１１３４（第１図参照）
は、ＣＡＳプロモータとクローニングに適するＢａｍＨ
Ｉ部位を持ったシグナル配列とを含有した。
作成した：第１図のゲノム地図は、制御領域もしくはプ
ロモータ領域がエクソンＩおよびＩＩと一緒に９ｋｂ
Ｋｐｎ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ断片としてクローン化されう
ることを示している。したがって、Ｅ１コスミドをＫｐ
ｎ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断し、次いでこれを予め
Ｋｐｎ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断されているｐＵＣ
１９（ベセスダ・リサーチ・ラブス社）に結合させた。
得られたプラスミドｐＣＡＳ１１３４（第１図参照）
は、ＣＡＳプロモータとクローニングに適するＢａｍＨ
Ｉ部位を持ったシグナル配列とを含有した。
【００２８】真核宿主にてゲノム構成物を機能させ、す
なわちトランスジェニック作業を行なってＤＮＡを前核
中に注入するには、原核配列を最初に除去せねばならな
い。原核配列を除去するべく用いた１つの方法は、Ｓａ
ｌ Ｉ部位が真核ＤＮＡに隣接するようにｐＣＡＳ１１
３４を改変することである。ＣＡＳプロモータの上流に
位置するＫｐｎ Ｉ部位を、ＣＡＳ−１１リンカー５′
ＧＧＴ ＣＧＡ ＣＣＧ ＴＡＣ ３′を用いてＳａ
ｌ Ｉ部位に変化させ、これをＫｐｎ Ｉで切断した後
にプラスミドに結合させた。得られたプラスミドｐＣＡ
Ｓ１１４１（第１図参照）は、ＣＡＳプロモータに隣接
するＳａｌ Ｉ部位とＢａｍＨ Ｉクローン化部位とを
含有した。
なわちトランスジェニック作業を行なってＤＮＡを前核
中に注入するには、原核配列を最初に除去せねばならな
い。原核配列を除去するべく用いた１つの方法は、Ｓａ
ｌ Ｉ部位が真核ＤＮＡに隣接するようにｐＣＡＳ１１
３４を改変することである。ＣＡＳプロモータの上流に
位置するＫｐｎ Ｉ部位を、ＣＡＳ−１１リンカー５′
ＧＧＴ ＣＧＡ ＣＣＧ ＴＡＣ ３′を用いてＳａ
ｌ Ｉ部位に変化させ、これをＫｐｎ Ｉで切断した後
にプラスミドに結合させた。得られたプラスミドｐＣＡ
Ｓ１１４１（第１図参照）は、ＣＡＳプロモータに隣接
するＳａｌ Ｉ部位とＢａｍＨ Ｉクローン化部位とを
含有した。
【００２９】（実施例２ ＣＡＳ−組換生産物の作製）
本発明の方法により産生しうる１種の組換えポリペプチ
ドは組織プラスミノーゲン賦活物質、すなわちＴＰＡで
ある。下記するように、カゼインシグナルペプチドを用
いて、本発明による構成物を有するトランスジェニック
・マウスの乳腺からＴＰＡの分泌を直接指令した。この
構成おいて、カゼインシグナルペプチドのヌクレオチド
配列をＲＮＡ処理（プロセッシング）により成熟ＴＰＡ
の配列に融合させた。ＴＰＡの配列はＤ．ペニカ等によ
りネイチャー、第３０１巻、第２１４〜２１頁（１９８
３）に記載されている。ＴＰＡ遺伝子においてはＣＡＳ
遺伝子におけると同様に、成熟配列からシグナルペプチ
ドを分離するイントロンＩＩにＢａｍＨ Ｉ部位が存在
する［Ｒ．フッシャー等、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー、第２６０巻、第１１２２３〜３０頁
（１９８５）］。ＴＰＡのｃＤＮＡは、成熟ＴＰＡのア
ミノ酸Ｎｏ．３にてエクソンＩＩＩ中にＢｇｌＩＩ部位
を示す。
本発明の方法により産生しうる１種の組換えポリペプチ
ドは組織プラスミノーゲン賦活物質、すなわちＴＰＡで
ある。下記するように、カゼインシグナルペプチドを用
いて、本発明による構成物を有するトランスジェニック
・マウスの乳腺からＴＰＡの分泌を直接指令した。この
構成おいて、カゼインシグナルペプチドのヌクレオチド
配列をＲＮＡ処理（プロセッシング）により成熟ＴＰＡ
の配列に融合させた。ＴＰＡの配列はＤ．ペニカ等によ
りネイチャー、第３０１巻、第２１４〜２１頁（１９８
３）に記載されている。ＴＰＡ遺伝子においてはＣＡＳ
遺伝子におけると同様に、成熟配列からシグナルペプチ
ドを分離するイントロンＩＩにＢａｍＨ Ｉ部位が存在
する［Ｒ．フッシャー等、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー、第２６０巻、第１１２２３〜３０頁
（１９８５）］。ＴＰＡのｃＤＮＡは、成熟ＴＰＡのア
ミノ酸Ｎｏ．３にてエクソンＩＩＩ中にＢｇｌＩＩ部位
を示す。
【００３０】ＴＰＡのゲノムクローン［Ｒ．フィッシャ
ー等、上記］からの１．７ｋｂ断片を、ＢａｍＨ Ｉ−
Ｂｇｌ ＩＩを用いてサブクローン化した。この１．７
ｋｂ断片はイントロンＩＩの１部と３′スプライスアク
セプタ部位とＢｇｌ ＩＩ部位までのエクソンＩＩＩと
を含有した。この１．７ｋｂ断片を用いて、ＴＰＡのｃ
ＤＮＡクローンに見られるＴＰＡシグナル配列を置換
し、ＢａｍＨ Ｉカセットを得た。実施例１に示したよ
うに、成熟蛋白の配列からカゼインシグナルペプチドの
ための配列を分離するイントロンＩＩに位置するＢａｍ
Ｈ Ｉ部位が存在する。ＣＡＳプロモータプラスミドｐ
ＣＡＳ１１４１をＢａｍＨ Ｉで切断し、かつＴＰＡを
含有するＢａｍＨ Ｉカセットを第１図に示したように
切断プラスミドに結合させてプラスミドｐＣＡＳ１１５
１を生ぜしめ、これはＴＰＡのｃＤＮＡ配列の上流にＣ
ＡＳプロモータを有する。この構成物は、ＴＰＡ構造配
列がＲＮＡ処理によりカゼインシグナル配列を受入れる
ことを可能にする。
ー等、上記］からの１．７ｋｂ断片を、ＢａｍＨ Ｉ−
Ｂｇｌ ＩＩを用いてサブクローン化した。この１．７
ｋｂ断片はイントロンＩＩの１部と３′スプライスアク
セプタ部位とＢｇｌ ＩＩ部位までのエクソンＩＩＩと
を含有した。この１．７ｋｂ断片を用いて、ＴＰＡのｃ
ＤＮＡクローンに見られるＴＰＡシグナル配列を置換
し、ＢａｍＨ Ｉカセットを得た。実施例１に示したよ
うに、成熟蛋白の配列からカゼインシグナルペプチドの
ための配列を分離するイントロンＩＩに位置するＢａｍ
Ｈ Ｉ部位が存在する。ＣＡＳプロモータプラスミドｐ
ＣＡＳ１１４１をＢａｍＨ Ｉで切断し、かつＴＰＡを
含有するＢａｍＨ Ｉカセットを第１図に示したように
切断プラスミドに結合させてプラスミドｐＣＡＳ１１５
１を生ぜしめ、これはＴＰＡのｃＤＮＡ配列の上流にＣ
ＡＳプロモータを有する。この構成物は、ＴＰＡ構造配
列がＲＮＡ処理によりカゼインシグナル配列を受入れる
ことを可能にする。
【００３１】次いで、哺乳動物をトランスジェニック改
変させるために使用するＤＮＡを分離した。ｐＣＡＳ１
１５１ＤＮＡをＳａｌ Ｉで完全に切断した。１％アガ
ロースＴＢＥ［マニアチス等、上記］における電気泳動
の後、真核配列に相当する１３ｋｂ断片をゲルから切除
し、かつＤＮＡを電気溶出させた。次いで、ＤＮＡを平
衡ＣｓＣｌ濃度勾配にて１晩遠心分離した。ＤＮＡバン
ドを除去しかつ緩衝剤ＴＮＥ（５ｍＭトリス（ｐＨ７．
４）５ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８））に対し徹底的に透析した。
変させるために使用するＤＮＡを分離した。ｐＣＡＳ１
１５１ＤＮＡをＳａｌ Ｉで完全に切断した。１％アガ
ロースＴＢＥ［マニアチス等、上記］における電気泳動
の後、真核配列に相当する１３ｋｂ断片をゲルから切除
し、かつＤＮＡを電気溶出させた。次いで、ＤＮＡを平
衡ＣｓＣｌ濃度勾配にて１晩遠心分離した。ＤＮＡバン
ドを除去しかつ緩衝剤ＴＮＥ（５ｍＭトリス（ｐＨ７．
４）５ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８））に対し徹底的に透析した。
【００３２】（実施例３ マウス中への構成物のトラン
スジェニック組込み）成長しているマウス胚中へ所望の
遺伝子情報をトランスジェニック的に組込む方法は当業
界で確立されている［Ｂ．ホーガン等、「マウス胚の処
理；ラボラトリー・マニュアル」、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（１９８６）］。Ｃ５７Ｂ
１とＣＢ６との間のＦ１世代［スローン・ケタリング）
交配を用いた［ジャクソン・ラボラトリース社］。６週
令の雌を、ゲスチル（妊娠雌マウス血清）の注射に続き
２日後のヒトコリオゴナドトロピンの注射により排卵過
多にした。処理した雌を２４時間後にＣ５７Ｂ１雄マウ
スと交配させた。移植前受精した胚を、ＤＮＡのマイク
ロインジェクションおよび疑妊娠雌への移植のため交配
してから１２時間以内に取出した。
スジェニック組込み）成長しているマウス胚中へ所望の
遺伝子情報をトランスジェニック的に組込む方法は当業
界で確立されている［Ｂ．ホーガン等、「マウス胚の処
理；ラボラトリー・マニュアル」、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（１９８６）］。Ｃ５７Ｂ
１とＣＢ６との間のＦ１世代［スローン・ケタリング）
交配を用いた［ジャクソン・ラボラトリース社］。６週
令の雌を、ゲスチル（妊娠雌マウス血清）の注射に続き
２日後のヒトコリオゴナドトロピンの注射により排卵過
多にした。処理した雌を２４時間後にＣ５７Ｂ１雄マウ
スと交配させた。移植前受精した胚を、ＤＮＡのマイク
ロインジェクションおよび疑妊娠雌への移植のため交配
してから１２時間以内に取出した。
【００３３】卵を包囲する卵丘細胞をヒマルロニターゼ
で先す最初に切断することにより、構成物を注入した。
構成物は、寸法が３０％〜５０％膨潤するまで胚の前核
中に注入した。次いで、注入した胚（２６２個）を疑妊
娠Ｆ１雌の卵管に移植した。注入されかつ移植された２
６２個の胚のうち、２３匹の子供が生まれた。これらの
テールブロットを行ない、かつニック翻訳されたｐＣＡ
Ｓ１１５１ＤＮＡで試験して、その５匹がＣＡＳ配列を
有することを示した。雌ＧＯ子孫のうち２匹を６週間で
雄に交配して、Ｇ１世代を得た。
で先す最初に切断することにより、構成物を注入した。
構成物は、寸法が３０％〜５０％膨潤するまで胚の前核
中に注入した。次いで、注入した胚（２６２個）を疑妊
娠Ｆ１雌の卵管に移植した。注入されかつ移植された２
６２個の胚のうち、２３匹の子供が生まれた。これらの
テールブロットを行ない、かつニック翻訳されたｐＣＡ
Ｓ１１５１ＤＮＡで試験して、その５匹がＣＡＳ配列を
有することを示した。雌ＧＯ子孫のうち２匹を６週間で
雄に交配して、Ｇ１世代を得た。
【００３４】ｐＣＡＳ１１５１配列につき、これら交配
体の子孫をテールブロットにより試験した。次いで、分
娩後に得られた雌を育成しかつ授乳させた。ｐＣＡＳ１
１５１ＤＮＡ配列を有するこれらの雌マウスはそのミル
ク中にＴＰＡを産生したのに対し、比較は産生しなかっ
た。
体の子孫をテールブロットにより試験した。次いで、分
娩後に得られた雌を育成しかつ授乳させた。ｐＣＡＳ１
１５１ＤＮＡ配列を有するこれらの雌マウスはそのミル
ク中にＴＰＡを産生したのに対し、比較は産生しなかっ
た。
【００３５】トランスジェニック雄ＧＯマウスを比較雌
と交配させた。テールプロットによりＧ１子孫を試験
し、かつｐＣＡＳ１１５２配列を有する雌を搾乳用に育
成した。Ｇ１子孫はそのミルク中に０．２〜０．５μｇ
／ｍｌのＴＰＡを産生した。次いで、これらの雌を野生
型Ｆ１と交配させた。ｐＣＡＳ１１５１ＤＮＡ配列を有
する子孫は同レベルのＴＰＡを産生したのに対し、この
配列を持たない子孫はそのミルク中にＴＰＡを産生しな
かった。
と交配させた。テールプロットによりＧ１子孫を試験
し、かつｐＣＡＳ１１５２配列を有する雌を搾乳用に育
成した。Ｇ１子孫はそのミルク中に０．２〜０．５μｇ
／ｍｌのＴＰＡを産生した。次いで、これらの雌を野生
型Ｆ１と交配させた。ｐＣＡＳ１１５１ＤＮＡ配列を有
する子孫は同レベルのＴＰＡを産生したのに対し、この
配列を持たない子孫はそのミルク中にＴＰＡを産生しな
かった。
【００３６】（実施例４ 大型哺乳動物中へのヒトＴＰ
Ａ配列のトランスジェニック組込み）少なくとも１回の
事前の発情期間の後、羊を胚ドナーとする前に排卵過多
にした。より詳細には、発情サイクルのほぼ１０日目
に、各羊にプロゲスタゲンで含浸した腟内スポンジ（各
スポンジは６０ｍｇの６α−メチル−１７−α−アセト
キシプロゲステロンを含有する）を移植した。このスポ
ンジを１２日間にわたり移植状態に保持した。スポンジ
を取出す前の３日間および取出した翌日まで、各動物に
ゴナドトロピン処理を施し、この処理は毎日２回の筋肉
内注射により２．５ｍｇの豚卵胞刺戟ホルモンを投与し
て行なった。発情の開始時点で、羊を受精可能なラムに
交配させるか或いは１頭当たり０．２ｍｌの洗浄したラ
ム精子を子宮に受精させた。スポンジ除去してから７２
時間以内に、１細胞受精胚および分裂胚を、麻酔された
羊の生殖管から外科的に採取し、その際各卵管のカニュ
ーレ挿入した漏斗管端部を介し子宮−卵管接合部から得
られた熱失活胎児牛血清１０％を含有する約６ｍｌのハ
ムスＦ−１０媒体で逆行洗浄した。洗浄液を集め、かつ
胚を解剖用顕微鏡の下で剔出した。
Ａ配列のトランスジェニック組込み）少なくとも１回の
事前の発情期間の後、羊を胚ドナーとする前に排卵過多
にした。より詳細には、発情サイクルのほぼ１０日目
に、各羊にプロゲスタゲンで含浸した腟内スポンジ（各
スポンジは６０ｍｇの６α−メチル−１７−α−アセト
キシプロゲステロンを含有する）を移植した。このスポ
ンジを１２日間にわたり移植状態に保持した。スポンジ
を取出す前の３日間および取出した翌日まで、各動物に
ゴナドトロピン処理を施し、この処理は毎日２回の筋肉
内注射により２．５ｍｇの豚卵胞刺戟ホルモンを投与し
て行なった。発情の開始時点で、羊を受精可能なラムに
交配させるか或いは１頭当たり０．２ｍｌの洗浄したラ
ム精子を子宮に受精させた。スポンジ除去してから７２
時間以内に、１細胞受精胚および分裂胚を、麻酔された
羊の生殖管から外科的に採取し、その際各卵管のカニュ
ーレ挿入した漏斗管端部を介し子宮−卵管接合部から得
られた熱失活胎児牛血清１０％を含有する約６ｍｌのハ
ムスＦ−１０媒体で逆行洗浄した。洗浄液を集め、かつ
胚を解剖用顕微鏡の下で剔出した。
【００３７】次いで、この胎芽を１０％の胎児牛血清を
含有する新鮮なハムスＦ−１０に移し、かつマイクロマ
ニピュレータを装着した倒立顕微鏡の台に載せた。次い
で、各胚には、たとえばＲ．Ｌ．ブリンスター等、セ
ル、第２７巻、第２２３〜３１頁（１９８１）に示され
た方法により、ｐＣＡＳ１１５１のような複数の構成物
をマイクロインジェクトした。次いで、胚を１０ｍｌの
ハムスＦ−１０と共にガラスピペット先端に吸引し、か
つ同期された受容体羊における卵管の房状端部に１〜３
ｃｍ排出された。次いで、これらの羊を適当な時間にわ
たり妊娠させ、かつその子孫をＴＰＡをコードするＤＮ
Ａ配列の組込みにつき試験した。これらトランスジェニ
ック子孫の雌は、そのミルク中にＴＰＡを産生した。
含有する新鮮なハムスＦ−１０に移し、かつマイクロマ
ニピュレータを装着した倒立顕微鏡の台に載せた。次い
で、各胚には、たとえばＲ．Ｌ．ブリンスター等、セ
ル、第２７巻、第２２３〜３１頁（１９８１）に示され
た方法により、ｐＣＡＳ１１５１のような複数の構成物
をマイクロインジェクトした。次いで、胚を１０ｍｌの
ハムスＦ−１０と共にガラスピペット先端に吸引し、か
つ同期された受容体羊における卵管の房状端部に１〜３
ｃｍ排出された。次いで、これらの羊を適当な時間にわ
たり妊娠させ、かつその子孫をＴＰＡをコードするＤＮ
Ａ配列の組込みにつき試験した。これらトランスジェニ
ック子孫の雌は、そのミルク中にＴＰＡを産生した。
【００３８】プラスミドｐＣＡＳ１１５１を含有する本
発明の構成物は１９８７年６月２３日付でメリーランド
州、ロックビル在、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託されかつＬＥ３９２／ｐＣＡＳ１１
５１として同定された培養物により代表され、ここでｐ
ＣＡＳ１１５１はイー・コリＫ１２中に存在する。これ
は、受託番号ＡＴＣＣ６７４５０が付与されている。
発明の構成物は１９８７年６月２３日付でメリーランド
州、ロックビル在、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに寄託されかつＬＥ３９２／ｐＣＡＳ１１
５１として同定された培養物により代表され、ここでｐ
ＣＡＳ１１５１はイー・コリＫ１２中に存在する。これ
は、受託番号ＡＴＣＣ６７４５０が付与されている。
【００３９】以上、本発明の多くの実施例につき説明し
たが、この基本的構成を変化させて本発明の方法および
構成物を用いる他の具体例も与えうることが了解されよ
う。したがって、本発明の範囲は実施例として上記に説
明した特定実施例のみに限定されないことが了解されよ
う。
たが、この基本的構成を変化させて本発明の方法および
構成物を用いる他の具体例も与えうることが了解されよ
う。したがって、本発明の範囲は実施例として上記に説
明した特定実施例のみに限定されないことが了解されよ
う。
【００４０】（発明の要旨）本発明は、哺乳動物ミルク
中の組換えタンパク質の産生に関する。特に、本発明
は、哺乳動物中にトランスジェニック的に組み込まれた
場合に、その哺乳動物の雌性種が所望の組換えタンパク
質をそのミルク中またはそのミルクとともに産生するこ
とを可能にする発現系に関する。本発明はまた、そのミ
ルク中に所望の組換え産物を産生するトランスジェニッ
ク哺乳動物に関する。
中の組換えタンパク質の産生に関する。特に、本発明
は、哺乳動物中にトランスジェニック的に組み込まれた
場合に、その哺乳動物の雌性種が所望の組換えタンパク
質をそのミルク中またはそのミルクとともに産生するこ
とを可能にする発現系に関する。本発明はまた、そのミ
ルク中に所望の組換え産物を産生するトランスジェニッ
ク哺乳動物に関する。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、組換生産物が、慣用の
組換えポリペプチド産生技術によるよりも簡便に、かつ
顕著に低いコストで製造することができる。
組換えポリペプチド産生技術によるよりも簡便に、かつ
顕著に低いコストで製造することができる。
【図１】第１図は本発明のプラスミド、ｐＣＡＳ１１５
１の構成を示す。
１の構成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 組換えポリペプチドを含有する非ヒト哺
乳動物ミルクであって、該組換えポリペプチドが該哺乳
動物によって該ミルクとともにか、またはその中に産生
される、ミルク。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000071355A JP2000300115A (ja) | 2000-01-01 | 2000-03-14 | 非ヒト哺乳動物のミルク |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000071355A JP2000300115A (ja) | 2000-01-01 | 2000-03-14 | 非ヒト哺乳動物のミルク |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10357018A Division JPH11253097A (ja) | 1998-12-02 | 1998-12-02 | 非ヒト哺乳動物のミルク |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000300115A true JP2000300115A (ja) | 2000-10-31 |
Family
ID=18589952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000071355A Pending JP2000300115A (ja) | 2000-01-01 | 2000-03-14 | 非ヒト哺乳動物のミルク |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000300115A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8519008B2 (en) | 2003-01-22 | 2013-08-27 | Purina Animal Nutrition Llc | Method and composition for improving the health of young monogastric mammals |
-
2000
- 2000-03-14 JP JP2000071355A patent/JP2000300115A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8519008B2 (en) | 2003-01-22 | 2013-08-27 | Purina Animal Nutrition Llc | Method and composition for improving the health of young monogastric mammals |
| US9078457B2 (en) | 2003-01-22 | 2015-07-14 | Purina Animal Nutrition Llc | Method and composition for improving the health of young monogastric mammals |
| US9433232B2 (en) | 2003-01-22 | 2016-09-06 | Purina Animal Nutrition Llc | Methods for feeding sows and for improving the health of young piglets |
| US10172376B2 (en) | 2003-01-22 | 2019-01-08 | Purina Animal Nutrition Llc | Methods for feeding sows and for improving the health of young piglets |
| US10980250B2 (en) | 2003-01-22 | 2021-04-20 | Purina Animal Nutrition Llc | Methods for feeding sows and for improving the health of young piglets |
| US11452303B2 (en) | 2003-01-22 | 2022-09-27 | Purina Animal Nutrition Llc | Methods for feeding sows and for improving the health of young piglets |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20020312 |