CN104313052A

CN104313052A - 一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体

Info

Publication number: CN104313052A
Application number: CN201410586289.XA
Authority: CN
Inventors: 曾凡一; 曾溢滔; 任晓叶
Original assignee: SHANGHAI TAOTAO TRANSGENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI TAOTAO TRANSGENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2015-01-28

Abstract

本发明公开了属于生物技术领域的一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体。它包括骨架质粒和hFVIIIBDD-IRES-vWF片段，其中所述骨架质粒为pcDNA3.1(-)质粒，hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了共表达载体的制备方法，包括以下步骤：(1)利用包含hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的共表达质粒，通过显微注射法制备转基因哺乳动物，(2)从步骤(1)所得转基因哺乳动物的乳汁中分离人凝血因子VIII即得。在本发明制备的转基因动物乳汁中所表达的vWF蛋白能够显著延长凝血因子VIII的半衰期。

Description

一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体。

背景技术

血友病是一种隐性遗传的出血性疾病，是由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致的凝血功能障碍。根据所缺乏的特定凝血因子可以分为血友病A(hFVIII缺乏)、血友病B(hFIX缺乏)和血友病C(hFXI缺乏)。其中发病率最高的是由于基因hFVIII先天缺陷导致凝血因子VIII缺乏引起的血友病A，约占血友病总数的85％，男性发病率约为1/5000，其中三分之一的是由于基因自发突变引起的。

人凝血因子VIII基因(hFVIII)，主要在肝脏中合成，两个C区(各含约150个氨基酸组成)和一个大的B区(980个氨基酸)，各区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2。该初级结构经糖基化、二硫键形成、酪氨酸残基硫酸化、蛋白质折叠等加工后分泌到循环系统中时，是由两条链以Ca²⁺连接组成，即A1-A2-B或A1-A2结构域所组成的重链及由A3-C1-C2构成的轻链，因B区断裂位点不同导致重链分子量在90～200kDa间，轻链分子量则为80kDa。科学家认为B区是非必须片段，目前不确定其主要功能。vWF(von Willebrand factor，血管性血友病因子)基因位于12号染色体上，其编码获得vWF蛋白是一种大分子量的多亚基糖蛋白，由多个220kD的亚基组成，因终产物的聚合度不一，分子量最高者可高达20MD。一方面，vWF可以介导血小板粘附于受损的血管壁，形成血栓得以止血；另外，正常情况下，vWF与hFVIII在血浆中紧密结合形成稳定的复合物。FVIII：vWF复合物的形成对维持hFVIII的半衰期至关重要，因为复合体的形成在体内阻碍了可能由细胞表面受体介导的hFVIII分解。活化时，重链删除残余的B区，A1和A2断裂并与脱离了vWF的轻链组合为活化的三聚体。

专利201310297925.2公开了一种利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法。该方法制备的人第八凝血因子由于没有保护元件vWF极不稳定，是一种非常不稳定的蛋白质，极易失活，不利于活性因子的保存。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服目前以动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII时，所得人凝血因子VIII不稳定的缺陷，提供了一种利用动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII的方法。

一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体，包括骨架质粒和hFVIIIBDD-IRES-vWF片段，其中所述骨架质粒为pcDNA3.1(-)质粒，hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

所述共表达载体的启动子为P1A3启动子。

一种包含所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体的重组表达转化体，所述重组表达转化体的宿主细胞是HC-11细胞株。

本发明所述重组表达转化体是指含有本发明所述转基因质粒的转化细胞。其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述转基因质粒转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞较佳地为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使所述转基因质粒稳定地自行复制，并且其所携带的外源基因可被有效表达即可，所述宿主细胞较佳地为真核细胞，优选地为HC-11细胞株。所述细胞株的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。所述转化方法为本领域常规转化方法，其较佳地包括化学转化法、热激法或电转法。

一种利用动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII的方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)利用所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体，通过显微注射法制备转基因哺乳动物；

(2)从步骤(1)所得转基因哺乳动物的乳汁中分离人凝血因子VIII即得。

步骤(1)所述转基因哺乳动物为转基因牛、转基因羊或者转基因小鼠。

本发明所述的转基因质粒为本领域常规的转基因质粒。所述转基因质粒较佳地为包含hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的转基因质粒，所述转基因质粒的载体骨架较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述转基因质粒的载体骨架优选地为pcDNA3.1(-)质粒。

较佳地，将本发明所述hFVIIIBDD-IRES-vWF片段克隆连接到共表达质粒的基因表达盒中。本发明所述基因表达盒为本领域常规基因表达盒，所述表达盒较佳地包括合适的转录调节序列，以及转录终止信号，还包括有助于实现表达或实现表达所需的其他因子，如表达增强子元件。所述基因表达盒在骨架质粒的位置为任何位置，只要不影响该骨架质粒的其他功能以及hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的表达即可。

本发明所述共表达质粒的基因表达盒中还包括启动子，其中所述启动子为常规启动子，较佳地包括组成型启动子，诱导型启动子和/或组织特异性启动子。其中所述组成型启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。诱导型启动子是受到生理或发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂进行调节的启动子。组织特异性启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。本发明所述基因表达盒中的启动子为常规启动子，较佳地为真核启动子，更佳地为CMV启动子，优选地为P1A3启动子。

本发明所述hFVIIIBDD片段为本领域常规的表达人凝血因子hFVIIIBDD的片段，其序列较佳地为如序列表中SEQ ID NO：1中第1pb到第4416pb的核苷酸所示，所述vWF片段为本领域常规的表达血管性血友病因子的片段，其序列较佳地为如序列表中SEQ ID NO：1中第5360pb到第13801bp所示，所述IRES片段为本领域常规的IRES片段，其序列较佳地为如序列表中SEQ ID NO：1中第4629pb到5266pb所示。

其中步骤(2)从所得转基因动物的乳汁中分离人凝血因子VIII的方法为本领域常规的蛋白质分离方法。

所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体在制备基因治疗药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明所述利用动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII的方法能够显著延长凝血因子VIII的半衰期，有效提高所得凝血因子VIII的稳定性。

附图说明

图1为dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF载体的构建流程图。

图2为pcDNA3.1(-)-vWF质粒结构图。

图3为pcDNA3.1(-)-vWF质粒酶切鉴定结果图。

图4为pcDNA3.1(-)-IRES载体的构建图。

图5为pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES载体酶切鉴定结果图。

图6为pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF载体酶切鉴定结果图。

图7为dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF载体体酶切鉴定结果图。

图8为vWF外源基因瞬时转染细胞的RT-PCR结果图。

图9为共表达载体转染HC-11细胞后hFVIIIBDD基因的转录分析结果图。

图10为PCR方法鉴定共表达转基因小鼠结果图。

图11为转基因小鼠乳汁中hFVIII浓度和活性的半衰期结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1构建含P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的共表达载体

1、已有的pcDNA3.1(-)-vWF载体鉴定

pcDNA3.1(-)-vWF-neo载体的构建方法请参见文献：诸江，王鸿利，陈淳等；人血管性血友病因子cDNA全长的克隆与表达.中华血液学杂志[J]；1996，17(9)：475-478.。该载体经过酶切鉴定以及测序后，鉴定其中的vWF片段是正确的，因此将该载体作为后续目的载体中vWF片段的来源。

pcDNA3.1(-)-vWF-neo载体的酶切鉴定反应体系如表1和表2所示：

表1 DraI酶切鉴定pcDNA3.1(-)-vWF质粒

表2 PmeI酶切鉴定pcDNA3.1(-)-vWF质粒

所得pcDNA3.1(-)-vWF质粒大小为13843bp，包含8.9kb的vWFcDNA序列，其结构示意图如图2所示。用限制性内切酶DraI和PmeI鉴定该质粒。理论上，DraI酶切后的片段长度分别为8943bp，2951bp，1200bp，692bp和19bp；PmeI酶切后片段大小为8943bp和4900bp。所得pcDNA3.1(-)-vWF质粒酶切鉴定结果与理论值相符，酶切电泳结果如图3所示。

2、构建中间载体pcDNA3.1(-)-IRES

PCR扩增获得两端带酶切位点的IRES序列，所得IRES片段长610bp。XhoI酶切pcDNA3.1(-)载体(该载体购买自Invitrogen公司)片段和所得IRES片段，回收后连接获得中间载体pcDNA3.1(-)-IRES，T7和BGH测序结果显示连接正确。中间载体pcDNA3.1(-)-IRES的详细构建流程如图4所示，构建方法包括以下步骤：

(1)PCR扩增IRES片段：IRES的扩增引物前后端各加了酶切位点，上游设计的酶切位点是XhoI和SalI，下游设计的酶切位点是XhoI。获得的IRES片段酶切后连入pcDNA3.1(-)载体。其引物序列扩增获得的片段大小为610bp，引物序列如下：

IRES-R：5′-CCGCTCGAGAAGGTCGTCTCCTTGTGG-3′(SEQ ID NO：5)；

IRES-F：5′-CCGCTCGAGTCGACATCCCGCCCCTCTCC-3(SEQ ID NO：6)。

IRES的PCR反应模板为市售pLVX-IRES-Puro质粒(该质粒购自Clontech公司)，其反应体系见表3所示：

表3 扩增IRES片段的PCR反应体系

PCR扩增程序为(1)94℃，10min；(2)94℃，30sec；(3)56℃，30sec；(4)72℃，45sec，其中步骤(2)-(4)重复33个循环；(5)72℃，10min。所得IRES片段长610bp。

(2)PCR产物回收：胶回收试剂盒操作(方法见BIOMAGA说明书)。

(3)pcDNA3.1(-)载体片段及PCR产物酶切反应，XhoI酶切pcDNA3.1(-)载体(该载体购买自Invitrogen公司)片段和所得IRES片段，回收、连接以获得中间载体pcDNA3.1(-)-IRES，酶切体系如表4和表5所示：

表4 XhoI大量酶切pcDNA3.1(-)质粒反应体系

37℃酶切反应3-6h，完成后对载体片段作去磷酸化处理，防止自连。向表4体系中加入CIP(CIP为牛小肠碱性磷酸酶，购买自NEB公司)1.0μl，37℃反应1h。

表5 XhoI大量酶切IRES回收片段反应体系

37℃酶切反应3-6h，酶切产物利用胶回收试剂盒回收，方法同前。

(4)连接反应：

回收获得的载体片段和IRES片段，16℃，连接反应过夜，其反应体系如下：

表6 pcDNA3.1(-)与IRES片段连接反应体系

(5)转化以上连接产物，摇菌，挑取克隆并鉴定

i).连接产物转化感受态细胞：

A.将存于-80℃的感受态细胞取出后放于冰盒中，自然融化。

B.将10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀，静置冰浴30min.

C.42℃热激1.5min，立即置于冰中放置3min。

D.超净台内，向感受态细胞中加300μlLB培养基，颠倒混匀，置于37℃摇床，180rpm，1h使其复苏。

E.于超净台内，将复苏的感受态细胞涂到含有氨苄抗性的LB板上，倒置于37℃恒温培养箱培养过夜。

ii).菌落的小量扩增及质粒提取：次日，于超净台内，用无菌Tip挑取平板上的多个单菌落于4ml含氨苄的LB培养基中，37℃，220rpm培养12-16h。感受态制备及质粒提取方法可见《分子克隆》第二版。

iii).质粒电泳快速鉴定质粒大小，疑似阳性质粒酶切鉴定，鉴定正确后，送公司测序。获得的中间载体pcDNA3.1(-)-IRES经T7和BGH测序结果显示连接正确，IRES片段的核苷酸序列如序列表中IRES片段核酸序列为：SEQ ID NO：4所示。中间载体pcDNA3.1(-)-IRES的详细构建流程如图4所示。

3、构建中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES

中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-neo的构建方法包括以下步骤：

(1)各连接片段的获取及连接：

(i)XhoI大量酶切pcDNA3.1(-)质粒(反应方法同上)，酶切体系如表7和表8所示，酶切完全后(3-6h)向该反应体系中加CIP 1.5μl，37℃反应1h去磷酸化(方法同前)；

酶切产物电泳，胶回收试剂盒回收载体片段；

(ii)SalI、XhoI酶切pcDNA3.1(-)-IRES质粒获得IRES片段：

表7 Sal I大量酶切pcDNA3.1(-)-IRES质粒反应体系

37℃反应5h。

补平反应：向以上体系内加 BSA 2μl

T4 polymerase(NEB) 2μl

dNTP 6μl

12℃反应15min；回收酶切产物：两倍体积无水乙醇沉淀以上酶切产物体系，-20℃过夜，13000rpm，4℃离心10min，将以上沉淀晾干并用175μl dd H₂O溶解。

继续利用Xho I酶对以上片段进行大量酶切：

向以上溶解的产物中加入10×buffer 4 20μl

BSA 2μl

XhoI(NEB) 3μl

37℃反应过夜；酶切产物电泳，胶回收试剂盒回收IRES片段；

(iii)SalI、XhoI酶切pCI-hFVIIIBDD质粒获得hFVIIIBDD片段：此处pCI-hFVIIIBDD载体的构建方法请参见文献：耿解萍，戚正武，陈赛娟等；凝血因子FVIII全cDNA的克隆.自然科学进展[J]；1995，5(3)：368-370.。该质粒的酶切体系请见表8。

表8 Sal I大量酶切pCI-hFVIIIBDD质粒反应体系

37℃反应5h；

补平反应：向以上体系内加BSA 2μl

T4 polymerase(NEB) 2μl

dN TP 6μl

12℃反应15min；回收酶切产物：两倍体积无水乙醇沉淀以上酶切产物体系，-20℃过夜，13000rpm，4℃离心10min，将以上沉淀晾干并用175μl dd H₂O溶解。继续进行Xho I对以上片段进行大量酶切：

向以上溶解的产物中加入 10×buffer 4 20μl

BSA 2μl

XhoI(NEB) 3μl

37℃反应过夜；酶切产物电泳，胶回收试剂盒回收hFVIIIBDD片段，所述hFVIIIBDD的片段核酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

(iv)三片段进行连接获得中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES

用连接试剂盒(购买自TaKaRa公司的Solution I试剂盒)进行片段连接，其连接体系如表9所示：

表9 三片段连接反应体系

16℃连接过夜。转化、挑克隆及鉴定方法同前，获得的中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES经T7和BGH测序显示连接正确。

(2)中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES的酶切鉴定

构建所得中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-neo大小为10712bp。理论上，EcoRI酶切片段的大小分别为347bp，963bp，1728bp，2048bp，5626bp；XhoI酶切片段的大小分别为5285bp，5427bp；SphI酶切片段的大小分别为574bp，795bp，1628bp，7643bp；KpnI酶切片段的大小分别为231bp，3293bp，7188bp；NcoI酶切片段的大小分别为735bp，3342bp，6635bp。酶切鉴定的电泳结果如图5所示。

4、构建中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF

中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF的构建方法包括以下步骤：

(1)酶切获得目的片段及连接：

(i)载体片段的酶切、补平、去磷酸化及回收，酶切体系如表10所示：

表10 NotI大量酶切pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES质粒反应体系

37℃酶切过夜；

补平处理：向以上体系内加T4polymerase(NEB) 2μl

dNTP 6μl

12℃补平15min；75℃灭活20min，使酶失活；去磷酸化处理：向向以上体系内加CIP(NEB)2μl，37℃反应1h；以上产物电泳，胶回收试剂盒回收载体片段。

(ii)vWF片段的获得

AvrII、EcoRI双酶切pcDNA3.1(-)-vWF质粒反应体系如表11所示：

表11 AvrII、EcoRI双酶切pcDNA3.1(-)-vWF质粒反应体系

37℃酶切过夜。

补平处理：向以上体系内加T4 polymerase(NEB) 2μl

dNTP 6μl

12℃补平15min；以上产物电泳，胶回收试剂盒回收vWF片段。

(iii)目的片段连接反应

连入vWF片段的连接反应体系如表12所示：

表12 连入vWF连接反应体系

16℃连接反应过夜。连接产物转化、挑克隆及鉴定方法同前。获得的中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF经测序鉴定正确。

(2)中间载体pcDNA3.1(-)-hFVmBDD-IRES-vWF的酶切鉴定结果

构建所得中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF-neo载体大小为19452bp。理论上，PuvI酶切片段的大小分别为3316bp，6144bp，9992bp；KpnI酶切片段的大小分别为553bp，3293bp，3968bp，4450bp，7188bp；EcoRI酶切片段的大小分别为347bp，1728bp，2048bp，5626bp，9703bp；BamI酶切片段的大小分别为2763bp，3444bp，5987bp，7258bp。详细酶切结果显示与理论值相符，酶切鉴定的电泳结果如图6所示。

5、构建目的载体dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF

目的载体dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF的构建方法包括以下步骤：

(1)各连接片段的获得、连接及克隆挑取

(i)载体片段的获得

双酶切中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF、补平、去磷酸化并回收载体片段，其具体步骤及反应体系如表13所示：

表13 NheI、MluI双酶切pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF质粒反应体系

37℃反应5h；补平处理：

向以上体系内加T4 polymerase(NEB) 2μl

dNTP 8μl

12℃补平15min；灭活：向体系内加0.5M的EDTA，72℃，20min，使酶失活；去磷酸化处理：向向以上体系内加CIP(NEB)2μl，37℃反应1h；以上产物电泳，胶回收试剂盒回收载体片段。

(ii)P1A3启动子片段的酶切、补平及回收

此处P1A3来源于pGEM-5Zf(+)-P1A3载体，该载体的构建方法可参考文献Huang Zan，YAN JingBin，HUANG Ying，Sun Qiong，XIAO YanPing，Huang Ying，ZENG YiTao.HighExpression of Human FlX(hFIX)in transgenic mice directed by goatβ-casein gene promoter.ActaGenetica Sinica.2002，29(3)：206-211.。pGEM-5Zf(+)-P1A3载体的酶切体系如表14所示：

表14 NotI大量酶切pGEM-5Zf(+)-PIA3质粒反应体系

37℃反应5h。

补平处理：向以上体系内加T4 polymerase(NEB) 2μl

dNTP 8μl

12℃补平15min；以上产物电泳，胶回收试剂盒回收载体片段。

(iii)连接反应

连接体系如表15所示：

表15 连入vWF连接反应体系

16℃连接反应过夜。连接产物转化、挑克隆及鉴定方法同前。获得的中间载体dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF经测序鉴定正确。

(2)目的载体dpcDNA3.1(-)-PIA3-hFVIIIBDD-IRES-vWF的鉴定：

理论上，构建成功的目的载体dpcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF经SmaI酶切片段的大小分别为223bp，387bp，802bp，1228bp，1781bp，2030bp，2106bp，16759bp；ScaI酶切片段的大小分别为33bp，937bp，2703bp，3128bp，3426bp，4661bp，10428bp；SacI酶切片段的大小分别为148bp，1890bp，3591bp，5081bp，6176bp，8430bp；NdeI酶切片段的大小分别为67bp，86bp，324bp，350bp，778bp，2420bp，2910bp，18381bp；XbaI酶切片段的大小分别为265bp，1411bp，2633bp，4329bp，16678bp。详细酶切结果显示与理论值相符，后续测序结果显示各片段正确连接，所得目的载体的酶切鉴定电泳结果如图7所示。

dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF载体的详细构建流程如图1所示，所得目的载体大小为25316bp，该载体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

实施例2细胞水平实验验证所得载体有效

利用实施例1所得dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF质粒和pcDNA3.1(-)-vWF质粒转染HC-11细胞(HC-11细胞购买自ATCC)，以中间载体pcDNA3.1(-)-hFVIIIBDD-IRES-vWF质粒的直接PCR产物为阳性对照，48h后收集细胞，抽提细胞的RNA，所得RT-PCR结果显示在细胞水平上利用质粒dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF和质粒pcDNA3.1(-)-vWF瞬时转染的细胞系中均转录vWF基因，所得RT-PCR结果如图8所示。图8中泳道1为转染P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF所得细胞系的样品，泳道2为转染pcDNA3.1(-)-vWF所得细胞系的样品。

对获得的cDNA模板进行hFVIIIBDD的PCR扩增，验证dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF共表达载体在细胞水平可以转录hFVIIIBDD基因。共表达载体转染HC-11细胞后hFVIIIBDD基因的转录分析如图9所示。图9中泳道1为转染P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF所得细胞系的样品，泳道2为转染pcDNA3.1(-)-vWF所得细胞系的样品。

RT-PCR实验方法包括以下步骤：

(1)逆转录获得cDNA模板

每组取1μg的RNA进行逆转录得到cDNA模板。RT反应体系如表16所示：

表16 逆转录反应体系(20μl)-I

70℃，10min，立即冰上放置3min；然后向以上体系内加入逆转录酶等，逆转录反应体系见表17：

表17 逆转录反应体系(20μl)-II

42℃，1h；70℃，10min，冰上放置至少3min；经过这两步实验获得的便是cDNA模板，保存条件为-20℃。

(2)PCR的模板为RT获得的cDNA，RT-PCR反应体系如表18所示及条件同前。

vWF的PCR引物如下，扩增获得的片段为491bp：

hvWF-F：5’-AGTCCTGCTGTCAGACAGATAC-3’(SEQ ID NO：7)

hvWF-R：5’-CACACTGCCTATACTCCATACC-3’(SEQ ID NO：8)；

hFVIIIBDD基因引物序列：上游引物5′-GTAGAATTCACGGATCACCT-3′(SEQ ID NO：9)，

下游引物5′-TACACCAACAGCATGAAGAC-3′(SEQ ID NO：10)；

内参基因β-actin引物序列：

上游引物：5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′(SEQ ID NO：11)，

下游引物：5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′(SEQ ID NO：12)。

表18 RT-PCR反应体系

通过以上细胞水平的实验结果证明pcDNA3.1(-)-vWF载体和本发明所述dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF共表达载体，在细胞水平都能转录出vWF的mRNA，并且利用P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF共表达载体转染HC-11细胞后能检测出hFVIIIBDD基因的转录。上述结果显示pcDNA3.1(-)-vWF(即CMV-vWF)载体和dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF共表达载体(即P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF载体)在细胞水平都能正常地转录表达。

实施例3转基因小鼠家系的建立及鉴定

我们通过显微注射，获得了原代转基因小鼠，原代转基因小鼠的制备方法包括以下步骤：

(1)受精卵供体鼠的准备

选择7周龄的发情母鼠，腹腔注射10U孕马血清促性腺激素(PMS)，此后第三日再分别注射10U的人促绒毛膜性激素(HGG)，然后与公鼠放在同一笼内(公母1对1)。第四日早晨检查母鼠有无阴栓，若有说明已交配，可作为受精卵供体。

(2)假孕受体鼠的制备

供体鼠注射HGG的当天，将发情的雌鼠与输卵管结扎了的公鼠以1对1合笼。次早晨检查母鼠有无阴栓，若有可作为假孕受体鼠。

(3)受精卵的采集

(i)提前对动物房进行紫外消毒，所用一切物品均隔离包装并高压灭菌。

(ii)在培养皿中用移液枪吸取80μl的M2培养液(不加透明质酸)滴成一滴，如此在不同位置滴多个液滴用于清洗受精卵。在另一培养皿中，以同样的方式滴数个M16的液滴并覆盖以轻质石蜡油，用于放置洗涤后的受精卵，此培养皿放在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育。在第三个培养皿中滴加含有透明质酸的M2培养液，用来放置剪切的输卵管。

(iii)颈椎脱臼法处死受精卵供体鼠，70％酒精消毒，在小鼠背部脊椎两侧纵向切开，剥离皮肤，再向腹壁同样切开，用镊子取出卵巢、输卵管及子宫。将输卵管完整切下放入含有透明质酸的M2培养液中。

(iv)撕开输卵管的壶腹部，用Flushing pipet依次收集受精卵，并置于M2培养液(不加透明质酸)的液滴中。再将受精卵吸起移至另一个液滴，以此方法清洗数次，在选择合适的受精卵时，也去除了透明质酸酶，

(v)取出培养箱中孵育的培养皿，将清洗过后的受精卵移至盖以轻质石蜡油的M16液滴中。整个过程一般可得受精卵20-80枚，理想状态的受精卵雄雌原核清晰，有完整的透明带，形态饱满。若原核发布不达标，可在37℃，5％CO₂的培养箱孵育一段时间。

(4)显微注射受精卵

用于显微注射的载体片段，用特殊胚胎水溶解后，稀释为2-4ng/μl进行注射，若片段超过10kb，一般稀释为2ng/μl。

本实验方案中分别利用质粒dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD(即P1A3-hFVIIIBDD小鼠)(该质粒构建方法见王晴博士毕业论文：《人凝血因子VIII基因在细胞和小鼠水平表达研究》2013、05)和dpcDNA3.1(-)-P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF(即P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF小鼠)制备三种不同转基因原代小鼠。

(i)滴20-30μlM2培养液于凹孔载波片的中央，再覆以轻质石蜡油，用移卵管将待注射的受精卵移入培养液中，并将载玻片移至显微注射仪，调节焦距准备实验。

(ii)将注射针针头放入DNA溶液中，使注射针自动吸入注射用DNA片段，体视镜下检查注射针内是否有气泡。若无气泡，则可在注射仪右侧安置注射器，使其处于正压状态避免吸入空气。

(iii)一般用持卵管在显微注射仪的左侧固定受精卵，将注射针快速刺入雄原核，轻轻推动使DNA注入，可见核的体积比原来膨大将近一倍时，快速拔出注射器。如此方式注射多个受精卵，尽量缩短操作时间。

(iv)注射后的受精卵可先在37℃，5％CO2的培养箱孵育，成熟后可用于移植。

(5)已注射受精卵的移植

(i)腹腔注射1％巴比妥，麻醉假孕母鼠。

(ii)在小鼠背部最后一根肋骨处纵行切口，用镊子将小鼠的卵巢、输卵管及子宫暴露。

(iii)持卵管吸入多个以注射的受精卵，并插入输卵管，用嘴缓慢地将受精卵吹至输卵管。

(iv)拔出持卵管后，把所有暴露的组织放回体内。缝合伤口后放回新的笼子。待18-21天后，受精卵可成熟为小鼠，母鼠分娩。

(6)转基因小鼠的繁殖

鉴定获得的阳性小鼠，若要繁殖后代，与野生型昆明白小鼠交配即可。鉴定得的阳性后代再与野生型小鼠交配获得后代，如此反复。

用PCR方法分别鉴定hFVIIIBDD基因和vWF基因，PCR反应体系同前RT-PCR中的PCR反应体系。模板为抽提获得的鼠尾DNA。引物序列同前，反应程序为(1)94℃，10min；(2)94℃，30sec；(3)58℃，30sec；(4)72℃，30sec，其中步骤(2)-(4)重复33个循环；(5)72℃，10min。获得5只P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF原代转基因小鼠，其中2号转基因小鼠家系的PCR检测结果如图10所示。P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF转基因小鼠基因组DNA的PCR产物电泳显示为250bp大小的hFVIIIBDD片段和491bp大小的vWF片段，与阳性质粒结果一致，而阴性对照的野生型小鼠中未见条带。所得转基因2号小鼠的家系情况见表19。

表19 P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF-2共表达转基因小鼠家系表

本实施中共获得7只P1A3-hFVIIIBDD原代转基因小鼠，其鉴定及检测方法同前所述，此不赘述。

2、检测转基因小鼠的乳汁中hFVIIIBDD的含量、活性及vWF的含量

利用ELISA试剂方法检测hFVIIIBDD的ELISA方法为自己包被并摸索条件，所使用的抗体分别为鼠抗人hFVIII单克隆抗体ab61370(abcam，UK)和绵羊抗hFVIII多克隆抗体ab20721(abcam，UK)，具体实验方法包括以下步骤：

(i)用羊抗人FVIII的多抗，以1∶40000的稀释度包被，每孔120μl，37℃孵育，2h。

(ii)洗板，每次1min，5次；每孔加150μl2％BSA，4℃封闭过夜。

(iii)加样品，每孔120μl，37℃孵育，2h；样品稀释浓度为1∶50-1∶100。

(iv)洗板，用鼠抗人FVIII的单抗1∶80000稀释，每孔120μl，37℃孵育，2h。

(v)洗板，加入带有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，1∶8000稀释，每孔120μl，37℃孵育，2h。

(vi)洗板，加入TMB显色液，每孔100μl，待标准品显色梯度明显后加入100μl1M H2SO4终止反应。

(vii)用酶标仪读取数据(450nm)。

检测hFVIIIBDD的活性方法为活化部分凝血酶活时间(APTT)测定，使用的仪器为自动血凝仪(ACL TOP700)，记载了利用所述方法检测乳汁中hFVIIIBDD活性方法的文献如下(i)，检测结果如表20和表21所示。

检测vWF的ELISA试剂盒购自Ray Biotech，(货号：ELH-vWF)检测获得的转基因小鼠乳汁中目的蛋白的含量(检测方法请参见以下文献：(i).Chen C-M，Wang C-H，Wu S-C，LinC-C，Lin S-H，Cheng WTK.Temporal and spatial expression of biologically active human factorVIII in the milk of transgenic mice driven by mammary-specificbovine lactalbumin regμlationsequences.Transgenic Res 2002；11：257-68.(ii).L.TANG，L.LEONG，D.SIM et al.vonWillebrand factor contributes to longer half-lifeof PEGylated factor VIII in vivo.Haemophilia.2013；19：539-545.)。

表20 P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF-2转基因小鼠乳汁中目的蛋白含量

表21 P1A3-hFVIIIBDD-54转基因小鼠乳汁中目的蛋白含量

3、不同品系转基因小鼠乳汁中vWF对hFVIII的稳定性作用

P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF-2家系和P1A3-hFVIIIBDD-54号家系(该家系详细请参见博士论文：《人凝血因子VIII基因在细胞和小鼠水平表达研究》王晴2013年05月)比较转基因小鼠乳汁中的hFVIII在37℃下浓度和活性的半衰期发现，P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF-2家系小鼠乳汁中的hFVIII浓度和活性的半衰期平均值分别为3.5h和3.2h；而P1A3-hFVIIIBDD-54号家系小鼠乳汁中的hFVIII浓度和活性的半衰期平均值分别为2.5h和2.0h，结果见图11所示。该结果表明，在共表达转基因小鼠乳汁中，vWF对人凝血因子VIIIBDD有显著的稳定作用。

以上结果表明，在共表达P1A3-hFVIIIBDD-IRES-vWF转基因小鼠乳汁中，vWF因子的存在对凝血因子VIII有显著提高稳定性的作用。对于转基因动物乳腺生物反应器产生的乳汁来说，同样有延长凝血因子VIII半衰期的作用，因此hFVIIIBDD因子和vWF因子在动物乳腺反应器中的共表达可以显著提高乳汁中人凝血因子VIII的稳定性。

应理解，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体，其特征在于，包括骨架质粒和hF VIIIBDD-IRES-vWF片段，其中所述骨架质粒为pcDNA3.1(-)质粒，hF VIIIBDD-IRES-vWF片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体，其特征在于，所述共表达载体的启动子为P1A3启动子。

3.一种包含如权利要求1-2任一项所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体的宿主细胞是HC-11细胞株。

4.一种利用动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII的方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

(1)利用权利要求1或2所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体，通过显微注射法制备转基因哺乳动物；

5.根据权利要求4所述利用动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII的方法，其特征在于，步骤(1)所述转基因哺乳动物为转基因牛、转基因羊或者转基因小鼠。

6.权利要求1-2任一项所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体在制备基因治疗药物中的应用。