JP2000508161A

JP2000508161A - キメラ有蹄類及びトランスジェニック有蹄類の生産のための胚幹細胞

Info

Publication number: JP2000508161A
Application number: JP7528913A
Authority: JP
Inventors: マシュービーウィラー
Original assignee: バイオテクノロジーリサーチアンドディヴェロプメントコーポレイション; ザボードオブトラスティーズオブザユニバーシティオブイリノイ
Priority date: 1993-05-14
Filing date: 1994-05-16
Publication date: 2000-07-04
Also published as: AU7019394A; US7071373B1; CA2162870A1; EP0701608A1; ATE184647T1; US5942435A; AU694126B2; EP0701608B1; DE69420726D1; WO1994026884A1; DK0701608T3; DE69420726T2; US5523226A; GR3032058T3; ES2140542T3

Abstract

(57)【要約】トランスジェニック有蹄類並びにこれらを生産し、使用するための組成物及び方法が提供される。ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの胚幹細胞系並びにそれらの樹立方法が本発明の中心である。このような系の細胞は、関係する外在性遺伝子物質で形質転換され、次いで使用されて外在性遺伝子物質を含む生殖細胞を有するキメラ有蹄類を与える。キメラ有蹄類は飼育されてトランスジェニック有蹄類を与える。本発明のトランスジェニック動物は改良された品質を示し、またヒトタンパク質またはペプチドホルモンを与えるのに使用でき、または異種移植片ドナーとして使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】キメラ有蹄類及びトランスジェニック有蹄類の生産のための胚幹細胞発明の背景本発明は、胚幹細胞、その幹細胞からのキメラ有蹄類、及びそのキメラからのトランスジェニック有蹄類を生産するための組成物及び方法に関する。トランスジェニック動物は幾つかの異なる種において幾つかの異なる方法により生産されていたが、有蹄類の如き大きなトランスジェニック哺乳類を妥当なコストで容易かつ再現性良く生産する方法が依然として欠如している。大きなトランスジェニック哺乳類、例えば、有蹄類、特にブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギを含む偶蹄目を生産するための現行の方法は、それらを商業的競争の場で広められるようになることを阻害する制限を有する。このような方法として、卵子のマイクロインジェクション及び、例えば、トランスジーンを含むレトロウイルスベクターによる組換え分子による胚導入が挙げられる。このような方法の高コストを説明するために、ブタに遺伝子物質を微量注射してトランスジェニックブタを生産することは単一トランスジェニック動物系統を生産するのに25,000ドル〜250,000ドルのコストがかかる。マイクロインジェクションの別の問題は、それが許容できない程低い成功率の技術上困難な操作であることである。更に、マイクロインジェクションにより移入されたDNAは、通常トランスジーンの多重コピーのタンデム線状アレイで、ゲノム中にランダムにとり込まれる。これらの制限は1)トランスジーンが全くとり込まれず、2)トランスジーンがとり込まれるが、発現されず、3)トランスジーンがとり込まれるが、一時的または異常に発現されて、動物が生産されることをもたらした。トランスジーンは稀にとり込まれ、正常に発現される。また、宿主ゲノム中のトランスジーンのとり込みは、所謂逆突然変異による内在性遺伝子の分断をもたらすことがあり、これが宿主の発育、成長または正常な生理の幾つかの特徴を乱す。更に、ランダムな挿入は、トランスジーンが調節される調節上の難点を生じる。何となれば、トランスジーン発現の調節を変化し得る挿入トランスジェニックDNA構築物の上流及び下流の隣接配列がトランスジーンとランダムに混在するからである。トランスジェニック動物の生産方法、形質転換胚幹細胞(ES細胞)の使用は、マウスキメラ（これらにトランスジェニックマウスが由来する）を生産するのに使用される場合にその他の方法よりも或る種の利点を示した。それらが単離された後、ES細胞は多くの世代につき試験管内で生育されて、制限されない数の同一の ES細胞を生産する。これらの細胞は、初期の胚胎との融合または注射により組み合わされる時、胚の一部になることができ、また正常な発育プロセスに関与することができる。得られた動物は二つの遺伝子型を含むキメラである（Bradleyらの論文，1984年）。 ES細胞の利点は、それらが試験管内で遺伝子操作し得ることである。ES細胞は外在性DNAをエレクトロポレーションまたはバイオリスチック(biolistic)アプローチによりES宿主細胞に導入することにより形質転換し得る。形質転換後に、個々のES細胞クローンは、キメラ胚胎を生産するのに使用される前に外在性DNAのとり込み及び適当な発現につき試験管内でスクリーニングし得る(Thomasらの論文，1987年)。培養中のES細胞の遺伝子操作及び遺伝子操作されたES細胞に由来する中間のキメラ動物を経由するトランスジェニック動物のその後の世代はES細胞技術の特に重要な利点を与える。遺伝子ノックアウト及び遺伝子置換は、微生物中で行われていたが、過去10年以内に哺乳類細胞中でのみ実施されていた相同的組換えによる遺伝子操作の方法である。これらの技術は特別な遺伝子の標的不活化（ノックアウト）を可能にするだけでなく、遺伝子の変性別型またはその他の遺伝子による特別な遺伝子の置換を可能にする。このようなノックアウト及び置換は、その他の方法で容易に得られない細胞及び動物の性質の変性を可能にする。核酸分子の設計及び成功して変性された哺乳類細胞の検出を含む、哺乳類遺伝子ノックアウト及び遺伝子置換の実施が、Thomasらの論文，1987年;Jasin及びBergの論文， 1988年;Manso-urらの論文，1988年;Brinsterらの論文，1989年;Capecchiの論文，1989年;Frohman及びMartinの論文，1989年;Hastyらの論文，1991年; Jeannotteらの論文，1991年;Mortensenらの論文，1992年;並びにThomasらの論文，1992年を含む多数の刊行物に説明されている。遺伝子ノックアウト及び遺伝子置換は哺乳類接合体のマイクロインジェクションにより行い得る。しかしながら、これらの方法をこのようにして実施するために注射される必要がある接合体の数は、このアプローチを極めて困難にする程に多く、しかも注射が技術上過度のことを要求し、その成功した達成の唯一の報告がかつて公表されているにすぎなかった（Brinsterらの論文，1989年）。充分大きな数のES細胞が培養中に生育でき、そして試験管内で組換え技術により都合良く遺伝子操作されてES細胞、ひいてはES細胞に由来する動物中の遺伝子ノックアウト及び／または遺伝子置換のルーチン生産を可能にし得る。移入DNAを含むES細胞クローンは選択され、そして胚盤胞注射に使用し得る。試験管内で形質転換ES細胞をスクリーニングし、選択することができることは、この戦略を使用してトランスジェニック動物を生産することの最も重要な理由の一つである。全動物の使用は、所望の形質転換が成功したことが知られた後にのみ進行する。この操作は生体内の失敗を最小にし、これらは試験管内の試験よりも高価であり、しかも結果を生じるのに長時間を要する。キメラ生物は、それらの遺伝子補体を異にする細胞の混合物であるものである。形質転換されたES細胞がキメラ胚をつくるのに使用される場合、これらの細胞の幾つかがキメラの生殖腺にとり込まれ、精子及び卵子の形成に関与し得る。配偶子へのトランスジーンのとり込みは生殖系伝達を可能にする。それ故、キメラ個体により生じた子孫の幾つかはトランスジェニックであろう(Gosslerらの論文，1986年，Robertsonの論文，1987年)。トランスジェニック動物はその細胞の全て中にトランスジーンを有するが、トランスジーンは必ずしも発現されない。トランスジェニックであるキメラ胚胎から発育するのは通常個体ではないが、むしろその個体の子孫である。これは、キメラ個体が創始系統として作用して一種以上の望ましい遺伝子を有する多くのトランスジェニック個体を生産できるのと同じ程度に重要な区別であるが、そのキメラはトランスジェニックではない。 ES細胞は、相同的組換えにより前もって選択された部位でそれらのゲノムに挿入された遺伝子を有するマウスのトランスジェニック系統を生産するのに使用されていた。特定のゲノム変化を有する動物をつくることの戦略は、商用上有価な植物及び動物を発育させる上で、更に哺乳類発育の遺伝的調節を理解する上で遺伝子操作の計り知れない可能性を有する。しかしながら、ES細胞方法は更に大きなトランスジェニック哺乳類、例えば、トランスジェニック有蹄類の生産に成功して適用されていなかった。マウスから更に大きな動物にこれらの方法を外挿することができない理由は、おそらく種の発育段階の相違である。例えば、胚盤は、それが生後５日のマウス中で固体塊であるのだが、ブタ中で固体塊ではない。 Piedrahitaらの論文(1990年a及びb)は潜在的なブタ幹細胞を単離したが、系統を維持できず、またこれらの細胞の多能性を実証できなかった。多能細胞は、幾つかの異なる細胞型に発育するように誘導し得る細胞と定義される。真の全能胚細胞は動物全体中に存在するあらゆる細胞型に発育するように誘導し得る細胞であり、即ち、それらは動物全体を直接生産する潜在性を有する。ヒツジ胚胎はES 様細胞を全く生じなかった。ブタ細胞培養倍加時間は80時間であり、これはマウスES細胞の倍加時間に対して長い。著者らは、彼らの推定のブタES細胞がマウス ES細胞とは形態及び挙動を異にすると考えた。 Notarianniら（1990年）は、多能幹細胞の使用によるトランスジェニックブタの生産方法を報告していたが、多能胚幹細胞が生産されることを納得するようには示していなかった。キメラブタはトランスジェニックブタの生産に向かっての中間工程と報告されていなかった。国際公開WO90/03432号（以下、“エバンス”特許と称する）及びエバンスグループからのその他の刊行物において、その結論は、特に幹細胞の同定及び単離に言及して“ハムスター胚胎に成功して適用されたマウス胚胎からの胚幹細胞の単離方法は有蹄類胚胎に適用できない”（６頁）ことであり、そして有蹄類“幹細胞は形態または成長特性の点でマウス胚幹細胞に必ずしも似ていないであろう” と予測した（７頁）。形態の記載及びブタ“選択細胞”グループの幾つかを示す図面はマウスの如きその他の生物からの胚幹細胞よりも上皮細胞を連想させる。実際に著者らはブタからの“ES”細胞がマウスES細胞とは形態上似ていないと述べている。また、選択細胞が分化されないことを確かめる生化学試験が行われなかった。キメラ動物は、細胞が幾つかの細胞型に分化し得る（多能）という証拠として示されなかった。たとえ、幾つかの胚幹細胞がエバンスにより報告された“選択”細胞集団に実際に混合されたとしても、これらの細胞集団を使用してキメラブタを生産することは比較的有効ではないと予測されるであろう。何となれば、チャンスは胚幹細胞が宿主胚胎に移入された物質中に含まれるか否かを指示するであろうからである。とり込みの可能性は混合培養物中の胚幹細胞の比率（％）に比例すると予測されるでろう。ES細胞につき実質的に濃縮された培養物の欠如は、有効ではなく、かつ予測できない結果をもたらすであろう。更に、開示された方法は“胚幹細胞の生産方法”と記載できず、これは実質的な均一性及び再現性のいずれもが実証されなかったことを意味する。エバンスは、フィーダ細胞層が細胞成長に必要であることを教示し、ならし培地または成長因子の使用を教示していない。フィーダ層及びならし培地の使用は Piedrahitaら(1990年a及びb)及びGossler(1986年)の方法の一部であった。 Strojek(1990年)はエバンスの方法及び結果と同様の方法及び結果を記載している。栄養芽細胞及びブタ胚胎に由来する不均一培養物が開示された。 Handyside(1987年)は胚幹細胞からキメラヒツジを生産しようと試みたが、明らかに成功しなかった。Flake(1986年)はヒツジからキメラを生産したが、ES移入ではなく子宮内の移植を用いた。 Doetschmanら（1988年）は、ハムスターをマウス胚繊維芽細胞フィーダ層で生育することによりハムスターから“胚幹細胞”を同定した。多能性が懸濁培養物中の分化により測定された。 Wareら（1988年）はバッファローラットリバーBRLで生育する“家畜”からの胚胎由来細胞及びマウス原発性胎児繊維芽細胞を報告した。 Wallら（1991年）はトランスジェニックブタをファクトリーとして使用して生物産物を生産することを示唆したが、この目標を達成する方法を教示しなかった。胚癌細胞を胚胎に導入することによりこのような細胞を使用してキメラマウスを生産しようとする試みが、ごく限られた成功を有していた。胚癌細胞は最初に胚細胞腫瘍または奇形癌腫に由来した(Stevensの論文，1970年)。Rossant及び Papaioa-nnou（1984年）は、ES及びES細胞の両方が試験管内で同様の型に分化し得ることを示した。しかしながら、ES細胞を使用して表現型上正常な発育を示すキメラ胚胎の形成は通常低く（Papaioannouらの論文，1979年;Rossant及び McBurneyの論文，1982年）、一方、ES細胞はキメラマウスを生産する際に更に有効である(Bradleyらの論文，1984年)。これらの方法に関する変化において、 Martin（1981年）は奇形癌腫細胞の増殖により馴化された培地中で成長するマウス幹細胞を報告した。しかしながら、生育環境中で癌細胞を使用することは、このようなトランスジェニック動物がヒト用の製品、例えば、食品、または移植用臓器に最終的に使用される場合には一般大衆にとって快適でありそうもない。トランスジェニック有蹄類の生産の改良された方法が明らかに必要とされる。簡単かつ有効な方法がコストを低減し、かつ生産量を改良するのに望ましい。トランスジェニック動物は臨床試験前の医薬物質の試験または治療方法の試験のための疾患のモデルとして有益である。別の利点は、家畜の更に望ましい品質が好適な発現産物でトランスジーンを導入して品質を改良することにより生じ得ることである。これらの望ましい品質として、飼料利用の増大された効率、改良された食肉の品質、増大されたペスト及び疾患の耐性、及び増大された受胎率が挙げられる。トランスジェニック動物は組換え遺伝子技術により有益なタンパク質を生産するための別の“ファクトリー”である。大きな動物、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びヤギが組換え宿主、例えば、微生物または小動物から得られない幾つかの製品の潜在的なファクトリーである。このような製品の例は、ヒトに移植可能である臓器である。トランスジェニック動物を生産するための胚幹細胞移入は利用可能な方法の改良であろう。胚幹細胞介在性遺伝子移入が家畜に使用されなかった理由は、これらの種から利用可能な樹立された、安定な胚幹細胞系の欠如である。ES細胞系の利用可能性はトランスジェニック動物を生産するのに実施可能な方法を与えるであろう。しかしながら、家畜種からのES細胞系の発育は極めて困難な方法である。げっ歯類（マウスを含む）及び有蹄類（ブタを含む）の初期発育の胚形態は、特に胚盤胞段階で非常に異なる。例えば、げっ歯類の胚盤胞は卵筒、管状構造を形成し、一方、有蹄類の胚盤胞は発育上均等な平らにされた胚盤を形成する。これらのそれ以外の点で均等な構造の形状の相違は、げっ歯類及び有蹄類の胚盤胞の細胞により示される非常に異なる性質に寄与する。これらの相違は全ての動物中で嚢胚形成を特性決定する細胞分布の大量の再構築中に生体内で最も明らかである。げっ歯類及び有蹄類の胚細胞が初期発育中、特に胞胚形成及び嚢胚形成中に受けなければならない移動及び形状変化がこうして非常に異なる。げっ歯類及び有蹄類の胚細胞の性質の相違はまたこれらの二つの群の動物中の胎盤形成の相違と関連していると考えられる。げっ歯類の栄養芽細胞（その後胎盤を形成する胚盤胞の細胞）は生体内及び試験管内で観血的であるが、一方、有蹄類の栄養芽細胞は観血的ではなく、こうして試験管内で培養される時にげっ歯類の栄養芽細胞とは異なって挙動する。本発明に関して、生体内のそれらの異なる性質と平行して、げっ歯類及び有蹄類の胚胎の均等な細胞の多くが栄養芽細胞につき上記されたように試験管内で異なる性質を示すことは、特に重要である。こうして、全ての有蹄類の初期の胚の発育は形態上同一であるが、生体内及び試験管内の有蹄類の胚細胞とげっ歯類の胚細胞の相違は、1)胚胎から単離すべき有蹄類の胚細胞の選択;2）有益な有蹄類ES細胞培養物への拡大(expansion)に選択すべき細胞の選択;及び3)継続された増殖に有益な有蹄類のES細胞培養物の選択を手引きするのに適用されるのに適した形態上の基準に関する技術において不確実性をもたらした。生体内及び試験管内の有蹄類の胚細胞とげっ歯類の胚細胞のこれらの相違は、げっ歯類における胚幹細胞単離の実施（当業界で知られているようなもの）と比較して、有蹄類における胚幹細胞単離の実施（本発明による）の重大な相違を説明する。マウスから有蹄類、例えば、ブタに外挿することの別の問題は、正確に類似する発育段階が有蹄類に較べてマウスの胚胎中に存在しないことである。有蹄類において、成長は一般に遅く、しかも初期の胚の外胚葉は生後５日のマウスの胚胎のように固体塊としてではなく円板状の配置で存在する。本発明において、その技術の限界が安定な多能の有蹄類胚幹細胞培養物の生産により解決される。これらの細胞培養物が、トランスジェニック有蹄類を生産する際の中間工程であるキメラ有蹄類をつくるのに使用される。本発明の局面は、例えば、培養条件、効力の有効性、及びキメラの生産の点でその先行技術とは異なる。発明の要約本発明は、キメラを形成するための宿主の胚胎への遺伝子移入のための宿主ビヒクルとしての安定な胚幹(ES)細胞系の使用を含む新規かつ再現性のある方法を提供することによりトランスジェニック有蹄類を生産する技術の問題及び限界を解決する。本発明の新規な局面はレシピエント胚胎への胚幹細胞移入により生産された有蹄類キメラの有効性である。本発明は、発育され、飼育されてトランスジェニック有蹄類を生産するキメラ胚胎に関する。有蹄類として、ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギが挙げられる。有蹄類はその他の種よりも幾つかの明確な利点を与える。何となれば、それらはヒトに免疫上及び生理上更に似ており、こうして良好な研究モデル（例えば、ブタ、Phillips及びTumblesonの論文，1986年）として利用できるからである。本発明において使用されるキメラ有蹄類の生産方法は、第一遺伝子補体 (birst genetic complement)を有する有蹄類の胚幹(ES)細胞をその胚幹細胞と同じ種の宿主胚胎に導入することを含む。好適な胚幹細胞は多能であるが、好ましい細胞は全能である。全能幹細胞が好ましい。何となれば、これらの細胞は全胚胎に発育するように誘導し得るからである。多能幹細胞は、三つの生殖細胞層: 内胚葉、外胚葉、中胚葉のいずれか一つから宿主構造を生産することが示された細胞である。全能幹細胞はまた多能であるが、その逆は必ずしも真ではない。胚幹細胞は、一般に前移植段階、好ましくは胚盤胞段階または桑実胚段階で胚胎に導入される。宿主胚胎は第二遺伝子補体を有し、これは一般に第一遺伝子補体とは異なる。遺伝子補体は本明細書中で存在する全ての遺伝子を表示してもよく、また関係する特別な一つ以上の遺伝子を表示し得る。それ故、補体は“異なって”いてもよい。何となれば、それは遺伝子の異なる対立遺伝子、または異なる一つ以上の遺伝子を有し、そして異なる種からのものであってもよいからである。成体動物、特にトランスジェニック系統を再現できる成体動物を得るために、ES細胞を有する宿主胚胎が特別な用途に適した段階への発育の完結に適した環境中に置かれる。トランスジェニック動物を生産するために、キメラは再現可能に機能性である必要があろう。胚幹細胞は有蹄類の第一品種に由来していてもよく、また宿主胚胎が第一品種と同じ種の第二品種に由来していてもよい。“由来する”は、胚胎起源が特別な品種からのものである方法により細胞が生産されたことを意味する。例示の実施態様において、第一品種及び第二品種はブタである。特に、ブタの第一品種はマイシャン(Meishan)品種であり、またブタの第二品種はデュロック(Duroc)品種である。第一遺伝子補体は一般に第二遺伝子補体とは異なる。第一遺伝子補体は、例えば、部位特異性組換えにより胚幹細胞の最初の遺伝子補体に安定に組込まれた外在性ヌクレオチドセグメントであることが好ましい。この型の第一遺伝子補体の例は、本発明の方法により生産されたキメラ有蹄類から回収可能な形態のタンパク質を与えるように発現し得るヌクレオチドセグメントである。ヌクレオチドセグメントは、ヒト因子IX、ヒト血液タンパク質、ヒトホルモン、ヒト成長因子、ヒトサイトカイン、ヒト酵素、ヒトホルモンレセプター、ヒト結合タンパク質、抗原、翻訳因子、転写因子、オンコプロテイン、またはプロトオンコプロテイン、ヒト乳タンパク質、及びヒト筋肉タンパク質を含むタンパク質をコードする。第一遺伝子補体は、発現された時に、有蹄類の性質、例えば、胴体の重量及び組成、乳生産、疾患耐性、等を改善するヌクレオチドセグメントを含んでいてもよい。胚有蹄類幹細胞は、選択可能なマーカーをコードする外在性ヌクレオチドセグメントを含んでいてもよい。好適なマーカーの例はヒグロマイシン(Hph)(Yates らの論文，1985年)及びプロマイシン(Pac)(Morgenstern及びLandの論文，1990年 )及びneoである。その他の選択可能なマーカーとして、ada(アデノシンデアミナーゼ)及びdHFR（ジヒドロフォレートレダクターゼ）が挙げられる。マーカーは、関係する結合トランスジーンの血縁をトレースするのに有益である。胚幹細胞は胚幹細胞の培養から得られる。本発明は胚幹細胞培養物を精製し、胚幹細胞を培養物から単離する方法に関する。その方法はフィーダ層の不在下で幹細胞ならし培地中で有蹄類胚胎からの解離細胞を培養して第一培養物を生成することを含む。また、培養はフィーダ層を使用して開始されてもよい。解離細胞は、フィーダ層を用いて、またはそれを用いずに幹細胞培地(SCM)中で試験管内で発育された有蹄類胚胎から得られる。バッファローラットリバー細胞により馴化された培地がBRL/CMと称され、この目的に好適である。ビタミン、アミノ酸及び抗生物質が幹細胞ならし培地(CSCM)中に存在する。好適な幹細胞ならし培地 (CSCM)は約40％の幹細胞培地(SCM)及び約60％のバッファローラットリバー細胞ならし培地(BRL/CM)を含む。要するに、胚胎は 1．SCM及びフィーダ層； 2．CSCM； 3．CSCM及びフィーダ層；または 4．ホワイテン培地で成長するであろう。胚幹細胞は 1．CSCM； 2．SCM及びフィーダ層で成長するであろう。胚胎培養物は、胚幹細胞培養物に特徴的な形態上の特徴及び成長パラメーターを有する第二の安定な培養物が樹立されるまで継代培養される。安定な細胞培養物は、反復継代培養にわたってその形態上の特徴及びモード染色体数を維持するものである。形態上の特徴として、個々の細胞及び培養外観（固体表面における成長パターン）の両方が挙げられる。有益であるために、培養物はまた反復継代培養で生存すべきである。継代数44までの継代培養が、本発明の方法を使用して達成された。胚幹細胞は、構造タンパク質、例えば、サイトケラチン18またはビメンチン（これらは分化細胞中にのみ存在する）の存在につき分析された時に定義により陰性である。胚幹細胞は抗原、例えば、神経フィラメント、グリア繊維状酸性タンパク質、ケラチンまたはデスミン（これらは分化細胞中にのみ存在する）の存在につき分析された時に陰性である。アッセイに好適な神経フィラメントとして、68,160または200kdの分子量を有するタンパク質が挙げられる。安定な培養物から単離されたES細胞の形態上の特徴として、光学顕微鏡で観察されるような丸い形状、約８〜15ミクロンの直径、及び約10-25:75-90の細胞質と核の直径比が挙げられる。コロニー直径は一般に0.08〜1.5mmの範囲である。培養物それ自体の成長パラメーターとして、約18〜36時間の倍加時間及び単層ではなく多層中の成長が挙げられる。本発明は本明細書に記載された培養物から単離された本明細書で定義された胚の有蹄類幹細胞に関する。培養物は、培養物の表面に見える細胞の少なくとも50％、好ましくは70〜80％が“ES細胞”の特徴として本明細書に開示された形態を示す場合に胚幹細胞培養物と称される。細胞は、ES細胞培養物を単離し、精製するための更なる継代培養のために、ES細胞形態を示す培養物中の領域から選択される（“プラッキングされる”）。これらの未分化細胞は分化し得るので、形態上の不均一性が観察し得る。比較的高比率の分化細胞を有する培養物は好適ではない。本発明の方法を使用して、宿主免疫不全哺乳類、例えば、マウスに導入された時に奇形腫または奇形癌腫を形成できる細胞の型から実質的になる胚幹細胞培養物が生産される。このアッセイにつき、培養物からの推定の胚幹細胞が免疫不全哺乳類に導入される。適当な腫瘍が胚幹細胞から免疫不全哺乳類中に形成される場合、その培養物は胚幹細胞を含むものと推論される。免疫不全哺乳類は一般に SCIDマウス、ヌードマウスまたはヌードラットである。適当な腫瘍は、例えば、 ES細胞に遺伝上関連することが示される腫瘍である。遺伝子補体がES細胞を使用して発現される細胞型の測定方法は下記の工程を含む。 (a)遺伝子補体、通常、トランスジーンを含む有蹄類の胚幹細胞を免疫不全哺乳類に導入して腫瘍を生じる工程； (b)その腫瘍を適当な条件下に置いて腫瘍を複数の認識可能な細胞型に分化させ、遺伝子補体を発現させる工程；及び (c)分化細胞型を分析して、どの細胞型中で遺伝子補体が発現されるのかを測定する工程。本発明の局面は、トランスジーンを発現し、かつ免疫不全哺乳類に導入された有蹄類の胚幹細胞に由来した腫瘍細胞である。例示の実施態様において、単離されたES細胞及びES細胞系の起源は、マイシャン、デュロック及びヨークシャーからなる群から選ばれたブタ系統の胚胎である。例示の実施態様において、安定な細胞系はブタの胚幹細胞の培養物に由来していた。D195と称される例示の細胞系が本明細書に記載される。本発明は本発明の方法により生産されたキメラ有蹄類に関する。その方法は、核を胚幹細胞から有蹄類宿主細胞（これからトランスジェニック胚胎またはキメラ胚胎が発育する）に移入することを含む。好適な宿主細胞として、除核有蹄類卵子及び除核有蹄類胚細胞が挙げられる。トランスジェニック有蹄類の生産方法は本発明の局面である。キメラ有蹄類に由来するトランスジェニック有蹄類は、キメラ有蹄類を飼育することにより生産される。トランスジェニック動物は親キメラ中に生殖細胞キメリズムがあった場合の結果として生じ、そしてキメラを形成するのに使用された胚幹細胞の遺伝子補体を含むキメラ中の配偶子が子孫を生産するのに使用される。組織が異種移植片として使用し得る有蹄類の生産方法は下記の工程を含む。 (a)遺伝子補体を胚有蹄類幹細胞からレシピエント有蹄類胚細胞にとり込んでキメラ有蹄類を生産する工程（前記遺伝子補体はキメラ有蹄類からの組織を異種移植片のレシピエントと組織適合性にする（例えば、PCT特許公開93/02188及び9 4/00560を参照のこと）；及び (b)キメラ有蹄類を飼育して異種移植のための組織を含むトランスジェニック子孫を生産する工程。本発明は、トランスジェニック有蹄類を使用して外在性タンパク質を生産する方法に関するものであり（前記トランスジェニック有蹄類は前記外在性タンパク質を与えることができるヌクレオチドセグメントを含む遺伝子補体を有する）、前記方法は前記有蹄類をヌクレオチドセグメントが活性化される条件に暴露して前記外在性タンパク質を体液または組織中で回収可能な形態で得て、前記タンパク質を前記体液から回収することを含む。好適な体液は雌の有蹄類から分泌された乳である。この技術の一つの特に重要な適用は、その他の疾患の遺伝子の治療に必要なヒトタンパク質を生産するための生物リアクターまたはファクトリーとしての有蹄類の使用である。トランスジェニックブタは１g/Lより多い外来異種乳タンパク質を生産することが示されていた(Wallらの論文，1991年)。ブタは毎日10kgまでの乳を潜在的に生産でき、泌乳が７週間続くので、１匹の雌ブタはそれの泌乳中に凝固因子IXの如きヒトタンパク質１kgを生産し得る(Wallらの論文，1991年)。 ES細胞を含む有蹄類胚胎は、その胚胎に由来する胚胎のクローンであるので、本発明の範囲内にある。胚幹細胞に由来する細胞、及び単離された胚幹細胞の核を胚幹細胞と同じ種からのレシピエント細胞に移入することによりつくられた胚胎を含むキメラ胚胎が含まれる。好適なレシピエント細胞として、除核ブタ胚細胞及び除核ブタ卵子が挙げられる。胚胎はその遺伝子補体に安定に組込まれた外在性ヌクレオチドセグメントを有することが好ましい。有蹄類胚幹細胞の核及びキメラ動物の子孫がまた本発明の局面である。図面の簡単な説明図１（図1A、1B、1C及び1Dを含む）はエバンスにより“幹細胞”と称される細胞（上のパネル）と、ブタ細胞を使用する“本発明の胚幹細胞”（下のパネル）の発育の形態上の特徴の比較である。図1(A)250倍の倍率の樹立細胞系中の未分化細胞の巣（図5A、エバンス特許、この写真はこの写真の源であるNotarianniらの論文（1990年）からの図3Aと同じであり、即ち、図5A特許＝図3A,Notarianniらの論文，1990年）図1(B)250倍の倍率の本発明の樹立細胞系からの未分化“胚幹細胞”のクラスター巣図1(C)エバンス未分化細胞（図5B、エバンス）の単層生育；対図1(D)250倍の倍率の本発明の樹立細胞系からの“胚幹細胞”の多層生育図２400倍のギムザで染色された本発明のES細胞；細胞が分散され、スライドに固定される。図３は図3A及び3Bを含む。図3Aは変化された毛色パターンを示すキメラブタの写真である。毛色パターンは個体間で変化したが、黒色の毛（矢印）の単一領域または多領域、背部及び腹部の縞模様またはこれらのパターンの組み合わせを含んでいた。図3Bは純粋飼育されたデュロック子ブタ（左、レシピエント胚胎の飼育）及び純粋飼育されたマイシャン（右、ES細胞系の飼育）の間のキメラ子ブタ（中央）の写真である。好ましい実施態様の詳細な説明トランスジェニック動物は、計画的な実験介入の結果としてゲノムに安定にとり込まれたそれらのDNAの変化を有する。本発明の方法において、有蹄類胚幹細胞系からの一つ以上の細胞が宿主胚胎に導入されてキメラ動物をつくる。或る比率のこれらの動物は生殖細胞キメラである（哺乳類において、生殖細胞は初期の原始線条段階で体細胞から分裂する。その時間後に起こる細胞の形質転換は形質転換生殖細胞または形質転換体細胞をもたらす）。トランスジェニック系統はキメラ動物を飼育することにより、そしてトランスジェニック発現を示すその飼育の子孫を選択することにより生産される。これらの子孫は時折“生殖細胞系トランスジェニックス”と称される。トランスジェニック動物を生産する別法はES細胞系からの核を胚胎が発達する細胞に移入することである。胚幹細胞を使用してトランスジェニック有蹄類を生産することの利点の中に、効率が改良されること、及び形質転換ES細胞がクローン（突然変異を妨げる単一の親細胞と同じ遺伝子型を有する血縁系列）の前駆細胞として使用し得ることがある。これらのクローンはそれらの細胞の遺伝子補体を変性するように操作される。多数の変性細胞は、複製動物が生産し得るように試験管内で複製し得る。本発明の重要な利点は、遺伝子操作を調節し、再現できることである。特定の染色体位置へのトランスジーンの導入は“遺伝子ターゲッティング”と称される。何となれば、それは宿主ゲノムの特定の位置へのヌクレオチド配列の再現性のとり込みを可能にするからである。このようなターゲッティングは上記の遺伝子ノックアウト及び遺伝子置換をもたらし得る。特定の遺伝子変化により動物をつくることの戦略は農業に計り知れない潜在的な用途を有する。この用途は新規な改良されたゲノムを有する植物及び動物を生産することを含む。これらの改良、例えば、低減された損傷または良好な味覚は植物または動物それ自体にあってもよく、または、例えば、医薬品を製造するためのファクトリーとして、またはヒト移植において使用される臓器のための製造ラインとしての形質転換された植物または動物に関する新規な用途であってもよい。本発明の方法及び組成物はこれらの戦略を有蹄類につき実現させる。胚幹細胞培養物に可能な遺伝子操作の種類の可変性、このような培養物をつくる方法の再現性、及び遺伝子操作の結果の予測可能性が、本発明のその他の有利な局面である。その方法の初期工程は、安定な未分化胚幹(ES)細胞系を樹立することである。本発明の目的のために、安定は同じ環境条件下で連続の継代培養により実質的に同様の細胞型及び成長パラメーターを維持し、そして安定なモード染色体補体を維持することを意味する。“モード”は細胞当たりの最も頻繁な染色体カウントを表す。染色体補体に関する“安定”は、反復継代培養後の同じモード細胞数及び培養形態の維持を表す。この文脈中の“未分化”は分化の形態上または生化学上の証拠を示さないことを意味する。胚幹細胞は、胚構造に分化できる未分化細胞である。胚幹細胞系は胚幹細胞の培養に由来する。ES細胞は分化し得るので、また培養物は分化細胞及び未分化細胞（後者が本発明のES細胞と定義される）の両方を含み得るので、培養物は細胞の少なくとも50％、好ましくは70〜80％がES 細胞である場合に安定であると定義される。胚幹細胞を単離する際の予備工程は胚胎を回収することである。分割中の発育のパターンは偶蹄目（ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ）中の有蹄類につき同様である (Bearden及びFuquayの論文，1980年)。接合体から胚盤胞にいたる発育の段階はこれらの種につき実質的に同一であり、それ故、同様の基準がES細胞を生じるための胚胎の回収に当てはまる。おそらく、内部細胞塊(ICM)中の細胞が多い程、細胞系をつくるチャンスが良好である。胚盤胞の形成及びその後の透明層からのふ化後に、胚胎は伸び始める(Cruz及びPedersenの論文，1991年)。この伸長はブタ、ヒツジ及びヤギでは発情後11日目に起こり、またウシでは13日目に起こる(B azer、Geisert、Zavyの論文、1987年)。これは、これらの種（ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ）中の前移植胚胎発育の類似性を支持する更なる証拠である。また、この伸長段階は、胚胎がES細胞を生産するために選択されるのに適した段階を通過した時点をマークする。ブタを使用する例示の実施態様において、雌が、好ましくは毎日２回、発情につきチェックされる。ES細胞のドナー雌ブタは雌ブタの発情の時点で受精される。次いで胚胎は、前胚盤胞段階が求められる場合には発情後1.5〜5.5日に、拡大胚盤胞が所望される場合には発情後5.5〜7.5日に、またはふ化胚盤胞が求められる場合には発情後7.5〜10.0日に回収される。本明細書で定義された形態上の基準、及び発育の日の両方が胚胎を選択するのに使用される。拡大された胚盤胞は、胚胎が内部細胞塊(ICM)を有する胞胚腔（液体で充満された腔）と、平らにされ、直径及び容積の点で拡大された透明層中で平らにされ、拡大された栄養芽細胞とを有する胚胎発育の段階と本明細書で定義される。胚胎培養は、好適な培地、培養皿、温度、及びその他の条件を使用して開始される。例示の実施態様において、胚胎が細胞のフィーダ層で生育される。改良ホワイテン培地が胚胎を洗浄するのに使用されてもよく、またふ化への培養のための幹細胞培地(SCM)の別法として使用されてもよい。培養の約24〜48時間後に、拡大された胚盤胞が一般に透明層からふ化し、そして基質に付着する。また、ふ化された胚盤胞は培養の約24〜48時間後に（１〜10日の範囲）培養皿に付着する。胚幹細胞が付着された胚胎から単離され、培養物中に維持される。培養胚胎の内部細胞塊(ICM)が培養の最初の１〜14日中で明らかである。ICMが出現した後、それは培養皿から取り除かれ、その細胞が一般にタンパク質分解酵素と機械攪拌の組み合わせにより分離される。分離された細胞は、円形細胞の巣が一般に培養の７〜８日（約２〜21日の範囲）後に現れるまで培養される。フィーダ層の不在下の幹細胞ならし培地がこの成長段階に好ましい。しかしながら、フィーダ層が別法としてまた使用されてもよい。フィーダ層または培養容器（幹細胞ならし培地(CSCM)中）へのふ化ブタ胚盤胞の初期の付着はマウス胚盤胞とは異なる。マウスでは、ふ化胚盤胞(HB)がプレートダウンし、内部細胞塊(ICM)と共に付着して、門またはポリープのように成長する。栄養芽細胞はICMから外に成長し、透明な領域をICMと栄養芽細胞の間に残す。この配置が、実質的に栄養芽細胞汚染のない、ICMの容易な“プラッキング ”を可能にする。次いで単離されたICMがトリプシン中に入れられその後の継代培養のために細胞を解離し得る。“プラッキング”は培養物から細胞または細胞の群を手動で摘出することと本明細書で定義される。摘出は当業者に知られている手段、例えば、ニードル、ガラスピペット、または微小鉗子によるものである。一方、有蹄類の例示の実施態様において、ブタHBが付着し、大きな凝集塊でプレートダウンし、次いであたかもそれが融解しているかのように広がり始める。その結果、ICMが栄養芽細胞と会合され、その配置は外観がフライにした卵に似ている。この現象はICM単独をプラッキングすることを初期に（最初の数日、１〜５日）困難にし、その結果として、個々の胚胎の塗布された配置に応じて、IC Mがプラッキングされてもよく、または塗布された全体の胚胎がトリプシン処理されて細胞を解離してもよい。ES細胞の不連続の多層凝集塊またはコロニーが目視できた後に、プラッキングが行われてこれらの細胞を汚染栄養芽細胞及び／またはその他の分化細胞型から単離する。これは適当なES形態を有する細胞の精製をもたらす。連続の継代培養が、培養成長速度の関数である間隔で行われる。例示の実施態様において、継代培養間隔は２〜14日（1〜21日の範囲）である。胚胎培養につき、フィーダ細胞層が成長を支持するのに使用し得る。培養物を継代培養することは、胚幹細胞培養物に特徴的な形態上の特徴及び成長パラメーターを有する安定な培養物が樹立されるまで続けられる。その他の基準に加えて、本発明は形態上異なるブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの ES細胞の単離及び増殖のための手段を与える一組の形態上の基準を教示する。ES 細胞系の多能性に関する予備スキャンとして、未分化形態が光学顕微鏡を使用して探究される。形態上、ES細胞は小さく（直径約８〜15ミクロン）、円形であり、かつ一つ以上の突起した核小体を含む大きな暗核を有する。細胞質と核の比は約15:85である。ES細胞の走査電子顕微鏡は、互いの細胞の密接な会合、不規則な表面及びコロニーの最も外の細胞で明らかな微絨毛を有する円形または多角形の細胞を明らかにする。培養成長パラメーターとして、約18〜36時間の倍加時間、及び単層の成長ではなく多層の成長が挙げられる。ブタES細胞は、例えば、約 0.08〜1.5mmの範囲の直径を有するコロニー中で成長する。このような形態上異なるES細胞が見られる同じ胚胎培養物の幾つかにおいて、細胞はEvansら（1981年）によりブタES細胞の特徴であると記載された異なる形態上の特徴（以下、“エバンス形態”と称される）で観察される。本発明によれば、エバンス形態の特徴を有する細胞を主として含むが、本発明の細胞につき本明細書で記載された形態上の特徴を有する細胞を主として含まない培養物が廃棄される。細胞の約50％以上が本明細書で定義された形態上の基準に適合する場合、これらの細胞が次の継代培養においてES細胞を濃縮するのに選択される（“プラッキングされる”）。エバンス形態を有する細胞は、或る程度分化できるとともに、キメラブタをつくることができることが示されていなかった。樹立胚幹細胞は約18〜36時間毎に分裂して迅速に成長する。自然の望まれない分化に対し保護するために、細胞は一般に高密度で保たれる。培地の頻繁な交換及び継代培養が、一般に約1-2x10⁶の細胞／培地約10〜12mlを含む100mmの皿の適当な密度の健全な培養物を維持するのに使用される方法である。モード染色体カウント、即ち、正倍数体ゲノムに特徴的な染色体の数の最も頻繁なクラスが、安定な培養物の証拠である。ブタにつき、モード数は38であり、ウシにつき、60であり、ヒツジにつき、54であり、またヤギにつき、60である。宿主胚胎へのとり込みに適した胚有蹄類幹細胞培養物を同定するのに好ましい方法は下記の工程を含む。 (a)培養物からの第一胚幹細胞を免疫不全哺乳類に導入する工程； (b)腫瘍が胚幹細胞から哺乳類中で形成するかどうかを測定する工程；そしてそうである場合、 (c)その培養物を“ES”細胞培養物と表示する工程。 ES細胞の指標としての分化の欠如はまた細胞骨格構造タンパク質、例えば、サイトケラチン及びビメチン（これらは分化細胞型中でのみ発現される）の不在により測定し得る。逆に、誘導後に分化する細胞の能力は、典型的な未分化ES細胞形態の損失及び例えば、抗サイトケラチンに関する陽性の蛍光抗体染色により検出される。胚幹細胞は、それらが非常に分化する傾向があり、こうしてそれ自体で表現型上不安定であるという点で典型的な培養哺乳類細胞とは本質的に異なる。こうして、ES細胞培養物は一般に培養物中でES細胞と非ES細胞の不均一混合物として現れ、このような非ES細胞はES細胞及びその他の胚細胞の部分分化誘導体及び完全分化誘導体を種々含む。このような培養物中のES細胞は典型的には異なる形態を有する細胞の凝集塊として成長することが見られる。凝集塊は非ES細胞で差し込まれ、これらは異種の形態上の特徴を示す。有益なES細胞培養物は充分に低い比率、好ましくは10〜30 ％のこのような非ES細胞を有して、本明細書に開示された手段により比較的均一なES細胞の量の単離を可能にする。培養ES細胞の表現型の不安定性は、成長しているES細胞培養物の特徴の連続変化をもたらす。こうして、ES細胞培養は、細胞培養者が形態を基準として夫々の培養の細胞を頻繁に、通常、毎日評価して分化して大きな比率の非ES細胞を生じた充分な細胞を含む培養物を廃棄することを必要とする。ES細胞培養は有益な培養物からES細胞の低温保存（凍結）を伴って、このような培養物がそれらの特徴を不可避に変化し、それらを有益にするこれらの特徴を失う時に適当な細胞の回収を可能にする。 ES細胞が最初に培養中の胚胎から調製される場合、ES細胞培養物中に見られる不均一性はその後の継代培養物と比較して最大の程度まで存在する。こうして、 ES細胞の単離及び調製につき、多くの胚胎が培養され、そして所望の形態上の特徴を有する細胞の大きな同定可能な凝集物（凝集塊）を含む二三のもののみが使用され、一方、培養された胚胎の大半が廃棄される。こうして、連続増殖に有益なES細胞培養物を選択するのに使用される形態上の基準はまた胚胎からのES細胞の初期の単離及び有益なES細胞培養物へのそれらの拡大に必須である。本明細書に開示された方法を使用して、ES細胞がマイシャンブタ、ヨークシャーブタ及びデュロックブタから発育された。ES細胞を生産する効率はドナーの系統または品種により若干影響される。ブタのその他の好適な品種または型として、NIHミニピッグ、野生ブタ、SLAハプロタイプのブタ、等が挙げられる。ヌクレオチド配列を含む第一遺伝子補体による試験管内の胚幹細胞の形質転換は当業者に知られている方法のいずれかにより行われる。前記方法の例として、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン沈殿、トランスダクション（レトロウイルス）、レセプター介在性DNA移入、リポフェクション (lipofection)、マイクロインジェクション、またはその他の手段が挙げられる。例示の実施態様において、試験管内で生じた遺伝子突然変異が宿主細胞ゲノムの特定の部位にとり込まれる。形質転換宿主細胞が多能または全能の胚幹細胞であり、かつ前記幹細胞がキメラ有蹄類にとり込まれる場合、トランスジェニック動物が宿主ゲノムの特定の位置における特定の遺伝子変化により生産される。キメラからトランスジェニック動物に進行するための要件は、胚幹細胞の子孫である配偶子が存在すること、そして配偶子がキメラの子孫を生産するのに使用されることである。安定な細胞培養物の存在は同じ変性遺伝子補体を有するES細胞のクローンの発育を可能にし、それ故、同じ遺伝子補体を有するトランスジェニック有蹄類を複製する機会が生じる。個々の細胞系は容易にスクリーニングされて染色体DNAへの外在性DNAの相同的組換えまたは非相同的組換えを検出する。本発明の方法により生産された細胞系を使用して、特定の染色体位置にトランスジーンを有するトランスジェニック有蹄類が生産される。トランスジェニック有蹄類の安定な遺伝子変性系統が、特定の遺伝子を特定の位置に導入することにより容易に生産される。相同的組換えが使用されて上記の遺伝子ノックアウトまたは遺伝子置換を生じるだけでなく、単一遺伝子を特定の位置に組込んで、遺伝子の多重コピーの導入、及びコピーの予測できない数及び位置（これらは従来の方法で問題を生じた）を避けて、トランスジェニック動物を生産する。遺伝子の単一コピーの挿入は、成長ホルモン遺伝子がその他の方法により生産されたトランスジェニック有蹄類に導入された時に観察されるような多重コピーの組込みから生じる問題の幾つかを避ける。キメラ有蹄類の生産方法は、胚幹(ES)細胞（これは全能であることが好ましく、かつ第一遺伝子補体を有する）を第二遺伝子補体を有するレシピエント胚胎に導入してキメラ胚胎をつくる初期工程を含む。第一遺伝子補体のヌクレオチド配列は、ゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製により、直接合成により、組換え技術により、またはこれらの組み合わせにより得られる。適当な調節配列が含まれる。第一遺伝子補体、例えば、単離されたヌクレオチド配列の形質転換は、トランスジェニック有蹄類を生産する特別な一つ以上の目標に応じて選択される。形質転換の制限は、当業者に一般に知られている制限である。第一補体は第二補体と異なっていてもよい。第一遺伝子補体は、宿主（レシピエント）の種に対し外来（外在性）であるヌクレオチド配列であってもよく、またはそれは宿主種に対し天然であってもよい。後者の場合、ヌクレオチド配列は宿主中に天然に存在するものから変性されてもよい。キメラにとり込まれ、続いてトランスジェニック有蹄類にとり込まれる第一遺伝子補体として使用することが望ましい外在性ヌクレオチド配列は、 1)血液凝固因子、例えば、因子VIII及びIX； 2)脂肪細胞の抑制に有益であるTNFα； 3)成長因子、例えば、 a)EGF(これは新生児下痢後に分断された胃腸ライニングの回復に有益である ); b)神経成長因子であるNGF; 4)鉄結合ラクトフェリン； 5)人工血液または貧血の治療用のヘモグロビン； 6)ホルモン、例えば、インスリン、FSHβ、GH、LHβ、PMSG；及び 7)下記の遺伝子 a)疾患耐性と関連するSLAまたはMHC; b)サイトカイン遺伝子; c)補体遺伝子をコードする遺伝子を含む。血管新生促進因子、医薬または診断用のタンパク質、及び抗体が、トランスジェニック有蹄類により、例えば、それらの乳中で製造し得るその他の有益な製品である。形質転換されてもよい適当な胚細胞を選択した後、それが所望の段階、一般に桑実胚段階または胚盤胞段階で一般に同じ種のレシピエント胚胎に導入される。また、その他の段階、例えば、１細胞、２細胞または８細胞段階が好適である。次いで胚胎が適当に調製されたレシピエント母体に直ちに移入され、または約10 日までにわたって培養して保たれる(Polgeの論文，1982年;Webelらの論文， 1970年)。細胞を宿主胚胎に導入するあらゆる方法が好適であり、マイクロインジェクションが挙げられる。導入が成功する場合、キメラ有蹄類が生産される。キメリズムは、通常、発現産物を検出することにより、または同定プローブにハイブリッドを形成することにより、形質転換された胚幹細胞により導入された遺伝子を検出するのに適したアッセイにより検出される。例えば、宿主胚盤胞ゲノム中に存在しない皮膚色素遺伝子は動物中の斑点として検出し得る。キメラ胚胎は発育の完結に適した環境に置かれてキメラ成体を形成し、そしてキメラ胚胎が性的熟成まで発育される。キメラ動物が飼育されて子孫を生産し得る。子孫が、子孫中の第一遺伝子補体（トランスジーン）を検出することにより、その発現産物、もしくはその特定のヌクレオチド配列を検出することによりトランスジェニック有蹄類であるか否かを決定することが好ましい。遺伝マーカーがトランスジーンの血縁をトレースするのに有益である。形質転換された胚細胞が導入された胚胎から生産される有蹄類はおそらくキメラである。勿論、こうして生産された全ての動物が技術上の変化及びチャンスのために実際にキメラであるとは限らない。しかしながら、ブタにつき、胚胎当たりの成功率は、マイクロインジェクションを使用してトランスジェニックブタを生産しようと試みた他者により報告されたものより高い（約30％、25〜100％の範囲）。ブタは一般にサス・スクロファ(Sus scrofa)の属及び種のものである。例示の実施態様において、キメラはブタの第一品種、例えば、マイシャン系統からの胚幹細胞と、ブタの第二品種、例えば、デュロック系統からの桑実胚とを含む。ヤギ、カプラ・ヒルカス(Capra hirucus)において、好適な第一品種はサーネン(Saanen)であり、好適な第二品種はトッゲンブルグ(Toggenburg)である。ヒツジ、オビス・アリエス(Ovis aries)において、好適な第一品種はドーセット(Do- rset)であり、好適な第二品種はリンカーン(Lincoln)(ホモ接合の黒色系統)である。ウシボス・タウラス(Bos taurus)において、好適な第一品種はアンガス (Angus)であり、好適な第二品種はハーフォード(Hereford)である。キメラは、それらが毛色マーカー（即ち、ブタにつきマイシャンＸデュロック、ウシにつきアンガスＸハーフォード、ヒツジにつきドーセットＸリンカーン（ホモ接合の黒色系統）、ヤギにつきサーネンＸトッゲンブルグまたは黒色もしくは褐色のヌビアン(Nubian)）を使用して容易にスクリーニングし得るように設計される。キメラブタ胚胎が２種の毛色マーカーを使用して生産された。マイシャン（黒色の皮膚色素を有する黒色の毛）ES細胞がデュロック（ピンク色の皮膚色素を有する赤褐色の毛）胚胎に注射された。これらの組み合わせはキメラ動物の容易な目視検出を可能にした（図３）。情報遺伝マーカーがキメラ動物、例えば、グルコースホスフェートイソメラーゼ(GPI)及びコレステロール−７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子系中の多型性をスクリーニングするのに使用された。次いで推定のキメラ有蹄類が飼育されて子孫を生産する。親として使用されたキメラ動物の幾つかは形質転換された配偶子を有する。形質転換された配偶子が受精に使用される場合、得られる子孫はトランスジェニック動物である。何となれば、その細胞の全てが形質転換された配偶子により形成された接合体に由来し、それ故、子孫の細胞の全てがトランスジェニックであると予想されるからである。勿論、キメラブタの子孫の全てがトランスジェニックであるとは限らない。何となれば、キメラ有蹄類の全てが形質転換された配偶子を有するとは限らず、また形質転換されたそれらの配偶子の全てを有するとは限らないからである。トランスジェニック動物を生産するために、遺伝子補体、例えば、本発明の胚幹細胞を形質転換するのに初期に使用される単離されたヌクレオチド配列は、宿主のゲノムにとり込まれる必要がある。形質転換ヌクレオチド配列が外在性DNA を含む場合（これは一般的な場合である）、外在性DNAは宿主の内在性DNAにとり込まれるようになる必要がある。とり込みは一般に非相同的組換えにより行われる。しかしながら、相同的組換えがまたDNAとり込みを達成するための手段であってもよい。相同的組換えは関連DNA配列または同一DNA配列の間の組換えと本明細書で定義される。非相同的組換えは無関連のDNA配列の間の組換えと定義される。タンパク質生産の結果として生産された変性組織もしくは乳タンパク質または化合物を有するトランスジェニック有蹄類は、医薬用タンパク質、治療用タンパク質、生化学タンパク質、加工タンパク質、製造タンパク質または組成タンパク質、例えば、下記のタンパク質を含む。 1)血液タンパク質（凝固因子VIII及びIX、補体因子または補体成分、ヘモグロビンまたはその他の血液タンパク質、等； 2)ホルモン（インスリン、成長ホルモン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、PMSG、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトキシン、ドーパミン、等）； 3)成長因子、即ち、EGF、PDGF、NGF、IGF等； 4)サイトカイン、即ち、インターロイキン、CSP、GMCSF、TNF、TGFα及びβ、等； 5)酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成キナーゼまたはコレステロール分解キナーゼ、消化キナーゼ、ステロイド生合成キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、グリコソラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニレートサイクラーゼまたはグアニレートサイクラーゼ、等）； 6)ホルモンレセプターまたはその他のレセプター(LDL、HDL、ステロイド、タンパク質、ペプチド、脂質またはプロスタグランジン等）； 7)結合タンパク質（ステロイド結合タンパク質、成長ホルモン結合タンパク質または成長因子結合タンパク質、等）； 8)免疫系タンパク質（抗体、SLA遺伝子またはMHC遺伝子）； 9)抗原（バクテリア、寄生虫、ウイルス、アレルゲン、等）； 10）翻訳因子または転写因子、オンコプロテインまたはプロトオンコプロテイン、乳タンパク質（カゼイン、ラクトアルブミン、ホエー、等）；及び 11）筋肉タンパク質（ミオシン、トロポミオシン、等）。本発明の局面は、トランスジェニック動物の生産の前にトランスジーン発現につき胚細胞をスクリーニングする系である。このアッセイにおいて、SCIDマウス（またはその他の免疫不全もしくは免疫悪化げっ歯類）に導入されたES細胞は腫瘍を生じる。これらは、幾つかの完全に分化された組織（筋肉、骨、脂肪、軟骨、皮膚、上皮、神経組織、腺組織、造血組織、分泌組織、等を含む）を含む奇形腫または奇形癌腫であってもよい。トランスジーンを有するES細胞の夫々の系列が SCID（またはその他の免疫不全もしくは免疫悪化マウス）に注射され、腫瘍が回収し得る。次いでin situハイブリダイゼーション、免疫細胞化学、溶液ハイブリダイゼーション、ノーザン分析、サザン分析またはウェスタン分析、等が、どの組織型がトランスジーンを発現するのかを測定するために行い得る。この方法は、トランスジーンの適当な発現が起こらなかった形質転換ES系列の拒絶に有益である。更に、この方法は遺伝子調節研究においてキメラ動物またはトランスジェニック動物生産に対するショートカットに相当する。下記のプロトコル及び操作が本発明の種々の局面の実施態様である。種々の培地、溶液、等の配合は物質及び方法の項目に見られる。 1.未分化胚幹(ES)細胞系の精製工程１：生体内または試験管内で発育させ、そして自然ふ化、機械的または化学的除去により透明層から自由にさせた単離された個々のブタ、ウシ、ヒツジまたはヤギの胚胎を、(1)ウシ胎児血清(20％)、β−メルカプトエタノール、抗生物質、ヌクレオシド及び非必須アミノ酸のみを含むダルベッコ改良イーグル培地からなる ES培地(SCM)と共にミトマイシンＣ不活化マウス胚繊維芽細胞(STO)単層またはその他の細胞層、または(2)約40％のダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)と、合計で約20％のウシ胎児血清(FCS)、β−メルカプトエタノール、抗生物質、ヌクレオシド及び非必須アミノ酸を含む約60％のバッファロー・ラット・リバー細胞ならし培地(BRL-CM)(Smith及びHooperの論文，1987年)とからなる幹細胞ならし培地(CSCM)中で最初に培養した。工程２：約4〜21日後に、コロニーを、(1)皿からプラッキングし、即ち、選択的に除去し、または(2)皿全体をトリプシンで分散させ、ならし培地のみを含むプレートに塗布し（処理１）、または本明細書に開示されているようにSTOフィーダ層に塗布する（処理２）。プロトコル: ES細胞コロニーを下層の細胞から取り除き、そしてカルシウム／マグネシウムを含まないPBSの２回の交換により洗浄する。次いでコロニーをトリプシン溶液(Ca++、Mg++を含まない食塩加リン酸緩衝液、PBS中0.25％のトリプシン、0.4％のEDTA(表12を参照のこと))の液滴に移し、37〜39℃で１〜５分間インキュベートする。また、細胞の皿全体を洗浄し、トリプシン処理してもよい。細胞を微細な内径のパスツールピペットで激しくピペット操作することにより分離する。細胞を１mlの幹細胞ならし培地(CSCM)に入れてトリプシンを中和する。 CSCMは約40％のダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)と、合計で約20％のウシ胎児血清(FCS)、β−メルカプトエタノール、抗生物質、ヌクレオシド及び非必須アミノ酸を含む約60％のバッファロー・ラット・リバー細胞ならし培地(BRL- CM)(Smith及びHooperの論文，1987年)とを含む。両方の処理におけるES細胞を培養液中で成長させる。工程３：更に２〜21日後に、コロニーを再度プラッキングし（処理１）、または皿全体（処理２）をならし培地のみを含むプレートの上に置く。両方の処理におけるES 細胞を培養液中で成長させる。また、フィーダ層を使用して成長を支持してもよいが、好ましくない。SCMまたはCSCMをフィーダ層の存在下で使用してもよい。プロトコル：工程２で上記したとおり工程４：更に２〜21日後に、コロニーをプラッキングし（処理１）、または皿全体（処理２）をならし培地のみを含むプレートの上に置く。両方の処理におけるES細胞を培養液中で成長させる。プロトコル：工程２で上記したとおり工程５：更に２〜21日後に、充分な細胞数、約5-10X10⁶の細胞がある場合には、細胞の一部を継代培養し、一部を凍結してこれらの幹細胞コロニーのバックアップ原液として作用する。工程６：一致する形態、サイズ８〜15μ、核と細胞質の比約85:15、及びコロニー成長特性（倍加時間18〜36時間）を有するES細胞系が樹立されるまで、CSCM（または工程２によるフィーダ細胞）のみで培養した細胞を２〜４日毎にCSCMのみに通す。この全プロセス（工程１−６）は単一ES細胞系を単離するのに５〜21週間を要し得る。次いでこれらの系統をキメラの生産及び／または核移入に使用する。工程７は、適当な細胞がその操作のこの時点で単離されたか否かを同定するのに必要とされる。連続継代培養を、成長速度の関数である間隔で行う。例示の実施態様において、継代培養の間隔は２〜14日（１〜21日の範囲）である。胚胎培養物につき、フィーダ細胞層を使用して成長を支持してもよい。胚幹細胞培養物に特徴的な形態上の特徴及び成長パラメーターを有する安定な培養物が樹立されるまで、継代培養を続ける。胚幹細胞は、それらが非常に分化し易い傾向であり、こうしてそれ自体が表現型上不安定である点で典型的な培養哺乳類細胞とは本質的に異なる。こうして、 ES細胞培養物は一般にES細胞と非ES細胞、例えば、ES細胞及びその他の胚細胞の部分分化誘導体及び完全分化誘導体を種々含む非ES細胞との不均一混合物として培養中に現れる。このような培養物中のES細胞は典型的には異なる形態を有する細胞の凝集塊として成長することが見られる。凝集塊に非ES細胞を点在させ、これらは不均一な形態上の特徴を示す。有益なES細胞培養物は充分に低い比率、好ましくは10〜30 ％のこのような非ES細胞を有して、本明細書に開示された手段による比較的均一なES細胞の量の単離を可能にする。培養ES細胞の表現型の不安定性は、成長しているES細胞培養物の特徴の連続変化をもたらす。こうして、ES細胞培養は、細胞培養者が形態変化の基準につき夫々の培養の細胞を頻繁に、通常、毎日評価して、分化して大きな比率の非ES細胞を生じた細胞を充分に含む培養物を廃棄することを必要とする。ES細胞培養は有益な培養物からのES細胞の低温保存（凍結）を伴って、このような培養物がそれらの特徴を不可避に変化し、それらを有益にするこれらの特徴を失う時に適当な細胞の回収を可能にする。 ES細胞を最初に培養中の胚胎から調製する時に、ES細胞培養物に見られる不均一性がその後の継代培養物と較べて最大の程度まで存在する。こうして、ES細胞の単離及び調製につき、多くの胚胎を培養し、所望の形態上の特徴を有する細胞の大きな同定可能な凝集物（凝集塊）を含む少ない胚胎のみを使用し、一方、培養胚胎の大半を廃棄する。こうして、連続増殖に有益なES細胞培養物を選択するのに使用される形態上の基準がまた胚胎からのES細胞の初期の単離及び有益なES 細胞培養物へのそれらの拡大に必須である。その他の基準に加えて、本発明は形態上異なるブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの ES細胞の単離及び増殖の手段を与える形態上の基準の組を教示する。ES細胞系の多能性の予備スキャンとして、未分化形態が光学顕微鏡を使用して探究される。形態上、ES細胞は小さく（直径約８〜15ミクロン）、円形であり、かつ一つ以上の突起核小体を含む大きな暗核を有する。細胞質と核の比は約15:85であり、成長パラメーターは約18〜36時間の倍加時間及び単層成長ではなく多層成長を含む。このような形態上異なるES細胞が見られる同じ胚体培養物の幾つかにおいて、エバンスらによりブタES細胞の特徴であると記載された異なる形態上の特徴（以下、“エバンス形態”と称される）を有する細胞が観察される。本発明によれば、エバンス形態の特徴を有する細胞を主として含み、本発明の細胞につき本明細書に記載された形態上の特徴を有する細胞を主として含まない培養物が廃棄される。細胞の約50％以上が本明細書に特定された形態上の基準に適合する場合、これらの細胞が次の継代培養でES細胞を濃縮するために選択される（“プラッキングされる”）。エバンス形態を有する細胞は、或る程度分化できるが、キメラブタを生じることができることは示されていなかった。工程７：単離操作におけるこの工程は免疫系悪化げっ歯類（例えば、SCID、照射ヌードマウスまたはラット）の睾丸の白膜の下のES細胞の注射を伴って、奇形癌腫を生じる。マウスを毎日腫瘍の存在につき調べる。触知可能な腫瘍が観察される場合、げっ歯類を安楽死させ、腫瘍を回収する。未分化ES細胞を腫瘍から回収し、試験管内培養物に再度導入して、それらの形態及び成長特性がES細胞の予想されるものに適合するか否かをチェックする。適当な形態、サイズ８〜15μを有し、核と細胞質の比約85:15を有し、そして成長特性（18〜36時間の倍加時間）を有するES細胞系が培養中に再度樹立され、そして工程６のように選択される。これらの系統をキメラの生産及び／または核移入に使用する。注：この工程は、適当な形態のES細胞が観察されるあらゆる時点で起こり得る。工程８：周期的に、コロニーを先に概説したようにプラッキングし、そして一致した形態、サイズ８〜15μを有し、核と細胞質の比約85:15を有し、そして成長特性(18 〜36時間の倍加時間)を有するES細胞を再度単離することが必要である。注：これらの単離され、精製された未分化ES細胞系の維持は、キメラの発生及び核移入につき適当な細胞型を保証するのに必要とされる。或る分化が試験管内培養中に、また凍結プロセスの結果として自然に起こる。これらの分化細胞は良く継代培養しないが、時折ES細胞を分化細胞から再度精製することが必要である。工程９：キメラ生産または核移入のためにES細胞（サイズ８〜15μ、核と細胞質の比約 85:15を有し、そして18〜36時間の倍加時間）の濃縮集団を得るために、ES細胞コロニーを下層の細胞から取り除き、カルシウム／マグネシウムを含まないPBS の２回の交換により洗浄する。次いでコロニーをトリプシン溶液の50μlの液滴に移し、37〜39℃で１〜５分間インキュベートする。コロニーを１mlの幹細胞ならし培地(CSCM)に入れてトリプシンを中和する。細胞を微細な内径のパスツールピペットによる激しいピペット操作により分離する。ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギのES細胞の精製はまた遠心分離水ひ、フローサイトエトリー、ユニット重力沈降、差別的遠心分離、細胞分離、マウス細胞または分化ブタ細胞を優先的に死滅させるための免疫手術、コロニーまたは個々の細胞のプラッキング、差別的染色または免疫染色、キメラ胚体の生産並びに内部細胞塊及び幹細胞の再度の単離、ES細胞vs．その他のブタ細胞型またはマウス細胞のアフィニティークロマトグラフィー、電界における移動度、等により行われてもよい。処理１： ES細胞コロニーを下層の細胞から取り除き、カルシウム／マグネシウムを含まないPBSの２回の交換により洗浄する。次いでコロニーをトリプシン溶液（Ca++ 、Mg++を含まない食塩加リン酸緩衝液、PBS中0.25％のトリプシン、0.4％のEDTA ; 1.0％のNaCl、0.025％のKCl、0.025％のKH₂PO₄及び0.114％のNa₂HPO₄、pH7.2)の 50μlの液滴に移し、37〜39℃で１〜５分間インキュベートする。細胞を微細な内径のパスツールピペットによる激しいピペット操作により分離する。コロニーを１mlの幹細胞ならし培地(CSCM)に入れてトリプシンを中和する。CSCMは約40％のダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)と、合計で約20％のウシ胎児血清 (FCS)、β−メルカプトエタノール、抗生物質、ヌクレオシド及び非必須アミノ酸を含む約60％のバッファロー・ラット・リバー細胞ならし培地(BRL-CM)(Smith 及びHooper，1987)とを含む。細胞を穏やかな遠心分離によりペレットにし、そして1)室温で一夜放置し、続いて新しいペトリプレート上でCSCMで継代培養し、または2)直ちに新しいペトリプレート上でCSCMで継代培養する。処理２： ES細胞コロニー及び下層の細胞を含むプレートをカルシウム／マグネシウムを含まないPBSの２回の交換により洗浄する。プレートは１〜５mlのトリプシン溶液(Ca++、Mg++を含まない食塩加リン酸緩衝液、PBS中0.25％のトリプシン、0.4 ％のEDTA;1.0％のNaCl、0.025％のKCl、0.025％のKH₂PO₄及び0.114％の Na₃HPO₄、pH7.2)を有し、37〜39℃で１〜５分間インキュベートする。細胞を激しいピペット操作によりプレートから取り除き、幹細胞ならし培地(CSCM)に入れてトリプシンを中和する。CSCMは約40％のダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)と、合計で約20％のウシ胎児血清(FCS)、β−メルカプトエタノール、抗生物質、ヌクレオシド及び非必須アミノ酸を含む約60％のバッファロー・ラット・リバー細胞ならし培地(BRL-CM)(Smith及びHooperの論文，1987年)とを含む。細胞を微細な内径のパスツールピペットによる激しいピペット操作により更に分離する。細胞を穏やかな遠心分離によりペレットにし、そして1)室温で一夜放置し、続いて新しいペトリプレート上で新しいミトマイシンＣ試験したSTOフィーダ層及びC SCMで継代培養し、または2)直ちに新しいペトリプレート上で新しいCSCMで継代培養する。表１胚幹細胞系の生産方法の比較 ^a 手動ふ化が開示されているが、全ての処理芽細胞がふ化されるかどうかは明らかではない。^b Pied.=Piedrahitaら1990a及びb^c 本発明 2.ES細胞系の試験管内の特性決定本発明の局面は、有蹄類胚胎に導入された時にキメラ状態を生じそうである形質転換された胚幹細胞を試験管内で選択することである。選択基準は形質転換された胚幹細胞の形態上の特徴に基いている。一般に、光学顕微鏡を使用して細胞の検査により同定可能な形態上の特徴は予測的であるが、予測の形態上の特徴に関するその他のアッセイがまた本発明の範囲内にある。培養中に、本発明の胚幹細胞は半透明であり、凝集塊中で成長する。細胞は全培養表面を最終的に覆い、そして単層成長とは反対に多層のコロニー又は巣（凝集塊）を形成する傾向がある（図１、２）。胚幹細胞の培養中に、幾つかが未分化のまま残り、その他が分化し、即ち、構築された組織、例えば、腎臓組織を連想させる構造及びマーカーを示し始めるであろう。分化細胞は光屈折性または円形もしくは多角形の細胞境界を有する。また、細胞は液充満ドームを形成し、細胞は現在記載されたES形態を示す。これらの細胞の倍加速度は約18〜36時間である。これらの特徴はマウス胚幹細胞につき報告されたものと殆ど異ならないが、エバンスにより報告されたものとはかなり異なる（図１、表１）。マウス胚幹細胞に対する個々の有蹄類（ブタとして具体化される）ES細胞の類似性として、核と細胞質の比が約85:15であることが挙げられる。核は円形であり、かつ幾つかの突起核小体を含む。細胞サイズは単離された系統間で若干変化するが、安定な系統の殆どが８〜15ミクロンの範囲の直径を有する円形細胞からなる。表２に、エバンスの表明されたESブタ細胞と、本発明のESブタ細胞との相違が示される。また、本明細書に開示されたブタ細胞と、マウスのES細胞との類似性が記載される。表２マウス及び有蹄類ES細胞の細胞形態の比較 ^a エバンスは“種々のサイズ”(エバンス特許の欄10)、及び細胞系間で変化するサイズに関する。また、ウシ細胞が関連している。^b Wheelerら未公表の結果^c Pied.=Piedrahitaら1990a及びb^d 本発明、ブタから^e 発情は全ての種において０日目である。 3.有蹄類胚幹細胞に関する奇形腫／奇形癌腫それ故、有蹄類系統の発育中のスクー-ニングプロセスの一部として、細胞培養物がES細胞を含んでいたか否かを測定するアッセイは、培養物からの細胞を免疫不全哺乳類に導入して、腫瘍が形成されるかどうかを見ることであった。奇形腫または奇形癌腫の生成が、試験した培養物がES細胞を含んでいたことを推論するための基準である。奇形腫は、腫瘍が見られる領域に対し胎生学的、並びに組織学的に外来である奇異かつ無秩序に配置された組織を含む真の腫瘍である。奇形癌腫は癌性要素を含む奇形腫である。癌は悪性の上皮腫瘍である。真に多能である全ての系統は、増殖し、分化し、重症複合免疫不全マウス(SCI D)またはその他の免疫非応答性動物中で腫瘍を形成すべきである。腫瘍を生じるこれらの細胞系がキメラ動物の生産に使用するためのES細胞として好ましい。その選択方法は二つの部分を有する。1)腫瘍を形成できた細胞系のみを維持し、そして2)腫瘍からの細胞または番号1)で維持された細胞（これらはそれらの未分化状態を維持していた）のみがキメラ生産に使用される。下記のプロトコルをそのアッセイに使用した。細胞をトリブロモエタノール (0.005g/5gのBW)で麻酔した成体雄SCIDマウスに導入した。睾丸を腹中央線切除により露出させた。例示の実施態様において、約2x10⁶の細胞を一つの睾丸の白膜の下に26ゲージの針で注射し、他の睾丸に培地のみを注射した。幾つかの細胞系につき、更に多くの細胞が使用される必要があり得る。それ故、多数の細胞が試験されるまで、培養物は陰性と分析されるべきではない。腫瘍が生じないと結論する前に、最大約８週間の観察が完結されるべきである。細胞の注射の３週後に、動物を安楽死させ、腫瘍の存在につき調べた。次いで腫瘍からの細胞をES細胞培養系に入れた。培養の７日中に、幾つかのブタ細胞が分化し、一方、その他はそれらの初期の胚の未分化形態を維持した。次いでこれらの未分化コロニーを選択し、単離し、キメラの生産に使用するために成長させた。 4.多能ES細胞の試験管内分化真のES細胞を試験管内で外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に分化するように誘導する。有蹄類につき本明細書に記載され、マウスにつきいずれかで記載されたような未分化ES細胞形態の特徴の前記分化中の同時の損失がある。 ES細胞中で分化を誘導する方法は、細胞が小さく、自由に浮遊する細胞凝集物を形成するまで、細胞系をフィーダ層の上で高密度で培養することである。凝集物を回収し、分散させ、そして0.1％のゼラチンで被覆された60mmの組織培養プレートに再度塗布する。再度塗布した凝集物を、外在性薬剤を培地に添加しないで、細胞が集密になるまで培養する。これを高細胞密度により行う。培地を約48時間毎に交換し、細胞を分化の証拠につき毎日調べる。一般に、細胞の約30〜40％がこれらの条件下で最終的に分化し、即ち、当業者に知られている基準に従って認識可能な細胞型に達する。最も普通に観察された細胞型は繊維芽細胞型の形態を有する。繊維芽細胞が継代培養されない場合、それらは最終的に直径約50ミクロンの脂肪細胞のような細胞に発育するであろう。また、形態が管状である複合細胞構造が現れる。単層培養物中で、幾つかの細胞構造は長さ100ミクロンに達する。これらの網状構造は毛細管に似ており、またマウスで報告された構造に似ている。それ程普通ではないが、神経様細胞がまたこれらの培養物中に見られる。分化細胞型の性質は、本明細書の方法の項目に記載されたようにして免疫蛍光により測定される。未分化の多能細胞は細胞骨格構造タンパク質サイトケラチン18及びビメンチンを欠如しており、これらは分化細胞型中でのみ発現される。例えば、他者により報告された“上皮様”細胞は試験してサイトケラチン18につき陽性である。細胞分化の指標である抗原構造に対し誘導される抗体が利用可能である(Rudnicki及びMcBurneyの論文，1987年)。これらの構造の例として、神経フィラメント（外胚葉中で発現される）、グリア繊維タンパク質（外胚葉中で発現される）、ケラチン（内胚葉中で発現される）及びデスミン（中胚葉中で発現される）が挙げられる。抗原−抗体複合体の形成が分化状態の指標である。逆に、抗原−抗体反応の不在が分化の欠如の証拠である。多能性の証拠は、単一細胞系から、全ての胚層からの構造の分化により与えられる。多能細胞は細胞骨格構造タンパク質、サイトケラチン18及びビメンチンを欠如しており、これらは分化細胞型中でのみ発現される。神経フィラメント（外胚葉中で発現される）、グリア繊維酸性タンパク質（外胚葉中で発現される）、ケラチン（内胚葉中で発現される）及びデスミン（中胚葉中で発現される）を含む、特定の抗原に対する陽性染色が、細胞分化の指標である。未分化形態を示すES様細胞の複製コロニーを、ビメンチン、サイトケラチン18、神経フィラメント、グリア繊維酸性タンパク質、ケラチン及びデスミンに関して染色の存在または不在につき調べた（表３）。試験に使用した細胞系はES細胞を示唆する形態を示した。表３胚細胞骨格構造タンパク質の免疫染色１括弧中の文字は処理を示す。T=誘導された分化、C=未処理の対照系 STO=胚繊維芽細胞対照は試験した全ての抗体に対し陰性であった。２フルオレセインイソチオシアネート対照３グリア繊維酸性タンパク質４神経フィラメント68kD及び200kDタンパク質 5.多能ES細胞の生体内分化多能ES細胞の生体内分化を、キメラを生産する細胞の能力を測定することにより試験した。キメラを生産するために、約10〜20の細胞を生後６〜７日のブタ胚胎の胞胚腔に注射した。この操作はマウス胚キメラの生産につき記載された操作と同様である。例示の実施態様において、マイシャンブタES細胞(MW/M175F)をデュロック胚胎に注射した。デュロックブタは赤色の毛及びピンク色の皮膚色素を有するものとして特性決定される。マイシャンブタは黒色の毛及び黒色の皮膚色素を有するものとして特性決定される。これらの容易に目視できる遺伝した形質は推定のキメラの容易な目視スクリーニングを可能にする。この実施態様において、キメラが生産される場合、黒色の毛及び黒色の色素が赤褐色のバックグラウンドに対して現れる。逆の実施態様において、デュロックES細胞をマイシャン胚胎に注射し、毛色／皮膚キメラが存在する場合、赤褐色の毛及び斑点が黒色の毛、黒色の皮膚バックグラウンドに現れるであろう（表４を参照のこと）。表４デュロックレシピエント胚胎へのマイシャン胚幹細胞のマイクロインジェクションによるブタキメラの生産コートキメリズムを示す、本明細書に記載された本発明のES細胞を使用して生産されたキメラブタの写真が図３に示される。ブタの皮膚の観察によるキメラのスクリーニングに加えて、ハプトグロビン、グルコースホスフェートイソメラーゼ(GPI)及びコレステロール７−αヒドロキシラーゼ系中の遺伝マーカーの如き遺伝マーカーのスクリーニングが利用可能である。例えば、マイシャン品種はGP I多型性のＢイソタイプのみを有し、一方、デュロック品種はＡイソタイプ及びＢイソタイプの両方を有する。マイシャンブタ中のＡイソタイプ及びＢイソタイプの出現はキメリズムの証拠である。キメラ子ブタの例は、ＡGPIイソタイプ及びＢ GPIイソタイプを示すものである。このようなブタを、デュロック(D49/6E) ES細胞をマイシャン胚胎に注射することにより生産した。コレステロール−７−αヒドロキシラーゼ遺伝子は、ブタのマイシャン品種、デュロック品種及びヨークシャー品種中のコレステロール−７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子座におけるTaqＩ多型性により特性決定される。マイシャン品種に関する多型バンドは約2.5kb及び約4kbに現れる。デュロック品種及びヨークシャー品種に関する多型バンドは約2.8kb及び約5.0kbに現れる。2.5kb及び4kb対立遺伝子はマイシャン品種のみに特異性の品種である。2.8kb及び5.0kb対立遺伝子はデュロック品種及びヨークシャー品種のみに特異性の品種である。あらゆる組み合わせ中の２バンド（マイシャン品種に特徴的なバンドとデュロック品種またはヨークシャー品種に特徴的なバンド）もしくは３バンドまたは４バンドの出現は、キメリズムの証拠である。制限酵素断片長多型(RFLP)が、サザン分析、ホスホイメジリー(phosphoimagery)またはオートラジオグラフィーにより分析される。 6.胚幹細胞に関する用途 a)異種移植これらの移植物質の宿主生物による拒絶を減少する外在性主要組織適合性またはその他の外来もしくは内在性の抗原及び／または遺伝子を有する細胞、組織または臓器が、本発明により生産し得る。外在性の外来または相同の DNAが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムへの暴露、マイクロインジェクション、リポフェクション、レトロウイルスもしくはその他のウイルスまたは微生物のベクター、またはその他の手段により有蹄類ES細胞に移入される。ES 細胞はこのDNAのとり込みまたは抗原の発現につきスクリーニングされ、胚胎に直接移入されてキメラを生産し、または核移入系に使用されて有蹄類をクローン化する。これらの細胞、組織及び臓器が異種移植のために胚胎、胎児、新生子または得られる成体から回収される。この方法において、ヒト化有蹄類移植片、例えば、腎臓が意図される。損傷され、非機能性の、または悪化された細胞または組織の置換、修復または増強のための分化細胞の生産が別の用途である。外在性の外来または相同のDNA が、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、マイクロインジェクション、リポフェクション、レトロウイルスもしくはその他のウイルスまたは微生物のベクターまたはその他の手段により有蹄類ES細胞に移入される。ES細胞はこのDNA のとり込みにつきスクリーニングされ、胚胎に直接移入されてキメラを生産し、または核移入系に使用されて有蹄類をクローン化する。これらの細胞及び組織が或る欠陥を修復または増強するのに使用するために胚胎、または得られる成体から回収される。例えば、有蹄類胎児、及び新生子からの臓器が、パーキンソン患者、心臓発作を有した人、または脊髄損傷を治療するのに使用し得る。 b.特定のタンパク質またはその他の生物分子の生産食品補給物、添加剤、等として製造または加工に使用される医薬品、診断薬、または抗体が、ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギのES細胞を使用して生産される。外在性の外来または相同のDN Aが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、マイクロインジェクション、リポフェクション、レトロウイルスもしくはその他のウイルスまたは微生物のベクターまたはその他の手段により有蹄類ES細胞に移入される。ES細胞はこのDN Aのとり込みにつきスクリーニングされ、または胚胎に直接移入されてキメラを生産し、または核移入系に使用されて有蹄類をクローン化する。これらのタンパク質またはその他の分子が更なる精製のために有蹄類の胚胎、胎児、新生子または得られる成体から回収される。例えば、ヒト血液凝固因子IXが血友病の治療のためにブタ、ウシ、ヒツジ、及びヤギの乳中で生産し得る。トランスジェニックのブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギが、商用または実験用に回収し得る変性組織または乳タンパク質と共に生産し得る（表５）。この方法において生産し得る下記の医薬用、治療用、加工用、製造用または組成物用のタンパク質の例として、血液タンパク質（凝固因子VIII及びIX、補体因子または補体成分、ヘモグロビンまたはその他の血液タンパク質、等）、ホルモン（インスリン、成長ホルモン、甲状腺ホルモン、ゴナドトロピン、PMSG、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトキシン、ドーパミン、カテコールアミン等）、成長因子(EGF、PDGF、NGF、IGF等)、サイトカイン（インターロイキン、CSF、 GMCSF、TNF、TGFα及びβ等）、酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロールの生合成キナーゼまたは分解キナーゼ、消化キナーゼ、ステロイド生合成キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、グリコソラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロムアデニレートまたはグアニレートサイクラーゼ等）、ホルモンレセプターまたはその他のレセプター(L DL、HDL、ステロイド、タンパク質、ペプチド、脂質またはプロスタグランジン等)、結合タンパク質（ステロイド結合タンパク質、成長ホルモンまたは成長因子結合タンパク質等）、免疫系タンパク質（抗生物質、SLA遺伝子またはMHC遺伝子）、抗原（バクテリア、寄生虫、アレルゲン等）、翻訳因子または転写因子、オンコプロテインまたはプロトオンコプロテイン、乳タンパク質（カゼイン、ラクトアルブミン、ホエー等）、筋肉タンパク質（ミオシン、トロポミオシン等）が挙げられる。典型的な状況において、ヌクレオチド配列はトランスジェニックのブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギから最終的に回収されたタンパク質の前駆体形態をコードする。勿論、或る種の生産物は或る種の組織からの生産のために回収できない。どの細胞型が或る構造を発現するのかを測定するための本明細書に開示された方法が、どの組織が好適であるのかを決定するのに有益であろう。表５トランスジェニックのブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの体液から回収できるタンパク質の例 ¹タンパク質源としてブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの乳を使用する場合、哺乳類特異性プロモーターがトランスジーン、例えば、α−ラクトアルブミンに必要とされる。例示の実施態様において、胚幹細胞によるトランスジェニックのブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの乳中のヒト凝固因子IX(FIX)の生産は下記のプロトコルにより行われる。ヒト凝固因子IXタンパク質をコードする配列をFIX cDNA(Clarkら， 1989)から切除し、哺乳類特異性プロモータ−（例えば、αラクトアルブミンプロモーター）につないでトランスジーン構築物を生産する。この構築物を幹細胞にエレクトロポレーションする。選択可能なマーカーの遺伝子、例えば、neoを同時エレクトロポレーションし、その結果、回収期間後に、トランスジェニック細胞がG418を培地に添加することにより選択され、これがとり込まれず、neo遺伝子を発現していない全ての細胞を死滅させるであろう。これらの幹細胞をブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの胚胎に注射してキメラを形成し、またはクローニングに使用してトランスジェニック動物を直接生産する。トランスジーンをプローブとして使用して動物をスクリーニングし、哺乳類組織バイオプシーからのmRNAを FIX遺伝子の適当な発現につき試験する。トランスジェニック雌を飼育し、乳を取り、FIXを乳から抽出する。 c.家畜の遺伝子形質の強化ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギのES細胞を使用して疾患耐性；成長速度及び効率；乳生産、品質及び組成；枝肉の品質及び組成；成体組成；再現性の効率及び性能を改良する。更に、病原に対する自己免疫化、成長促進物質の増大された分泌、泌乳を含む再現性プロセスの刺激を含む、成体期への発育及び成長中の特定の遺伝子の発現を調節することにより改良された性能が、意図されている。有蹄類ES細胞から得られる遺伝子操作された個体は、ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの新規な品種または系統の創始動物として利用できる。例えば、変性乳タンパク質組成物は子孫の増大された生存能及び増大された成長を可能にする。有害な対立遺伝子、遺伝子、またはDNA配列の除去または変性は、相同的組換えを使用して行われる。特定のDNA配列が除去され、導入され、または変性されて個体の生物学を操作する。ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギのES細胞から得られる遺伝子操作された個体は、ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの新規な品種または系統の創始動物として利用できる。例えば、雄ブタのしみを生じるホルモンの生産を担う酵素をコードする遺伝子を除去すると、その状態を示さない動物を生じるであろう。 d.その他の種からの遺伝子操作された同一の子孫の生産は、胚細胞または未受精卵母細胞へのES細胞核の移入により行われ、その結果、得られる細胞系、組織、臓器または子孫は形質転換された一つ以上の核の遺伝子物質の全部または一部を含む。これらの個体は生産物の一様性；遺伝子マッピング、組織適合性を増大し、特定の望ましい、または遺伝的（DNA形質転換された）遺伝子型を増殖し、移植目的及び研究目的のために多数の遺伝的に同一の細胞、組織、臓器及び動物を与えるのに有益である。外在性の一つ以上の遺伝子を含み、またはそれらを含まない特定の細胞系からのES細胞が、顕微操作により外来細胞質、例えば、除核された卵母細胞または胚細胞に移入される。得られる細胞が培養されて新規な系統を樹立し、キメラの胚胎、組織、及び／または臓器を形成するのに使用され、または遺伝子操作された子孫の生産のために代理母に移入される。除核された卵母細胞または胚細胞への多細胞または単一ES細胞もしくは核の移入は顕微操作により行われる。移入された細胞または核の融合は、電気パルス、センダイウイルスまたはポリエチレングリコシドの如き融合剤への暴露、または細胞膜のイオンフラックスを変化するイオノファへの暴露により行われる。有蹄類ES細胞から得られる遺伝子操作された個体は有蹄類の新規な品種または系統の創始動物として利用できる。例えば、トランスジーンを有するES細胞は除核された卵母細胞に融合されてクローン化された細胞、組織、臓器（腎臓移植片）または動物の生産のために同一の核DNAを有する細胞を生産し得る。 7.遺伝子移入 SCIDマウス中で腫瘍を生じた細胞系は、本発明の方法によりトランスジーンをキメラ動物に運ぶためのベクターとして好ましい。トランスジーンを含む細胞は種々の方法により細胞に運ばれる。これらの方法として、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、レトロウイルス感染及びリン酸カルシウムが挙げられる。細胞は抗生物質G4l8（構築物がneo遺伝子を含む場合）またはその他の適当なスクリーニング薬剤もしくは化合物でスクリーニングされる。スクリーニング後に残っているコロニーがクローン化され、そしてPC R、サザン分析、ノーザン分析またはウェスタン分析を含む、当業者に知られている方法によりトランスジーンのとり込みにつきチェックされる。 8.ブタ中の幹細胞生産の効率ブタのデュロック系統、マイシャン系統、ヨークシャー系統及び［ランドレースＸヨークシャー(L X Y)］系統からの胚胎をブタ胚幹細胞系の発育のために回収した。８日目のふ化された胚盤胞をドナー動物から手術によりフラッシュし、胚幹細胞発育培地の存在下で24ウェルプラスチック培養プレート中で培養した。胚胎を培養の開始後の３日目、７日目そして14日目に調べ、胚盤胞の付着及び細胞成長の量を記録した。細胞の付着及び成長の型を栄養芽細胞様または内部細胞塊様として分類した。合計391の胚盤胞を回収し、培養した（110のデュロック、 84のヨークシャー、44のL X Y及び153のマイシャン）。デュロック胚盤胞は速く付着する傾向があり、かつヨークシャーまたはL X Y交雑種よりも内部細胞塊様付着を示した。内部細胞塊様付着の頻度は品種間で異なった。この付着を示した胚胎の比率は、夫々デュロック、マイシャン、ヨークシャー及びL X Yにつき16. 4％、11.1％、5.9％及び4.5％であった。デュロック内部細胞塊様付着の頻度はヨークシャーまたはL X Yよりも高かったが(P<.05)、マイシャン胚胎付着頻度とは異ならなかった。また、内部細胞塊様付着の発生に関する個々のドナーの効果があった(P<.05)。個々のドナーからの胚胎はそれらの内部細胞塊様付着頻度において０〜50％の範囲であった。しかしながら、ドナー効果は品種に依存しなかった。結果は、付着し、こうして培養中に潜在的に成長するブタ胚胎の能力が品種及び胚胎のドナーにより影響されることを示す。効率に関する追加の情報につき、表６及び表７を参照のこと。表6 表7 9.抗生物質耐性抗生物質G418（ゲネチシン）は、neo遺伝子をとり込み、発現している哺乳類細胞の選択物質として頻繁に使用されるゲンタマイシンに関連するアミノグリコシドである。発現しない細胞は、その薬剤への暴露の二三日後に死滅する。マウス細胞の選択に使用される投与量は普通125〜400mg/ml培地の範囲である。ブタneo発現細胞の選択に最適のG418の投与量を決定するために、投与量曲線を作成した。マウスES-D3細胞及びブタD195細胞の両方を２mlの幹細胞ならし培地中ウェル当たり1x10⁴の細胞で12ウェルプレートに塗布した。塗布の後の日にG 418を含む培地を下記の濃度で添加した。0、250、500、750、1000または 1250μg/ml。細胞を分散させ、２日目、４日目、６日目及び８日目にカウントした。トリパンブルー排除により測定される、夫々の処理ウェル中の生細胞の数を毎日夫々の細胞型につき未処理の対照ウェル中の細胞の数で割った。48時間後にマウス細胞の68％、６％、２％、２％及び０％が夫々の投与量で生存し、一方、ブタ細胞の70％、54％、75％、29％及び５％が生存した。８日目に、ES-D3細胞のわずかに0.2±0.3％が250μgの投与量で生存し、0％がそれより高い全ての投与量で生存した。この時点で、D195細胞の92.7±4.7％が250μgの治療グループ中で生存した。しかしながら、750μgでは、わずかに0.03±0.03％が生存した。それ故、D195細胞を選択するのに最良の投与量は750μg/mlであることが決定された。その他のブタES様細胞がまたそれより多い投与量のG418を必要とするかどうかを測定するために、マウスES-D3、D195及びM2-176、M2-158と称される２種のその他のブタ系統を用いてこの実験を繰り返した。後の二つの系統はES形態を示す。これらを８日にわたって250、750そして1250μg/mlのG418で処理し、次いで細胞カウントを実験１のようにして測定した。先の実験のように、生細胞の比率は 250μgの投与量でマウスES-D3系統とD195系統の間で異なり(P<.01)、またそれより多い両方の投与量で同様であった。しかしながら、D195細胞は250μg/mlではその他のブタ系統よりG418に対し耐性であった(P<.05)。これらの結果は、マウスES細胞がD195細胞よりもG418に対し感受性であることを意味するものと解される。しかしながら、これらの細胞はまたその他のブタ系統とは異なって応答し、 G418選択投与量が夫々の細胞系につき最適化される必要があることを示す。 10．ES細胞によるマウス腫瘍生成における因子マウス胚幹(ES-D3)細胞、例えば、系統ES-D3は、同系マウスまたは免疫悪化マウスに導入される時に奇形腫を生じる。しかしながら、腫瘍発生に関与する因子は同定されていなかった。レシピエントマウスの注射部位、注射された細胞数及び性別が腫瘍形成を変化させるという仮説を試験するために、マウスES-D3細胞を重症複合免疫不全(SCID)マウスに注射し、17〜21日間生育した。検死時に、腫瘍を回収し、転移の証拠を観察し、組織を組織検査のために固定した。実験１において、２x10⁶の細胞を雄SCIDマウスの皮下の睾丸及び腎臓に注射した。腫瘍発生率は睾丸(9/9)及び腎臓(10/10)につき100％であったが、皮下注射につきわずかに83％(5/6)であった。実験２において、腫瘍発生率に関する注射された細胞の数の効果を分析した。 2x10⁶、2x10⁴、2x10²または0の注射を４匹のマウスの睾丸に夫々行った。17後に、わずかに2x10⁶のグループ(4/4)が大きな目視できる腫瘍を有していた。 2x10⁴のグループ中の１匹のマウス(1/4)が組織学的に同定された奇形腫を有していた。2x10⁶のグループにおいて、合計の腫瘍重量は0.73g〜2.66gの範囲であった。隔膜への腹部転移が全てのマウス中に存在した。神経組織及び腺状組織を可変量の角質化皮膚、線毛上皮細胞、杯細胞、及び軟骨を含む奇形腫中で一致して同定された。 ES-D3細胞は雌胚胎に由来するので、実験３は腎臓に2x10⁶のES-D3細胞で注射された雄及び雌のマウス中で形成する腫瘍の能力を比較した。奇形腫は雄(6/6）及び雌(6/6)の両方で生じた。転移がこの実験で雌の66％、また雄のわずかに33 ％で見られた。平均腫瘍重量は性別間で異ならなかった(1.1+.39g vs.1.6+.68g) 。これらのデータは、1)注射部位が腫瘍形成に重要ではないが、部位がそれ程有利ではないこと、2)2x10⁴より多い細胞が腫瘍形成に必要であること、3)雌ES細胞が雄レシピエント及び雌レシピエントの両方で腫瘍を生じることを示すものと解される。これらの実験は同様の質問に答えるための有蹄類における実験のモデルである。 11．ES細胞系 D195と称される細胞系を、ブタ胚胎細胞をプラスチック上でBRL-幹細胞ならし培地中で培養することにより生産した。この系統の特徴として、以下のものが挙げられる。 1)PCRにより測定してブタ特異性対立遺伝子（例えば、α−ラクトアルブミン）に対し陽性； 2)プラスチック及びSTOフィーダ細胞の両方で異なるコロニー中で成長する： 3)培養容器中で集密まで成長された場合に胚様体を生産する（胚様体は腫瘍を生じず、それらが分化されることを示す；胚様体はレシピエントブタに逆に移入された時に妊娠を生じない；しかしながら、それらはかなり広範囲の栄養膜小胞を生じる） 4)倍加時間は約18〜24時間である； 5)細胞が多能細胞と一致する。何となれば、それらはレチノイン酸と共にインキュベートされた時に神経様形態に分化し、またジメチルスルホキシド(DMSO)と共にインキュベートされた時に筋肉様形態に分化するからである； 6)細胞が直径８〜15μであり、５％の細胞質対85％の核の比を有し、かつ単離された場合に円形である。 D195の処理の操作は下記のとおりである。解凍： 36℃で約１分間解凍する。幹細胞培地(SCM)9ml中に再度懸濁させ、300gで５分間遠心分離して細胞をペレットにし、上澄みを除去する。細胞を幹細胞ならし培地(CSCM)1ml中1X10⁶の細胞まで再度懸濁させる。継代培養：細胞懸濁液2mlを75cm²の組織培養フラスコ中のCSCM18mlに添加する。細胞は２〜３日毎に継代培養されるべきである。75cm²の組織培養フラスコ当たり２x 10⁶の細胞の密度で塗布する。それらが約80％の集密になる時に、細胞は継代培養されるべきである。継代培養液に、培地を流出させ、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含まない食塩加リン酸緩衝液(PBS)10mlで洗浄する。トリプシン-EDTA２mlを添加し、37 ℃で１〜２分間インキュベートする。フラスコを穏やかに攪拌して細胞を取り除き、手のひらに対し軽くたたく。CSCM4mlを添加し、フラスコの側部をCSCMで洗浄し、内容物全部を50mlの円錐遠心分離管に入れる。培地を数回穏やかにピペット操作することにより細胞を分離する。細胞をカウントし、1ml中1x10⁶の細胞まで再度懸濁させる。細胞懸濁液２mlを75cm²の組織培養フラスコ中のCSCM18mlに添加する。細胞は一般に２〜３日毎に継代培養を必要とするであろう。低温保存： D195細胞を2-4X10⁶/mlで凍結する。凍結培地0.5mlを低温バイアルに添加し、次いでCSCM中の細胞懸濁液(2-4X10⁶の細胞／0.5ml)0.5mlを添加し、穏やかに混合し、直ちにスタイロフォームボックスに入れ、-70℃の冷凍機に入れる。一夜凍結させる。凍結した時、-196℃の液体窒素に入れる。物質及び方法：ブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギの胚胎の回収及びES様細胞の単離 1.排卵の調節及び胚胎回収：雌を毎日２回発情につきチェックし、発情時に受精してドナーになる。胚胎を種に応じて下記の日に回収する。拡大またはふ化された胚盤胞としてブタ5.5-8. 0;ふ化された胚盤胞の初期に、ウシ5.5-1日;ふ化された胚盤胞の初期に、ヒツジ 5-9日；ふ化された胚盤胞の初期に、ヤギ5-9日。 2.STO 細胞の継代培養： STO細胞のプレートが集密(80％)になり、または接近する時、それらを継代培養する。培地をプレートから除去し、新たに解凍された（37℃の水浴中で解凍）トリプシンEDTA(0.25％;0.04％)２mlを添加する。プレートを38℃のインキュベーター中に５分間入れる。夫々のプレートに血清DMEM(sDMEM、完全培地；37℃の水浴中で温めた）２mlを添加することによりトリプシンを中和する。次いで細胞を激しくピペット操作して単一細胞懸濁液を生成する。新しい培地を添加して1: 2〜1:10の希釈を行う。その希釈比を細胞の集密の程度及びプレートの数に調節する。プレートを穏やかに回転させて一様な塗布を確実にする。次いでプレートを38℃の５％のCO₂のインキュベーターに入れる。培地を２日毎に交換して、細胞は接種密度に応じて２〜５日以内に集密(80％)まで成長する。 3.フィーダ層の調製： STO細胞をフィーダ層として使用する２日前に処理する。ほぼ集密（一般に集密になる１日前）であるSTO細胞のプレートを使用して、培地を吸引し、慎重に1 0μg/mlのミトマイシンＣ（シグマケミカル社）の溶液2〜4mlと交換し、38℃のインキュベーターに２〜３時間戻す。この時点で、夫々のプレートを無菌PBS、p H7.25mlで2〜3回洗浄することによりミトマイシンＣ溶液を除去する。培地をsDM EM10mlと交換し、プレートを38℃のインキュベーターに24時間戻す。24時間後に、培地を新しい培地と交換し、フィーダ層として使用する時に再度交換する。フィーダ層を使用前に10日まで保存することができる。 4.胚胎培養：胚胎を改良ホワイテン培地またはその他の胚胎培地中で３回洗浄し、1)繊維芽細胞(STO細胞）の再度形成されたフィーダ層、または2)無フィーダ層を含む培養容器に、20％のウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン、10^-4Mの２− メルカプトエタノール、及び非必須アミノ酸を含む幹細胞改良ホワイテン培地（フィーダ層用）、またはフィーダ層用の幹細胞培地(SCM)、もしくはCSCM（フィーダ層と共に、またはそれを用いない）と共に個々に入れる。 ES細胞培地(SCM)は、0.1mMの２−メルカプトエタノール、50IUのペニシリン/L 、50μgのストレプトマイシン/L、10mM/LのMEM非必須アミノ酸(Robertson, 1987)及び20％のFBSを含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM;L-グルタミン、 4500mgのグルコース/Lを含む)からなる。胚胎を回収した後、それらを新しい培地で３回洗浄してその道からの汚染物質を希釈する。胚胎がふ化されていなかった場合、それらを油の下のW-2培地の微小液滴に移して培養してふ化させる。６日の胚胎またはそれより若いものがフラッシュされる場合に、これが起こるであろう。ふ化胚盤胞が得られる時、それらを24ウェルプレート中の個々のウェルに移す。夫々のウェルは、STOフィーダ層を使用する場合には培地(幹細胞培地、SCM)、またフィーダ層を使用しない場合には幹細胞ならし培地(CSCM)１mlを含むべきである。培養の初期段階が行われる。培養の24〜48時間後に、胚胎が透明層からふ化し、培養皿に付着する。 5.幹細胞単離及び培養：胚幹細胞を付着胚胎から単離し、下記のプロトコルにより培養中に維持する。内部細胞塊(ICM)が培養の最初の二三日中に大きくなる。拡大後、ICMを下層の細胞から取り除き、カルシウム／マグネシウムを含まないPBSの２回の交換により洗浄する。次いでICMをトリプシン溶液（Ca⁺⁺、Mg⁺⁺を含まない食塩加リン酸緩衝液、PBS中0.25％のトリプシン、0.4％のEDTA、表12を参照のこと；1.0％のNaC l、0.025％のKCl、0.025％のKH₂PO₄）の50μlの液滴に移し、38℃で１〜５分間インキュベートする。細胞を微小パスツールピペットで分離する。次いで内容物をフィーダ層を用いて、またはそれを用いずに新しい培養容器中の20％のFCSを含むCSCMの新しい液滴に移す。培養物を円形の幹細胞（これらは培養の７〜８日（２〜21日の範囲）後に現れる）の巣の外観につき毎日検査する。コロニーを、上記のようにしてフィーダ層から解離し、トリプシンで処理し、新しいフィーダ層に通す。成功した培養において、幹細胞の小さい巣が継代培養の２〜３日後に現れる。これらの巣を単離し、分散させ、フィーダ層を用いて、またはそれを用いずに新しい培養容器に塗布する。この段階の細胞は、成長速度に応じて３〜10日毎の継代培養を必要とする。細胞は２〜３日毎に新しい培地と交換された培地を消費した。ES細胞系の多能性を予備特性決定するために、未分化形態の顕微鏡観察を使用する。ES 細胞は典型的には小さく、かつ円形であり、一つ以上の突起核小体を含む大きな暗核を有する。 ES細胞を、本明細書に記載されたようにして、フィーダ細胞または分化ブタ細胞（これらの系統はならし培地(CSCM)単独中で完全に発育されていてもよい）から精製する。更なる特性決定は細胞骨格構造タンパク質、サイトケラチン18及びビメンチン（これらは分化細胞型中でのみ発現される）の欠如につきES細胞の間接免疫蛍光染色を必要とする。典型的な未分化ES細胞形態及び抗サイトケラチン 18抗体及び抗ビメンチン抗体による陽性の染色の同時の損失と共に、内胚葉、外胚葉または中胚葉への多能ES細胞の試験管内分化が、誘導し得る。 6.胚幹細胞の培養：樹立された後、幹細胞は18〜36時間毎に分裂して迅速に成長する。高速の細胞分裂が維持されることを確実にするように、細胞は比較的高い密度に保たれるべきである。何となれば、これは自然分化のレベルを最小にするからである。培養物を毎日、または培地の酸性度に応じて再度栄養補給し、３〜４日の間隔で継代培養する。細胞を、それらが由来した最初の胚胎につき同じ培地(CSCM)中でルーチンで成長させる。プレートが集密に接近した時に、幹細胞を通過させる。細胞に通過の２〜３時間前に再度栄養補給して細胞生存度を改良する。培地を吸引し、細胞表面を無菌 PBS５mlで洗浄する。PBSをトリプシンEDTA0.5〜3mlと交換し、38℃で１〜５分間インキュベートする。次いでプレートをインキュベーターから除去し、無菌プラッキングされたパスツールピペットを使用して懸濁液を激しくピペット操作する。ピペット操作後に、細胞懸濁液を光学顕微鏡の低出力(40X)のもとに目視検査して、それが細胞凝集物を比較的含まないことを確実にする。細胞を遠心分離管中で1000Xgで５分間にわたってペレットにし、上澄みを吸引し、細胞を培地(CSCM)10ml中で再度懸濁させる。最後に、細胞密度を測定し、細胞懸濁液を、完全培地10〜12mlを含むフィーダプレートに再度塗布する(100mmのプレート当たり1-2x10⁶の細胞）。キメラを形成するためのES細胞の使用 7.キメラの生産：一般に10〜20の培養通過からの5〜20（１〜30の範囲）のES細胞を顕微操作器に取り付けられている直径25〜30μのガラス注射針により細胞塊（桑実胚）または胞胚腔（胚盤胞及び拡大された胚盤胞）に入れる。注射後、胚胎を直ちにレシピエント若雌ブタ、ウシ、雌ヒツジ、または雌ヤギ（これらは胚胎ドナーの24時間後に発情中であった）に移した。キメラを、それらが、例えば、毛色マーカー（即ち、ウシにつきマイシャンＸデュロック、アンガスＸハーフォード、ヒツジにつきドーセットＸリンカーン（ホモ接合の黒色系統）、ヤギにつきサーネンＸトッゲンブルグまたは黒色もしくは褐色のヌビアン）を使用して容易にスクリーニングされるように、設計する。得られた個々のキメラは、胚細胞系列の夫々に由来する異なる色の皮膚の斑及び毛を有するであろう。 8.核移入によるキメラ及びクローンの生産：キメラを下記の段階の前移植胚胎によるES細胞の凝集により生産する。１細胞、２細胞、４細胞、８細胞、16細胞、32細胞、桑実胚、胚盤胞、及びふ化胚盤胞。核移入子孫またはクローンを胚胎の下記の段階の除核された前移植胚細胞との ES細胞の融合または注射により生産する。卵母細胞、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞、16細胞、32細胞、桑実胚、胚盤胞、及びふ化胚盤胞。多能ES細胞の生体内分化を、キメラ子孫の形成に関与するそれらの能力により確かめる。桑実胚、胚盤胞及び拡大された胚盤胞段階胚胎を油の下のPBS100μl に入れる。胚胎を顕微操作器（ナラシゲ社、東京、日本）に取り付けられた微小ガラス保持ピペットにより把握する。 9.ブタの品種：マイシャン品種は上海付近の湖タイフ領域からのものである。タイフブタは中国に最も多産のものであることが明らかである。その領域は温度により特徴付けられ、その温度は平均15.7℃であり、-9.0℃の年間低温から38.2℃の年間高温までの範囲である。ブタの中国タイフ品種は非常に多産であり、初期年齢で青春期に達するが、不十分な成長速度及び枝肉品質を有する。中国マイシャンブタは色が明るい灰色から暗黒色までの範囲であり、白色の斑点の種々の程度を有する。マイシャンブタは特徴的に白色の足及びひずめ、極めてしわの多い顔及び大きいたれ下がった耳を有する。中国におけるブタの家畜化は少なくとも紀元前3,000 年に逆上り、時間が経って、中国ブタは世界のブタの品種の開発に貢献した。南中国からの多数のブタが紀元前３世紀にローマ帝国に輸入され、ヨーロッパの品種を改良するのに使用された。紀元16世紀から18世紀まで、南中国からのブタが英国に輸入され、最新品種、特にヨークシャー及びバークシャーの開発に使用された。18世紀の終わりまでに、中国先祖を有する品種が殆ど全ての土着の英国品種を置換した。米国のバークシャー品種及びヨークシャー品種は夫々1823年及び1893年に英国からの輸入に由来した。19世紀のアメリカに導入された中国ブタはまたポーランドチャイナ品種及びチェスターホワイト品種の形成に役割を果たした。有望な外国品種の輸入は家畜生産において長い伝統をもち、最も最近に導入されたブタ品種であるランドレース（1934年にデンマークから最初に輸入された）が米国のブタ生産にかなり貢献した。デュロック品種は完全にアメリカの品種であり、1870年代に逆上り、その時にニュージャージーからのジャージーレッドとニューヨークからのデュロックの組み合わせがデュロックージャージーとして知られている品種を形成し、その後、単にデュロックとして知られているようになった。デュロックは非常に耐久性の品種であり、速い成長速度及び良好な霜降り特性を有することが示された。これらの二つの特性、即ち、速い成長及び枝肉品質、十強い承認が、デュロックを米国の純粋飼育登録の上位（ヨークシャーと共に）に置くことを助けた。デュロックは色がソリッドレッドであり、明色から暗色まで変化し、かつ中間サイズのたれ下がった耳を有する。 10．培地： SCM幹細胞培地(SCM)はダルベッコ改良イーグル培地(DMEM：L-グルタミン、 4500mgのグルコース/L;シグマ・ハイブリマックス#D6655、シグマ・ケミカル社、セントルイス、MO）と下記の補給物質とからなっていた(Robertson，1987)。2 0％のFCS、0.1mMの２−メルカプトエタノール、50IUのペニシリン/L、50μgのストレプトマイシン,L、10mM/LのMEM非必須アミノ酸（シグマ#M7145、シグマ・ケミカル社、セントルイス、MO）、ヌクレオシド(.03mMのアデノシン、.03mMのグアノシン、.03mMのシチジン、.03mMのウリジン、及び.01mMのチミジン）。CSCM 幹細胞ならし培地(CSM)は40％のダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)と、合計2 0％のFCS、及び下記の補給物質を含む60％のバッファロー・ラット・リバー細胞 (BRL-3A、ATCC CRL#1442)ならし培地(BRL-CM)とを含む(Smith及びHooper, 1987;Hooper，1987)。0.1mMの２−メルカプトエタノール、50IUのペニシリンL、 50mgのストレプトマイシン/L、10mMのL MEM非必須アミノ酸、ヌクレオシド(.03m Mのアデノシン、.03mMのグアノシン、.03mMのシチジン、.03mMのウリジン、及び .01mMのチミジン）。その他の培地及び溶液製剤が表８〜17に示される。表８培地*添加剤＝β−メルカプトエタノール、抗生物質原液、ヌクレオシド原液、及び MEM非必須アミノ酸 PEN=ペニシリン STREPT=ストレプトマイシン表９試験管内環境中の動物細胞の培養のためのダルベッコ改良イーグル培地(DMEM) 表９（続き） pHを1NのHClで7.3に調節し、濾過滅菌し、４℃で２週間まで貯蔵した。これは試験管内環境中の動物細胞の維持及び増殖のための一般の組織培地である。表10 細胞培養操作のための食塩加リン酸緩衝液(PBS) pHを1NのHClで7.3に調節し、濾過滅菌して細胞培養物の汚染を防止した。これは細胞保全性を維持するための種々の細胞培養技術に使用される一般の目的の食塩溶液である。表11 バクテリア汚染を防止するための細胞培地への添加用の抗生物質原液４℃で貯蔵し、毎週交換した。ペニシリン及びストレプトマイシンは、汚染が起こった後に試験管内の細胞培養液中のバクテリアの増殖を防止することを助ける。表12 組織培養中の細胞の分離のためのトリプシン-EDTA溶液濾過滅菌し、10mlのチューブにアリコートにし、次いで-20℃で凍結した。トリプシンは、組織培養中に細胞の通過のために細胞凝集塊を単一細胞懸濁液に分離する酵素プロテアーゼである。凍結溶液を解凍し、使用前に37℃まで温める。表13 試験管内のSTO細胞の維持及び増殖のためのSTO繊維芽細胞培地濾過滅菌し、４℃で貯蔵し、２週間以内に使用した。STO細胞と共に使用する前に37℃に温めた。この培地は組織培養中の形質転換繊維芽細胞系STOの増殖及び維持を可能にする。表14 試験管内のマウスES細胞の単離及び維持のためのマウスES細胞培地濾過滅菌し、４℃で貯蔵し、２週間以内に使用した。ES細胞と共に使用する前に37℃に温めた。この培地は、有糸分裂抑制された胚繊維芽細胞との同時培養の時にマウス胚盤胞からの胎児細胞系の単離及び増殖を可能にする。表15 組織培地への添加のためのヌクレオシド原液濾過滅菌し、アリコートにし、４℃で貯蔵し、そして培地への添加前に再度溶解する。迅速に成長する細胞培養物の培地へのヌクレオシドの添加は細胞増殖を助ける。表16 胚細胞の低温保存（凍結）培地濾過滅菌し、1.0mlの凍結バイアルに0.5mlのアリコートにし、-20℃で貯蔵した。0.5mlの細胞懸濁液の添加の前に解凍し、-70℃に徐々に冷却し、次いで-196 ℃で凍結した。低温保存溶液は細胞中の氷結晶の形成を防止し、こうして高い細胞生存度を可能にする。表17 改良ホワイテン培地** MWは112.1無水であり、3.7mlの60％のシロップ/l=39.6mOsm (3.7ml/112.1=0.033x.6=0.0198Osm=19.8mOsm) 分化に関するアッセイ 11．多能性ブタ胚幹細胞中の分化の目安としての免疫蛍光：物質幾つかの胎児ブタを試験するためのES細胞系 PBS+0.1％のBSA ８チャンバー組織-Tekスライド 0.1Mのソレンセンリン酸緩衝液中３％のパラホルムアルデヒド一次抗体モノクローナル抗サイトケラチン-ICN モノクローナル抗GFAP-ICN モノクローナル抗神経フィラメント68-ICN モノクローナル抗神経フィラメント170-ICN モノクローナル抗神経フィラメント200-ICN モノクローナル抗デスメン-ICN モノクローナル抗ビメンチン-ICN 二次抗体 FITC-ICN 37°保湿インキュベーター L.R.ホワイト包埋剤陽性対照 1）幾つかの胎児ブタから脳、心臓、腸、及び骨格筋を除去し、１mmの切片に切断し、ガラスバイアルに入れる。 2）ソレンセン緩衝液中で３回洗浄する。最終緩衝液洗浄液を除去し、バイアルを３％のパラホルムアルデヒドで充満する。最低１時間で固定する。 3）固定剤を除去し、緩衝液で夫々５分間で３回洗浄して過剰の固定剤を除去する。 4）一連のエタノール交換、10％、25％、50％そして70％エタノール中で３回脱水する。夫々の交換10分間。 5）３回目の70％エタノール交換後に、エタノールの1/2を除去し、等容積のL.R. ホワイト包埋剤と交換する。 6）バイアルを低速のロータリーミキサーに一夜入れる。 7）翌日、ホワイト／エタノール混合物の1/2を除去し、等容積のL.R.ホワイトを添加する。１時間セットする。１回繰り返す。 8）バイアルを数枚の厚さのキム・ワイプ(kim wipes)の上で倒立させ、軽くたたいて全ての切片を除去する。 9）夫々のビームカプセルの先端にL.R.ホワイトの液滴を入れ、そして木質アプリケータースティックを使用して、切片を取り上げ、夫々のカプセルの中央に入れる。１切片／カプセル。 10）カプセルにL.R.ホワイトを入れ、気泡を生じないように注意する。 11）全てのカプセルを調製した後、56°のオーブンに入れてL.R.ホワイトを重合する。オーブン中に一夜放置する。 12）翌日、カプセルを試験して、重合が起こったかどうかを見る。重合が起こった場合、ブロックをカプセルから除去し、切取り、切片にする。重合が起こらなかった場合、オーブン中に24時間放置する。 13）切片を非蛍光スライドの上に置き、PAPペンを使用して切片のまわりに円を描く。 14）夫々の切片の上に一次抗体溶液20μlを落とす。インキュベーターに30分間入れる。 15）一次抗体を除去し、PBSで３回洗浄する。自己蛍光につきチェックする。 16）夫々の切片の上に二次抗体溶液20μlを落とす。インキュベーターに30分間入れる。 17）二次抗体を除去し、PBSで３回洗浄する。乾燥させ、目視し、次いで結果を記録する。免疫蛍光のための細胞の調製 1）細胞が80〜90％の集密である時に継代培養し、細胞懸濁液の正規希釈液をつくる。 2）1mlのピペットを使用して、細胞懸濁液0.3mlを組織-Tekスライド中の８チャンバーの夫々に移す。下記の夫々のためにチャンバーをつくる。 a.夫々の抗体 b.ブランク−自己蛍光につきチェックする。 c.FITCのみ 3）所望の数のスライドを調製した後、インキュベーターに入れ、単層が集密になるまで、または所望の細胞が明らかになるまで培養する。（培養が２日を越える場合、培地を交換する）。 4）細胞が用意される時、培地を除去し、単層をPBS+.1％BSAで洗浄する。 5）最終緩衝液洗浄液を除去し、チャンバーを３％のパラホルムアルデヒドで充満する。最低１時間固定するが、抗体を添加するのに供するまで放置できる。一次抗体 1）固定剤を除去し、0.1％のBSA緩衝液で10分間で３回洗浄する。（最後の緩衝液を１時間洗浄したまま残す）。 2）必要とされる一次抗体の容積を計算する。夫々のチャンバーは50μlを必要とするであろう。次いでこの容積を使用して1:50希釈液を調製する。（夫々の抗体 500μlを必要とする場合、10μlの抗体を490μlの0.1％のBSA緩衝液で希釈する）。 3）最終緩衝液洗浄液を除去し、抗体50μlを夫々のチャンバーに添加する。インキュベーターに30分間入れる。 4）インキュベーション後、チャンバーを緩衝液で充満し、10分間セットする。 5）必要とされるFITCの容積を計算し、1:200の希釈液を調製する。 6）抗体及び緩衝液を除去し、0.1％のBSA緩衝液で３回洗浄する。 7）ブランクを調製していない場合、この時点で自己蛍光につきチェックすることができる。 8）FITC50μlを夫々のチャンバーに添加し、30分間インキュベートする。 9）インキュベーション後、チャンバーを0.1％のBSA緩衝液で充満し、10分間セットする。 10）FITC及び緩衝液を除去し、緩衝液で３回洗浄する。最終の洗浄後に、スライドを倒立させ、乾燥させる。 11）乾燥した時、チャンバー及びガスケットを除去し、次いで蛍光につき観察し、結果を記録する。 12．アルカリ性ホスファターゼ染色(Talbotら，1993)：試薬 PBS 中４％のホルムアルデヒド 37％のホルムアルデヒ自ド10.8ml PBS89.2ml ファストレッドTR塩（シグマF-8764） 1mg/mlのdd H₂O dd H₂O 50ml中.05g pHをNaOHで8.4に調節ナフトールAS-MXホスフェート（感光性）（シグマN-5000）原液:100mg/ml(.1g/dd H₂O１ml) 必要とされるファストレッドTR塩溶液１ml当たり40μlのナフトールAS-MXホスフェート原液を混合する。対照陽性：ES-D3細胞陰性：STO細胞操作 1）細胞から培地を流出させる。 2）PBSで１回洗浄する。 3）４％のホルムアルデヒドで15分間固定する。 4）dd H₂Oで洗浄する。 5）ウェル当たり250μlの夫々の試薬をピペットで入れ、暗所で15分間インキュベートする。 6）H₂Oで洗浄し、H₂OまたはPBS中で貯蔵する。 13．遺伝子操作による家畜の改良：遺伝子操作は家畜を改良するのに重要な利点を有する（Ebertら，1991）。動物の疾患耐性の遺伝子マッピングは発展している技術である。マーカー補助選択(MAS)及びトランスジェニック動物技術が、この試みに使用される方法の一部である(Lewinら，1991)。マーカー補助選択及び遺伝子移入に加えて、或る場合には、直接選択が遺伝子操作により操作し得る単一遺伝子をおそらく同定し、単離する。単離される重要な遺伝子がES細胞によりトランスジェニック動物に移入し得る。単離される重要な遺伝子がES細胞によりトランスジェニック動物に移入し得る。成長の如き量的形質に影響する重要な遺伝子(ホルモンに加えて、成長因子及びそれらのレセプター)(Schook及びClamp，1993;Karg，1989)及び枝肉成長速度に影響するブタHAL遺伝子が、おそらく好適な重要な遺伝子の候補である。泌乳は、ホルモンの外部投与(Kargら，1989)ではなくホルモンの遺伝子変性による改良の主要な標的である。 DNA技術はヤギの乳タンパク質品質に寄与することが示されていた(Martinら， 1993)。これらの著者らは遺伝子移入のビヒクルとしての“大きな家畜動物からの胚胎由来幹細胞”の欠如を残念に思っている(95頁)。本発明が或る特定の実施態様に関して説明されたが、本発明の精神から逸脱しないで、多くの改良及び変化が当業者によりなし得ることが理解されるであろう。それ故、本発明の真の精神及び範囲内にある全てのこのような改良及び変化を包含することが、請求の範囲により意図されている。引用文献以下に引用される刊行物は、それらがここに使用される方法、技術、及び／または組成物の背景を補充、説明、提供し、またはそれらを教示する程度で参考として本明細書に含まれる。 Bazer F.W.，Geisert，R.D.，Zavy，M.T.，1987.受精、分割及び移植家畜における生殖、第５編、Hafez,E.S.E.編集、Lea ＆Febiger、フィラデルフィア、PA Bearden，J.H．及びJ.W．Fuquay，1980.妊娠応用動物生殖、レストン印刷会社、レストンVA85-98頁 Bradley，A.，Evans，M.，Kaufman，M.H.，Robertson，E.，1984．胚胎由来奇形癌腫細胞系からの生殖細胞系キメラの形成Nature(ロンドン)，309:255-256 Brinsterら，1989．マウス卵子に微量注射されたDNAによる主要組織適合性クラスII Eα遺伝子の標的修正 Proc Natl Acad Sci，86:7087-7091 Capecchi，Mario R.，1989．新しいマウス遺伝学：遺伝子ターゲッティングによるゲノムの変性 Trends in Genetics，5(3):70-76 Clarkら，1989．トランスジェニックヒツジの乳中のヒト抗血友病性因子IXの発現Biotechnology，7巻:487-492 Cruz，Y.P.及びPedersen，R.A.，1991．哺乳類胚胎中の胚細胞系列及び胚外細胞系列の起源哺乳類開発における研究の動物応用 Pedersen，R.A.，McLaren, A.M First，N.L．編集，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、プレインビュー、ニューヨーク Doetschmanら，1988．ハムスター胚盤胞由来胚幹(ES)細胞の樹立 Dev.Biol., 127:224-227 Ebert，K.M．ら，1991．遺伝子操作による家畜の変化現行のコミュニケーション４細胞及び分子生物学、哺乳類開発における研究の動物応用 Pedersenら編集、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、233-266 Evans，1990．WO90/03432 Evans，M.J．及びKaufman，M.H．1981．マウス胚胎からの多能性細胞の培養の確立Nature，292:154-156 Flake，A.W．ら，1986．子宮中の胎児造血幹細胞の移植：造血キメラの形成 Science，233巻 Frohman及びMartin，1989．切断、ペースト、及び救済：マウスにおける特定の遺伝子を変性することの新しいアプローチ Cell，56:145-147 Gossler，A.，Doetschman，T.，Korn，R.，Serfling，E.，Kemler R．1986.胚盤胞由来胚幹細胞系によるトランスゲネシス Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83: 9065-9069 Handyside，A.，Hooper，M.L.，Kaufman，M.H.,Wilmut，I.，1987．ヒツジからの胎児幹細胞系の単離について Roux's Arch．Dev．Biol.，196，185-190 Hastyら，1991．胚幹細胞中の遺伝子ターゲッティングに必要とされる相同性の長さ Molecular and Cellular Biology，11(11):5586-5591 Hooper，M.C.，1987．奇形癌腫及び胚幹細胞：実用的アプローチ Robertson E. J.編集IRLプレス社、オクスフォード、英国、51-70 Jasin及びBerg，1988．標的遺伝子選択を用いない哺乳類細胞中の相同的組込み Genes ＆Development，2:1353-1363 Jeannotteら，1991．Hox1.3遺伝子発現の低レベルは標的遺伝子分断を生じるための無プロモーターベクターの使用を除外しない Molecular and Cellular Bi- ology，11(11):5578-5585 Karg，H.，1989．増殖の操作家畜生産のためのバイオテクノロジー、プレナムプレス、ニューヨーク及びロンドン 18:159-180 Karg，H.ら，1989．泌乳の操作家畜生産のためのバイオテクノロジー、プレナムプレス、ニューヨーク及びロンドン 19:181-206 Lewin，H.A．ら，1991．動物の感染性疾患に対する耐性のための遺伝子のマッピング遺伝子マッピング技術及び応用、マルセル・デッカー社、13:283-304 Mansourら，1988．マウス胚胎由来幹細胞中のプロトオンコジーンint-2の分断: 非選択性遺伝子に突然変異をターゲッティングするための一般的な戦略Nature, 336:348-352 Martin，G.，1981．奇形癌腫幹細胞により馴化された培地中で培養された初期マウス胚胎からの多能性細胞系の単離、PNAS78:7634-7638 Martin，P.ら，1993．遺伝子技術による乳タンパク質品質の改良、Livestock P- roduction Science35:95-115 Morgenstern及びLand，1990．Nucleic Acids Res．18:3587-3596 Mortensenら，1992．単一ターゲッティング構築物とのホモ接合性変異体ES細胞の生産 Molecular and Cellular Biology，12(5):2391-2395 Notarianniら，1990．ブタ胚盤胞からの多能性胚細胞系の培養中の維持及び分化 J．Reprod．Fert．Suppl.，41，51-56 Papaioannou，V.E.，Evans，E.P.，Gardner，R.L.,及びGraham，C.F.，1979. 胎児癌細胞系(C145b)の増殖及び分化J．Embroyl．exp．Morph.，54，277-295 Phillips，R.W.＆Tumbleson，M.E.，1986．モデル生医学研究におけるブタ Tumbleson，M.E．編集、１巻（プレナムプレス、ニューヨーク）、437-440 Piedrahita，J.A.，Anderson，G.B.，BonDurrant，R.H．l990a．ブタ胚胎由来細胞系の単離の効率に関するフィーダ層の影響 Therio.，34:865-877 Piedrahita，J.A.，Anderson，G.B.，BonDurrant，R.H．1990b．マウス、ブタ及びヒツジの胚胎の挙動の比較 Therio.，34:879-901 Polge，C.，1982.胚胎移植及び保存 Cole，D.J.A.，Foxcroft，GTR編集、ブタ増殖の調節、ロンドン：バターワースサイエンティフィック；1982:277-291 Robertson，E.J.，1987.奇形癌腫中の胚胎由来幹細胞系及び胚幹細胞：実用的アプローチ Robertson編集、IRLプレス社、オクスフォード、英国、71-112 Robertson，E.J.，1987.マウス生殖細胞系への経路としての多能性幹細胞系 Trends Genet.，2:9-13 Rossant，J．及びMcBurney，M.W.，1982．胚盤胞注射後の正倍数体雄奇形癌腫細胞系の発生の可能性J.Embroy．exp．Morph.，70，99-112 Rossant，J．及びPapaioannou，V.E.，1984.胚胎児癌と胚胎由来幹細胞の関係 Cell Differentiation，15，155-161 Rudnicki,M.A.及びMcBurney,M.W.，1987.奇形癌腫及び胚幹細胞：実用的アプローチ、胎児癌細胞系における分化の方法及び誘導 Robertson編集、IRLプレス社、オクスフォード、英国、19-49 Schook，L.B.ら，1993．成長及び発育の遺伝子マッピング、ブタの生殖、Hollis 編集、CABインターナショナル、ワリングフォード、英国、4:75-92 Smith，A.G．及びM.L.Hooper，1987.バッファロー・ラット・リバー細胞がマウス胎児癌及び胚幹細胞の分化を抑制する拡散活性を生じるDev．Biol.，121:9 Stevens，L.C.，1970.前移植及び後移植マウス胚胎の睾丸内移植片からの移植性奇形癌腫の発生Dev．Biol.，21，364-382 Strojek，R.M．ら，1990．ブタ胚盤胞からの形態上未分化の胚幹細胞の培養方法 Herrogenology，33:901-913 Talbot，N.C.，C.E．Rexroad，Jr.，V.G．Pursel，＆A.M．Powell，1993.培養中のブタ及びヒツジの外胚葉細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色Molecular Re- production and Development，36:139-147 Tholllas，K.R.，Capecchi，M.R.，1987．マウス胚胎由来幹細胞における遺伝子ターゲッティングによる部位誘導突然変異誘発Cell，51(3):503-512 Thomasら，1992．配列置換ベクターを使用することによる胚幹細胞における高適合度の遺伝子ターゲッティングMolecular and Cellular Biology，12(7):2919- 2923 Wall，R.J.，Pursel，V.G.，Shamay，A.，McKnight，R.A.，Pittius，C.W．及び Henninhausen，L.，1991．トランスジェニックブタの乳腺中の異種乳タンパク質の高レベルの合成Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，1696-1700 Ware，C.B.ら，1988．家畜からの胚幹細胞系の発育Biology of Reproduction,補遺,38巻 Webel，S.K.，Peters，J.B．Anderson，L.L.，1970．ブタにおける胚胎の同調移入及び非同調移入J．Animal Science，30:565-568 Yatesら，1985．Nature，313:811-815

Claims

【特許請求の範囲】 1.(a)第一遺伝子補体を有する有蹄類胚幹細胞をその胚幹細胞と同じ種のレシピエント胚胎（前記レシピエントは第二遺伝子補体を有する）に導入してキメラ有蹄類胚胎を形成し、そして (b)キメラ有蹄類胚胎を発育の完結に適した環境に置いてキメラ有蹄類を形成することを特徴とするキメラ有蹄類の生産方法。 2．有蹄類胚幹細胞が多能性である請求の範囲第１項に記載の方法。 3．有蹄類胚幹細胞が全能性である請求の範囲第２項に記載の方法。 4．胚幹細胞を前移植段階の胚胎に導入する請求の範囲第１項に記載の方法。 5．前移植段階が胚盤胞段階である請求の範囲第４項に記載の方法。 6．胚幹細胞が有蹄類の第一品種に由来し、かつレシピエント胚胎が第一品種と同じ種の第二品種に由来する請求の範囲第１項に記載の方法。 7．第一品種及び第二品種がブタである請求の範囲第６項に記載の方法。 8．ブタの第一品種がマイシャン品種であり、かつ第二品種がデュロック品種である請求の範囲第７項に記載の方法。 9．第一遺伝子補体が第二遺伝子補体とは異なる請求の範囲第１項に記載の方法。 10．第一遺伝子補体が胚幹細胞の遺伝子補体に安定に組込まれた外在性ヌクレオチド配列を含む請求の範囲第９項に記載の方法。 11．第一遺伝子補体がキメラ有蹄類からヒト因子IXを回収可能な形態で与えるように発現され得るヌクレオチド配列を含む請求の範囲第10項に記載の方法。 12．第一遺伝子補体が、ヒト血液タンパク質、ヒトホルモン、ヒト成長因子、ヒトサイトカイン、ヒト酵素、ヒトホルモンレセプター、ヒト結合タンパク質、抗原、翻訳因子、転写因子、オンコプロテイン、プロトオンコプロテイン、ヒト乳タンパク質、及びヒト筋肉タンパク質からなる群から選ばれたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む請求の範囲第10項に記載の方法。 13．第一遺伝子補体が、ブタ枝肉組成、ブタ枝肉重量、ブタ疾患耐性及びブタ乳生産を改良する群から選ばれたタンパク質をコードするブタヌクレオチド配列を含む請求の範囲第10項に記載の方法。 14．請求の範囲第１項〜第13項のいずれか一項に記載の方法により生産されたキメラ有蹄類。 15．胚幹細胞培養物の単離、精製方法であって、前記方法が、 (a)有蹄類胚胎から分離された細胞をフィーダ層の不在下で幹細胞ならし培地中で培養することにより第一培養物を調製し、そして (b)胚幹細胞培養物に特徴的な形態上の特徴及び成長パラメーターを有する第二の安定な培養物が樹立されるまで第一培養物を継代培養することを含むことを特徴とする胚幹細胞培養物の単離、精製方法。 16．有蹄類胚胎から分離された細胞を、フィーダ層の上で幹細胞培地(SCM)中で試験管内で発育された有蹄類胚胎から得る請求の範囲第15項に記載の方法。 17．幹細胞培地がバッファロー・ラット・リバー細胞により馴化され、かつ成長因子、ビタミン、アミノ酸及び抗生物質を含む請求の範囲第15項に記載の方法。 18．幹細胞ならし培地(CSCM)が約40％の幹細胞培地(SCM)と約60％のバッファロー・ラット・リバー細胞ならし培地(BRL/CM)とを含む請求の範囲第17項に記載の方法。 19．培養物から単離された細胞の形態上の特徴が、光学顕微鏡で観察して円形の形状、約8〜15ミクロンの直径、及び細胞質と核の直径の比約10-25:75-90を含み、かつ培養中の細胞の成長パラメーターが約18〜36時間の倍加時間及び単層成長ではなく多層成長を含む請求の範囲第15項に記載の方法。 20．宿主マウスに導入された時に奇形腫または奇形癌腫を形成できる細胞少なくとも50％を含む胚幹細胞培養物を生産することと更に特定される請求の範囲第15 項に記載の方法。 21．非悪性培養物が胚幹細胞を含むか否かを試験する方法であって、前記方法が、 (a)請求の範囲第15項に従ってつくられた培養物からの細胞を免疫不全哺乳類に導入し、 (b)腫瘍が細胞から免疫不全哺乳類中に形成されるか否かを測定し、そして形成される場合に、 (c)培養物が胚幹細胞を含むと推定することを特徴とする試験方法。 22．免疫不全哺乳類がSCIDマウスである請求の範囲第21項に記載の方法。 23．胚胎がマイシャン系統のブタから得られる請求の範囲第15項に記載の方法。 24．請求の範囲第15項に従ってつくられた培養物から単離された胚有蹄類幹細胞。 25．トランスジェニック有蹄類の生産方法であって、前記方法が請求の範囲第24 項に記載の細胞からの核を胚胎が発育する有蹄類レシピエント細胞に移入することを特徴とするトランスジェニック有蹄類の生産方法。 26．レシピエント細胞が除核された有蹄類卵子である請求の範囲第25項に記載の方法。 27．レシピエント細胞が除核された有蹄類胚細胞である請求の範囲第25項に記載の方法。 28．全能性である請求の範囲第24項に記載の単離された有蹄類細胞。 29．請求の範囲第24項に記載の幹細胞から開始される培養。 30．請求の範囲第29項に記載の培養物を継代培養することにより誘導された安定な細胞系。 31．幹細胞の有蹄類起源の補体を含む遺伝子補体と、前記補体に安定に組込まれた外在性ヌクレオチド配列とを有する請求の範囲第24項に記載の胚有蹄類幹細胞。 32．外在性ヌクレオチド配列が選択可能なマーカーをコードする請求の範囲第31 項に記載の胚有蹄類幹細胞。 33．選択可能なマーカーがハイグロマイシン(Hph)、ピューロマイシン(Pac)、ne o、ada及びdHFRを含む請求の範囲第32項に記載の胚細胞。 34．請求の範囲第14項に記載のキメラ有蹄類に由来するトランスジェニック有蹄類。 35．組織が異種移植片として使用し得る有蹄類の生産方法であって、前記方法が、 (a)請求の範囲第24項に記載の胚有蹄類幹細胞からの遺伝子補体を宿主有蹄類胚細胞にとり込んで、キメラ有蹄類を形成し（前記遺伝子補体はキメラ有蹄類からの組織を異種移植片のレシピエントと組織適合性にする）、そして (b)キメラ有蹄類を飼育して異種移植用の組織を含む子孫有蹄類を形成することを特徴とする有蹄類の生産方法。 36．子孫有蹄類がトランスジェニック有蹄類である請求の範囲第35項に記載の方法。 37．請求の範囲第34項に記載のトランスジェニック有蹄類を使用して外在性タンパク質を生産する方法であって（前記トランスジェニック有蹄類は前記外在性タンパク質を与えることができるヌクレオチド配列を含む遺伝子補体を有する）、前記方法が、前記有蹄類を、ヌクレオチド配列が活性化されて有蹄類体液または組織中に前記外在性タンパク質を回収可能な形態で与える条件に暴露し、そして前記タンパク質を前記体液または組織から回収することを特徴とするトランスジェニック有蹄類の使用方法。 38．体液が雌有蹄類から分泌された乳である請求の範囲第37項に記載の方法。 39．外在性タンパク質が、TNFα、ヒト成長因子、ヒトペプチドホルモン、有蹄類成長因子、及び有蹄類乳タンパク質からなる群から選ばれる請求の範囲第37項に記載の方法。 40．成長因子がEGFである請求の範囲第39項に記載の方法。 41．遺伝子補体が発現される細胞型の測定方法であって、前記方法が、 (a)遺伝子補体を含む有蹄類胚幹細胞を免疫悪化哺乳類に導入して腫瘍を生じ、 (b)その腫瘍を適当な条件下に置いて腫瘍を複数の認識可能な細胞型に分化させ、その遺伝子補体を発現させ、そして (c)分化された細胞型を分析して、どの細胞型中で遺伝子補体が発現されるのかを測定することを特徴とする細胞型の測定方法。 42．トランスジーンを発現する腫瘍細胞であって、前記腫瘍細胞が免疫不全哺乳類に導入された有蹄類胚幹細胞に由来することを特徴とする腫瘍細胞。 43．有蹄類から単離された胚幹細胞。 44．細胞が全能性である請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 45．分化細胞中にのみ存在する構造タンパク質の存在下で分析された時に陰性である請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 46．構造タンパク質がサイトケラチン18またはビメンチンである請求の範囲第45 項に記載の胚幹細胞。 47．分化細胞中にのみ存在する抗原の存在下で分析された時に陰性である請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 48．抗原が神経フィラメント、グリア繊維状酸性タンパク質、ケラチンまたはデスミンである請求の範囲第47項に記載の胚幹細胞。 49．神経フィラメントが68kd、160kdまたは200kdの分子量を有するタンパク質である請求の範囲第48項に記載の胚幹細胞。 50．光学顕微鏡で観察して円形の形状、約8〜15ミクロンの直径、及び細胞質と核の直径比約10-25:75-90を有する請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 51．安定な培養中に、固体表面上の多層成長及び約18〜36時間の倍加時間を示す請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 52．細胞が免疫不全宿主動物に導入された時に奇形腫または奇形癌腫を形成できる請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 53．細胞の起源がマイシャン、デュロック及びヨークシャーからなる群から選ばれたブタ系統の胚胎である請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 54．細胞がレシピエント胚胎に導入される時に、前記細胞がキメラブタを生産できる請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 55．レシピエント胚胎がマイシャン、デュロック及びヨークシャーからなる群から選ばれたブタ系統に由来する請求の範囲第54項に記載の胚幹細胞。 56．前記細胞が幹細胞の胚胎起源の有蹄類の補体を含む遺伝子補体と、前記補体に安定に組込まれた外在性ヌクレオチド配列とを有する請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞。 57．外在性ヌクレオチド配列が、遺伝子補体中に胚幹細胞の補体を含む宿主有蹄類からタンパク質を回収可能な形態で与えるように発現され得る請求の範囲第56 項に記載の胚幹細胞。 58．外在性ヌクレオチド配列が、血液タンパク質、ホルモン、成長因子、免疫系調節因子、サイトカイン、酵素、ホルモンレセプター、結合タンパク質、抗原、翻訳因子、転写因子、オンコプロテイン、プロトオンコプロテイン、乳タンパク質及び筋肉タンパク質からなる群から選ばれたタンパク質をコードする請求の範囲第56項に記載の胚幹細胞。 59．ヌクレオチド配列がヒトタンパク質をコードする請求の範囲第58項に記載の胚幹細胞。 60．請求の範囲第43項に記載の胚幹細胞から開始された細胞系。 61．胚幹細胞の培養物から開始された安定な細胞系。 62．クローンである請求の範囲第61項に記載の細胞系。 63．固体表面で培養された時に単層ではなく多層で成長し、かつ約18〜36時間の倍加時間を有する請求の範囲第61項に記載の細胞系。 64．細胞系から単離された細胞が光学顕微鏡で観察して円形の形状、約8〜15ミクロンの直径、及び細胞質と核の直径比約10-25:75-90を有する請求の範囲第61 項に記載の細胞系。 65．分化細胞中にのみ存在する構造タンパク質の存在下で分析された時に陰性である請求の範囲第61項に記載の細胞系。 66．構造タンパク質がサイトケラチン18またはビメンチンである請求の範囲第65 項に記載の細胞系。 67．分化細胞中にのみ存在する抗原の存在下で分析された時に陰性である請求の範囲第61項に記載の細胞系。 68．抗原が神経フィラメント、グリア繊維状酸性タンパク質、ケラチンまたはデスミンである請求の範囲第67項に記載の細胞系。 69．神経フィラメントが68kd、160kdまたは200kdの分子量を有するタンパク質である請求の範囲第68項に記載の細胞系。 70．D195と称される請求の範囲第60項に記載の細胞系。 71．請求の範囲第43項に記載の細胞を含む胚胎。 72．請求の範囲第71項に記載の胚胎に由来するブタ胚胎のクローン。 73．ブタ胚幹細胞に由来する細胞を含むキメラブタ胚胎。 74．胚幹細胞と同じ種からのレシピエント細胞への単離された胚幹細胞の核の移入を含む方法により生産された有蹄類の胚胎。 75．レシピエント細胞が除核された胚細胞である請求の範囲第74項に記載の胚胎。 76．レシピエント細胞が除核された卵子である請求の範囲第74項に記載の胚胎。 77．請求の範囲第74項に記載の胚胎からクローン化された胚胎。 78．その遺伝子補体に安定に組込まれた外在性ヌクレオチド配列を含む請求の範囲第71項または第74項に記載の胚胎。 79．有蹄類からの胚幹細胞の単離された核。 80．請求の範囲第14項に記載のキメラ有蹄類の子孫。