JP2010017184A

JP2010017184A - ヒトの凝固第ｖｉｉｉ因子及びフォンビルブラント因子を発現するトランスジェニック動物

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Publication number: JP2010017184A
Application number: JP2009188810A
Authority: JP
Inventors: Henryk Lubon; ヘンリクルボン; William N Drohan; ウイリアムエヌ．ドロハン; William H Velander; ウイリアムエイチ．ベランダー
Original assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Current assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 2009-08-18
Publication date: 2010-01-28
Also published as: EP1739170A2; JPH10506013A; ES2262143T3; EP1739170A3; DE69534907T2; EP0807170A1; US6255554B1; ATE321785T1; CA2200610A1; DE69534907D1; EP0807170B1; US5880327A; WO1996009377A1; CA2200610C

Abstract

【課題】F8を産生する非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物および前述の特徴を有するトランスジェニック哺乳動物を作製する方法を提供する。
【解決手段】ゲノムに安定的に組み込まれた外因性の二本鎖DNA配列を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物。該二本鎖DNA配列は、ヒト第VIII因子蛋白質とシグナルペプチドとをコードするDNA配列に機能的に結合したシス作用性の調節ユニットを含む。トランスジェニック哺乳動物は、好ましくは、例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、及びブタなどの家畜動物である。ヒトフォンビルブラント因子の遺伝子を乳中に同時に発現させることによって、新たに分泌された第VIII因子を安定化させることができる。
【選択図】なし

Description

発明の背景
本発明は概して、トランスジェニック動物、及び臨床上有効量の蛋白質を合成するためのバイオリアクターとしてのそれらの使用に関する。さらに特定すると、本発明は、組換えヒト第VIII因子蛋白質又は組換えヒトフォンビルブラント因子蛋白質を発現し、また蛋白質を容易に単離することができる体液中に、新たに発現した蛋白質を分泌するように遺伝子操作された、非ヒトトランスジェニック動物に関する。

第VIII因子（「F8」）は、哺乳動物の肝臓で合成される約260kDaの分子量を有する血漿糖蛋白質である。これは血液凝固をもたらす凝固反応のカスケード系の重要な成分である。このカスケードには、F8と複合化した第IXa因子が第X因子を活性型の第Xa因子へと変換する工程が含まれている。F8は、この工程において共同因子として作用し、第IXa因子の活性のためカルシウムイオン及びリン脂質と共に必要とされる。二つの最も一般的な血友病疾患は、機能的なF8（血友病A、全ての場合の約80％）又は機能的な第IXa因子（血友病B又は即ちクリスマス因子疾患）の不全によって引き起こされる。

最近までの血友病Aの標準的な治療法では、ヒトドナーの血漿に由来するF8濃縮物からなる調製物が頻繁に注射されていた。この交換治療法は一般的には有効であるが、このような治療法では、患者が肝炎やエイズのようなウイルス伝染性の疾患に対する危険にさらされる。このリスクはモノクローナル抗体を用いる免疫精製法により血漿からF8をさらに精製し、有機溶媒又は加熱のいずれかを用いて処理することによりウイルスを不活化することによって減少してきているが、このような調製物は治療費用を大きく増加させてしまい、また危険が全くなくなったわけではない。これらの理由のために、患者に対しては、予防的にでななくむしろ一次的に治療が行われる。もう一つの合併症としては、約15％の患者にこのように調製されたF8に対して阻害作用のある抗体が生じる。

血友病Aの治療における有力な進歩として、ヒトF8の完全な2,351アミノ酸配列をコードするcDNAクローンの単離（Woodら、Nature, 312: 330 (1984) :非特許文献１、及び米国特許第4,757,006号、1998年7月12日 :特許文献1参照）、推定ヒトF8遺伝子DNA配列、及びその製造のための組換え法が提供された。

クローン化されたcDNAより決定されたヒトF8の誘導一次アミノ酸配列を分析すると、それはより大きな前駆体ポリペプチドからプロセシングされたヘテロ二量体であることが示される。このヘテロ二量体は、約210kDaのN−末端の重鎖の断片と金属イオン依存的に相互作用する約80kDaのC−末端の軽鎖からなる。「Kaufman, Transfusion Med. Rev., 6: 235 (1992) :非特許文献２」によるレビューを参照のこと。このヘテロ二量体の生理学的活性化は、トロンビン（第IIa因子）によって蛋白質鎖が蛋白質分解により開裂することにより起こる。トロンビンは重鎖を90kDaの蛋白質に開裂させ、それから54kDaの断片と44kDaの断片に開裂させる。トロンビンはまた、80kDaの軽鎖を72kDaの蛋白質に開裂させる。活性なF8を構成するのは、後者の蛋白質、及びカルシウムイオンにより会合した二つの重鎖断片（上記の54kDaと44kDa）である。72kDaの蛋白質及び54kDaの蛋白質がさらにトロンビン、活性型プロテインC又は第Xa因子によって開裂すると、不活性化が起こる。血漿ではこのF8複合体は、F8の蛋白質分解を阻害すると考えられるフォンビルブラント因子蛋白質（「vWF」）の50倍過剰量との相互作用により安定化される。

F8のアミノ酸配列は三つの構造ドメインに組織化されており、それは330個のアミノ酸からなる3つの部分を有するAドメイン、980個のアミノ酸からなる一つのBドメイン、及び150個のアミノ酸からなる2つの部分を有するCドメインである。Bドメインは他の蛋白質との相同性がなく、この蛋白質の25箇所の潜在的なアスパラギン（N）結合型グリコシル化部位のうちの18箇所を提供する。ブタF8及びヒトF8は、Bドメインで著しい開放性（divergence）を示すが、ブタの蛋白質はヒトの血友病Aを治療するために用いることができる。このことは、B鎖がホモ分子の生物活性に重要ではないか、又はこのドメインの複数の型が類似の効果を有するかのいずれかであることを示唆している。ブタF8とヒトF8は、三つのAドメインのうちの二つで、80〜85％の相同性を有している。

肝細胞はインビボでF8を産生する細胞型である可能性が高いが、今日までこの蛋白質を発現する天然の細胞系は知られていなかった。カウフマン（Kaufman、1992、前記 :非特許文献２）及びウッドら（Woodら、1984、前記 :非特許文献1）は、形質転換されたハムスターの腎細胞に、F8をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションし、該蛋白質を発現させた。カウフマン（Kaufman, Nature 342: 207 (1989) :非特許文献３）は形質転換されたCHO細胞で組換えF8を発現させたが、調整増殖倍地への新たに合成した蛋白質の産生及び分泌は非常に少なかった。このことは三つの要因に起因すると考えられている。それは、蛋白質分解から新たに分泌されたF8を保護するためには、これらの培養系で用いられる調整培地にvWFが存在する必要があったこと（vWFが含まれていないと、第VIII因子は続いて分解してしまうような不完全な鎖として分泌された）、細胞から新たに合成されたF8の分泌が不完全であったこと（大部分が小胞体に残った）、そして、翻訳後調節の結果として生じるF8のmRNAのレベルが低かったことである。安定な組換えF8は、vWFに対する遺伝子が同時に発現した場合にのみCHO細胞によって分泌された。臨床上有効な量でF8を産生するための哺乳動物組織の培養系の使用には、培養培地が高価であり、哺乳動物組織の培養系の産生能力が限られているというもう一つの欠点がある。

感染性の粒子が含まれず、臨床で使用するのに適当なヒトF8蛋白質を大量に合成するための効果的で比較的安価な方法が、依然として大きく必要とされている。組換え技術でヒトF8を産生する下記に記載されたトランスジェニック動物系により、この要求が満たされる。

例えばパレヤンダ（Paleyanda）らは、「止血及び血栓症における組換え技術（RECOMBINANT TECHNOLOGY IN HEMOSTASIS AND THROMBOSIS）、Hoyerら編、（プレナム出版（Plenum Press）、ニューヨーク州、1991） :非特許文献４」において、F8のアメリカ合衆国内の市場は年間約600,000,000ユニットであると見積っている。特異的活性が5,000U/mgであれば、1年で約120gが必要である。本発明のトランスジェニック動物の乳中では50mg／Lの発現レベルが達成可能であり、精製の過程でその蛋白質の50％が消失すると想定されており、約1頭の雌牛（一年に6,000Lの乳を生産する）、10頭のヤギ、ヒツジもしくはブタ（一年に500Lの乳を生産する）、又は5,333匹のウサギ（一年に0.9Lの乳を生産する）がいれば、この国のF8の必要量の全てを充分すぎるほど供給できると推定されている（Paleyandaら、前記 :非特許文献４）。

米国特許第4,757,006号、1998年7月12日

Woodら、Nature, 312: 330 (1984) Kaufman, Transfusion Med. Rev., 6: 235 (1992) Kaufman, Nature 342: 207 (1989) パレヤンダ（Paleyanda）ら、止血及び血栓症における組換え技術（RECOMBINANT TECHNOLOGY IN HEMOSTASIS AND THROMBOSIS）、Hoyerら編、（プレナム出版（Plenum Press）、ニューヨーク州、1991）

したがって、F8を産生する非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物を提供することが本発明の目的である。
前述の特徴を有するトランスジェニック哺乳動物を作製する方法を提供することが本発明のもう一つの目的である。
さらに本発明のもう一つの目的は、非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物を乳中に発現したF8を分泌するように誘導し、その乳からこの蛋白質を単離することによって商業的に価値のある量でF8を製造する方法を提供することである。
さらにもう一つの本発明の目的は、F8蛋白質とvWF蛋白質の両方が発現し動物の乳中に分泌されるように、F8をコードするDNA及びvWFをコードするDNAの両方がゲノムに安定的に組み込まれたトランスジェニック動物を提供することである。

これらの目的は、非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物の作製によって実現された。該動物は、ゲノムに、F8蛋白質又はvWF蛋白質又はその両方の蛋白質をコードするDNA配列に機能的に結合した分泌腺において特異的に作用する蛋白質プロモーターと、動物の体液中に新たに発現したF8蛋白質を分泌させるのに有効なシグナルペプチドとを含む、外因性の組換え二本鎖DNA配列が安定的に組み込まれている。さらに特定すると、この蛋白質プロモーターは乳蛋白質用のものであって、シグナルペプチドは動物の乳中に発現したF8を誘導する。

これらの目的はまた、F8又はvWFをコードするDNA配列に機能的に結合した組織特異的に活性な蛋白質プロモーターと、宿主の動物の体液中に新たに発現したF8及びvWFを誘導するシグナルペプチドをコードするDNA配列とを含む二本鎖のDNA構築物を提供することによって実現される。該構築物は、トランスジェニック動物を作製するために用いられる。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、次の詳細な説明及び添付した請求の範囲から明かとなろう。しかしながら、この詳細な説明から本発明の精神及び範囲内での種々の変形及び修飾が当業者に明らかになるため、好ましい態様を示している、以下に記載された詳細な説明及び実施例は、本発明を制限するものと考えるべきではないことを理解しなくてはならない。

図1は、乳清酸性蛋白質（「WAP」）遺伝子配列の寄与部分を示したヒトF8 cDNA構築物の概略図である。14.6kbの挿入部は2.6kbの5’WAP遺伝子、7.5kbのヒトF8cDNA、及び4.6kbの3’WAP遺伝子からなり、プラスミドのNot I消化によって切り出すことにより、2.1kbのpPoly III Dベクターを放出することができる。図2は、マウスWAP−ヒトF8 cDNAハイブリッド遺伝子の作成を示す概略図であって、p225.11プラスミドにおける、マウスWAP遺伝子のKpnI部位における7.5kbのヒトF8 cDNAの挿入が示されている。図3は、乳中にヒトのF8を発現するように誘導されたトランスジェニックマウスから得られる分離した乳清蛋白質のウエスタンブロットを示すスケッチである。一番左のレーンは分子量のマーカーを示している。次のレーンは約80kDaと約210kDaに主要なバンドを有する標準のヒトF8を示している。次のレーンは対照の乳清中に含まれる蛋白質を示している。F2及びF3と記されたレーンは、組換えヒトF8を発現するように誘導されたトランスジェニックマウスの乳清に含まれる蛋白質を示している。

発明の詳細な説明
ゲノムに外因性の二本鎖DNA配列が安定的に組み込まれている非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物が発明された。該外因性のDNA配列は、ヒトF8蛋白質と、そのトランスジェニック動物の乳中に新たに発現したF8蛋白質を分泌させるように誘導するのに有効なシグナルペプチドとをコードするDNA配列に機能的に結合した乳腺細胞で特異的に作用する乳蛋白質プロモーターを含んでいる。

本明細書において「動物」という用語は、ヒト以外の全ての哺乳動物を意味する。それはまた、胚の段階及び胎児の段階などの全ての分化段階の個々の動物を含む。「トランスジェニック」動物とは、微量注入又は組換えウイルスの感染などにより、亜細胞レベルで伸長に遺伝子操作することによって直接的又は間接的に導入された遺伝情報を保持する細胞を含む動物である。

本明細書において「トランスジェニック」とは、従来の交雑、即ちインビボでの受精は包含せず、むしろ一個又はそれ以上の細胞が組換えDNA分子を導入された動物を意味する。この分子は、動物の染色体に組み込まれることが非常に好ましいが、本発明はまた、たとえば酵母人工染色体へと組み込むことのできるような、染色体外複製DNA配列の使用も包含する。

「胚細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝情報が摘出され、胚芽系細胞に組み入れられ、それによりその情報を子孫に受け継ぐ能力が授与されているトランスジェニック動物をさす。実際にこのような子孫が情報の一部又は全部を所有しているならば、それらもトランスジェニック動物である。

動物に導入される情報は、好ましくは、受容者が属している動物の種にとって外来性（即ち「異種型」）のものであるが、特定の個々の受容者にのみ外来であってもよいし、又は受容者によって既に所有されている遺伝情報であってもよい。後者の場合では、導入された遺伝子は天然の遺伝子と異なって発現してもよい。

本発明のトランスジェニック動物はヒト以外であり、乳、血清、及び尿を生成する。家畜動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギなど）、ネズミ（マウスなど）、及び家庭用ペット（例えばネコ及びイヌ）が本発明の範囲に含まれる。

本発明のトランスジェニック動物は、ヒトのF8もしくはvWF、又はそれらの断片、又はそれらの修飾物をコードする適当なポリヌクレオチドを、成熟動物の胚系細胞のDNAに安定的に組み込まれ、そして正常のメンデルの法則で受け継がれるように、単細胞の胚に導入することによって作製することが非常に好ましい。

胚の微小操作法についての技術の進歩により、今や異種DNAを哺乳動物の受精卵への導入が可能となっている。例えば全能性又は多能性の幹細胞は微量注入法、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム融合法、又はレトロウイルス感染法などによって形質転換し、続いてその形質転換された細胞を胚に導入し、その後その胚をトランスジェニック動物に生長させることができる。非常に好ましい方法では、分化中の胚に目的のDNAを含むレトロウイルスを感染させ、その感染した胚からトランスジェニック動物が作製される。しかしながら、最も好ましい方法においては、適当なDNAを胚の前核又は細胞質に、好ましくは単細胞の段階で同時注入し、その胚を成熟したトランスジェニック動物へと生長させる。これらの手法は周知である。哺乳動物の受精卵に異種DNAを微量注入するための標準的な実験操作のレビュー、例えば「ホーガン（Hogan）ら、マウス胚の操作（MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO）、(コールドスプリングハーバー出版（Cold Spring Harbor Press）、1986)」、「クリムペンフォート（Krimpenfort）ら、Bio/Technology 9:88 (1991)」、「パルミター（Palmiter）ら、Cell, 41: 343 (1985)」、「ケーマー（Kraemer）ら、初期哺乳動物胚の遺伝子操作（GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO、(コールドスプリングハーバー出版、1986)」、「ハマー（Hammer）ら、Nature, 315: 680 (1985)」、「ワグナー（Wagner）ら、米国特許第5,175,385号」、「クリムペンフォートら、米国特許第5,175,384号」を参照のこと。なおこれらのそれぞれの内容は、参照として組み入れられる。

ヒトF8 cDNAは適当な遺伝子起源（即ち、この蛋白質を産生する天然の臓器であるヒトの肝臓）より単離することによって得ることができ、又は、「ウッド（Wood）ら、1984前記」、及び「ツール（Toole）ら、米国特許第4,757,006号」に記載されている、単離したmRNAの鋳型からcDNAを調製する方法、直接合成法、又はそれらの組合せなどの別の方法によって得ることができる。なおこれらの文献は、参照として組み入れられる。

F8もしくはvWF、又はそれらの個々の断片又はそれらの修飾蛋白質をコードするcDNAは、適当なリーディングフレームで下記に詳細に説明するように適当な調節シグナルと融合させ、それによって例えば、通常の方法によって細菌（例えば大腸菌）のプラスミドベクター内に調製することによって増幅される遺伝子構築物を作成することができる。「サンブルック（Sambrook）ら、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）(コールドスプリングハーバー出版、1986)を参照のこと。なおこの内容は参照として組み入れられる。増幅した構築物は続いて、そのベクターから切り取り、トランスジェニック動物を生産する際に用いるべく精製する。精製は陰イオン性HPLCを1サイクル又はそれ以上繰り返す方法によって行うことができる。他の方法には、ショ糖又はNaClの勾配を通す超遠心分離法、ゲル電気泳動を行った後にアガロースを処理してエタノール沈澱させる方法、又は低圧クロマトグラフィー法が含まれる。数サイクルのHPLCを行って精製することにより、マウス及びブタでは20％又はそれ以上の大きさで形質転換頻度が顕著に高くなる。

本発明は好ましくは、目的の、又は天然のヒトのF8又はvWFそれ自体を産生するDNA構築物の使用を包含しているが、目的とする蛋白質はまた、他の蛋白質を含む融合蛋白質として産生してもよい。例えば本発明の目的とする組換え蛋白質は、その目的とする蛋白質を安定化するため、又は迅速かつ容易に乳からその精製が行えるように、大きな組換え蛋白質の一部として産生することもできる。それから、この融合の相手を化学的又は酵素的に分離することにより、目的の蛋白質が単離される。

天然の分子と同一の配列を有する組換えヒトF8（「rhF8」）を産生することもでき、またそれらは断片又は誘導体として産生することもできる。種々の変形したrhF8又はそれらのサブユニットは、上記の参照に記載されているような周知のインビトロでの突然変異誘発法を用いて、クローン化したDNAを変化させることによって産生することが可能である。

rhF8の遺伝子を含むトランスジェニック動物の生産法においては、前駆体の蛋白質又はヘテロ二量体のrhF8をコードするcDNA又はゲノムDNAが使用される。それぞれの蛋白質の鎖の全長塩基配列が、前記のウッド（Wood）ら、及びツール（Toole）らの刊行物に開示されている。

本発明において有用なDNA構築物は、この蛋白質の乳腺特異的な発現、翻訳後のグリコシル化、及び乳又は他の体液中へのこの蛋白質の分泌、並びに充分な生物活性の発現のために必要なすべてのシス作用性シグナルに機能的に結合したrhF8又はrhvWFをコードする二本鎖DNA配列を提供する。

修飾されたF8又はvWFのDNA配列も本発明で用いることができる。この場合に含まれる有用な修飾には、翻訳後の修飾、大きさもしくは活性部位の改変、又は該蛋白質もしくはその一部の他の蛋白質との融合が含まれるが、これらに限られるわけではない。このような修飾は、当技術分野において周知の手法、例えばオーバーラップオリゴヌクレオチドのライゲーションや、又はオリゴヌクレオチド仲介型突然変異誘発によりクローン化遺伝子に突然変異を導入する方法によって、蛋白質に組み入れることができる。

本発明において有用なシス作用性の調節領域には、F8又はサブユニット鎖遺伝子の発現を推進するプロモーターが含まれる。特に好ましいプロモーターは、乳腺細胞において特異的に活性で、乳蛋白質を含むプロモーターである。そのようなプロモーターの中でも特に好ましいのは、短いWAPプロモーター、長いWAPプロモーター、短いα、β、カッパカゼインプロモーター、長いα、β、カッパカゼインプロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、及びβ−ラクトグロブリン（「BLG」）プロモーターである。

プロモーターは、様々な乳の蛋白質組成物に基づき選択することができる。例えば、トランスジェニックげっ歯動物、トランスジェニックブタ、及びトランスジェニックヒツジでは、WAPプロモーター及びBLGプロモーターが特に有用である。げっ歯動物WAPの短いプロモーター及び長いプロモーターが、ラットWAP遺伝子、ヒトtPA遺伝子、及びCD4遺伝子を発現させるために用いられ、ヒツジBLGプロモーターが、ヒツジBLG遺伝子、ヒトアルファ−１−アンチトリプシン遺伝子、及びヒトIX遺伝子を発現させるために用いられている。概要について「Paleyandaら、1991、前記」及び「Clarkら、TIBTECH 5: 20 (1987)」を参照のこと。これらの内容はそれぞれ参照として本明細書に組み込まれる。本発明を実施するためのプロモーターのうち好ましいものは、げっ歯動物カゼインプロモーター及びWAPプロモーター、並びにブタ（porcine）、ウシ(bovine)、ウマ(equine)、及びヒツジ(ovine)（ブタ(pigs)、ヒツジ(sheep)、ヤギ(goats)、ウシ(cows)、ウマ(horses)）、ウサギ、げっ歯動物、及び家庭用ペット（イヌ及びネコ）由来のカゼインプロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、及びBLGプロモーターである。これらのプロモーターの遺伝子は単離されており、その特徴が開示されている。概要について「Clarkら、(1987)、上記」及び「Henninghausen、蛋白質の発現及び精製（Protein Expression and Purification）、4 1: 3 (1990)」を参照のこと。これらの内容はそれぞれ参照として本明細書に組み込まれる。

プロモーターは、通常の制限エンドヌクレアーゼ及びサブクローニングの段階を行うことにより単離することができる。WAPシグナル配列の直ぐ5'側の2.6kb EcoRI-Kpn1断片として単離されている、マウスWAPプロモーターが好ましいが、「長い」WAPプロモーター（マウスWAP遺伝子の5'側の4.2kb Sau 3A-Kpn1プロモーター、又はその断片）も、本発明を実施するために適している。

蛋白質をトランスジェニック動物の乳中及び／又は他の体液中に直接分泌する調節配列が、本発明にとって重要である。この点に関して、同種の調節配列と異種の調節配列のいずれも、本発明において有用である。一般的に、乳由来のシグナルペプチド又は発生期標的ポリペプチドのいずれかのような、乳蛋白質を分泌することが知られている調節配列が用いられうるが、他の体液、特に血液及び尿中に発現蛋白質を分泌するシグナル配列も、本発明により用いることができる。トランスジェニックマウスにおいて最も好ましいのは、WAP蛋白質の調節配列である。

上記のようなプロモーターに加えて、転写を調節する有用な配列には、エンハンサー、スプライスシグナル、転写終結シグナル、及びポリアデニル化部位がある。この点に関して、特に有用であるのは、上に挙げたトランスジェニック動物の乳腺細胞又は他の細胞におけるF8またはvWFの遺伝子の転写の効率を増大させるものである。乳腺細胞において高度に発現する蛋白質のための転写調節配列が好ましい（前記参照）。

好ましくは、本発明の発現系又は構築体には、所望の組換え蛋白質をコードするDNA配列、又は調節に用いられる乳蛋白質遺伝子の下流の3'非翻訳領域が含まれていてもよい。該領域は、発現系のRNA転写物を安定化させ、そのことにより所望の蛋白質の収量を増大させると考えられる。この点に関して有用な3'非翻訳領域には、ポリAシグナルを提供する配列がある。該配列は、例えば、SV40スモールt抗原、カゼイン3'非翻訳領域、又は当技術分野において周知の他の3'非翻訳領域に由来する。好ましくは、3'非翻訳領域は、乳特異的蛋白質に由来する。該領域のポリA転写物の安定化効果は、発現配列のmRNAの安定化に重要である。リボソーム結合部位も、F8の発現効率を増大させるために重要である。同様に、F8の翻訳後修飾を調節する配列が、本発明において有用である。

このように、本発明により、乳及び／又は他の体液における蛋白質の効率的な発現を促進するシス作用性の調節配列に機能的に結合した、F8蛋白質又はvWF蛋白質又はその両方をコードする遺伝子を含む二本鎖キメラDNAが、胚に導入され、胚ゲノムに組み込まれ、胚から成熟する成体の、胚系細胞を含む全動物細胞の後代に受け継がれる遺伝要素の一部となる。このようにして発現され、乳中に分泌された組換え蛋白質は、免疫学的な応答性を有し、それば後述のようなELISAアッセイにより測定することができる。

F8サブユニット鎖の合成が、ホロ蛋白質の生成により制限される可能性がある場合、この鎖の発現は、異なる遺伝子座の遺伝子と置換することにより増加させることができる。該他の遺伝子座には、他の配列と同じ調節配列又は異なる調節配列下のDNA配列が含まれていてもよい。

特に好ましい態様において、本発明のトランスジーンは、一般的に、F8 cDNA／シグナルペプチド配列に隣接する上流及び下流にWAP乳蛋白質を含む（図１及び２）。ATGコドンの直前又はその位置にある利用可能な制限部位で終わる天然の5'WAP調節配列を、ヒトF8の鎖に由来するリンカー配列をもたない翻訳可能な配列のATGに生じる制限部位に連結させることができる。ある特定の制限部位で終わる連結された5'調節配列及びF8翻訳可能配列のそれぞれを、WAPの3'非翻訳領域及び連結部のWAP3'隣接領域の始めの部分に生じた対応する制限部位に連結させることができる。この構築体のモチーフにより、乳蛋白質遺伝子の天然5'調節領域及び3'UTRを、介在配列なしに直接隣接させることができる。全ての構築体の終わりにある特定の制限部位は、構築体が動物ゲノム内の単一のドメインへと組み込まれるのを促進するように選択することができる。

上記において、本発明のDNA構築体をWAPプロモーターに関して一般的に説明してきたが、同様にして他の適当なプロモーター（前記参照）をポリヌクレオチドをコードするフィブリノーゲンに連結させてもよいことは明らかである。例示のため、以下に、乳腺におけるF8蛋白質及びF8-BLG融合蛋白質の発現効率を増大させるためのBLGプロモーターの使用を記載する。

上記のような手法により、F8をコードするcDNAをヒツジBLG遺伝子へと挿入することができる。例えば、該構築体を作製するためには、11.2kbpのヒツジBLG遺伝子を、ベクターpUCXSRVにおいて開始ATGコドンの上流に特有のEcoRV部位を有するように修飾することができる。この領域周辺の配列を以下のように変化させることができる。

PvuI MetLys
配列番号１天然 CCCCAGCTGCAGCCATGAAG
EcoRV MetLys
配列番号２ pUCXSRV CCCCAGGGATATCCCTGCAGCCATGAAG

このことにより、BLG遺伝子の上流に平滑末端断片をクローニングすることができる。hF8をコードするcDNAを含むプラスミド（例えば、p122、図２）由来の7.5kbp断片を単離し、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端を生成し、得られたものをEcoRVで切断したpUCXSRVへと連結させることができる。大腸菌にこのプラスミドを形質転換した後、得られたクローンは、ミニプレップ法により調製したプラスミドDNAを制限解析し、DNAの5'側及び3'側のクローニング連結部周辺のヌクレオチド配列を決定することにより特徴決定することができる。所望の構造を有するクローンは、以下のようにして、生物体液中にF8-BLG融合産物を分泌する、トランスジェニックのげっ歯動物、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、及びその他の家畜、並びに家庭用ペット（ネコ及びイヌ）を作製するために用いることができる。

ヒトF8ゲノム配列はまた、以下の記載において例示されているヒツジBLGプロモーターへと融合させてもよい。プラスミドpUCXSRV中のヒツジBLGをコードするDNA配列を欠失させ、ヒツジBLGプロモーター配列のみを含むベクター（pUCSV）を作製する。pUCSRVと同様に、特有のEcoRV部位へとライゲーションさせることにより、平滑末端をこのプロモーター領域に融合させることができる。この部位に対する5'側の配列は、両プラスミドで同一である。

オーバーラップするF8配列を有するコスミドを使用することにより、約15kbpより大きいゲノムF8配列を、その大きさに関わらずトランスジェニック動物に導入することができる。この場合、hF8をコードする完全なゲノムポリヌクレオチドの必要な集合は、肺細胞へ微量注入した後、インビボの相同性組み換えにより達成される。前述の例における有用な構築体において、プラスミドは、適当な転写、終結、及びポリアデニル化を確実にするために、F8ゲノム配列を、F8翻訳停止コドンの直後でヒツジBLGの3'隣接配列に融合させる。ヒツジBLGの3'隣接配列に融合したhF8遺伝子を、プラスミドから切り出し、クレノウ酵素を用いて3'の突出を修復し、得られたものをEcoRVで切断したpUCSRと連結させる。大腸菌へ形質転換した後、得られたクローンを、制限DNA解析を行い、5'及び3'のクローニング連結部の周辺のヌクレオチド配列を決定することにより、特徴決定した。所望の構造を有するクローンは、トランスジェニック動物を作製するため、動物受精卵へと導入することができる。

BLG遺伝子を基本として、様々なベクターを構築することができる。この方法による構築体においては、ヒツジBLG蛋白質をコードする配列は欠失させるが、5'プロモーター配列は保持される。各々は、ヒツジ遺伝子とは異なるイントロンの補集合、及び、プロモーターと遺伝子の3'隣接領域との間の平滑末端を有する断片のクローニングを可能にする特有のEcoRV部位を有していてもよい。しかしながら、各々は、BLGプロモーター、EcoRV部位、及びBLGの3'隣接配列を含む。各組換え体について、p122由来の7.5kbpのKpnI断片を単離し、上記のように平滑末端を作成し、得られたものをEcoRVで切断したベクター配列へと連結させる。適当な構造を有する（上記のようにして決定する）これらの構築体を、トランスジェニック動物の生物体液中にF8を発現させるために使用することができる。

インビボでBLG標的cDNA構築体へとさらなる隣接配列として組み込まれる異なる構築体として注入された、天然のBLGゲノム配列を有する二重トランスジェニックマウス（例えば、BLGプロモーター−イントロンI−EcoRV−イントロンVI−BLG3'隣接、及びBLG）は、BLGプロモーター−F8 cDNA−BLG遺伝子又はBLGプロモーター−F8ゲノム（±BLGの3'末端）の構築体を使用した場合に観察されるよりも高頻度で高度に発現する。予めBLG-cDNA標的へと連結させた、完全な、又は天然のBLGゲノム配列は、同様の利点を有するかもしれない。これと同様の原理は、WAPゲノム配列にも拡張することができる。

本発明によるトランスジェニック動物からの乳の採取は、通常の方法により達成できる。「McBurneyら、J. Lab. Clin. Med. 64: 485 (1964)」「Velanderら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12003 (1992)」を参照のこと。これらのそれぞれの内容は、参照として本明細書に組み込まれる。F8もしくはvWFもしくはそれらの断片、又はそれらの蛋白質産物は、過度の操作をすることなく、通常の方法により乳又は尿から単離し、精製することができる。好ましい方法としては、全乳又は乳清（脱脂乳）蛋白質のいずれかに対する、陰イオン交換及び免疫クロマトグラフィーの組み合わせ、寒冷沈降反応、亜鉛誘導沈降が挙げられる。これらの方法については、「Bringeら、J. Dairy Res. 56: 543 (1989)」を参照のこと。この内容は、参照として本明細書に組み込まれる。

乳は、外来の蛋白質を分解する可能性のある多数のプロテアーゼを含むことが知られている。これらには、主として、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するアルカリプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様酵素、アミノペプチダーゼ、及び酸ペプチダーゼが含まれる（Clarkら（1987）、前記）。従って、新たに分泌されたF8又はその断片は、蛋白分解から保護することが望ましい。このような予防措置には、採取後に乳を迅速に処理し、乳中に、例えばSIGMA CHEMICAL CO. CATALOG（1993年版）850頁（この内容は参照として本明細書に含まれる）に挙げられているような周知の蛋白分解の阻害剤を添加することが含まれる。

上記のように、生理学的な条件下において、循環するF8をvWFとの複合体にすることにより、F8が分解に対して安定化される。本発明において、アメリカンタイプカルチャーコレクション（メリーランド州ロックビル）から入手可能なvWFのcDNAを、図１及び２に示されたものと同様の構築体へと集合させ、F8構築体と同時に胚へと微量注入することができる。このような条件において、両蛋白質は発現され乳中に分泌されるであろう。

乳清中に新たに分泌されたF8及び／又はvWFの決定のため、本発明者らは、イムノラジオメトリックELISAアッセイを用いた。該アッセイは、本質的に「Hoyerら、Methods Enzymol. 84: 51, 56-57 (1982)」に従って行った。なお、これは参照として本明細書に組み込まれる。F8抗原は、放射性ヨード化したヒト抗F8 Fab'インヒビター抗体を用いて測定する。該抗体は、インヒビターを発現している自己免疫抗体を有する患者又は輸血による血友病患者から得られる。vWF抗原は、精製されたF8での免疫により得られたウサギ抗体を用いて測定する。いずれのアッセイにおいても、免疫複合体から精製された放射標識された抗体を使用する。該アッセイにおける抗原測定は、抗原−抗体複合体と遊離の抗体の硫安溶液中での安定性が異なることに基づいている。

以下の実施例は、本発明を例示することのみを目的として記載されており、本明細書及び添付の請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限するためのものと解釈すべきではない。

実施例１
mWAP-hF8 cDNAハイブリッド遺伝子の構築
pPolyIII-Dベクター（図２中のp120）を、Kpn1で制限分解し、平滑末端化し、再びライゲーションさせてKpn1部位を含まないベクターAを作製した。

p121プラスミドからEcoRIで7.2kbのmWAPを切り出し、平滑末端化し、EcoRIで直線化させたベクターAへとライゲーションさせた。得られたものは、WAP遺伝子にEcoRIと、それに続くNot1制限部位が隣接する、9.3kbのプラスミド（標識p184）であった。

Kpn1でプラスミドp122を部分分解することにより、Kpn1制限部位が隣接する7.5kbのF8 cDNAが生じた。次に、このcDNAを、mWAP遺伝子内のKpn1部位でプラスミドp184に挿入し、プラスミドp225.11、16.8kbのプラスミドを作製した。上流Not1部位を有する2.6kbの5'mWAPセグメント、及び下流Not1部位を有する4.6kbの3'mWAP遺伝子が、ヒトF8遺伝子に隣接している。

図１に示したように、5'mWAP/hF8/3'mWAPハイブリッド遺伝子を含む14.7kbの挿入配列を、p225.11プラスミドをNot1消化することにより切り出し、それにより2.1kbのpPolyIII-Dベクターを放出することができる。

p225.11プラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（メリーランド州ロックビル）（ATCC受託番号＿）に寄託されている。本出願人らは、これにより、（1）本特許出願の係属中は、特許商標庁長官により適当に指定された者が寄託されたプラスミドを利用することができること、（2）本特許が発行された場合は、特許の有効期間中、又は、いずれが長くとも、最後の分譲請求から少なくとも5年間、又は30年間は、制限なく公衆が利用可能であること、（3）死滅したプラスミドは交換されること、を保証する。

実施例２
ELISAアッセイによる乳清中の第VIII因子蛋白質のアッセイ
上記のmWAPプロモーター系を用いて作製されたトランスジェニックマウスの乳清中のhrF8の濃度を推定するために、以下の手順に従い、ELISAアッセイを使用した。

材料：
乳清、マウスf2.1.9.10
乳清、マウスf2.13.9
乳清、マウスf2.1.13.13
乳清、マウスf2.1.22.8
乳清、対照マウスD15
トロンビン緩衝液：0.15M NaCl、20mM HEPES、5mM CaCl_２、0.01％ Tween 80, pH7.4
トロンビン：2U/ml
TBS：20mM Tris，500mM NaCl, pH 8.0
TBS/T:0.05％ Tween20を含むTBS
TBS/T/NFDM:5％脱脂粉乳
1X TBS/T/NFDM中の一次抗体:
mAb 413（最終濃度2μg/ml；抗重鎖）
mAb 37（最終濃度5μg/ml；抗軽鎖）
1X TBS/T中に6000倍に希釈した二次抗体
ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼ複合体（GIBO）
ルミホス蛍光ビオチン複合発色系（LumiPhos Luminescent Biotin-conjugated development system）（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））

操作手順：
1）乳清試料（200μg全蛋白質）を、5分間トロンビン（130μU/μL）で消化した。等容量の2X試料用緩衝液を添加した後、試料を5分間加熱し、氷上で急速に冷却した。
2）1.2mmの厚さの7.5％アクリルアミドレムリゲルで試料を泳動させ、12vで1.5時間、蛋白質をニトロセルロース膜に電気的にブロットした。膜は、4℃でTBS中に保存した。
3）TBS/T/NFDMで1時間膜をブロックし、TBS/Tで3回洗浄した後、膜を室温で2時間一次抗体にさらし、過剰の抗体を除去し、膜をTBS/Tで3回洗浄した。
4）膜を室温で15分間二次抗体にさらし、TBS/Tで4回洗浄した。
5）製品説明書に従いルミホスで膜を暗所で20分間インキュベートした後、膜に25分間コダック(Kodak)XAR-5フィルムを感光させ、フィルムを濃度計で測定した。

ELISA試験の結果を以下の表に示す。
PDLの説明試料の容量 ^＊第VIII因子抗原
マウス番号 μl ユニット／ml ng/ml
対照D15 100 0.041 8.2
F2.13.9 100 0.045 9.0
F2.1.9.10 50 0.100 20.0
F2.1.22.8 40 0.144 28.8
F2.1.13.13 50 0.093 18.6
^＊試料は-20℃で保存した。2匹は乳を4℃で保存したためELISAの結果が低下した。本方法のバックグラウンド値（対照マウスD15）と比較して、4匹のうち3匹のマウスで平均で約250％抗原（F8）産生が増加した。

実施例３
マウス乳清試料のウェスタンブロット
試料中のrhF8を同定するため、2匹のトランスジェニックマウス（F2及びF3）の乳清をイムノブロットした。ウェスタンブロットは、図３に示されている。

左の最初のレーンは、45から200kDaの分子量マーカーを含む。左から2番目のレーンは、標準のhF8であり、約80kDaに主要なバンド、約210kDaにもう一つのバンドが示されている。左から3番目のレーンは、対照乳清蛋白質を示す。Ｆ２及びＦ３のレーンはトランスジェニックの乳性を示す。対照と比較して、標準hF8と同様に、約80kDaの新たなバンドが強く染色された。F2及びF3のレーンでも、約120kDaのバンドが強く染色された。このバンドは、対照では比較的弱く、標準のhF8には存在が認められなかった。そのバンドについては、同定されていない。

考え合わせると、実施例２及び３より、本発明のトランスジェニックマウスが、確実に組換えヒトF8を発現し、該蛋白質を動物の乳中へと分泌することが示された。

Claims

組換えヒト第VIII因子蛋白質又はそれらの断片もしくは修飾体を発現し、該発現した蛋白質を体液中に分泌する非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
外因性の二本鎖DNA配列が安定的に組み込まれているゲノムを有する雌哺乳動物を含む、請求項1に記載の動物において、該DNA配列が第VIII因子蛋白質又はそれらの断片もしくは修飾体とシグナルペプチドとをコードするDNA配列に機能的に結合した乳蛋白質プロモーターを含み、該プロモーターが乳腺細胞で特異的に作用するものであり、該シグナルペプチドが該雌哺乳動物の乳中に新たに発現した該第VIII因子を誘導し分泌させるのに有効なものである、動物。
ヒト第VIII因子が約2332個のアミノ酸残基からなるヘテロ二量体の糖蛋白質を含み、該ヘテロ二量体の糖蛋白質が約80kDaのC−末端アミノ酸配列と約210kDaのN−末端アミノ酸配列を含む、請求項2に記載の動物。
ヒトフォンビルブラント因子蛋白質又はそれらの断片もしくは修飾体を発現し、該蛋白質を体液中に分泌する非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
外因性の二本鎖DNA配列が安定的に組み込まれているゲノムを有する雌哺乳動物を含む、請求項4に記載の動物において、該DNA配列が組換えヒトフォンビルブラント因子とシグナルペプチドとをコードするDNA配列に機能的に結合した乳蛋白質プロモーターを含み、該プロモーターが乳腺細胞で特異的に作用するものであり、該シグナルペプチドが該雌哺乳動物の乳中に新たに発現したフォンビルブラント因子を誘導し分泌させるのに有効なものである、動物。
組換えヒト第VIII因子とフォンビルブラント因子とを同時に発現し、両蛋白質を乳中に同時に分泌する非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物。
乳蛋白質プロモーターが、乳清酸性蛋白質プロモーター、カゼインプロモーター、ラクトアルブミンプロモーター、及びベータ−ラクトグロブリンプロモーターからなる群より選択されるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の動物。
雌哺乳動物が、げっ歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、及びウシからなる群より選択されるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の動物。
組換えヒト第VIII因子を製造する方法であって、
（a）外因性の二本鎖DNA配列がゲノムへ組み込まれていることを特徴とする非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物を提供する段階（該外因性のDNA配列は第VIII因子蛋白質とシグナルペプチドとをコードするDNA配列に機能的に結合した乳蛋白質プロモーターを含み、該プロモーターは乳腺細胞で特異的に活性なものであり、該シグナルペプチドは該哺乳動物の乳中に新たに発現した該第VIII因子を誘導し分泌させるのに有効なものである）、
（b）該雌哺乳動物に乳汁を分泌させる段階、
（c）該雌哺乳動物から乳を採集する段階、及び
（d）該乳から該蛋白質を単離する段階、
を含む、方法。
動物が第2の外因性の二本鎖DNA配列が安定的に組み込まれたゲノムをさらに有する請求項9に記載の方法において、該第2の外因性DNA配列がヒトフォンビルブラント因子とシグナルペプチドとをコードするDNA配列に機能的に結合した乳蛋白質プロモーターを含み、該プロモーターが乳腺細胞で特異的に作用するものであり、該シグナルペプチドが該哺乳動物の乳中に新たに発現したフォンビルブラント因子を誘導するのに有効なものである、方法。
乳腺組織において組換えヒト第VIII因子蛋白質を産生し、乳中に該ポリペプチドを分泌する能力のある非ヒトトランスジェニック雌哺乳動物を製造する方法であって、
（a）該第VIII因子蛋白質とシグナルペプチドとをコードするDNA配列に機能的に結合した乳蛋白質プロモーターを含む二本鎖DNA配列を提供する段階（該プロモーターは乳腺細胞で特異的に作用するものであり、該シグナルペプチドは該哺乳動物の乳中に新たに合成された第VIII因子を誘導するのに有効なものである）、
（b）該二本鎖DNAを精製する段階、
（c）該精製された二本鎖DNAを雌哺乳動物の胚に注入する段階（該注入されたDNA配列は、ゲノムに安定的に組み込まれた該注入されたDNAを有するトランスジェニック哺乳動物を製造するのに有効なものである）、及び
（ｄ）該動物で乳汁の分泌が誘導される期間まで該胚を分化させる段階、
を含む、方法。
外因性のDNA配列がプラスミドp225.11（ATCC受託番号＿）に含まれる、請求項9に記載の方法。