JP2015516161A5

JP2015516161A5 -

Info

Publication number: JP2015516161A5
Application number: JP2015511622A
Authority: JP
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2017-11-09
Anticipated expiration: 2033-05-07

Description

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、様々なフィーダー層を用いて、又はマトリックスタンパク質被覆した容器を用いて、容易に培養で増殖させることができる。あるいは、ｍＴｅｓｒ（登録商標）１培地（カナダ、ＶａｎｃｏｕｖｅｒのＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような既知組成の培地と組み合わせた化学的に既知組成の表面を、細胞のルーチン増殖に用いてもよい。多能性細胞は、酵素で、機械的に、又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）など様々なカルシウムキレート剤を用いて、培養プレートから容易に取り出すことができる。あるいは、多能性細胞は、マトリックスタンパク質又はフィーダー層の非存在下で、懸濁液中で増殖させてもよい。

ヒト胚性幹細胞系Ｈ１（ｈＥＳＣＨ１）の細胞を、種々の継代（４０継代〜５２継代）で採取し、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、米国ミズリー州のＳｔ．ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を追補したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダのＶａｎｃｏｕｖｅｒのＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１０μＭのＹ２７６３２を追補したＭＥＦ−ＣＭ（調整培地）のいずれか中に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）をコーティングした皿上で、以下の密度で単一細胞として播種した：０．３×１０⁵細胞／ｃｍ²、０．５×１０⁵細胞／ｃｍ²、０．７５×１０⁵細胞／ｃｍ²、０．９×１０⁵細胞／ｃｍ²、１×１０⁵細胞／ｃｍ²、１．２５×１０⁵細胞／ｃｍ²、１．５×１０⁵細胞／ｃｍ²、１．８×１０⁵細胞／ｃｍ²、及び２×１０⁵細胞／ｃｍ²。播種の４８時間後に、培養物を不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で約３０秒間洗浄し、インキュベートした。培養物を、以下の通りに、胚体内胚葉（ＤＥ）系統に分化させた：
ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−４日）：ステージ１の培地（２％の無脂肪酸ＢＳＡ（カタログ番号６８７００、米国アイオワ州のＡｎｋｅｎｙのＰｒｏｌｉａｎｔ）、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１ＸＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５ｍＭのＤ−グルコース（カタログ番号Ｇ８７６９、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１：５００００ＸＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８（米国ミネソタ州のＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓのＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）及び２．５μＭのＭＣＸ化合物（ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願公開第２０１０−００１５７１１号、参照によりその全容が本明細書に援用される）を追捕したＭＣＤＢ−１３１培地（カタログ番号１０３７２−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州のＣａｒｌｓｂａｄ））において、細胞を１日培養した。次いで、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１ＸＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、２．５ｍＭのＤ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び１：５００００ＸＴＳ−Ｘを追補したＭＣＤＢ−１３１培地で細胞を更に３日培養した。

Claims

多能性幹細胞を培養する方法であって、前記多能性幹細胞を、約０．８×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で表面上に播種する工程を含む、方法。
多能性幹細胞を分化させる方法であって、前記多能性幹細胞を、約０．８×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で表面上に播種する工程と、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、多能性幹細胞を、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程を含む方法であり、前記多能性幹細胞が、約０．８×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で表面上に播種されている、方法。
胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、多能性幹細胞を胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法であり、前記多能性幹細胞が、約０．８×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で表面上に播種されている、方法。
胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を約１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約５．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で表面上に播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる方法であって、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を約１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約５．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で表面上に播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、
ａ）多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、
ｂ）前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ）前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
前記多能性幹細胞が、約０．８×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で表面上に播種される、請求項７に記載の方法。
前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約５．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で播種する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、
ａ）多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、
ｂ）前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ）前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
を含む方法。
前記多能性幹細胞が、約０．８×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で播種される、請求項１０に記載の方法。
前記多能性幹細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される、請求項１〜４および７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞の分化効率を最大化するのに十分な播種密度で、第１の表面上に播種する工程と、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の分化効率を最大化するのに十分な密度で播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
前記多能性幹細胞が、約０．８×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で第１の表面上に播種される、請求項１３に記載の方法。
前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、約１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２〜約５．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の播種密度で第２の表面上に播種される、請求項１３に記載の方法。
前記第１の表面がＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、請求項１３に記載の方法。
前記第２の表面がＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、請求項１３に記載の方法。
前記第１および第２の表面が同じ表面である、請求項１３に記載の方法。
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、請求項４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が胚体内胚葉細胞である、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が膵臓内胚葉細胞である、請求項４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
ヒト胚性幹細胞と比べる場合、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、及びインスリンから選択される少なくとも１つのマーカーの発現において下降を示し、並びにＺＩＣ１及びＣＤＸ２のアップレギュレーションを示す、ヒト胚性幹細胞からインビトロで分化させた細胞の集団であって、前記ヒト胚性幹細胞が、５×１０^５細胞／ｃｍ^２未満の播種密度で表面上に播種される、細胞の集団。