CN101978044B - 单个多能干细胞培养 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多能干细胞培养领域以及易于在工业水平培养多能干细胞的方法。

Description

单个多能干细胞培养
本发明涉及多能干细胞培养领域以及易于在工业水平培养多能干细胞的方法。
背景
多能干细胞，例如胚胎干细胞，具有分化成为所有成体细胞类型的能力。同样地，胚胎干细胞可以是由于疾病、感染或先天性异常损害的器官的替换细胞和组织的来源。体外增殖细胞同时维持它们多能性的困难妨碍了胚胎干细胞作为替换细胞来源使用的潜力。
当前培养未分化的胚胎干细胞的方法需要复杂的培养条件，例如在有饲养细胞层的情况下培养该胚胎干细胞。可选择地，通过接触饲养细胞培养物获得的培养基可以用来培养胚胎干细胞。采用这些方法的培养系统往往使用从与培养的干细胞不同的物种获得的细胞(异种细胞)。另外，这些培养系统可能补充动物血清。
例如，Reubinoff等(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等(Science 6 November 1998：Vol.282.no.5391，pp.1145-1147)公开了使用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层从人类胚泡的胚胎干细胞系的培养。
在另一个例子中，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的条件培养基。WO2005014799陈述：“根据本发明产生的培养基以鼠科动物细胞，尤其是那些称为MMH(Met鼠科动物肝细胞)的已分化且永生化的转基因肝细胞的细胞分泌活性为条件。”
然而，异种细胞或异种细胞产物的使用增加了通过这样的方法产生的胚胎干细胞群可能被病毒和/或免疫原性异蛋白质污染的风险。
Richards等(Stem Cells 21：546-556，2003)评估了一组11种不同的人类成体、胎儿和初生儿饲养细胞饲养物层支持人类胚胎干细胞培养的能力。Richards等陈述：“在成体皮肤成纤维细胞饲养物上培养的人类胚胎干细胞系保留了人类胚胎干细胞形态并且仍然是多能的”。
US6642048公开了在无饲养物培养中支持灵长类动物多能干(pPS)细胞生长的培养基，以及可用于生产这样的培养基的细胞系。US6642048陈述：“本发明包括从胚胎组织获得的或从胚胎干细胞分化的间充质细胞和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述和例示了取得这样的细胞系，加工培养基，以及使用该条件培养基生长干细胞的方法。”
US20020072117公开了产生在无饲养物培养中支持灵长类动物多能干细胞生长的培养基的细胞系。使用的细胞系是从胚胎组织获得的或从胚胎干细胞分化的间充质细胞和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了该细胞系作为初始饲养细胞层的用途。
在另一个例子中，Wang等(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了在来源于人类胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长人类胚胎干细胞的方法。
在另一个例子中，Xu等(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了从人类胚胎干细胞衍生物获得的条件培养基，所述衍生物通过遗传修饰以过表达人类端粒酶逆转录酶。
在另一个例子中，Stojkovic等(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了一种来源于人类胚胎干细胞自发分化的饲养细胞系统。
在另一个例子中，Miyamoto等(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了一种从人类胎盘获得饲养细胞的来源。
Amit等(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了一种来源于人类包皮的饲养细胞层。
在另一个例子中，Inzunza等(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了一种来自人类生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
一种可供选择的培养系统使用补充有能够促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养物、无血清的培养系统，其中胚胎干细胞在补充有能够触发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的非条件血清替换(SR)培养基中维持。
在另一个例子中，Levenstein等(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了在没有成纤维细胞或条件培养基的情况下，使用补充有bFGF的培养基长期培养人类胚胎干细胞的方法。
在另一个例子中，US20050148070公开了在没有血清和成纤维细胞饲养细胞的确定成分培养基中培养人类胚胎干细胞的方法，该方法包括：在包含白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白代替物、至少一种胰岛素或胰岛素代替物的培养基中培养干细胞，该培养基基本上不含哺乳动物胎儿血清并且包含至少大约100ng/ml的能够活化成纤维细胞生长因子信号传导受体的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子从除成纤维细胞饲养层以外的来源提供，在没有饲养细胞或条件培养基的情况下该培养基支持干细胞以未分化的状态的增殖。
在另一个例子中，US20050233446公开了一种用于培养干细胞的确定成分培养基，包括未分化的灵长类动物原始干细胞。在溶液中，该培养基与培养的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养中，特定的培养基包括基础培养基以及支持该原始干细胞基本上未分化的生长所必需的量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸。
在另一个例子中，US6800480陈述“在一种实施方案中，提供了一种用于以基本上未分化的状态生长灵长类动物来源的原始干细胞的细胞培养培养基，其包括有效支持灵长类动物来源的原始干细胞生长的低渗透压、低内毒素的基础培养基。该基础培养基与有效支持灵长类动物来源的原始干细胞生长的营养血清以及选自饲养细胞和来源于饲养细胞的细胞外基质组分的基质组合。该培养基还包括非必需氨基酸、抗氧化剂、以及选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子。”
在另一个例子中，US20050244962陈述：“在一个方面本发明提供了一种培养灵长类动物胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎儿血清(优选还基本上不含任何动物血清)和有从并非仅仅是(other than just)成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子的培养物中培养干细胞。在一种优选的形式中，通过添加足够的成纤维细胞生长因子使以前需要来维持干细胞培养的成纤维细胞饲养层不必要。”
在另一个例子中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养物和无血清的确定成分的、等渗的培养基，包括：a)基础培养基；b)足够支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的量的bFGF；c)足够支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的量的胰岛素；和d)足够支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的量的抗坏血酸。
在另一个例子中，WO2005086845公开了一种用于维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞接触足够维持该细胞未分化状态的量的转化生长因子β(TGFβ)家族蛋白质成员、成纤维细胞生长因子(FGF)家族蛋白质成员或烟酰胺(NIC)足够的时间以获得需要的结果。
胚胎干细胞提供了用于研究和药物筛选的潜在资源。目前，人类ES细胞系的大规模培养是有问题的并且提供了相当的挑战。一种对这些挑战可能的解决方案是以单细胞传代和培养人类胚胎干细胞。单细胞更适于标准组织培养技术，例如计数、转染等等。
例如，Nicolas等提供了一种用于从用慢病毒载体遗传修饰之后通过荧光激活细胞分选法(FACS)分离的单细胞产生和扩增hES细胞系的方法。Stem Cells andDevelopment(2007)，16(1)，109-118。
在另一个例子中，美国专利申请US2005158852公开了一种“用于改良单个人类胚胎干细胞的生长和存活的方法。该方法包括下列步骤：获得单个未分化的HES细胞；把该单个未分化细胞与细胞外基质(ECM)混合以环绕该细胞；以及在生长环境中把该混合物接种到具有营养培养基的饲养细胞上”。
在另一个例子中，Sidhu，KS et al(Stem Cells Dev.2006 Feb；15(1)：61-9.)“描述了三种人类胚胎干细胞(hESC)克隆hES 3.1、3.2和3.3的首次报道，它们通过流式细胞术分选单细胞制剂来源于亲本系hES3。在细胞分选前后单细胞制剂的成活力保持＞98％”。
然而，人类胚胎干细胞以单细胞传代和培养引起遗传异常和多能性损失。培养条件在多能性和遗传稳定性的维持中是重要的。通常，hES细胞系的传代是手动实施的或使用酶性试剂，例如胶原酶、liberase或分散酶。
例如，Draper JS等指出“在五个独立的时期三种独立的人类胚胎干细胞系中存在包括染色体17q增加的核型改变。”(Nat Biotechnol.2004Jan；22(1)：53-4.Epub 2003 Dec7)。
在另一个例子中，Buzzard等陈述，“我们仅仅检测到一种核型改变事件......使用的培养方法可能对我们的结果具有一些影响，已知我们的方法与大多数其它小组使用的那些方法显然不同。通常在使用破裂的移液管的边缘首次剖解菌落7天后传代人类ES细胞......没有细胞离散的酶或化学方法合并入该方法。我们推测这可能解释了在我们手中的hES细胞的相对细胞遗传弹性。”(Nat Biotechnol.2004 Apr；22(4)：381-2；authorreply 382)。
在另一个例子中，Mitalipova MM等陈述“批量传代方法......会使非整倍体细胞群体在培养中的延长传代后永生，但是可用于较短的时期(直到至少15代)而不损害核型......在长期手动繁殖条件继之以在比手动传代方法需要更大量的hES细胞的实验中有限量的传代下维持hES细胞的正常的核型是可能的，单独地，可以提供”。(NatBiotechnol.2005 Jan；23(1)：19-20)。
在另一个例子中，Heng BC等陈述“结果显示第二种流程(使用温和吸取的胰酶消化)比第一种流程(使用刮擦的胶原酶处理)对细胞成活力损害更少。这随后转变为更高的冻融存活率”。(Biotechnology and Applied Biochemistry(2007)，47(1)，33-37)。
在另一个例子中，Hasegawa K.等陈述，“我们建立了能够容忍完全离解的hESC亚系。这些细胞显示出高的再平板接种(replating)效率以及高的克隆效率并且它们维持它们分化成为三种胚层的能力。”(Stem Cells.2006 Dec；24(12)：2649-60.Epub 2006 Aug24)。
概述
本发明提供了用于已经用酶释放为单细胞的多能干细胞的维持、传代和分化的方法。尤其是，本发明提供了用于已经释放为单细胞的多能干细胞的维持、传代和分化，而没有随后的多能性损失，并且没有染色体异常增加的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了用于分化多能干细胞的方法，包括下列步骤：
a)成簇培养多能干细胞，
b)释放该多能干细胞为单细胞，
c)平板接种该单个多能干细胞到组织培养基质上，和
d)分化该细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了用于维持多能干细胞的方法，包括下列步骤：
a)获得多能干细胞，
b)释放该多能干细胞为单细胞，和
c)平板接种该单个多能干细胞到组织培养基质上。
在一个实施方案中，本发明提供了用于传代多能干细胞的方法，包括下列步骤：
a)获得多能干细胞簇，
b)释放该多能干细胞为单细胞，
c)平板接种该单个多能干细胞到组织培养基质上，
d)允许该单个多能干细胞扩增，
e)释放该单个多能干细胞，和
f)平板接种该单个多能干细胞到新的组织培养基质上。
附图简述
图1：在MEF条件培养基中1∶30减少的生长因子MATRIGELTM上生长的H9ccp33人类ES细胞的4×放大图像。
图2：在分化处理以产生定形内胚层之后表达CXCR4的细胞的百分数。深灰色：在第45和55代之间的H1细胞簇(H1 cc)进行的六次DE分化实验的平均值。黑色：用第47和54代的H1单细胞(H1 sc)进行的两次DE分化实验的平均值。白色：在第37和55代之间的H9细胞簇(H9 cc)进行的五次DE分化实验的平均值。浅灰：在第36和48代之间的H9单细胞(H9 sc)进行的三次DE分化实验的平均值。误差条表示重复实验的标准差。
图3：在接触14或17天的胰腺内分泌分化流程之后通过实时PCR进行的基因表达分析。A.分析第37代的H9单细胞和细胞簇。B.延续H1 p47和H9 p37细胞簇和单细胞至胰腺内胚层阶段。在第14和17天之后Pdx1表达。对每一数据集把未经处理细胞的指示标记的基因表达设置为值1。
图4：在MEF条件培养基中1∶30减少的生长因子MATRIGELTM上生长的H9scp22人类ES单细胞的4×放大图像。
图5：通过FACS评估hES细胞的多能性标记表达。标明的标记阳性细胞的百分数列在X轴上。
图6：以簇传代38次随后以单细胞传代20次的H9 hES单细胞的染色体分散。
图7：在定形内胚层分化期间H9单细胞和细胞簇的比较。在细胞接触定形内胚层分化流程之后显示了CXCR4阳性细胞的百分数。对于H9sc-p N＝2而对于H9cc N＝5。误差条表示重复实验的平均值的标准差。
图8：在H9单细胞(第22代)分化之后胰腺内胚层标记的增加。显示了在11、14或17天的胰腺内分泌分化之后通过实时PCR进行的基因表达分析。第14和17天的值是一块六孔板的两个孔的平均值。
图9：hES单细胞可以在MEF上分化。在MEF饲养物上生长并分化为定形内胚层的H1scp4细胞的FACS结果。定形内胚层标记CXCR4(CD184)在89％的细胞中表达而在未分化细胞中为0％(参见图5)。
图10：hES单细胞(H9scp18)可以在96孔格式中分化为定形内胚层。显示了Sox17阳性检测的免疫荧光数据。8个孔在实验的持续时间中用MEF条件培养基处理：MEF培养基。8个孔用不含组分的基础分化培养基处理：无化合物。对每一数据条算出8个孔的重复实验数据组的平均值。总共40个孔各自用Wnt3a或Gsk3b抑制剂处理并对每一数据组算出平均值。误差条表示每一重复实验组的标准差。
图11：使用hES单细胞(H9scp19)的药效团筛选。测试了总共13种实验小分子化合物在定形内胚层分化流程中替代Wnt3a的能力。显示了三种有效的化合物。数据组表示在两个或更多孔中Sox17阳性细胞的平均值。使用以MEF条件培养基或基础培养基处理的细胞作为阴性对照
图12：评估H9p33 hES细胞簇和单细胞之间的转染效率。用8μl Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlesbad，CA)和4或8μg DNA(分别是黑色和灰色条)把CMV-GFP转染进入细胞。
图13：在MEF上生长然后以簇或单细胞传代至MATRIGELTM的H1 hES细胞的相位显微照片。用胶原酶从MEF传代至MATRIGELTM的第37代H1 hES细胞形成具有一些松散分化的细胞的分散、高密度的菌落。用AccutaseTM或TrypLETM传代一次的H1 hES细胞形成具有高密度的已分化细胞的区块(pocket)的单细胞层培养物。
图14：直接从MEFS传代至MATRIGELTM的H1 hES细胞以单细胞自发地分化。画面A：在用AccutaseTM从MEFs到MATRIGELTM传代2次之后仍然在群中的细胞的百分数。画面B：在用AccutaseTM从MEF到MATRIGELTM传代2次之后hES细胞中的多能性和分化标记的表达。画面C：在用AccutaseTM从MEF到MATRIGELTM传代2次之后H1 hES细胞的相位显微照片。
详述
为了公开的清楚，而不是作为限制，把本发明的详细说明分成下列小部分，其描述或例示本发明的某些特征、实施方案或应用。
定义
干细胞是通过它们在单细胞水平自我更新和分化产生后代细胞两种能力定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞还以它们在体外分化成为来自多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能性细胞，以及在移植之后产生多个胚层的组织和在注射进入胚泡之后相当大地促成大多数，如果不是全部，组织的能力为特征。
干细胞通过它们的发育潜力分类为：(1)全能的，表示能产生所有胚胎和胚外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，表示能产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的(multipotent)，表示能产生一种亚型的细胞谱系，但是都在一种特定的组织、器官或生理系统之内(例如，造血干细胞(HSC)可以产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和元件(例如血小板)的后代)；(4)寡能的，表示能产生比多潜能(multipotent)干细胞更限制性的亚型的细胞谱系；和(5)偏能的，表示能产生单一细胞谱系(例如生精子的干细胞)。
分化是非特化的(“未定型的”)或较少特化的细胞获得特化细胞(例如神经细胞或肌细胞)特征的过程。已分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系中具有更加特化的(“定型的”)位置的细胞。当应用于分化过程时，术语“定型的”指的是在分化途径中进行至一个节点的细胞，在正常环境下，在该节点，它将继续分化成为特定细胞类型或细胞类型的亚型，而不能在正常环境下分化成为不同的细胞类型或回复到较少分化的细胞类型。脱分化指的是细胞回复到在细胞谱系中较少特化的(或定型的)位置的过程。如本文使用的，细胞谱系规定了细胞的遗传性，即，它来自哪种细胞和它可以产生什么细胞。细胞谱系把细胞置于发育和分化的遗传图式中。谱系特异性标记指的是与感兴趣的谱系的细胞表型特异性相关的特征并且可用于评价未定型细胞至感兴趣的谱系的分化。
在培养中多种术语用于描述细胞。“维持”通常指的是在易于细胞生长和/或分裂的条件下放入生长培养基中的细胞，其可能或可能不产生更大群的细胞。“传代”指的是把细胞从一个培养容器移去并在易于细胞生长和/或分裂的条件下把它们置于第二个培养容器的过程。
特定的细胞群或细胞系有时指的是它已经传代的次数或以其为特征。例如，已经传代10次的培养细胞群可以称为P10培养物。原始培养物，即在从组织的细胞分离之后的第一培养物，指定为P0。在第一次继代培养之后，细胞被描述为第二培养物(P1或第1代)。在第二次继代培养之后，细胞成为第三培养物(P2或第2代)，等等。本领域技术人员可以理解在传代期间可能有许多次种群加倍；因此培养物种群加倍的数目大于传代数。在传代之间的时期细胞的扩增(即种群加倍的数目)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基质、培养基、生长条件和传代之间的时间。
本文使用的“AFP”或“甲胎蛋白”指的是在肝脏发育起始时产生的一种抗原。AFP还可以在胚外细胞中表达。
“β-细胞谱系”指的是具有转录因子PDX-1和至少一种下列转录因子阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征标记的细胞包括β细胞。
本文使用的“Brachyury”是一种T-框(box)基因家族成员。它是原条和中胚层细胞的标记。
本文使用的“表达定形内胚层谱系特征标记的细胞”指的是表达至少一种下列标记的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源框蛋白质、FGF4 CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征标记的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
本文使用的“CD99”指的是登录号NM_002414的基因编码的蛋白质。
本文使用的“表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞”指的是表达至少一种下列标记的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞包括胰腺内胚层细胞。
本文使用的“表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞”指的是表达至少一种下列标记的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3或PTF-1α。表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞、和胰腺激素分泌细胞、和β细胞谱系的细胞。
本文使用的“CXCR4”指的是基质细胞衍生因子1(SDF-1)受体，又名“LESTR”或“fusin”。在形成原肠胚过程中的小鼠胚胎中，CXCR4在定形内胚层和中胚层中而不是在胚外内胚层中表达。
本文使用的“定形内胚层”指的是在原肠胚形成期间具有从外胚层产生的细胞特性的细胞，其形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下列标记：CXCR4、HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、c-Kit、CD99和Mixl1。
本文使用的“胚外内胚层”指的是表达至少一种下列标记的细胞群：SOX-7、AFP和SPARC。
“GATA-4”和“GATA-6”是GATA转录因子家族的成员。该转录因子家族由TGF-β信号传导诱导并有助于早期内胚层标记的维持。
本文使用的“GLUT-2”指的是在许多胎儿和成人组织(包括胰腺、肝、肠、脑和肾)中表达的葡萄糖转运分子。
本文使用的“Goosecoid”或“GSC”指的是在胚孔的背唇中表达的同源结构域转录因子。
本文使用的“Islet-1”或“Isl-1”是LIM/同源结构域转录因子家族的成员，在发育中的胰腺中表达。
本文使用的“MafA”是在胰腺中表达的转录因子，控制在胰岛素生物合成和分泌中涉及的基因的表达。
本文使用的“标记”是在感兴趣的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在本上下文中，对于阳性标记差异表达表示增加的水平而对于阴性标记其表示减少的水平。与其它细胞相比，在感兴趣的细胞中标记核酸或多肽的可检测水平足够高或低，以致可以使用本领域已知的多种方法中的任意一种鉴定和将感兴趣的细胞同其它细胞区别开来。
本文使用的“中内胚层细胞”指的是表达至少一种下列标记的细胞：CD48、eomesodermin(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、GATA-6。
本文使用的“Nodal”是TGFβ蛋白超家族的成员。
“Oct-4”是POU结构域转录因子的成员并被普遍认为是多能干细胞的标志。Oct-4与多能干细胞的关系通过其紧密地限制性表达到未分化的多能干细胞表明。当分化为体细胞谱系时，Oct-4的表达迅速消失。
本文使用的“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指的是能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长激素释放抑制激素和胰多肽。
本文使用的“胰腺激素分泌细胞”指的是能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长激素释放抑制激素和胰多肽。
本文使用的“Pax-4”和“Pax-6”是涉及胰岛发育的胰腺β细胞特异性转录因子。
本文使用的“PDX-1”指的是涉及胰腺发育的同源结构域转录因子。
本文使用的“前-原条细胞”指的是表达至少一种下列标记的细胞：Nodal或FGF8。
本文使用的“原条细胞”指的是表达至少一种下列标记的细胞：Brachyury、Mix样同源框蛋白质或FGF4。
本文使用的“PTF-1α”指的是48kD的碱性螺旋-环-螺旋蛋白，其是三聚体胰腺转录因子1(PTF1)的序列特异性DNA结合亚基。
本文使用的“SPARC”又名“酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白”。
“SSEA-1”(时期专一的胚胎抗原1)是存在于鼠畸胎癌干细胞(EC)、鼠和人胚胎生殖细胞(EG)和鼠胚胎干细胞(ES)表面上的糖脂表面抗原。
“SSEA-3”(时期专一的胚胎抗原3)是存在于人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)表面上的糖脂表面抗原。
“SSEA-4”(时期专一的胚胎抗原4)是存在于人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)表面上的糖脂表面抗原。
“TRA1-60”是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)表面上表达的硫酸角质素相关抗原。
“TRA1-81”是在人畸胎癌干细胞(EC)、人胚胎生殖细胞(EG)和人胚胎干细胞(ES)表面上表达的硫酸角质素相关抗原。
“TRA2-49”是在人畸胎癌干细胞(EC)和人胚胎干细胞(ES)表面上表达的碱性磷酸酶同工酶。
本发明提供了用于已经用酶释放为单细胞的多能干细胞的维持、传代和分化的方法。尤其是，本发明提供了用于已经释放为单细胞的多能干细胞的维持、传代和分化，而没有随后的多能性损失，并且没有染色体异常增加的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了用于分化多能干细胞的方法，包括下列步骤：
a)成簇培养多能干细胞，
b)释放该多能干细胞为单细胞，
c)平板接种该单个多能干细胞到组织培养基质上，和
d)分化该单个多能干细胞。
可以通过酶处理释放多能干细胞簇为单细胞。酶处理可以用TrypLETM Express，可选择地用TrypLETM Select，可选择地用胰蛋白酶，或者可选择地用胰蛋白酶/EDTA。
酶处理可以是大约2至大约5分钟。可选择地，酶处理为大约5分钟。
可以使用从大约0.5g/L到大约2.5g/L浓度的酶。
在一个实施方案中，可以用TrypLETM EXPRESS释放多能干细胞簇为单细胞。
在一个实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞。在一个替代的实施方案中，胚胎干细胞是人的。
在一个实施方案中，把释放的单个多能细胞平板接种到组织培养基质上。基质可以是MATRIGELTM，可选择地基质可以是纤连蛋白，可选择地基质可以是层粘连蛋白，可选择地基质可以是人血清，或者可选择地基质可以是胶原。
在一个实施方案中，把释放的单个多能细胞平板接种到三维支持物上。支持物可以与至少一种促进该释放的单个多能细胞存活和行使功能的药物试剂结合。对本发明来说适合使用的支持物材料包括泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织品和无纺结构形式的合成和天然材料。
在一个实施方案中组织培养基质是MATRIGELTM。可以在从大约1∶30到大约1∶10的稀释度使用MATRIGELTM。在一个实施方案中，以1∶10的稀释度使用MATRIGELTM。
单个多能干细胞可以分化成为表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。可选择地，单个多能干细胞可以分化成为表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞。可选择地，单个多能干细胞可以分化成为表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了用于维持多能干细胞的方法，包括下列步骤：
a)获得多能干细胞簇，
b)释放该多能干细胞为单细胞，和
c)平板接种该单个多能干细胞到组织培养基质上。
可以通过酶处理释放多能干细胞簇为单细胞。酶处理可以用TrypLETM Express，可选择地用TrypLETM Select，可选择地用胰蛋白酶，或者可选择地用胰蛋白酶/EDTA。
酶处理可以是大约2至大约5分钟。可选择地，酶处理为大约5分钟。
可以使用从大约0.5g/L到2.5g/L浓度的酶。
在一个实施方案中，可以用TrypLETM Express释放多能干细胞簇为单细胞。
在一个实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞。在一个替代的实施方案中，胚胎干细胞是人的。
在一个实施方案中，把释放的单个多能细胞平板接种到组织培养基质上。基质可以是MATRIGELTM，可选择地基质可以是生长因子减少的MATRIGELTM，可选择地基质可以是纤连蛋白，可选择地基质可以是层粘连蛋白，可选择地基质可以是人血清，或者可选择地基质可以是胶原。
在一个实施方案中，把释放的单个多能细胞平板接种到三维支持物上。支持物可以与至少一种促进该释放的单个多能细胞存活和行使功能的药物试剂结合。对本发明来说适合使用的支持物材料包括泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织品和无纺结构形式的合成和天然材料。
在一个实施方案中组织培养基质是生长因子减少的MATRIGELTM。可以在从大约1∶30到大约1∶10的稀释度使用生长因子减少的MATRIGELTM。在一个实施方案中，以1∶30的稀释度使用MATRIGELTM。
单个多能干细胞可以分化成为表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。可选择地，单个多能干细胞可以分化成为表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞。可选择地，单个多能干细胞可以分化成为表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了用于传代多能干细胞的方法，包括下列步骤：
a)获得多能干细胞簇，
b)释放该多能干细胞为单细胞，
c)平板接种该单个多能干细胞到组织培养基质上，
d)允许该单个多能干细胞扩增，
e)释放该单个多能干细胞，和
f)平板接种该单个多能干细胞到新的组织培养基质上。
可以通过酶处理释放多能干细胞簇为单细胞。酶处理可以用TrypLETM Express，可选择地用TrypLETM Select，可选择地用胰蛋白酶，或者可选择地用胰蛋白酶/EDTA。
酶处理可以是大约2至大约5分钟。可选择地，酶处理为大约5分钟。可以使用从大约0.5g/L到2.5g/L浓度的酶。
在一个实施方案中，可以用TrypLETM Express释放多能干细胞簇为单细胞。
在一个实施方案中，在细胞再次经受酶传代到新的组织培养基质上以前单个多能细胞生长到大约70至80％的密度。使用本发明的方法，单个多能干细胞可以传代一次，或者它们可以传代多于一次。
在一个实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞。在一个替代的实施方案中，胚胎干细胞是人的。
在一个实施方案中，把释放的单个多能细胞平板接种到组织培养基质上。基质可以是MATRIGELTM，可选择地，基质可以是生长因子减少的MATRIGELTM，可选择地基质可以是纤连蛋白，可选择地基质可以是层粘连蛋白，可选择地基质可以是人血清或者可选择地基质可以是胶原。
在一个实施方案中，把释放的单个多能细胞平板接种到三维支持物上。支持物可以与至少一种促进该释放的单个多能细胞存活和行使功能的药物试剂结合。对本发明来说适合使用的支持物材料包括泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织品和无纺结构形式的合成和天然材料。
在一个实施方案中组织培养基质是生长因子减少的MATRIGELTM。可以在从大约1∶30到大约1∶10的稀释度使用生长因子减少的MATRIGELTM。在一个实施方案中，以1∶30的稀释度使用MATRIGELTM。
用于多能干细胞的分离、扩增和培养的其它方法
多能干细胞的鉴定
多能干细胞可以表达时期专一的胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可使用命名为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标记中的一种或更多种(Thomson et al.，Science 282：1145，1998)。多能干细胞在体外的分化导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达(如果存在)的损失以及SSEA-1表达的增加。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，其可以按照厂商(Vector Laboratories，Burlingame Calif)的描述通过用4％多聚甲醛固定该细胞然后用Vector Red作为底物显影来检测。未分化的多能干细胞通常还表达Oct-4和TERT，通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一个需要的表型是分化成为所有三种胚层：内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜力。干细胞的多能性可以通过，例如注射细胞进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4％多聚甲醛固定其形成的畸胎瘤，然后组织学上检查它们来自三种胚层的细胞类型的证据来确定。可选择地，多能性可以通过胚状体的产生和评价该胚状体与三种胚层相关的标记的存在来确定。
增殖的多能干细胞系可以使用标准G显带技术确定核型并与公布的相应灵长类物种核型相比。需要获得具有“正常核型”的细胞，其表示细胞是整倍体的，其中所有人染色体都存在并且没有显著地改变。
多能干细胞的来源
可以使用的多能干细胞类型包括已经建立的多能细胞系。非限制性例子是已经建立的人胚胎干细胞或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。从已经在没有饲养物的情况下培养的多能干细胞群获取的细胞也是合适的。突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)也是合适的。
多能干细胞的培养
在一个实施方案中，多能干细胞通常在以多种方式支持该多能干细胞的饲养细胞层上培养。可选择地，多能干细胞在基本上不含饲养细胞，但是仍然支持多能干细胞不经受相当大的分化的增殖的培养系统中培养。使用以先前培养另一种细胞类型为条件的培养基支持不分化的在无饲养物培养物中多能干细胞的生长。可选择地，使用化学成分确定的培养基支持不分化的在无饲养物培养物中多能干细胞的生长。
例如，Reubinoff等(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等(Science 6 November 1998：Vol.282.no.5391，pp.1145-1147)公开了使用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层从人胚泡的多能干细胞系的培养。
Richards等(Stem Cells 21：546-556，2003)评估了一组11种不同的人类成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人类多能干细胞培养的能力。Richards等陈述：“在成体皮肤成纤维细胞饲养物上培养的人类胚胎干细胞系保留了人类胚胎干细胞形态并且仍然是多能的”。
US20020072117公开了产生在无饲养物培养中支持灵长类动物多能干细胞生长的培养基的细胞系。使用的细胞系是从胚胎组织获得的或从胚胎干细胞分化的间充质细胞和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了该细胞系作为初始饲养细胞层的用途。
在另一个例子中，Wang等(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了在来源于人类胚胎干细胞的饲养细胞层上人类多能干细胞长期生长的方法。
在另一个例子中，Stojkovic等(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了来源于人类胚胎干细胞自发分化的饲养细胞系统。
在另一个例子中，Miyamoto等(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了从人胎盘处获得的饲养细胞的来源。
Amit等(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了来源于人包皮的饲养细胞层。
在另一个例子中，Inzunza等(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了在无饲养物培养中支持灵长类动物多能干(pPS)细胞生长的培养基，以及可用于生产这样的培养基的细胞系。US6642048陈述：“本发明包括从胚胎组织获得的或从胚胎干细胞分化的间充质细胞和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述和例示了取得上述细胞系，加工培养基和使用该条件培养基生长干细胞的方法。”
在另一个例子中，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的条件培养基。WO2005014799陈述：“根据本发明产生的培养基以鼠科动物细胞，尤其是那些称为MMH(Met鼠科动物肝细胞)的已分化且永生化的转基因肝细胞的细胞分泌活性为条件。”
在另一个例子中，Xu等(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了从已经遗传修饰以过表达人端粒酶逆转录酶的人类胚胎干细胞衍生物获得的条件培养基。
在另一个例子中，US20070010011公开了维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种可供选择的培养系统使用补充有能够促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，October19，2005)公开了一种无饲养物、无血清的培养系统，其中胚胎干细胞在补充有能够触发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的非条件血清替换(SR)培养基中维持。
在另一个例子中，Levenstein等(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了在没有成纤维细胞或条件培养基的情况下，使用补充有bFGF的培养基长期培养人类胚胎干细胞的方法。
在另一个例子中，US20050148070公开了在没有血清和成纤维细胞饲养细胞的确定成分培养基中培养人类胚胎干细胞的方法，该方法包括：在包含白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白代替物、至少一种胰岛素或胰岛素代替物的培养基中培养干细胞，该培养基基本上不含哺乳动物胎儿血清并且包含至少大约100ng/ml的能够活化成纤维细胞生长因子信号传导受体的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子从并非仅仅是成纤维细胞饲养层的来源提供，在没有饲养细胞或条件培养基的情况下该培养基支持干细胞以未分化的状态增殖。
在另一个例子中，US20050233446公开了一种用于培养干细胞的确定成分培养基，包括未分化的灵长类动物原始干细胞。在溶液中，该培养基与培养的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养中，特定的培养基包括基础培养基以及支持该原始干细胞基本上未分化的生长所必需的量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸。
在另一个例子中，US6800480陈述，“在一种实施方案中，提供了一种用于以基本上未分化的状态生长灵长类动物来源的原始干细胞的细胞培养培养基，其包括有效支持灵长类动物来源的原始干细胞生长的低渗透压、低内毒素的基础培养基。该基础培养基与有效支持灵长类动物来源的原始干细胞生长的营养血清以及选自饲养细胞和来源于饲养细胞的细胞外基质组分的基质组合。该培养基还包括非必需氨基酸、抗氧化剂、以及选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子。”
在另一个例子中，US20050244962陈述：“在一个方面本发明提供了一种培养灵长类动物胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎儿血清(优选还基本上不含任何动物血清)和有从并非仅仅是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子的培养物中培养干细胞。在一种优选的形式中，通过添加足够的成纤维细胞生长因子使以前需要来维持干细胞培养的成纤维细胞饲养层不必要。”
在另一个例子中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养物和无血清的确定成分的、等渗的培养基，包括：a)基础培养基；b)足够支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的量的bFGF；c)足够支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的量的胰岛素；和d)足够支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长的量的抗坏血酸。
在另一个例子中，WO2005086845公开了一种用于维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞接触足够维持该细胞未分化状态的量的转化生长因子β(TGFβ)家族蛋白质成员、成纤维细胞生长因子(FGF)家族蛋白质成员或烟酰胺(NIC)足够的时间以获得需要的结果。
可以把多能干细胞平板接种到合适的培养基质上。在一个实施方案中，合适的培养基质是细胞外基质组分，例如来源于基底膜或可以形成粘着分子受体-配体对的一部分的那些。在一个实施方案中，合适的培养基质是MATRIGELTM(Becton Dickenson)。MATRIGELTM是来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶制剂，其在室温下是凝胶以形成重建的基底膜。
作为替换物其它细胞外基质组分和组分混合物是合适的。取决于增殖的细胞类型，这可以包括单独的或以不同组合的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、内功素、硫酸乙酰肝素等等。
可以以合适的分布和在有促进细胞存活、增殖和保留需要的特性的培养基的情况下把多能干细胞平板接种到基质上。所有这些特性得益于小心注意接种分布并且本领域技术人员能够容易地确定。
合适的培养基可以由下列组分组成，例如Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基(DMEM)、Gibco # 11965-092；Knockout Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基(KO DMEM)、Gibco # 10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺、Gibco #15039-027；非必需氨基酸溶液、Gibco 11140-050；β-巯基乙醇、Sigma # M7522；人类重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Gibco # 13256-029。
多能干细胞的分化
在本发明的一个实施方案中，在培养中多能干细胞增殖，同时维持它们的多能性。细胞随时间的多能性改变能够通过检测与多能性相关的标记的表达水平的改变而确定。可选择地，多能性改变能够通过检测与分化相关的标记或与另一种细胞类型相关的标记的表达水平的改变而监测。
在一个替代的实施方案中，多能干细胞在培养中增殖然后以促进它们分化成为另一种细胞类型的方式处理。其它细胞类型可以是表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。可选择地，该细胞类型可以是表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞。可选择地，该细胞类型可以是表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。可选择地，该细胞类型可以是表达β细胞谱系特征标记的细胞。
根据本发明的方法处理的多能干细胞可以通过本领域任何合适的方法分化成为多种其它细胞类型。例如，根据本发明的方法处理的多能干细胞可以分化成为神经细胞、心脏细胞、肝细胞、等等。
例如，根据本发明的方法处理的多能干细胞可以根据WO2007030870中公开的方法分化成为神经祖细胞和心肌细胞。
在另一个例子中，根据本发明的方法处理的多能干细胞可以根据美国专利6,458,589中公开的方法分化成为肝细胞。
表达定形内胚层谱系特征标记的细胞的形成
多能干细胞可以通过本领域的任何方法分化成为表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以根据D′Amour et al，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法分化成为表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以根据Shinozaki et al，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法分化成为表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以根据McLean et al，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法分化成为表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以根据D′Amour et al，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法分化成为表达定形内胚层谱系特征标记的细胞。
定形内胚层谱系特征标记选自SOX17、GATA4、Hnf-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源框蛋白质、FGF4 CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适合在本发明使用的是表达至少一种定形内胚层谱系特征标记的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征标记的细胞是原条前体细胞。在一个替代的方面，表达定形内胚层谱系特征标记的细胞是中内胚层细胞。在一个替代的方面，表达定形内胚层谱系特征标记的细胞是定形内胚层细胞。
表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞的形成
多能干细胞可以通过本领域的任何方法分化成为表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以根据D′Amour et al，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法分化成为表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞。
胰腺内胚层谱系特征标记选自Pdx1、HNF-1β、PTF1a、HNF-6、HB9和PROX1。适合在本发明使用的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征标记的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞是胰腺内胚层细胞。
表达胰腺内分泌谱系标记的细胞的形成
多能干细胞可以通过本领域的任何方法分化成为表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以根据D′Amour et al，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法分化成为表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以通过Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法分化成为表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。
例如，多能干细胞可以通过D′Amour et al，Nature Biotechnology，2006中公开的方法分化成为表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。
胰腺内分泌谱系特征标记选自NGN-3、NeuroD、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3和PTF-1α。在一个实施方案中，胰腺内分泌细胞能够表达至少一种下列激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素释放抑制激素和胰多肽。适合在本发明使用的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征标记的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征标记的细胞是胰腺内分泌细胞。该胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素表达细胞。可选择地，该胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素分泌细胞。
在本发明的一个方面，该胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征标记的细胞。表达β细胞谱系特征标记的细胞表达Pdx1和至少一种下列转录因子：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征标记的细胞是β细胞。
三维支持物
对本发明来说适合使用的支持材料包括泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织品和无纺结构形式的合成和天然材料，其已经用于体外和体内重建或再生生物组织，以及递送趋化性试剂以诱导组织生长，适于在本发明的方法的实践中使用。参见，例如，在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国公布申请2004/0062753 A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中公开的材料。
为了形成与药物试剂结合的支持物，可以在形成支持物之前把药物试剂与聚合物溶液混合。可选择地，可以把药物试剂包被到制造的支持物上，优选在有药物载体的情况下。药物试剂可以以液体、细碎的固体或任何其它适当的物理形式存在。可选择地，可以把赋形剂加入该支持物以改变药物试剂的释放速度。在一个替代的实施方案中，支持物与至少一种抗炎的药物化合物结合，例如在美国专利6,509,369中公开的化合物。
支持物可以与至少一种抗凋亡的药物化合物结合，例如在美国专利6,793,945中公开的化合物。
支持物也可以与至少一种纤维化抑制剂药物化合物结合，例如在美国专利6,331,298中公开的化合物。
支持物还可以与至少一种能够增强血管发生的药物化合物结合，例如在美国公布申请2004/0220393和美国公布申请2004/0209901中公开的化合物。
支持物也可以与至少一种免疫抑制药物化合物结合，例如在美国公布申请2004/0171623中公开的化合物。
本发明通过下列实施例进一步说明，但不受其限制。
实施例
实施例1
以细胞簇传代和维持hESC
在丝裂霉素C灭活的原始小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上维持人类胚胎干细胞系H1和H9。在重复传代过程中把hES细胞从MEF饲养物转换到MATRIGELTM。
组织培养皿的MATRIGELTM包被：在4℃解冻生长因子减少的MATRIGELTM(Becton-Dickinson，Bedford，Mass.)然后在冷的DMEM/F12(Invitrogen，Carlsbad，CA)中1∶30稀释。把足够覆盖的体积加入每个6cm皿(2ml)或六孔板的每个孔(1ml)，并且在室温孵育1hr。平板在几小时之内使用或者在4℃存储最多2星期。
人类胚胎干细胞培养：通过在含1mg/ml胶原酶IV(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的DMEM/F12中孵育10分钟，随后用吸量管刮擦从饲养层收获未分化的人类胚胎干细胞集落(H9和H1)。在1000rpm离心4分钟沉淀细胞团并且用2ml吸量管温和地分散沉淀以破裂集落为细胞小簇。在补充有bFGF(8ng/ml；R&D Systems，Minneapolis，MN)的MEF-CM中把这些细胞簇接种到MATRIGELTM包被的皿上，在5ml生长培养基中每6cm皿50-150集落。每日更换培养基。在MEF-CM中的MATRIGELTM上的集落变大并且当它们占有70-80％表面区域时传代，大约每3-4天。集落中的hES细胞具有高的核质比例并具有显著的核仁，与饲养物上维持的hES细胞相似(图1)。已分化的细胞相当于培养中总细胞的少于5％。
对于在MATRIGELTM上的MEF-CM中的细胞的常规传代，细胞在含1mg/ml胶原酶IV的DMEM/F12中孵育直至60分钟并且通过强烈的DMEM/F12流刮擦从皿移走。沉淀、分散细胞，并以1∶3或1∶4的比例接种。
实施例2
人类胚胎干细胞以单细胞传代：酶评估
为了容易处理hES细胞，传代技术可以使用需要较短孵育时间并且不包括刮擦步骤的其它酶溶液。另外，用胶原酶以细胞簇传代细胞不允许接种的细胞的数值定量。许多酶溶液可以用来在一个快速的步骤中释放单细胞。通过下列实验鉴定引起最少细胞损坏并且不阻碍细胞附着或细胞生长的快速作用的酶。
在六孔皿中以簇生长的人类胚胎干细胞H9p33细胞用下列酶孵育；TrypLETMExpress、TrypLETM Select、胰蛋白酶/EDTA(0.05％)或胰蛋白酶(0.25％)，于36℃2分钟。除胰蛋白酶之外的所有酶在2分钟之内释放细胞。于36℃在5分钟之后完成用胰蛋白酶的释放。以200,000细胞/孔再接种细胞进MATRIGELTM包被的六孔平板并允许扩增三天。人类胚胎干细胞还用胶原酶以簇传代(30分钟孵育)并在MATRIGELTM包被的孔上以1∶5稀释度再接种，与计数的TrypLETM Express细胞相似。三天之后，通过TrypLETM Express 5分钟孵育释放hESC。用0.01％台盼蓝孵育细胞然后计数(表1)。对于测试的所有酶紧接着释放之后的细胞成活力大于98％。使用胶原酶的人类胚胎干细胞传代是标准传代方法。三天培养之后，TrypLETM Select和TrypLETM Express两者产生的回收细胞计数与胶原酶相似。胰蛋白酶/EDTA和胰蛋白酶在维持细胞附着/生长上效果显著较差。TrypLETM Select和TrypLETMExpress是评估的最好的酶并且在时程实验，实施例3中进一步测试。
实施例3
人类胚胎干细胞以单细胞传代：酶暴露时间的优化
TrypLETM Select和TrypLETM Express证明是测试的所有酶中最佳的。为了确定这些酶与hES细胞的理想孵育时间，TrypLETM Select和TrypLETM Express与H9p34 hESC簇在37℃孵育2分钟或10分钟。细胞从孔移走、计数并通过离心沉淀。把200,000细胞/孔的等分试样接种进六孔平板。细胞生长三天随后用TrypLETM Express释放并在有0.01％台盼蓝的情况下计数。
对于两种酶的两种孵育时间细胞成活力均大于98％。表II表明接种36hrs之后回收的细胞数目/孔。用TrypLETM Express传代的细胞在三天之后达到初始的接种密度。这表明接种之后大多数细胞不重新附着；然而，附着的细胞能够增殖和扩增。假如一旦附着，细胞以相同的速率扩增，这些数据证明用TrypLETM Express处理2分钟产生最好的附着率。然后在所有随后的实验中把2分钟的TrypLETM Express处理用于产生单细胞。
实施例4
人类胚胎干细胞单细胞和细胞簇分化为定形内胚层
胚胎干细胞可以分化为多种细胞谱系。以单细胞传代的人类ES细胞对帮助细胞输入定量和容易处理提供了显著的改进。确定了这些单个hES细胞分化的能力。
细胞簇和单细胞的接种：在减少的生长因子MATRIGELTM上的H9或H1细胞簇6cm平板与2ml含胶原酶(1mg/ml)的DMEM：F12在37℃孵育直至60分钟。通过吸取和刮擦移去细胞并以900rpm离心4分钟。然后把细胞簇接种进1∶15或1∶30减少的生长因子MATRIGELTM包被的六孔板。该传代方法产生接种细胞簇(cc)。可选择地，在减少的生长因子MATRIGELTM上的H9或H1细胞簇的6cm平板与TrypLETMExpress(2ml)在37℃孵育5分钟并通过吸取分散。在以900rpm离心4分钟之后，把细胞接种进1∶10减少的生长因子MATRIGELTM包被的六孔板并称为单细胞(sc)。
定形内胚层分化：把大约60至70％融合的H9和H1 sc和cc培养物暴露于补充有0.5％FBS、10ng/ml Wnt3a(R&D Systems)和100ng/ml活化素A(AA；R&D Systems)的DMEM：F12培养基2天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml活化素A的DMEM/F12培养基处理另外的三天。
通过FACS分析培养物的CXCR4、CD99和CD9表达以及通过实时PCR分析SOX-17、SOX-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、goosecoid(GSC)、HNF-3β和GATA4。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标记，而GATA4、HNF-3β和SOX-17代表定形内胚层标记，以及GSC、Bry和CXCR4代表原条的标记。按照观察到的产生的CXCR4阳性细胞百分数，单细胞以与细胞簇相似的程度分化至DE(图2)。
实施例5
hES单细胞和细胞簇分化为胰腺内胚层
还测试了在改进的Novocell(Baetge，EE et al.，Nature Biotechnology(2006)，24(11)，1392-1401.)公布的流程之后的进一步分化以确定hES单细胞的分化能力。在实施例4中描述的DE流程之后细胞进一步分化为胰腺内胚层。
胰腺内胚层分化：使用来自实施例4的细胞簇和单细胞两者，一个H9(p37)DE实验进一步分化为胰腺内胚层。在定形内胚层流程完成之后，细胞与含FGF10(50ng/ml；R&DSystems)、sonic hedgehog抑制剂、KAAD环王巴明(cyclopamine)(2.5uM；Sigma-Aldrich)和2％FBS的DMEM：F12培养基孵育3天。接着，细胞与含FGF10(50ng/ml)、KAAD环王巴明(2.5uM)、视黄酸(1uM；Sigma-Aldrich)和1％B27(Invitrogen)的DMEM-低葡萄糖孵育另外的三天。接着，细胞与含Exendin 4(50ng/ml；Sigma-Aldrich)、DAPT(1uM；Calbiochem)和1％B27的DMEM-低葡萄糖孵育另外的三天。对于每种细胞类型，从六孔板的一个孔获取RNA样品然后通过实时PCR在该步骤分析胰腺标记Pdx1、Nkx6.1、Nkx2.2、Pax4、NeuroD、HNF3b、Ptf1a、胰岛素和AFP。使用包含50ng/ml，HGF、IGF(R&D Systems)，和Exendin 4(50ng/ml)，和1％B27的CMRL培养基(Invitrogen)继续分化三天。在该时期重复相同胰腺内胚层标记的评估。来自相同系的未经处理的hES细胞的RNA样品与处理的样品平行经受实时PCR。把处理的样品针对未经处理的对照组标准化为1的倍数改变。监测并在单细胞和细胞簇之间比较Pdx1表达。在单细胞和细胞簇之间胰腺内胚层标记表达的诱导是相当的(图3)。因此，hES单细胞具有与hES细胞簇相似的固有的分化能力。
实施例6
hES细胞以单细胞传代
hES细胞以单细胞传代可以帮助扩大培养的能力和易于制造过程。
单细胞产生和传代的描述：H9细胞如上所述在MATRIGELTM上以簇生长。在第38代，6cm平板的H9细胞在37℃与2ml TrypLETM Express孵育5分钟。在DMEM：F12中重悬浮细胞并以900rpm离心4分钟。以1∶4比例再接种细胞到1∶30生长因子减少的MATRIGELTM包被的平板上。大约5次传代之后，在再接种之前计数细胞并以14,000细胞/cm2的密度平板接种。以每4天的间隔继续传代和按该密度再接种。因为由单细胞产生，细胞保持致密结构但是从未形成紧密的簇(比较图1和图4)。
实施例7
hES单细胞多能性的分析
对于任何传代技术hES细胞多能性的维持是必须的。因此，在使用TrypLETMExpress多次传代之后评估了单细胞的多能性。
FACS多能性分析：H9单细胞以簇培养38次传代随后以单细胞16次传代，包括一个深低温保藏冻融。然后通过FACS分析细胞多能性标记的表达。利用与TrypLETM Express溶液孵育5分钟从培养平板移走粘附细胞。释放的细胞在DMEM：F12培养基中重悬浮并通过离心回收，随后在由PBS中的2％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、0.05％叠氮化钠组成的染色缓冲液中洗涤和重悬浮。视情况，使用0.1％γ-球蛋白(Sigma)溶液对细胞进行Fc受体封闭15分钟。等分试样(大约105细胞)如表IIIA中指出的与藻红蛋白(phycoerythirin，PE)或别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)缀合的单克隆抗体(每106细胞5μl抗体)或者与非缀合的原始抗体一起孵育。对照包括适当同种型匹配的抗体、未染色的细胞和仅仅用二级缀合抗体染色的细胞。所有与抗体的孵育在4℃进行30分钟，之后用染色缓冲液洗涤细胞。用非缀合原始抗体染色的样品与二级缀合PE或APC标记的抗体在4℃孵育另外的30分钟。使用的二级抗体的列表参见表IIIB。沉淀洗涤的细胞并在染色缓冲液中重悬浮，然后使用FACS阵列(BD Biosciences)仪鉴定细胞表面分子，收集至少10,000个事件。hESC胶原酶传代的H1p40和H9scp16具有相当的多能性蛋白质表达型(图5)。
实施例8
人类胚胎干细胞单细胞核型稳定性分析
经过多次传代hES单细胞的核型应该仍然是稳定的。H9单细胞以簇培养38次传代随后以单细胞多次传代。通过标准G显带核型分析(Cell Line Genetics，Madison，WI)确定H9细胞的核型。评估了总共20个G显带的细胞并且通过FISH(荧光原位杂交)分析了200个间期核。在这些分析的细胞中没有发现染色体畸变。细胞遗传学分析显示这些细胞具有正常数目的常染色体和最常见的46的染色体数目。在第13代和第20代实施H9单细胞的核型分析。第20代的细胞经受了一次深低温保藏冻融事件。第13和20代的细胞是核型正常的(图6)。
实施例9
hES单细胞和hES细胞簇分化为定形内胚层
对于最后的效用，以单细胞传代的hES细胞必须保持它们的分化潜力。单细胞经受如下定形内胚层流程。用TrypLETM Express多次传代之后的H9细胞(sc-p)用TrypLETMExpress从传代的单细胞(第6和21代)释放(sc)到MATRIGELTM(1∶10稀释)上以分化。把大约60至70％融合的H9 sc单细胞层暴露于补充有0.5％FBS、10ng/ml Wnt3a和100ng/ml活化素A的DMEM：F12培养基2天，随后用补充有2％FBS和100ng/ml活化素A的DMEM/F12培养基处理另外的三天。
在第5天，通过FACS分析细胞的CXCR4、CD99和CD9表达以及通过实时PCR分析SOX-17、SOX-7、甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3β和GATA4。AFP和SOX-7被认为是内脏内胚层标记，而GATA4、HNF-3β和SOX-17代表定形内胚层标记，并且GSC、Bry和CXCR4代表原条的标记。多次传代的单细胞(第6和21代)保持它们分化为DE的能力，与细胞簇(第36-55代)相似(图7)。
实施例10
hES单细胞分化为胰腺内胚层
依附下列步骤细胞进一步分化为胰腺内胚层；与含FGF10(50ng/ml)、sonichedgehog抑制剂、KAAD环王巴明(2.5uM)和2％FBS的DMEM：F12培养基孵育三天，随后与含FGF10(50ng/ml)、KAAD环王巴明(2.5uM)、视黄酸(1uM)和1％B27的DMEM-低葡萄糖孵育三天。在第11天进行细胞的评估。一些培养物在含Exendin 4(50ng/ml)、DAPT(1uM)和1％B27的DMEM-低葡萄糖中继续处理三天。在第14天，通过实时PCR分析样品的胰腺标记Pdx1、Nkx6.1、Nkx2.2、Pax4、NeuroD、HNF3b、Ptf1a、胰岛素和AFP。一些培养物使用包含50ng/ml，HGF、IGF、和Exendin 4、和1％B27的CMRL培养基继续分化另外的三天。在在第17天末重复相同胰腺内胚层标记的评估。胰腺内胚层标记Nkx2.2、NeuroD、HNF6、HNF3b主要在第14和17天末表达。Pdx1表达在每一处理时期逐渐增加(图8)。
实施例11
在MEF饲养物上分化hES单细胞
为了达到hES细胞最佳分化为胰腺内胚层，定形内胚层群必须是最大的。当前，在MEF饲养物上生长hES产生最高可达到水平的定形内胚层和胰腺内胚层。为了确定hES单细胞是否能够达到这个目标，把H1scp4以14,000细胞/cm2接种到MEF饲养物上。细胞在包含含20％Knock-out Serum Replacement(Invitrogen)、1×非必需氨基酸(invitrogen)、8ng/ml bFGF、1mM L-谷氨酰胺和1mM 2-巯基乙醇溶液的DMEM-F12的ES细胞培养基中生长。7天后细胞达到60-70％融合，把定形内胚层流程应用于该细胞。特别地，每孔100ul添加含100ng/ml活化素A、10ng/ml Wnt3a和0.5％FBS的DMEM：F12培养基2天，随后用含100ng/ml活化素A和2％FBS的DMEM：F12培养基处理3天。然后用TrypLETM Express移去细胞并且通过FACS分析细胞的CXCR4、CD99和CD9表达(图9)。多于90％的细胞表达CXCR4和CD99。少于8％的细胞表达CD9，像期望的那样。如通过CXCR4阳性细胞数目确定的，在MEF饲养物上接种单个H1细胞改进了定形内胚层分化。
实施例12
在96孔板中分化hES单细胞
以簇传代hES细胞的一个常见困难是它们难以定量并且不以匀速生长。单细胞具有可以生长为融合的单细胞层并且可以在传代之前计数以为了实验目的确保相等接种的优点。这些属性是成功的筛选确认的先决条件。
把hES H9scp18以14,000细胞/cm2的密度接种进用1∶30生长因子减少的MATRIGELTM包被的Packard View 96孔板(Perkin-Elmer)。细胞在MEF条件培养基中生长3到4天然后使用DE分化流程处理。40孔的亚组用标准流程(含10ng/ml Wnt3a、100ng/ml活化素A和0.5％FBS的DMEM：F12，2天)处理。40孔的第二亚组用GSK3b抑制剂IX(100nM；EMDChemicals，La Jolla，CA)代替Wnt3a处理。这继之以用含100ng/ml活化素A和2％FBS的DMEM：F12处理两个亚组3天。在培养的最后，用4％多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟，用PBS洗涤3次，然后在100ul PBS中存储过夜。用0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich)在室温下透化处理细胞20分钟或者在4℃处理5分钟，然后用PBS洗涤3次并用含4％鸡血清(Invitrogen-Gibco，Carlesbad，CA)的PBS室温下封闭30分钟。稀释一级抗体(山羊抗hSox17(R&D Systems)并以1∶100稀释度添加到4％鸡血清中，室温下1hr。在PBS中1∶200稀释二级抗体，Alexa Fluor 488鸡抗山羊IgG(Invitrogen-Molecular Probes，Carlesbad，CA)并在用PBS洗涤3次之后加入到细胞。为了复染细胞核，把5μM Draq5(Alexis Platform，Switzerland)加入细胞，室温下5分钟。用PBS洗涤细胞一次并保留在100μl/孔PBS中用于成像以确定已分化的DE细胞数目。在IN Cell 1000分析器(GE Healthcare；Piscataway，NJ)上读取平板的孔到孔细胞数目定量和Sox17染色。用Wnt3a处理产生每孔最高数量的细胞核，在孔之间很少变异(图10)。用Gsk3β抑制剂处理显示弱的细胞成活力。明显地，Wnt3a处理允许单个ES细胞在96孔规格以稳固的和可再生的方式形成DE。
实施例13
使用hES单细胞的筛选试验
在证明单细胞适于96孔规格的接种和分化之后，确定了用新化合物处理的灵敏度。hES H9scp19以14,000细胞/cm2的密度接种进用1∶30生长因子减少的MATRIGELTM包被的96孔板中。细胞在MEF条件培养基中生长3-4天然后在DE分化实验中处理。以1或3μM的浓度一式三份地测试了总共13种新化合物，在DE分化流程中代替Wnt3a的小分子抑制剂。把包含Wnt3a(10ng/ml)或Gsk3b抑制剂IX(100nM)的孔用作阳性对照。所有分化孔用含单一化合物加上100ng/ml活化素A和0.5％FBS的DMEM：F12处理2天随后在没有化合物的情况下用含100ng/ml活化素A和2％FBS的DMEM：F12处理2天。在该流程的最后，如上面实施例11中描述的固定、透化处理、封闭和染色细胞以确定Sox 17表达和细胞核。然后在IN Cell 1000分析器上读取平板。该筛选表明在DE分化流程中H9scp21对13种化合物中的3种以类似于Wnt3a的方式作出反应(图11)。化合物A在1μM较低的剂量有效而化合物B和C在1和3μM两者都有效。在有效处理范围(大于60％Sox17阳性细胞)中，孔之间的标准差都是小的。因此，单细胞通过筛选技术鉴定新化合物的能力是稳定的。
实施例14
单个hES细胞在滚瓶中的扩增
为了易于规模扩大用于制造目的，hES细胞需要容易地扩增为大的数量。当前，胶原酶处理以传代hES细胞不适于在滚瓶或振荡器烧瓶中的扩大。重复地以单细胞扩增和生长的HES细胞具有均匀地粘附到不同表面的能力。在该实施例中，测试了滚瓶作为潜在的扩大容器。H9scp19以14,000细胞/cm2接种进1∶30减少的生长因子MATRIGELTM包被的480cm2滚瓶(6.7×106细胞；Corning，Acton，MA)。用每瓶100ml体积的MEF条件培养基来维持细胞，每2天更换。对于24hrs瓶设置为20rev/hr而对于剩余时间增至60rev/hr。经过4天评价期细胞均匀地粘附到滚瓶并且显著地扩增。使用TrypLETM Express移去细胞并计数。回收计数表明获得了每瓶13×106细胞，表明与原始接种相比发生了最少的细胞加倍。我们估计少于一半的最初接种的细胞附着到滚瓶，暗示在滚瓶中发生了更大的实际细胞扩增。这证明以单细胞传代的hES细胞可以在自动化滚瓶系统中扩增。将实施进一步的实验以确定随同多能性的维持一起的扩增率。
实施例15
单个hES细胞的转染
把DNA引入细胞以产生转基因细胞类型是有用的特征。DNA可以包含表达载体或报告基因以易于区别或允许细胞的选择。已经证明hES细胞难以在簇中转染。然而，hES单细胞可以更加适于转染技术。
用TrypLETM Express传代H9p33细胞并以20,000细胞/cm2接种到1∶30减少的生长因子MATRIGELTM包被的平板上。用胶原酶传代H9p33细胞并从一个6cm平板接种进用1∶30减少的生长因子MATRIGELTM包被的六孔板的一个孔。3天之后，用CMV-GFP转染细胞，其中GFP在CMV病毒启动子下在所有细胞中表达。特别地，在250μl Opti-MEM培养基中稀释2或4μg DNA并且在250μl Opti-MEM中加入8μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)。室温下5分钟之后合并混合物。在加入2ml MEF条件培养基中培养的细胞之前合并的试剂在室温下孵育20分钟。其后每24小时用MEF条件培养基替换培养基。3天之后，用4％多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟然后用PBS洗涤两次并在PBS中4℃保存过夜。为了复染细胞核，把5μM Draq5(Alexis Platform)加入细胞，室温下5分钟。用PBS洗涤细胞一次并保存在1ml/孔PBS中用于在IN Cell 1000分析器上成像以确定转染效率(图12)。HES单细胞在转染效率上显示出为hES簇两倍的改进。因此，hES单细胞具有改进的转染能力并且更容易遗传修饰。随着最佳化，也许使用其它转染方法或试剂，可能实现单细胞ES细胞转染更加引人注目的改进。
实施例16
在饲养细胞层上培养的hES细胞簇转变为在细胞外基质上培养的单个hES细胞需要除去饲养细胞
使用酶，例如胰蛋白酶、重组胰蛋白酶(TrypLETM)或AccutaseTM(无脊椎动物来源的胰蛋白酶样酶)的哺乳动物细胞传代是当前在研究和生产装置中原代和永生化细胞系两者细胞培养的标准。这些酶产生同质的单细胞悬浮液，其可以以适于在高通量规格384孔板或多升规模可变的(scaleable)培养容器的多种装置中平板接种的可重复的方式计数、分析、操作和传代。
考虑到单细胞传代的明显优点，对开发以单细胞传代人类胚胎干细胞的方法有相当大的兴趣。然而，当前最好的使用人类胚胎干细胞的实际操作要求细胞通过手动破裂或使用维持胚胎细胞簇的酶(胶原酶或中性蛋白酶)传代来以簇传代。在这个领域过去的研究已经产生了可以在饲养物(Cellartis SCEDTM461系)上以单细胞传代的细胞的产生，或使用AccutaseTM从胶原酶传代的簇到MATRIGELTM上的单细胞的单细胞的产生(R.Bajpai etal.，2008)。
在此是开发单细胞传代方法以使用TrypLETM或AccutaseTM在成批传代方法中把hES细胞直接从饲养物带到matrigel的尝试。结果表明使用TrypLETM或AccutaseTM成批传代把基于簇形式饲养物的传代的hES细胞直接带到MATRIGELTM而没有MATRIGELTM上基于簇的胶原酶传代的中间步骤是无效的，这归因于已分化细胞群的出现，因此较少可能产生同质的和稳固的hES细胞培养物。
结果
努力把hES细胞从基于饲养物的培养转移到无饲养物的培养，我们传代了已经在hESC培养基中由MEF饲养层支持并在六孔板的10cm2孔上生长了5天的H1第37代hES细胞。细胞使用TrypLETM、AccutaseTM或1mg/ml的胶原酶传代。
在添加酶到细胞之前，我们吸出了耗费的培养基，添加1ml PBS(无Ca2+，或Mg2+)到每个孔，吸出，然后添加1ml室温的酶(胶原酶、AccutaseTM或TrypLETM)。AccutaseTM或TrypLETM达到室温之后以存储浓度使用。胶原酶从-80℃冰箱移出，解冻，与9ml DMEM/F12混合，无菌过滤，并在使用之前达到室温。
37℃下在酶中孵育细胞10min。10分钟的处理之后AccutaseTM或TrypLETM使所有细胞完全从皿中升起(lift)。10分钟的孵育之后胶原酶没有升起细胞，因此在10分钟的孵育之后使用10ml玻璃吸量管刮擦细胞。把含2％Probumin的1ml DMEM-F12加入每个孔并将孔中合并的总体积转入50ml无菌锥形管，确保升起和悬浮尽可能多的细胞。
以200×g离心细胞5分钟随后另外用2％Probumin洗涤和以200×g离心5分钟。然后在MEF条件培养基中重悬浮细胞并以1比3.5的比例平板接种到MATRIGELTM(在DMEM中1∶30稀释)包被的T25烧瓶上，然后置于37℃，5％CO2的湿润孵育箱中。
通过使用改进的Neubauer血细胞计数器计数来计算细胞数量。用AccutaseTM升起的细胞具有3.8百万细胞/10cm2孔的密度。用TrypLETM升起的细胞具有3.7百万细胞/10cm2孔的密度。由于集落形式胶原酶不能通过血细胞计数器计数。考虑到1比3.5的分流比，我们以2.72百万细胞/T25烧瓶或108,000细胞/cm2的接种密度平板接种Accutase处理的细胞，以2.65百万细胞/T25烧瓶或105,000细胞/cm2的接种密度平板接种TrypLETM处理的细胞。我们假定以相似的密度(105,000至108,000细胞/cm2)接种胶原酶处理的孔，因为在酶处理之前孔与孔之间hES密度没有看得出的差异。一个另外的烧瓶用胶原酶升起的细胞平板接种以用于在下次传代中计数的目的。
每日更换补充有16μg/ml bFGF的MEF条件培养基维持细胞4天。培养4天之后培养物融合，并且单细胞处理的hES细胞形成了具有偶见成纤维细胞区块(pocket)的hES细胞单细胞层，而簇传代的hES细胞形成大的集落形式簇的hES细胞(图13)。然后这些细胞再次传代。
如先前描述的，37℃下在酶中孵育细胞10min。10分钟的处理之后AccutaseTM或TrypLETM使细胞从塑料和MATRIGELTM中升起。胶原酶没有升起细胞，因此细胞在37℃进一步孵育总计45分钟。用AccutaseTM升起另外的胶原酶烧瓶。然后用改进的Neubauer血细胞计数器计数单细胞。
酶孵育之后把含2％Probumin的2ml DMEM-F12加入每个烧瓶，从烧瓶中上下吸取总体积(～4ml)5-10次以便悬浮尽可能多的细胞。然后把悬浮液转入50ml锥形管并以200×g离心5min。然后在补充有16μg/ml bFGF的MEF条件培养基中重悬浮细胞，然后以1∶4的比例平板接种到用1∶30 MATRIGELTM预包被的T25烧瓶。
AccutaseTM传代的细胞培养4天之后具有总计5.6百万细胞(223,000细胞/cm2)的密度，TrypLETM传代的细胞培养4天之后具有总计5.05百万细胞(202,000细胞/cm2)的密度，而胶原酶传代的细胞培养4天之后具有总计3.45百万细胞(138,000细胞/cm2)的密度。考虑到细胞以1∶4的比例传代，对于AccutaseTM传代以58,000细胞/cm2的密度平板接种细胞，对于TrypLETM传代是51,000细胞/cm2，和35,000细胞/cm2。
然后生长细胞另外6天，每日更换补充有16ng/ml bFGF的MEF条件培养基。用胶原酶传代的细胞形成密集的同质细胞的大的集落并且已分化的/成纤维细胞样细胞是稀少的，而用AccutaseTM或TrypLETM传代的细胞生长非常缓慢，随着时间停止生长或长满可能由分化中的hES细胞形成的成纤维细胞样细胞(图14)。
这些结果暗示从饲养物到无饲养物(MATRIGELTM)培养转换的使用手动传代或支持簇形式传代的酶(胶原酶或中性蛋白酶)的中间阶段对使细胞在启动单细胞传代之前适应MATRIGELTM上的无饲养物培养是最好的。
遍及本文件引用的出版物在此通过引用全文并入。尽管本发明的多个方面已经在上面通过参考实施例和优选方案说明了，将理解本发明的范围不是通过上述说明而是通过在专利法的原理下适当解释的下列权利要求限定。
表1：细胞释放酶组
酶 细胞数目(105)
胶原酶 3.5
TRYPLE SELECT 3.15
TRYPLE EXPRESS 2.6
TRYPSIN/EDTA 0.7
TRYPSIN 0.1
表II：hESC的酶传代的时程
酶 2分钟(105) 10分钟(105)
TRYPLE EXPRESS 2.1 1.3
TRYPLE SELECT 0.75 1.7
表IIIA：用于FACS和免疫印迹分析的原始抗体清单
表IIIB：用于FACS和免疫印迹分析的第二缀合抗体清单

Claims (15)

1.一种用于将作为单细胞的多能干细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征标记的细胞的方法，包括下列步骤：
a.成簇培养多能干细胞，
b.释放该多能干细胞为单细胞，
c.平板接种该单个多能干细胞到组织培养基质上，和
d.分化该单个多能干细胞，
其中，该多能干细胞通过用选自重组胰蛋白酶、TrypLETM SELECT和TrypLETM EXPRESS的酶处理而释放为单细胞，并且该组织培养基质选自作为来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶制剂的MATRIGELTM、纤连蛋白、层粘连蛋白、人血清和胶原；并且
其中所述多能干细胞为已经建立的胚胎干细胞系。
2.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用0.5g/l至2.5g/l浓度的酶处理而释放为单细胞。
3.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用2.5g/l浓度的酶处理而释放为单细胞。
4.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用酶处理2至5分钟而释放为单细胞。
5.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用酶处理5分钟而释放为单细胞。
6.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用1×至0.001×浓度的TrypLETM EXPRESS处理而释放为单细胞。
7.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用1×浓度的TrypLETM EXPRESS处理而释放为单细胞。
8.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用TrypLETM EXPRESS处理2至5分钟而释放为单细胞。
9.权利要求1的方法，其中该多能干细胞通过用TrypLETM EXPRESS处理5分钟而释放为单细胞。
10.权利要求1的方法，其中MATRIGELTM以1∶30至1∶10的稀释度使用。
11.权利要求10的方法，其中MATRIGELTM以1∶10的稀释度使用。
12.权利要求1的方法，其中该组织培养基质是生长因子减少的MATRIGELTM。
13.权利要求12的方法，其中生长因子减少的MATRIGELTM以1∶30至1∶10的稀释度使用。
14.权利要求12的方法，其中生长因子减少的MATRIGELTM以1∶30的稀释度使用。
15.权利要求14的方法，其中该已经建立的胚胎干细胞系是人的。
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