JP5145553B2 - EndoGalC−hDAFダブルトランスジェニックブタ - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
1.胎児線維芽細胞の採取
梅山雌ブタ×梅山雄ブタによる交配後、妊娠44日目の雌から胎児を採取した。採取した胎児の頭部と内臓をハサミで除去し、残った胴体部分を細切りした。細切りした1gの胎児組織を、10mLの0.25%トリプシン−0.04%EDTA−2Na液に懸濁し、4℃にて一晩冷蔵した。胎児組織を含む縣濁液は、遠心分離処理(1500rpm、5分)により、その上清を除去した後、37℃に保温したウォーターバスにて20〜30分間処理した。保温処理後、胎児組織1g当たり、10mLのDMEM+10%FCSを加えてピペッティングし、セルストレーナーに流し込んで濾過した。濾過液は遠心分離処理され、その上清を除去した後、沈殿物を10mLのDMEM+10%FCSに再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようDMEM+10%FCSにて調整した後、細胞培養用シャーレにまき、37℃にて、5%CO2下で培養し、胎児線維芽細胞を分離した。
分離した胎児線維芽細胞は、植継ぎを行わずに遺伝子導入に用いた。0.25%トリプシン−0.04%EDTA−2Na液にて胎児線維芽細胞を剥離させ、DMEM+10%FCSに懸濁した。細胞懸濁液は遠心分離処理(1500rpm、5分)した後、その上清を除去し、冷HBSに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心分離処理を行って、その上清を除去し、細胞数が2.5×107cells/mLになるようにHBSにて調整した。キュベットに、細胞溶液0.4mL(1.0×107cells/mL)と、100μLの調整済みDNA液(ネオマイシン耐性遺伝子を繋げて新たに作製したEndoGalC発現ベクター、25nM、図1参照)とを入れた後、良く混和した。遺伝子導入は、電気穿孔法により行い、300V、950μF、抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、室温にて10分間静置した。静置した細胞は、DMEM+10%FCSにて培養した。パルス印加後2〜3日目に増殖してきた細胞に対して、ネオマイシン(G418)を500μg/mL添加して、5〜12日間薬剤選択を行った。薬剤選択後に生存していた細胞はコロニーピックアップせず、細胞集団として増殖させた。
薬剤選択後、細胞数が十分に増殖したところで、細胞を0.25%トリプシン−0.04%EDTAで剥がし回収した。回収した細胞はPBSで2回洗浄し、細胞数を2×105/tubeになるように調整した。細胞は、αGalを認識するFITC-labelled Griffoniasimplicifolia isolectin IB4(GS-IB4)(FITC)と4℃で30分間染色し、PBSで洗浄した。解析を行う直前に死細胞を判定する為に200μg/mLのPIを10μL/tube添加した。解析対象である凝集した細胞を取り除くためにセルストレーナーキャップ付きのチューブに移した後、FACS(fluorescence-activated cell sorter)にて解析した。αGal発現レベルを計るのに平均蛍光強度(MFI)を用いた。またソーティングを行う場合は上記の過程をすべてクリーンベンチ内で行い出来るだけ4℃を保った。αGal抗原が切断されている細胞のみをFACSのソーティング技術を用いて分離し、細胞数に準じたディッシュ若しくはプレートにまき、培養を続けた。
ランドレース(L)、及びランドレース×大ヨークシャー(W)×デュロック(D)の三元交雑種(LWD)の生後160〜194日齢の春期発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにeCG(ピーメックス、三共ライフテック株式会社製)を1500IU投与し、その72時間後にhCG(プペローゲン、三共ライフテック株式会社製)を500IU投与した。hCG投与48時間後に屠殺し、卵巣、卵管、及び子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌ブタからの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠21〜50日後に人工流産処置することにより行った。核移植予定5日前にPGF2α類縁体クロプロステロール約0.2mg(プラネート、武田社製:2mL量)を臀部筋肉内に投与した。その24時間後に、同様にPGF2α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にeCGを臀部筋肉内に1500IU投与した。PGF2αとeCGとを投与してから72時間後にhCGを500IU投与した。hCG投与46時間後に屠殺し、卵巣、卵管、及び子宮の結合組織を摘出した。
摘出した卵巣、卵管、及び子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液(PBS:Ca2+、Mg2+不含(タカラバイオ株式会社製)+0.1%ウシ血清アルブミン:BSA(Sigma社製、Cat.No.A-4503)+100mL当たり1mL添加抗生物質:Antibiotic,Antimycotic,(Sigma社製A-7292))で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は0.1%ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、PZM−3液を用いてインキュベーター(38.5℃、5%CO2、5%O2、90%N2)内で供試するまで体外培養を行った。
屠場にて食肉用として屠殺された春期発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、PBS(−)液にて35℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、37℃に保温したPBS(−)にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径2〜6mmの卵胞を選び、メスによりTCM199(Hanks’salts、Gibco社製)に10%FCS、20mMHEPES、100IU/mLペニシリン(Sigma社製)、及び0.1mg/mLストレプトマイシン(Sigma社製)を添加した培養液中で切開した。卵丘細胞が3層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体(COC)とCOCに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体(GCOC)を選別し、採卵をした。
採取したCOC及びGCOCは、約30〜40個/穴で改変NCSU37を500μL分注した4穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変NCSU−37は、10%ブタ卵胞液、0.6mMシステイン、50μMβメルカプトエタノール、1mMジブチリルcAMP、10IU/mLPMSG(ピーメックス;1000IU)、及び10IU/mLhCG(プペローゲン;1500IU)を添加して作製した。20〜22時間培養後、ホルモン及びジブチリルcAMP無添加改変NCSU37に移して供試時まで培養した。成熟培養は39℃、気相条件は、5%CO2、5%O2、90%N2の条件で実施した。成熟培養時間は42〜44時間で行い、成熟卵子(第一極体放出卵子)のみを試験に使用した。
除核操作前に、体内成熟卵子や屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンB(Sigma社製Cat.No.C-6762)を5μg/mL含むPZM3液に移し、15分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンBが含まれるPZM3液で作製したドロップ内(10cmプラスチックシャーレの中心付近に50μLでドロップを作製し、ミネラルオイル20mLで被った)で行った。卵子は、第一極体が、12時から3時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレーター(プライムテック社製)に取り付けた除核用ピペット(外径25−30μm、先端を30〜45度の角度で研磨)により、第一極体ごと細胞質を1/4〜1/3量程吸引した。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、20%PVP液(Sigma社製Cat.No.PVP-360)ドロップにて、吸引と排出とを繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンBが含まれないPZM3液に移し、洗浄を行った。洗浄には、PZM3液が3mL入った35mmディッシュ(Falcon社製1008)で2回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンBを除去した。その後、注入操作まで、PZM3液ドロップ(35mmディッシュ(Falcon社製3001)に100μLのドロップを作製し、4mLミネラルオイルで被った)に移し、インキュベーター内で培養した。
FACSのソーティングによりα−gal抗原を100%近く切断した梅山ブタ雌の胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはDMEM+10%FCSを用い、植継ぎ回数は2〜12回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、10〜16日間放置し(核移植予定日約16日前に植え継ぐ)、細胞周期をG1/G0期に同調した。核移植に用いる約1時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、PBS(−)にて3回以上洗浄を行い、0.25%トリプシン+0.04%EDTA−2Na液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に10%FCS添加DMEMを加え、懸濁した後、遠心分離処理(1500rpm、5分、室温)を行った。遠心分離処理後、上清を除去し、PZM3液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
注入用チャンバー(10cmシャーレにPZM3液50μLでドロップを作製し、ミネラルオイル20mLで被った)のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子30〜50個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニュピレーターに体細胞核注入用ピペット(外径7−10μm、鈍端)を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニュピレーターに取り付ける前に、ピペット後端より5mmの位置にフロリナートを3〜5mm幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず20%PVP液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄(ピペッティングやPVPドロップへのピペット先端の出し入れ)した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理まで1〜3時間インキュベーターで培養を行った。
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は、直流パルス刺激(SSH-2,島津製作所)を、1.5kV/cm100μsec.×1回にて行った。チャンバーには2mm幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には0.05mMCaCl2、0.1mMMgSO4、及び0.02%BSAを含む0.28Mマンニトール溶液を用いた。
活性化処理卵子や屠殺採卵した未受精卵子は、5μg/mLサイトカラシンB(Sigma社製Cat.No.C-6762)を含むPZM3液で2時間培養し、第2極体の放出を抑制させる処理を行った。
活性化後サイトカラシンB液で2時間処理した卵子は、サイトカラシンBを含まないPZM3液にて複数回洗浄し、PZM3液にて体外培養を行い、活性化処理後2日目に分割した胚のみ胚移植に用いた。
仮腹の同期化は妊娠ブタを人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵ブタのものより、1日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄ブタ希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後21〜50日目の妊娠ブタを用いた。核移植予定6日前にPGF2α類縁体クロプロステロール約0.2mgを臀部に注射した。その24時間後に、同様にPGF2α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にeCGを1000IU投与した。PGF2αとeCGとを投与してから72時間後にhCGを500IU投与した。hCGを投与してから約68時間目に仮腹へケタラールを投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はPPカテーテル(フジヒラ社製)を卵管へ挿入して行った。
誕生したブタから採取可能な組織(耳及び臍帯組織)や血液等からDNAを抽出し、PCR解析を行った。図1のベクターにおけるORF(Open Reading Frame)の5’側と3’側でプライマーを2組設計し、判別に用いた。プライマーはフォワード(5'-ttacatccagattcagcaac-3';配列番号1)及びリバース(5'-ggaacattagccataacttc-3';配列番号2)、フォワード(5'-tagagacacaagttggagatggt-3';配列番号3)及びリバース(5'-gctaattgaatatcagtatttttcac-3';配列番号4)の2組を用いた。PCRサイクルの条件は、94℃にて5分の後、94℃にて1分、55℃にて1分、72℃にて1分を40サイクルした後、72℃にて5分処理し、4℃で保存した。PCR産物を5μL採取し、PAGEゲルにて電気泳動(200V、30分間)を行った。2本バンドを検出した場合にEndogalC遺伝子の導入の有無を判別した。
誕生したクローンブタの耳組織より細胞を採取し、上記「3・FACSによる解析及びソーティング」記載の方法によりα−Gal抗原の切断の有無を解析した。
1.胎児線維芽細胞の採取
ランドレース種雌×大ヨーク種雄による交配後、妊娠71日目の雌から雄胎児を採取した。採取した胎児の筋肉組織をハサミで採取し、細切りした。その後の処理は、実施例1−1に記載された胎児線維芽細胞の採取の方法に準じて行った。
分離した胎児線維芽細胞は、植継ぎを行わず、遺伝子導入に用いた。遺伝子導入前日に胎児線維芽細胞を0.25%トリプシン−0.04%EDTA−2Na液にて剥離させ、翌日50〜90%コンフルエントになるように10cmディッシュに継代した(1.0×106/ディッシュ)。遺伝子導入には、Lipofectamine PLUS Reagent(invitrogen社製)を用いた。hDAF発現ベクター(図6参照)2.0μgを750μLのD−MEMに溶解した。次に30μLのPLUS Reagentを混合し、15分間、室温で放置した。その後、別に750μLのD−MEMに溶かしておいたLipofectamine45μLをタッピングしながら加え、さらに15分間、室温で放置した。その間、細胞にD−MEMを加え洗浄後、除去し、再度D−MEMを加えてインキュベーター内で培養した。ベクターは室温放置後、分散するように細胞に滴下し、37℃、5%CO2下で3時間培養した。3時間後、20%FCS添加D−MEMを加え、メディウムが10%FCS添加D−MEMになるよう調整した。遺伝子導入から48時間以降にそれぞれの細胞に適した濃度(1.0〜2.0μg/mL)でピューロマイシンを溶かした10%FCS−DMEMに交換した。その後、2〜3日に1回の割合でピューロマイシンを含む培養液の交換を行った。薬剤選択後、生存していた細胞はコロニーピックアップせず、細胞集団として増殖させた。
トリプシン−EDTAで剥がした細胞を2%FCS−PBSで洗浄し、細胞数を5×105/tubeになるように調整した。細胞はαGalを認識するFITC、或いはFITC標識された抗hDAF抗体で染色し(4℃、30分間)、2%FCS−PBSで2回洗浄した。解析を行う直前に死細胞を判定する為に200μg/mLのPIを10μL/tube添加した。凝集細胞を取り除くためにセルストレーナーキャップ付きのチューブに移した後、FACSで解析した。αGal発現レベル及びhDAF発現レベルを計るのに平均蛍光強度(MFI)を用いた。またソーティングを行う場合は上記の過程をすべてクリーンベンチ内で行い出来るだけ4℃を保った。ソーティング技術を用いて分離された細胞は、細胞数に準じたディッシュ若しくはプレートにまき、培養を続けた。
実施例1の「4.ホルモン処理による採卵方法」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「5.体内成熟卵子の準備」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「6.屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「7.体外成熟培養」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「8.卵子核の除去操作(除核操作)」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「9.ドナー組換え体細胞の準備」記載の方法に準じて行った。その際、FACSのソーティングによりhDAFを高発現しているLW雄の胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。
実施例1の「10.体細胞核の注入操作」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「11.卵子の活性化処理」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「12.活性化卵子の第2極体放出抑制処理」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「13.活性化卵子の体外培養」記載の方法に準じて行った。
実施例1の「14.ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法」記載の方法に準じて行った。
誕生したブタから採取可能な組織(耳及び臍帯組織)や血液等からDNAを抽出し、PCR解析を行った。プライマーはフォワード(5'-aaggccgtacaagttttccc-3';配列番号5)、リバース(5'-gaactgttggtgggaccttg-3';配列番号6)の1組を用いた。PCRサイクルの条件は、94℃にて5分の後、94℃にて1分、60℃にて1分、72℃にて1分を40サイクルした後、72℃にて5分処理し、4℃で保存した。PCR産物を5μL採取し、PAGEゲルにて電気泳動(200V、30分間)を行った。2本バンドを検出した場合にEndogalC遺伝子の導入の有無を判別した。
誕生したクローンブタの耳組織より細胞を採取して、上記「3・FACSによる解析及びソーティング」記載の方法によりhDAFの発現を解析した。
細胞障害試験を行う2〜3日前に96wellプレートに細胞(通常の非組換えブタ由来耳細胞=LWD、PAEC=通常の非組換えブタ由来血管内皮細胞、hDAFクローン由来耳細胞、ヒト由来血管内皮細胞=HUVEC)をまく。障害試験は、ヒト血清を用いる。ヒト血清は、新鮮な血清と、補体不活化処理(56℃、30分)した血清の2種類を用いる。それぞれの細胞に対して、新鮮な血清で感作させた区と補体不活化処理した血清で感作させた区の2つの試験区を設けた。96wellプレートの培養液を除去した後、PBS(−)で洗浄し、ヒト血清(新鮮血清または補体不活化処理血清)を含む培養液を添加して、37℃、30分間、インキュベーター内で培養する。ヒト血清感作後(30分間処理後)、培養液を除去し、PBS(−)で2回洗浄し、MTT試薬(0.1Mコハク酸2Na、0.4%MTTを含むPBS(−)=生存しているミトコンドリアを染色する方法)を1well当たり20μl加えて37℃、4時間培養する。DMSOを100μl添加して、プレートミキサーで良く混合する。マイクロプレートリーダー(吸光度測定装置)を用いて、測定する。各サンプルの吸光度(O.D.値)を用いて以下の計算式で細胞障害度を計算した。
細胞障害度(%)=(補体不活化処理血清にて感作させたO.D.値−新鮮血清にて感作させたO.D.値)/補体不活化処理血清にて感作させたO.D.値
1.EndoGalCトランスジェニッククローンブタとhDAFトランスジェニッククローンブタの交配
hDAFクローンブタ雄の精液を採取し、モデナ(ブタ精液希釈液)にて希釈後、誕生したEndoGalCトランスジェニッククローンブタ雌の発情時に人工授精を行った。
誕生したブタのPCR判定は、実施例1の「15.誕生したブタのPCR判定
」及び実施例2の「15.誕生したブタのPCR判定」記載の方法に準じて行った。
1.ダブルトランスジェニックブタの臓器摘出
PCR解析及びFACS解析によりEndoGalC及びhDAF遺伝子が組み込まれていることが確認されたブタは体重23.5kgまで発育させた。発育したダブルトランスジェニックブタ(ドナー)は、ケタラール筋中麻酔後、ハロセン麻酔下で、外科的手術により腎臓を摘出した。摘出した腎臓は、氷冷し、通常のドナー手術に従い、摘出時及びバックテーブルにおいてビアスパン(University of Wisconsin液)で灌流し4℃にて保存した。
レシピエントには、雌のドグエラヒヒ(体重12kg)を用いた。ケタラール筋中麻酔後、ハロセン麻酔下で、外科的手術により、上記ダブルトランスジェニックブタより摘出した腎臓を移植した。
ブタ腎臓を移植したヒヒの免疫抑制剤処理は、タクロリムス(FK)0.15mg/kg/日、シクロホスファミド1〜2mg/kg/日、メチルプレドニゾロン2mg/kg/日量で投与することにより行った。
Claims (7)
- 採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子にEndoGalC遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られた、非組み換えブタと比較して、98%〜99%のαGal抗原が切断されているEndoGalCトランスジェニッククローンブタと、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、hDAF遺伝子を導入したブタ体細胞核を注入することで得られたhDAFトランスジェニッククローンブタとを、交配することにより得られる、EndoGalC及びhDAFを共発現することを特徴とするダブルトランスジェニックブタ又はその子孫。
- ブタ体細胞核として、ブタ胎児線維芽細胞を用いることを特徴とする請求項1記載のダブルトランスジェニックブタ又はその子孫。
- 請求項1又は2記載のダブルトランスジェニックブタ又はその子孫に由来し、EndoGalC及びhDAFを共発現することを特徴とするブタ臓器。
- 腎臓であることを特徴とする請求項3記載のブタ臓器。
- 請求項3又は4記載のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に移植し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応が抑制されたことを特徴とする移植方法。
- 請求項3又は4記載のブタ臓器が移植され、超急性拒絶反応又は急性拒絶反応が抑制されたことを特徴とする被移植非ヒト哺乳動物。
- 請求項3又は4記載のブタ臓器を、非ヒト哺乳動物に移植する前後又は同時に、被検物質を前記非ヒト哺乳動物に投与し、被移植非ヒト哺乳動物における超急性拒絶反応又は急性拒絶反応の程度を、被検物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とする免疫抑制剤のスクリーニング方法。
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