CN105524941A - 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法 - Google Patents
一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105524941A CN105524941A CN201610035065.9A CN201610035065A CN105524941A CN 105524941 A CN105524941 A CN 105524941A CN 201610035065 A CN201610035065 A CN 201610035065A CN 105524941 A CN105524941 A CN 105524941A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene transfer
- bird
- transfer system
- specific
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 244000144977 poultry Species 0.000 title abstract description 9
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 title abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 238000003822 preparative gas chromatography Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 27
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 12
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 8
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 5
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 claims description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 101100263436 Drosophila melanogaster vas gene Proteins 0.000 description 21
- 101100049051 Penaeus vannamei vasa gene Proteins 0.000 description 21
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 17
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 17
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 14
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 11
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 101100442582 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) spe-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 2
- 210000002298 blastodisc Anatomy 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 101150089602 vasa gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统和方法。该基因转移系统包括含有具有如SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列的vasa启动子的转座酶辅助质粒。该基因转移方法包括：(1)使用生物工程方法，构建含有vasa启动子或者含有vasa启动子和通用增强子元件的转座酶辅助质粒；(2)使用生物工程方法，构建含有需要转移的目的基因表达盒的转座子供体质粒；(3)提取质粒后，将上述转座子供体质粒和转座酶质粒按1:2比例混合均匀，调整其终浓度为500ng—1.5μg/μL；(4)将步骤(3)中所得的混合质粒使用包埋剂包裹后，转染禽类早期胚胎血液中PGCs细胞。通过本发明，可以实现外源基因在禽类胚胎PGCs基因组中高效特异整合，从而达到提高转基因禽的制备效率的目的。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程领域，涉及建立一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统以及基于此基因转移系统介导的禽类转基因方法。
背景技术
转座子是一类在基因组上可以自由跳跃(复制或移位)的DNA序列，由Mc.Clintock于1940年首先在玉米中发现，以后又陆续在细菌、真菌及昆虫等各种生物中发现。近年来，转座子系统已经应用于非病毒介导的转基因，尤其是转基因哺乳动物方面。但在转基因禽类制备方面，基于禽类特殊的生理生殖特点，即：胚胎的早期发育在母禽的生殖系统就已启动，因而即使是刚产出的蛋，也已发育成具有约60000个形态上未分化的全能细胞的胚盘(位于囊胚腔)，以及禽类受精卵和早期胚胎具有硕大的卵黄、难以直接进行基因操作等原因，禽类转基因技术一直落后于其它动物。
转基因禽类制备具有繁殖周期短、生产性能高、研究成本较低等优点，其输卵管是生产蛋白质的天然“发酵罐”。近年来禽蛋生物反应器以其自身的优势和不可限量的前景渐渐成为一个新的研究热点。其中，转基因鸡制备主要集中于病毒侵染X期胚盘、体外或体内转染PGCs等方法。这些方法虽然取得了一定成果，但仍然存在转基因效率不高、基因表达抑制和基因沉默现象以及生物安全性等问题，所以转基因禽类的制备一直以来都缺少一种有效的、非病毒介导的基因转化系统。转座子介导技术的使用，提高了外源基因在鸡基因组的整合效率，展示了制备转基因禽类的前景。常用的转座子系统有鲑鱼SB(Sleepingbeauty)、PB(PiggyBac)、Tol2等，都是根据“切割-黏贴”的方式进行转座，可以有效地提高转基因动物制备效率，但转座子系统不具有生殖细胞特异性，其在体细胞和生殖细胞中基因转移率相当，所以转基因后代仍存在嵌合体多、性腺基因转移效率低下等问题。
原始生殖细胞(PGCs)是精子和卵子的前体细胞，在PGCs生殖质中含有线粒体16SrRNA和Vasa、Oska、Tudor基因蛋白。Vasa是生殖发育调控重要的基因之一，在胚胎发育过程中只在性腺组织中表达，具有组织特异性。Vasa的同源物也在包括鸡在内的很多物种中证实：NaokiTsunekawa等(NaokiTsunekawa,MitsuruNaito,YasuhiroSakai,TakaoNishidaandToshiakiNoce,Isolationofchickenvasahomologgeneandtracingtheoriginofprimordialgermcells.Development,2000,127:2741-2750)发现了生殖系特异表达的鸡的vasa同源基因CVH(chickenvasahomologue)蛋白贯彻整个鸡胚发育期及成年睾丸和卵巢中，表明了CVH与鸡胚生殖系的发育相关；同时Minematsu等(TAKEOMINEMATSU,TAKASHIHARUMI,ANDMITSURUNAITO,GermCell-SpecificExpressionofGFPGeneInducedbyChickenvasaHomologue(Cvh)PromoterinEarlyChickenEmbryos.MOLECULARREPRODUCTIONANDDEVELOPMENT,2008,75:1515–1522)也通过直接将不同长度CVH启动子体内、体外转染鸡胚生殖细胞的实验，验证了该vasa同源基因CVH的生殖细胞特异性，且得出了“增强基因表达需要CVH基因5’侧翼区序列长度至少为1555bp”的结论。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、基因转移效率高的特异于禽类原始生殖细胞(PGCs)的基因转移系统及方法。本发明的发明理念是：构建特异于禽类PGCs的基因转移系统，该基因转移系统的转座酶辅助质粒含有vasa启动子，由vasa启动子驱动转座酶，利用vasa启动子能够在PGCs中特异表达的特性，实现转座酶在PGCs中的特异性表达，从而使得该基因转移系统的转座子供体质粒所携带的目的基因表达盒在PGCs特异性切割整合，由此提高转座子介导目的基因(如：报告基因或者外源基因等)在PGCs的基因转移特异性和效率；此外，可以在该基因转移系统的启动子前增加通用增强子元件(即无组织特异性的增强子元件，如SV40)，进一步驱动转座酶在PGCs中高效特异表达；转染禽类早期胚胎血液中PGCs细胞，实现外源基因在禽类胚胎PGCs基因组中高效特异整合，从而提高转基因禽的制备效率，推动转基因禽研究进展。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，包括转座子系统，所述转座子系统包括转座子供体质粒和转座酶辅助质粒，其中，所述转座酶辅助质粒含有具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的vasa启动子。
为了达到更高的基因转移效率，所述转座酶辅助质粒还含有通用增强子元件(即无组织特异性的增强子元件)；优选地，所述通用增强子元件为具有如SEQIDNo.2核苷酸序列所示的SV40增强子元件。
所述转座子系统可以为SB转座子系统，也可以是PB、Tol2和ZB等常用转座子系统。
所述转座子供体质粒可以是pT3-PST，包括PB、SB、Tol2转座子两侧末端重复序列和Msc1克隆位点，克隆位点可插入需要转移的目的基因表达盒。
所述目的基因盒可以是报告基因表达盒，或者其它外源基因表达盒。
优选地，所述转座子系统为SB转座子系统时，转座酶质粒包括SB100X转座酶cDNA序列。
优选地，在转染上述特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统时，使用可调节气体压力的玻璃毛细管细针进行显微注射。该方法操作简单快捷、效率高、实验重复性好。相比之下，禽胚注射通常采用口吸管注射法或显微操作仪，这两者对操作者技术水平要求较高。口吸管法显微注射剂量受人为因素影响较大，导致实验重复性较差；显微操作仪价格昂贵，操作难度较大。
本发明还提供了一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用生物工程方法，构建如上所述的含有vasa启动子或者含有vasa启动子和通用增强子元件的转座酶辅助质粒；
(2)使用生物工程方法，构建含有需要转移的目的基因表达盒的转座子供体质粒；
(3)提取质粒后，将步骤(2)中所得的转座子供体质粒和步骤(1)中所得的转座酶质粒按1:2比例混合均匀，调整其终浓度为500ng—1.5μg/μL；
(4)将步骤(3)中所得的混合质粒使用包埋剂包裹后，转染禽类早期胚胎血液中PGCs细胞，从而使得转座酶仅在PGCs细胞特异表达，提高嵌合体禽类生殖系转基因效率。
优选地，步骤(4)中所述的包埋剂为多聚乙烯亚胺(PEI)。
本发明所达到的技术效果是：
1)本发明构建了具有PGCs特异表达特性的基因转移系统，该系统包括含有vasa启动子的转座子系统，vasa启动子是生殖细胞特异启动子，能够指导下游基因在生殖细胞特异的表达；此外，在启动子前增加的通用增强子元件，可以进一步实现转座酶在PGCs中高效特异表达；
2)本发明所提供的基因转移系统，特异于禽类PGCs，可以从基因表达特异性和强度方面有效地提高转座子介导外源基因在PGCs的基因转移效率，从而更有效地提高转基因禽类制备效率；
3)本发明提供的基于转座子系统的基因转移方法，操作简单快捷、实验重复性好，PGCs特异性强，生殖系基因转移效率高。经过胚胎水平验证，该方法能够高效介导基因转染PGCs，因而可应用于多个生物技术领域：例如，a)使用本发明中给出的方法可有效地将目的基因盒整合到宿主PGCs基因组中，提高禽类胚胎生殖系转基因效率，显著提高禽类转基因效率；b)可以应用于制备转基因禽类生物反应器，在蛋清中生产人源珍贵药用蛋白。
附图说明
图1是PCR扩增vasa启动子产物电泳图。
图2是PCR扩增转座酶SB100X产物电泳图。
图3是PCR扩增SV40增强子产物电泳图。
图4是pSV40En-GFP质粒酶切产物电泳图。
图5是pSV40En-VASA-GFP质粒酶切产物电泳图。
图6是pSV40En-VASA-GFP质粒图谱。
图7是pSV40En-VASA-SB100X质粒酶切产物电泳图。
图8是pSV40En-VASA-SB100X质粒图谱。
图9是不同启动子质粒显微注射鸡胚14D后荧光图。图中，P:阳性；N:正常对照。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，在本具体实施例中着重以鸡类为例，结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。由于鸡、鹌鹑、鸽子、火鸡、鸵鸟等均为家禽中的陆禽，其胚胎可在母体外人工孵化,在胚胎早期发育过程中，PGCs均具有相似的迁移特性。禽类的vasa基因高度同源，且在PGCs特异表达。因此本发明所述的技术方案适用于包括鸡、鹌鹑、鸽子、火鸡、鸵鸟等禽类。
实施例1
本实施例1是转座酶质粒pSV40En-VASA-SB100X的构建方法。该转座酶质粒包括PGC特异启动子(VASA)、SB100X转座酶cDNA序列和RabbitglobinPolyA序列、增强表达的SV40增强子(SV40Enhancer)元件。其中，RabbitglobinPolyA序列来自pCAG-GFP载体，长度为535bp。
相关构建方法主要包括以下步骤：
1)vasa启动子元件PCR引物的设计及其克隆
根据文献(TAKEOMINEMATSU,TAKASHIHARUMI,ANDMITSURUNAITO,GermCell-SpecificExpressionofGFPGeneInducedbyChickenvasaHomologue(Cvh)PromoterinEarlyChickenEmbryos.MOLECULARREPRODUCTIONANDDEVELOPMENT,2008,75:1515–1522)所示的vasa基因序列，自行设计了vasa启动子元件的PCR扩增引物，其核苷酸序列如下：
VASA-F：5’-ATTCTAGAGGCAACCATGACACAAGCAT-3’；
VASA-R：5’-TACCCGGGAGCGAATGCCAGCAGCC-3’。
以鸡血液提取的基因组DNA为模板，按上述设计的扩增vasa启动子元件的引物扩增启动子片段。反应体系总体积为50μL，包括10μL5xSFBuffer、1μLdNTP、2μL10μM引物VASA-F、2μL10μM引物VASA-R、1μLPhantaTMSuper-Fidelity和2μL基因组DNA，加超纯水至50μL。PCR扩增程序：预变性94℃5min；然后94℃40s，62℃40s，72℃2m30s，共30个循环；最后72℃10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图1)，获得预期2198bp大小的产物片段。将PCR产物琼脂糖凝胶回收，与T载体连接，进行TA克隆，筛选出阳性克隆测序，测序比对正确后保存供下一步连接用。
2)SB100X转座酶编码区(ORF)的克隆
以pCMV-SB100X质粒(LajosMátés,MarineeKLChuah,EyayuBelay,etal.,MolecularevolutionofanovelhyperactiveSleepingBeautytransposaseenablesrobuststablegenetransferinvertebrates.NatureGenetics,2009,41,753-761)为模板，按所述文献中列举的扩增SB100X-ORF的引物扩增转座酶基因片段，所述引物的核苷酸序列分别为：SB100X-ORFF：5’-TACCCGGGGCCACCATGGGAAAATCAAAAGAAAT-3’；SB100X-ORFR：5’-TTGCGGCCGCCTAGTATTTGGTAGCATTGC-3’。反应体系总体积为50μL，包括10μL5xSFBuffer、1μLdNTP、2μL10μM引物SB100X-ORFF、2μL10μM引物SB100X-ORFR、1μLPhantaTMSuper-Fidelity和2μLpTNT-SB100X模板质粒，加超纯水至50μL。PCR扩增程序：预变性94℃5min；然后94℃40s，60℃40s，72℃1m30s，共30个循环；最后72℃10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图2)，获得预期1040bp大小的产物片段。将PCR产物琼脂糖凝胶回收，与T载体连接，进行TA克隆，筛选出阳性克隆测序，测序比对正确后保存供下一步连接用。
3)SV40Enhancer元件的克隆
以pGL3-control质粒(pGL3-control载体为商品化质粒，购自Promega公司)为模板，设计了扩增SV40Enhancer的引物扩增启动子片段，所述引物的核苷酸序列分别为：
SV40En-F:5’-ATACTAGTTGAACGATGGAGCGGAGA-3’；
SV40En-R：5’-GCTCTAGACGCTGTGGAATGTGTGTCA-3’。
反应体系总体积为50μL，包括10μL5xSFBuffer、1μLdNTP、2μL10μM引物SV40En-F、2μL10μM引物SV40En-R、1μLPhantaTMSuper-Fidelity和3μLpGL3-control，加超纯水至50μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃1min，循环30次；72℃10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图3)，获得预期大小(约252bp)的产物片段。将PCR产物琼脂糖凝胶回收，与T载体连接，进行TA克隆，筛选出阳性克隆测序，测序比对正确后保存供下一步连接用。
4)pSV40En-GFP的载体构建
用限制性内切酶Spe1和Xba1将SV40Enhancer从T载体中切出，琼脂糖凝胶回收。同时用Spe1和Xba1双酶切pCAG-GFP(pCAG-GFP为商品化质粒，购自Addgene公司)，切胶回收3942bp片段作为载体框架。将SV40Ehancer和载体框架连接后，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定(如图4)，分别获得预期的3492bp大小的载体框架和252bp大小的SV40增强子片段，经酶切鉴定阳性克隆者命名为pSV40Enhancer-GFP。
5)报告基因表达质粒pSV40En-VASA-GFP的载体构建
用限制性内切酶Xma1和Xba1将vasa启动子从T载体中切出，琼脂糖凝胶回收。同时用Xma1和Xba1双酶切pSV40Enhancer-GFP，切胶回收4067bp片段作为载体框架。将Vasa启动子和载体框架连接后，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定，获得预期大小的片段4097bp和2198bp(如图5)，经酶切鉴定后阳性克隆者命名为pSV40Enhancer-VASA-GFP(如图6)，图中列出部分酶切位点及相应的元件名称。
6)转座酶真核表达质粒pSV40En-VASA-SB100X的构建
用限制性内切酶Xma1和Not1将SB100X从T载体中切出，琼脂糖凝胶回收。同时用Xma1和Not1双酶切pSV40Enhancer-VASA-GFP，切胶回收5516bp片段作为载体框架。将SB100X和载体框架连接后，转化感受态细胞Top10，挑单菌落至液体培养基LB培养，提质粒进行电泳及酶切鉴定，获得预期大小的片段5516bp和1040bp(如图7)，经酶切鉴定后阳性克隆者命名为pSV40En-VASA-SB100X(如图8)，图中列出部分酶切位点及相应的元件名称。该转座酶辅助质粒的序列如SEQIDNo.3所示。序列中，SV40增强元件19-267；Vasa启动子267-2461；SB100XCDS2461-3479；RabbitglobinPolyA3503-4037。
实施例2
实施例2是pSV40En-VASA-SB100X介导目的基因在鸡胚的基因转移测试结果，以及与含有其他可表达转座酶的转座子系统(如：含有巨细胞病毒启动子(CMV))的转座子系统介导目的基因表达的比较。
1、受精蛋的准备
实验用种蛋(农大三号)购自中国农业科学院家禽研究所。实验分为四组：pSV40En-VASA-SB100X组、pCMV-SB100X组、开窗正常对照组及不开窗对照组，每组重复3次，实验组每次20枚蛋，对照组每次5枚蛋。
2、质粒的准备
pSV40En-VASA-SB100X、pCMV-SB100X、pT3-PST-CAG-GFP质粒用无内毒素质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)提取。其中，本实施例中转座子载体pT3-PST-CAG-GFP的构建方法，具体方法参见参考文献(沈丹，谢雨琇，李庆平等,多转座子载体的构建及转座特性比较研究.中国农业科学,2015,48(11):2270-2278)。该转座子供体质粒(pT3-PST)包括PB、SB、Tol2转座子两侧末端重复序列和Msc1克隆位点，克隆位点可插入需要转移的目的基因表达盒。所述目的基因盒可以是报告基因表达盒，或者其它外源基因表达盒。
将pT3-PST-CAG-GFP质粒和pSV40En-VASA-SB100X/pCMV-SB100X转座酶质粒按1:2比例混合均匀，终浓度调整为1μg/μL,用PEI包裹后用于显微注射。
3、显微注射鸡胚
实验分为四组：pSV40En-VASA-SB100X组、pCMV-SB100X组、开窗正常对照组及不开窗对照组，每组重复3次，实验组每次20枚蛋，对照组每次5枚蛋。将3μL转染液装入玻璃毛细管拉成的细针，通过调节气体压力，将转染液注入14-16HH胚胎血管内，于孵化的第14D取性腺、心、肝、脾、肺、肾、肠、胃、脑等组织用体式荧光显微镜观察胚胎各组织EGFP表达水平，记录阳性胚胎数，同时统计孵化第7D和14D的成活率。
4、不同启动子介导目的基因表达检测
在荧光显微镜下检测荧光表达情况，结果显示：实验组pSV40En-VASA-SB100X组和pCMV-SB100X组在显微注射后14D性腺表达绿色荧光蛋白(EGFP)；并且vasa启动子介导的EGFP只在性腺中表达，性腺阳性率为11.03％，而CMV启动子组则在肠、脾、大脑等组织均有不同程度表达，性腺阳性率1.67％，部分荧光照片如图9所示。图9中，性腺组织并排为一个阳性(P)，一个正常对照(N)，正常对照(N)在荧光场下不发光，因而看不清组织轮廓；对照组(肠)也不发荧光，故在荧光场下看不出组织轮廓。从图9中，可以看出相比于在肠和性腺都具有荧光表达的pCMV-SB100X，pSV40En-VASA-SB100X具有性腺表达的特异性。此外，在相同曝光参数等情况下，还可根据图9的绿色荧光强度判断出，pSV40En-VASA-SB100X组性腺表达强度要高于pCMV-SB100X组。本实施例2的结论：通过显微注射pSV40En-VASA-SB100X转染液至14-16HH胚胎血管内进行PGCs转染，在vasa启动子和SV40增强子元件指导下，SB转座酶在PGCs中高效特异表达，从而介导含绿色荧光蛋白报告基因表达盒的转座子发生转座，整合进入PGCs基因组，这些转基因阳性PGCs迁移至生殖脊，生殖脊发育成性腺后，性腺能够检测到绿色荧光报告基因的表达。提示本基因转移系统能够有效介导外源基因整合至PGCs基因组，且具有PGCs转染的特异性和高效性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，包括转座子系统，所述转座子系统包括转座子供体质粒和转座酶辅助质粒，其中，所述转座酶辅助质粒含有具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的vasa启动子。
2.如权利要求1所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，所述转座酶辅助质粒还含有通用增强子元件。
3.如权利要求2所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，所述通用增强子元件为具有如SEQIDNo.2核苷酸序列所示的SV40增强子元件。
4.如权利要求1或者3所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，所述转座子系统为SB、PB、Tol2和/或ZB转座子系统。
5.如权利要求4所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，所述转座子供体质粒是pT3-PST，包括PB、SB、Tol2转座子两侧末端重复序列和Msc1克隆位点，克隆位点可插入需要转移的目的基因表达盒。
6.如权利要求5所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，所述目的基因盒是报告基因表达盒或者其它外源基因表达盒。
7.如权利要求6所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，所述转座酶质粒还包括SB100X转座酶cDNA序列和RabbitglobinPolyA序列。
8.如权利要求1或者7所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统，其特征在于，在转染所述特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统时，使用可调节气体压力的玻璃毛细管细针进行显微注射。
9.一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用生物工程方法，构建如权利要求1、2或者7所述的含有vasa启动子的转座酶辅助质粒的基因转移系统；
(2)使用生物工程方法，构建含有需要转移的目的基因表达盒的转座子供体质粒；
(3)提取质粒后，将步骤(2)中所得的转座子供体质粒和步骤(1)中所得的转座酶质粒按1:2比例混合均匀，调整其终浓度为500ng—1.5μg/μL；
(4)将步骤(3)中所得的混合质粒使用包埋剂包裹后，转染禽类早期胚胎血液中PGCs细胞。
10.如权利要求9所述的一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移方法，其特征在于，步骤(4)中所述的包埋剂为多聚乙烯亚胺(PEI)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610035065.9A CN105524941A (zh) | 2016-01-19 | 2016-01-19 | 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610035065.9A CN105524941A (zh) | 2016-01-19 | 2016-01-19 | 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105524941A true CN105524941A (zh) | 2016-04-27 |
Family
ID=55767469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610035065.9A Pending CN105524941A (zh) | 2016-01-19 | 2016-01-19 | 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105524941A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728477A (zh) * | 2017-04-24 | 2018-11-02 | 华东理工大学 | 一种高效的转座突变系统及构建方法 |
| CN110484632A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-22 | 扬州大学 | 一种鉴别比利时兔和野兔的分子标记及其方法 |
| CN112626128A (zh) * | 2012-04-20 | 2021-04-09 | 联邦科学技术研究组织 | 细胞转染方法 |
| CN113692225A (zh) * | 2019-03-05 | 2021-11-23 | 以色列农业和农村发展部农业研究组织(范卡尼中心) | 经基因组编辑的鸟类 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102695798A (zh) * | 2009-11-23 | 2012-09-26 | 水慷科技公司 | 母系诱导的动物不育 |
| CN104195112A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-12-10 | 昆明市第一人民医院 | 一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法 |
-
2016
- 2016-01-19 CN CN201610035065.9A patent/CN105524941A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102695798A (zh) * | 2009-11-23 | 2012-09-26 | 水慷科技公司 | 母系诱导的动物不育 |
| CN104195112A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-12-10 | 昆明市第一人民医院 | 一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| EU280324.1: "Gallus gallus CVH gene,promoter region and partial cds", 《GENBANK》 * |
| TAKEO等: "Germ Cell-Specific Expression of GFP Gene Induced by Chicken vasa Homologue(Cvh)Promoter in Early Chicken Embryos", 《MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT》 * |
| U47297.2: "Cloning vector pGL3-Enhancer,complete sequence", 《GENBANK》 * |
| 周智慧: ""睡美人"转座子介导外源基因在鸡输卵管和睾丸整合表达特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑（电子期刊）》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112626128A (zh) * | 2012-04-20 | 2021-04-09 | 联邦科学技术研究组织 | 细胞转染方法 |
| CN108728477A (zh) * | 2017-04-24 | 2018-11-02 | 华东理工大学 | 一种高效的转座突变系统及构建方法 |
| CN108728477B (zh) * | 2017-04-24 | 2022-02-22 | 华东理工大学 | 一种高效的转座突变系统及构建方法 |
| CN113692225A (zh) * | 2019-03-05 | 2021-11-23 | 以色列农业和农村发展部农业研究组织(范卡尼中心) | 经基因组编辑的鸟类 |
| CN110484632A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-22 | 扬州大学 | 一种鉴别比利时兔和野兔的分子标记及其方法 |
| CN110484632B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-04-22 | 扬州大学 | 一种鉴别比利时兔和野兔的分子标记及其方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230189769A1 (en) | Process for using crispr to transfect primordial germ cells in avians | |
| Mozdziak et al. | Status of transgenic chicken models for developmental biology | |
| Ivarie | Avian transgenesis: progress towards the promise | |
| JP5889198B2 (ja) | 動物において母性的に誘導される不稔性 | |
| CN105524941A (zh) | 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法 | |
| AU2012258786B2 (en) | Transgenic chicken comprising an inactivated immunoglobulin gene | |
| US20140331346A1 (en) | Controllable on-off method for fish reproduction | |
| JP6644276B2 (ja) | 家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞、遺伝子改変家禽の生産方法及び家禽卵 | |
| Shuman | Production of transgenic birds | |
| Sun et al. | Evaluation of methods for DNA delivery into shrimp zygotes of Penaeus (Litopenaeus) vannamei | |
| CN105018523A (zh) | 一种zb转座子系统及其介导的基因转移方法 | |
| ONO et al. | Production of quail chimera by transfer of early blastodermal cells and its use for transgenesis | |
| CN102747102A (zh) | 一种hsa乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞 | |
| EP1103614B1 (en) | Novel plasmid vector | |
| CN111073963B (zh) | 一种一日龄鉴别鸡受精蛋性别的方法 | |
| DK202170116A1 (en) | Genetically modified salmon which produce sterile offspring | |
| CN113462692B (zh) | 一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用 | |
| CN104313052A (zh) | 一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体 | |
| Wang et al. | Exploring transgene transfer from the transgenic chicken model to its offspring through a nonviral vector | |
| CN117025687A (zh) | 一种转基因不育鸡的制备方法 | |
| Cyriac et al. | Transgenic chicken: methods and applications. | |
| Hyman | Creation of transgenic chicken for production of human therapeutic proteins in ovo. | |
| Volkova et al. | Retroviral-mediated gene transfer as an effective tool for the in vitro genetic transformation of chicken embryonic cells and production of transgenic chickens | |
| Scott et al. | Production of transgenic birds using lentiviral vectors | |
| JP4474017B2 (ja) | 新規プラスミドベクター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160427 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |