KR101732952B1

KR101732952B1 - 단일 다분화성 줄기 세포 배양

Info

Publication number: KR101732952B1
Application number: KR1020107001915A
Authority: KR
Inventors: 쉘리 넬슨
Original assignee: 라이프스캔, 인코포레이티드
Priority date: 2007-07-01
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2017-05-08
Also published as: MX2010000348A; RU2010103046A; EP3192865A1; JP2010532172A; PL2173862T3; WO2009006399A1; EP2173862B1; KR20160054032A; CN101978044B; WO2009006399A9; CN104250632A; EP2559756A1; EP2559756B1; ES2626656T3; CA2691975C; CN104250632B; RU2473687C2; ZA201000715B; EP3192865B1; DK3192865T3

Abstract

본 발명은 다분화성 줄기 세포 배양 분야 및 산업적 수준으로 다분화성 줄기 세포 배양을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

Description

단일 다분화성 줄기 세포 배양{Single pluripotent stem cell culture}

본 발명은 다분화성 줄기 세포 배양 및 산업적 수준으로 다분화성 줄기 세포 배양을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

다분화성 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포는 모든 성인 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖고 있다. 이와 같이, 배아 줄기 세포는 질환, 감염 또는 선천적인 이상 때문에 손상된 기관에 대한 대용 세포 및 조직의 공급원일 수 있다. 배아 줄기 세포가 대용 세포 공급원으로서 사용되기 위한 잠재력은 시험관내에서 당해 세포의 다분화성을 유지하면서 세포를 증식시키기 어려워 제한된다.

비분화된 배아 줄기 세포를 배양하는 현존의 방법은 복합적인 배양 조건을 필요로 하는데 예를 들어, 배아 줄기 세포는 영양 공급 세포(feeder cell) 층의 존재하에 배양한다. 또는, 영양 공급 세포 배양에 노출시킴에 의해 수득된 배지를 사용하여 배아 줄기 세포를 배양할 수 있다. 당해 방법을 사용하는 배양 시스템은 흔히 배양되는 줄기 세포 종과는 상이한 종으로부터 수득된 세포(이종 세포)를 사용한다. 추가로, 이들 배양 시스템은 동물 혈청이 보충될 수 있다.

예를 들어, 문헌[참조: Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)) 및 Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147)]은 마우스 배아 섬유아세포 영양 공급 세포 층을 사용하는 사람 배반포 기원의 배아 줄기 세포주의 배양을 기재하고 있다.

또 다른 예에서, WO2005014799는 포유동물 세포의 유지, 증식 및 분화를 위해 조건화된 배지를 기재하고 있다. WO2005014799는 "본 발명에 따라 제조된 배양 배지는 쥐 세포, 특히 MMH(Met 쥐 간세포)로 명명된 분화되고 불멸화된 유전자전이성 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조건화된다"고 기재하고 있다.

그러나, 이종 세포 또는 이종 세포 생성물의 사용은 당해 방법에 의해 생성된 수득한 배아 줄기 세포 집단이 면역원성의 바이러스 및/또는 이종 단백질로 오염될 위험을 증가시킨다.

문헌[참조: Richards et al, (Stem Cells 21 : 546-556, 2003)]은 사람 배아 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 특정 패널의 11개의 상이한 사람 성인, 태아 및 신생아 영양 공급 세포 층을 평가하였다. 문헌[Richards et al]은 "성인 피부 영양 공급 섬유아세포상에서 배양된 사람 배아 줄기 세포주는 사람 배아 줄기 세포 형태를 유지하고 다분화성을 보유하고 있다"라고 기재하고 있다.

US6642048은 영양 공급 세포 부재 배양에서 영장류 다분화성 줄기(pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 당해 배지의 제조를 위해 유용한 세포주를 기재하고 있다. US6642048은 "본 발명은 배아 조직으로 부터 수득되거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 간엽 및 섬유아세포형 세포주를 포함한다. 당해 세포주를 유도하고 배지를 프로세싱하고 조건화된 배지를 사용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법은 본 문헌에 기재되고 설명되어 있다"라고 기재하고 있다.

US20020072117은 영양 공급 세포 부재 배양에서 영장류 다분화성 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성시키는 세포주를 기재하고 있다. 사용된 세포주는 배아 조직으로부터 수득되거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 간엽 및 섬유아세포형 세포주이다. US20020072117은 또한 1차 영양 공급 세포층으로서의 당해 세포주의 용도를 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005)]은 사람 배아 줄기 세포로부터 유도된 영양 공급 세포층상의 사람 배아 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004)]은 사람 텔로머라제 역전사효소를 과발현하도록 유전학적으로 변형된 사람 배아 줄기 세포 유도체로부터 수득된 조건화된 배지를 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005)]은 사람 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 공급 세포 시스템을 기재하고 있다.

추가의 예에서, 문헌[참조: Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004)]은 사람 태반으로부터 수득된 영양 공급 세포 공급원을 기재하고 있다.

문헌[참조: Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003)]은 사람 포피로부터 유래된 영양 공급 세포 층을 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Inzunza et al (Stem Cells 23 : 544-549, 2005)]은 사람 출생후 포피 섬유아세포 기원의 영양 공급 세포층을 기재하고 있다.

또 다른 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진시킬 수 있는 성장 인자가 보충된 무혈청 배지를 사용한다. 예를 들어, 문헌[참조: Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005)]은 영양 공급 세포 부재, 무혈청 배양 시스템을 기재하고 있고 당해 시스템에서 배아 줄기 세포는 배아 줄기 세포 자가 재생산을 유발할 수 있는 여러 성장 인자가 보충된 비조건화된 혈청 대용(SR) 배지에서 유지된다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006)]은 섬유아세포 또는 조건화된 배지의 부재하에 bFGF가 보충된 배지를 사용하여 사람 배아 줄기 세포를 장기 배양하는 방법을 기재하고 있다.

또 다른 예에서, US20050148070는 혈청 및 영양 공급 섬유아세포의 부재하에 합성 배지에서 사람 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 기재하고 있고, 당해 방법은 줄기 세포를, 알부민, 아미노산, 비타민, 무기물, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대용물, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대용물을 함유하는 배양 배지, 포유동물 태아 혈청이 필수적으로 부재인 배양 배지 및 섬유아세포 성장 인자 시그날 전달 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자 약 100ng/ml 이상을 함유하는 배양 배지에서 줄기세포를 배양함을 포함하고, 이때, 당해 성장 인자는 영양 공급 섬유아세포 층 이외의 공급원으로부터 공급되고 당해 배지는 영양 공급 세포 또는 조건화된 배지 부재하에 비분화된 상태의 줄기 세포의 증식을 지지한다.

또 다른 예에서, US20050233446은 비분화된 영장류 원시 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포를 배양하는데 유용한 합성 배지를 기재하고 있다. 용액중에서, 당해 배지는 배양된 줄기 세포와 비교하여 실질적으로 등장성이다. 소정의 배양에서, 특정 배지는 기본 배지 및 실질적으로 비분화된 원시 줄기 세포의 성장을 지지하는데 필요한 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각의 양을 포함한다.

또 다른 예에서, US6800480은 "하나의 양태에서, 실질적으로 비분화된 상태의 영장류 유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되고 당해 배양 배지는 영장류 유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하는데 효과적인 저 삼투압성 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류 유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하는데 효과적인 영양 혈청 및 영양 공급 세포 및 영양 공급 세포 유래의 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기질과 배합된다. 당해 배지는 비-필수 아미노산, 산화방지제 및 뉴클레오사이드 및 피루베이트 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다"라고 기재하고 있다.

또 다른 예에서, US20050244962는 "하나의 측면에서, 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 포유동물 태아 혈청이 필수적으로 부재인 배양물(바람직하게는 또한 임의의 동물 혈청이 부재인 배양물)에서 영양 공급 섬유아세포 층 이외의 공급원으로부터 공급되는 섬유아세포 성장 인자의 존재하에 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에 줄기 세포 배양을 유지하기 위해 요구되는 영양 공급 섬유아세포 층은 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가로 불필요해 진다"라고 기재하고 있다.

추가의 예에서, WO2005065354는 필수적으로 영양 공급 세포 및 혈청 부재인 등장성 합성 배양 배지를 기재하고 있고 당해 배지는 a) 기본 배지; b) 실질적으로 비분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c) 실질적으로 비분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d) 실질적으로 비분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.

또 다른 예에서, WO2005086845는 비분화된 줄기 세포의 유지 방법을 기재하고 있고 당해 방법은 줄기 세포를, 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 비분화된 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양으로 전환 성장 인자-베타(TGFβ) 계열의 단백질 구성원, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 계열의 단백질 구성원 또는 니코틴아미드(NIC)에 노출시킴을 포함한다.

배아 줄기 세포는 연구 및 약물 스크리닝을 위한 잠재적 재원을 제공한다. 현재, 사람 ES 세포주의 대량 배양은 문제가 되고 있고 상당한 도전 과제이다. 당해 도전 과제에 대한 가능한 해결책은 사람 배아 줄기 세포를 단일 세포로서 계대하고 배양하는 것이다. 단일 세포는 표준 조직 배양 기술, 예를 들어, 계수, 형질감염 등에 보다 잘 적용될 수 있다.

예를 들어, 문헌[참조: Nicolas et al, Stem Cells and Development (2007), 16(1), 109-118]은 렌티바이러스 벡터에 의한 유전자 변형 후 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 분리된 단일 세포로부터 hES 세포주를 생성시키고 성장시키는 방법을 제공한다.

또 다른 예에서, US 특허원 US2005158852는 단일 사람 배아 줄기 세포의 성장 및 생존을 개선시키기 위한 방법을 기재하고 있다. 당해 방법은 단일 비분화된 HES 세포를 수득하는 단계; 단일 비분화된 세포를 세포외 매트릭스(ECM)와 혼합하여 세포를 포집시키는 단계 및 당해 혼합물을 성장 환경에서 영양 배지와 함께 영양 공급 세포상으로 접종하는 단계를 포함한다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Sidhu, KS et al (Stem Cells Dev. 2006 Feb; 15(l):61-9)]은 유동 세포 측정에 의한 단일 세포 제제의 분류에 의해 모주 hES3로부터 유래된 3개의 사람 배아 줄기 세포(hESC) 클론인 hES 3.1, 3.2 및 3.3을 최초로 보고하였다. 세포 분류 전후 단일 세포 제제의 생존성은 98% 초과로 유지되었다.

그러나, 단일 세포로서 사람 배아 줄기 세포의 계대 및 배양은 유전학적 비정상 및 다분화성의 상실을 유발한다. 배양 조건은 다분화성 및 유전학적 안정성을 유지하는데 중요하다. 일반적으로, hES 세포주의 계대는 물리적으로 수행되거나 콜라게나제, 리베라제 또는 디스파제와 같은 효소 제제를 사용하여 수행된다.

예를 들어, 문헌[Draper JS et al., Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(l):53-4. Epub 2003 Dec 7]은 5개의 독립적인 경우상에서 3개의 독립적인 사람 배아 줄기 세포주에서 염색체 17q가 획득됨을 포함하는 핵형 변이의 존재를 주지시킨다.

또 다른 에에서, 문헌[Buzzard et al., Nat Biotechnol. 2004 Apr;22(4):381-2; author reply 382]은 "본 발명자는 단지 하나의 핵형 변화 이벤트를 검출하였고..., 사용되는 배양 방법은 본 발명자의 결과와 약간의 관련성을 가질 수 있지만 단 본 발명자의 방법은 대부분의 다른 그룹에 의해 사용된 것들과는 명백히 상이하다. 전형적으로 본 발명자는 절단된 피펫의 말단으로 콜로니를 먼저 절개함에 의해 7일 후 사람 ES 세포를 계대하고... 세포 해리에 대한 어떠한 효소적 방법 또는 화학적 방법도 당해 방법으로 혼입되지 않는다. 본 발명자는 이것이 직접 hES 세포의 상대적인 세포유전학적 회복력을 설명할 수 있을 것으로 고려한다"라고 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Mitalipova MM et al, Nat Biotechnol. 2005 Jan;23(l):19-20]은 "대량 계대 방법...이 확대된 계대 배양 후 이수체 세포 집단을 영속시킬 수 있지만 핵형을 손상시키지 않고 보다 짧은 기간(적어도 15회 이하의 계대) 동안 사용될 수 있으며... 장기 매뉴얼 증식 조건에 이어서 매뉴얼 계대 방법 단독으로 제공될 수 있는 보다 더 큰 양의 hES 세포를 요구하는 실험에서 제한된 대량 계대에 의해 hES 세포에서 정상적인 핵형을 유지할 수 있다"라고 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Heng BC et al, Biotechnology and Applied Biochemistry (2007), 47(1), 33-37]은 "당해 결과는 제2 프로토콜(약한 피펫팅과 함께 트립신 처리)이 제1 프로토콜(스크래칭과 함께 콜라게나제 처리)보다 세포 생존성에 훨씬 덜 해롭다는 것을 입증하였다. 이것은 또한 보다 높은 동결-해동 생존율을 의미한다"라고 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Hasegawa K. et al, Stem Cells. 2006 Dec;24(12):2649-60. Epub 2006 Aug 24]은 "본 발명자는 완전한 해리에 내성인 hESC 서브라인을 확립하였다. 이들 세포는 재분주 효율(replating efficiency) 및 또한 높은 클로닝 효율을 나타내며 이들은 3개의 생식 층으로 분화하는 능력을 유지한다"라고 기재하고 있다.

[요약]

본 발명은 효소를 사용하여, 단일 세포로 방출된 다분화성 줄기 세포의 유지, 계대 및 분화를 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 다분화성에 대한 후속 손실 없이 및 비정상적인 염색체의 획득 없이 단일 세포로서 방출된 다분화성 줄기 세포의 유지, 계대 및 분화를 위한 방법을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은,

a) 클러스터(cluster)로서 다분화성 줄기 세포를 배양하는 단계,

b) 단일 세포로서 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계,

c) 단일 다분화성 줄기 세포를 조직 배양 기질상에 분주하는 단계 및

d) 세포를 분화시키는 단계를 포함하는, 다분화성 줄기 세포를 분화시키기 위한 방법을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은,

a) 다분화성 줄기 세포를 수득하는 단계,

b) 단일 세포로서 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계 및

c) 단일 다분화성 줄기 세포를 조직 배양 기질상에 분주하는 단계를 포함하는, 다분화성 줄기 세포를 유지시키는 방법을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은,

a) 다분화성 줄기 세포의 클러스터를 수득하는 단계,

b) 단일 세포로서 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계,

c) 단일 다분화성 줄기 세포를 조직 배양 기질상에 분주하는 단계,

d) 단일 다분화성 줄기 세포가 성장되도록 방치하는 단계,

e) 단일 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계 및

f) 단일 다분화성 줄기 세포를 새로운 조직 배양 기질상에 분주하는 단계를 포함하는, 다분화성 줄기 세포를 계대시키기 위한 방법을 제공한다.

도 1: MEF-조건화된 배지중에 1:30 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM상에서 성장한 H9ccp33 사람 ES 세포를 4x 확대한 이미지.
도 2: 완성내배엽을 유도하도록 분화 처리한 후 CXCR4를 발현하는 세포의 %. 암회색: 계대 45와 55 사이에서 H1 세포 클러스터(H1 cc)를 사용한 6회 DE 분화 실험의 평균값. 흑색: 계대 47 및 54에서 H1 단일 세포(H1 sc)를 사용한 2회 DE 분화 실험의 평균값. 백색: 계대 37과 55사이에서 H9 세포 클러스터(H9 cc)를 사용한 DE 분화 실험의 평균값. 밝은 회색: 계대 36과 48 사이에서 H9 단일 세포(H9 sc)를 사용한 3회 DE 분화 실험의 평균값. 오차 막대는 반복 실험의 표준 편차를 나타낸다.
도 3: 췌장 내분비 분화 프로토콜의 14일 또는 17일에 노출 후 실시간 PCR에 의한 유전자 발현의 분석. A. 계대 37에서 H9 단일 세포 및 세포 클러스터가 분석되었다. B. H1 p47 및 H9 p37 세포 클러스터 및 단일 세포의 췌장 내배엽 단계로의 진행. 14일 및 17일 후 Pdx1 발현. 비처리된 세포에 대한 지시 마커를 위한 유전자 발현이 각각의 데이터 세트에 대해 하나의 값으로 설정되었다.
도 4: 이미지는 MEF 조건화된 배지중에 1:30 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM상에서 성장한 H9scp22 사람 ES 단일 세포를 4x 확대한 것을 보여준다.
도 5: hES 세포의 다분화성 마커 발현에 대한 FACS에 의한 평가. 지시 마커에 대해 양성인 세포의 %는 X-축상에 열거한다.
도 6: 클러스터로서 38회 계대에 이어서 단일 세포로서 20회 계대에서 H9 hES 단일 세포의 염색체 전개.
도 7: 완성내배엽 분화 동안에 H9 단일 세포 및 세포 클러스터의 비교. CXCR4에 대해 양성인 세포의 %는 세포가 완성내배엽 분화 프로토콜에 노출된 후 나타낸다. H9sc-p의 경우 N=2 및 H9cc의 경우 N=5. 오차 막대는 반복 실험에 대한 평균값에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 8: H9 단일 세포(22회 계대)가 분화된 후 췌장 내배엽 마커의 증가. 실시간 PCR에 의한 유전자 발현의 분석은 췌장 내분비 분화의 11일, 14일 또는 17일 후에 나타낸다. 14일 및 17일에 대한 값은 6개 웰 플레이트으로부터의 2개의 웰의 평균값이다.
도 9: hES 단일 세포는 MEF상에서 분화될 수 있다. MEF 영양 공급 세포상에서 성장하고 완성내배엽으로 분화된 H1scp4 세포로부터의 FACS 결과. 완성내배엽 마커 CXCR4 (CD 184)는 비분화된 세포에서 0%인 것에 비해 세포의 89%에서 발현된다(도 5 참조).
도 10: hES 단일 세포(H9scp18)는 96웰 포맷에서 완성내배엽으로 분화될 수 있다. Sox17 양성 검출을 위한 면역형광 데이터를 나타낸다. 8개의 웰을 실험 진행 동안 MEF 조건화된 배지(MEF 배지)로 처리하였다. 8개의 웰을 성분 없이(화합물 부재) 기본 분화 배지로 처리하였다. 8개 웰의 반복 데이터 세트를 각각의 데이터 바를 위해 평균치를 계산하였다. 총 40개의 웰을 각각 Wnt3a 또는 Gsk3b 억제제로 처리하고 각각의 데이터 세트를 위해 평균치를 계산하였다. 오차 막대는 각각의 반복 세트에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 11: hES 단일 세포(H9scp19)를 사용한 약물작용발생단 스크리닝. 총 13회의 실험적 소분자 화합물은 완성내배엽 분화 프로토콜에서 이들이 Wnt3a를 대체할 능력에 대해 서험되었다. 3개의 효과적인 화합물을 나타낸다. 당해 데이터 세트는 2개 이상의 웰에서 Sox17 양성 세포의 평균값을 나타낸다. MEF-조건화된 배지 또는 기본 배지로 처리된 세포는 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 12: H9p33 hES 세포 클러스터와 단일 세포간의 형질감염 효율의 평가. CMV-GFP는 8㎕의 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlesbad, CA) 및 4 또는 8㎍의 DNA를 사용하여 세포로 형질감염시켰다(각각 검정 및 회색 막대).
도 13: MEF상에서 성장하고 이어서 클러스터 또는 단일 세포로서 MATRIGEL^TM로 계대된 H1 hES 세포의 상 마이크로그래프. 콜라게나제를 사용하여 MEF로부터 MATRIGEL^TM로 계대된 37회 계대 H1 hES 세포는 구분되는 매우 촘촘한 콜로니를 형성하고 일부는 느슨한 분화된 세포를 갖는다. Accutase^TM 또는 TrypLE^TM을 사용하여 1회 계대된 H1 hES 세포는 매우 촘촘한 분화된 세포의 포켓을 갖는 단층 배양물을 형성한다.
도 14: MEFS로부터 MATRIGEL^TM로 직접 단일 세포로서 계대된 H1 hES 세포는 자발적으로 분화한다. 패널 A: Accutase^TM를 사용하여 MEF로부터 MATRIGEL^TM로 2회 계대한 후 집단에 잔류하는 세포의 %. 패널 B: Accutase^TM를 사용하여 MEF로부터 MATRIGEL^TM로 2회 계대한 후 hES 세포에서의 다분화성 및 분화 마커의 발현. 패널 C: Accutase^TM을 사용하여 MEF로부터 MATRIGEL^TM으로 2회 계대한 후 H1 hES 세포의 상 마이크로그래프.

제한되지 않으면서 기재된 내용을 명백히하기 위해 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특징, 양태 또는 적용을 기술하거나 설명하는 하기의 서브섹션으로 나눈다.

정의

줄기 세포는 비분화된 세포로서 자가-재생산하고 분화하여 후손 세포를 생성하는 단일 세포 수준에서의 이들의 능력에 의해 정의되고 자가 재생산 선조체, 재생산 하지 못하는 선조체 및 말단 분화된 세포를 포함한다. 줄기 세포는 또한 시험관내에서 다중 생식 층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로 다양한 세포 계열의 기능성 세포로 분화하는 이들의 능력 및 이식후 다중 생식 층의 조직을 생성하고 배반포로 주입 후 모두는 아니지만 실질적으로 대부분 조직에 기여하는 이들의 능력을 특징으로 한다.

줄기 세포는 이들의 개발 잠재력에 따라 다음과 같이 분류된다: (1) 모든 배야 세포 유형 및 배외 세포 유형을 생성시킬 수 있음을 의미하는 분화전능(totipotent); (2) 모든 배아 세포 유형을 생성시킬 수 있음을 의미하는 다분화성; (3) 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템내에서 특정 서브세트의 세포 계열을 생성시킬 수 있음을 의미하는 다능성(multipotent)(예를 들어, 조혈 줄기 세포(HSC)는 혈액의 정상적인 성분인 HSC(자가-재생산), 혈액 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 선조체 및 모든 세포 유형 및 성분(예를 들어 혈소판)을 포함하는 후손 세포를 생성할 수 있다); (4) 다능성 줄기 세포 보다 제한된 서브세트의 세포 계열을 생성할 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계열(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)를 생성할 수 있음을 의미하는 단분화능.

분화는 비특수화("중립성")되거나 덜 특수화된 세포가, 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화되거나 분화 유도된 세포는 세포 계열내에서 보다 특수화된 ("편향성") 위치에 취해진 세포이다. 당해 용어 "편향성"은 분화 과정에 적용되는 경우 정상적인 상황하에서 특정 세포 유형 또는 서브세트의 세포 유형으로 분화를 계속할 지점의 분화 경로에서 진행하지만 정상적인 상황하에서 상이한 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 회귀할 수 없는 세포를 언급한다. 탈분화는 세포 계열내에서 세포가 덜 특수화된(또는 편향된) 위치로 회귀하는 과정을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포의 계열은 세포의 유전적 형질을 정의하는데, 즉 세포가 어디로부터 유래되고 어떠한 세포를 생성시킬 수 있는지에 대한 것을 정의한다. 세포의 계열은 발생 및 분화의 유전적 구성내에 세포를 위치시킨다. 계열 특이적 마커는 목적하는 계열의 세포 표현형과 특이적으로 연관된 특성을 언급하고 중립성 세포의 목적하는 계열로의 분화를 평가하기 위해 사용될 수 있다.

다양한 용어가 배양물내 세포를 기재하는데 사용된다. "유지"는 일반적으로 세포 성장 및/또는 분열을 촉진시키는 조건하에서, 보다 큰 세포 집단을 유발하거나 유발할 수 없는 성장 배지에 위치된 세포를 언급한다. "계대"는 하나의 배양 용기로부터 세포를 제거하고 이들을 세포 성장 및/또는 분열 촉진시키는 조건하에서 제2 배양 용기에 위치시키는 과정을 언급한다.

특정 세포 집단 또는 세포주는 때로는 이것이 계대된 횟수로서 언급되거나 특징화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 언급될 수 있다. 1차 배양물, 즉 조직으로부터 세포 분리 후 제1 배양물은 P0로서 지정된다. 제1 계대배양 후, 세포는 2차 배양물(P1 또는 1회 계대)으로서 기재된다. 제2 계대배양 후, 당해 세포는 3차 배양물(P2 또는 2회 계대) 등이 된다. 계대 기간 동안에 많은 집단이 배가될 수 있고 따라서 배양물 집단의 배가수는 계대수보다 크다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 계대 사이의 기간 동안에 세포의 증식(즉, 집단수 배가)은 많은 인자에 따라 다양하고 이는 분주 밀도, 기질, 배지, 성장 조건 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이 "AFP" 또는 "알파-태아단백질 단백질"은 간 발생 개시 시점에서 생성된 항원을 언급한다. AFP는 또한 배외 세포에서 평가될 수 있다.

"β-세포 계열"은 전사 인자 PDX-1 및 하기의 전사 인자중 하나 이상에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 언급한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 세포 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "브라키우리(Brachyury)"는 T-박스 유전자 계열 구성원이다. 이것은 원시선(primitive streak) 및 중배엽 세포를 위한 마커이다.

본원에 사용된 바와 같은 "완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커중 하나 이상을 발현하는 세포를 언급한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, 브라키우리, 혼합형 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중배엽 세포 및 완성내배엽 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "CD99"는 등록번호 NM_002414의 유전자에 의해 암호화된 단백질을 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 "췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커중 하나 이상을 발현하는 세포를 언급한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 하기의 마커중 하나 이상을 발현하는 세포를 언급한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포 및 췌장 호르몬 분비 세포 및 β-세포 계열의 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "CXCR4"은 또한 "LESTR" 또는 "fusin"으로서도 공지된 기질 세포 유래 인자 1(SDF-1) 수용체를 언급한다. 장배 형성 마우스 배아에서, CXCR4는 완성내배엽 및 중배엽에서 발현되지만 배외 내배엽에서는 발현되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 "완성내배엽"은 장배 형성 동안에 낭배 외피로부터 발생하는 세포의 특징을 갖고 위장관 및 이의 유도체를 형성하는 세포를 언급한다. 완성내배엽 세포는 하기의 마커를 발현한다: CXCR4, HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스, OTX2, 구세코이드, c-Kit, CD99, 및 Mixl1.

본원에 사용된 바와 같은 "배외 내배엽"은 하기의 마커중 하나 이상을 발현하는 세포 집단을 언급한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.

"GATA-4" 및 "GATA-6"은 GATA 전사 인자 계열의 구성원이다. 당해 계열의 전사 인자는 TGF-β 시그날리간드에 의해 유도되고 조기 내배엽 마커의 유지에 기여한다.

본원에 사용된 바와 같은 "GLUT-2"는 다수의 태아 및 성인 조직(췌장, 간, 장, 뇌 및 신장을 포함함)에서 발현된 글루코스 수송 분자를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 "구세코이드(Goosecoid)" 또는 "GSC"는 원구의 원구배순에서 발현되는 호메오도메인 전사 인자를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 "Islet-1" 또는 "Isl-1"은 전사 인자의 LIM/호메오도메인 계열의 구성원이고 발생하는 췌장에서 발현된다.

본원에 사용된 바와 같은 "MafA"는 췌장에서 발현된 전사 인자이고 인슐린 생합성 및 분비에 관여하는 유전자의 발현을 조절한다.

본원에 사용된 바와 같은 "마커"는 목적하는 세포에서 상이하게 발현되는 핵산 또는 폴리펩타이드 분자이다. 당해 내용에서, 차등 발현은 양성 마커에 대해 증가된 수준 및 음성 마커에 대해 감소된 수준을 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩타이드의 검출가능한 수준은 기타 세포와 비교하여 목적하는 세포에서 충분히 보다 높거나 낮아서 목적하는 세포는 당업계에 공지된 다양한 임의의 방법을 사용하여 동정될 수 있고 기타 세포와 구분될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "중배엽 세포"는 하기의 마커중 하나 이상을 발현하는 세포를 언급한다: CD48, 에오메소더민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.

본원에 사용된 바와 같은 "Nodal"은 TFG 베타 슈퍼패밀리 단백질의 구성원이다.

"Oct-4"는 POU-도메인 전사 인자의 구성원이고 널리 다분화성 줄기 세포의 홀마크로서 간주된다. Oct-4와 다분화성 줄기 세포의 관계는 비분화된 다분화성 줄기 세포에 대해 매우 제한된 발현에 의해 나타난다. 체세포 계열로 분화하는 즉시, Oct-4의 발현은 신속하게 사라진다.

본원에 사용된 바와 같은 "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기의 호르몬중 하나 이상을 발현할 수 있는 세포를 언급한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩타이드.

본원에 사용된 바와 같은 "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기의 호르몬중 하나 이상을 분비할 수 있는 세포를 언급한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩타이드.

본원에 사용된 바와 같은 "Pax-4" 및 "Pax-6"은 섬 발생에 관련된 췌장 β 세포 특이적인 전사 인자이다.

본원에 사용된 바와 같은 "PDX-1은 "췌장 발생에 관련된 호메오도메인 전사 인자를 언급된다.

본원에 사용된 바와 같은 "전구 원시선 세포"는 하기의 마커중 하나 이상을 발현하는 세포를 언급한다: Nodal, 또는 FGF8.

본원에 사용된 바와 같은 "원시선 세포"는 하기의 마커중 하나 이상을 발현하는 세포를 언급한다: 브라키우리, 혼합형 호메오박스 단백질 또는 FGF4.

본원에 사용된 바와 같은 "PTF-1 알파"는 48kD의 염기성 나선-루프-나선 단백질을 언급하고 이는 3량체 췌장 전사 인자-1(PTF1)의 서열 특이적 DNA 결합 서브유니트이다.

본원에 사용된 바와 같은 "SPARC"은 또한 "시스테인이 풍부하고 산성인 분비된 단백질(Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine)"로서 공지되어 있다.

"SSEA-1" (단계 특이적인 배아 항원-1)은 쥐 기형암종 줄기 세포(EC), 쥐 및 사람 배아 줄기 세포(EG) 및 쥐 배아 줄기 세포(ES)의 표면상에 존재하는 당지질 표면 항원이다.

"SSEA-3" (단계 특이적인 배아 항원-3)은 사람 기형암종 줄기 세포(EC), 사람 배아 생식 세포(EG) 및 사람 배아 줄기 세포(ES)의 표면상에 존재하는 당지질 표면 항원이다.

"SSEA-4" (단계 특이적인 배아 항원-4)는 사람 기형암종 줄기 세포(EC), 사람 배아 생식 세포(EG) 및 사람 배아 줄기 세포(ES)의 표면상에 존재하는 당지질 표면 항원이다.

"TRA1-60"은 사람 기형암종 줄기 세포(EC), 사람 배아 생식 세포(EG) 및 사람 배아 줄기 세포(ES)의 표면상에서 발현된 케라틴 설페이트 관련 항원이다.

"TRA1-81"은 사람 기형암종 줄기 세포(EC), 사람 배아 생식 세포(EG) 및 사람 배아 줄기 세포(ES)의 표면상에 발현된 케라틴 설페이트 관련 항원이다.

"TRA2-49"은 사람 기형암종 줄기 세포(EC) 및 사람 배아 줄기 세포(ES)의 표면상에 발현된 알칼리성 포스파타제 이소자임이다.

본 발명은 효소를 사용하여 단일 세포로서 방출된 다분화성 줄기 세포의 유지, 계대 및 분화를 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 다분화성이 후속적으로 상실되지 않고 비정상적인 염색체가 획득되지 않으면서 단일 세포로서 방출된 다분화성 줄기 세포의 유지, 계대 및 분화를 위한 방법을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 다분화성 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공하고, 당해 방법은,

a) 클러스터로서 다분화성 줄기 세포를 배양하는 단계,

b) 단일 세포로서 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계,

c) 다분화성 줄기 세포를 조직 배양 기질상에 분주하는 단계 및

d) 단일 다분화성 줄기 세포를 분화시키는 단계를 포함한다.

다분화성 줄기 세포의 클러스터는 효소적 처리에 의해 단일 세포로서 방출될 수 있다. 효소적 처리는 TrypLE^TMExpress, 또는 TrypLE^TMSelect, 또는 트립신 또는 트립신/EDTA에 의해 수행될 수 있다.

효소적 처리는 약 2분 내지 약 5분 동안 수행할 수 있다. 또한, 효소적 처리는 약 5분 동안이다.

당해 효소는 약 0.5g/L 내지 약 2.5g/L의 효소 농도로 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 다분화성 줄기 세포의 클러스터는 TrypLE^TMEXPRESS을 사용하여 단일 세포로서 방출된다.

하나의 양태에서, 다분화성 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 또 다른 양태에서, 배아 줄기 세포는 사람 세포이다.

하나의 양태에서, 방출된 단일 다분화성 세포는 조직 배양 기질상에 분주한다. 당해 기질은 MATRIGEL^TM일 수 있거나, 또는 당해 기질은 피브로넥틴일 수 있거나, 또는 당해 기질은 라미닌일 수 있거나, 또는 당해 기질은 사람 혈청일 수 있거나, 또는 당해 기질은 콜라겐일 수 있다.

하나의 양태에서, 방출된 단일 다분화성 세포는 3차원 지지체상에 분주한다. 당해 지지체는 방출된 단일 다분화성 세포의 생존 및 기능을 촉진시키는 하나 이상의 약제학적 제제와 함께 혼입될 수 있다. 본 발명의 목적에 사용하기에 적합한 지지 물질은 포말, 스폰지, 겔, 하이드로겔, 직물 및 부직포 구조물 형태의 합성 및 천연 물질을 포함한다.

하나의 양태에서 조직 배양 기질은 MATRIGEL^TM이다. MATRIGEL^TM은 약 1:30 내지 약 1:10의 희석으로 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, MATRIGEL^TM은 1:10의 희석으로 사용된다.

단일 다분화성 줄기 세포는 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 또는, 단일 다분화성 줄기 세포는 췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 또는, 단일 다분화성 세포는 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 다분화성 줄기 세포를 유지하는 방법을 제공하고, 당해 방법은

a) 다분화성 줄기 세포의 클러스터를 수득하는 단계,

b) 단일 세포로서 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계, 및

c) 단일 다분화성 줄기 세포를 조직 배양 기질상에 분주하는 단계를 포함한다.

다분화성 줄기 세포의 클러스터는 효소적 처리에 의해 단일 세포로서 방출될 수 있다. 효소적 처리는 TrypLE^TMExpress, 또는 TrypLE^TMSelect, 또는 트립신, 또는 트립신/EDTA에 의해 수행될 수 있다.

당해 효소적 처리는 약 2 내지 약 5분 동안 수행될 수 있다. 또한 효소적 처리는 약 5분 동안 수행된다.

당해 효소는 약 0.5g/L 내지 2.5g/L 효소의 농도로 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 방출된 단일 다분화성 세포는 조직 배양 기질상에 분주한다. 당해 기질은 MATRIGEL^TM일 수 있거나 또는, 당해 기질은 성장 인자 감소된 MATRIGEL^TM일 수 있거나, 또는 당해 기질은 피브로넥틴일 수 있거나, 또는 당해 기질은 라미닌일 수 있거나, 또는 당해 기질은 사람 혈청일 수 있거나 또는 당해 기질은 콜라겐일 수 있다.

하나의 양태에서, 방출된 단일 다분화성 세포는 3차원 지지체상에 분주한다. 당해 지지체는 방출된 단일 다분화성 세포의 생존 및 기능을 촉진시키는 하나 이상의 약제학적 제제와 함께 혼입될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 적합한 지지 물질은 포말, 스폰지, 겔, 하이드로겔, 직물 및 부직포 구조물 형태의 합성 및 천연 물질을 포함한다.

하나의 양태에서 조직 배양 기질은 성장 인자-감소된 MATRIGEL^TM이다. 성장 인자-감소된 MATRIGEL^TM은 약 1:30 내지 약 1:10의 희석으로 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, MATRIGEL^TM은 1:30의 희석으로 사용된다.

하나의 양태에서, 본 발명은 다분화성 줄기 세포를 계대시키는 방법을 제공하고, 당해 방법은,

a) 다분화성 줄기 세포의 클러스터를 수득하는 단계,

b) 단일 세포로서 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계,

d) 단일 다분화성 줄기 세포가 증식되도록 방치하는 단계,

e) 단일 다분화성 줄기 세포를 방출시키는 단계 및

f) 신규 조직 기질상에 당해 단일 다분화성 줄기 세포를 분주하는 단계를 포함한다.

다분화성 줄기 세포의 클러스터는 효소적 처리에 의해 단일 세포로서 방출될 수 있다. 효소적 처리는 TrypLE^TMExpress, 또는 TrypLE^TMSelect, 또는 Trypsin, 또는 트립신/EDTA에 의해 수행될 수 있다.

효소적 처리는 약 2 내지 약 5분 동안 수행될 수 있다.

또는, 당해 효소적 처리는 약 5분 동안 수행된다. 당해 효소는 약 0.5g/L 내지 2.5g/L의 효소 농도로 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 단일 다분화성 세포는 세포가 다시 새로운 조직 배양 기질상으로 효소적으로 계대되기 전에 약 70 내지 80%의 밀도로 성장시킨다. 단일 다분화성 줄기 세포는 1회 계대될 수 있거나 이들은 본 발명의 방법을 사용하여 1회 이상 계대될 수 있다.

다분화성 줄기 세포의 분리, 증식 및 배양을 위한 기타 방법

다분화성 줄기 세포의 특성 분석

다분화성 줄기 세포는 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 지정된 항체를 사용하여 검출가능한 단계-특이적 배아 항원(SSEA) 3 및 4중 하나 이상을 발현할 수 있다(Thomson et al, Science 282: 1145, 1998). 다분화성 줄기 세포의 시험관내 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)을 상실시키고 SSEA-1의 발현을 증가시킨다. 비분화된 다분화성 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타제 활성을 갖고 있고 당해 활성은 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시킴에 이어서 제조업자(Vector Laboratories, Burlingame Calif.)에 의해 기재된 바와 같은 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 사용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 비분화된 다분화성 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같이 Oct-4 및 TERT를 발현한다.

증식된 다분화성 줄기 세포의 또 다른 바람직할 수 있는 표현형은 모든 3개의 생식 층의 세포로 분화하는 잠재력이다: 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 조직. 줄기 세포의 다분화성은 예를 들어, 세포를 중증 합병성 면역결핍(SCID) 마우스에 주입하고 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 형성된 기형종(teratoma)을 고정화시킴에 이어서 3개의 생식층으로부터 세포 유형의 입증을 위해 조직학적으로 이들을 분석함에 의해 확인될 수 있다. 또는, 다분화성은 배양체를 생성시키고 3개의 생식층과 연관된 마커의 존재에 대해 배양체를 분석함에 의해 결정될 수 있다.

증식된 다분화성 줄기 세포주는 표준 G-분염법을 사용하여 핵형분석하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. 세포가 정배수체(여기서, 모든 사람 염색체는 존재하고 크게 변화되지 않았다)임을 의미하는 "정상적인 핵형"을 갖는 세포를 수득하는 것이 요망될 수 있다.

다분화성 줄기 세포의 공급원

사용될 수 있는 다분화성 줄기 세포의 유형은, 착상 동안에 임의의 시점에서, 전형적으로 약 10 내지 12주 착상전이 필연적으로 아닌 시점에서 채취된 전배아 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직 또는 태아 조직을 포함하는, 착상 후 형성된 조직으로부터 유래된 다분화성 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예는 예를 들어, 사람 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9(WiCell)와 같은 사람 배아 줄기 세포 또는 사람 배아 생식 세포의 확립된 주이다. 또한 당해 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안에 기재된 조성물의 용도가 고려되고, 이 경우에 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 1차 다분화성 세포이다. 또한 영양 공급 세포의 부재하에 이미 배양된 다분화성 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 적합하다. 또한 예를 들어, BGO1v(BresaGen, Athens, GA)와 같은 돌연변이 사람 배아 줄기 세포주가 적합하다.

하나의 양태에서, 사람 배아 줄기 세포는 문헌[참조: Thomson et al. 미국 특허 제5,843,780호; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]에 기재된 바와 같이 제조한다.

다분화성 줄기 세포의 배양

하나의 양태에서, 다분화성 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 다분화성 줄기 세포를 지지하는 영양 공급 세포 층상에서 배양된다. 또는, 다분화성 줄기 세포는 실질적으로 영양 공급 세포가 부재이지만 실질적인 분화의 진행 없이 다분화성 줄기 세포의 증식을 지지해주는 배양 시스템에서 배양한다. 분화 없이 영양 공급 세포가 부재인 배양에서 다분화성 줄기 세포의 성장은 사전에 또 다른 세포 유형과 배양함에 의해 조건화된 배지를 사용하여 지지된다. 또는, 분화 없이 영양 공급 세포 부재의 배양에서 다분화성 줄기 세포의 성장은 화학적 합성 배지를 사용하여 지지된다.

예를 들어, 문헌[참조: Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000) 및 Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147)]은 마우스 배아 섬유아세포 영양 공급 세포 층을 사용하여 사람 배반포로부터 다분화성 줄기 세포주의 배양을 기재하고 있다.

문헌[참조: Richards et al, (Stem Cells 21 : 546-556, 2003)]은 사람 다분화성 줄기 세포 배양을 지지하는 이의 능력에 대해 11개 상이한 사람 성인, 태아 및 신생태아 영양 공급 세포 층을 평가하였다. 문헌[참조: Richards et al]은 "성인 피부 영양 공급 섬유아세포 상에서 배양된 사람 배아 줄기 세포주는 사람 배아 줄기 세포 형태를 유지하고 다분화성으로 유지된다"라고 기재하고 있다.

US20020072117은 영양 공급 세포 부재 배양에서 영장류 다분화성 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포 주를 기재하고 있다. 사용된 세포주는 배아 조직으로부터 수득되고 배아 줄기 세포로부터 분화된 간엽 및 섬유아세포형 세포주이다. US20020072117은 또한 1차 영양 공급 세포층으로서 세포주의 용도를 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005)]은 사람 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 공급 세포상의 사람 다분화성 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 기재하고 있다.

추가의 예에서, 문헌[참조: Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004)]은 사람 태반으로부터 수득된 영양 공급 세포의 공급원을 기재하고 있다.

문헌[참조: Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003)]은 사람 포피로부터 유래된 영양 공급 세포층을 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Inzunza et al (Stem Cells 23 : 544-549, 2005)]은 생후 포피 섬유아세포로부터의 영양 공급 세포 층을 기개하고 있다.

US6642048은 영양 공급 세포 부재 배양에서의 영장류 다분화 줄기(pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 당해 배지의 제조를 위해 유용한 세포주를 기재하고 있다. US6642048은 "본 발명은 배아 조직으로부터 수득되거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 간엽 및 섬유아세포형 세포주를 포함한다. 당해 세포주를 유도하기 위한 방법, 배지를 프로세싱하는 방법 및 조건화된 배지를 사용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 당해 문헌 내용에 기재되고 설명된다"라고 기재하고 있다.

또 다른 예에서, WO2005014799는 포유동물 세포의 유지, 증식 및 분화를 위해 조건화된 배지를 기재하고 있다. WO2005014799는 "본 발명에 따라 제조된 배양 배지는 쥐 세포, 특히 분화되고 불멸화된 유전자 전이 간엽 세포 MMH(Met 쥐 간엽세포)의 세포 분비 활성에 의해 조건화된다"라고 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004)]은 사람 텔로머라제 역전사 효소를 과발현하도록 유전학적으로 변형된 사람 배아 줄기 세포 유도체로부터 수득된 조건화된 배지를 기재하고 있다.

또 다른 예에서, US20070010011은 다분화성 줄기 세포의 유지를 위한 화학적 합성 배양 배지를 기재하고 있다.

또 다른 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진시킬 수 있는 성장 인자가 보충된 무혈형 배지를 사용한다. 예를 들어, 문헌[참조: Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005)]은 배아 줄기 세포가 배아 줄기 세포 자가 재생산을 유발할 수 있는 상이한 성장 인자가 보충된 비조건화된 혈청 대용물(SR) 배지에서 유지되는 영양 공급 세포 부재 무혈청 배양 시스템을 기재하고 있다.

또 다른 예에서, 문헌[참조: Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006)]은 섬유아세포의 부재 또는 bFGF가 보충된 배지를 사용하는 조건화된 배지에서 사람 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 기재하고 있다.

또 다른 예에서, US20050148070는 무혈청 및 영양 공급 섬유아세포 부재하에 사람 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 기재하고 있고 당해 방법은, 알부민, 아미노산, 비타민, 무기물, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대용물, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대용물에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 당해 배양 배지는 포유동물 태아 혈청이 실질적으로 부재이고 섬유아세포 성장 인자 시그날 전달 수용체를 활성화시킬 수 있는 약 100ng/ml 이상의 섬유아세포 성장 인자를 함유하며 여기서, 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양 공급 세포 층 이외의 공급원으로부터 제공되고 당해 배지는 영양 공급 세포 부재하에 또는 조건화된 배지에서 비분화된 상태의 줄기 세포의 증식을 지지한다.

또 다른 예에서, US20050233446은 비분화된 영장류 원시 줄기 세포를 포함하고 줄기 세포를 배양하는데 유용한 합성 배지를 기재하고 있다. 용액중의 당해 배지는 배양된 줄기 세포와 비교하여 실질적으로 등장성이다. 소정의 배양에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 실질적으로 비분화된 성장을 지지하는데 필요한 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각의 양을 포함한다.

또 다른 예에서, US6800480은 "하나의 양태에서, 영장류 유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하는데 효과적인 낮은 삼투압의 낮은 내독소 기본 배지를 포함하는 실질적으로 비분화된 상태의 영장류 유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공된다. 기본 배지는 영장류 유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하는데 효과적인 영양물 혈청, 및 영양 공급 세포 및 영양세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기질과 배합된다. 당해 배지는 또한 비필수 아미노산, 산화방지제 및 뉴클레오사이드 및 피루베이트 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다"라고 기재하고 있다.

또 다른 예에서, US20050244962는 "하나의 측면에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명자는 단지 영양 공급 섬유아세포 층 이외의 공급원으로부터 공급되는 섬유아세포 성장인자의 존재하에 포유동물 태아 혈청이 실질적으로 부재인 배양물(또한 바람직하게는 임의의 동물 혈성이 실질적으로 부재인 배양물)에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 영양 공급 섬유아세포 층은 줄기 세포 배양을 유지하기 위해 사전에 요구되지만 충분한 섬유아세포 성장 인자를 첨가함으로써 불필요해진다"라고 기재하고 있다.

추가의 예에서, WO2005065354는 합성 등장성 배양 배지를 기재하고 있고 당해 배지는 필수적으로 영양 공급 세포 부재 및 무혈청이고, a) 기본 배지; b) 실질적으로 비분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c) 실질적으로 비분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d) 실질적으로 비분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.

또 다른 예에서, WO2005086845는 비분화된 줄기 세포의 유지를 위한 방법을 기재하고 있고, 당해 방법은 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 계열 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 계열 단백질의 구성원 또는 티코틴아미드(NIC)에 줄기 세포를 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 비분화된 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양으로 노출시킴을 포함한다.

다분화성 줄기 세포를 적합한 배양 기질 상으로 분주할 수 있다. 하나의 양태에서, 적합한 배양 기질은 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들 또는 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 하나의 양태에서, 적합한 배양 기질은 MATRIGEL^TM (Becton Dickenson)이다. MATRIGEL^TM은 Engelbreth-Holm-Swarm 종양 세포 기원의 가용성 제제이고 이는 실온에서 겔화되어 재구성된 기저막을 형성한다.

다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물은 대체물로서 적합하다. 증식된 세포 유형에 따라, 이것은 라미민, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 배합으로 포함할 수 있다.

다분화성 줄기 세포는 적합한 분포 및 세포 생존, 증식 및 목적하는 특성의 유지를 촉진시키는 배지의 존재하에 기질상으로 분주할 수 있다. 모든 이들 특징은 분주 분포에 세심한 주의를 기울임으로써 이득이 되고 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예를 들어, 듈베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)), Gibco # 11965-092; 녹아웃 듈베코 변형 이글스 배지(Knockout Dulbecco's modified Eagle's medium)(KO DMEM), Gibco # 10829-018; 햄스(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, Gibco # 15039-027; 비필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; β-머캅토에탄올, Sigma # M7522; 사람 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), Gibco # 13256-029로부터 제조될 수 있다.

다분화성 줄기 세포의 분화

본 발명의 하나의 양태에서, 다분화성 줄기 세포는 배양중에 증식하면서 이들의 다분화성을 유지한다. 시간에 따른 세포의 다분화성의 변화는 다분화성과 연관된 마커 발현 수준에서의 변화를 검출함에 의해 측정될 수 있다. 또는 다분화성의 변화는 분화와 연관된 마커의 발현 수준 또는 또 다른 세포 유형과 연관된 마커의 발현 수준의 변화를 검출함에 의해 모니터링될 수 있다.

또 다른 양태에서, 다분화성 줄기 세포는 배양에서 증식되고 이어서 또 다른 세포 유형으로의 이들의 분화를 촉진하는 방식으로 처리된다. 기타 세포 유형은 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 또는, 세포 유형은 췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 또는, 당해 세포 유형은 췌장 내분비 게열에 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 또는, 당해 세포 유형은 β-세포 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 처리된 다분화성 줄기 세포는 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 다양한 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 다분화성 줄기 세포는 신경 세포, 심장 세포, 간 세포 등으로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 다분화성 줄기 세포는 WO2007030870에 기재된 방법에 따라 신경 선조체 및 심근세포로 분화될 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 다분화성 줄기 세포는 미국 특허 제6,458,589호에 기재된 방법에 따라 간세포로 분화될 수 있다.

완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성

다분화성 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 기재된 방법에 따라 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662 (2004)]에 기재된 방법에 따라 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: McLean et al, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007)]에 기재된 방법에 따라 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 기재된 방법에 따라 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

완성내배엽 계열에 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, 브라키우리(Brachyury), 혼합형 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 하나 이상 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기 위해 적합하다. 본 발명의 하나의 측면에서, 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 또 다른 측면에서, 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중배엽 세포이다. 또 다른 측면에서, 완성내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성내배엽 세포이다.

췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성

다분화성 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 기재된 방법에 따라 췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커는 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기 위해 적합하다. 본 발명의 하나의 측면에서, 췌장 내배엽 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.

췌장 내분비 계열의 마커를 발현하는 세포의 형성

다분화성 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 기재된 방법에 따라 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 기재된 방법에 의해 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 다분화성 줄기 세포는 문헌[참조: D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 기재된 방법에 의해 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

췌장 내분비 계열에 특징적인 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4 및 PTF-1 알파로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, 췌장 내분비 세포는 하기의 호르몬중 하나 이상을 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩타이드. 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 하나 이상 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기 위해 적합하다. 본 발명의 하나의 측면에서, 췌장 내분비 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 또는, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. 세포 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 Pdx1 및 하기의 전사 인자중 하나 이상을 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 하나의 측면에서, β-세포 계열에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.

3차원 지지체

본 발명의 목적에 사용하기 위해 적합한 지지체 물질은 포말, 스폰지, 겔, 하이드로겔, 직물 및 부직포 구조 형태의 합성 및 천연 물질을 포함하고, 당해 물질은 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 조직을 재구성하거나 재생하기 위해서 뿐만 아니라 조직 성장을 유도하기 위한 화학주성 제제를 전달하기 위해 사용되어 왔고 본 발명의 방법을 수행하기 위해 적합하다. 당해 물질에 대해 예를 들어 문헌[미국 특허 제5,770,417호, 미국 특허 제6,022,743호, 미국 특허 제5,567,612호, 미국 특허 제5,759,830호, 미국 특허 제6,626,950호, 미국 특허 제6,534,084호, 미국 특허 제6,306,424호, 미국 특허 제6,365,149호, 미국 특허 제6,599,323호, 미국 특허 제6,656,488호, 미국 공개 출원번호 제2004/0062753 A1호, 미국 특허 제4,557,264호 및 미국 특허 제6,333,029호]를 참조한다.

약제학적 제제가 혼입된 지지체를 제조하기 위해, 약제학적 제제는 지지체를 형성하기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 또는 약제학적 제제는 바람직하게는 약제학적 담체의 존재하에 조립된 지지체상으로 피복될 수 있다. 약제학적 제제는 액체, 미분된 고체 또는 임의의 다른 적합한 물리적 형태로서 존재할 수 있다. 또는, 부형제는 약제학적 제제의 방출률을 변화시키기 위해 당해 지지체에 첨가될 수 있다. 또 다른 양태에서, 당해 지지체에는 예를 들어 미국 특허 제6,509,369호에 기재된 화합물과 같은 소염 화합물인 하나 이상의 약제학적 화합물이 혼입된다.

당해 지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,793,945호에 기재된 화합물과 같은 항-아폽토시스 화합물인 하나 이상의 약제학적 화합물이 혼입될 수 있다.

당해 지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 제6,331,298호에 기재된 화합물과 같은 섬유증 억제제인 하나 이상의 약제학적 화합물이 혼입될 수 있다.

당해 지지체에는 또한 미국 공개 출원번호 제2004/0220393호 및 미국 공개된 출원번호 제2004/0209901호에 기재된 화합물과 같은, 혈관형성을 증진시킬 수 있는 하나 이상의 약제학적 화합물이 혼입될 수 있다.

당해 지지체에는 또한 예를 들어, 미국 공개 출원번호 제2004/0171623호에 기재된 화합물과 같은 면역억제 화합물인 하나 이상의 약제학적 화합물이 혼입될 수 있다.

본 발명은 추가로 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만 이에 제한되지 않는다.

[실시예]

실시예 1

세포 클러스터로서 hESC 의 계대 및 유지

사람 배아 줄기 세포주 H1 및 H9를 미토마이신 C 불활성화된 1차 마우스 배아 섬유아세포(MEF)상에서 유지시켰다. 당해 hES 세포를 반복된 계대상에서 MEF 영양 공급 세포로부터 MATRIGEL^TM로 전환시켰다.

조직 배양 디쉬의 MATRIGEL^TM 피복: 성장 인자 감소된 MATRIGEL^TM(Becton-Dickinson, Bedford, Mass.)을 4℃에서 해동시킴에 이어서 냉각된 DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)중에서 1:30으로 희석시켰다. 보호하기에 충분한 용량을 6cm 디쉬(2ml) 각각에 또는 6웰 플레이트 각각의 웰(1ml)에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 몇 시간 이내에 플레이트를 사용하거나 2주까지 4℃에 저장한다.

사람 배아 줄기 세포 배양: 비분화된 사람 배아 줄기 세포 콜로니(H9 및 H1)을 DMEM/F12 중에서 10분 동안 1mg/ml의 콜라게나제 IV(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 항온처리하고 피펫으로 박리시켜 영양 공급 세포층으로부터 수거하였다. 세포 클럼프를 4분 동안 1000rpm에서 원심분리하여 펠릿화시키고 펠릿을 2ml의 피펫으로 약하게 분산시켜 콜로니를 세포의 소형 클러스터로 쪼개었다. 당해 세포 클러스터를 bFGF (8ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN)가 보충된 MEF-CM 중의 MATRIGEL^TM 피복된 디쉬상으로 분주하여 5ml의 성장 배지중의 6cm 디쉬당 50 내지 150 콜로니가 되도록 하였다. 배지를 매일 갈아주었다. MEF-CM 중의 MATRIGEL^TM 상의 콜로니가 크게 되도록 하고 이들이 약 3 내지 4일 마다 표면적의 70 내지 80%를 차지하는 경우 통과시켰다. 콜로니중의 hES 세포는 세포질에 대한 핵의 비율이 높고 명확한 핵을 갖고 있어 영양 공급 세포상에 유지된 hES 세포와 유사하다(도 1). 분화된 세포는 배양중의 총 세포중 5% 미만이었다.

MEF-CM 중의 세포에 대한 MATRIGEL^TM 상으로의 통상적인 계대를 위해, 세포를 60분 이하 동안 DMEM/F12에서 1mg/ml의 콜라게나제 IV 중에서 항온처리하고 박리와 함께 DMEM/F12의 강압적 스트림으로 디쉬로부터 제거하였다. 세포를 펠릿화하고 분산시키고 1:3 또는 1:4의 비율로 분주하였다.

실시예 2

단일 세포로서 사람 배아 줄기 세포의 계대: 효소의 평가

hES 세포의 취급을 용이하게 하기 위해, 계대 기술은 보다 짧은 항온처리 시간을 필요로 하고 박리 단계를 포함하지 않는 다른 효소 용액을 사용할 수 있다. 추가로, 콜라게나제와 함께 세포 클러스터로서 세포를 계대시키는 경우 분주된 세포의 수치적 정량을 허용하지 않는다. 많은 효소적 용액은 하나의 급속 단계에서 단일 세포를 방출시키기 위해 유용하다. 최소 세포 손상을 유발하고 세포 접착 또는 세포 성장을 방해하지 않는 신속 작용 효소는 하기의 실험에 의해 동정하였다.

6웰 디쉬에서 클러스터로 성장된 사람 배아 줄기 세포 H9p33 세포를 36℃에서 2분 동안 하기의 효소로 항온처리하였다: TrypLE^TMExpress, TrypLE^TM Select, 트립신/EDTA(0.05%), 또는 트립신(0.25%). 트립신을 제외한 모든 효소는 2분 이내에 세포를 방출시켰다. 트립신을 사용한 방출은 36℃에서 5분 후에 달성되었다. 세포는 MATRIGEL^TM로 피복된 6웰 플레이트로 웰당 200,000세포가 되도록 재분주하고 3일 동안 증식하도록 방치하였다. 사람 배아 줄기 세포는 또한 콜라게나제를 사용하여 클러스터로서 계대시키고(30분 항온처리) 계수된 TrypLE^TM Express 세포와 유사하게 MATRIGEL 피복된 웰상에서 1:5 희석으로 재분주하였다. 3일 후, hESC는 TrypLE^TM Express와 5분 항온처리함에 의해 방출시켰다. 세포를 0.01% 트립판 블루로 항온처리함에 이어서 계수하였다(표 I). 방출 즉시 세포 생존성은 시험된 모든 효소에 대해 98%를 초과하였다. 콜라게나제를 사용한 사람 배아 줄기 세포의 계대는 표준 계대 방법이다. 3일 배양 후, TrypLE^TM Select 및 TrypLE^TM Express는 콜라게나제와 유사한 회복된 세포 계수를 산출하였다. 트립신/EDTA 및 트립신은 세포 접착/성장을 유지하는데 상당히 덜 효과적이었다. TrypLE^TM Select 및 TrypLE^TM Express는 평가된 최상의 효소였고 추가로 시간 경과 실험에서 시험하였다(실시예 3).

실시예 3

단일 세포로서 사람 배아 줄기 세포의 계대: 효소 노출 시간의 최적화

TrypLE^TM Select 및 TrypLE^TM Express는 시험된 모든 효소의 최적성을 입증하였다. hES 세포와 함께 당해 효소에 대한 이상적인 항온처리 시간을 결정하기 위해, TrypLE^TM Select 및 TrypLE^TM Express를 37℃에서 2분 또는 10분 동안 H9p34 hESC 클러스터로 항온처리하였다. 세포를 웰로부터 제거하고 계수하고 원심분리로 펠릿화하였다. 200,000 세포/웰의 적정액을 6웰 플레이트로 분주하였다. 세포를 3일 동안 성장시킴에 이어서 TrypLE^TM Express로 방출시키고 0.01% 트립판 블루의 존재하에 계수하였다.

세포 생존성은 2개의 항온처리 시간 동안 2개의 효소에 대해 98%를 초과하였다. 표 III은 분주 36시간 후 회수된 웰당 세포의 수를 나타낸다. TrypLE^TM Express로 계대된 세포는 3일 후 초기 분주 밀도에 도달하였다. 이것은 대다수의 세포가 분주 후 재접착지 못하지만 접착한 세포는 성장하고 증식할 수 있음을 나타낸다. 세포가접착된 즉시 동일한 비율로 증식하는 경우, 당해 데이터는 TrypLE^TM Express를 사용한 2분의 처리가 최상의 접착률이 수득되게 함을 나타낸다. 이어서 2분 동안 TrypLE^TM Express 처리는 모든 후속 실험에서 단일 세포를 제조하기 위해 사용하였다.

실시예 4

사람 배아 줄기 세포 단일 세포 및 세포 클러스터의 완성내배엽으로의 분화

배아 줄기 세포는 다중 세포 계열로 분화할 수 있다. 단일 세포로서 계대된 사람 ES 세포는 상당한 개선책을 제공하여 세포 투입 정량화 및 취급의 용이함을 도와준다. 당해 단일 hES 세포가 분화하는 능력을 결정하였다.

세포 클러스터 및 단일 세포의 분주: 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM 상의 H9 또는 H1 세포 클러스터의 6cm 플레이트는 37℃에서 60분 이하 동안 DMEM:F12 중에서 2ml의 콜라게나제(1mg/ml)로 항온처리하였다. 당해 세포를 피펫팅하고 박리함에 의해 제거하고 4분 동안 900rpm에서 원심분리하였다. 이어서 세포 클러스터를 1:15 또는 1:30 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM로 피복된 6웰 플레이트에 분주하였다. 당해 계대 방법으로 분주 세포 클러스터(cc)를 수득하였다. 또는, 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM 상의 H9 또는 H1 세포 클러스터의 6cm 플레이트를 37℃에서 5분 동안 TrypLE^TM Express (2ml)과 항온처리하고 피펫팅함에 의해 분산시켰다. 4분 동안 900rpm에서 원심분리한 후, 이어서 세포를 1:10 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM이 피복된 6웰 플레이트로 분주하고 단일 세포(sc)로 명명하였다.

완성내배엽 분화: 컨플루언시(confluency)가 대략 60 내지 70%인 H9 및 H1 sc 및 cc 배양물을 2일 동안 0.5% FBS, 10 ng/ml Wnt3a (R&D Systems) 및 100 ng/ml 액티빈 A (AA; R&D Systems)가 보충된 DMEM:F12 배지에 노출시킴에 이어서 추가로 3일 동안 2% FBS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM/F12 배지로 처리하였다.

당해 배양물을 CXCR4, CD99, 및 CD9 발현에 대해 FACS로 분석하고 SOX-17, SOX-7, 알파-태아 단백질 (AFP), CXCR4, 브리키우리(Bry), 구세코이드(GSC), HNF-3 베타, 및 GATA4에 대해서는 실시간 PCR로 분석하였다. AFP 및 SOX-7은 내장 내배엽 마커로서 간주되고 GATA4, HNF-3 베타 및 SOX-17은 완성내배엽 마커를 나타내며 GSC, Bry 및 CXCR4는 원시선의 마커이다. 단일 세포는 수득한 CXCR4 양성 세포의 %를 통해 관찰된 바와 같이 세포 클러스터와 유사한 정도로 DE로 분화하였다(도 2).

실시예 5

hES 단일 세포 및 세포 클러스터의 췌장 내배엽으로의 분화

변형과 함께 문헌[참조: Novocell (D'Amour, KE et al, Nature Biotechnology (2006), 24(11), 1392-1401)]에 공개된 프로토콜에 따라 추가의 분화를 또한 시험하여 hES 단일 세포의 분화 능력을 측정하였다. 당해 세포를 추가로 실시예 4에 기재된 DE 프로토콜에 따라 췌장 내배엽으로 분화시켰다.

췌장 내배엽 분화: 실시예 4 기원의 세포 클러스터 및 단일 세포 둘다를 사용하는 H9(p37) DE 실험중 하나를 추가로 췌장 내배엽으로 분화시켰다. 완성내배엽 프로토콜의 완료 후, 세포를 DEME:F12 배지중의 FGF10(50ng/ml; R&D Systems), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) 억제제, KAAD 사이클로파민(2.5uM; Sigma-Aldrich) 및 2% FBS를 사용하여 3일 동안 항온처리하였다. 이후 세포를 DMEM-저농도 글루코스중에서 추가로 3일 동안 FGF10(50ng/ml), KAAD 사이클로파민(2.5uM), 레티노산(1uM; Sigma-Aldrich) 및 1% B27(Invitrogen)과 항온처리하였다. 이후, 세포를 DMEM-저농도 글루코스중의 엑센딘 4 (50ng/ml; Sigma-Aldrich), DAPT (1uM; Calbiochem), 및 1% B27에서 추가로 3일 동안 항온처리하였다. RNA 샘플을 각각의 세포 유형에 대해 6웰 플레이트의 하나의 웰로부터 채취함에 이어서 당해 단계에서 췌장 마커 Pdx1, Nkx6.1, Nkx2.2, Pax4, NeuroD, HNF3b, Ptf1a, 인슐린 및 AFP에 대해 실시간 PCR로 분석하였다. 분화는 50ng/ml의 HGF, IGF (R&D Systems), 및 엑센딘 4 (50ng/ml), 및 1% B27을 함유하는 CMRL 배지(Invitrogen)를 사용하여 3일 동안 계속하였다. 동일한 췌장 내배엽 마커의 평가는 당해 단계에서 반복하였다. 동일한 주의 비처리된 hES 세포로부터의 RNA 샘플을 처리된 샘플과 병행하여 실시간 PCR에 적용하였다. 처리된 샘플을 하나의 배수 변화로 설정된 비처리된 대조군으로 정상화하였다. Pdx1 발현을 모니터링하고 단일 세포와 세포 클러스터간에 비교하였다. 췌장 내배엽 마커 발현의 유도는 단일 세포와 세포 클러스터간에 동일하였다(도 3). 따라서, 당해 hES 단일 세포는 hES 세포 클러스터와 유사한 고유 분화 능력을 갖고 있다.

실시예 6

단일 세포로서 hES 세포의 계대

단일 세포로서 hES 세포의 계대는 배양을 스케일-업하고 제조 공정을 촉진시키는 능력을 도와준다.

단일 세포 생성 및 계대에 대한 설명: H9 세포는 상기된 바와 같이 MATRIGEL^TM 상에서 클러스터로서 성장시켰다. 38회 계대에서, H9 세포의 6cm 플레이트를 37℃에서 5분 동안 2ml의 TrypLE^TM Express와 항온처리하였다. 당해 세포를 DMEM:F12 중에 재현탁시키고 900rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 당해 세포를 1:30 성장 인자 감소된 MATRIGEL^TM 피복된 플레이트상으로 1:4의 비율로 재분주하였다. 대략 5회 계대 후, 세포를 재분주전에 계수하고 14,000세포/cm²의 밀도로 분주하였다. 당해 밀도에서 계대 및 재분주는 매 4일 간격으로 계속하였다. 당해 세포는 이들이 단일 세포로부터 성장하지만 촘촘한 클러스터를 형성하지 않음으로 밀집된 구조를 보유하였다(도 1 및 도 4를 비교한다).

실시예 7

hES 단일 세포 다분화성의 분석

hES 세포 다분화성의 유지는 임의의 계대 기술과 함께 필요하다. 따라서, 단일 세포는 TrypLE^TM Express를 사용한 다중 계대 후 다분화성에 대해 평가하였다.

FACS 다분화성 분석: H9 단일 세포는 클러스터로서 38회 계대 배양함에 이어서 1회의 냉동보존 동결 해동을 포함하는 단일 세포로서 16회 계대 배양하였다. 당해 세포를 이어서 다분화성 마커의 발현에 대해 FACS로 분석하였다. 접착성 세포는 TrypLE^TM Express 용액과의 5분 항온처리를 사용하여 배양 플레이트로부터 제거하였다. 방출된 세포는 DMEM:F12 배지 중에 현탁시키고 원심분리로 회수하고 이어서 세척하고 2% BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), PBS 중의 0.05% 아지드화나트륨으로 이루어진 염색 완충액중에 재현탁시켰다. 적당하게, 당해 세포는 0.1% 감마 글로불린(Sigma) 용액을 사용하여 15분 동안 Fc-수용체 차단시켰다. 적정액 (대략 10⁵ 의 세포)을 표 III에 나타낸 같이 피코에리트린(PE) 또는 알로피코시아닌(APC) 접합된 모노클로날 항체(10⁶ 세포당 5㎕의 항체)로 항온처리하거나 비접합된 1차 항체로 항온처리하였다. 대조군은 적당한 이소형 일치된 항체, 비염색된 세포 및 2차 접합된 항체로만 염색된 세포를 포함했다. 항체를 사용한 모든 항온처리는 4℃에서 30분 동안 수행하고 이후 세포를 염색 완충액으로 세척하였다. 비접합된 1차 항체를 사용하여 염색된 샘플을 2차 접합된 PE 또는 APC 표지된 항체를 사용하여 4℃에서 30분 동안 추가로 항온처리하여다. 사용된 2차 항체의 목록에 대해 표 III을 참조한다. 세척된 세포를 펠릿화하고 염색 완충액중에 재현탁시키고 세포 표면 분자는 FACS 어레이(BD Biosciences) 장치를 사용하여 동정되었고 적어도 10,000 이벤트를 수거하였다. hESC 콜라게나제 계대된 H1p40 및 H9scp16은 동등한 다분화성 단백질 발현 프로필을 갖는다(도 5).

실시예 8

사람 배아 줄기 세포 단일 세포 핵형 안정성의 분석

hES 단일 세포의 핵형은 다수의 계대 동안 안정하게 유지되어야만 한다. H9 단일 세포는 클러스터로서 38회 계대 배양함에 이어서 단일 세포로서 다중 계대하였다. H9 세포의 핵형은 표준 G-분염법 핵형 분석에 의해 결정하였다(Cell Line Genetics, Madison, WI). 총 20G 분염 세포를 평가하고 200 간기(interphase) 핵을 FISH(형광 원위치 하이브리드화)에 의해 평가하였다. 분석된 세포에서 어떠한 염색체 이상이 발견되지 않았다. 세포유전학적 분석은 세포가 정상적인 수의 상염색체를 갖고 모달(modal) 염색체수는 46개임을 보여주었다. H9 단일 세포의 핵형 분석은 13회 계대 및 20회 계대에서 수행하였다. 20회 계대 세포는 1회 냉동보존 동결 해동 이벤트를 진행하였다. 13회 및 20회 계대 세포는 핵형적으로 정상이었다(도 6).

실시예 9

hES 단일 세포 및 hES 세포 클러스터의 완성내배엽으로의 분화

궁극적인 용도를 위해, 단일 세포로서 계대된 hES 세포는 이들의 분화 능력을 보유해야만 한다. 단일 세포는 다음과 같이 완성내배엽 프로토콜에 적용하였다. TrypLE^TM Express (sc-p)를 사용한 다중 계대 후 H9 세포를, 분화를 위해 MATRIGEL^TM (1:10 희석)상으로 계대된 단일 세포(6회 계대 및 21회 계대)로부터 TrypLE^TM Express(sc)를 사용하여 방출시켰다. 대략 60 내지 70% 컨플루언시를 갖는 단일층에서 H9 sc를 2일 동안 0.5% FBS, 10 ng/ml Wnt3a 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12 배지에 노출시킴에 이어서 추가로 3일 동안 2% FBS 및 100ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM/F12 배지로 처리하였다.

5일째에, 당해 세포를 CXCR4, CD99, 및 CD9 발현에 대해 FACS로 분석하고 SOX-17, SOX-7, 알파-태아 단백질(AFP), CXCR4, 브리키우리(Bry), 구스세코이드(GSC), HNF-3 베타, 및 GATA4에 대해서는 실시간 PCR로 분석하였다. AFP 및 SOX-7은 내장 내배엽 마커로서 간주되고 GATA4, HNF-3 베타 및 SOX-17은 완성내배엽 마커이고 GSC, Bry, 및 CXCR4은 원시선 마커이다. 수회 계대된(6회 계대 및 21회 계대) 단일 세포는 세포 클러스터(36회 내지 55회 계대)와 유사하게 DE로 분화하는 능력을 보유하고 있다(도 7).

실시예 10

hES 단일 세포의 췌장 내배엽으로의 분화

세포를 하기의 단계에 따라 췌장 내배엽으로 추가로 분화시켰다; DMEM:F12 배지중에 FGF10(50ng/ml), 소닉 헤지호그 억제제, KAAD 사이클로파민(2.5uM), 및 2% FBS을 사용한 3일간 항온처리에 이어서 DMEM-저 글루코스중의 FGF10 (50ng/ml), KAAD 사이클로파민 (2.5uM), 레티노산(1uM) 및 1% B27로 3일간 항온처리하였다. 세포의 평가는 11일째에 수행하였다. 몇몇 배양물은 DMEM-저 글루코스중의 엑센딘 4 (50ng/ml), DAPT (1uM), 및 1% B27에서 3일 동안 계속 처리하였다. 14일째에 샘플을 실시간 PCR에 의해 췌장 마커 Pdx1, Nkx6.1, Nkx2.2, Pax4, NeuroD, HNF3b, Ptf1a, 인슐린 및 AFP에 대해 분석하였다. 몇몇 배양물은 50ng/ml, HGF, IGF, 및 엑센딘 4, 및 1% B27을 함유하는 CMRL 배지를 사용하여 추가로 3일 동안 분화를 계속하였다. 동일한 췌장 내배엽 마커의 평가는 17일 말기에 반복하였다. 췌장 내배엽 마커 Nkx2.2, NeuroD, HNF6 및 HNF3b은 14일 및 17일 말기에 주로 발현되었다. Pdx1 발현은 각각의 처리 단계에서 단계적으로 증가하였다(도 8).

실시예 11

MEF 영양 공급 세포상에서 hES 단일 세포의 분화

hES 세포의 췌장 내배엽으로의 최적의 분화를 달성하기 위해, 완성내배엽 집단을 최대이어야만 한다. 현재, MEF 영양 공급 세포상에서 hES를 성장시켜 가장 높게 달성가능한 수준의 완성내배엽 및 췌장 내배엽을 수득한다. hES 단일 세포가 당해 목적을 달성할 수 있는지를 결정하기 위해, H1scp4를 14,000 세포/cm²로 MEF 영양 공급 세포상으로 분주하였다. 당해 세포를, DMEM-F12 중의 20% 녹-아웃 혈청 대용물(Invitrogen), 1x 비필수 아미노산(Invitrogen), 8ng/ml bFGF, 1mM L-글루타민 및 1mM 2-머캅토에탄올 용액을 함유하는 ES 세포 배지에서 성장시켰다. 7일 후 세포는 60 내지 70%로 컨플루언시하였고 완성내배엽 프로토콜을 세포에 적용하였다. 구체적으로, 2일째에 DMEM:F12 배지중의 100ng/ml 액티빈 A, lOng/ml Wnt3a 및 0.5% FBS를 웰당 100ul로 첨가하고 이어서 3일째에 DMEM:F12 배지중의 100ng/ml 액티빈 A 및 2% FBS로 처리하였다. 이어서 당해 세포를 TrypLE^TM Express로 제거하고 CXCR4, CD99 및 CD9 발현에 대해 FACS로 분석하였다(도 9). 90% 초과의 세포는 CXCR4 및 CD99를 발현하였다. 8% 미만의 세포는 예상된 바와 같이 CD9을 발현하였다. MEF 영양 공급 세포상으로의 단일 H1 세포의 분주는 CXCR4 양성 세포 수에 의해 측정된 바와 같이 완성내배엽 분화를 개선시킨다.

실시예 12

96웰 플레이트에서 hES 단일 세포의 분화

클러스터로서 hES 세포의 계대와 관련하여 하나의 공통된 난제는 이들을 정량하기가 어렵고 고른 비율로 성장하지 않는다는 것이다. 단일 세포는 이들이 컨플루언트 단일층으로 성장할 수 있고 계대 전에 실험 목적을 위해 균등한 분주가 보장되도록 계수될 수 있다는 이점을 갖는다. 이들 성질은 성공적인 스크리닝 보장을 위한 전제조건이다.

hES H9scp18은 1:30 성장 인자 감소된 MATRIGEL^TM로 피복된 팩카드 뷰 96웰 플레이트(Packard View 96-well plates (Perkin-Elmer))에 14,000 세포/cm² 밀도로 분주하였다. 당해 세포를 MEF 조건화된 배지중에서 3 내지 4일 동안 성장시킴에 이어서 DE 분화 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 40웰 서브세트를 표준 프로토콜(2일 동안 DMEM:F12 중의 10ng/ml Wnt3a, 100ng/ml Activin A, 및 0.5% FBS)로 처리하였다. 제2 40웰 서브세트를 Wnt3a 대신 GSK3b 억제제 IX (10OnM; EMD Chemicals, La Jolla, CA)로 처리하였다. 이어서 DMEM:F12 중의 100ng/ml 액티빈 A 및 2% FBS를 사용하여 3일 동안 2개 서브세트로 처리하였다. 배양 말기에, 당해 세포를 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정화시키고 PBS로 3회 세척하고 100ul의 PBS 중에 밤새 저장하였다. 실온에서 20분 동안 또는 4℃에서 5분 동안 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 세포에 투과시킴에 이어서 PBS로 3회 세척하고 실온에서 30분 동안 PBS 중에서 4% 닭 혈청(Invitrogen-Gibco, Carlesbad, CA)으로 차단하였다. 1차 항체(염소-항-hSox17 (R&D Systems))를 희석하고 1:100 희석으로 실온에서 1시간 동안 4% 닭 혈청중에 첨가하였다. 2차 항체, Alexa Fluor 488 닭-항염소 IgG (Invitrogen-Molecular Probes, Carlesbad, CA)를 1:200으로 PBS 중에 희석시키고 PBS로 3회 세척한 후 세포에 첨가하였다. 핵을 대비염색시키기 위해, 5μM Draq5 (Alexis Platform, Laufelfingen, Switzerland)를 실온에서 5분 동안 당해 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고 이미지화를 위해 웰당 100㎕ PBS 중에 방치하여 분화된 DE 세포의 수를 측정하였다. 당해 플레이트를 웰 대 웰의 세포수 정량 및 Sox17 염색을 위해 IN Cell 1000 분석기(GE Healthcare; Piscataway, NJ)상에서 판독하였다. Wnt3a를 사용한 처리는 웰당 최고수의 세포 핵을 유발하였고 웰간에 거의 차이가 없었다(도 10). Gsk3β 억제제를 사용한 처리는 불량한 세포 생존성을 나타내었다. 명백하게, Wnt3a 처리는 단일 ES 세포가 96웰 포맷에서 원기왕성하고 재생식 가능한 방식으로 DE를 형성하도록 할 수 있다.

실시예 13

hES 단일 세포를 사용한 스크리닝 분석

단일 세포가 96웰 포맷으로 분주 및 분화에 순응할 수 있음을 입증한 후에, 신규 화합물을 사용한 처리에 대한 민감성을 측정하였다. hES H9scp19는 1:30 성장 인자 감소된 MATRIGEL^TM로 피복된 96웰 플레이트에 14,000 세포/cm²의 밀도로 분주하였다. 당해 세포를 MEF 조건화된 배지에서 3 내지 4일 동안 성장시킴에 이어서 DE 분화 실험에서 프로세싱하였다. 총 13개의 신규 화합물을 1 내지 3μM의 농도로 3회 시험하고 DE 분화 프로토콜에서 Wnt3a 대신 소분자 억제제로 사용하였다. Wnt3a (10ng/ml) 또는 Gsk3b 억제제 IX (10OnM)를 함유하는 웰은 양성 대조군으로서 사용하였다. 모든 분화 웰은 2일 동안 단일 화합물 및 DMEM:F12 중의 100ng/ml 액티빈 A 및 0.5% FBS로 처리하고 이어서 2일 동안 화합물의 부재하에 DMEM:F12 중에 100ng/ml 액티빈 A 및 2% FBS로 처리하였다. 프로토콜 말기에, 상기 실시예 11에 기재된 바와 같이 세포를 고정화시키고 투과시키고 차단시키고 염색하여 Sox 17 발현 및 핵을 측정하였다. 이어서 당해 플레이트를 IN 세포 1000 분석기상에서 판독하였다. 당해 스크린은 H9scp21이 DE 분화 프로토콜에서 Wnt3a와 유사한 방식으로 13개 화합물중 3개에 응답했음을 나타냈다(도 11). 화합물 A는 1μM 이상의 용량에서 효과적이었고 반면 화합물 B 및 C는 1 및 3μM 둘다에서 효과적이었다. 효과적인 처리 범위(60% 초과의 Sox17 양성 세포)에서, 웰간의 표준 편차는 작았다. 따라서, 단일 세포는 스크리닝 기술을 통한 신규 화합물을 동정하기 위한 이들의 능력에 있어서 일관성이 있다.

실시예 14

롤러 병 중에서 단일 hES 세포의 증식

제조 목적을 위한 스케일 업을 용이하게 하기 위해, hES 세포는 대량으로 용이하게 증식될 필요가 있다. 현재, hES 세포를 계대시키기 위한 콜라게나제 처리는 롤러 병 또는 진탕 플라스크에 순응될 수 없다. 단일 세포로서 반복적으로 증식되고 성장된 HES 세포는 상이한 표면에 균등하게 부착하는 능력을 갖는다. 본 실시예에서, 롤러 병은 잠재적인 스케일-업 용기로서 시험하였다. H9scp19는 1:30 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM으로 피복된 480cm² 롤러 병(6.7 x 10⁶ 세포; Corning, Acton, MA)으로 14,000 세포/cm²로 분주하였다. 병 당 MEF 조건화된 배지 100ml의 용적을 사용하여 세포를 유지시키고 2일 마다 갈아주었다. 당해 병을 24시간 동안 20rev/시간으로 설정하고 나머지 시간 동안 60rev/시간으로 증가시켰다. 당해 세포는 롤러 병에 균등하게 부착하였고 4일 평가 기간 동안 가시적으로 증식하였다. 당해 세포를 TrypLE^TM Express를 사용하여 제거하고 계수하였다. 회수 계수는 13 x lO⁶ 세포가 수득됨을 나타냈고 이는 본래의 분주된 것과 비교하여 세포가 최소 2배로 됨을 나타낸다. 처음 분주된 세포의 절반 미만이 롤러 병에 부착되는 것으로 평가되었고 이는 보다 큰 실제 세포 증식이 롤러 병에서 발생함을 시사한다. 이것은 단일 세포로서 계대된 hES 세포가 자동화된 롤러 병 시스템에서 증식될 수 있음을 입증한다. 다분화성의 유지와 함께 증식률을 결정하기 위한 추가의 실험을 수행한다.

실시예 15

단일 hES 세포의 형질감염

유전자전이 세포 유형을 제조하기 위해 DNA를 세포로 도입하는 것이 유용하다. DNA는 분화를 촉진시키거나 세포의 분비를 가능하게 하기 위해 발현 벡터 또는 리포터 유전자를 함유할 수 있다. hES 세포는 클러스터에서 형질감염시키기가 어려운 것으로 입증되었다. 그러나, hES 단일 세포는 형질감염 기술에 보다 순응할 수 있다.

H9p33 세포는 TrypLE^TM Express을 사용하여 계대시키고 1:30 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM 피복된 플레이트상으로 20,000 세포/cm²를 첨가하였다. H9p33 세포는 콜라게나제를 사용하여 계대시키고 하나의 6cm 플레이트로부터 1:30 감소된 성장 인자 MATRIGEL^TM 피복된 플레이트의 6웰중 하나의 웰에 분주하였다. 3일 후, 당해 세포를 CMV-GFP로 형질감염시키고 이때 GFP는 CMV 바이러스 프로모터하에 모든 세포에서 발현된다. 구체적으로, 2 또는 4㎍의 DNA는 250㎕ Opti-MEM 배지 및 8㎕의 리포펙타민 2000(Invitrogen)중에서 250㎕ Opti-MEM으로 희석시켰다. 당해 혼합물을 실온에서 5분 후에 배합하였다. 배합된 시약을 2ml의 MEF 조건화된 배지에서 배양된 세포에 첨가하기 전에 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 당해 배지를 이후 24시간마다 MEF 조건화된 배지로 대체하였다. 3일 후, 당해 세포를 실온에서 20분 동안 4% 포름알데하이드로 고정화시키고 PBS로 2회 세척하고 PBS에서 4℃에서 밤새 방치하였다. 핵을 대조염색시키기 위해, 5μM의 Draq5 (Alexis Platform)를 실온에서 5분 동안 세포에 첨가하였다. 당해 세포를 PBS로 1회 세척하고 IN Cell 1000 분석기상에서 이미지화하기 위해 웰당 1ml의 PBS 중에 방치하여 형질감염 효율을 측정하였다(도 12). hES 단일 세포는 hES 클러스터보다 형질감염 효율에서 2배 개선됨을 보여준다. 따라서, hES 단일 세포는 개선된 형질감염 능력을 갖고 유전학적으로 변형시키기가 용이하다. 또한 다른 형질감염 방법 또는 시약을 사용한 최적화와 함께 단일 세포 ES 세포 형질감염을 보다 크게 개선시킬 수 있다.

실시예 16

영양 공급 세포 층상에서 배양된 hES 세포 클러스터의 영양 공급 세포의 세포외 매트릭스상에서 배양된 단일 hES 세포로의 전환은 영양 공급 세포의 제거를 요구한다

트립신, 재조합 트립신(TrypLE^TM), 또는 Accutase^TM(무척추동물 유래 트립신형 효소)와 같은 효소를 사용한 포유동물 세포의 계대는 연구 및 제조 셋팅에서 1차 및 불멸화된 세포주 둘다의 세포 배양을 위한 현재의 표준방법이다. 이들 효소는 고효율 포맷으로서 384 웰 플레이트 또는 다중층 확대가능한 배양 용기와 같은 다양한 플레이팅에 순응할 수 있는 재생가능한 방식으로 계수되고, 분석되고 조작되고 계대될 수 있는 세포의 균질의 단일 세포 현탁액을 생성시킨다.

단일 세포 계대의 명확한 이점 때문에 단일 세포로서 사람 배아 줄기 세포를 계대시키는 방법의 개발이 상당한 관심 대상이 되었다. 그러나, 현재 사람 배아 줄기 세포를 사용한 최상의 수행은 배아 세포의 클러스터를 유지하는 물리적 파괴 또는 효소(콜라게나제 또는 중성 프로테아제)를 사용한 계대에 의해 세포가 클러스터로 계대될 것을 요구한다. 당해 분야의 과거 연구는 영양 공급 세포(Cellartis SCEDTM461 주)상으로 단일 세포로서 계대될 수 있는 세포를 유도하거나 Accutase^TM를 사용한 MATRIGEL^TM 상에서 콜라게나제 계대된 클러스터로부터 단일 세포로의 단일 세포를 유도하였다(참조: R. Bajpai et al., 2008).

본원에서 TrypLE^TM 또는 Accutase^TM을 사용한 벌크 계대 방법에서 영양 공급 세포로부터 직접 매트리겔로 hES 세포를 취득하는 단일 세포 계대 방법을 개발하고자 하였다. 당해 결과는 MATRIGEL^TM 상으로 클러스터 기본 콜라게나제 계대의 중간 단계 없이 TrypLE^TM 또는 Accutase^TM 벌크 계대를 사용하여 직접 MATRIGEL^TM으로의 hES 세포의 클러스터 스타일 영양 공급 세포 기본 계대를 취하는 것은 분화된 세포 집단의 출현으로 인해 비효율적이고 따라서 균질의 원기왕성한 hES 세포 배양을 수득할 가능성이 적음을 나타낸다.

결과

영양 공급 세포 기본 배양으로부터 hES 세포의 영양 공급 세포 부재 배양으로 전환시키기 위한 노력으로 hESC 배지에서 MEF 영양 공급 세포 층에 의해 지지되고 5일 동안 6웰 플레이트의 10cm² 웰상에서 성장시킨 H1 37회 계대 hES 세포를 계대하였다. 당해 세포를 TrypLE^TM , Accutase^TM , 또는 1mg/ml의 콜라게나제를 사용하여 계대하였다.

효소를 세포에 첨가하기 전에, 소비된 배지를 흡인인출하고 1ml PBS(Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 부재)를 각각의 웰에 첨가하고 다시 흡인인출하고 이어서 1ml의 실온 효소(콜라게나제, Accutase^TM, 또는 TrypLE^TM)를 첨가하였다. Accutase^TM 또는 TrypLE^TM를 실온에 도달한 후에 스톡 농도로 사용하였다. 콜라게나제를 -80℃ 동결기로부터 제거하고 해동시키고 9ml의 DMEM/F12와 혼합하고 멸균 여과하고 사용전에 실온이 될때까지 방치하였다.

당해 세포를 37℃에서 10분 동안 효소 중에서 항온처리하였다. Accutase^TM 또는 TrypLE^TM는 10분 처리 후 모든 세포가 디쉬로부터 완전히 부양되도록 하였다. 콜라게나제는 10분 항온처리 후 세포를 부양시키지 않아서 세포는 10분 항온처리 후 10ml의 유리 피펫으로 박리시켰다. DMEM-F12 중의 1ml의 2% 프로부민을 각각의 웰에 첨가하고 웰중의 배합 총 용량을 50ml의 멸균 원뿔 튜브로 옮겨 가능한 한 많은 세포가 부양되고 현탁되도록 한다.

당해 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리함에 이어서 2% 프로부민을 사용하여 추가로 세척하고 200 x g에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서 세포를 MEF 조건화된 배지에서 재현탁시키고 1 대 3.5 비율로 MATRIGEL^TM (DMEM 중에 1:30 희석) 피복된 T25 플라스크상으로 분주하고 37℃, 5% CO₂, 습윤화된 배양기에 위치시켰다.

세포수는 개선된 뉴바우어 혈구 계측기(Improved Neubauer hemocytomer)로 계수하여 계산하였다. Accutase^TM 으로 부양된 세포는 10cm² 웰당 3.8 x 10⁶ 개의 세포 밀도를 가졌다. TrypLE^TM으로 부양된 세포는 10cm² 웰당 3.7 x 10⁶의 세포 밀도를 가졌다. 콜라게나제는 콜로니 유형 때문에 혈구 계측기로 계산할 수 없다. 1 대 3.5 분배율(split ratio)이 주어진 경우, 본 발명자는 Accutase^TM 처리된 세포를 T25 플라스크당 2.72 x 10⁶개 세포의 분주 밀도 또는 cm²당 lO8,OO0개 세포의 분주 밀도로 분주하였고, TrypLE^TM 처리된 세포는 T25 플라스크당 2.65 x 10⁶개 세포의 분주 밀도 또는 cm²당 105,000개의 세포 밀도로 분주하였다. 본 발명자는 콜라게나제 처리된 웰이 유사한 농도 (105,000 내지 108,000 세포/cm²)로 분주되었다고 가정하였는데 그 이유는 효소 처리 전 웰간에 hES 밀도에 감지할 만한 차이가 없었기 때문이다. 다음 계대에서 계수 목적을 위해 추가의 플라스크에 콜라게나제 부양된 세포를 분주하였다.

16㎍/ml의 bFGF가 보충된 MEF 조건화된 배지를 매일 갈아주면서 4일 동안 세포를 유지시켰다. 배양 4일 후 배양물은 컨플루언시하고 단일 세포 처리된 hES 세포는 hES 세포의 단일층을 형성하고 약간의 섬유아세포 포켓을 갖는 반면 클러스터 계대된 hES 세포는 hES 세포의 대형 콜로니 유형 클러스터를 형성하였다(도 13). 이어서 이들 세포는 다시 계대하였다.

이전에 기재한 바와 같이, 당해 세포는 37℃에서 10분 동안 효소로 항온처리하였다. Accutase^TM 및 TrypLE^TM은 10분 처리 후 플라스틱 및 MATRIGEL^TM로부터 세포가 부양되도록 하였고 세포를 추가로 37℃에서 총 45분 동안 항온처리하였다. 추가의 콜라게나제 플라스크를 Accutase^TM를 사용하여 부양시켰다. 이어서 단일 세포를 개선된 뉴바우어 혈구 계측기로 계산하였다.

이어서 DMEM-F12 중의 2ml의 2% 프로알부민을, 효소 항온처리 후 각각의 플라스크에 첨가하고 플라스크로부터 총 용적(약 4ml)을 5 내지 10회 상향 하향으로 피펫팅하여 가능한 한 많은 세포를 현탁시켰다. 이어서 당해 현탁액을 50ml의 원뿔 튜브로 옮기고 200 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서 세포를 16㎍/ml의 bFGF가 보충된 MEF 조건화된 배지에서 재현탁시키고 이어서 1:4의 비율로 1:30의 MATRIGEL^TM으로 사전에 피복된 T25 플라스크에 분주하였다.

배양 4일 후 Accutase^TM 계대된 세포는 총 5.6 x 10⁶개의 세포 밀도(223,000개 세포/cm²)를 가졌고, TrypLE^TM 계대된 세포는 배양 4일 후 총 5.05 x 10⁶개의 세포 밀도(202,000개 세포/cm²)를 가졌고, 콜라게나제 계대된 세포는 배양 4일 후 총 3.45 x 10⁶의 밀도(138,000개 세포/cm²)를 가졌다. 세포가 1:4의 비율로 계대되는 경우, 세포는 Accutase^TM 계대를 위해 58,000개 세포/cm²의 밀도, TrypLE^TM 계대를 위해서는 51,000개 세포/cm²의 밀도 및 35,000개 세포/cm²의 밀도로 분주하였다.

이어서 세포는 16ng/ml의 bFGF가 보충된 MEF 조건화된 배지를 매일 갈아주면서 추가로 6일 동안 성장시켰다. 콜라게나제로 계대된 세포는 밀집된 균일 세포의 대형 콜로니를 형성하고 분화된/섬유아세포형 세포는 드물고, Accutase^TM 또는 TrypLE^TM을 사용하여 계대된 세포는 매우 느리게 성장하고 시간 경과에 따라 성장을 멈추거나 분화하는 hES 세포로부터 형성될 가능성 있는 섬유아세포형 세포와 함께 과성장하였다(도 14).

이들 결과는, 클러스터 유형의 계대(콜라게나제 또는 중성 프로테아제)를 지지하는 물리적 계대 또는 효소를 사용하는 영양 공급 세포에서 영양 공급 부재(MATRIGEL^TM) 배양으로 전환에서의 중간 단계는 단일 세포 계대를 개시하기 전에 MATRIGEL^TM 상에서 영양 공급 세포 부재 배양으로 순응시키는데 최상임을 제안한다.

본원 전반에 걸쳐 인용된 공개문헌은 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다. 본 발명의 다양한 측면이 실시예 및 바람직한 양태를 참조로 상기에서 설명되었지만, 본 발명의 범위는 이전의 기재에 의해서 한정되지 않고 특허법 원칙하에 적절히 해석된 하기의 청구항에 의해 한정되는 것임을 인지할 것이다.

Claims

a) 클러스터로서 다분화성 줄기 세포를 배양하는 단계,
b) 상기 다분화성 줄기 세포를 0.5 g/l 내지 2.5 g/l의 농도의 TrypLE^TMSELECT 또는 TrypLE^TMEXPRESS로 2분 내지 5분동안 처리하여 단일 세포로 방출시키는 단계,
c) 영양 공급 세포가 없는 조직 배양 기질 상에 상기 단일 다분화성 줄기 세포를 분주(plating)하는 단계 및
d) 상기 단일 다분화성 줄기 세포를 액티빈 A(activin A) 및 Wnt3a가 보충된 배지에서 완성 내배엽 세포(definitive endoderm cell)로 분화시킴에 이어서 상기 완성 내배엽 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시킴을 포함하는 단계적 프로토콜을 통해, 상기 단일 다분화성 줄기 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 단계
를 포함하는, 단일 세포로서의 다분화성 줄기 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 다분화성 줄기 세포가 1X 내지 0.001X 농도의 TrypLE^TMEXPRESS로 처리함에 의해 단일 세포로서 방출되는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 다분화성 줄기 세포가 1X 농도의 TrypLE^TMEXPRESS로 처리함에 의해 단일 세포로서 방출되는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 다분화성 줄기 세포가 2분 내지 5분 동안 TrypLE^TMEXPRESS로 처리함에 의해 단일 세포로서 방출되는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 다분화성 줄기 세포가 5분 동안 TrypLE^TMEXPRESS로 처리함에 의해 단일 세포로서 방출되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 조직 배양 기질이 MATRIGEL^TM, 피브로넥틴, 라미닌, 사람 혈청 및 콜라겐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 다분화성 줄기 세포가 사람 배아 줄기 세포인, 방법.
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