JP6450674B2 - ヒト胚性幹細胞の膵臓の内胚葉への分化 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年5月7日に出願された、米国特許仮出願シリアル番号61/643,684号の利益を主張するものであり、当該出願を参照により本明細書にその全容において、かつあらゆる目的について援用するものである。
本発明は、細胞分化の分野にある。より具体的には、本発明は、膵臓の内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞及び膵臓の内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞のその後の有効な生成に有用な、ヒト多能性細胞及び/又は胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の播種密度の範囲を提供する。
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉(内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)から様々な細胞系統の機能性細胞へとインビトロで分化する能力を特徴とする。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に(全てではないとしても)ほとんどの組織に寄与する。
多能性幹細胞は、段階特異的胚抗原(SSEA)3及び4、並びにTra−1−60及びTra−1−81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現する(Thomsonら、1998,Science 282:1145〜1147)。インビトロでの多能性細胞の分化は、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1−81の発現の消失をもたらす。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者(カリフォルニア州Vector Laboratories)により説明されているように、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてVector Redを使用して発色させることにより検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、RT−PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必ずしもではないが、通常は妊娠約10〜12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば、胚盤胞など)、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞(hESCs)又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株H1、H7、及びH9(米国ウィスコンシン州MadisonのWiCell Research Institute)などである。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。また、OCT4、NANOG、Sox2、KLF4、及びZFP42など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞(IPS)又は再プログラム化された多能性細胞も好適である(Annu Rev Genomics Hum Genet,2011,12:165〜185)。本発明の方法で使用されるヒト胚性幹細胞もまた、Thomsonら(米国特許第5,843,780号;Science,1998,282:1145〜1147;Curr Top Dev Biol 1998,38:133〜165;Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995,92:7844〜7848)によって記載されるように調製することができる。
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、即ち、ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra 1−60、Tra 1−81の1つ以上の発現が挙げられる。
胚性幹細胞の播種密度は、胚体内胚葉マーカーの発現に大きく影響しない
この実施例は、ES細胞の初期播種密度が胚体内胚葉系統の細胞の生成に大きく影響を与えるかどうかを理解するために行った。
ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):ステージ1の培地(2%の無脂肪酸BSA(カタログ番号68700、米国アイオワ州のAnkenyのProliant)、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム(カタログ番号S3187、SigmaAldrich)、1X GlutaMax(商標)(カタログ番号35050−079、Invitrogen)、2.5mMのD−グルコース(カタログ番号G8769、SigmaAldrich)、1:50000XITS−X(Invitrogen)、100ng/mLのGDF8(米国ミネソタ州のMinneapolisのR&D Systems)及び2.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤、14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オン、米国特許出願公開第2010−0015711号、参照によりその全容が本明細書に援用される)を追捕したMCDB−131培地(カタログ番号10372−019、Invitrogen(米国カリフォルニア州のCarlsbad))において、細胞を1日培養した。次いで、2%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び1:50000X TS−Xを追補したMCDB−131培地で細胞を更に3日培養した。
胚性幹細胞の播種密度は、膵臓内胚葉及び膵臓内分泌腺マーカーの発現に大きく影響を及ぼす
この実施例は、ESの初期播種密度が、膵臓の内胚葉/内分泌腺培養物の生成に大きく影響を及ぼすかどうかを理解するために行った。
a)ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):ステージ1の培地(2%の無脂肪酸BSA(Proliant、カタログ番号68700)、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム(SigmaAldrich、カタログ番号S3187)、1X GlutaMax(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050−079)、2.5mMのD−グルコース(SigmaAldrich、カタログ番号G8769)、1:50000X TS−X(Invitrogen)、100ng/mLのGDF8(R&D Systems)及び2.5μMのMCX化合物を追捕したMCDB−131培地(Invitrogen、カタログ番号10372−019)において、細胞を1日培養した。次いで、2%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び1:50000XITS−Xを追補したMCDB−131倍地で細胞を更に3日培養した。
b)ステージ2(原腸管−2日):細胞を、1:50000X ITS−X、0.1%ALBUMAX BSA(Invitrogen)、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、及び50ng/mLを追補したMCDB−131培地で2日間処理し、次いで
c)ステージ3(前腸−3日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、20mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、0.1%のALUBUMAX BSA、0.25μMのSANT−1、20ng/mLのアクチビン−A、2μMのRA、50ng/mLのFGF7、及び200nMのLDN(BMP受容体阻害剤、カタログ番号04−0019、Stemgent、カリフォルニア州)を追補したMCDB131培地で処理した。
d)ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、20mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、00015g/mLの重炭酸ナトリウム、0.1%のALBUMAX BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのTPB(PKC活性化剤、カタログ番号565740、EMD Chemicals、ニュージャージー州のGibstown)、200nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤(SD−208、Molecular Pharmacology、2007、72:152−161に開示されている)、及び100nMのCYP26A阻害剤(N−{4−[2−エチル−1−(1H−1、2、4−トリアゾル−1−イル)ブチル]フェニル}−1、3−ベンゾチアゾール−2−アミン、ベルギー、Janssen)を追補したMCDB131培地で3日間処理した。
e)ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌腺−3日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、20mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、0.1%のALBUMAX BSA、200nMのLDN−193189、100nMのCYP26A阻害剤、及び2μMのALk5阻害剤を追補したMCDB131培地で3日間処理した。
分化されたヒト胚性幹細胞系H1の細胞中の以下の遺伝子、即ち、ZIC1(図6A)、
CDX2(図6B)、PDX−1(図6C)、NKX6.1(図6D)、NKX2.2(
図6E)、NGN3(図6F)、NEUROD(図6G)、インスリン(図6H)HNF
4a(図6I)、及びPTF1a(図6J)の発現のリアルタイムPCR分析からのデー
タを示す。実施例1で観察された影響とは異なり、初期播種密度は、膵臓の内胚葉/内分
泌腺マーカーの発現に劇的に影響を与えた。特に、1〜1.5×105細胞/cm2未満の
初期播種密度による培養物から分化させた細胞は、PDX−1、NKX6.1、NGN3
、NKX2.2、NeuroD、及びインスリンの発現における著しい下降を示したが、
一方内胚葉マーカーZIC1及び後方腸管マーカー、CDX2のアップレギュレーション
を示した。実施例1からのデータに加えてこのデータは、CXCR4及び他のDE関連遺
伝子の高い発現が、膵臓の内胚葉/内分泌腺遺伝子の生成の予測ではないことを明確に強
調する。初期播種密度は、膵臓の内胚葉/内分泌腺細胞の効率を制御する上での重要な変
数であると考えられる。
本出願は、例えば以下の発明を提供する。
[1] 多能性幹細胞を培養する方法であって、前記多能性幹細胞を、約0.8×10 5 細胞/cm 2 〜約3.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で表面上に播種する工程を含む、方法。
[2] 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[1]に記載の方法。
[3] 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[2]に記載の方法。
[4] 前記多能性幹細胞が、Matrigelを含む表面上に播種される、[1に記載の方法。
[5] 多能性幹細胞を分化させる方法であって、前記多能性幹細胞を、約0.8×10 5 細胞/cm 2 〜約3.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で表面上に播種する工程と、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[6] 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[5]に記載の方法。
[7] 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[6]に記載の方法。
[8] 前記多能性幹細胞が播種される前記表面が、Matrigelを含む、[5]に記載
の方法。
[9] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[5]に記載の方法。
[10] 胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、多能性幹細胞を、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程を含む方法であり、前記多能性幹細胞が、約0.8×10 5 細胞/cm 2 〜約3.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で表面上に播種されている、方法。
[11] 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[10]に記載の方法。
[12] 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[11]に記載の方法。
[13] 前記多能性幹細胞が播種される前記表面が、Matrigelを含む、[10]に記載の方法。
[14] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[10]に記載の方法。
[15] 胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞の分化効率を最大化するのに十分な播種密度で、第1の表面上に播種する工程と、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の分化効率を最大化するのに十分な密度で播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[16] 前記多能性幹細胞が、約0.8×10 5 細胞/cm 2 〜約3.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で前記第1の表面上に播種される、[15]に記載の方法。
[17] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が約1.5×10 5 細胞/cm 2 〜約5.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で第2の表面上に播種される、[15]に記載の方法。
[18] 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[15]に記載の方法。
[19] 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[18]に記載の方法。
[20] 前記第1の表面が、Matrigelを含む、[15]に記載の方法。
[21] 前記第2の表面が、Matrigelを含む、[15]に記載の方法。
[22] 前記第1の表面と前記第2の表面が同一表面である、[15]に記載の方法。
[23] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[15]に記載の方法。
[24] 前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[15]に記載の方法。
[25] 胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、多能性幹細胞を胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法であり、前記多能性幹細胞が、約0.8×10 5 細胞/cm 2 〜約3.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で表面上に播種されている、方法。
[26] 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[25]に記載の方法。
[27] 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[26]に記載の方法。
[28] 前記表面が、Matrigelを含む、[25]に記載の方法。
[29] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[25]に記載の方法。
[30] 前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[25]に記載の方法。
[31] 膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、
a)多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、
b)前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c)前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[32] 前記多能性幹細胞が、約0.8×10 5 細胞/cm 2 〜約3.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で表面上に播種される、[31]に記載の方法。
[33] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約1.5×10 5 細胞/cm 2 〜約5.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で播種する工程を更に含む、[31]に記載の方法。
[34] 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[31]に記載の方法。
[35] 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[34]に記載の方法。
[36] 前記表面が、Matrigelを含む、[31]に記載の方法。
[37] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[31]に記載の方法。
[38] 前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[31]に記載の方法。
[39] 膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、
a)多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、
b)前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c)前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[40] 前記多能性幹細胞が、約0.8×10 5 細胞/cm 2 〜約3.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で播種される、[39]に記載の方法。
[41] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約1.5×10 5 細胞/cm 2 〜約5.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で播種する工程を更に含む、[39]に記載の方法。
[42] 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[39]に記載の方法。
[43] 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[40]に記載の方法。
[44] 前記表面が、Matrigelを含む、[39]に記載の方法。
[45] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[39]に記載の方法。
[46] 前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[39]に記載の方法。
[47] 胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約1.5×10 5 細胞/cm 2 〜約5.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で表面上に播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[48] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[47]に記載の方法。
[49] 前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[47]に記載の方法。
[50] 胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる方法であって、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約1.5×10 5 細胞/cm 2 〜約5.0×10 5 細胞/cm 2 の播種密度で表面上に播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[51] 前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[50]に記載の方法。
[52] 前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[50]に記載の方法。
[53] ヒト胚性幹細胞と比べる場合、PDX−1、NKX6.1、NGN3、NKX2.2、NeuroD、及びインスリンから選択される少なくとも1つのマーカーの発現において下降を示し、並びにZIC1及びCDX2のアップレギュレーションを示す、ヒト胚性幹細胞からインビトロで分化させた細胞の集団であって、前記ヒト胚性幹細胞が、5×10 5 細胞/cm 2 未満の播種密度で表面上に播種される、細胞の集団。
Claims (24)
- 多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させる方法であって、
a. 前記多能性幹細胞を、0.8×105細胞/cm2〜3.0×105細胞/cm2の播種密度で表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Y27632を追補した既知組成の培地またはY27632を追補した調整培地中で48時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させる工程と
を含み、
前記工程cが、
前記多能性幹細胞をアクチビンおよび血清を追補した培地中で培養する工程、
前記多能性幹細胞を酪酸ナトリウムおよびアクチビンAを追補した培地中で培養する工程、または
前記多能性幹細胞をGDF−8およびMCX化合物を追補した培地中で培養する工程
を含む、方法。 - 多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させる方法であって、
a. 前記多能性幹細胞を、1.5×105細胞/cm2〜3.0×105細胞/cm2の播種密度で表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Y27632を補充した既知組成の培地またはY27632を補充した調整培地中で48時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、GDF8およびMCX化合物を追補した培地中で培養することによって胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含む方法。 - 胚体内胚葉細胞を得る方法であって、
多能性幹細胞を、GDF8および14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オンを追補した培地中で培養することによって胚体内胚葉細胞に分化させる工程
を含み、
前記多能性幹細胞が、1.5×105細胞/cm2より高い密度で表面上に播種されており、Y27632を追補した既知組成の培地またはY27632を追補した調整培地中で分化前の48時間培養されている、方法。 - 胚体内胚葉細胞を分化させる方法であって、
多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含む方法であり、
前記多能性幹細胞が、0.8×105細胞/cm2〜3.0×105細胞/cm2の播種密度で表面上に播種されて、Y27632を追補した既知組成の培地またはY27632を追補した調整培地中で分化前に48時間培養され、ならびに
前記多能性幹細胞を、
GDF−8およびMCX化合物;
GDF−8および14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オン;
アクチビンおよび血清;または
酪酸ナトリウムおよびアクチビンA
を追補した培地中で培養することによって、前記多能性幹細胞が胚体内胚葉細胞へと分化される、方法。 - 胚体内胚葉細胞を分化させる方法であって、
前記胚体内胚葉細胞を1.5×105細胞/cm2〜5.0×105細胞/cm2の播種密度で表面上に播種する工程と、
前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含み、
前記胚体内胚葉細胞が、
GDF8およびMCX化合物;
GDF−8および14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オン;
アクチビンおよび血清;または
酪酸ナトリウムおよびアクチビンA
を追補した培地中で多能性幹細胞を培養することによって取得されたものである、方法。 - 前記膵臓内胚葉細胞を膵臓内分泌細胞に分化させる工程をさらに含む、請求項4または請求項5に記載の方法。
- 膵臓内胚葉細胞を得る方法であって、
a. 多能性幹細胞を、0.8×105細胞/cm2〜3.0×105細胞/cm2の密度で表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Y27632を追補した既知組成の培地またはY27632を追補した調整培地中で48時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、GDF8およびMCX化合物を追補した培地中で培養することによって胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
d. 前記胚体内胚葉細胞を、FGF7を追補した培地中で培養することによって原腸管細胞に分化させる工程と、
e. 前記原腸管細胞を、SANT−1、アクチビン−AおよびLDN−193189を追補した培地中で培養することによって前腸細胞に分化させる工程と、
f. 前記前腸細胞を、SANT−1、TPB、LDN−193189、SD−208およびN−{4−[2−エチル−1−(1H−1、2、4−トリアゾル−1−イル)ブチル]フェニル}−1,3−ベンゾチアゾール−2−アミンを追補した培地中で培養することによって、膵臓前腸前駆細胞に分化させる工程と、
g. 前記膵臓前腸前駆細胞を、LDN−193189、SD−208およびN−{4−[2−エチル−1−(1H−1、2、4−トリアゾル−1−イル)ブチル]フェニル}−1、3−ベンゾチアゾール−2−アミンを追補した培地中で培養することによって膵臓内胚葉細胞に分化させる工程とを含む、方法。 - 前記多能性幹細胞が、1.5×105細胞/cm2〜3.0×105細胞/cm2の播種密度で表面上に播種される、請求項7に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞を、1.5×105細胞/cm2〜5.0×105細胞/cm2の播種密度で播種する工程を更に含む、請求項7に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉細胞を膵臓内分泌腺細胞へと分化させる工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、Matrigel(商標)を含む表面上に播種される、請求項1〜4および7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 胚体内胚葉細胞を分化させる方法であって、
a. 多能性幹細胞を、0.8×105細胞/cm2〜3.0×105細胞/cm2の密度で、第1の表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Y27632を追補した既知組成の培地またはY27632を追補した調整培地中で48時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、GDF8およびMCX化合物を追補した培地中で胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
d. 前記胚体内胚葉細胞を、1.5×105細胞/cm2〜5.0×105細胞/cm2の密度で第2の表面上に播種する工程と、
e. 前記胚体内胚葉細胞を、膵臓内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含む方法。 - 前記MCX化合物が、14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オンである、請求項1、2、4、5、7または12に記載の方法。
- 前記第1の表面がMatrigel(商標)を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記第2の表面がMatrigel(商標)を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記第1および第2の表面が同じ表面である、請求項12に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞が、ヒトのものである、請求項1〜6および12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉細胞が、ヒトのものである、請求項4〜6および12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記既知組成の培地がmTESRである、請求項1〜5、7および12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調整培地がMEF調整培地である、請求項1〜5、7および12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程が、前記胚体内胚葉細胞をFGF−10およびレチノイン酸を用いて培養することを含む、請求項4、5または12に記載の方法。
- 前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程が、前記胚体内胚葉細胞をノギンと共にEGF又はベータセルリンと組み合わせて培養することを含む、請求項4、5または12に記載の方法。
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