JPH09220039A

JPH09220039A - 精子又は卵子への外来遺伝子の導入方法及びトランスジェニック動物の作製方法

Info

Publication number: JPH09220039A
Application number: JP8052278A
Authority: JP
Inventors: Chihiro Koike; 千裕小池
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-14
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 1997-08-26

Abstract

(57)【要約】【課題】外来遺伝子を受精卵に注入する操作を行うこと
なく、受精卵に外来遺伝子を導入してトランスジェニッ
ク動物を得ることができる方法を提供する。【解決手段】（ａ）外来遺伝子とリポソームとの複合体
を、哺乳動物の精巣動脈又は卵巣動脈を介して、前記哺
乳動物の精巣内又は卵巣内に導く工程と、（ｂ）工程
（ａ）を経た前記哺乳動物の有する精子又は卵子と、こ
の哺乳動物の卵子又は精子とを受精させる工程、とを備
える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、精子又は卵子へ
の外来遺伝子の導入を介してトランスジェニック動物を
作製する技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】トランスジェニック動物を作製するため
に行われる、受精卵等への外来遺伝子の導入には、マイ
クロインジェクション法が多く用いられている。マイク
ロインジェクション法は、マイクロマニピュレーターを
用いて、顕微鏡下で、減数分裂後の受精卵をホールディ
ングピペットで保持し、先端が直径１μｍ程度の注入用
のガラスピペットを受精卵に突き刺して、雌性前核ある
いは雄性前核に到達させ、前核内部に外来遺伝子を含ん
だ溶液を注入する方法である。この方法によると、雄性
前核内等での遺伝子の組換えにより、注入された外来遺
伝子が受精卵の染色体に組込まれる。そして、この授精
卵を仮親に移植し、仔を発生、出産させて目的とする遺
伝子を持つトランスジェニック動物を得ることができ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、かかる
マイクロインジェクション法にあっては、核への注入操
作に習熟して初めて、受精卵に傷害を与えないで核内に
外来遺伝子を注入することができる。さらに、実際に、
外来遺伝子が染色体に組込ませた仔を得るには、多くの
受精卵を処理する必要がある。特に、ウシやブタなどの
家畜として有用な大型哺乳類については、細胞質が不透
明なために、前核が良く見えず、前核への注入操作が困
難であるという問題がある。このため、効率良く受精卵
に外来遺伝子を導入することのできる方法が要望されて
いた。

【０００４】一方、精子又は卵子の一方に、予め外来遺
伝子を導入しておいて、これらの精子と卵子とを受精さ
せることにより、受精卵に外来遺伝子を導入することも
できる。これらの生殖細胞では、減数分裂が生じるた
め、外来遺伝子が導入されやすいと考えられる。特に、
精子は活発に生産されており、生体内において外来遺伝
子が導入されやすい状態にあると考えられる。そこで、
本発明者は、精子又は卵子に外来遺伝子を導入した上で
卵子又は精子と受精させることにより、トランスジェニ
ック動物を作製することに着目した。かかる観点からの
トランスジェニック動物の作製方法は、従来にない新規
な方法である。そこで、本発明では、精子又は卵子に外
来遺伝子を導入する方法を提供することを第１の課題と
する。また、本発明では、外来遺伝子を受精卵の前核に
注入する操作を行うことなく、受精卵に外来遺伝子を導
入してトランスジェニック動物を得ることができる方法
を提供することを第２の課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】前記した第１の課題を解
決するための発明は、外来遺伝子とリポソームとの複合
体を、哺乳動物の精巣動脈又は卵巣動脈を介して、前記
哺乳動物の精巣内又は卵巣内に導くことにより、精巣内
の精子又は卵巣内の卵子に外来遺伝子を導入することを
特徴とする精子又は卵子への外来遺伝子の導入方法であ
る。この発明によれば、外来遺伝子とリポソームとの複
合体が、哺乳動物の精巣動脈又は卵巣動脈に注入される
と、血流により、精巣又は卵巣に到達される。精巣又は
卵巣に到達された複合体により、外来遺伝子が精子又は
卵子内に導入される。

【０００６】この発明において、特に、前記外来遺伝子
は直鎖状であることが好ましい。外来遺伝子が直鎖状で
あると、染色体に組み込まれやすいからである。

【０００７】また、この発明において、前記複合体は、
前記哺乳動物に取りつけられ、前記複合体が入ったタン
クと、このタンクに接続され、腎動脈内に開口させた注
入管とを介して、前記精巣動脈又は前記卵巣動脈に注入
されることが好ましい。この方法によると、タンク内の
前記複合体が、継続的に精巣内又は卵巣内に到達され
る。

【０００８】前記した第２の課題を解決するための発明
は、（ａ）外来遺伝子とリポソームとの複合体を、哺乳
動物の精巣動脈又は卵巣動脈を介して、前記哺乳動物の
精巣内又は卵巣内に導く工程と、（ｂ）工程（ａ）を経
た前記哺乳動物の有する精子又は卵子と、この哺乳動物
の卵子又は精子とを受精させる工程、とを備えたことを
特徴とする受精卵への外来遺伝子の導入方法である。こ
の発明によると、哺乳動物の精子又は卵子には、予め、
受精卵に導入しようとする外来遺伝子が導入されてい
る。この精子又は卵子を、卵子又は精子とを受精される
ことにより、受精卵に外来遺伝子が導入される。したが
って、受精卵の前核に、外来遺伝子の注入する操作を行
うことなく、受精卵に外来遺伝子が導入される。

【０００９】この発明において、特に、前記工程（ｂ）
において、前記工程（ａ）を経た哺乳動物を交配させる
ことにより前記哺乳動物の有する精子又は卵子と、この
哺乳動物の卵子又は精子とを受精させることが好まし
い。交配により、精巣から精子を、あるいは卵巣から卵
子を取り出すことなく、簡易に、かつ効率よく、外来遺
伝子の導入された精子又は卵子を、卵子又は精子とを受
精させることができ、受精卵に外来遺伝子が導入され
る。さらに、このまま、雌において、仔を発生させ、ト
ランスジェニック動物を得ることができる。

【００１０】また、この発明においては、前記工程
（ａ）における外来遺伝子は、直鎖状であることが特に
好ましい。外来遺伝子が直鎖状であると、精子又は卵子
の染色体内に組込まれやすい。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につ
き、詳細に説明する。前記第１の発明及び第２の発明に
おいて、精子又は卵子に導入する外来遺伝子は、哺乳動
物において発現させようとする遺伝子の塩基配列を含ん
でいるものを用いることができる。外来遺伝子は、直鎖
状であることが、染色体への組込まれる率が高い点で好
ましい。本発明において、外来遺伝子と複合体を形成す
るリポソームとしては、各種リポソームを任意に用いる
ことができる。本発明に好適に用いられるリポソームと
しては、リポフェクチン試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社
製）を挙げることができる。リポソームと外来遺伝子と
の複合体の形成は、リポソームと核酸とを混合すること
により行うことができる。

【００１２】複合体を、哺乳動物の精巣内又は卵巣内に
導くには、精巣動脈又は卵巣動脈に複合体を導入して、
精巣動脈又は卵巣動脈の血流を利用して行う。精巣又は
卵巣に複合体を導くには、例えば、以下の方法を利用す
ることができる。ラットを例に挙げて、精巣動脈に複合
体を導く方法について、図１及び図２に基づいて、説明
する。図１には、ラットの血管系の解剖図が示されてい
る。また、図２には、腎動脈の起始部の拡大図が示され
ている。まず、大動脈に繋がる左右の腎動脈に対応する
左右の腎臓の一方、ここでは左の腎臓の腎動脈２にカテ
ーテル４を挿入する。挿入されたカテーテル４の開口端
部は、腎動脈２の起始部に結索等により固定する。その
後、左の腎臓を摘出し、右の腎臓１を残す。その後、こ
のカテーテル４の他方の開口端部は、腹腔から、背部皮
下に導くとともに、皮下に留置した小さな貯留タンク６
に接続する。この貯留タンク６に、遺伝子とリポソーム
との複合体Ｈを注入する。結索により封じられた一方の
腎動脈２の起始部に開口するカテーテル４の開口から、
複合体Ｈが逆行性に流出されると、大動脈８から左右の
精巣動脈１０、１２への血流によって、左右の精巣１
４、１６に到達される。

【００１３】貯留タンク６に、注射等により、複合体Ｈ
を補給することにより、簡易に、しかも継続的に、精巣
１４，１６に複合体Ｈを導くことができる。また、貯留
タンク６を備えることにより、継続的に精巣１４，１６
に複合体Ｈを導いた状態で、雌体と交配させることがで
きる。なお、同様にして、雌の卵巣に複合体を導くこと
が可能である。そして、同様に、交配させることができ
る。

【００１４】このようにして、精巣又は卵巣に外来遺伝
子とリポソームとの複合体を導いて、精子又は卵子の細
胞膜とこの複合体が融合することにより、外来遺伝子
は、精子内又は卵巣内に導入される。外来遺伝子が導入
された精子又は卵子と、卵子又は精子とを受精させるに
は、導入処理が行われた精巣から精子を、あるいは卵巣
から卵子を採取して、人工受精を行ってもよく、また、
導入処理を行った個体を交配させて行ってもよい。交配
によって受精させると、そのまま容易に仔を得ることが
できる。

【００１５】得られた仔において、外来遺伝子が導入さ
れているかどうかは、仔の体組織の一部、例えば尾の一
部を切り取り、ＤＮＡを抽出してサザーンブロッテンィ
ングにより、外来遺伝子に由来する断片の有無を確認す
ることにより行う。また、この確認には、他の方法、例
えばＰＣＲ法等各種方法を用いることができる。

【００１６】なお、第１の発明及び第２の発明が適用さ
れる哺乳動物は、種を問わないものである。また、雄、
雌を問わないで適用することができる。ただし、活発に
生産されるとともに、生産される個数も多い精子に外来
遺伝子を導入する方が、外来遺伝子が導入される確率が
高い。また、交配の際に、多数個の精子が供給されるこ
とから、外来遺伝子が導入された精子が、卵子と受精す
る確率も高い。さらに、外来遺伝子の導入された精子を
多数個を得ることができるとともに、精子の採取も容易
である。したがって、第１の発明及び第２の発明におい
て、特に、雄の哺乳動物において、精子に外来遺伝子を
導入するようにすることが、好ましい。より好ましく
は、マイクロインジェクション法による外来遺伝子の導
入が困難なウシや、ブタ等の大型家畜動物の雄に適用す
ることである。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて説明する。な
お、本発明は、以下の実施例に限定されるものでは決し
てない。（ラット試験体の作製）本実施例に用いた雄のラット
は、成熟したＦ３４４系である。ラットの左腎動脈の起
始部に、スポイト付きカテーテルの開口端部を二重結索
により固定し、左腎を摘出する。そして、このスポイト
付きカテーテルのスポイト部を、腹腔を通り抜け、背部
の皮下に位置させた。本実施例においては、このスポイ
ト部を複合体を供給するためのタンクとして用いた。本
実施例におけるスポイト付カテーテルは、本発明の注入
管に対応されている。

【００１８】（外来遺伝子断片の調製）本実施例で用い
た外来遺伝子断片は、ｐＭＡＭｎｅｏプラスミド（クロ
ーンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製）を制限酵素Ｐｖ
ｕＩで切断して、ＲＳＶプロモータ部分からアンピシリ
ン耐性遺伝子内の切断部分までの約６．４ｋｂを用い
た。（リポソーム）リポソームとしては、リポフェクチン試
薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）を用いた。

【００１９】（外来遺伝子−リポソーム複合体の調製）
前記外来遺伝子は、ＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社
製）中に、約０．１μｇ／μｌとなるように調製した外
来遺伝子溶液とし、リポフェクチン試薬１０μｌに対し
て、１０μｌの無血清培地を混合して、リポソーム溶液
とした。これらの溶液各２０μｌ（計４０μｌ）を、緩
やかに混合し、室温にて１０〜１５分放置した後、さら
に、６０μｌの無血清培地を加えて、緩やかに混合し
た。撹拌されている状態で複合体（１００μｌ）として
利用した。

【００２０】（外来遺伝子−リポソーム複合体のラット
の精巣動脈への導入）複合体１００μｌを、２４時間間
隔で、計８回、雄ラットの皮下に位置されるスポイト部
に注入した。注入開始して９日目に、同系の発情した雌
ラットと交配させた。以後、３日置きに、合計４回、計
４匹の雌ラットと交配させた。

【００２１】４匹の雌ラットから、約３週間後に、仔を
得た。生まれた仔から、その尾の一部を切り取って抽出
したＤＮＡを用い、サザーンブロッティング法により、
導入したＤＮＡに由来する断片が存在するか否かを調べ
ることで、外来遺伝子が導入されたトランスジェニック
ラットを選別した。ＤＮＡは、制限酵素ＢｇｌIIと制限
酵素ＳｍａＩとで切断した。プローブとして、外来遺伝
子断片を同様の制限酵素で切断して得た、約１０００ｂ
ｐのＤＮＡ断片を用いた。

【００２２】この実施例における産仔数、トランスジェ
ニック（Ｔｇ）ラット数を表１に示す。

【表１】外来遺伝子断片を有するＴｇラットの作製 ──────────────────────────── 産仔数分析数Ｔｇラット数（導入率％） ──────────────────────────── ４７４７１１（２３．４％） ────────────────────────────

【００２３】このように、本実施例においては、高い導
入確率で、Ｔｇラットを得ることができた。すなわち、
精巣動脈を介した外来遺伝子の導入により、精子内に外
来遺伝子が導入され、さらに、導入された外来遺伝子が
受精卵にも導入されたことが示された。

【００２４】Ｔｇラットにおける、外来遺伝子の導入を
サザーンブロッティング法にて検定した一例を図４に示
す。この図において、レーン１は、コントロールのＤＮ
Ａ断片を泳動した結果であり、レーン１０は、ネガティ
ブコントロールである。レーン２から９が、産仔のＤＮ
Ａを制限酵素処理して得たＤＮＡ試料を泳動した結果で
ある。この結果では、レーン４、５、７がＴｇラットで
あった。

【００２５】

【発明の効果】本発明により、受精卵に外来遺伝子を注
入することなく、全く新規な方法によって、精子又は卵
子に外来遺伝子を導入することが可能となる。また、本
発明では、哺乳動物の体内において、精子又は卵子に外
来遺伝子を導入できるため、この精子又は卵子を、卵子
又は精子と受精させることにより、簡易に外来遺伝子が
導入された産仔を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ラットの血管に関する解剖図である。

【図２】精巣動脈を介した精巣への外来遺伝子の導入方
法を示す図である。

【図３】実施例で用いた外来遺伝子を含んだプラスミド
を表す図である。

【図４】産仔への外来遺伝子の導入をサザーンブロッテ
ィング法で検定した結果を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】外来遺伝子とリポソームとの複合体を、哺
乳動物の精巣動脈又は卵巣動脈を介して、前記哺乳動物
の精巣内又は卵巣内に導くことにより、精巣内の精子又
は卵巣内の卵子に外来遺伝子を導入することを特徴とす
る精子又は卵子への外来遺伝子の導入方法。
【請求項２】請求項１に記載の精子又は卵子への外来遺
伝子の導入方法であって、前記外来遺伝子は直鎖状であることを特徴とする精子又
は卵子への外来遺伝子の導入方法。
【請求項３】（ａ）外来遺伝子とリポソームとの複合体
を、哺乳動物の精巣動脈又は卵巣動脈を介して、前記哺
乳動物の精巣内又は卵巣内に導く工程と、（ｂ）工程（ａ）を経た前記哺乳動物の有する精子又は
卵子と、この哺乳動物の卵子又は精子とを受精させる工
程、とを備えたことを特徴とするトランスジェニック動
物の作製方法。
【請求項４】請求項３に記載のトランスジェニック動物
の作製方法であって、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）を経た哺乳動
物を交配させることにより前記哺乳動物の有する精子又
は卵子と、この哺乳動物の卵子又は精子とを受精させる
ことを特徴とするトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項５】請求項３または４に記載のトランスジェニ
ック動物の作製方法であって、前記工程（ａ）における外来遺伝子は、直鎖状であるこ
とを特徴とするトランスジェニック動物の作製方法。