JP2023551404A - 異種間移植のための成長ホルモン受容体ノックアウトを有する多重トランスジェニックブタ - Google Patents

異種間移植のための成長ホルモン受容体ノックアウトを有する多重トランスジェニックブタ Download PDF

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Abstract

本開示は、有利にはこれらの動物を異種間移植のための好適なドナーにする複数の遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック豚動物）を対象とする。本開示は、これらの動物に由来する臓器、臓器断片、組織および細胞、ならびにそれらの治療的使用に及ぶ。本開示はさらに、このような動物を作製する方法に及ぶ。ある特定の実施形態において、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック豚動物）は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）遺伝子の発現が低減されているか、またはＧＨＲタンパク質の機能が損なわれている。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、ありとあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、２０２０年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／１１６，７１８号明細書の優先権を主張する。
技術分野
本開示は、一般的に、異種間移植治療に特に有用なドナー動物、ドナー組織およびドナー細胞に関し、より詳細には、少なくとも６つの遺伝学的改変を含む多重トランスジェニック豚動物であって、この遺伝学的改変は、これらの豚動物を異種間移植のための好適なドナーにする多重トランスジェニック豚動物、それに加えて、これらの豚動物に由来する組織および細胞に関する。
異種間移植（異なる種のドナーからの臓器、組織および細胞の移植）は、ヒトドナーの不足に効果的に対処することができる。多くの方法で有利である一方で、異種間移植は、同種間移植より複雑な免疫学的なシナリオを生じる。異種間移植の最も深刻な障壁は、免疫メカニズムのカスケードによる植え付けられた臓器の拒絶であり、このカスケードは、３つの相：超急性拒絶反応（ＨＡＲ）、急性体液性異種移植片拒絶反応（ＡＨＸＲ）、およびＴ細胞媒介細胞性拒絶反応に分けられる。ＨＡＲは、移植片再灌流後の数分から数時間以内に、回復不能の移植片のダメージと喪失が起こる非常に急速な事象である。
相当な努力が、ドナー動物の遺伝学的改変を介して異種間移植によって生じる免疫バリアに取り組むことに向けられてきた。最も一般的に使用されるドナー動物は、ブタである。ブタは、多くの解剖学的および生理学的な特徴をヒトと共有しているため、異種間移植におけるほとんどの調査の焦点であり続けている。さらにブタは、妊娠期間が比較的短く、病原体がない環境で飼育することができる。ブタはまた、一般的に人間の食物源として使用されるために、ほとんどの動物研究（例えば、霊長類）に関連する同じ倫理上の問題がない。
異種間移植後のブタ組織を保護するために有効な免疫抑制および抗炎症療法と組み合わせた、複数の遺伝学的改変を有するブタの利用可能性の増加のために、異種間移植は大きく進歩している。しかしながら、新規の生理学的不適合の表現型が、豚由来異種移植片のレシピエントで観察されている。豚由来異種移植片は、非ヒト霊長類モデルにおいて同所移植後の移植片の長期的な機能を損なう固有の成長表現型を提示する。特に、ブタに由来する腎臓および心臓異種移植片は、非ヒト霊長類への移植後に急速に成長する。例えば、非ヒト霊長類への同所移植後に、ブタ心臓の心室肥大が観察されている。最終的に、ブタ由来の心臓異種移植片のレシピエントは、１ヶ月未満で早期の肥大性心筋症および拡張期心不全で死亡する。これらのブタ由来の心臓異種移植片における生命を維持する機能は、テムシロリムスおよび他の後負荷軽減剤の投与から最大６ヶ月まで延長された。
豚由来異種移植片の固有の成長表現型の原因は不明である。成長ホルモン（ＧＨ）は、多くの動物における出生後の成長の主要な刺激因子である。成長ホルモンは、成長ホルモン受容体に結合することによって、成長を刺激する。成長ホルモンシグナル伝達経路の活性化は、成長ホルモンが成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）に結合することによって開始される。このシグナル伝達事象は、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）の生産をもたらし、生物の成長、発達および免疫機能を促進する。成長ホルモンの過剰な生産は、先端巨大症または巨人症を引き起こす可能性がある。ナンセンス突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト、欠失およびミスセンス変異を含む成長ホルモン遺伝子の欠陥は、ＧＨＲシグナル伝達経路を損ない、矮小発育症を引き起こす。ＧＨＲを機能不全にするヒトＧＨＲにおける天然に存在する（naturally-occuring）突然変異は、成長遅延表現型、晩発思春期および成熟期における低身長症を特徴とする（chartacterized）ラロン症候群と関連する。ラロン症候群におけるＧＨＲ突然変異は、ＧＨＲのＧＨへの結合の失敗をもたらすか、または細胞内シグナル伝達経路を活性化するが、どちらの場合でもＩＧＦ－１生産および分泌の重度の低減を引き起こす。マウスモデルにおけるＧＨＲへの実験的な突然変異は、ラロン症候群を有するヒトで観察された成長遅延表現型を再現する。総合すると、これらの観察から、豚ＧＨＲへの意図的な突然変異は、ブタにおける成長遅延表現型を生じ、これは、異種間移植後の臓器過成長を制限するために有益であろうということが示唆される。
したがって、固有の異種移植片の急速な成長を防止し、化学的添加物の使用なしで異種移植片の生存を改善するための、ＧＨＲの発現が欠如した多重トランスジェニックドナー動物（例えば、ブタ）を異種間移植治療に使用する必要性がある。本開示はこの必要性に取り組む。
本開示は、有利にはこれらの動物を異種間移植（xenotransplanation）のための好適なドナーにする複数の遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック豚動物）を対象とする。本開示は、これらの動物に由来する臓器、臓器断片、組織および細胞、ならびにそれらの治療的使用に及ぶ。本開示はさらに、このようなトランスジェニック動物を作製する方法に及ぶ。
本開示の一態様は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化；またはＧＨＲ遺伝子のうちの少なくとも１つの対立遺伝子における、ＧＨＲの機能を損なう突然変異を引き起こす遺伝子変化を含むトランスジェニックブタを提供する。一部の実施形態において、遺伝子変化は、ＧＨＲノックアウト遺伝子変化である。一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、遺伝子変化がないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％またはそれを超えてＧＨＲの発現を減少させる。一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、遺伝子変化がないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％少ないインスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）を生産する。
本開示の一態様は、ＧＨＲ遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化；またはＧＨＲ遺伝子のうちの少なくとも１つの対立遺伝子における、ＧＨＲの機能を損なう突然変異を引き起こす遺伝子変化を含むトランスジェニックブタであって、１つまたは複数の追加の遺伝子変化をさらに含むトランスジェニックブタを提供する。一部の実施形態において、１つまたは複数の追加の遺伝子変化は、（ｉ）１つもしくは複数の遺伝子の発現の減少、（ｉｉ）１つもしくは複数の遺伝子の機能の低下、および／または（ｉｉｉ）１つもしくは複数の導入遺伝子の発現をもたらす。一部の実施形態において、１つまたは複数の導入遺伝子は、独立して、抗凝血剤、補体調節因子、イムノモジュレーター、または細胞保護的導入遺伝子から選択される。
一部の実施形態において、抗凝血剤は、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、またはＣＤ３９から選択される。一部の実施形態において、補体調節因子は、補体阻害剤である。一部の実施形態において、補体阻害剤は、ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９から選択される。一部の実施形態において、イムノモジュレーターは、免疫抑制剤である。一部の実施形態において、免疫抑制剤は、豚ＣＬＴＡ４－ＩＧ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、またはＣＤ４７から選択される。一部の実施形態において、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＤＡＦ／ＣＤ５５、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、またはＨＯ１から選択される。一部の実施形態において、１つまたは複数の遺伝子変化は、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧａｌＮＴ２）、およびシチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）の発現の減少を含む。
一態様において、本開示は、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化を含むトランスジェニックブタを提供する。一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、遺伝子変化がないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％少ないＩＧＦ－１を生産する。
一態様において、本開示は、少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニックブタを提供する。一部の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座に取り込まれ、発現されており、ブタは、アルファ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼおよび成長ホルモン受容体の発現を欠如している。一部の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座に取り込まれ、発現されており、ブタは、アルファ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、成長ホルモン受容体、β－１，４－Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧａｌＮＴ２）、およびシチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）の発現を欠如している。
一部の実施形態において、単一の遺伝子座は、（ｉ）ネイティブの遺伝子座であるか；（ｉｉ）改変されたネイティブの遺伝子座であるか；（ｉｉｉ）ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２、およびＧＧＴＡ１からなる群から選択されるか；（ｉｖ）ネイティブのＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；（ｖ）改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；（ｖｉ）トランスジェニックＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；（ｖｉｉ）ネイティブのＣＭＡＨ遺伝子座であるか；（ｖｉｉｉ）改変されたＣＭＡＨ遺伝子座であるか；（ｉｘ）トランスジェニックＣＭＡＨ遺伝子座であるか；（ｘ）ＧＧＴＡ１遺伝子座ではないか；（ｘｉ）ネイティブのβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；（ｘｉｉ）改変されたβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；または（ｘｉｉｉ）トランスジェニックβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座である。
一部の実施形態において、改変されたネイティブの遺伝子座は、遺伝子編集が媒介する挿入、欠失もしくは置換を含むか；またはトランスジェニックＤＮＡを含む。一実施形態において、トランスジェニックＤＮＡは、選択可能なマーカー（maker）遺伝子またはランディングパッドを含む。一部の実施形態において、プロモーターの少なくとも１つは、外因性プロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターである。一実施形態において、調節可能プロモーターは、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。
一部の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、第１のポリシストロンおよび第２のポリシストロンとして発現される。一部の実施形態において、少なくとも２つのプロモーターは、第１のポリシストロンの発現を制御する第１のプロモーターおよび第２のポリシストロンの発現を制御する第２のプロモーターを含む。一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、少なくとも４つのプロモーターを含み、少なくとも４つの導入遺伝子のそれぞれは、専用のプロモーターによって制御される。一実施形態において、第１のプロモーターは、第２のプロモーターと異なる。一実施形態において、第１のプロモーターは、構成的プロモーターであり、第２のプロモーターは、組織特異的プロモーターである。一実施形態において、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは、構成的プロモーターである。一実施形態において、少なくとも２つのプロモーターは、ＣＡＧおよびＴＢＭプロモーターを含む。
一部の実施形態において、組織特異的プロモーターは、内皮細胞特異的なプロモーターであり、代替の実施形態において、組織特異的プロモーターは、ＴＢＭプロモーター、ＥＰＣＲプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、および／またはＴｉｅ－２プロモーターから選択される内皮細胞特異的なプロモーターである。
一部の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、抗凝血剤、補体阻害剤、イムノモジュレーター、細胞保護的導入遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態において、（ｉ）抗凝血剤は、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、ＣＤ３９およびそれらの組合せからなる群から選択されるか；（ｉｉ）補体阻害剤は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびそれらの組合せからなる群から選択されるか；（ｉｉｉ）イムノモジュレーターは、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＬＴＡ４－ＩＧ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮおよびそれらの組合せからなる群から選択される免疫抑制剤であるか；（ｉｖ）イムノモジュレーターは、ＣＤ４７であるか；または（ｖ）細胞保護的導入遺伝子は、ＨＯ－１、Ａ２０およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態において、導入遺伝子のうちの少なくとも２つは、抗凝血剤であるか；導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、細胞保護的導入遺伝子であるか；導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、イムノモジュレーター（immunomodulatory）であるか；または導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、補体阻害剤である。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニックブタは、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変をさらに含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変は、（ｉ）遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入；またはそれらの組合せからなる群から選択されるか；（ｉｉ）ヒトＣＤ４６の取り込みおよび発現を含むか；（ｉｉｉ）ヒトＨＬＡ－Ｅの取り込みおよび発現を含むか；（ｉｖ）β４ＧａｌＮＴ２遺伝子のノックアウトを含むか；（ｖ）ＣＭＡＨ遺伝子のノックアウトを含むか；あるいは（ｖｉ）少なくとも１つのネイティブの遺伝子の発現の排除または低減をもたらす。
一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変は、少なくとも少なくとも２つの追加の導入遺伝子；第２の単一の遺伝子座における２つの追加の導入遺伝子；または第２の単一の遺伝子座における４つの追加の導入遺伝子の取り込みおよび発現を含む。一実施形態において、単一の遺伝子座は、ＧＧＴＡ１であり、第２の単一の遺伝子座は、ＣＭＡＨであるか；単一の遺伝子座は、β４ＧａｌＮＴ２であり、第２の単一の遺伝子座は、ＣＭＡＨであるか；単一の遺伝子座は、ＣＭＡＨであり、第２の単一の遺伝子座は、β４ＧａｌＮＴ２であるか；または単一の遺伝子座は、ＧＧＴＡ１であり、第２の単一の遺伝子座は、β４ＧａｌＮＴ２である。一部の実施形態において、少なくとも１つのネイティブの遺伝子は、ＣＭＡＨ、ｉｓｏＧｌｏｂｏｓｉｄｅ ３シンターゼ、β４ＧａｌＮＴ２、フォルスマン（Forrsman）シンターゼ、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、本明細書に記載される通り、ＣＤ４６と；（ｉ）ＥＰＣＲ、ＨＯ－１、ＴＢＭ、およびＣＤ４７；（ｉｉ）ＥＰＣＲ、ＨＯ１、ＴＢＭ、およびＴＦＰＩ；（ｉｉｉ）ＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；（ｉｖ）ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；または（ｖ）ＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＢＭ、およびＣＤ３９から選択される少なくとも４つの導入遺伝子の組合せとを発現する。
一部の実施形態において、４つの導入遺伝子のうち２つは、第１または第２のポリシストロンのいずれかで発現され、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＯＩ、Ａ２０、およびＣＤ４７からなる群から選択される。一部の実施形態において、ポリシストロンで発現される導入遺伝子の少なくとも１つの対は、（ａ）ＴＢＭおよびＣＤ３９；（ｂ）ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；（ｃ）Ａ２０およびＣＤ４７；（ｄ）ＴＦＰＩおよびＣＤ４７；（ｅ）ＣＩＩＴＡＫＤおよびＨＯ－１；（ｆ）ＴＢＭおよびＣＤ４７；（ｇ）ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩ；（ｈ）ＣＩＩＴＡＫＤおよびＡ２０；（ｉ）ＴＢＭおよびＡ２０；（ｊ）ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；（ｋ）ＴＢＭおよびＨＯ－１；（ｌ）ＴＢＭおよびＴＦＰＩ；（ｍ）ＣＢＴＡおよびＴＦＰＩ；（ｎ）ＥＰＣＲおよびＨＯ－１；（ｏ）ＴＢＭおよびＣＤ４７；（ｐ）ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩ；（ｑ）ＴＢＭおよびＥＰＣＲ；（ｒ）ＣＤ４７およびＨＯ－１；（ｓ）ＣＤ４６およびＣＤ４７；（ｔ）ＣＤ４６およびＨＯ－１；ならびに（ｕ）ＣＤ４６およびＴＢＭからなる群から選択される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニックブタは、成長ホルモン受容体の発現を欠如しており、（ｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；（ｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；（ｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；（ｉｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１；（ｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；（ｖｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５；（ｖｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｖｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｉｘ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｘ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｘｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｘｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１；（ｘｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７；（ｘｉｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ；（ｘｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７；（ｘｖｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１；または（ｘｖｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７から選択される遺伝子型を含む。
本開示の一態様は、本明細書に記載されるトランスジェニックブタから得られた臓器を提供する。本開示の別の態様は、本明細書に記載されるトランスジェニックブタから得られた肺または肺断片、心臓または心臓断片、腎臓または腎臓断片、肝臓または肝臓断片を提供する。本開示の別の態様は、本明細書に記載されるトランスジェニックブタから得られた組織、または細胞を提供する。
本発明の一態様は、少なくとも４つの導入遺伝子を発現するが、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現が欠如したトランスジェニックブタを作製する方法であって、（ｉ）ブタゲノム内の単一の遺伝子座に、少なくとも２つのプロモーターの制御下に少なくとも４つの導入遺伝子を取り込ませて、多遺伝子性ブタゲノムを提供すること；（ｉｉ）多遺伝子性ブタゲノムを含む細胞をトランスジェニックブタに成熟させることを含む方法を提供する。
一部の実施形態において、ブタゲノムは、体細胞ブタゲノムであり、細胞は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によって提供されるブタ接合体である。一部の実施形態において、多遺伝子性ブタゲノムは、マイクロインジェクションによって再構築されたＳＣＮＴ接合体に移入される。一実施形態において、体細胞ブタゲノムは、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を含む。一実施形態において、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変は、遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入；またはそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、多遺伝子性ブタゲノムに少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を導入することをさらに含む。一実施形態において、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変は、遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入；またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態において、ブタゲノムは、配偶子ブタゲノム、接合体ブタゲノム、胎児ブタゲノムもしくは胚盤胞ブタゲノムからなる群から選択されるか；またはブタゲノムは、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、多遺伝子性ブタゲノムに少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を導入することをさらに含む。一部の実施形態において、取り込むステップは、（ｉ）生物学的なトランスフェクション、化学的なトランスフェクション、物理的なトランスフェクション、ウイルス媒介形質導入もしくは形質転換、またはそれらの組合せからなる群から選択される方法；あるいは（ｉｉ）細胞質マイクロインジェクションおよび前核マイクロインジェクションを含む。
一部の実施形態において、単一の遺伝子座は、（ｉ）ネイティブの遺伝子座であるか；（ｉｉ）改変されたネイティブの遺伝子座であるか；（ｉｉｉ）遺伝子編集が媒介する挿入もしくは欠失もしくは置換を含む改変されたネイティブの遺伝子座であるか；（ｉｖ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはランディングパッドから選択されるトランスジェニックＤＮＡを含む改変されたネイティブの遺伝子座であるか；（ｖ）ネイティブのＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；（ｖｉ）改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；（ｖｉｉ）トランスジェニックＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；（ｖｉｉｉ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはトランスジェニックパッドを含むトランスジェニックＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；（ｘｉｘ）ネイティブのβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；（ｘ）改変された□β４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；（ｘｉ）トランスジェニックβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；（ｘｉｉ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはトランスジェニックパッドを含むトランスジェニック□β４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；（ｘｉｉｉ）単一の遺伝子座は、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２、ＡＡＶＳ１遺伝子座およびＲｏｓａ２６からなる群から選択されるネイティブの遺伝子座であるか；（ｘｉｖ）ＣＭＡＨ、□β４ＧａｌＮＴ２、ＡＡＶＳ１遺伝子座およびＲｏｓａ２６からなる群から選択される改変された遺伝子座であるか；（ｘｖ）ＧＧＴＡ１遺伝子座ではないか；（ｘｖｉ）ネイティブのＣＭＡＨ遺伝子座であるか；（ｘｖｉｉ）改変されたＣＭＡＨ遺伝子座であるか；（ｘｖｉｉｉ）トランスジェニックＣＭＡＨ遺伝子座であるか；または（ｘｉｘ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはトランスジェニックパッドを含むトランスジェニックＣＭＡＨ遺伝子座である。
一部の実施形態において、トランスジェニックＤＮＡは、ポリヌクレオチド改変酵素のための１つまたは複数の認識配列を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド改変酵素は、操作されたエンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびクラスター化された等間隔にスペーサーが入った短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼからなる群から選択される。一実施形態において、部位特異的リコンビナーゼは、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ－デルタレゾルバーゼ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ＯＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂｌ－インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼまたはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態において、遺伝子編集が媒介する挿入もしくは欠失もしくは置換は、定義された配列の１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含むか；または遺伝子編集が媒介する挿入もしくは欠失もしくは置換は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって媒介される。
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変は、（ｉ）ＣＤ４６の取り込みおよび発現；（ｉｉ）ヒトＨＬＡ－Ｅの取り込みおよび発現；または（ｉｉｉ）β４ＧａｌＮＴ２遺伝子、ＣＭＡＨ遺伝子、およびＧＧＴＡ１遺伝子からなる群から選択される遺伝子のノックアウトを含む。
本開示の一態様は、本明細書に記載される方法によって生産されたトランスジェニック動物または生産群を提供する。一部の実施形態において、本方法は、トランスジェニックブタを第２のトランスジェニックブタと交配させることをさらに含む。一実施形態において、第２のトランスジェニックブタは、少なくとも１つの遺伝学的改変を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの遺伝学的改変は、抗凝血剤、補体阻害剤、イムノモジュレーター、細胞保護的導入遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの導入遺伝子の取り込みおよび発現；または少なくとも１つの豚遺伝子のノックアウトを含む。
本開示の一態様は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生産されたトランスジェニック動物または生産群を提供する。
本開示の一態様は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、本明細書に記載されるトランスジェニックブタから得られた少なくとも１つの臓器、臓器断片、組織または細胞を、それを必要とする対象に埋め込むことを含む方法を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１つの臓器または臓器断片は、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも１つの臓器または臓器断片は、肺である。一部の実施形態において、臓器は、それを必要とする対象における罹患した臓器または機能不全の臓器を、対象に臓器を埋め込むことによって置き換えるかまたは補うために使用され、臓器の移植は、ｉ）腎臓移植；ｉｉ）肺移植、ｉｉｉ）心移植；ｉｖ）肝臓移植；またはｖ）膵臓移植である。一部の実施形態において、対象は、哺乳動物、非ヒト霊長類、またはヒトである。
一部の実施形態において、それを必要とする対象は、進行した肺疾患を有し、肺または肺断片が埋め込まれる。一部の実施形態において、進行した肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、アルファ１－アンチトリプシン疾患、または原発性肺高血圧症に関連する。
一部の実施形態において、それを必要とする対象を処置するための方法は、拒絶反応抑制剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗微生物剤、および抗ウイルス物質ならびにそれらの組合せから選択される１種または複数の治療剤を対象に投与することをさらに含む。
図１Ａは、２Ａペプチド配列によって連結された２つの導入遺伝子からなる、本開示において有用なベクターのバイシストロン性単位を描写する図である。図１Ｂは、独立したプロモーター／エンハンサーによって駆動する２つのバイシストロン性単位のための挿入部位に隣接する、およびそれらを分離するグロビンインシュレーターを含む本開示において有用な発現ベクターを描写する図である。 ６つの遺伝子編集（ＧＥ）／改変を有するブタ（６ＧＥブタ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＴＢＭ．ＣＤ３９．ＥＰＣＲ．ＤＡＦ）における遺伝子発現をフローサイトメトリーによって描写した図であり、アルファ－Ｇａｌ発現の欠如、ならびにＣＤ４６、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＥＰＣＲ、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７を含む５つのヒト導入遺伝子のロバストな発現を実証する。 ６ＧＥブタ（ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＴＢＭ．ＣＤ３９．ＥＰＣＲ．ＤＡＦ）におけるＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７に対する蛍光標識した抗体を使用した肺切片の免疫組織化学染色を描写する図である。 本開示に従って設計および生産された多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）を描写する図である。補体調節遺伝子ｈＣＤ４６およびＣＤ５５のための発現カセットを含む６つの遺伝学的改変を有するブタを、抗凝血剤遺伝子であるトロンボモジュリン（ＴＢＭ）、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ３９、および組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、免疫抑制遺伝子である豚細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４（ｐＣＴＬＡ４Ｉｇ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体ドミナントネガティブ（ＣＩＩＴＡ－ＤＮ）、および／または抗炎症導入遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ１）、Ａ２０、ＣＤ４７の内皮特異的または偏在的な発現と組み合わせて生産した。 本開示に従って設計および生産された多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）を描写する図である。補体調節遺伝子ｈＣＤ４６およびＣＤ５５のための発現カセットを含む６つの遺伝学的改変を有するブタを、抗凝血剤遺伝子であるトロンボモジュリン（ＴＢＭ）、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ３９、および組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、免疫抑制遺伝子である豚細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４（ｐＣＴＬＡ４Ｉｇ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体ドミナントネガティブ（ＣＩＩＴＡ－ＤＮ）、および／または抗炎症導入遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ１）、Ａ２０、ＣＤ４７の内皮特異的または偏在的な発現と組み合わせて生産した。 肺におけるｐＲＥＶ９４１導入遺伝子の発現分析を描写する図である。 肺におけるｐＲＥＶ９７１導入遺伝子の発現分析を描写する図である。 肺におけるｐＲＥＶ９６７導入遺伝子の発現分析を描写する図である。 ９４１ＨＤＲベクター（ＭＣＶベクターｐＲＥＶ９４１であり、ヒト導入遺伝子ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＴＢＭ、およびＣＤ３９を有する）；ＧＴＫＯ細胞における改変されたアルファＧａｌ遺伝子座の標的化に特異的な５００ｂｐの相同アームを描写する図である。 陰性対照野生型ブタおよび９４１ＨＤＲ標的化ブタからの肺切片におけるＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＴＢＭ、およびＣＤ３９導入遺伝子の免疫組織化学染色を描写する図である。４つ全てのヒト導入遺伝子の発現が観察された。強い構成的ＣＡＧプロモーターからのこのＭＣＶにおける導入遺伝子（ＥＰＣＲおよびＤＡＦ）の発現は、内皮特異的な豚ＩＣＡＭ－２（ｐＩＣＡＭ２）プロモーターの制御下の導入遺伝子（ＴＢＭおよびＣＤ３９）で観察されたものより強かった。 ９４１ＨＤＲ標的化ブタからの心臓、肝臓、肺、および腎臓組織溶解物のウェスタンブロット分析を描写する図である。ＴＢＭに特異的な抗ヒトモノクローナル抗体（内皮特異的なｐＩＣＡＭ２プロモーターの制御下で）、ならびにＥＰＣＲおよびＤＡＦ（ＣＡＧプロモーターを共有する）を、ＭＣＶ－トランスジェニックブタからの組織における導入遺伝子発現（この場合、具体的には９４１ＨＤＲ）の検出のために最適化した。ＥＰＣＲおよびＤＡＦについては、アルファＧａｌ遺伝子座組込みの環境における発現が全ての組織で観察され、ＴＢＭについてはそれより弱かったことから（肺では高いことを除く）、このゲノム中の予め決定された部位における、重要なことに生きたブタにおける複数の導入遺伝子の良好な発現が実証される。 図１１Ａは、アルファＧａｌ遺伝子座に標的化された９４１ＨＤＲを含むＴＢＭトランスジェニックＭＣＶブタの複数の系列（ブタ８７５－５）におけるヒトトロンボモジュリン発現のＥＬＩＳＡ検出を描写する図である。図１１Ｂは、アルファＧａｌ遺伝子座に標的化されたｐＲＥＶ９７１からの胎児ＭＶＥＣ細胞における全ての導入遺伝子のフローサイトメトリー発現を描写する図である。 ｃＤＮＡとしてのＣＲＩＳＰＲによって強化されたノックインおよび豚エクソン２２～２８の、ヒトの等価なエクソン２２～２８での置き換えを介した豚ｖＷＦ遺伝子座のヒト化を描写する図である。ステップ１において、両方の２つのＣＲＩＳＰＲおよびヒトエクソン２２～２８に隣接する両方のブタ相同アームを含有する標的化ベクターでの、さらに、ＧＦＰ－Ｐｕｒｏの内部選択カセットでの、ブタ線維芽細胞のトランスフェクションに従う。ＣＲＩＳＰＲによって誘導された二重鎖切断は、豚エクソン２２およびエクソン２８のジャンクションにおける鎖交換および相同性依存性修復を開始させ、ステップ２において、ヒトｖＷＦ配列を挿入する。次いで二対立遺伝子の遺伝子置き換えが確認された胎児細胞を、部位特異的なトランスポゾンで処置して（ステップ３）、選択カセットを除去し、豚－ヒト配列のフレーム内の融合を残す。 ジャンクション（５’および３’）における配列分析を描写する図であり、ヒトエクソン２２～２８のノックインおよび挿入における豚およびヒトｖＷＦ配列の完全なアライメントを示す。 血小板凝集能測定によって試験した場合の豚ｖＷＦ編集全血の正常な機能を描写する図である。 ヒト血小板に曝露されたｖＷＦ編集豚乏血小板血漿の自発的な凝集がないことを描写する図である。豚乏血小板血漿（ＰＰＰ）を、２ステップの遠心分離プロトコールを使用して、クエン酸塩で抗凝血処理された豚血液試料から調製した。ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）を、新たに採取したヒト血液試料（クエン酸塩で抗凝血処理された）から調製した。試験管中でヒトＰＲＰを豚ＰＰＰと１：１で混合し、Ｃｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ全血アグリゴメーターを使用して血小板の凝集を即座に記録した。 本開示によるバイシストロン性ＣＤ４６／ＣＤ５５（ＤＡＦ）ベクターを描写する図である。 ヒトｖＷＦでの置換による豚ｖＷＦ改変を描写する図である。 本開示によるトランスジェニックブタのための複数の導入遺伝子の、より具体的には、６つの遺伝学的改変（ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＣＤ５５．ＴＢＭ．ＣＤ３９）の発現、および５つの導入遺伝子（ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＣＤ５５．ＴＢＭ．ＣＤ３９）の取り込み発現の高いレベルを示す図である。 少なくとも１０個の改変を含み、ＧＨＲの発現が欠如した、マルチトランスジェニック豚動物を生産するために使用されるバイシストロン性（Ｂ１１８）および多シストロン性（Ｂ１６７）ベクターの概略図である。 少なくとも１０個の改変を含むマルチトランスジェニック豚動物を１ステップで生産するために使用される多シストロン性（Ｂ２００）ベクターの概略図である。マルチトランスジェニック動物は、単一の遺伝子座に組み込まれた６個またはそれより多くの導入遺伝子を含み、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ；ＧＴＫＯ）遺伝子、シチジンモノホスホ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ；ＣＭＡＨ）遺伝子、ベータ－１，４－Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧａｌＮＴ２）遺伝子；および成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如している。 ＧＨＲノックアウトの概略図である。豚ＧＨＲ遺伝子のエクソン３を標的化するＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ配列を示す。 ＧＨＲノックアウトの概略図である。４つのＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ配列単独の、または組み合わせの切断効率を示す。 ＧＨＲノックアウトの概略図である。４つのＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ配列単独の、または組み合わせの切断効率を示す。 １０個の遺伝子編集／改変を有するブタ（１０ＧＥ）を生成するための２ステップのアプローチの概略図である。 １０ＧＥブタ（swine）心臓をヒヒに移植した後に経胸壁心エコー図（ＴＴＥ）によって測定された、１０ＧＥブタ心臓隔壁厚さにおける変化を例示するラインチャートである。特に、ＧＨＲＫＯまたは非ＧＨＲＫＯ移植片のいずれかにおいて、移植後の１ヶ月で固有の成長において差はない。Ｂ３３１３０およびＢ３２８６３は、ＧＨＲＫＯ移植片を受けたヒヒを指し、Ｂ３３１２１およびＢ３２９８８は、非ＧＨＲＫＯ移植片を受けたヒヒを指す。 １０ＧＥブタ心臓をヒヒ（baboo）に移植した後にＴＴＥによって測定された、１０ＧＥブタ心臓後壁厚さにおける変化を例示するラインチャートである。点線は、術後２８日を示し、これは、以前の研究における肥大による平均的な以前の異種間移植の移植失敗に相当する。各データポイントは、隔壁または後壁のいずれかの３つの測定の平均に相当する。バーは、±標準偏差を示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＧＨＲノックアウトを生成するための戦略を示す図である。ＧＨＲエクソン３内で３７ｂｐ離れて位置する部位で切断して、フレームシフト欠失および未成熟停止コードをもたらし、結果として短縮化した非機能性ＧＨＲタンパク質が生じるように、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計したことを示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＧＨＲノックアウトを生成するための戦略を示す図である。ＧＨＲＫＯおよび野生型ブタから増幅した核酸の相対的な移動を例示するＲＴ－ＰＣＲ反応のゲル電気泳動画像を示す。 ＧＨＲＫＯブタが、野生型対照ブタと比較して成長速度および体重の低減を示したことを実証するＧＨＲＫＯブタの成長チャートである。曲線は、雄および雌の最もよく適合したラインである。ＧＨＲＫＯブタの平均は、ボックスと円によって示され、標準誤差は垂直線によって示される。ＧＨＲ－ＷＴブタのデータは、個々のデータポイントとして示される。 ３匹の６ＧＥ ＧＨＲＫＯ雌の成長速度を、標準ブタのゴンペルツの方程式によって予測された上限／下限値と比較した成長チャートを示す図であり、誕生から約２５０日までの３匹の６－ＧＥ雌の成長速度は予想通りであり、確立された数学モデリングによる商業的なブタの生理学的成長の下限範囲に近づき続けたことが実証される（ゴンペルツの成長方程式；Wellock et al., Animal Science 78:370-388 (2004)）。 ２匹の１０ＧＥ（ＧＨＲＫＯ）ブタの成長速度を、標準ブタのゴンペルツの方程式によって予測された上限／下限値と比較した成長チャートを示す図であり、誕生から約１３０日までの２匹の１０－ＧＥ雄の成長速度は予想通りであり、確立された数学モデリングによる商業的なブタの生理学的成長の下限範囲に近づき続けたことが実証される（ゴンペルツの成長方程式；Wellock et al., Animal Science 78: 370-388 (2004)）。 野生型ブタと比較したＧＨＲＫＯ動物の差次的な成長を実証する、ＧＨＲＫＯ動物および野生型ブタの写真である。写真に示される両方のブタは、ＧＨＲ遺伝子座においてのみ異なるマルチトランスジェニック同腹子である。左側のブタはＧＨＲ－ＫＯであり、右側のブタは野生型である。 野生型ブタと比較してＧＨＲＫＯブタにおいて低減した血清ＩＧＦ－１レベルを実証する棒グラフである。 図２９Ａは、各ヒト導入遺伝子の発現が、尾部および耳生検に基づいて１０ＧＥブタで発現されたことを実証するウェスタンブロット分析からの結果を示す図である。１０ＧＥブタからの尾部生検からの結果を示し、５２４Ｄ１－８、５２５Ｄ－１尾部における導入遺伝子発現を例示する。図２９Ｂは、各ヒト導入遺伝子の発現が、尾部および耳生検に基づいて１０ＧＥブタで発現されたことを実証するウェスタンブロット分析からの結果を示す図である。１０ＧＥブタからの耳生検からの結果を示し、５２５Ｄ－１および５２５Ｄ－１５の耳パンチ試料における導入遺伝子発現を例示する。特に、全ての試料で、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＨＯ－１、ＣＤ４６およびＤＡＦが発現された。アクチンは、全ての系列におけるタンパク質の存在を示すローディング対照として機能した。 １０ＧＥブタの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における全ての遺伝学的改変を確認するフローサイトメトリー分析を示す図である。１０ＧＥブタにおけるＧＧＴＡ１（アルファｇａｌ）ノックアウト、β４ＧａｌＮＴ２ノックアウト、およびＣＭＡＨノックアウトの不活性化を実証する。 １０ＧＥブタの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における全ての遺伝学的改変を確認するフローサイトメトリー分析を示す図である。１０ＧＥブタにおけるＣＤ４６、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ２０１（ＥＰＣＲ）、ＣＤ４７、およびＣＤ１４１（ＴＢＭ）の発現を実証する。 １０ＧＥブタの心臓、腎臓および肺組織におけるヒト（ｈ）ＥＰＣＲ、ｈＴＢＭ導入遺伝子の発現を例示する免疫組織化学画像である。 １０ＧＥブタの心臓、腎臓および肺組織におけるｈＨＯ－１、ｈＣＤ４７導入遺伝子の発現を例示する免疫組織化学画像である。 １０ＧＥブタの心臓、腎臓および肺組織におけるｈＤＡＦ（ＣＤ５５）およびｈＣＤ４６導入遺伝子の発現を例示する免疫組織化学画像である。 図３２Ａは、ヒト死亡者における導入遺伝子発現の移植後分析を例示するウェスタンブロットおよび免疫組織化学画像である。ウェスタンブロットによる腎臓生検におけるヒト導入遺伝子タンパク質発現を示し、Ｓｉｍｐｌｅ ＷＥＳキャピラリー電気泳動によって、ｈＴＢＭ、ｈＥＰＣＲ、ｈＣＤ４７、ｈＨＯ１、ｈＣＤ４６、ｈＤＡＦが予測された分子量で検出されたことを実証する。操作されていないブタ（ＷＴ）からの腎臓溶解物は、導入遺伝子発現のための陰性対照として機能した。豚アクチンは、両方の試料中のタンパク質の存在を示す内因性対照として機能した。図３２Ｂは、ヒト死亡者における導入遺伝子発現の移植後分析を例示するウェスタンブロットおよび免疫組織化学画像である。免疫組織化学によるヒト導入遺伝子発現を示し、抗体結合の位置で暗い沈殿によって示される通り、腎臓切片においてｈＴＢＭ、ｈＥＰＣＲ、ｈＣＤ４７、ｈＨＯ１、ｈＣＤ４６、およびｈＤＡＦ発現が検出されたことを実証する。操作されていないブタ（ＷＴ）からの陰性対照切片において、染色は見られなかった。全ての画像は２００倍で撮った。 ＰＥＲＶの伝達およびＰＢＭＣにおけるマイクロキメリズム分析を例示するゲル電気泳動画像であり、移植後の異なる時間間隔からのｍＲＮＡを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、ＰＥＲＶまたはマイクロキメリズム（ブタ特異的なＲＰＬ４）は検出されなかったことを実証する。ブタ（＋）は、ＰＥＲＶＣ陽性ブタ対照であり、ブタ（－）は、ＰＥＲＶＣ陰性移植ブタの遺伝学的特徴である。ＧＡＰＤＨは、全ての試料におけるｍＲＮＡの存在を示す内因性対照である。ＮＣは、陰性ＰＣＲ対照／水である。結果はｑＲＴ－ＰＣＲによって確認された（データは示されない）。
遺伝子改変されたブタ（swine）は、適時の同種移植片を受けることができない末期臓器不全患者にとって、将来性のある臓器源と考えられている。しかしながら、近年、異種移植片移植における多くの失敗は、移植片の過成長との関連が示されている。特に、異種ドナー生物（例えば、ブタ）からの異種移植片が、レシピエント霊長類に移植される場合、移植された異種移植片が過成長し、これが最終的にレシピエント霊長類の死亡を引き起こす。例えば、ブタ由来の心臓異種移植片を移植した非ヒト霊長類は、最終的に、１ヶ月未満で早期の肥大性心筋症および拡張期心不全で死亡する。一部の場合で、これらの異種移植片における生命を維持する機能は、テムシロリムスや他の後負荷軽減剤の投与から、最大６ヶ月まで延長した。心臓異種移植片（xenographs）に加えて、ブタからヒヒへの異種間移植後の最初の３ヶ月に、腎臓異種移植片の急速な過成長も観察された。腎臓は腹部内に納まることが可能であるため、腎臓の急速な成長はレシピエント動物（例えば、非ヒト霊長類）にとって差し迫った危険はないが、比較的限られた胸部領域内での心臓の急速な成長は、動物にとって危険である。過成長表現型の原因は不明である。急速な成長表現型は、例えばブタと霊長類との間の成長パターンの成長の不一致によって引き起こされる可能性がある。
本開示は、テムシロリムスなどの化学的なアジュバントの使用を必要としない過成長の問題に対する代替の解決法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、固有の異種移植片の過成長および／または異種移植片レシピエントの生存は、成長ホルモン受容体が欠如したトランスジェニック動物を遺伝学的操作により作製することによって改善できることを見出した。目標は、ブタの成長（すなわちブタ組織の成長）を低減するかまたは遅くすることであった。ＧＨＲノックアウトが欠如したトランスジェニック動物（ＧＨＲＫＯ）は、ラロン症候群に関連する全ての表現型を提示する。特に、ＧＨＲＫＯ動物は正常に繁殖した。しかしながら、それらは低身長症を有し、それらの体重は対照動物の５０％より多く低減し、ほとんどの臓器の重量もそれに比例して低減した。さらに、ＧＨＲ－ＫＯ動物は、著しく低減した血清インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）レベルを示した。さらに、ＧＨＲＫＯ動物へのＩＧＦ１の投与がそれらの成長を促進したことから、ＩＧＦ１は過成長表現型に関与する可能性があることが示される。
本開示は、異種間移植のための臓器、臓器断片、組織または細胞の供給源として特に有用なトランスジェニック動物を対象とする。特に、本発明は、異種間移植のための臓器、臓器断片、組織または細胞の供給源として有用な、トランスジェニック有蹄動物、より詳細には、トランスジェニック豚動物（ブタ）を対象とする。本発明はまた、このようなドナー動物から得られた臓器、臓器断片、組織または細胞、このようなドナー動物を生産する方法、それに加えて、疾患および障害の処置における、このような動物から得られた臓器、臓器断片、組織または細胞の使用にも及ぶ。
有利には、ドナー動物は、当業界において公知の臓器、臓器断片、組織および細胞よりも、移植の状況において機能的に優れた臓器、臓器断片、組織および細胞を提供する。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、本開示の臓器、臓器断片、組織および細胞は、不一致異種間移植後に現在観察されている消費性凝固障害（播種性血管内凝固（ＤＩＣ）としても公知）、血栓性微小血管症、ＨＡＲ、および豚異種移植片の過成長の著しい低減によって、改善された生存および／または機能性を有すると考えられる。
臓器または臓器断片は、任意の好適な臓器であってもよく、例えば、肺、心臓、腎臓、肝臓または膵臓であってもよい。組織は、任意の好適な組織であってもよく、例えば、上皮または結合組織であってもよい。細胞は、任意の好適な細胞であってもよい。細胞は、任意の好適な細胞であってもよく、例えば、膵島細胞であってもよい。
例示的な実施形態において、本開示は、肺異種間移植のための臓器（すなわち、肺；心臓、および腎臓）、臓器断片、組織または細胞の供給源として特に有用なトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）を提供し、それから得られた臓器（すなわち、肺、心臓、および腎臓）、臓器断片、組織および細胞、それに加えて、トランスジェニック動物を生産する方法、ならびに肺異種間移植のためにそれから得られた臓器、組織および細胞を使用する方法に及ぶ。
有利には、トランスジェニック動物から得られた臓器、臓器断片、組織または細胞は、異種間移植後、以下：超急性拒絶反応（ＨＡＲ）、急性体液性拒絶反応（ＡＨＸＲ／ＤＸＲ）、急性細胞性異種移植片拒絶反応（ＡＣＸＲ）、および／または異種移植片の過成長のうち１つまたは複数を、低いレベルから皆無のレベルで生じる。
一実施形態において、トランスジェニック動物から得られた臓器、臓器断片、組織または細胞は、異種間移植後、異種移植片の過成長（例えば、ＩＧＦ－Ｉおよびグルコースの減少した血清レベル）を、低いレベルから皆無のレベルで生じる。一実施形態において、トランスジェニック動物から得られた臓器、臓器断片、組織または細胞は、異種間移植後、ＨＡＲおよびＡＨＸＲを、低いレベルから皆無のレベルで生じる。別の実施形態において、トランスジェニック動物から得られた臓器、臓器断片、組織または細胞は、異種間移植後、ＨＡＲ、ＡＨＸＲおよびＡＣＸＲを、低いレベルから皆無のレベルで生じる。さらに別の実施形態において、トランスジェニック動物から得られた臓器、臓器断片、組織または細胞は、異種間移植後、ＨＡＲ、ＡＨＸＲ、過成長、およびＡＣＸＲを、低いレベルから皆無のレベルで生じる。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、遺伝学的改変によって引き起こされる機能的なＧＨＲの任意の発現が欠如した豚動物であり、少なくとも数種の追加の遺伝学的改変（例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子置き換え、点突然変異、欠失、挿入、または置換（すなわち、遺伝子、遺伝子断片またはヌクレオチドの）、大きいゲノムの挿入またはそれらの組合せ）を取り込んでいる。遺伝学的改変は、例えば相同組換えまたは遺伝子編集方法などの任意の好適な技術によって媒介され得る。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、機能的なアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）およびＧＨＲの任意の発現が欠如した（遺伝学的改変またはそれ以外の方式の結果として）豚動物であり、少なくとも数種の追加の遺伝学的改変（例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子置き換え、点突然変異、欠失、挿入、または置換（すなわち、遺伝子、遺伝子断片またはヌクレオチドの）、大きいゲノムの挿入またはそれらの組合せ）を取り込んでいる。遺伝学的改変は、例えば相同組換えまたは遺伝子編集方法などの任意の好適な技術によって媒介され得る。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、機能的なアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）および／またはＧＲＨの任意の発現が欠如した（遺伝学的改変の結果として）豚動物であり、単一の遺伝子座に、少なくとも２つのプロモーターの制御下に、少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する。ある特定の実施形態において、１つのプロモーターは、１つの導入遺伝子の発現を制御し、例えば、少なくとも４つの導入遺伝子のそれぞれの発現は、単一の（専用の）プロモーターによって制御される。代替の実施形態において、１つのプロモーターは、１つより多くの導入遺伝子の発現を制御し、例えば、１つのプロモーターは、２つの導入遺伝子の発現を制御する。
有利には、４つ、またはそれより多くの導入遺伝子が、繁殖中、共に組み込まれ、共に発現され、共分離される。単一の遺伝子座は、変更してもよい。ある特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたネイティブの遺伝子座である。改変されたネイティブの遺伝子座は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲによって誘導された挿入もしくは欠失（インデル）、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、Ｎｅｏ）の導入、または１つもしくは複数の導入遺伝子の取り込みを容易にするように意図された大きいゲノムインサート（例えば、ランディングパッド）の導入などの任意の好適な技術によって改変することができる。特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座である。ＧＧＴＡ１遺伝子座は、少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現によって、例えば相同組換え、遺伝子編集の適用またはリコンビナーゼ技術によって不活性化される。単一の遺伝子座はまた、例えば、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＭＡＨ、またはβ４ＧａｌＮＴ２であってもよい。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数の追加の豚遺伝子の発現は、遺伝学的改変以外のメカニズムによって改変されてもよい。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、機能的なアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）および／またはＧＨＲの任意の発現が欠如した（遺伝学的改変またはそれ以外の方式の結果として）豚動物であり、単一の遺伝子座に、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つの、もしくは少なくとも１０個の導入遺伝子またはそれより多くの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する。一部の実施形態において、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＢＭ、ＨＯ１、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ４７である。ある特定の実施形態において、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個の導入遺伝子またはそれより多くの導入遺伝子の発現は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０個のプロモーターまたはそれより多くによって制御される。ある特定の実施形態において、プロモーターは、導入遺伝子にとって専用のものであり、すなわち、１つのプロモーターは、１つの導入遺伝子の発現を制御し、一方で代替の実施形態において、１つのプロモーターは、１つより多くの導入遺伝子の発現を制御し、例えば、１つのプロモーターは、２つの導入遺伝子の発現を制御する。有利には、２つまたはそれより多くの追加の導入遺伝子が、繁殖中、共に組み込まれ、共に発現され、共分離される。単一の遺伝子座は、変更してもよい。ある特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたネイティブの遺伝子座である。改変されたネイティブの遺伝子座は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲによって誘導された挿入もしくは欠失（インデル）、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ｎｅｏ）の導入、または１つもしくは複数の導入遺伝子の取り込みを容易にするように意図された大きいゲノムインサート（例えば、ランディングパッド）の導入などの任意の好適な技術によって改変することができる。特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座である。
ＧＧＴＡ１遺伝子座は、少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現によって、例えば相同組換え、遺伝子編集の適用またはリコンビナーゼ技術によって不活性化される。単一の遺伝子座はまた、例えば、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＭＡＨ、ＧＲＨ、またはβ４ＧａｌＮＴ２であってもよい。任意選択で、ドナー動物は、追加の遺伝学的改変を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数の追加の豚遺伝子の発現は、遺伝学的改変以外のメカニズムによって改変されてもよい。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、機能的なアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）および／またはＧＨＲの任意の発現が欠如した（遺伝学的改変またはそれ以外の方式の結果として）豚動物であり、単一の遺伝子座（すなわち、遺伝子座１）に、少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現し、第２の単一の遺伝子座（すなわち、遺伝子座２）に、１つまたは複数の追加の導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する。ある特定の実施形態において、１つのプロモーターは、１つの導入遺伝子の発現を制御する。一部の実施形態において、遺伝子座１または遺伝子座２における少なくとも４つの導入遺伝子のそれぞれの発現は、単一の（専用の）プロモーターによって制御される。代替の実施形態において、１つのプロモーターは、１つより多くの導入遺伝子の発現を制御し、例えば、１つのプロモーターは、遺伝子座１における２つの導入遺伝子の発現を制御する。特定の遺伝子座は、変更してもよい。特定の実施形態において、第１の単一の遺伝子座は、ＧＧＴＡ１であり、第２の単一の遺伝子座は、例えば、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２、ＧＨＲ、またはｖＷＦである。特定の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、それぞれの単一の遺伝子座、すなわち遺伝子座１および遺伝子座２に取り込まれ、発現されて、２つの別個の独立した遺伝子座で８つまたはそれより多くの導入遺伝子を発現する動物を生産する。ある特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたネイティブの遺伝子座である。改変されたネイティブの遺伝子座は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲによって誘導された挿入もしくは欠失（インデル）、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、Ｎｅｏ）の導入、または１つもしくは複数の導入遺伝子の取り込みを容易にするように意図された大きいゲノムインサート（例えば、ランディングパッド）の導入などの任意の好適な技術によって改変することができる。任意選択で、ドナー動物は、追加の遺伝学的改変を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数の追加の豚遺伝子の発現は、遺伝学的改変以外のメカニズムによって改変されてもよい。有利には、２つまたはそれより多くの追加の導入遺伝子が、繁殖中、共に組み込まれ、共に発現され、共分離される。
少なくとも２つのプロモーターは、変更してもよい。プロモーターは、外因性であってもよいし、またはネイティブであってもよい。例示的な実施形態において、プロモーターは、構成的であるか、または調節可能である（例えば、組織特異的、誘導性）。一実施形態において、両方のプロモーターは、構成的であってもよいし、またはドナー動物で偏在的に発現されてもよい（例えば、ＣＡＧまたは類似のプロモーターから）。２つのプロモーターを用いる別の実施形態において、１つのプロモーターは、組織特異的な方式で（例えば、内皮特異的な発現）導入遺伝子の発現を許容する場合があり、一方で第２のプロモーターは、構成的または偏在的な方式で（例えば、ＣＡＧまたは類似のプロモーターから）１つまたは複数の導入遺伝子の発現（同じ組込み部位で）を許容する場合がある。
ある特定の実施形態において、追加の遺伝学的改変（すなわち、上述した複数の導入遺伝子の取り込みおよび発現とは別に）は、これに限定されないが、豚フォン－ウィルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子などの特定の豚遺伝子の不活性化、または豚ｖＷＦ遺伝子の、ヒトｖＷＦ遺伝子からの等価なカウンターパートでの一部もしくは全ての置き換えをもたらす可能性がある。追加の遺伝学的改変と関連して不活性化することができる他の遺伝子としては、例えば、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、成長ホルモン受容体、ｉｓｏＧｌｏｂｏｓｉｄｅ ３シンターゼ、β４ＧａｌＮＴ２、フォルスマンシンターゼまたはそれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態において、導入遺伝子の取り込みのための単一の遺伝子座は、ＧＧＴＡ１遺伝子座ではなく、追加の遺伝学的改変は、ＧＧＴＡ１の不活性化を包含する。ある特定の実施形態において、追加の遺伝学的改変は、例えば、遺伝子編集によって誘導された欠失／挿入または遺伝子置換（インデル）である。
ある特定の実施形態において、追加の遺伝学的改変（すなわち、上述した複数の導入遺伝子の取り込みおよび発現とは別に）は、第２の遺伝子座における１つまたは複数の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらすことができる。
一実施形態において、本開示は、機能的なアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）および／またはＧＨＲの任意の発現が欠如した（遺伝学的改変またはそれ以外の方式の結果として）豚動物であり、豚フォン－ウィルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子の不活性化、または豚ｖＷＦ遺伝子の、ヒトｖＷＦ遺伝子からの等価なカウンターパートでの一部もしくは全ての置き換えをさらに含む。任意選択で、豚動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。ある特定の実施形態において、この動物は、１つまたは複数の遺伝学的改変を含有する第２の動物と交配してもよい。
本開示は、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現が欠如し、ＣＤ４６を発現し、少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニックブタを提供する。一部の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座に取り込まれ、発現され、少なくとも４つの導入遺伝子は、以下の組合せ、すなわち、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；ＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＢＭ、およびＣＤ３９；ＥＰＣＲ、ＨＯ－１、ＴＢＭ、およびＣＤ４７；ＥＰＣＲ、ＨＯ－１、ＴＢＭ、およびＴＦＰＩ；またはＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７から選択される。
一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、成長ホルモン受容体の発現を欠如しており、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１；またはＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７から選択される遺伝子型を含む。
一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、成長ホルモン受容体の発現を欠如しており、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１；またはＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７から選択される遺伝子型を含む。
本開示はまた、このようなトランスジェニック動物（またはそれに由来する臓器、組織もしくは細胞）を作製する方法およびそれらを使用する方法にも及ぶ。例示的な実施形態において、本開示は、少なくとも４つの導入遺伝子を発現するが、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはＧＨＲの発現が欠如したトランスジェニックブタを作製する方法であって、（ｉ）ブタゲノム内の単一の遺伝子座に、少なくとも２つのプロモーターの制御下に少なくとも４つの導入遺伝子を取り込ませて、多遺伝子性ブタゲノムを提供すること；（ｉｉ）多遺伝子性ブタゲノムを含む細胞をトランスジェニックブタに成熟させることを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、ブタゲノムは、体細胞ブタゲノムであり、細胞は、ブタ接合体である。ある特定の実施形態において、ブタゲノムは、配偶子ブタゲノム、接合体ブタゲノム、胎児ブタゲノムまたは胚盤胞ブタゲノムからなる群から選択される。例示的な実施形態において、取り込むことは、生物学的なトランスフェクション、化学的なトランスフェクション、物理的なトランスフェクション、ウイルス媒介形質導入もしくは形質転換、またはそれらの組合せからなる群から選択される方法を含む。ある特定の実施形態において、取り込むことは、細胞質マイクロインジェクションおよび前核マイクロインジェクションを含む。
例示的な実施形態において、本方法は、２Ａ技術を利用する多シストロン性ベクターなどの、機能的な、および／または生産上の利点を有する、導入遺伝子が共に組み込まれ、共に発現させることを許容するバイまたは多シストロン性ベクターの使用を含む。好ましい実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子を含有する多シストロン性ベクター内の各バイシストロンは、それ自体のプロモーターの制御下にあり、一方または両方のプロモーターは、２つまたはそれより多くの遺伝子の構成的発現をもたらす可能性があり、第２のプロモーターは、２つまたはそれより多くの遺伝子の組織特異的な発現をもたらす可能性がある。これらのベクターは、編集ヌクレアーゼおよび／または部位特異的インテグラーゼなどの遺伝学的編集ツールと組み合わせて利用される。
ある特定の実施形態において、本方法は、全ての導入遺伝子が一緒に共分離し、単一の単位として後代／子孫に継代される繁殖を容易にするために、６つまたはそれより多くの導入遺伝子を、共に組み込み、共に発現させることを許容する単一の多シストロン性ベクターの使用を含む。
本開示はまた、本開示のトランスジェニック動物から得られた１つまたは複数の臓器、臓器断片、組織または細胞で、それを必要とする対象を処置する方法にも及ぶ。例示的な実施形態において、臓器は、腎臓、肝臓、肺、心臓、膵臓または他の固形臓器である。本開示によって企図される組織の例としては、これらに限定されないが、上皮および結合組織が挙げられる。
１つより多くの臓器または臓器断片を含む移植も本発明によって企図される。例えば肺（または肺断片）、腎臓（または腎臓断片）および心臓（またはその断片）を含む移植が本開示によって企図される。
Ｉ．定義
用語「有害事象」は、本明細書で使用される場合、医療製品に関するとみなされるかどうかにかかわらず、一時的に医療製品（例えば、異種間移植）の使用に関連する、任意の都合の悪いまたは予期せぬ兆候（例えば異常な検査所見を含む）、症状、または疾患を指す。
用語「動物」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物を指す。具体的な実施形態において、動物は、少なくとも６ヶ月の月齢である。ある特定の実施形態において、動物は、離乳年齢を過ぎている。ある特定の実施形態において、動物は、繁殖年齢に達するまで生存する。本発明の動物は、「遺伝子改変」されているか、または「トランスジェニック」であり、これは、動物の少なくとも１つの細胞における、典型的には動物の少なくとも１つの生殖系列細胞への遺伝子型または表現型の作用を媒介するように、動物が、付加された、もしくは取り込まれた導入遺伝子もしくは他の外来ＤＮＡ、または改変された、例えば、標的化された、組み換えられた、中断された、欠失させた、崩壊させた、置き換えられた、抑制された、強化された、もしくはそれ以外の方法で変更された内因性遺伝子を有することを意味する。一部の実施形態において、動物は、そのゲノムの１つの対立遺伝子に組み込まれた導入遺伝子を有していてもよい（ヘテロ接合型トランスジェニック）。他の実施形態において、動物は、２つの対立遺伝子に導入遺伝子を有していてもよい（ホモ接合型トランスジェニック）。
用語「繁殖する」または「交配した」またはそれらの派生語は、本明細書で使用される場合、天然および人工の手段の両方を含む任意の生殖の手段を指す。
用語「繁殖群（breeding herd）」または「生産群（production herd）」は、本明細書で使用される場合、本開示の方法によって生成したトランスジェニック動物の群を指す。一部の実施形態において、遺伝学的改変は、動物において確認され、一緒に交配して、所望のセットの遺伝学的改変（または単一の遺伝学的改変）を有する動物群を形成することができる。国際公開第２０１２／１１２５８６号パンフレット；ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０２５０９７号明細書を参照されたい。これらの後代をさらに交配して、それらの後代において異なるまたは同じセットの遺伝学的改変（または単一の遺伝学的改変）を生じさせてもよい。この所望の遺伝学的改変を有する動物のための繁殖サイクルは、望む限り長く続けることができる。「群（herd）」は、この文脈において、同一または異なる遺伝学的改変を有する長期にわたり生産された動物の複数の世代を含み得る。「群（herd）」はまた、同一または異なる遺伝学的改変を有する動物の単一の世代を指す場合もある。
用語「ＣＲＩＳＰＲ」または「クラスター化された等間隔にスペーサーが入った短鎖反復回文配列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）」または「ＳＰＩＤＲ」または「スペーサー散在型ダイレクトリピート（SPacer Interspersed Direct Repeats）」は、本明細書で使用される場合、通常特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを指す。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（E. Coli）において認識された散在した短い配列反復（interspersed short sequence repeats、ＳＳＲｓ）の別個のクラス（Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]；およびNakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]）、および関連する遺伝子を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断を方向付けるためにＲＮＡ塩基対合を使用する真核生物のＲＮＡ干渉に機能的に類似した原核生物適応免疫系の構成要素である。ＤＮＡ ＤＳＢを方向付けることは、２つの構成要素：エンドヌクレアーゼとして機能するＣａｓ９タンパク質、ならびにＣａｓ９／ＲＮＡ複合体を標的ＤＮＡ配列に方向付けることにおいて役立つＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を必要とする（Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 9(6):467-477, 2011）。単一の標的化ＲＮＡの改変は、Ｃａｓタンパク質のヌクレオチド標的を変更するのに十分である可能性がある。一部の場合で、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９切断活性を方向付けるために、単一のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドとして操作により作製することができる（Jinek et al., Science, 337(6096):816-821, 2012）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、他所で記載されるように、細菌、酵母、ヒト、およびゼブラフィッシュで使用することができる（例えば、Jiang et al., Nat Biotechnol, 31(3):233-239, 2013；Dicarlo et al., Nucleic Acids Res, doi:10.1093/nar/gkt135, 2013；Cong et al., Science, 339(6121):819-823, 2013；Mali et al., Science, 339(6121):823-826, 2013；Cho et al., Nat Biotechnol, 31(3):230-232, 2013；およびHwang et al., Nat Biotechnol, 31(3):227-229, 2013を参照）。
本明細書で使用される場合、用語「臨床的に重要な免疫抑制レジメン」は、本明細書で開示される遺伝子改変されたブタの臓器、組織または細胞移植後に患者に提供される免疫抑制薬の臨床的に許容できるレジメンを指す。臨床的な重要性を決定することは、一般的にＦＤＡによる、薬物または処置の効能を維持しながらヒトへの安全性が保たれるように許容できるリスクと見込みの利益とのバランスをとった判定を必要とする。
用語「構成的」プロモーターは、本明細書で使用される場合、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結した場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下での細胞中での遺伝子産物の生産をもたらすヌクレオチド配列を指す。
用語「ドナー」は、本明細書で使用される場合、異種間移植のためのドナー臓器、組織または細胞の供給源として役立つ可能性がある任意の非ヒト動物を含むことを意味する。ドナーは、これらに限定されないが、胎児、新生児、若年および成人などの任意の発達段階にあってもよい。
用語「内因性」は、本明細書で使用される場合、本明細書における核酸配列および動物への言及で使用されるとき、その動物のゲノムに天然に存在する任意の核酸配列を指す。内因性核酸配列は、１つもしくは複数の遺伝子配列、遺伝子間配列、遺伝子配列もしくは遺伝子間配列の部分、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
用語「内皮特異的」、「内皮組織における特異的な導入遺伝子発現」、「内皮組織において少なくとも１つの導入遺伝子を特異的に発現する」などに関して、本明細書で使用される場合、これらの用語は、内皮組織および／または細胞に制限された導入遺伝子の発現を可能にする内皮特異的な調節エレメントの制御下にある導入遺伝子を指すと理解される。導入遺伝子の機能および発現は、内皮組織および／または細胞に制限される。
用語「内皮」は、本明細書で使用される場合、体腔内部を内張りする薄い平らな細胞の単一の層で構成される中胚葉起源の上皮である。例えば、漿膜腔または心臓内部は、内皮細胞の内層を含有し、「血管内皮」は、血管を内張りする内皮である。
用語「内皮特異的な調節エレメント」などは、本明細書で使用される場合、プロモーター、エンハンサーまたはそれらの組合せを指し、プロモーター、エンハンサーまたはそれらの組合せは、内皮組織および／または細胞に制限された導入遺伝子の発現を駆動する。調節エレメントは、内皮組織および／または細胞に制限された導入遺伝子の機能および発現を提供する。
用語「エンハンサー」は、本明細書で使用される場合、組織特異的な方式で導入遺伝子の発現の増加を促進することを意図した核酸構築物中のエレメントを指す。エンハンサーは、遺伝子転写効率を劇的に変更する外部のエレメントである（Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, pp. 708-710, Benjamin Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA(C) 1987）。ある特定の実施形態において、動物は、エンハンサーエレメントと組み合わせたプロモーターの制御下で導入遺伝子を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、エンハンサーエレメントと組み合わせて使用され、エンハンサーエレメントは、本質的にプロモーターと会合しているかまたはそれと共存するＤＮＡの非コードまたはイントロン領域である。
「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えばｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称される場合もある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含む場合がある。
用語「遺伝子」は、本明細書において、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指すのに広く使用される。したがって、遺伝子は、その発現に必要なコード配列および／または調節配列を含む。遺伝子は、例えば他のタンパク質のための認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含み得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含む様々な供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。
用語「遺伝子編集」は、本明細書で使用される場合、遺伝子編集ツールを使用して、ＤＮＡが挿入される、置き換えられる、またはゲノムから除去される遺伝子工学の一種を指す。遺伝子編集ツールの例としては、これらに限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲが挙げられる。
用語「遺伝子編集によって媒介される」または類似の用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子編集／遺伝子編集ツールの使用を含む遺伝子の改変（例えば、欠失、置換、再配列）を指す。
用語「遺伝子ノックアウト」は、本明細書で使用される場合、染色体遺伝子座にコードされた遺伝情報の崩壊の結果生じる遺伝学的改変を指す。
用語「遺伝子ノックイン」は、本明細書で使用される場合、染色体遺伝子座にコードされた遺伝情報の異なるＤＮＡ配列での置き換えの結果生じる遺伝学的改変である。
用語「遺伝学的改変」は、本明細書で使用される場合、核酸の、例えば生物のゲノム内の核酸の、１つまたは複数の変更を指す。例えば、遺伝学的改変は、遺伝子の変更、付加（例えば、遺伝子ノックイン）、および／または欠失（例えば、遺伝子ノックアウト）を指す場合がある。
発現のレベルへの言及に伴う用語「高い」は、本明細書で使用される場合、表現型（検出可能な発現または治療的有用性）を提供するのに十分とみなされる発現のレベルを指す。典型的には、発現の「高い」レベルは、超急性拒絶反応（ＨＡＲ）、急性体液性異種移植片拒絶反応（ＡＨＸＲ）、Ｔ細胞媒介細胞性拒絶反応および即時の血液媒介炎症性応答（ＩＢＭＩＲ）などの移植片拒絶反応を低減させることが可能な十分なレベルである。
用語「相同性駆動組換え（homology driven recombination）」または「相同組換え修復（homology direct repair）」または「ＨＤＲ」は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ中の二本鎖切断（ＤＳＢ）の存在によって開始される相同組換え事象を指すのに使用され（Liang et al. 1998）；ＨＤＲの特異性は、高度に効率的で標的化された二本鎖切断を生じ、標的化細胞のゲノムの正確な編集を可能にすることが公知の任意のゲノム編集技術；例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（Findlay et al. 2014；Mali et al. February 2014；およびRan et al. 2013）と組み合わせた場合に制御できる。
用語「強化された相同性駆動挿入またはノックイン」は、本明細書で使用される場合、高度に効率的で標的化された二本鎖切断を生じ、標的化細胞のゲノムの正確な編集を可能にすることが公知の、相同性駆動組換えと任意のゲノム編集技術；例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとの組合せを利用した、二本鎖切断部分に相同なＤＮＡの相同アームまたはセグメントが隣接した、ＤＮＡ構築物の挿入、より具体的には大きいＤＮＡ断片または構築物の挿入として記載される。（Mali et al. Feb 2013）。
用語「ヒト化された」は、本明細書で使用される場合、その構造（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列）が、非ヒト動物に天然に見出される特定の遺伝子またはタンパク質の構造に実質的または同一的に相当する部分を含み、さらに、関連する特定の非ヒト遺伝子またはタンパク質に見出されるものとは異なり、その代わりに相当するヒト遺伝子またはタンパク質に見出される同等の構造により密接に相当する部分も含む核酸またはタンパク質を指す。一部の実施形態において、「ヒト化」遺伝子は、実質的にヒトポリペプチド（例えば、ヒトタンパク質またはその部分（例えば、その特徴的な部分）のアミノ酸配列としてのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするものである。用語「超急性拒絶反応」は、移植後の最初の２４時間以内に起こるかまたは始まる移植した材料または組織の拒絶反応を指す。
用語「インプラント」または「移植」または「移植片」は、本明細書で使用される場合、組織または臓器を血管が発達した状態にする条件下で、対象に組織または臓器を挿入する動作を指すと理解されるものとし、さらに、そのようにして挿入された（すなわち「埋め込まれた」または「移植された」または「植え付けられた」）組織または臓器も指すものとする。哺乳動物における移植片の血管新生に好都合な条件は、大規模な血液供給ネットワークを有する移植片の部位における局所的な組織層を含む。
用語「イムノモジュレーター」は、本明細書で使用される場合、免疫応答をモジュレートする能力を有する導入遺伝子を指す。例示的な実施形態において、本開示によるイムノモジュレーターは、補体阻害剤または免疫抑制剤であってもよい。具体的な実施形態において、イムノモジュレーターは、補体阻害剤である。補体阻害剤は、ＣＤ４６（またはＭＣＰ）、ＣＤ５５、ＣＤ５９および／またはＣＲＩであってもよい。具体的な実施形態において、少なくとも２つの補体阻害剤が発現されてもよい。一実施形態において、補体阻害剤は、ＣＤ５５およびＣＤ５９であってもよい。別の実施形態において、イムノモジュレーターは、クラスＩＩトランス活性化因子またはその突然変異体であってもよい。ある特定の実施形態において、イムノモジュレーターは、クラスＩＩトランス活性化因子優性ネガティブ突然変異体（ＣＩＩＴＡ－ＤＮ）であってもよい。別の具体的な実施形態において、イムノモジュレーターは、免疫抑制剤である。免疫抑制剤は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇであってもよい。他のイムノモジュレーターは、これらに限定されないが、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＰＤＬ Ｉ、ＰＤＬ２、または腫瘍壊死因子－α関連誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）ＣＤ４７、インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７）として公知、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、および／またはＨＬＡ－ＤＲの群から選択することができる。
「誘導性」プロモーターは、本明細書で使用される場合、環境または発生調節下にあるプロモーターである。
用語「ランディングパッド」または「操作されたランディングパッド」は、本明細書で使用される場合、部位特異的リコンビナーゼおよび／または標的化エンドヌクレアーゼなどの特異的なポリヌクレオチド改変酵素と選択的に結合し、それによって改変される少なくとも１つの認識配列を含有するヌクレオチド配列を指す。一般的に、ランディングパッド配列における認識配列は、改変しようとする細胞のゲノムにおいて内因的に存在しない。標的化組込みの速度は、標的化される細胞のゲノム内に内因的に存在しない高い効率のヌクレオチド改変酵素のための認識配列を選択することによって改善することができる。内因的に存在しない認識配列の選択はまた、起こり得るオフターゲット組込みも低減する。他の態様において、改変しようとする細胞におけるネイティブの認識配列の使用が望ましい場合がある。例えば、ランディングパッド配列において複数の認識配列が採用される場合、そのうち１つまたは複数は外因性であってもよく、１つまたは複数はネイティブであってもよい。
単一のランディングパッド中に複数の認識配列が存在していてもよく、それにより、２種またはそれより多くの独特な配列を挿入できるように、２種またはそれより多くのポリヌクレオチド改変酵素によってランディングパッドを逐次的に標的化することを可能にする。代替として、ランディングパッドにおける複数の認識配列の存在は、同じ配列の複数のコピーをランディングパッドに挿入することを可能にする。ランディングパッドは、少なくとも１つの認識配列を含んでいてもよい。例えば、外因性核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０個のまたはそれより多くの認識配列を含んでいてもよい。１つより多くの認識配列を含む実施形態において、認識配列は、互いに独特であってもよいし（すなわち、異なるポリヌクレオチド改変酵素によって認識される）、同じ繰り返しの配列であってもよいし、または繰り返しの配列と独特な配列との組合せであってもよい。任意選択で、ランディングパッドは、抗生物質耐性遺伝子、代謝選択マーカー、または蛍光タンパク質などの選択可能なマーカーをコードする１つまたは複数の配列を含んでいてもよい。他の配列、例えば転写調節および制御エレメント（すなわち、プロモーター、部分的なプロモーター、プロモータートラップ、開始コドン、エンハンサー、イントロン、インシュレーターおよび他の発現エレメント）も存在していてもよい。
用語「大きい標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」は、本明細書で使用される場合、真核細胞のための大きい標的化ベクターであって、真核細胞における相同な遺伝子の標的化を実行することを意図した他のアプローチによって典型的に使用されるものより大きいクローニングしたゲノムＤＮＡの断片由来のものを含む。ＬＴＶＥＣの例としては、これらに限定されないが、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。
用語「ゲノム遺伝子座」または「遺伝子座」（locus、複数形はloci）は、本明細書で使用される場合、染色体上の遺伝子またはＤＮＡ配列の特異的な位置であり、特定の遺伝子のイントロンまたはエクソン配列の両方を含み得る。「遺伝子」は、生物において実行される機能的役割を有するポリペプチドまたはＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのストレッチを指し、したがってこれは、生物における遺伝の分子単位である。本発明の目的のために、遺伝子は、このような調節配列がコード化および／または転写された配列に隣接しているかどうかにかかわらず、遺伝子産物の生産を調節する領域を含むとみなされ得る。したがって、遺伝子としては、必ずしもこれらに限定されないが、イントロン、エクソン、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、５’または３’調節配列、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域が挙げられる。
用語「肺移植」は、本明細書で使用される場合、患者の罹患した肺をドナー由来の肺で部分的または完全に置き換える外科手術を指す。肺移植は、「片肺」であってもよく、その場合、レシピエントにおいて２つの肺のうち１つのみが取り出され、ドナーからの単一の肺で置き換えられ、または「両肺」であってもよく、その場合、両方の肺をそれぞれの側から一つずつ取り出し、ドナーからの両方の肺で置き換えることを含む。ある特定の実施形態において、肺は、心臓と一緒に移植される。
用語「肺保存」は、本明細書で使用される場合、肺の調達時間からレシピエントへの埋め込みが行われるまでのドナー肺を維持および保護するプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、語句「移植機能の喪失」は、本明細書で使用される場合、臓器または組織がドナー動物で示す正常なプロセスの任意の生理学的な崩壊または機能不全を指す。
用語「哺乳動物」は、本明細書で使用される場合、任意の非ヒト哺乳動物を指し、その例としては、これらに限定されないが、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ウシ科動物）、シカ、ラバ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスが挙げられる。ある特定の実施形態において、動物は、少なくとも３００ポンドの豚動物である。具体的な実施形態において、哺乳動物は、雌の豚であり、少なくとも１回出産したことがある。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、非ヒト霊長類であり、例えば、サルまたはヒヒである。
「マーカー」または「選択可能なマーカー」は、本明細書で使用される場合、集団中の処置された細胞の大部分からの、マーカーを発現する稀なトランスフェクトされた細胞の単離を可能にする選択マーカーである。このようなマーカー「遺伝子」としては、これらに限定されないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、またはＧＦＰなどの蛍光タンパク質が挙げられる。
用語「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログが挙げられる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有していてもよく、公知のまたは未知の任意の機能を発揮することができる。
以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座（loci）（遺伝子座（locus））、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。この用語はまた、合成主鎖を有する核酸様の構造も包含し、例えば、Eckstein, 1991；Baserga et al., 1992；Milligan, 1993；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；Mata, 1997；Strauss-Soukup, 1997；およびSamstag, 1996を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の改変されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含んでいてもよい。ヌクレオチド構造への改変は、存在する場合、ポリマーのアセンブリの前に付与されてもよいし、またはその後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識化成分とのコンジュゲーションによって、さらに改変されてもよい。
語句「作動可能に連結した」は、本明細書で使用される場合、作動可能に連結した成分がその意図した方式で機能するような関係を含む。１つの例において、タンパク質をコードする核酸配列は、適した転写調節を保持するように調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結していてもよい。
用語「臓器」は、本明細書で使用される場合、一般的な機能を発揮するように構造単位において連結された組織の集合体を指す。臓器は、固形臓器であり得る。固形臓器は、堅い組織密度を有し、中空（例えば消化管の臓器）でもなく、液体（例えば血液）でもない内臓である。固形臓器の例としては、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓および副腎が挙げられる。
用語「霊長類」は、本明細書で使用される場合、キツネザル、ロリス、メガネザル、新世界ザル、旧世界ザル、およびヒトを含む類人猿からなる霊長目に属する様々な哺乳動物を指し、手および足の爪、短い鼻、および大きい脳を特徴とする。ある特定の実施形態において、霊長類は、非ヒト霊長類である。他の実施形態において、霊長類は、ヒトである。
用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、一般的にコード領域の上流（５’）にあるＤＮＡの領域を指し、少なくとも部分的に転写の開始およびレベルを制御する。本明細書における「プロモーター」への言及は、その最も広い意味で解釈されるものとし、その例としては、古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列、例えばＴＡＴＡボックスまたは非ＴＡＴＡボックスプロモーターなど、それに加えて、発達および／もしくは環境の刺激に応答して、または組織特異的もしくは細胞型特異的な方式で遺伝子発現を変更する追加の調節エレメント（すなわち、活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）が挙げられる。プロモーターは通常、ただし必ずではないが、構造遺伝子の上流または５’に位置し、その発現が構造遺伝子を調節する。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは通常、遺伝子の転写開始部位の２ｋｂ以内に位置するが、それらは多くのｋｂ離れていてもよい。プロモーターは、細胞における発現をさらに強化する、および／またはそれに作動可能に連結された構造遺伝子の発現のタイミングもしくは誘導能を変更するために、開始部位に対してそれより遠位に配置された追加の特異的な調節エレメントを含有していてもよい。
用語「豚（porcine）」、「豚動物（porcine animal）」、「ブタ（pig）」、および「ブタ（swine）」は、本明細書で使用される場合、性別、サイズ、または品種に関係なく同じタイプの動物を指す一般名称である。用語「認識部位」または「認識配列」は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ主鎖と結合し、その部位特異的な切断を指示するための、ヌクレアーゼまたは他の酵素によって認識される特異的なＤＮＡ配列を指す。
用語「組換え部位」は、本明細書で使用される場合、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象のための基質として機能することができるヌクレオチド配列を指す。
用語「調節エレメント」および「発現制御エレメント」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、特定の環境において、作動可能に連結したコード配列の転写および／または翻訳に影響を与えることができる核酸分子を指す。これらの用語は広義に使用され、転写を促進または調節する全てのエレメントを網羅し、その例としては、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基礎的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサー、および応答エレメントが挙げられる（例えば、Lewin, “Genes V” (Oxford University Press, Oxford) pages 847-873を参照）。原核生物における例示的な調節エレメントとしては、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞で使用される調節エレメントとしては、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを挙げることができる。
用語「調節可能プロモーター」は、本明細書で使用される場合、ペプチドが動物、組織または臓器で発現されるかどうかを調節するのに使用できるプロモーターを指す。調節可能なプロモーターは、組織特異的であってもよく特異的な組織でのみ発現されるか、または一時的に調節可能であるか（特異的な時間にのみオンになるか（発生段階によって駆動する）、または誘導性エレメントによって制御されたときだけターンオンもしくはオフされるように（発現されるかまたは発現されないように）誘導可能である。（これはまた、免疫誘導性プロモーターおよびサイトカイン応答プロモーターなどの誘導性プロモーターであってもよく、例えば、インターフェロンガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１、ＩＬ－６またはＴＧＦ－ベータによって誘導されたものであってもよい）。例えば、臓器または組織がブタの一部である間、発現を防止することができるが、一旦ブタがヒトに移植されたら、細胞性免疫応答を克服する期間の間、発現が誘導できる。加えて、発現のレベルを調節可能プロモーターシステムによって制御して、レシピエントの免疫系の免疫抑制が確実に起こらないようにすることができる。
用語「調節配列」、「調節エレメント」、および「制御エレメント」は、本明細書で使用される場合、置き換え可能であり、発現させようとするポリヌクレオチド標的の上流（５’非コード配列）、その中、またはその下流（３’非翻訳配列）のポリヌクレオチド配列を指す。調節配列は、例えば、転写のタイミング、転写の量もしくはレベル、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、および／または関連する構造的なヌクレオチド配列の翻訳に影響を与える。調節配列としては、活性化因子に結合する配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、リプレッサーに結合する配列、ステム－ループ構造、翻訳開始配列、翻訳リーダー配列、転写終結配列、翻訳終結配列、プライマー結合部位などを挙げることができる。
用語「セーフハーバー」遺伝子座は、本明細書で使用される場合、トランスジェニックＤＮＡ（例えば構築物）を、損害を与えることなく付加することができ、一貫したレベルの発現をもたらすゲノム中の部位を指す。ある特定の実施形態において、本開示は、セーフハーバー遺伝子座内に導入遺伝子を含むトランスジェニックＤＮＡの取り込みおよび発現を含む。
用語「部位特異的リコンビナーゼ」は、本明細書で使用される場合、２つの組換え部位が、単一の核酸分子内で、または別個の核酸分子で物理的に離れている「組換え部位」間の組換えを容易にすることができる酵素群を指す。「部位特異的リコンビナーゼ」の例としては、これらに限定されないが、ｐｈｉＣ３１、ａｔｔ、Ｂｘｂ１、Ｒ４（インテグラーゼ）、ならびに／またはＣｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。
用語「対象」は、本明細書で使用される場合、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指し、その例としては、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などが挙げられる（例えば、特定の処置（例えば、移植片）のレシピエントであるか、または移植片のドナーである。用語「対象」および「患者」は、本明細書において別段の指定がない限り、ヒト対象への言及において同義的に使用される（例えば、対象は、移植片のドナーである）。
用語「標的化ベクター」は、本明細書で使用される場合、典型的には、標的遺伝子または標的配列の重要なエレメントに隣接する、ゲノムＤＮＡに相同な特別に設計したＤＮＡアームを含む組換えＤＮＡ構築物を指す。細胞に導入されると、標的化ベクターは、相同組換えを介して細胞のゲノムに組み込まれる。「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたはそれを特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、細胞中での遺伝子産物の生産を生じさせるヌクレオチド配列である。
用語「組織」は、本明細書で使用される場合、細胞と完全な臓器との間の中間の細胞の組織的なレベルを指す。組織は、特定の機能を一緒に行う同じ起源からの類似した細胞の集合体である。次いで複数の組織を一緒に機能的グループにまとめることによって臓器が形成される。本開示によって企図される組織の例としては、これらに限定されないが、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織および石灰化組織が挙げられる。結合組織の例は、血液、骨、腱、靱帯、脂肪および疎性結合組織であり、これらはまた、線維性結合組織、骨格結合組織、および液体結合組織として分類することができる。筋肉組織は、３つの別個のカテゴリーに分けられる：臓器の内部層に見出される、内臓筋または平滑筋；典型的には骨に付着しており、全体の運動をもたらす、骨格筋；および生物全体に血液を注送するように収縮する心臓に見出される、心筋。中枢神経系および末梢神経系を構成する細胞は、神経（または神経系）組織として分類される。中枢神経系において、神経系組織は、脳および脊髄を形成する。末梢神経系において、神経系組織は、脳神経および運動ニューロンを含む脊髄神経を形成する。
用語「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」は、本明細書で使用される場合、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成した人工制限酵素を指す。これらの試薬は、効率的な、プログラム可能な、特異的なＤＮＡ切断を可能にし、インサイチュでのゲノム編集に有効な手段である。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実質的にいかなるＤＮＡ配列とも結合するようにすぐに操作することができる。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書で使用される場合、広義であり、その例としては、別のＴＡＬＥＮの助けがなくても二本鎖ＤＮＡを切断することができるモノマーＴＡＬＥＮが挙げられる。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するように一緒に機能するように操作されたＴＡＬＥＮの対の一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの旋進性を参照して左-ＴＡＬＥＮおよび右-ＴＡＬＥＮと称する場合もある。米国特許出願第１２/９６５,５９０号明細書；米国特許出願第１３/４２６,９９１号明細書（米国特許第８,４５０,４７１号明細書）；米国特許出願第１３/４２７,０４０号明細書（米国特許第８,４４０,４３１号明細書）；米国特許出願第１３/４２７,１３７号明細書（米国特許第８,４４０,４３２号明細書）；および米国特許出願第１３/７３８,３８１号明細書を参照されたく、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、本明細書で使用される場合、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換または形質導入されたものである。細胞は、初代の対象細胞およびその後代を含む。
「導入遺伝子」は、一方の生物から他方の生物に移入した遺伝子または遺伝物質である。導入遺伝子が生物に移入されると、生物は、トランスジェニック生物と称することができる。典型的には、この用語は、一方の生物から単離され、異なる生物に導入される遺伝子配列を含有するＤＮＡのセグメントを記載している。このＤＮＡの非ネイティブのセグメントは、トランスジェニック生物でＲＮＡもしくはタンパク質を生産する能力を保持していてもよいし、またはトランスジェニック生物の遺伝子コードの正常な機能を変更することもできる。一般的に、ＤＮＡは、生物の生殖系列に取り込まれる。例えば、高等脊椎動物において、これは受精卵の核に外来ＤＮＡを注射することによって、または体細胞核移植を介して達成することができ、そこで所望の導入遺伝子を有する体細胞が宿主ゲノムに取り込まれ、除核した卵母細胞に移入され、代理母に移植した後に生きた子孫が得られる。導入遺伝子は、細胞に挿入されたら、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のコピーであるｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）セグメントか、またはゲノムＤＮＡのその元の領域に存在する遺伝子それ自体のいずれかの形態であり得る。
導入遺伝子は、特にBAC（細菌人工染色体）もしくはコスミドに大きいクローンとして導入される場合、ゲノム配列であってもよいし、または多くの場合、ｃＤＮＡ領域と共に両方のゲノムＤＮＡ（イントロン領域、例えばイントロン１を含む）、５’もしくは３’調節領域の組合せを特徴とする「ミニ遺伝子」の形態であってもよい。導入遺伝子「発現」は、本明細書の文脈において、別段の規定がない限り、非ネイティブの核酸からのペプチド配列が、宿主中の少なくとも１つの細胞で発現されることを意味する。ペプチドは、宿主ゲノムに取り込まれた導入遺伝子から発現され得る。導入遺伝子は、タンパク質またはその断片（例えば、機能的な断片）をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。タンパク質の断片（例えば、機能的な断片）は、タンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも、または少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を含んでいてもよい。タンパク質の断片は、タンパク質の機能的な断片であってもよい。タンパク質の機能的な断片は、タンパク質の機能の一部または全てを保持していてもよい。
用語「移植寛容」は、本明細書で使用される場合、現行の薬理学的な免疫抑制の必要性がないドナー特異的な不応答の状況と定義される。移植寛容は、免疫抑制剤に関連する有害事象の多くを排除する可能性がある。そのようなものとして、寛容の誘導は、改善された異種移植片の受容をもたらす可能性がある。一実施形態において、寛容の誘導は、異種移植片拒絶反応の臨床症状の減少によって同定することができる。別の実施形態において、寛容の誘導は、異種移植片移植に関連する代謝性、炎症性および増殖性の病的な状態または疾患を緩和または防止することができる。さらに別の実施形態において、寛容の誘導は、異種移植片拒絶反応を防止するのに使用される免疫抑制療法の投与に関連する有害な臨床的状態または疾患を、緩和する、または減少させる、または防止することができる。なおもさらに別の実施形態において、寛容の誘導は、異種移植片の生存を促進することができる。異なる実施形態において、寛容の誘導は、これらの疾患または状態を呈する患者における再発を防止することができる。
用語「有蹄動物」は、有蹄哺乳動物を指す。偶蹄類は、２本の足指の（蹄が二つに割れた）有蹄動物であり、その例としては、レイヨウ、ラクダ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ、およびヒツジが挙げられる。奇蹄類は、足指が奇数の有蹄動物であり、その例としては、ウマ、シマウマ、サイ、およびバクが挙げられる。有蹄動物という用語は、本明細書で使用される場合、成体、胎芽または胎児の有蹄動物を指す。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを宿主細胞に移入することが可能な部分を指す。ベクターとしては、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖の核酸分子；１つまたは複数の遊離末端を含む、遊離末端を含まない（例えば環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む核酸分子；および当業界において公知のポリヌクレオチドの他の変種が挙げられる。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、環状の二本鎖ＤＮＡループを指し、これに、追加のＤＮＡセグメントが、例えば標準的な分子クローニング技術によって挿入されていてもよい。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損性アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターとしてはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって運搬されるポリヌクレオチドも挙げられる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書では、「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術において有用性を有する一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含んでいてもよく、これは、組換え発現ベクターが、発現させようとする核酸配列に作動可能に連結された、発現のために使用しようとする宿主細胞に基づき選択され得る１つまたは複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結した」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で調節エレメントに連結されていること（例えば、インビトロの転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）を意味することが意図される。組換えおよびクローニング方法に関しては、米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書に言及されており、その内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡベクターであり、より好ましくは、本発明によるタンパク質をコードするＲＮＡを発現することが可能である。
多数の好適なベクターが当業界において記載されており、その例は、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory PressまたはDNA cloning: a practical approach, Volume II: Expression systems、D. M. Glover編(IRL Press, 1995)に見出すことができる。
用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」は、本明細書で使用される場合、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびａＤＮＡ切断ドメインを含む人工の（操作された）ＤＮＡ結合タンパク質を指す。ジンクフィンガードメインは、特異的な所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作でき、これは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の固有の配列を標的化することを可能にする。これらは、使用者が特定した位置でＤＮＡ中に二本鎖切断を生じることによってゲノムの標的化編集を容易にする。各ＺＦＮは、２つの機能性ドメイン：ａ．）それぞれＤＮＡの固有な六量体（６ｂｐ）配列を認識する２つのフィンガーモジュールの鎖で構成されるＤＮＡ結合ドメインを含有する。２つのフィンガーモジュールがとじ合わされて、それぞれ≧２４ｂｐの特異性を有するジンクフィンガータンパク質を形成する。ｂ．）ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインで構成されるＤＮＡ切断ドメイン。ＤＮＡ結合およびＤＮＡ切断ドメインが一緒に融合すると、「ゲノムはさみ（genomic scissor）」の高度に特異的な対が生じる。ＺＦＮは、遺伝子編集ツールである。
ＩＩ．トランスジェニック動物
本開示は、異種間移植における使用のための臓器、臓器断片、組織または細胞の供給源として役立つトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック豚動物）を提供する。本開示は、トランスジェニック動物、加えてこのような動物の群、例えば生産群から得られた臓器、組織および細胞に及ぶ。
動物は、任意の好適な動物であってもよい。例示的な実施形態において、動物は、有蹄動物、より詳細には、豚動物またはブタである。
トランスジェニックドナー動物（例えば、有蹄動物、豚動物またはブタ）は、遺伝子改変されており、より詳細には、は、複数の導入遺伝子を含み、例えば、単一の遺伝子座に複数の導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、トランスジェニックドナー動物は、第１の遺伝子座（すなわち、遺伝子座１）と第２の遺伝子座（すなわち、遺伝子座２）とを分割する複数の導入遺伝子を発現するように遺伝子改変されている。
遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座であってもよいし、または改変されたネイティブの遺伝子座であってもよい。標的化を容易にするためのネイティブの遺伝子座を改変するための様々な戦略が本明細書に記載される。
例示的な実施形態において、本開示は、単一の遺伝子座に、少なくとも２つのプロモーター（例えば、外因性プロモーター、または外因性およびネイティブのプロモーターの組合せ）の制御下に、少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現を含むトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック豚動物）であって、ブタは、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠如している、トランスジェニック動物を提供する。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変、例えば、これらに限定されないが、ノックアウトおよびノックインなどの遺伝子の付加および／または欠失、それに加えて、遺伝子置換および再配列などを含む。
特定の実施形態において、本開示は、単一の遺伝子座に取り込まれ、発現される少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニック豚動物を提供し、少なくとも４つの導入遺伝子の発現は、専用のプロモーターによって制御され、すなわち、プロモーターがそれぞれ個々の導入遺伝子の発現を駆動させる。例えば、トランスジェニック動物が、単一の遺伝子座に４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する場合、それらの導入遺伝子の発現は、４つのプロモーターによって駆動され、この場合、各プロモーターは特定の導入遺伝子に特異的である。代替の実施形態において、所与のプロモーターは、１つより多くの導入遺伝子（例えば、２つの導入遺伝子、３つの導入遺伝子）の発現を制御する。例えば、トランスジェニック動物が４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する場合、４つの導入遺伝子のうち２つは、第１のプロモーターによって制御されたポリシストロンとして発現され、４つの導入遺伝子のうち２つは、第２のプロモーターによって制御されたポリシストロンとして発現される。
一部の実施形態において、第１または第２のポリシストロンのいずれかで発現される４つの導入遺伝子のうち２つは、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＯＩ、Ａ２０、およびＣＤ４７からなる群から選択される。一部の実施形態において、導入遺伝子の少なくとも１つの対は、ＴＢＭおよびＣＤ３９；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；Ａ２０およびＣＤ４７；ＴＦＰＩおよびＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＡ２０；ＴＢＭおよびＡ２０；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；ＴＢＭおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡおよびＴＦＰＩ；ＥＰＣＲおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩ；ＴＢＭおよびＥＰＣＲ；ＣＤ４７およびＨＯ－１；ＣＤ４６およびＣＤ４７；ＣＤ４６およびＨＯ－１；ＣＤ４６およびＴＢＭ；ならびにＨＬＡ－ＥおよびＣＤ４７からなる群から選択される。
例示的な実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、イムノモジュレーター（例えば、免疫抑制剤）、抗凝血剤、補体阻害剤および凍結保護導入遺伝子からなる群から選択される。例示的な実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座である。他の実施形態において、単一の遺伝子座は、改変されたネイティブの遺伝子座であり、例えばトランスジェニック遺伝子座である。トランスジェニック遺伝子座は、例えば、選択可能なマーカー遺伝子を含有する遺伝子座またはランディングパッドを含有する遺伝子座であってもよい。
例示的な実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）中に提供され、ランダムな組込み、または遺伝子編集ツールを利用することのいずれかによって取り込まれる。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有していてもよい。追加の遺伝学的改変は、例えば、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックインであってもよい。特定の実施形態において、追加の遺伝学的改変は、キメラ豚－ヒトｖＷＦを含む。
別の実施形態において、本開示は、少なくとも５つの遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、遺伝学的改変は、（ｉ）アルファ１，ガラクトシルトランスフェラーゼの発現の欠如（すなわち、アルファＧａｌヌルである）、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす、トランスジェニック動物を提供する。導入遺伝子の発現は、プロモーター、専用のプロモーターまたは２つもしくはそれより多くの導入遺伝子の発現を制御するプロモーターのいずれかによって駆動される。プロモーターは、外因性プロモーターであってもよいし、または外因性およびネイティブのプロモーターの組合せであってもよい。
ある特定の実施形態において、導入遺伝子の組合せの発現をよりよくモジュレートするために、４つより多くの付加された導入遺伝子が、１つより多くの遺伝子座において導入遺伝子の取り込みを含む可能性がある（例えば、ＧＧＴＡ１に組み込まれた、少なくとも２つのプロモーターの制御下における、少なくとも４つの導入遺伝子の組込み、および第２の遺伝子座（例えば、ＣＭＡＨまたはβ４ＧａｌＮＴ２またはＡＡＶＳ１またはＲｏｓａ２６）における、第２の多シストロン性の組込み））。第２の遺伝子座が遺伝子改変されているある特定の実施形態において、このような第２の遺伝子座は、別の豚遺伝子の発現を不活性化するように改変されていてもよい（例えば、遺伝子編集および／または相同組換え技術の適用を介して）。例示的な実施形態において、第２の遺伝子座として取り込まれ発現される複数の導入遺伝子は、イムノモジュレーター、補体阻害剤、抗凝血剤および凍結保護導入遺伝子からなる群から選択される。例示的な実施形態において、第２の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座（例えば、ランディングパッド）である。例示的な実施形態において、第２の遺伝子座における少なくとも２つの導入遺伝子は、ＭＣＶ中に提供され、遺伝子編集ツールを利用して取り込まれる。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有していてもよい。
一実施形態において、本開示は、少なくとも４つの遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、遺伝学的改変は、（ｉ）アルファ１，ガラクトシルトランスフェラーゼの低減した発現、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらし、このような４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーター（例えば、外因性プロモーターまたは外因性およびネイティブのプロモーターの組合せ）の制御下で発現される、トランスジェニック動物を提供する。例示的な実施形態において、導入遺伝子は、イムノモジュレーター、抗凝血剤、補体阻害剤および凍結保護導入遺伝子からなる群から選択される。例示的な実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座（例えば、ランディングパッド）である。例示的な実施形態において、少なくとも２つの導入遺伝子は、相同組換えの効率または相同性に依存する修復を強化するために、ＭＣＶ中に提供され、遺伝子編集ツール（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮ）を利用して取り込まれる。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有していてもよい。
別の実施形態において、本開示は、少なくとも５つの遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、遺伝学的改変は、（ｉ）アルファ１，ガラクトシルトランスフェラーゼの低減した発現、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、または２つの遺伝子座間を分割した、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす、トランスジェニック動物を提供する。例示的な実施形態において、導入遺伝子は、イムノモジュレーター、補体阻害剤、抗凝血剤および凍結保護導入遺伝子からなる群から選択される。例示的な実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座（例えば、ランディングパッド）である。例示的な実施形態において、少なくとも２つの導入遺伝子は、相同組換えの効率または相同性に依存する修復を強化するために、ＭＣＶ中に提供され、遺伝子編集ツール（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮ）を利用して取り込まれる。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有していてもよい。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、アルファ１，ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠如しており（すなわち、アルファＧａｌヌルである）、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、もしくは少なくとも７つ、またはそれより多くの遺伝学的改変を含む。任意選択で、導入遺伝子の組込みに加えて、追加のノックアウトは、ベータ４ＧａｌＮＴ２遺伝子またはＣＭＡＨ遺伝子（どちらも自然免疫および異種移植片の拒絶の原因への関与が示された遺伝子である）のノックアウトを含む。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、アルファ１，ガラクトシルトランスフェラーゼの低減した発現を有し、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの追加の遺伝学的改変を含む。ある特定の実施形態において、アルファ１，ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％低減される。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの発現の欠如をもたらす遺伝学的改変、および（ｉｉ）少なくとも４つの追加の遺伝学的改変、またはより詳細には４つの追加の遺伝学的改変を含む。これらの追加の遺伝学的改変は、任意の好適な遺伝学的改変であってもよく、その例としては、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲによって誘導された欠失／挿入または遺伝子置換（インデル）、例えば他の遺伝子座（例えば、β４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、ｖＷＦ）におけるノックアウトまたはノックインなどが挙げられる。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの低減した発現をもたらす遺伝学的改変、および（ｉｉ）少なくとも４つの追加の遺伝学的改変、またはより詳細には４つの追加の遺伝学的改変を含む。例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現の欠如をもたらす遺伝学的改変、ならびに（ｉｉ）少なくとも５つの追加の遺伝学的改変、またはより詳細には５つの追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の低減した発現をもたらす遺伝学的改変、ならびに（ｉｉ）少なくとも５つの追加の遺伝学的改変、またはより詳細には少なくとも５つの追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現の欠如をもたらす遺伝学的改変、ならびに（ｉｉ）少なくとも６つの追加の遺伝学的改変、またはより詳細には６つの追加の遺伝学的改変を含む。例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の低減した発現をもたらす遺伝学的改変、ならびに（ｉｉ）少なくとも６つの追加の遺伝学的改変、またはより詳細には６つの追加の遺伝学的改変を含む。
特定の実施形態において、ドナー動物（例えば、有蹄動物、豚動物またはブタ）は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは少なくとも６つ、またはそれより多くの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含む。例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）少なくとも４つの追加の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含む豚動物を提供する。例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）少なくとも５つの追加の導入遺伝子、またはより詳細には５つの追加の遺伝学的改変の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含む豚動物を提供する。
例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）少なくとも６つの追加の導入遺伝子、またはより詳細には６つの追加の遺伝学的改変の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含む豚動物を提供する。特定の実施形態において、ドナー動物（例えば、有蹄動物、豚動物またはブタ）は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の低減した発現、ならびに（ｉｉ）少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは少なくとも６つ、またはそれより多くの導入遺伝子、あるいはより詳細には４つ、５つ、または少なくとも６つの追加の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、ドナー動物（例えば、有蹄動物、豚動物またはブタ）は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の低減した発現、ならびに（ｉｉ）５つの追加の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含む。任意選択で、ドナー動物は、またはそれより多くの追加の遺伝学的改変を含有していてもよい。例示的な実施形態において、ドナー動物（例えば、有蹄動物、豚動物またはブタ）は、（ｉ）アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の低減した発現、ならびに（ｉｉ）６つの追加の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含む。任意選択で、ドナー動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変（ノックアウト、ノックイン、インデル、豚ｖＷＦの改変）を含有していてもよい。
ＩＩＩ．導入遺伝子発現
導入遺伝子の発現は、任意のレベルであってもよいが、具体的な実施形態において、発現は、高いレベルである。所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを使用することができる。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて構成的であってもよいし、または誘導性であってもよい。プロモーターは、外因性であってもよいし、またはネイティブであってもよいし、または外因性およびネイティブのプロモーターの組合せであってもよい。
ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、構成的または偏在的なプロモーターから発現される。ある特定の他の実施形態において、導入遺伝子は、組織特異的もしくは細胞型特異的なプロモーター、または誘導性プロモーターから発現され、追加の調節エレメント、例えばエンハンサー、インシュレーター、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）などを含んでいてもよい。例示的な実施形態において、４つまたはそれより多くの導入遺伝子が共発現される。例示的な実施形態において、４つまたはそれより多くの導入遺伝子は、およそ等しいモル量で発現される。
例示的な実施形態において、導入遺伝子は、主として内皮細胞で活性なプロモーターによって発現される。ある特定の実施形態において、導入遺伝子の発現は、豚Ｉｃａｍ－２エンハンサー／プロモーターによって制御される。ある特定の実施形態において、導入遺伝子の発現は、構成的ＣＡＧプロモーターによって制御される。
ある特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、２つまたはそれより多くの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらすように遺伝子改変されており、その場合、少なくとも１つの導入遺伝子は、構成的プロモーターによって制御され、少なくとも１つの導入遺伝子は、組織特異的プロモーター、またはより詳細には、主として内皮細胞で活性なプロモーターによって制御される。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、単一の遺伝子座における４つまたはそれより多くの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらすように遺伝子改変されており、その場合、少なくとも１つの導入遺伝子は、構成的プロモーターによって制御され、少なくとも１つの導入遺伝子は、組織特異的プロモーター、またはより詳細には、主として内皮細胞で活性なプロモーターによって制御される。
導入遺伝子は、異種間移植における使用のためにドナー動物（例えば、豚動物）を改変することにおける使用に好適な任意の導入遺伝子であってもよい。例示的な実施形態において、導入遺伝子は、イムノモジュレーター（例えば、補体調節因子、補体阻害剤、免疫抑制剤）、抗凝血剤、凍結防止遺伝子またはそれらの組合せから選択される。ある特定の実施形態において、ヒトにおける導入遺伝子の配列。
ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、イムノモジュレーターである。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、補体調節因子であり、またはより具体的には、補体阻害剤である。補体阻害剤としては、これらに限定されないが、ＣＤ４６（ＭＣＰ）、ＣＤ５９またはＣＲ１を挙げることができる。補体阻害剤の配列は、ヒトであってもよい。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、補体経路阻害剤（すなわち、補体阻害剤）である。補体阻害剤としては、これらに限定されないが、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＲ１およびＣＤ４６（ＭＣＰ）を挙げることができる。補体阻害剤の配列は、ヒトであってもよい。補体阻害剤は、ヒトＣＤ４６（ｈＣＤ４６）であってもよく、その場合、発現は、ミニ遺伝子構築物を介してなされる（Loveland et al., Xenotransplantation, 11(2):171-183. 2004を参照）。
ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、免疫抑制剤である。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、Ｔ細胞をモジュレートする作用を有する免疫抑制剤遺伝子、例えばＣＴＬＡ４－Ｉｇ、もしくはクラスＩＩ ＭＨＣのドミナントネガティブ阻害剤（ＣＩＩＴＡ）、またはＢ細胞もしくはＴ細胞媒介免疫機能の発現をモジュレートする他の遺伝子である。さらなる実施形態において、このような動物は、免疫機能に影響を与える遺伝子の発現を排除するように、さらに改変されてもよい。ある特定の実施形態において、免疫抑制剤は、ＣＤ４７である。
ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、抗凝血剤である。抗凝血剤としては、これらに限定されないが、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヒルジン、トロンボモジュリン（ＴＢＭ）、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、およびＣＤ３９を挙げることができる。抗凝血剤の配列は、ヒトであってもよい。
トランスジェニック動物は、同様に、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含有していてもよい。一実施形態において、動物は、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子（ＣＭＡＨ）（例えば、米国特許公報第２００５－０２２３４１８号明細書を参照）、ｉＧｂ３シンターゼ遺伝子（例えば、米国特許公報第２００５－０１５５０９５号明細書を参照）、および／またはフォルスマンシンターゼ遺伝子（例えば、米国特許公報第２００６－００６８４７９号明細書を参照）の発現を阻害するように遺伝子改変されていてもよい。加えて、動物は、凝血促進剤の発現を低減するように遺伝子改変されていてもよい。特に、一実施形態において、動物は、凝血促進剤遺伝子、例えばＦＧＬ２（フィブリノーゲン様タンパク質２）の発現を低減または排除するように遺伝子改変されている（例えば、Marsden, et al.(2003) J din Invest. 112:58-66；Ghanekar, et al.(2004) J. Immunol. 172:5693-701；Mendicino, et al.(2005) Circulation. 112:248-56；Mu, et al.(2007) Physiol Genomics. 31(1):53-62を参照）。別の実施形態において、動物は、ベータ－１，４Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧａｌＮＴ２）の発現を阻害するように遺伝子改変されていてもよい。
ＩＶ．特定の遺伝学
１．成長ホルモン受容体
本開示の一態様は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化；またはＧＨＲ遺伝子のうちの少なくとも１つの対立遺伝子における、ＧＨＲの機能を損なう突然変異を引き起こす遺伝子変化を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）を提供する。ヒトＧＨＲは、６３８個のアミノ酸膜貫通タンパク質であり、細胞外ドメイン（主としてエクソン３～エクソン７によってコードされた）、膜貫通ドメイン（主としてエクソン８によってコードされた）および細胞内ドメイン（主としてエクソン９および１０によってコードされた）を有し、サイトカイン受容体ファミリーに属する。成長ホルモン（ＧＨ）のＧＨＲへの結合は、ＧＨ－ＧＨＲシグナル経路を開始させ、ＩＧＦ－Ｉの生産ならびに生物の促進成長、発達および免疫機能をもたらす。したがって、ＧＨＲ遺伝子の突然変異は、体の成長および発達に破壊的な影響を働かせることができる。
実際に、ヒト成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）における突然変異、ならびにナンセンス突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト、欠失およびミスセンス変異などの様々なＧＨＲの欠陥は、ＧＨＲシグナル伝達経路を損なう。これらのＧＨＲの欠陥は、矮小発育症、前頭隆起、小さい顔中部、軽度の肥満症および小さい生殖器を特徴とする常染色体の疾患であるラロン症候群との関連が示されている。ブタにおいて、ＧＨＲにおける突然変異（ＧＨＲＫＯ）は、ラロン症候群を有するヒト患者の表現型を再現する（Yu et al., J Transl. Med 16:41 (2018)を参照）。
一部の実施形態において、ＧＨＲ遺伝子は、遺伝学的な標的化事象を介して不活性化されている。別の実施形態において、ＧＨＲ遺伝子の両方の対立遺伝子が遺伝学的な標的化事象を介して不活性化されている豚動物が提供される。一実施形態において、遺伝子は、相同組換えを介して標的化することができる。他の実施形態において、ＧＨＲ遺伝子は、崩壊させることができ、すなわち、遺伝子コードの一部を変更することによって、ＧＨＲ遺伝子のそのセグメントの転写および／または翻訳に影響を与えることができる。例えば、遺伝子の崩壊は、置換、欠失（「ノックアウト」）または挿入（「ノックイン」）技術、例えば、ＧＨＲ遺伝子のコード領域を中断する選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ｎｅｏ）の標的化された挿入などを介して行うことができる。
ある特定の実施形態において、ＧＨＲ遺伝子の対立遺伝子は、結果的に生じるＧＨＲがＩＧＦ－１を生成するための成長ホルモン刺激に応答できなくなるように不活性にされる。一実施形態において、ＧＲＨ遺伝子は、ＲＮＡに転写され得るが、タンパク質に翻訳されなくてもよい。別の実施形態において、ＧＲＨ遺伝子は、短縮化された形態で転写されてもよい。このような短縮化されたＧＲＨ ＲＮＡは、翻訳されないか、または機能を有さないＧＨＲタンパク質に翻訳されるかのいずれかであり得る。代替の実施形態において、ＧＨＲ遺伝子は、遺伝子の転写が起こらないような方法で不活性化されていてもよい。さらなる実施形態において、ＧＨＲ遺伝子は、転写され、次いで非機能性タンパク質に翻訳されてもよい。
一部の実施形態において、活性なＧＨＲ遺伝子の発現は、ＧＨＲ遺伝子の転写または翻訳を標的化する方法などの代替方法の使用によって低減させることができる。例えば、発現は、ネイティブのＧＨＲ遺伝子またはそのｍＲＮＡを標的化するアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用によって低減させることができる。他の実施形態において、部位特異的リコンビナーゼが、組換えのためのゲノムの領域を標的化するのに使用される。このようなシステムの例は、ＣＲＥ－ｌｏｘシステムおよびＦｌｐ－Ｆｒｔシステムである。
一部の実施形態において、ラロン症候群の１つまたは複数の特徴を付与する遺伝子変化を有するトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック豚動物が生成される。ラロン症候群は、成長ホルモンに応答するＩＧＦ－１生産の欠如、ならびに血清中の低いレベルのＩＧＦ－１およびグルコースを特徴とする。トランスジェニック動物は、成長ヒト受容体（growth human receptor）（ＧＨＲ）の発現の減少、またはＧＨＲの機能を損なうＧＨＲにおける突然変異を引き起こす変更をもたらす遺伝子変化を有していてもよい。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲノックアウト遺伝子変化を有する。一部の実施形態において、遺伝子変化は、ＧＨＲノックアウト遺伝子変化である。一部の実施形態において、ＧＨＲノックアウト（ＧＨＲＫＯ）トランスジェニックブタは、ＧＨＲＫＯ遺伝子変化を有さないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％またはそれを超えてＧＨＲの発現を減少させる。
ラロン症候群患者は、極めて高いレベルの循環する成長ホルモン（ＧＨ）、および非常に低いレベルのインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）を有し、患者は、ＧＨの投与に対して応答を示さない。ラロン症候群を有する患者はまた、糖尿病（ＩＩ型）やある特定のがんなどのある特定の状態に対して抵抗を示す場合もある。これまでのところ、ラロン症候群の唯一の治療的処置は、組換えＩＧＦ－Ｉの投与である。一部の実施形態において、トランスジェニックＧＨＲＫＯブタは、ＧＨＲＫＯ遺伝子変化を有さないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％少ないインスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）を生産する。
本開示の一態様は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化；またはＧＨＲ遺伝子のうちの少なくとも１つの対立遺伝子における、ＧＨＲの機能を損なう突然変異を引き起こす遺伝子変化を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、１つまたは複数の追加の遺伝子変化をさらに含むトランスジェニック動物を提供する。一部の実施形態において、１つまたは複数の追加の遺伝子変化は、（ｉ）１つもしくは複数の遺伝子の発現の減少、（ｉｉ）１つもしくは複数の遺伝子の機能の低下、および／または（ｉｉｉ）１つもしくは複数の導入遺伝子の発現をもたらす。一部の実施形態において、１つまたは複数の導入遺伝子は、独立して、抗凝血剤、補体調節因子、イムノモジュレーター、および細胞保護的導入遺伝子から選択される。一部の実施形態において、抗凝血剤は、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９から選択される。一部の実施形態において、補体調節因子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９から選択される補体阻害剤である。一部の実施形態において、イムノモジュレーターは、豚ＣＬＴＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、またはＣＤ４７から選択される免疫抑制剤である。一部の実施形態において、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＤＡＦ／ＣＤ５５、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、およびＨＯ１から選択される。一部の実施形態において、１つまたは複数の遺伝子変化は、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの発現の減少を含む。
一部の実施形態において、成長ホルモン遺伝子が欠如したトランスジェニックブタは、ＣＤ４６と、（ｉ）ＥＰＣＲ、ＨＯ－１、ＴＢＭ、およびＣＤ４７；（ｉｉ）ＥＰＣＲ、ＨＯ１、ＴＢＭ、およびＴＦＰＩ；（ｉｉｉ）ＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；（ｉｖ）ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；または（ｖ）ＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＢＭ、およびＣＤ３９から選択される少なくとも４つの導入遺伝子の組合せとを発現する。
一部の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子のうち２つは、第１または第２のポリシストロンのいずれかで発現され、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＯＩ、Ａ２０、およびＣＤ４７からなる群から選択される。一部の実施形態において、ポリシストロンで発現される導入遺伝子の少なくとも１つの対は、（ａ）ＴＢＭおよびＣＤ３９；（ｂ）ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；（ｃ）Ａ２０およびＣＤ４７；（ｄ）ＴＦＰＩおよびＣＤ４７；（ｅ）ＣＩＩＴＡＫＤおよびＨＯ－１；（ｆ）ＴＢＭおよびＣＤ４７；（ｇ）ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩ；（ｈ）ＣＩＩＴＡＫＤおよびＡ２０；（ｉ）ＴＢＭおよびＡ２０；（ｊ）ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；（ｋ）ＴＢＭおよびＨＯ－１；（ｌ）ＴＢＭおよびＴＦＰＩ；（ｍ）ＣＢＴＡおよびＴＦＰＩ；（ｎ）ＥＰＣＲおよびＨＯ－１；（ｏ）ＴＢＭおよびＣＤ４７；（ｐ）ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩ；（ｑ）ＴＢＭおよびＥＰＣＲ；（ｒ）ＣＤ４７およびＨＯ－１；（ｓ）ＣＤ４６およびＣＤ４７；（ｔ）ＣＤ４６およびＨＯ－１；（ｕ）ＣＤ４６およびＴＢＭ；ならびにＨＬＡ－ＥおよびＣＤ４７からなる群から選択される。
一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、成長ホルモン受容体の発現を欠如しており、（ｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；（ｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；（ｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；（ｉｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１；（ｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；（ｖｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５；（ｖｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｖｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｉｘ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｘ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｘｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；（ｘｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１；（ｘｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７；（ｘｉｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ；（ｘｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７；（ｘｖｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１；または（ｘｖｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７から選択される遺伝子型を含む。
一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、成長ホルモン受容体の発現を欠如しており、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７；ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１；またはＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７から選択される遺伝子型を含む。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、機能的なアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）および／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の任意の発現が欠如した（遺伝学的改変またはそれ以外の方式の結果として）豚動物であり、単一の遺伝子座に、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０個の導入遺伝子またはそれより多くの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する。一部の実施形態において、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＢＭ、ＨＯ１、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ４７である。ある特定の実施形態において、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個の導入遺伝子またはそれより多くの導入遺伝子の発現は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０個のプロモーターまたはそれより多くによって制御される。ある特定の実施形態において、プロモーターは、導入遺伝子にとって専用のものであり、すなわち、１つのプロモーターは、１つの導入遺伝子の発現を制御し、一方で代替の実施形態において、１つのプロモーターは、１つより多くの導入遺伝子の発現を制御し、例えば、１つのプロモーターは、２つの導入遺伝子の発現を制御する。
有利には、２つまたはそれより多くの追加の導入遺伝子が、繁殖中、共に組み込まれ、共に発現され、共分離される。単一の遺伝子座は、変更してもよい。ある特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたネイティブの遺伝子座である。改変されたネイティブの遺伝子座は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲによって誘導された挿入もしくは欠失（インデル）、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ｎｅｏ）の導入、または１つもしくは複数の導入遺伝子の取り込みを容易にするように意図された大きいゲノムインサート（例えば、ランディングパッド）の導入などの任意の好適な技術によって改変することができる。特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座である。ＧＧＴＡ１遺伝子座は、少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現によって、例えば相同組換え、遺伝子編集の適用またはリコンビナーゼ技術によって不活性化される。単一の遺伝子座はまた、例えば、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＭＡＨ、ＧＲＨ、またはβ４ＧａｌＮＴ２であってもよい。任意選択で、ドナー動物は、追加の遺伝学的改変を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数の追加の豚遺伝子の発現は、遺伝学的改変以外のメカニズムによって改変されてもよい。
２．インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）
本発明の一態様は、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化を含むトランスジェニックブタを提供する。インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）システムは、２つのリガンド（ＩＧＦ－１（受託番号ＤＱ７８４６８７）およびＩＧＦ－２（受託番号ＮＭ２１３８８３））、２つの膜貫通型受容体（ＩＧＦ－１Ｒ（受託番号ＡＢ００３３６２）およびＩＧＦ－２Ｒ（受託番号ＡＦ３３９８８５）、ならびにＩＧＦ－１およびＩＧＦ－２と特異的に結合する少なくとも６つの高親和性ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１～６；（ＩＧＦＢＰ－３；受託番号ＡＦ０８５４８２））を含むファミリーの代表である。この複合体システムは、胚形成、出生前および出生後の成長を含む正常なヒトおよび動物の発達において、さらに、組織ホメオスタシスの維持において、必須の役割を果たす。一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＧＦ－２ＲまたはＩＧＦＢＰ－３から選択されるインスリン増殖因子遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化を含む。一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、インスリン増殖因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化を含む。
一部の実施形態において、ＩＧＦ－１またはＩＧＲ－１Ｒ遺伝子は、遺伝学的な標的化事象を介して不活性化されている。別の実施形態において、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の両方の対立遺伝子が遺伝学的な標的化事象を介して不活性化されている豚動物が提供される。一実施形態において、遺伝子は、相同組換えを介して標的化することができる。他の実施形態において、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子は、崩壊させることができ、すなわち、遺伝子コードの一部を変更することによって、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子のそのセグメントの転写および／または翻訳に影響を与えることができる。例えば、遺伝子の崩壊は、置換、欠失（「ノックアウト」）または挿入（「ノックイン」）技術、例えば、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子のコード領域を中断する選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ｎｅｏ）の標的化された挿入などを介して行うことができる。
ある特定の実施形態において、臓器成長を促進するために、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の対立遺伝子は、結果的に生じるＩＧＦ－１ＲがＩＧＦ－１刺激に応答できなくなるように不活性にされる。一実施形態において、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子は、ＲＮＡに転写され得るが、タンパク質に翻訳されなくてもよい。別の実施形態において、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子は、短縮化された形態で転写されてもよい。このような短縮化されたＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ ＲＮＡは、翻訳されないか、または機能を有さないＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－１Ｒタンパク質に翻訳されるかのいずれかであり得る。代替の実施形態において、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子は、遺伝子の転写が起こらないような方法で不活性化されていてもよい。さらなる実施形態において、ＩＧＦ－１遺伝子は、転写され、次いで非機能性タンパク質に翻訳されてもよい。
一部の実施形態において、活性なＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の発現は、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の転写または翻訳を標的化する方法などの代替方法の使用によって低減させることができる。例えば、発現は、ネイティブのＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子またはそれらのｍＲＮＡを標的化するアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用によって低減させることができる。他の実施形態において、部位特異的リコンビナーゼが、組換えのためのゲノムの領域を標的化するのに使用される。このようなシステムの例は、ＣＲＥ－ｌｏｘシステムおよびＦｌｐ－Ｆｒｔシステムである。一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、遺伝学的なＩＧＦ－１変更を有さないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％少ないインスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）を生産する。
一部の実施形態において、トランスジェニックブタは、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化を含み、１つまたは複数の追加の遺伝子変化をさらに含む。一部の実施形態において、１つまたは複数の追加の遺伝子変化は、（ｉ）１つもしくは複数の遺伝子の発現の減少、（ｉｉ）１つもしくは複数の遺伝子の機能の低下、および／または（ｉｉｉ）１つもしくは複数の導入遺伝子の発現をもたらす。一部の実施形態において、１つまたは複数の導入遺伝子は、独立して、抗凝血剤、補体調節因子、イムノモジュレーター、および細胞保護的導入遺伝子から選択される。
一部の実施形態において、抗凝血剤は、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９から選択される。一部の実施形態において、補体調節因子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９から選択される補体阻害剤である。一部の実施形態において、イムノモジュレーターは、豚ＣＬＴＡ４－ＩＧ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、またはＣＤ４７から選択される免疫抑制剤である。一部の実施形態において、１つまたは複数の導入遺伝子は、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＤＡＦ／ＣＤ５５、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、およびＨＯ１から選択される。一部の実施形態において、１つまたは複数の遺伝子変化は、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの発現の減少を含む。
一部の実施形態において、ＩＧＦ－１またはＩＧＦ－１Ｒ遺伝学的改変は、単独で、または他の遺伝学的改変と組み合わせてなされ得る。一部の実施形態において、遺伝子変化は、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子変化を含み、その例としては、例えば、実施例に開示された６ＧＥまたは１０ＧＥ豚が挙げられる。
例示的な実施形態において、トランスジェニック動物は、機能的なアルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）および／またはＩＧＦ－１もしくはＩＧＦ－１Ｒの任意の発現が欠如した（遺伝学的改変またはそれ以外の方式の結果として）豚動物であり、単一の遺伝子座に、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０個の導入遺伝子またはそれより多くの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する。一部の実施形態において、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＴＢＭ、ＨＯ１、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ４７である。
ある特定の実施形態において、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個の導入遺伝子またはそれより多くの導入遺伝子の発現は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０個のプロモーターまたはそれより多くによって制御される。ある特定の実施形態において、プロモーターは、導入遺伝子にとって専用のものであり、すなわち、１つのプロモーターは、１つの導入遺伝子の発現を制御し、一方で代替の実施形態において、１つのプロモーターは、１つより多くの導入遺伝子の発現を制御し、例えば、１つのプロモーターは、２つの導入遺伝子の発現を制御する。
有利には、２つまたはそれより多くの追加の導入遺伝子が、繁殖中、共に組み込まれ、共に発現され、共分離される。単一の遺伝子座は、変更してもよい。ある特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたネイティブの遺伝子座である。改変されたネイティブの遺伝子座は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲによって誘導された挿入もしくは欠失（インデル）、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ｎｅｏ）の導入、または１つもしくは複数の導入遺伝子の取り込みを容易にするように意図された大きいゲノムインサート（例えば、ランディングパッド）の導入などの任意の好適な技術によって改変することができる。特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、ネイティブの、または改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座である。
一部の実施形態において、ＧＧＴＡ１遺伝子座は、少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現によって、例えば相同組換え、遺伝子編集の適用またはリコンビナーゼ技術によって不活性化される。単一の遺伝子座はまた、例えば、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＭＡＨ、ＧＲＨ、またはβ４ＧａｌＮＴ２であってもよい。任意選択で、ドナー動物は、追加の遺伝学的改変を有していてもよいし、および／または１つもしくは複数の追加の豚遺伝子の発現は、遺伝学的改変以外のメカニズムによって改変されてもよい。
３．アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（アルファＧａｌ）
一実施形態において、本開示は、異種間移植のための臓器、組織および細胞の供給源として使用するのに好適なトランスジェニック動物であって、ドナー動物は、アルファＧａｌの発現を欠如しているか、または発現が低減されている、トランスジェニック動物を提供する。アルファＧａｌの発現を欠如している（すなわち、アルファＧａｌヌルである）トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有し、ある特定の実施形態において、少なくとも４つの追加の遺伝学的改変、少なくとも５つの追加の遺伝学的改変、または少なくとも６つの追加の遺伝学的改変を有する。これらの遺伝学的改変は、例えば、導入遺伝子の取り込みまたは発現であり得る。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファＧａｌの発現の欠如；ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における少なくとも２つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす少なくとも３つの遺伝学的改変を有する。ある特定の実施形態において、単一の遺伝子座は、改変されたアルファＧａｌである。
異種間移植によって引き起こされる抗ｇａｌ体液性応答を排除またはモジュレートするための様々な戦略が実行されており、その例としては、アルファ－ガラクトシダーゼを用いたエピトープの酵素による除去（Stone et al., Transplantation 63: 640-645, 1997）、特異的な抗ｇａｌ抗体除去（Ye et al., Transplantation 58: 330-337, 1994）、αＧＴ発現の排除に成功しなかった他の炭水化物部分でのエピトープのキャッピング（Tanemura et al., J. Biol. Chem. 27321: 16421-16425, 1998およびKoike et al., Xenotransplantation 4: 147-153, 1997）、および補体阻害性タンパク質の導入（Dalmasso et al., Clin. Exp. Immunol. 86:31-35, 1991, Dalmasso et al. Transplantation 52:530-533 (1991)）が挙げられる。Ｃ．Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．（FASEB J 13, 1762 (1999))は、トランスジェニックブタにおけるαＧＴの競合阻害は、エピトープ数の部分的な低減しかもたらさないことを報告した。同様に、Ｓ．Ｍｉｙａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（J. Biol. Chem. 276, 39310 (2000)）は、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩトランスジェニックブタにおけるｇａｌエピトープの発現をブロックする試みもｇａｌエピトープ数の部分的な低減しかもたらさず、霊長類レシピエントにおける移植片の生存の著しい延長は失敗したことを報告した。
豚細胞および生きた動物におけるアルファＧａｌ遺伝子座の単一の対立遺伝子ノックアウトが報告されている。Ｄｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Nature Biotechnology 19: 559-562, 2001）は、ヒツジにおけるαＧＴ遺伝子の１つの対立遺伝子の標的化された遺伝子欠失を報告した。Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Transgenics Research 11: 143-150, 2002）は、ヘテロ接合型αＧＴノックアウト体細胞豚胎児線維芽細胞の生産を報告した。２００２年、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（Science 295:1089-1092, 2002)およびＤａｉ ｅｔ ａｌ．（Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002）は、αＧＴ遺伝子の１つの対立遺伝子をうまく不活性にしたブタの生産を報告しており、それにおいて、アルファＧａｌの不活性化が、アルファＧａｌ遺伝子のコード領域を中断する、マーカー遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）の標的化された挿入を介してなされ、Ｒａｍｓｏｏｎｄａｒ ｅｔ ａｌ．（Biol of Reproduc 69, 437-445 (2003)は、ヒトアルファ－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＨＴ）も発現するヘテロ接合型αＧＴノックアウトブタの生成を報告しており、これは、ＨＴおよびアルファＧａｌエピトープの両方を発現した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉに対するＰＣＴ出願番号国際公開第０３／０５５３０２号パンフレットは、異種間移植における使用のためのヘテロ接合型アルファＧａｌノックアウトミニブタ（swine）の生産を確認しており、それにおいて、ノックアウトブタ（swine）での機能的なαＧＴの発現は、野生型と比較して減少している。
Ａｕｓｔｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対するＰＣＴ公開番号国際公開第９４／２１７９９号パンフレットおよび米国特許第５，８２１，１１７号明細書；Ｂｒｅｓａｔｅｃに対するＰＣＴ公開番号国際公開第９５／２０６６１号パンフレット；ならびにＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ， Ｉｎｃ．およびＴｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに対するＰＣＴ公開番号国際公開第９５／２８４１２号パンフレット、米国特許第６，１５３，４２８号明細書、米国特許第６，４１３，７６９号明細書および米国特許出願公開第２００３／００１４７７０号明細書は、αＧＴ遺伝子のｃＤＮＡに基づくαＧＴ陰性豚細胞の生産の議論を提供している。異種間移植分野における重要な突破口は、アルファＧａｌの任意の機能的な発現が欠如した最初の生きたブタの生産であった（Phelps et al. Science 299:411-414 (2003)；Revivicor, Inc.によるＰＣＴ公開番号国際公開第０４／０２８２４３号パンフレット明細書、およびＩｍｍｅｒｇｅ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．によるＰＣＴ公開番号国際公開第０４／０１６７４２号パンフレットも参照されたい）。
一実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックブタ）からの動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座に取り込まれ、発現され、ブタは、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠如している、動物が提供される。例示的な実施形態において、導入遺伝子は、改変されたアルファＧａｌ遺伝子座に取り込まれ、発現される。ある特定の実施形態において、少なくとも２つのプロモーターは、外因性であるか、ネイティブであるか、または外因性およびネイティブの組合せである。
一実施形態において、（ｉ）任意の機能的なアルファＧａｌの発現を欠如しており、（ｉｉ）単一の遺伝子座に、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０個、またはそれより多くの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）が提供される。例示的な実施形態において、導入遺伝子は、改変されたアルファＧａｌ遺伝子座に取り込まれ、発現される。
ある特定の実施形態において、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含んでいてもよい。これらの遺伝学的改変は、同じ遺伝子座または異なる遺伝子座において、１つまたは複数の追加の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす可能性がある。一実施形態において、任意の機能的なアルファＧａｌの発現を欠如しており、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの追加の導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）が提供される。別の実施形態において、機能的なアルファＧａｌの発現のレベルが低減しており、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの追加の導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する動物、臓器、組織および細胞が提供される。機能的なアルファＧａｌの発現は、例えば、少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％低減され得る。
機能的なαＧＴの発現の欠如または低減したレベルは、任意の好適な手段によって達成することができる。実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子の１つの対立遺伝子が遺伝学的な標的化事象を介して不活性化されている動物（例えば、有蹄動物、豚動物）が提供される。別の実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子の両方の対立遺伝子が遺伝学的な標的化事象を介して不活性化されている豚動物が提供される。一実施形態において、遺伝子は、相同組換えを介して標的化することができる。他の実施形態において、遺伝子は、崩壊させることができ、すなわち、遺伝子コードの一部を変更することによって、遺伝子のそのセグメントの転写および／または翻訳に影響を与えることができる。例えば、遺伝子の崩壊は、置換、欠失（「ノックアウト」）または挿入（「ノックイン」）技術、例えば、アルファＧａｌ遺伝子のコード領域を中断する選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ｎｅｏ）の標的化された挿入などを介して行うことができる。既存の配列の転写をモジュレートする所望のタンパク質または調節配列のための追加の遺伝子が挿入されていてもよい。
ある特定の実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子の対立遺伝子は、結果的に生じるアルファＧａｌ酵素が細胞表面上でＧａｌを生成できなくなるように不活性にされる。一実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子は、ＲＮＡに転写され得るが、タンパク質に翻訳されなくてもよい。別の実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子は、短縮化された形態で転写されてもよい。このような短縮化されたＲＮＡは、翻訳されないか、または非機能性タンパク質に翻訳されるかのいずれかであり得る。代替の実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子は、遺伝子の転写が起こらないような方法で不活性化されていてもよい。さらなる実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子は、転写され、次いで非機能性タンパク質に翻訳されてもよい。
一部の実施形態において、活性なアルファＧａｌ遺伝子の発現は、遺伝子の転写または翻訳を標的化する方法などの代替方法の使用によって低減させることができる。例えば、発現は、ネイティブのアルファＧＴ遺伝子またはそのｍＲＮＡを標的化するアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用によって低減させることができる。他の実施形態において、部位特異的リコンビナーゼが、組換えのためのゲノムの領域を標的化するのに使用される。このようなシステムの例は、ＣＲＥ－ｌｏｘシステムおよびＦｌｐ－Ｆｒｔシステムである。
２つの不活性なアルファＧａｌ遺伝子の対立遺伝子を有するブタは、天然に存在しない。これまでに、遺伝学的な標的化事象を介してアルファＧａｌ遺伝子の第２の対立遺伝子をノックアウトすることを試みる一方で、第２の対立遺伝子が機能的なアルファＧａｌ酵素を生産しないようにする点突然変異を同定したことが発見された。
したがって、本開示の別の態様において、アルファＧａｌは、少なくとも１つの点突然変異を介して不活性にすることができる。一実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子の１つの対立遺伝子は、少なくとも１つの点突然変異を介して不活性にすることができる。別の実施形態において、アルファＧａｌ遺伝子の両方の対立遺伝子は、少なくとも１つの点突然変異を介して不活性にすることができる。一実施形態において、この点突然変異は、遺伝学的な標的化事象を介して生じさせることができる。別の実施形態において、この点突然変異は、天然に存在するものでもよい。さらなる実施形態において、突然変異誘発物質を介して、アルファＧａｌ遺伝子中に突然変異を誘導することができる。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。一部の実施形態において、追加の改変は、成長ホルモン受容体ノックアウト、ＩＧＦ－１ノックアウト、またはＩＧＦ－１Ｒノックアウトである。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、ＧＨＲの発現が、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれを超えて減少している。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれ未満のＩＧＦ－１を生産し得る。
４．β４ＧａＩＮＴ２
一実施形態において、本開示は、異種間移植のための臓器、組織および細胞の供給源として使用するのに好適なトランスジェニック動物であって、ドナー動物は、β１，４Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧＡＬＮＴ２）の発現を欠如しているか、または発現が低減されている、トランスジェニック動物を提供する。β４ＧＡＬＮＴ２の発現を欠如している（すなわち、β４ＧＡＬＮＴ２ヌルである）トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有する。これらの遺伝学的改変は、例えば、導入遺伝子の取り込みまたは発現であり得る。特定の実施形態において、β１，４Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧＡＬＮＴ２）の発現を欠如しているか、または発現が低減されているトランスジェニック動物もまた、（ｉ）アルファＧａｌの発現の欠如；ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現を特徴とする。
β４Ｇａｌ－ＮＴ２によって生産されたグリカンは、多くのヒトにとって異種抗原である。Estrada JL et al, Xenotransplantation 2015: 22: 194-202。ヒトおよびマウスにおいて、β４ＧＡＬＮＴ２は、Ｓｄａ血液型抗原であるＧａｌＮＡｃ ｂ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃ ａ２－３）Ｇａｌ ｂ１－４ＧｌｃＮＡｃ ｂ１－３Ｇａｌを生産するためのＮ－アセチルガラクトサミンのシアル酸で改変されたラクトサミンへの付加を触媒する。この遺伝子は、ブタの移植可能な臓器（腎臓、心臓、肝臓、肺、および膵臓）および内皮細胞において機能的である。ヒトのおよそ５％が不活性なβ４ＧａｌＮＴ２を有し、その結果として、この遺伝子によって生産されたＳＤａおよびＣＡＤ炭水化物に対する抗体を生じさせる。Byrne GW et al. Transplantation 2011; 91: 287-292；Byrne GW, et al., Xenotransplantation 2014; 21: 543-554を参照されたい。
そのゲノムが内因性β４ＧＡＬＮＴ２を欠如しているかまたはその発現が低減されているブタを生成するのに、任意の好適な方法を使用することができる。崩壊は、内因性の豚β４ＧＡＬＮＴ２核酸配列中の多くの部位に位置していてもよい。崩壊の例としては、これらに限定されないが、ネイティブの遺伝子配列における欠失、およびネイティブの遺伝子配列への異種核酸配列の挿入が挙げられる。挿入の例としては、これらに限定されないが、停止コドンにカップリングされた人工スプライスアクセプター、またはＧＦＰなどの融合パートナーにカップリングされたスプライスドナーを挙げることができる。ノックアウト構築物は、内因性β４ＧＡＬＮＴ２核酸配列、または内因性β４ＧＡＬＮＴ２核酸配列に隣接する配列に相同な配列を含有していてもよい。一部の場合で、ノックアウト構築物は、調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結した、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性、蛍光レポーター（例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰ）、または酵素（例えば、β－ガラクトシダーゼ））をコードする核酸配列を含有していてもよい。ノックアウト構築物としては、他の核酸配列、例えば組換え配列（例えば、ｌｏｘＰ配列、Sendai, et al, Transplantation, 81(5):760-766 (2006)を参照）、スプライスアクセプター配列、スプライスドナー配列、転写開始配列、および転写停止配列を挙げることができる。内因性β４ＧＡＬＮＴ２核酸配列における崩壊は、遺伝子発現の低減、または非機能性の短縮化、またはコードされたポリペプチドの融合をもたらすことができる。
一実施形態において、本開示は、β４ＧＡＬＮＴ２の発現が低減されている、またはそれを発現しないトランスジェニック動物（例えば、豚動物）を提供する。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、本開示は、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現を有するトランスジェニック動物（例えば、豚動物）であって、動物は、β４ＧＡＬＮＴ２を欠如しているか、またはその発現が低減されている、トランスジェニック動物を提供する。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。一部の実施形態において、追加の改変は、成長ホルモン受容体ノックアウト、ＩＧＦ－１ノックアウト、またはＩＧＦ－１Ｒノックアウトである。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、ＧＨＲの発現が、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれを超えて減少している。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれ未満のＩＧＦ－１を生産し得る。
一実施形態において、本開示は、豚β４ＧＡＬＮＴ２によって生産されたＳｄａまたはＳＤａ様グリカンの発現が低減されたかまたはそれを発現させないトランスジェニック動物（例えば、豚動物）を提供する。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。一部の実施形態において、追加の改変は、成長ホルモン受容体ノックアウト、ＩＧＦ－１ノックアウト、またはＩＧＦ－１Ｒノックアウトである。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、ＧＨＲの発現が、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれを超えて減少している。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれ未満のＩＧＦ－１を生産し得る。
例示的な実施形態において、本開示は、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現を有するトランスジェニック動物（例えば、豚動物）であって、動物は、豚β４ＧＡＬＮＴ２から生産されるＳｄａまたはＳＤａ様グリカンを欠如しているか、またはその発現が低減されている、トランスジェニック動物を提供する。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
５．ＣＭＡＨ
一実施形態において、本開示は、異種間移植のための臓器、組織および細胞の供給源として使用するのに好適なトランスジェニック動物であって、ドナー動物は、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）の発現を欠如しているか、または発現が低減されている、トランスジェニック動物を提供する。ＣＭＡＨの発現を欠如している（すなわち、ＣＭＡＨヌルである）トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有する。これらの遺伝学的改変は、例えば、導入遺伝子の取り込みまたは発現であり得る。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、（ｉ）アルファＧａｌの発現の欠如；ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす少なくとも４つの追加の遺伝学的改変を有する。
豚細胞は、ヒト細胞で見出されないシチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）を発現する。ＣＭＡＨは、シアル酸Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）をＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）に変換する。したがって、豚組織がヒトに移植される場合、このエピトープは、埋め込み直後にヒト患者から抗体媒介性の拒絶を惹起する。Varki A. Am J Phys Anthropol 2001;(Suppl. 33):54-69；Zhu A. Xenotransplantation, 2002;9: 376-381；Miwa Y. Xenotransplantation 2004;11:247-253；Tahara H. J Immunol 2010;184: 3269-3275を参照されたい。
そのゲノムが、内因性ＣＭＡＨを欠如しているか、またはその発現が低減したブタを生成するのに、任意の好適な方法を使用することができる。崩壊は、内因性の豚ＣＭＡＨ核酸配列中の多くの部位に位置していてもよい。崩壊の例としては、これらに限定されないが、ネイティブの遺伝子配列における欠失、およびネイティブの遺伝子配列への異種核酸配列の挿入が挙げられる。挿入の例としては、これらに限定されないが、停止コドンにカップリングされた人工スプライスアクセプター、またはＧＦＰなどの融合パートナーにカップリングされたスプライスドナーを挙げることができる。ノックアウト構築物は、内因性ＣＭＡＨ核酸配列、または内因性ＣＭＡＨ核酸配列に隣接する配列に相同な配列を含有していてもよい。一部の場合で、ノックアウト構築物は、調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結した、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性、蛍光レポーター（例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰ）、または酵素（例えば、β－ガラクトシダーゼ））をコードする核酸配列を含有していてもよい。ノックアウト構築物としては、他の核酸配列、例えば組換え配列（例えば、ｌｏｘＰ配列、Sendai, et al, Transplantation, 81(5):760-766 (2006)を参照）、スプライスアクセプター配列、スプライスドナー配列、転写開始配列、および転写停止配列を挙げることができる。内因性ＣＭＡＨ核酸配列における崩壊は、遺伝子発現の低減、または非機能性の短縮化、またはコードされたポリペプチドの融合をもたらすことができる。
一実施形態において、本開示は、ＣＭＡＨグリコシルトランスフェラーゼの発現が低減された、またはそれを発現しないトランスジェニック動物（例えば、豚動物）を提供する。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。一部の実施形態において、追加の改変は、成長ホルモン受容体ノックアウト、ＩＧＦ－１ノックアウト、またはＩＧＦ－１Ｒノックアウトである。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、ＧＨＲの発現が、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれを超えて減少している。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれ未満のＩＧＦ－１を生産し得る。
例示的な実施形態において、本開示は、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現を有するトランスジェニック動物（例えば、豚動物）であって、動物は、ＣＭＡＨおよび／または成長ホルモン受容体を欠如しているか、またはその発現が低減されている、トランスジェニック動物を提供する。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
６．ｖＷＦ
フォン－ウィルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子は、複数のドメインを有し、多量体の糖タンパク質をコードする大きく複雑な遺伝子である。（Ulrichts, H, Udvardy M, Lenting PJ, Pareyn I et al. Shielding of the A1 domain by the D’D3 domains of von Willebrand Factor Modulates Its interaction with Platelet Glycoprotein 1b-IX-V. (2006) JBC 281, 4699-4707.；Zhou Y-F, Eng ET, Zhu J, Lu C et all. Sequence and structure relationships within von Willebrand factor. (2012) Blood 120, 449-458）。多量体糖タンパク質であるフォン－ウィルブランド因子（ｖＷＦ）の主要な機能は、結合組織および内皮下層への血小板粘着、それに加えて、血小板糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）に結合するｖＷＦの機能としての血小板凝集である。しかしながら、この現象は、レシピエントの血小板の凝集が、供与された臓器の生存に傷害を与える作用を有する場合、異種間移植中においてそれほど好都合ではない。例を挙げると、豚肺（および他の臓器）のヒトまたは非ヒト霊長類への移植は、ヒト血小板の自発的な凝集および捕捉をもたらす。これは、この豚ｖＷＦのヒト血小板への自発的な結合を排除する目的で、豚ＶＷＦ遺伝子を「ヒト化」することによって回避することができる。
一般的に、豚ｖＷＦ遺伝子のヒト化または改変は、ヒト血小板の自発的な凝集および自発的な凝集を生じさせないヒトの遺伝学的カウンターパートでの置き換えに関連する遺伝子配列の欠失を必要とする。この例としては、ヒトｖＷＦ遺伝子の全部または一部で置き換えることによる豚ｖＷＦ遺伝子の全部または一部の欠失を挙げることができる。
自発的な血小板凝集応答の排除を目的とする豚ｖＷＦの改変としては、ｈｖＷＦにおけるＧＰ１ｂ結合部位のフォールディングおよび捕捉に関連することが公知のＤ３（部分的）、Ａ１、Ａ２、Ａ３（部分的）ドメイン内の領域（Ｄ３ドメイン）、加えて、ＧＰ１ｂ受容体に関連する領域（Ａ１ドメイン）およびＡＤＡＭＴＳ１３切断部位に関連する領域（Ａ２ドメイン）を挙げることができる。エクソン２２～２８は、これらの領域を包含する。ヒト血小板は、正常なストレスの力下で、ブタ血液の存在下で自発的に凝集する。成功した異種間移植におけるこの起こり得る脅威を回避するために、さらに、ヒトｖＷＦが血液中の正常な剪断応力の条件下で自発的な血小板凝集を誘導しないため、ｖＷＦタンパク質のフォールディングに関連するヒトｖＷＦ遺伝子の領域、それに加えて、ＧＰｉｂ結合、コラーゲン結合（２つの領域のうち１つ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３切断に関連する領域は、ブタｖＷＦ遺伝子におけるゲノムホモログの置き換えに利用される可能性がある（その結果、キメラヒト／ブタタンパク質が得られる）。この方法において、ｖＷＦ上のＧＰ１ｂ結合部位を隠したりまたはマスクしたりすることができる代替のフォールディング、加えてＡドメイン内のヒト化受容体部位が、ヒトｖＷＦ遺伝子からの単一のｃＤＮＡまたはゲノム断片と共に提供されてもよい。これは、このようなメカニズムが遺伝子編集方法を利用して強化される場合（例えば、ヒトｖＷＦ断片を豚ｖＷＦ遺伝子座に組み込むのにＣＲＩＳＰＲ支援相同組換えを使用できる）ことを含め、相同組換えまたは遺伝子標的化を介して達成することができる。このヒト断片は、上述の自発的な血小板凝集に関与する領域を置き換え、ヒトｖＷＦ遺伝子からのｃＤＮＡまたはゲノム断片の形態であってもよい。
例示的な実施形態において、関連するヒトｖＷＦ遺伝子配列の挿入は、例えば、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼなどのゲノム編集のために使用される任意の現行方法によって行うことができる。豚ｖＷＦの改変は、豚ｖＷＦ遺伝子の関連領域のみを置き換えることによって、または代替として、ｐｖＷＦ遺伝子全体をｈｖＷＦで置き換えることによって行うことができる。
一実施形態において、豚ｖＷＦ遺伝子の領域は、ヒトカウンターパートで置き換えられていてもよい（Ｅ２２～Ｅ２８領域）。代替として、トランスジェニック動物は、ｖＷＦ遺伝子の完全なノックアウト、および部位特異的な組換えシステムを使用するヒトｖＷＦ遺伝子の遺伝子合成配列の全体の置き換え（すなわち、ＣＲＥ－ＬＯＸ組換えシステム、および／または豚ｖＷＦゲノム配列におけるヌクレオチドをヒトカウンターパートで置き換えるための特異的な核酸塩基対の変更による）を有していてもよい。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌの発現、加えて豚ｖＷＦ遺伝子への遺伝学的改変を欠如しているトランスジェニック動物（例えば，豚トランスジェニック動物）である。改変は、例えば、豚ｖＷＦ遺伝子のノックアウト、およびヒト化またはキメラｖＷＦ遺伝子での置き換えであり得る。トランスジェニック動物は、もう１つの追加の遺伝学的改変を含有していてもよい。一実施形態において、トランスジェニック動物は、ＣＤ４６の取り込みおよび発現をさらに含む。一部の実施形態において、追加の改変は、成長ホルモン受容体ノックアウト、ＩＧＦ－１ノックアウト、またはＩＧＦ－１Ｒノックアウトである。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、ＧＨＲの発現が、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれを超えて減少している。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ＧＨＲ遺伝子変化がない動物と比較して、３０％、４０％、５０％、７５％、もしくは９０％またはそれ未満のＩＧＦ－１を生産し得る。
トランスジェニック動物は、同様に、１つまたは複数の遺伝学的改変を含有する第２のトランスジェニック動物と交配させる（bread）ことができる。一部の実施形態において、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体の発現、加えて豚ｖＷＦ遺伝子への遺伝学的改変を欠如しているトランスジェニック動物（例えば豚トランスジェニック動物）は、単一の遺伝子座における少なくとも４つの導入遺伝子を含有するか、または単一の遺伝子座における少なくとも４つの導入遺伝子、および第２の遺伝子座における少なくとも２つの導入遺伝子を含有する第２のトランスジェニック動物と交配させることができ、それによって複数の遺伝学的改変を含有する動物が提供される。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体の発現、ならびに単一の遺伝子座に、少なくとも２つのプロモーターの制御下に、豚ｖＷＦ遺伝子への遺伝学的改変（例えば、キメラヒト－豚ｖＷＦ）および少なくとも４つの遺伝学的改変を欠如しているトランスジェニック動物（例えば豚トランスジェニック動物）である。例示的な実施形態において、遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座または改変されたネイティブの遺伝子座である。一部の実施形態において、遺伝子座は、例えば、ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２およびＧＧＴＡ１であり得る。一部の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、相同組換えまたは遺伝子編集ツールによって取り込むことができる。
Ｖ．導入遺伝子
本開示のトランスジェニック動物のゲノムに導入された導入遺伝子は、任意の好適な導入遺伝子であってもよい。
１．イムノモジュレーター（Immunodulators）
一実施形態において、導入遺伝子は、イムノモジュレーターである。例示的な実施形態において、ドナー動物は、遺伝子改変されており、その結果として、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体の発現（例えば、発現が欠如しているかまたは低減されている）、（ｉｉ）少なくとも４つの導入遺伝子が、単一の遺伝子座に取り込まれ、発現され、少なくとも２つの導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、イムノモジュレーターである。イムノモジュレーターは、任意の好適なイムノモジュレーターであってもよい。例示的な実施形態において、イムノモジュレーターは、補体調節因子（例えば、補体阻害剤）または免疫抑制剤である。
２．補体調節因子
一実施形態において、本開示は、異種間移植のための臓器、組織および細胞の供給源として使用するのに好適なトランスジェニック動物（例えば、豚動物）であって、ドナー動物は、少なくとも１つの補体調節因子、例えば補体阻害剤を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物を提供する。例示的な実施形態において、ドナー動物は、結果として、（ｉ）アルファＧａｌおよび／またはＧＨＲの発現（例えば、発現）が欠如しているかまたは低減され、（ｉｉ）少なくとも４つの導入遺伝子が単一の遺伝子座に取り込まれ、発現されるように遺伝子改変されており、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、補体調節因子であり、またはより具体的には、補体阻害剤である。
補体は、一連の血液タンパク質の総称であり、免疫系の主要なエフェクターメカニズムである。補体活性化およびその標的構造上への沈着は、補体媒介細胞溶解の指示を引き起こす可能性があるか、または炎症の強力なモジュレーターの生成ならびに免疫エフェクター細胞の動員および活性化による細胞もしくは組織破壊を間接的にもたらす可能性がある。組織傷害を媒介する補体活性化の生成物は、補体経路中の様々なポイントで生成される。宿主組織における不適切な補体活性化は、多くの自己免疫および炎症性疾患の病理学において重要な役割を果たし、生体非適合性に関連する多くの疾患状態、例えば心肺の炎症後および移植による拒絶反応後の疾患状態にも関与する。宿主細胞膜上の補体沈着は、細胞表面で発現された補体阻害性タンパク質によって防止される。
補体系は、約３０種のタンパク質の集合体を含み、免疫系の主要なエフェクターメカニズムの１つである。補体カスケードは、主に古典（通常は抗体依存性）または代替（通常は抗体非依存性）経路のいずれかを介して活性化される。いずれかの経路を介した活性化により、カスケードの中心的な酵素複合体であるＣ３コンバターゼの生成が起こる。Ｃ３コンバターゼは、血清Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに切断し、その後者は活性化部位と共有結合し、それにより、Ｃ３コンバターゼのさらなる生成が起こる（増幅ループ）。活性化生成物Ｃ３ｂ（さらに古典経路を介してのみ生成するＣ４ｂも）およびその破壊生成物は、重要なオプソニンであり、標的細胞の細胞媒介溶解（食細胞およびＮＫ細胞による）を促進することに加えて、免疫複合体の輸送および可溶化に関与する。Ｃ３／Ｃ４活性化生成物および免疫系の様々な細胞におけるその受容体も、細胞性免疫応答をモジュレートすることにおいて重要である。Ｃ３コンバターゼは、Ｃ５を切断してＣ５ａおよびＣ５ｂをもたらす複合体であるＣ５コンバターゼの形成に参加する。Ｃ５ａは、強力な炎症促進性および走化性特性を有しており、免疫エフェクター細胞を動員し、活性化することができる。Ｃ５ｂの形成は、末端補体経路を開始させることで補体タンパク質Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８および（Ｃ９）ｎの逐次的なアセンブリを引き起こし、膜侵襲複合体（ＭＡＣまたはＣ５ｂ－９）を形成する。標的細胞膜におけるＭＡＣの形成は、直接の細胞溶解をもたらすことができるが、細胞活性化および様々な炎症性モジュレーターの発現／放出も引き起こす可能性がある。
膜補体阻害剤の２つの広範なクラス：補体活性化経路の阻害剤（Ｃ３コンバターゼ形成を阻害する）、および末端補体経路の阻害剤（ＭＡＣ形成を阻害する）がある。補体活性化の膜阻害剤としては、補体受容体１（ＣＲ１）、減衰促進因子（decay-accelerating factor）（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、および膜補因子タンパク質（ＭＣＰまたはＣＤ４６）が挙げられる。それらは全て、Ｃ３／Ｃ４結合タンパク質の共通の構造であるショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）と呼ばれる約６０～７０アミノ酸の様々な数の反復単位からなるタンパク質構造を有する。ヒト補体活性化阻害剤のげっ歯類ホモログが同定されている。げっ歯類タンパク質Ｃｒ１は、ＤＡＦとＭＣＰの両方と類似して機能する広く分布する補体活性化の阻害剤である。げっ歯類はまたＤＡＦおよびＭＣＰも発現するが、げっ歯類において、Ｃｒ１が、補体活性化の機能的に最も重要な調節因子と考えられる。ヒトに見出されるＣｒ１のホモログはないが、Ｃｒ１の研究および動物モデルにおけるその使用は、臨床的に重要である。
宿主細胞膜における末端補体経路およびＭＡＣ形成の制御は、主に、グリコシルホスファチジルイノシトール（glucosylphosphatidylinositol）（ＧＰＩ）アンカーによって原形質膜に付着した広く分布する２０ｋＤの糖タンパク質であるＣＤ５９の活性を介して起こる。ＣＤ５９は、ＭＡＣのアセンブル中にＣ８およびＣ９に結合し、膜挿入を防止する。
宿主細胞は、ＤＡＦ、ＭＣＰおよびＣＤ５９のような膜結合型補体調節タンパク質によってそれ自体の補体から保護される。臓器が別の種に移植されると、レシピエントにおける天然抗体はドナー臓器の内皮と結合し、補体を活性化し、それによって急速な拒絶反応を開始させる。これまでに、ヒト細胞とは対照的に、ブタの細胞はヒト補体に対して感受性が高いことが示唆されており、これは、ブタ細胞表面補体調節タンパク質がヒト補体に対して効果がないためと考えられた。臓器が別の種に移植されると、レシピエントにおける天然抗体はドナー臓器の内皮と結合し、補体を活性化し、それによって急速な拒絶反応を開始させる。ＩｇＭ天然抗体の除去、およびｓＣＲ１、ヘパリンまたはＣ１阻害剤を使用する全身の補体除去または補体の阻害などの拒絶を防止するかまたは遅延させるための数々の戦略が示されてきた。
拒絶の問題に対する代替アプローチは、トランスジェニックブタにおけるヒト膜結合型の補体調節分子を発現させることである。減衰促進因子ＤＡＦ（ＣＤ５５）、膜補因子タンパク質ＭＣＰ（ＣＤ４６）および反応性溶解物の膜阻害剤、ＭＩＲＬ（ＣＤ５９）を発現するトランスジェニックブタが生成されている。（Klymium et al. Mol Reprod Dev (2010)77:209-221を参照）。これらのヒト阻害剤は、豚血管内皮で豊富に発現されることが示されている。エクスビボにおける対照動物からの心臓のヒト血液での灌流は、数分以内に臓器の補体媒介の破壊を引き起こしたが、それに対してトランスジェニック動物から得られた心臓は、補体に無反応であり、数時間生き延びた。
上記で概説したように、ブタ臓器を「ヒト化する」ためにブタ臓器でヒト補体調節タンパク質を発現させることに関する論理的説明は、内因性ブタ調節タンパク質がヒト補体の阻害において非効率的であるという仮説に基づいており、したがって、異種間移植の文脈における臓器の生存にはほとんど寄与しないであろう。（Cantarovich et al., Xenotransplantation 9:25, 2002；Kirchhof et al., Xenotransplantation 11(5), 396, 2004；Tjernberg, et al., Transplantation. 2008 Apr. 27; 85(8): 1193-9）。加えて、可溶性補体阻害剤は、インビトロで膵島の補体媒介の溶解を防止することができる（Bennet, et al., Transplantation 69(5):711, 2000）。
Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第７，４６２，４６６号明細書は、ヒト補体調節タンパク質（ＣＲＰ）のうちいくつかの豚アナログの単離および特徴付けを記載している。この研究は、ヒト補体調節タンパク質分子を発現するブタ臓器が、ヒトＣＲＰ分子を発現したためではなく、大幅に増加した量の機能的なＣＲＰ分子を発現したために、補体損傷に対して耐性であったことを例示した。Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．は、豚ＣＲＰの増加した発現が、超急性拒絶反応を引き起こす補体損傷からドナー臓器を保護することにおいて、ヒト補体調節タンパク質を発現するドナー臓器と等しく有効であり得ることを見出した。
ＣＤ４６は、古典および代替経路の両方を介して活性化された補体媒介攻撃から宿主細胞を保護することができる、調節特性を有するタンパク質として特徴付けられている（Barilla-LaBarca, M. L. et al., J. Immunol. 168, 6298-6304 (2002)）。ヒトＣＤ４６（ｈＣＤ４６）は、低いレベルの天然もしくは誘導性抗Ｇａｌまたは抗非Ｇａｌ抗体によって媒介される炎症および体液性拒絶反応中の補体溶解からの保護を提供することができる。結果として、より多くの膵島を生着させ、その後よりよく拒絶反応から保護することができ、したがって免疫抑制の必要性を低減させる。
本開示の一実施形態において、機能的なアルファＧａｌおよび／ＧＨＲの発現を欠如しており（またはアルファＧａｌおよび／またはＧＨＲの発現が低減している）、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、またはそれより多くの補体阻害剤を取り込み、発現するように遺伝子改変されている動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）が提供される。補体阻害剤の発現は、偏在的であってもよいし、または組織特異的プロモーターの制御下であってもよい。
例示的な実施形態において、補体阻害剤は、膜補体阻害剤である。膜補体阻害剤は、補体活性化経路の阻害剤（Ｃ３コンバターゼ形成を阻害する）または末端補体経路の阻害剤（ＭＡＣ形成を阻害する）のいずれかであり得る。補体活性化の膜阻害剤としては、補体受容体１（ＣＲ１）、減衰促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰまたはＣＤ４６）などが挙げられる。末端補体経路の膜阻害剤としては、ＣＤ５９などを挙げることができる。
例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも２つの導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、補体調節因子であり、より具体的には補体阻害剤であり、さらにより具体的には膜補体阻害剤である、トランスジェニック動物を提供する。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。例示的な実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供され、組込みは、ランダムな組込みであってもよく、または遺伝学的な標的化ツールによって促進される。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含み、遺伝学的改変の例としては、これらに限定されないが、ネイティブの豚ｖＷＦ、β４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、またはフォルスマン（Forsmann）遺伝子の改変が挙げられる。
例示的な実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子を含む動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座に取り込まれ、発現され、ブタは、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現を欠如しており、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも１つの補体調節因子を含み、より具体的には、少なくとも１つの補体阻害剤を含む、動物が提供される。追加の導入遺伝子は、例えば、免疫抑制剤、細胞保護剤遺伝子またはそれらの組合せであってもよい。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。例示的な実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供され、組込みは、ランダムであるか、または遺伝学的な標的化ツールによって促進される。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、機能的なアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも４つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されている動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、少なくとも４つの追加の導入遺伝子のうちの少なくとも２つのうちの少なくとも１つは、補体阻害剤であり、より詳細には、少なくとも２つの膜補体阻害剤である、動物が提供される。
例示的な実施形態において、機能的なアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）少なくとも２つの補体阻害剤、より詳細には、少なくとも２つの膜補体阻害剤を取り込んでおり、それらを発現し、（ｉｉ）抗凝血剤、免疫抑制剤、細胞保護剤遺伝子またはそれらの組合せから選択される少なくとも２つの追加の導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現するように遺伝子改変されている動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）が提供される。
一実施形態において、トランスジェニック動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、機能的なアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）ＣＤ４６およびＣＤ５５を取り込み、それらを発現し、（ｉ）少なくとも２つの追加の導入遺伝子を取り込み、それらを発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物が提供される。ある特定の実施形態において、追加の導入遺伝子は、抗凝血剤、免疫抑制剤、細胞保護剤遺伝子またはそれらの組合せから選択される。
特定の実施形態において、機能的なアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも２つのプロモーターの制御下に、少なくとも４つの導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＣＤ４６であり、発現は、内因性プロモーターによって制御される、トランスジェニック動物が提供される。
別の実施形態において、機能的なアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）ＣＤ４６およびＣＤ５５を取り込み、それらを発現し、（ｉ）少なくとも３つの追加の導入遺伝子を取り込み、それらを発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）が提供される。ある特定の実施形態において、追加の導入遺伝子は、抗凝血剤、免疫抑制剤、細胞保護剤遺伝子またはそれらの組合せから選択される。例示的な実施形態において、少なくとも３つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤を含む。例示的な実施形態において、少なくとも３つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤および免疫抑制剤を含む。
別の実施形態において、機能的なアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）ＣＤ４６およびＣＤ５５を取り込み、それらを発現し、（ｉ）少なくとも４つの追加の導入遺伝子を取り込み、それらを発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）が提供される。ある特定の実施形態において、追加の導入遺伝子は、抗凝血剤、免疫抑制剤、細胞保護剤遺伝子またはそれらの組合せから選択される。例示的な実施形態において、少なくとも４つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤を含む。例示的な実施形態において、少なくとも４つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤および免疫抑制剤を含む。例示的な実施形態において、少なくとも４つの追加の導入遺伝子は、少なくとも３つの抗凝血剤を含む。
別の実施形態において、機能的なアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）ＣＤ４６およびＣＤ５５を取り込み、それらを発現し、（ｉ）少なくとも５つの追加の導入遺伝子を取り込み、それらを発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）が提供される。ある特定の実施形態において、追加の導入遺伝子は、抗凝血剤、免疫抑制剤、細胞保護剤遺伝子またはそれらの組合せから選択される。例示的な実施形態において、少なくとも５つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤、および少なくとも１つの免疫抑制剤を含む。例示的な実施形態において、少なくとも５つの追加の導入遺伝子は、少なくとも３つの抗凝血剤、および少なくとも１つの免疫抑制剤を含む。例示的な実施形態において、少なくとも５つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤、および少なくとも２つの免疫抑制剤を含む。一実施形態において、動物は、補体調節因子ペプチド、その生物学的に活性な断片または誘導体を発現するように改変してもよい。一実施形態において、補体調節因子ペプチドは、全長補体調節因子である。さらなる実施形態において、補体調節因子ペプチドは、全長未満の補体調節因子タンパク質を含有していてもよい。
当業者に公知の任意のヒトもしくは豚補体調節因子配列またはその生物学的に活性な部分もしくは断片が、本開示の組成物および方法に従っていてもよい。追加の実施形態において、任意のコンセンサス補体調節因子ペプチドが本開示に従って使用することができる。別の実施形態において、本明細書に記載される補体調節因子ペプチドおよびヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同な、核酸および／またはペプチド配列。さらなる実施形態において、補体調節因子と類似の活性を提示する任意の断片または相同配列を使用することができる。任意選択で、少なくとも４つの導入遺伝子のうち少なくとも１つの補体調節因子（例えば、補体阻害剤）を発現し、アルファ１，３ｇａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現が欠如した動物は、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を有する。
３．免疫抑制剤
一実施形態において、本開示は、異種間移植のための臓器、組織および細胞の供給源として使用するのに好適なトランスジェニック動物であって、ドナー動物は、少なくとも１つの免疫抑制剤を取り込み、発現するように遺伝子改変されている、トランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物は、典型的には、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有し、より詳細には、５つまたはそれより多くの追加の遺伝学的改変を有し、さらにより詳細には、６つまたはそれより多くの追加の遺伝学的改変を有する。
「免疫抑制剤」導入遺伝子は、免疫応答を下方調節することが可能である。任意のタイプの移植手順で、その臨床的な承認のために、効能と毒性とのバランスが重要な要素である。膵島移植に関して、さらなる懸念は、現在の免疫抑制剤の多く、特にグルココルチコイド（glucocortecoid）またはカルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムス（Tarcolimus）が、ベータ細胞に傷害を与えるか、または末梢インスリン耐性を誘導することである（Zeng et al. Surgery (1993) 113: 98-102）。シロリムス、低用量のタクロリムス、およびＩＬ－２受容体に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むステロイド非含有の免疫抑制プロトコール（「エドモントンプロトコール」）が、１型糖尿病を有する患者のための膵島移植単独の治験で使用されてきた（Shapiro, A. M. J. et al, (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230-238）。「エドモントンプロトコール」を使用した近年の成功により、糖尿病を処置するための膵島移植の使用に関する熱意が回復した。しかしながら、タクロリムスの毒性に関する懸念が、ヒトにおけるこの治療の適用を制限する可能性がある。
主要なＴ細胞共刺激シグナル、特にＣＤ２８経路をブロックする生物学的物質は、膵島を保護するための見込みのある代替物である。ＣＤ２８経路をブロックする薬剤の例としては、これらに限定されないが、突然変異体ＣＴＬＡ４分子を含む可溶性ＣＴＬＡ４が挙げられる。
Ｔ細胞活性化は、移植による拒絶反応の病因に関与する。Ｔ細胞の活性化は、少なくとも２セットのシグナル伝達事象を必要とする。第１のセットは、抗原提示細胞（ＡＰＣ５）上の主要組織適合（histocampatibility）複合体（ＭＨＣ）分子と組み合わされた抗原性ペプチドのＴ細胞受容体を介した特異的な認識によって開始される。第２のシグナルのセットは、抗原非特異的であり、ＡＰＣ上でそのリガンドと相互作用するＴ細胞共刺激受容体によって送達される。共刺激の非存在下で、Ｔ細胞活性化は損なわれるかまたは阻止され、これは、クローンアネルギーの抗原特異的な無応答状態、またはアポトーシス死による欠失を引き起こす可能性がある。したがって、Ｔ細胞共刺激の妨害は、正常な免疫機能を保ちながら抗原特異的な方式で不要な免疫応答を抑制するためのアプローチを提供する可能性がある。（Dumont, F. J. 2004 Therapy 1, 289-304）。
これまで同定された数々のＴ細胞共刺激経路のうち、最も顕著なものは、ＣＤ２８経路である。Ｔ細胞上で発現された細胞表面分子であるＣＤ２８、ならびに樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞上に存在するその対抗受容体であるＢ７．１（ＣＤ８Ｏ）およびＢ７．２（ＣＤ８６）分子は、Ｔ細胞共刺激シグナルを中断するための魅力的な標的として特徴付けられ、同定されている。ＣＤ２８に相同な第２のＴ細胞表面分子は、細胞傷害性（cytoxic）Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ４）として公知である。ＣＴＬＡ４は、細胞表面シグナル伝達分子であるが、ＣＤ２８の作用とは反対に、ＣＴＬＡ４はＴ細胞の機能を負に調節する。ＣＴＬＡ４は、Ｂ７リガンドに対してＣＤ２８より２０倍高い親和性を有する。１９８８年に、ヒトＣＴＬＡ４のための遺伝子がクローニングされ、１９９０年に染色体マッピングされた（Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)；Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31:198-201 (1990)；米国特許第５，９７７，３１８号明細書）。
ＣＤ２８／Ｂ７経路は、Ｔ細胞共刺激シグナルを中断するための魅力的な標的になりつつある。ＣＤ２８／Ｂ７阻害剤の設計は、このシステムの内因性の負の調節因子であるＣＴＬＡ４を活用してきた。Ｔ細胞共刺激を阻害する手段として、ＣＴＬＡ４－免疫グロブリン（ＣＴＬＡ４－Ｉｇ）融合タンパク質が広く研究されてきた。いずれの免疫抑制療法を用いても、難しいバランスをとる必要がある；疾患または拒絶反応を克服するのに十分な抑制を提供しなければならないが、過剰な免疫抑制は、免疫系全体を阻害することになる。臓器移植および自己免疫疾患の動物モデルの前臨床研究において、ＣＴＬＡ４－Ｉｇの免疫抑制活性が実証されている。近年、可溶性ＣＴＬＡ４が、腎不全、乾癬およびリウマチ様関節炎を有するヒト患者で試験され、リウマチ様関節炎の処置のために承認されたＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂにより開発された薬物（アバタセプト、可溶性ＣＴＬＡ４－Ｉｇ）として製剤化された。この薬物は、選択的なＴ細胞共刺激モジュレーターの新しいクラスにおける最初のものである。またＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂは、同種移植片腎臓移植のためのベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）を用いた第ＩＩ相臨床治験も実行している。ＬＥＡ２９Ｙは、Ｂ７受容体に対して野生型ＣＴＬＡ４より高い親和性を有するように操作されたＣＴＬＡ４の突然変異した形態であり、免疫グロブリンに融合されている。またＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎも、特発性血小板減少性紫斑病のためのそのＣＴＬＡ４－Ｉｇを用いた臨床治験を実行している。「可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子を使って同種異系島移植片を保護する方法（Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble CTLA4 mutant molecules）」というタイトルの米国特許第５，７３０，４０３号明細書は、同種膵島移植を保護するための可溶性ＣＴＬＡ４－ＩｇおよびＣＴＬＡ４突然変異分子の使用を記載している。
ある生物からのＣＴＬＡ－４が別の生物からのＢ７に結合できるにもかかわらず、最大の結合活性は、同種のＢ７で見出されている。したがって、ドナー生物からの可溶性ＣＴＬＡ－４は、レシピエントＢ７（正常細胞における）およびドナーＢ７（異種間移植された細胞における）の両方にこのようにして結合できるが、優先的には異種移植片におけるＢ７と結合する。したがって、異種間移植のための豚動物または細胞を含む本発明の実施形態において、豚ＣＴＬＡ４が典型的である。Ｉｍｐｅｒｉａｌ ＣｏｌｌｅｇｅによるＰＣＴ公開番号国際公開第９９／５７２６６号パンフレットは、異種間移植治療のための豚ＣＴＬＡ４配列および可溶性ＣＴＬＡ４－Ｉｇの投与を記載している。Vaughn A. et al., J Immunol (2000) 3175- 3181は、可溶性豚ＣＴＬＡ４－Ｉｇの結合および機能を記載している。豚ＣＴＬＡ４－Ｉｇは、豚（ヒトではない）Ｂ７と結合し、レシピエントＴ細胞上のＣＤ２８をブロックし、全体的なＴ細胞免疫抑制を引き起こすことなくこれらを局所的なＴ細胞アネルギーにする（Mirenda et. al., Diabetes 54:1048-1055, 2005を参照）。
免疫抑制剤としてのＣＴＬＡ４－Ｉｇに対する調査の多くは、ＣＴＬＡ４－Ｉｇの可溶性形態を患者に投与することに焦点を当ててきた。ＣＴＬＡ４－Ｉｇを発現するように操作されたトランスジェニックマウスが作り出され、数々の系列の実験に供された。Ｒｏｎｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．は、概してマウスにおけるＣＴＬＡ４の発現後の免疫系機能を検査した（Ronchese et al. J Exp Med (1994) 179: 809；Lane et al.J Exp Med. (1994) March 1; 179(3):819）。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（Transplantation. 2000 69(9):1806-12）は、同種異系の膵島移植に対する遺伝子導入により発現されたＣＴＬＡ４－Ｉｇの作用を試験するために、マウスにおけるトランスジェニック胎児膵臓同種移植片によって分泌されたＣＴＬＡ４－Ｉｇの保護的作用を記載した。Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．（J Immunol Methods 2003 277: 171-183）は、バイオリアクターとして使用するためのトランスジェニック動物の乳における可溶性ＣＴＬＡ４－Ｉｇの発現を誘導するための、乳房特異的なプロモーターの制御下でＣＴＬＡ４－Ｉｇを発現したトランスジェニックマウスの生産を報告した。
Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．によるＰＣＴ公開番号国際公開第０１／３０９６６号パンフレットは、補体タンパク質ＣＤ５９に付着したＴ細胞阻害剤ＣＴＬＡ－４を含有するキメラＤＮＡ構築物、加えて、それを含有するトランスジェニック豚細胞、組織、および臓器を記載している。ＰＣＴ公開番号国際公開第２００７０３５２１３号パンフレット（Revivicor）は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇを発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック豚動物を記載している。
追加の免疫抑制剤が、動物、組織または細胞で発現されてもよい。例えば、免疫機能が低下した表現型を生じるようにマウスで不活性化された遺伝子は、ブタにおいて、遺伝子標的化によってクローニングおよび崩壊させることができる。マウスで標的化され、免疫機能が低下したブタを生産するように標的化され得る一部の遺伝子としては、ベータ２－ミクログロブリン（ＭＨＣクラスＩ欠乏、Koller et al., Science, 248:1227-1230）、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ（Mombaerts et al., Nature, 360:225-231）、ＲＡＧ－１およびＲＡＧ－２（Mombaerts et al., (1992) Cell 68, 869-877、Shinkai, et al., (1992) Cell 68, 855-867、米国特許第５，８５９，３０７号明細書）が挙げられる。
一実施形態において、ドナー動物は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４－免疫グロブリン（immunoglobin）（ＣＴＬＡ４）を遺伝子導入により発現するように改変される。動物または細胞は、ＣＴＬＡ４ペプチドまたは生物学的に活性な断片（例えば、細胞外ドメイン、少なくとも膜貫通ドメインが除去されたペプチドの短縮化された形態）またはその誘導体を発現するように改変してもよい。ペプチドは、例えば、ヒトまたは豚であってもよい。ＣＴＬＡ４ペプチドは、突然変異していてもよい。
突然変異したペプチドは、豚および／またはヒトＢ７分子に対して野生型より高い親和性を有していてもよい。具体的な一実施形態において、突然変異したＣＴＬＡ４は、ＣＴＬＡ４（Ｇｌｕ１０４、Ｔｙｒ２９）であってもよい。ＣＴＬＡ４ペプチドは、それが細胞内で発現されるように改変されていてもよい。ＣＴＬＡ４ペプチドの他の改変としては、ＮまたはＣ末端への小胞体保持シグナルの付加が挙げられる。小胞体（endoplasmic reticiulum）保持シグナルは、例えば、配列ＫＤＥＬであってもよい。ＣＴＬＡ４ペプチドは、ペプチド二量体化ドメインまたは免疫グロブリン（Ｉｇ）分子に融合されていてもよい。ＣＴＬＡ４融合ペプチドは、２つのペプチドを合体させることができるリンカー配列を含んでいてもよい。別の実施形態において、本開示により生産された機能的な免疫グロブリンの発現が欠如した動物に、そのＴ細胞応答を抑制するための薬物として、ＣＴＬＡ４ペプチドまたはそのバリアント（ｐＣＴＬＡ４－Ｉｇ、またはｈＣＴＬＡ４－Ｉｇ（アバタセプト／オレンシア、またはベラタセプト））が投与されてもよい。ＣＴＬＡ４は、本明細書で使用される場合、これらのバリアントまたは当業界において公知のもののいずれかを指すのに使用され、例えば、ＣＴＬＡ４－Ｉｇである。
一実施形態において、ＣＴＬＡ４ペプチドは、全長ＣＴＬＡ４である。さらなる実施形態において、ＣＴＬＡ４ペプチドは、全長未満のＣＴＬＡ４タンパク質を含有していてもよい。一実施形態において、ＣＴＬＡ４ペプチドは、ＣＴＬＡ－４ペプチドの細胞外ドメインを含有していてもよい。特定の実施形態において、ＣＴＬＡ４ペプチドは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインである。よりさらなる実施形態において、本開示は、ＣＴＬＡ４の突然変異した形態を提供する。一実施形態において、ＣＴＬＡ４の突然変異した形態は、豚および／またはヒトＢ７に対して野生型より高い親和性を有していてもよい。具体的な一実施形態において、突然変異したＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４（Ｇｌｕ１０４、Ｔｙｒ２９）であってもよい。
一実施形態において、ＣＴＬＡ４は、タンパク質の少なくとも膜貫通ドメインが除去されたＣＴＬＡ４の短縮化された形態であってもよい。別の実施形態において、ＣＴＬＡ４ペプチドは、それが細胞内で発現されるように改変されていてもよい。一実施形態において、ゴルジ保持シグナルは、ＣＴＬＡ４ペプチドのＮまたはＣ末端に付加されてもよい。一実施形態において、ゴルジ保持シグナルは、配列ＫＤＥＬであってもよく、これは、ＣＴＬＡ４ペプチドのＣまたはＮ末端に付加されてもよい。さらなる実施形態において、ＣＴＬＡ４ペプチドは、ペプチド二量体化ドメインに融合されていてもよい。一実施形態において、ＣＴＬＡ４ペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）に融合されていてもよい。別の実施形態において、ＣＴＬＡ４融合ペプチドは、２つのペプチドを合体させることができるリンカー配列を含んでいてもよい。
当業者に公知の任意のヒトＣＴＬＡ４配列またはその生物学的に活性な部分もしくは断片は、本開示の組成物および方法に従っていてもよい。
非限定的な例としては、これらに限定されないが、ヒトＣＴＬＡ４配列を記載する以下のＧｅｎｂａｎｋ受託番号が挙げられる：ＮＭ００５２１４．２；ＢＣ０７４８９３．２；ＢＣ０７４８４２．２；ＡＦ４１４１２０．１；ＡＦ４１４１２０；ＡＹ４０２３３３；ＡＹ２０９００９．１；ＢＣ０７０１６２．１；ＢＣ０６９５６６．１；Ｌ１５００６．１；ＡＦ４８６８０６．１；ＡＣ０１０１３８．６；ＡＪ５３５７１８．１；ＡＦ２２５９００．１；ＡＦ２２５９００；ＡＦ４１１０５８．１；Ｍ３７２４３．１；Ｕ９０２７３．１；および／またはＡＦ３１６８７５．１。ＣＴＬＡ４ペプチドをコードするさらなるヌクレオチド配列は、これらに限定されないが、以下のＥＳＴデータベースからのＧｅｎｂａｎｋ受託番号などから選択することができる：ＣＤ６３９５３５．１；Ａ１７３３０１８．１；ＢＭ９９７８４０．１；ＢＧ５３６８８７．１；ＢＧ２３６２１１．１；ＢＧ０５８７２０．１；Ａ１８６０ｉ９９．１；ＡＷ２０７０９４．１；ＡＡ２１０９２９．１；Ａ１７９１４１６．１；ＢＸ１１３２４３．１；ＡＷ５１５９４３．１；ＢＥ８３７４５４．１；ＡＡ２１０９０２．１；ＢＦ３２９８０９．１；Ａ１８１９４３８．１；ＢＥ８３７５０１．１；ＢＥ８３７５３７．１；および／またはＡＡ８７３１３８．１。
追加の実施形態において、任意のコンセンサスＣＴＬＡ４ペプチドを本開示に従って使用することができる。別の実施形態において、ネイティブのＣＴＬＡ４ペプチドおよびヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％相同な、核酸および／またはペプチド配列。さらなる実施形態において、ＣＴＬＡ４と類似の活性を提示する任意の断片または相同配列を使用することができる。他の実施形態において、Ｔ細胞阻害活性を提示するアミノ酸配列は、豚ＣＴＬＡ４配列のアミノ酸３８～１６２またはヒトＣＴＬＡ４配列のアミノ酸３８～１６１であってもよい（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第０１／３０９６６号パンフレットを参照）。一実施形態において、使用される部分は、親分子の活性の、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％を有するべきである。
他の実施形態において、本開示のＣＴＬＡ４核酸およびペプチドは、免疫グロブリン遺伝子および分子またはその断片もしくは領域に融合されていてもよい。本開示のＣＴＬＡ４配列への言及は、免疫グロブリンに融合した配列を含む。一実施形態において、Ｉｇは、ヒトＩｇであってもよい。別の実施形態において、Ｉｇは、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１であってもよい。別の実施形態において、Ｉｇは、ＩｇＧの定常領域であってもよい。特定の実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ１のＣγ１鎖であってもよい。本開示の特定の一実施形態において、豚ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、ヒトＣγ１Ｉｇに融合されていてもよい。他の特定の実施形態において、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４に融合されていてもよい。さらなる特定の実施形態において、突然変異したＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（Ｇｌｕ１０４、Ｔｙｒ２９）は、ＩｇＧ１に融合されていてもよい。一実施形態において、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、Ｂ７－Ｈ４であり、これはまた、Ｂ７ｘとしても公知である。Ｂ７－４Ｈは、２００３年に同定され、免疫グロブリンのＢ７ファミリーに属する。GL Immunity, Vol. 18, 849-861, June, 2003を参照されたい。
一実施形態において、ドナー動物は、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）およびその突然変異体ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、腫瘍壊死因子－α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）インテグリン関連タンパク質（ＣＤ４７）、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、またはＨＬＡ－ＤＲを遺伝子導入により発現するように改変されている。
クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）は、転写活性化因子として作用する二または多機能性ドメインタンパク質であり、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現において重要な役割を果たす。これまでに、ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子の突然変異した形態は、アミノ末端の１５１個のアミノ酸が欠如したタンパク質をコードしており、ＨＬＡクラスＩＩ発現の有力なドミナントネガティブサプレッサーとして作用することが実証された（Yun et al., Int Immunol. 1997 October; 9(10):1545-53）。豚ＭＨＣクラスＩＩ抗原は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による直接的なＴ細胞認識の有力な刺激因子であり、それゆえに、臨床的な異種間移植におけるトランスジェニックブタドナーに対する拒絶応答において重要な役割を果たす可能性が高い。ブタ細胞において１つの突然変異したヒトＣＩＩＴＡ構築物が有効であり、著しくＩＦＮ［ガンマ］による誘導、それに加えて構成的豚ＭＨＣクラスＩＩ発現を抑制したことが報告された。さらに、突然変異したヒトＣＩＩＴＡ構築物を有する安定してトランスフェクトされた豚血管内皮細胞株は、精製したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞による直接的なＴ細胞の異種認識（xenorecognition）を刺激できなかった（Yun et al., Transplantation. 2000 Mar. 15; 69(5):940-4）。ＣＩＩＴＡ－ＤＮトランスジェニック動物からの臓器、組織および細胞は、ヒトレシピエントにおいて大幅に低減したＴ細胞拒絶応答を誘導することができる。他の導入遺伝子と組み合わせて、突然変異したＣＩＩＴＡのトランスジェニック発現は、臨床的に許容できるレベルの免疫抑制と共に長期の異種移植片生存を可能にする。
一実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における少なくとも２つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも１つの免疫抑制剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも２つの導入遺伝子のうちの少なくとも２つは、免疫抑制剤である、トランスジェニック動物を提供する。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。少なくとも４つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供され、遺伝子編集ツールを利用して遺伝子座に取り込まれてもよい。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、機能的なアルファＧＴアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）単一の遺伝子座に少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現するように遺伝子改変されている動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも１つの免疫抑制剤を含む、動物が提供される。免疫抑制剤は、例えば、ＣＩＩＴＡ－ＤＮまたはＣＬＴＡ４－ＩＧであってもよい。少なくとも４つの導入遺伝子は、補体阻害剤、抗凝血剤またはそれらの組合せから選択される追加の導入遺伝子を含んでいてもよい。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。少なくとも３つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供され、遺伝子編集ツールを利用して遺伝子座に取り込まれてもよい。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、機能的なアルファＧＴ、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）単一の遺伝子座に少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現するように遺伝子改変されている動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも２つの免疫抑制剤を含む、動物が提供される。免疫抑制剤は、例えば、ＣＩＩＴＡ－ＤＮまたはＣＬＴＡ４－ＩＧであってもよい。少なくとも４つの導入遺伝子はまた、補体阻害剤、抗凝血剤、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。少なくとも３つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供され、遺伝子編集ツールを利用して遺伝子座に取り込まれてもよい。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
４．他のイムノモジュレーター
ＰＤＬ１、ＰＤＬ２
Ｔ細胞活性化のための典型的な共刺激分子は、ＣＤ８０／８６またはＣＤ４０である。過去数年にわたるこれらの陽性共刺激経路に加えて、負のシグナルを媒介し、Ｔ細胞活性化の調節に重要な新しい共刺激経路が見出されている。これらのより新しい経路の１つは、プログラム死１（ＰＤ－１）受容体およびそのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる経路である。ＰＤ－１受容体は、休止細胞で発現されないが、ＴおよびＢ細胞活性化後に上方調節される。ＰＤ－１は、細胞質免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフを含有し、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合は、Ｔ細胞において阻害シグナルをもたらす。近年のデータは、ＰＤ１／ＰＤＬｉｇａｎｄ経路が、調節活性を提示するＴ細胞サブセットの制御において役割を果たす可能性があることを示唆する。マウスにおいて、ＰＤ－１シグナルは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性および適合性Ｔｒｅｇの生成に必要であることが示されている。これらの観察は、ＰＤ－１／ＰＤＬｉｇおよび相互作用は、Ｔ細胞応答を阻害するだけでなく、免疫調節も引き起こす可能性があることを示唆する。数種類の証拠から、ＰＤ－１／ＰＤＬｉｇａｎｄ経路は、同種移植片の生着および拒絶反応を制御できることが実証され、これは、これらの分子が、臓器移植後の免疫修飾のための興味深い標的であることを暗に示す。実際に、ラット移植モデルにおいて、同種移植片生存の延長は、ドナー心臓へのＰＤＬ１ Ｉｇ遺伝子移入により達成することができる。さらに、ＰＤ－Ｌ１Ｉｇの注射によってＰＤ－１シグナル伝達を強化することも、マウスにおいて拒絶反応から移植片を保護するということが報告されている。近年のデータはまた、マウスにおける膵島移植片でのＰＤ－Ｌ１ＩＧの過剰発現が、部分的に膵島移植片生存を延長させることができることも示す。ブタ細胞および組織におけるヒトＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２のトランスジェニック発現は、感作の直接的な経路を介して開始される早期のヒト抗ブタＴ細胞応答を低減するとされている（Plege et al., Transplantation. 2009 Apr. 15; 87(7):975-82）。Ｔｒｅｇの誘導によって、長続きする寛容を達成するのに必要な間接的な経路を介して異種移植片に感作されたＴ細胞を制御することも可能になると考えられる。
特定の実施形態において、アルファＧａｌの発現が欠如しており、少なくとも２つのプロモーターの制御下で少なくとも４つの導入遺伝子を取り込み、発現するトランスジェニック動物は、ＰＤＬ１またはＰＤＬ２の取り込みおよび発現を含む。
ＴＲＡＩＬ／ＦａｓＬ
アポトーシス誘導リガンド、例えばＦａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）または腫瘍壊死因子－α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ－２Ｌ）の発現は、異種移植片を攻撃するＴ細胞を排除することができる。ＴＲＡＩＬは、ＩＩ型膜タンパク質であり、ＦａｓＬと最大のアミノ酸同一性（２８％）を示す他の腫瘍壊死因子ファミリーメンバーのものに相同な細胞外ドメインを有する。ＴＲＡＩＬは、そのアポトーシス誘導作用を、腫瘍細胞に優先的に働かせる。正常細胞において、ＴＲＡＩＬ受容体の結合は、細胞死を引き起こさない。近年の研究によれば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む免疫細胞の細胞傷害作用は、少なくとも部分的にＴＲＡＩＬによって媒介されることが示されている。トランスジェニックブタにおけるヒトＴＲＡＩＬの発現は、霊長類への異種間移植の後に細胞によって媒介される拒絶反応からブタ組織を保護するための適度な戦略を提供することができる。トランスジェニックブタにおいて、ヒトＴＲＡＩＬの安定な発現が達成され、発現されたＴＲＡＩＬは、インビトロで生物学的に機能的であることが示されている（Klose et al., Transplantation. 2005 Jul. 27; 80(2):222-30）。（ｄ）ＣＤ４７：ＣＤ４７は、インテグリン関連タンパク質として公知であり、偏在的に発現される５０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり、マクロファージにおける免疫阻害性受容体であるシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）α（ＣＤ１７２ａ、ＳＨＰＳ－１としても公知）のためのリガンドとして役立つ。ＣＤ４７およびＳＩＲＰαは、細胞移動、Ｂ細胞の接着、およびＴ細胞活性化を含む様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす細胞間コミュニケーションシステム（ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシステム）を構成する。加えて、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシステムは、マクロファージによる貪食の負の調節に関与する。数々の細胞型（すなわち、赤血球、血小板、または白血球）の表面上のＣＤ４７は、阻害性マクロファージ受容体ＳＩＲＰαに結合することによってマクロファージによる貪食から保護することができる。自己の認識および貪食の阻害におけるＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用の役割は、初代野生型マウスマクロファージがＣＤ４７欠乏マウスから得られた非オプソニン化ＲＢＣを急速に貪食するが、野生型マウスからのものは貪食しないという観察によって例示されている。そのＳＩＲＰα受容体を介して、ＣＤ４７は、Ｆｃガンマおよび補体受容体によって媒介される貪食の両方を阻害することも報告されている。豚ＣＤ４７は、ヒトマクロファージ様細胞株においてＳＩＲＰαチロシンリン酸化を誘導せず、可溶性ヒトＣＤ４７－Ｆｃ融合タンパク質は、豚細胞に対するヒトマクロファージの食細胞作用を阻害することが実証された。また、ヒトＣＤ４７の発現のための豚細胞の操作は、ヒトマクロファージによる貪食への細胞の感受性を徹底的に低減させることも示された（Ide et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Mar. 20; 104(12):5062-6）。豚細胞におけるヒトＣＤ４７の発現は、ヒトマクロファージにおいてＳＩＲＰαに阻害シグナル伝達を提供でき、マクロファージによって媒介される異種移植片拒絶反応を防止するためのアプローチが提供される。
特定の実施形態において、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現が欠如しており、少なくとも２つのプロモーターの制御下で少なくとも４つの導入遺伝子を取り込み、発現するトランスジェニック動物は、ＴＲＡＩＬまたはＦａｓＬの取り込みおよび発現を含む。ＮＫ細胞応答。ＨＬＡ－Ｅ／ベータ２ミクログロブリンおよびＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ。
ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ブタからヒトへの異種間移植の成功に対して存在し得る障壁の１つであり、これはなぜなら、それらは、エクスビボにおいてヒト血液で灌流したブタ臓器に浸潤し、インビトロにおいて、抗体依存性細胞媒介細胞傷害によって直接的に、およびヒト血清の存在下の両方で豚細胞を溶解させるためである。ＮＫ細胞の自己反応性は、正常な自己細胞における阻害性ＮＫ受容体の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩリガンドの発現によって妨害される。活性化されたヒトＮＫ細胞の大部分で発現される阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ｅに特異的に結合する。非古典的なヒトＭＨＣ分子ＨＬＡ－Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを有するＮＫ細胞のための有力な阻害性リガンドであり、古典的なＭＨＣ分子とは異なり、同種Ｔ細胞応答を誘導しない。ＨＬＡ－Ｅは、小胞体中でアセンブルされ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）、および一部のＭＨＣクラス１分子のリーダー配列から得られたペプチドからなる安定な三量体複合体として細胞表面に輸送される。ＨＬＡ－Ｅの発現は、異種ヒトＮＫ細胞細胞傷害からの部分的な保護を提供することが示されている（Weiss et al., Transplantation. 2009 Jan. 15; 87(1):35-43）。ブタ臓器におけるＨＬＡ－Ｅのトランスジェニック発現は、同種応答のリスクを生じさせずに、ヒトＮＫ細胞によって媒介される豚異種移植片の拒絶反応を実質的に軽減する可能性を有する。加えて、豚臓器、組織、および細胞を「ヒト化」する目的で、他のＨＬＡ遺伝子を有するトランスジェニックブタの生成に成功した（Huang et al., Proteomics. 2006 November; 6(21):5815-25、また米国特許第６，６３９，１２２号明細書も参照）。
特定の実施形態において、アルファＧａｌの発現が欠如しており、少なくとも２つのプロモーターの制御下で少なくとも４つの導入遺伝子を取り込み、発現するトランスジェニック動物は、ＨＬＡ－３の取り込みおよび発現を含む。
ＣＤ４７
ＣＤ４７（表面抗原分類４７）は、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても公知であり、ヒトではＣＤ４７遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７は、免疫抑制剤およびイムノモジュレーターの両方であり、ＳＩＲＰアルファシグナル伝達において免疫寛容を生じることが公知である。
例示的な実施形態において、機能的なアルファＧＴアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）単一の遺伝子座に少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現するように遺伝子改変されている動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、少なくとも４つの導入遺伝子のうちの１つがＣＤ４７である、動物が提供される。少なくとも４つの導入遺伝子は、補体阻害剤、抗凝血剤またはそれらの組合せから選択される追加の導入遺伝子を含んでいてもよい。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。少なくとも３つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供され、遺伝子編集ツールを利用して遺伝子座に取り込まれてもよい。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
例示的な実施形態において、機能的なアルファＧＴアルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、（ｉ）単一の遺伝子座に少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現するように遺伝子改変されている動物（ならびにそれから得られた臓器、組織および細胞）であって、少なくとも４つの導入遺伝子のうちの１つは、ＣＤ７である、動物が提供される。少なくとも４つの導入遺伝子は、補体阻害剤、抗凝血剤またはそれらの組合せから選択される追加の導入遺伝子を含んでいてもよい。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座から選択することができる。少なくとも３つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供され、遺伝子編集ツールを利用して遺伝子座に取り込まれてもよい。任意選択で、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含む。
５．抗凝血剤
一実施形態において、本開示は、異種間移植のための臓器、組織および細胞の供給源として使用するのに好適なトランスジェニックドナー動物であって、ドナー動物は、少なくとも１つの抗凝血剤を取り込み、発現するように遺伝子改変されている、トランスジェニックドナー動物を提供する。動物は、典型的には、追加の遺伝学的改変を有し、より詳細には、少なくとも５つの追加の遺伝学的改変、さらにより詳細には、少なくとも６つの追加の遺伝学的改変を有する。例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物であって、少なくとも１つの導入遺伝子は、抗凝血剤である、トランスジェニック動物である。
抗凝血剤は、任意の好適な抗凝血剤であってもよい。発現は、偏在的であってもよいし、または組織特異的であってもよい。特定の実施形態において、発現は、主として内皮で活性なプロモーターによって制御される。好適な抗凝血剤導入遺伝子の代表的な非限定的な例としては、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ３９およびそれらの組合せが挙げられる。
組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）は、第Ｘａ因子（Ｘａ）およびトロンビン（第ＩＩａ因子）を可逆的に阻害できる単鎖ポリペプチドであり、したがって、ＴＦ依存性凝固を阻害する。ＴＦＰＩの総論に関しては、Ｃｒａｗｌｅｙ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008, 28(2):233-42）を参照されたい。Ｄｏｒｌｉｎｇおよびその共同研究者は、バイベル－パラーデ細胞内貯蔵顆粒に標的化するためのＰ－セレクチンテールを有する、ヒトＣＤ４の膜貫通／細胞質内ドメインに連結されたヒトＴＦＰＩの３つのクニッツドメインからなる融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを生成した（Chen D, et al. Am J Transplant 2004; 4: 1958-1963）。結果的に得られた内皮におけるＴＦＰＩの活性化依存性の提示は、シクロスポリン処置したラットによるマウス心臓異種移植片の血栓症によって媒介される急性体液性拒絶反応を完全に阻害するのに十分であった。また、凝血の有効な調節は、慢性的な拒絶反応を防止することができるという示唆もあった。ヒルジン／ＣＤ４／Ｐ－セレクチン融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウス心臓で類似の結果を得たことから、トロンビンの生成または活性の阻害が、このモデルにおける保護にとって重要であることが示される。
ヒルジンは、医療用ヒル（例えばヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis））の唾液腺における天然に存在するペプチドであり、トロンビンの有力な阻害剤である。Ｄｏｒｌｉｎｇおよびその共同研究者（Chen et al., J Transplant. 2004 December; 4(12):1958-63）も、膜結合型ヒルジン融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを生成し、その心臓をラットに移植した（マウス－ラットＸｅｎｏ－Ｔｘ）。３日以内に全て拒絶された、対照非トランスジェニックマウス心臓とは対照的に、両方のトランスジェニックマウス株からの臓器の１００％が、体液性拒絶反応に対して完全に耐性であり、Ｔ細胞媒介拒絶反応をシクロスポリンＡの投与によって阻害した場合、１００日より長く生き延びた。また、Ｒｉｅｓｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（Circulation. 1998 Dec. 15; 98(24):2744-52）は、血管内の血栓症を防止するための戦略としての、哺乳類細胞におけるヒルジン融合タンパク質の発現も調査した。細胞における発現は、局所的なトロンビンレベルを低減し、フィブリン形成を阻害した。それゆえに、ヒルジンは、異種間移植に存在する血栓作用を防止するための興味深い別の抗凝血剤導入遺伝子である。
トロンボモジュリン（ＴＢＭ）は、トロンビンと１：１の化学量論的な複合体を形成することによって、抗凝血経路においてプロテインＣのトロンビンによって誘導される活性化における補因子として機能する。内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）は、プロテインＣの活性化を強化するＮ－グリコシル化Ｉ型膜タンパク質である。プロテインＣ抗凝血剤システムにおけるこれらのタンパク質の役割は、Van de Wouwer et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004 August; 24(8):1374-83によって概説されている。これらおよび他の抗凝血剤導入遺伝子の発現は、異種間移植に対する凝血の障壁に取り組む可能性がある様々なグループによって調査されている（Cowan and D’Apice, Cur Opin Organ Transplant. 2008 April; 13(2):178-83によって概説される）。Ｅｓｍｏｎおよび共同研究者（Li et al., J Thromb Haemost. 2005 July; 3(7):1351-9）は、トランスジェニックマウスの内皮でＥＰＣＲを過剰発現させ、このような発現が血栓の問題からマウスを保護したことを示した。Ｉｉｎｏ ｅｔ ａｌ．(J Thromb Haemost. 2004 May; 2(5):833-4）は、膵島移植における血栓性合併症を防止するための手段として遺伝子治療を介したエクスビボでのドナー膵島におけるＴＢＭの過剰発現を示唆した。
ＣＤ３９は、主要な血管のヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ（ＮＴＰＤアーゼ）であり、ＡＴＰおよびＡＤＰをＡＭＰに、最終的にはアデノシンに変換する。細胞外アデノシンは、血栓症および炎症において重要な役割を果たすことから、移植におけるその有益な役割に関して研究されている（Robson et al. Semin Thromb Hemost. 2005 April; 31(2):217-33によって概説される）。近年の研究によれば、ＣＤ３９が、炎症性応答を低減させることにおいて主要な作用を有することが示されている（Beldi et al., Front Biosci, 2008, 13 : 2588-2603）。ｈＣＤ３９を発現するトランスジェニックマウスは、心移植モデルにおいて、血小板凝集不全、出血時間の延長、および全身性血栓塞栓症に対する抵抗を提示した（Dwyer et al., J Clin Invest. 2004 May; 113(10): 1440-6）。それらはまた、膵島でＣＤ３９を発現することも示され、ヒト血液とインキュベートした場合、これらの膵島は、野生型膵島と比較して凝固時間を有意に遅らせた（Dwyer et al., Transplantation. 2006 Aug. 15; 82(3):428-32）。トランスジェニックブタで構成的プロモーターシステムからｈＣＤ３９を高いレベルで発現させることにおける以前の試みは、高い出生後の致死率を示した（Ｒｅｖｉｖｉｃｏｒ，Ｉｎｃ．、未発表のデータ）。しかしながら、ＣＤ３９の内皮細胞特異的な発現は、トランスジェニックブタによってよりよく許容されることが示されている。したがって、動物の健康状態を損なわずに、それでもなお臨床的な異種間移植における有用性にとって十分な発現レベルを提供する方式で、ブタにおいてある特定の抗凝血剤導入遺伝子を発現させる必要がある。
例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如（または発現の低減）、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を有するトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも２つの導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、抗凝血剤である、トランスジェニック動物を提供する。一実施形態において、抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ３９およびそれらの（thereo）組合せから選択される。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座であってもよい。ネイティブの遺伝子座は、ＧＧＴＡ１、β４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、Ｒｏｓａ２６、ＡＡＶＳ１、または組み込まれた導入遺伝子に有益な発現特徴を付与する可能性がある他の内因性遺伝子座であってもよい。少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供されてもよく、取り込みは、遺伝子編集ツールを含んでいてもよい。このような編集は、「セーフハーバー」として（ゲノム中のいかなる必須の遺伝子も中断しないように）、および／または組込み部位に特異的な所望の特徴を提供するように、のいずれかで作用する予め決定された部位（例えばランディングパッド）への標的化された挿入を含んでいてもよい。異種移植片拒絶反応を防止するのに重要な遺伝子座における挿入の場合において、多重導入遺伝子の挿入はまた、霊長類において異種反応を誘導することに関与する豚遺伝子の不活性化の結果（すなわち、アルファＧａｌ、ＧＨＲ、ＣＭＡＨ、またはβ４ＧａｌＮＴ２など（ｉＧＢ３、フォルスマン）の不活性化）をもたらすことができる。任意選択で、動物は、１つより多くの遺伝子座に、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含んでいてもよく、少なくとも４つの導入遺伝子は、１つの遺伝子座に挿入され、２つまたはそれより多くの導入遺伝子の別のセット（少なくとも２つのプロモーターの制御下で）は、第２の部位に共に組み込むことができる。代替の実施形態は、１つの遺伝子座におけるＭＣＶ挿入、および異なる遺伝子座における標的化された不活性化を提供し、このような不活性化は、遺伝子編集ツールによって促進される可能性がある。
例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如（または発現の低減）、ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つ、またはそれより多くの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を有するトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、導入遺伝子のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つは、抗凝血剤である、トランスジェニック動物を提供する。
一実施形態において、抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。少なくとも４つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供されてもよく、取り込みは、遺伝子編集ツールを含んでいてもよい。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座であってもよい。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を含んでいてもよい。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも３つの抗凝血剤を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）を提供する。ある特定の実施形態において、抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。ある特定の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤のうちの少なくとも１つは、主として内皮細胞で活性なプロモーターの発現によって制御される。ある特定の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤のうちの少なくとも２つは、主として内皮細胞で活性なプロモーターの発現によって制御される。
例示的な実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも３つの抗凝血剤を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも３つの抗凝血剤のうちの１つは、ＥＰＣＲである、トランスジェニック動物を提供する。
例示的な実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも３つの抗凝血剤を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも３つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲおよびＴＢＭを含む、トランスジェニック動物を提供する。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも４つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも４つの追加の導入遺伝子は、少なくとも１つの抗凝血剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。一実施形態において、少なくとも１つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲである。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも４つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも４つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。一実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲおよびＴＢＭを含む。別の実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩを含む。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも４つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも４つの追加の導入遺伝子は、少なくとも３つの抗凝血剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。一実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲ、ＴＢＭおよびＴＦＰＩを含む。別の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲ、ＴＢＭおよびＣＤ３９を含む。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも５つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも５つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。一実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲおよびＴＢＭを含む。別の実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩを含む。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも５つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも５つの追加の導入遺伝子は、少なくとも３つの抗凝血剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。一実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲ、ＴＢＭおよびＴＦＰＩを含む。別の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲ、ＴＢＭおよびＣＤ３９を含む。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも６つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも６つの追加の導入遺伝子は、少なくとも２つの抗凝血剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。一実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲおよびＴＢＭを含む。別の実施形態において、少なくとも２つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩを含む。任意選択で、少なくとも６つの追加の導入遺伝子は、少なくとも１つの免疫抑制剤も含む。
一実施形態において、本開示は、アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しており（または発現が低減されており）、少なくとも６つの追加の導入遺伝子を取り込み、発現するように遺伝子改変されているトランスジェニック動物（例えば、有蹄動物、豚動物）であって、少なくとも６つの追加の導入遺伝子は、少なくとも３つの抗凝血剤を含む、トランスジェニック動物を提供する。ある特定の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、組織因子経路阻害剤、ヒルジン、トロンボモジュリン、内皮細胞プロテインＣ受容体、ＣＤ３９およびそれらの組合せから選択される。一実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲ、ＴＢＭおよびＴＦＰＩを含む。別の実施形態において、少なくとも３つの抗凝血剤は、ＥＰＣＲ、ＴＢＭおよびＣＤ３９を含む。
６．細胞保護的導入遺伝子
一実施形態において、本開示は、異種間移植のための臓器、組織および細胞の供給源として使用するのに好適なトランスジェニックドナー動物であって、ドナー動物は、少なくとも１つの凍結保護導入遺伝子（「細胞保護剤」）を取り込み、発現するように遺伝子改変されている、トランスジェニックドナー動物を提供する。例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如；ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、少なくとも４つの導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、細胞保護的導入遺伝子である、トランスジェニック動物を提供する。細胞保護的導入遺伝子としては、抗アポトーシス剤、抗酸化剤および抗炎症薬が挙げられると考えられる。例としては、以下が挙げられる。
Ａ２０
Ａ２０は、抗炎症性および抗アポトーシス活性を提供する。血管が発達した移植される臓器は、抗炎症薬、抗凝血剤および／または抗アポトーシス分子によって内皮細胞活性化および細胞性の傷害から保護することができる。急性血管性拒絶反応（ＡＶＲ）をモジュレートする大きな可能性を有する遺伝子のなかでも、ヒトＡ２０遺伝子（ｈＡ２０）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ誘導性因子として最初に同定された。ヒトＡ２０は、それぞれ数々のカスパーゼ、および転写因子である核内因子－カッパＢの封鎖を介して、ＴＮＦによって媒介されるアポトーシスおよび炎症から内皮細胞を保護することによる二重の細胞保護剤機能を有する。生存可能なＡ２０トランスジェニック子豚を生産し、これらの動物において、ｈＡ２０の発現は、ｈＡ２０発現によって、ＴＮＦによって媒介されるアポトーシスから保護された、さらに、少なくとも部分的にＣＤ９５（Ｆａｓ）Ｌによって媒介される細胞死から保護された骨格筋、心臓およびＰＡＥＣに限定された。加えて、ｈＡ２０－トランスジェニック－クローニングブタからの心筋細胞は、心臓発作から部分的に保護された（Oropeza et al., Xenotransplantation. 2009 November; 16(6):522-34）。
ＨＯ－１
ＨＯは、抗炎症性、抗アポトーシス、および抗酸化活性を提供する。ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）は、ヘム異化における律速酵素であり、これはＨＳＰ３２とも名付けられており、熱ショックタンパク質のメンバーに属しており、ヘム環が切断されて、二価鉄イオン、一酸化炭素（ＣＯ）およびビリベルジンになり、これが次いでビリベルジンレダクターゼによってビリルビンに変換される。ＨＯ－１、ＨＯ－２およびＨＯ－３を含むＨＯの３つのアイソフォームがクローニングされている。ＨＯ－１の発現は高度に誘導性であり、それに対してＨＯ－２およびＨＯ－３は構成的に発現される（Maines M D et al., Annual Review of Pharmacology & Toxicology 1997; 37:517-554、およびChoi A M et al., American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 1996; 15:9-19）。ＨＯ－１－／－マウスの分析は、ＨＯ－１をコードする遺伝子が鉄のホメオスタシスを調節し、有力な抗酸化性、抗炎症性および抗アポトーシス作用を有する細胞保護剤遺伝子として作用することを示唆している（Poss K D et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997; 94:10925-10930、Poss K D et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997; 94:10919-10924、およびSoares M P et al., Nature Medicine 1998; 4:1073-1077）。類似の発見が近年、ヒトにおけるＨＯ－１欠乏の事例報告で記載された（Yachie A et al., Journal of Clinical Investigation 1999; 103:129-135）。抗炎症、抗酸化および抗アポトーシスなどのＨＯ－１の細胞保護作用に関与する分子メカニズムは、その反応生成物によって媒介される。ＨＯ－１発現は、インビトロでのおよびインビボにおいて、異なる金属とのプロトポルフィリンによってモジュレートされる場合もある。コバルトプロトポルフィリン（ＣｏＰＰ）および鉄プロトポルフィリン（ＦｅＰＰ）は、ＨＯ－１の発現を上方調節することができる。対照的に、スズプロトポルフィリン（ＳｎＰＰ）および亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）は、ＨＯ－１の活性をタンパク質レベルで阻害する。近年、ＨＯ－１の発現は、マウスからラットへの心臓移植の拒絶反応を抑制すること（Sato K et al., J. Immunol. 2001; 166:4185-4194）、膵島細胞をアポトーシスから保護すること、およびインビボにおける移植後の膵島細胞の機能を改善すること（Pileggi A et al., Diabetes 2001; 50: 1983-1991）が証明された。また、遺伝子移入によるＨＯ－１の投与は、高酸素によって誘導された肺傷害からの保護を提供し（Otterbein L E et al., J Clin Invest 1999 ; 103 : 1047-1054）、ＨＯ－１の上方調節は、肥満Ｚｕｃｋｅｒラット肝臓を虚血／再灌流傷害から遺伝学的に保護し（Amersi F et al., J Clin Invest 1999; 104: 1631-1639）、ＨＯ－１遺伝子のアブレーションまたは発現は、シスプラチンによって誘導された腎尿細管アポトーシスをモジュレートする（Shiraishi F et al., Am J Physiol Renal Physiol 2000; 278:F726-F736）ことも証明された。トランスジェニック動物モデルにおいて、ＨＯ－１の過剰発現は、低酸素に対する肺の炎症性および血管反応を防止し（Minamino T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98:8798-8803）、虚血および再灌流傷害から心臓を保護する（Yet S F, et al., Cir Res 2001; 89: 168-173）ことが示された。ＨＯ－１導入遺伝子を有するブタが生産されたが、異種間移植におけるそれらの使用に関する臨床的な作用は報告されなかった（米国特許第７，３７８，５６９号明細書）。
ＦＡＴ－１
ＦＡＴ－１は、抗炎症活性を提供する。ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、（ｎ－３クラス）炎症を阻害することにおいて役割を果たす。哺乳類細胞は、ｎ－６ ＰＵＦＡをｎ－３ ＰＵＦＡに変換するデサチュラーゼを欠いている。その結果として、必須のｎ－３脂肪酸は、食物と共に供給されなければならない。しかしながら、哺乳動物とは異なり、寄生していない線虫カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）は、ｎ－６－脂肪酸に炭化水素鎖のｎ－３位で二重結合を導入してｎ－３ ＰＵＦＡを形成するｎ－３脂肪酸デサチュラーゼを発現する。エレガンスのＦＡＴ－１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスが生成され、その結果として、食物中の６系ＰＵＦＡを、３系ＰＵＦＡ、例えばＥＰＡ（２０：５ ｎ－３）およびＤＨＡ（２２－６ ｎ－３）に効率的に変換することができる。（Kang et al., Nature. 2004 Feb. 5; 427(6974):504）。別のグループは、ｆａｔ－１ ｃＤＮＡのコドンを、哺乳類システムにおける効率的な翻訳のためにさらに最適化したトランスジェニックマウスモデルを生産した；Ｃ．エレガンスのｎ－３脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子、ｍｆａｔ－１を過剰発現することを介して、ｎ－３ ＰＵＦＡの内因性の生産が達成された。このグループは、ｍｆａｔ－１のトランスジェニック発現を介したｎ－３ ＰＵＦＡの細胞性の増加およびｎ－６ ＰＵＦＡの低減が、マウスの単離された膵島におけるグルコース、アミノ酸、およびＧＬＰ－１により刺激されるインスリン分泌を強化し、膵島をサイトカイン誘導細胞死に対して強く耐性にしたことを示した（Wei et al., Diabetes. 2010 February; 59(2):471-8）。
可溶性ＴＮＦ－アルファ受容体（ｓＴＮＦＲ１）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、カケキシン（cachexin）またはカケクチン、正式には腫瘍壊死因子－アルファとして公知）は、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激するサイトカインのグループのメンバーである。ＴＮＦの主要な役割は、免疫細胞の調節における役割である。ＴＮＦは、アポトーシス細胞死を誘導して、炎症を誘導することができる。可溶性ＴＮＦ－アルファ受容体１（ｓＴＮＦＲ１）は、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインであり、ＴＮＦ－アルファに対するアンタゴニストである（Su et al., 1998. Arthritis Rheum. 41, 139-149）。異種移植片におけるｓＴＮＦＲ１のトランスジェニック発現は、有益な抗炎症性作用を有する可能性がある。
関連する抗酸化特性を有する他の細胞保護剤としては、これらに限定されないが、ＳＯＤおよびカタラーゼ（Catalyse）が挙げられる。酸素は、全ての好気性生物にとって必須の分子であり、ＡＴＰ生成、すなわち酸化的リン酸化において優勢な役割を果たす。このプロセスの間、副産物として、スーパーオキシドアニオン（Ｏ（２）（－））および過酸化水素（Ｈ（２）Ｏ（２））を含む活性酸素種（ＲＯＳ）が生産される。ヒトにおいて、抗酸化性防御システムが、ＲＯＳ生成のバランスをとる。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼは、抗酸化特性を有する２つの酵素である。ＳＯＤは、スーパーオキシドラジカルの過酸化水素への不均化を触媒し、後者は、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼによって水に変換される。ＲＯＳの生成の結果生じる細胞傷害は、移植の環境で起こり得る。抗酸化性の防御の低減のために、膵臓のベータ細胞は、特にフリーラジカルおよび炎症性の傷害を受けやすい。一般的に使用される拒絶反応抑制薬は、適応免疫応答を阻害することにおいて優れているが、ほとんどは膵島に対して有害であり、膵島の分離および虚血再灌流傷害の結果生じる活性酸素種および炎症に対して十分保護しない。それゆえに、エクスビボにおいて抗酸化剤で膵島を処置すること、または遺伝子治療もしくはドナー組織におけるトランスジェニック発現を介して抗酸化剤遺伝子を発現させることにおける関心が集まっている。エクスビボにおけるＥＣ－ＳＯＤおよびカタラーゼの遺伝子移入は、抗原によって誘導された関節炎のラットモデルにおいて抗炎症性であった（Dai et al., Gene Ther. 2003 April; 10(7):550-8）。加えて、門脈を介したＥＣ－ＳＯＤおよび／またはカタラーゼ遺伝子の送達は、マウスモデルにおいて、肝Ｉ／Ｒ傷害を著しく減じた（He et al., Liver Transpl. 2006 December; 12(12):1869-79）。近年のマウス研究において、同系の、最適未満の同系の、または異種の移植前の触媒性の抗酸化剤で処置した膵島は、未処置対照と比較して優れた機能を提示した。この同じ研究において、触媒性の抗酸化剤で処置した同種膵島の糖尿病マウスレシピエントは、移植後に改善された血糖コントロールを提示し、同種移植片拒絶反応の遅延を実証した（Sklavos et al., Diabetes. 2010 July; 59(7):1731-8. Epub 2010 Apr. 22）。別のマウス研究において、ＭｎＳＯＤを過剰発現する膵島移植片は、対照移植片よりおよそ５０％長く機能した（Bertera et al., Diabetes. 2003 February; 52(2):387-93）。さらに、トロンボモジュリン、ＥＰＣＲおよびＣＤ３９などのある特定の抗凝血剤も抗炎症活性を提供する。
例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如；ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における少なくとも４つの導入遺伝子の取り込みおよび発現（少なくとも２つのプロモーターの制御下で）をもたらす遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、少なくとも４つの導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、細胞保護的導入遺伝子である、トランスジェニック動物を提供する。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座であってもよい。少なくとも２つの導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供されてもよく、取り込みは、遺伝子編集ツールを含んでいてもよい。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有していてもよい。
例示的な実施形態において、本開示は、（ｉ）アルファＧａｌおよび／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現の欠如；ならびに（ｉｉ）単一の遺伝子座における、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つの導入遺伝子、または１つの遺伝子座における少なくとも４つの導入遺伝子、および第２の遺伝子座における１つまたは複数の導入遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物（例えば、ブタ）であって、導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、細胞保護的導入遺伝子であり、少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下にあり、プロモーターは、構成的、偏在的、組織特異的または誘導的に調節されるプロモーターシステムの異なる組合せであってもよい、トランスジェニック動物を提供する。導入遺伝子は、ＭＣＶとして提供されてもよく、取り込みは、遺伝子編集ツールを含んでいてもよい。単一の遺伝子座は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座であってもよい。任意選択で、動物は、１つまたは複数の追加の遺伝学的改変を有していてもよい。
ＶＩ トランスジェニック動物の生産
トランスジェニック動物は、これらに限定されないが、選択的な繁殖、核移植、卵母細胞、精液、接合体、もしくは割球へのＤＮＡの導入などの当業者に公知の任意の方法によって、または胚性幹細胞の使用を介して生産できる。本明細書においてさらに説明されるように、遺伝学的編集ツールも利用することができる。
一部の実施形態において、動物において遺伝学的改変を同定して、次いでこれを一緒に交配して、所望のセットの遺伝学的改変（または単一の遺伝学的改変）を有する動物群を形成してもよい。これらの後代をさらに交配して、それらの後代において遺伝学的改変の異なるまたは同じセット（または単一の遺伝学的改変）を生じさせてもよい。この所望の遺伝学的改変を有する動物のための繁殖サイクルは、望む限り続けることができる。「獣群」は、この文脈において、長期にわたり生産された同一または異なる遺伝学的改変を有する動物の複数の世代を含む場合がある。「獣群」はまた、同一または異なる遺伝学的改変を有する動物の単回の生成を指す場合もある。
遺伝学的改変（例えば、これらに限定されないが、相同組換え、ランダム挿入／組込み、ヌクレアーゼ編集、ジンクフィンガーに加えてＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを介した）に有用な細胞としては、一例として、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、および他の筋肉細胞などが挙げられる。さらに、遺伝子改変された（例えば、これに限定されないが、核移植を介して）動物を生産するために使用される細胞は、異なる臓器、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器などから得てもよい。細胞は、全ての体細胞または生殖細胞を含む体の任意の細胞または臓器から得てもよい。
加えて、遺伝子改変され得る動物細胞は、多種多様の臓器および組織、例えば、これらに限定されないが、皮膚、間充織、肺、膵臓、心臓、腸、胃、膀胱、血管、腎臓、尿道、生殖器、および胎芽、胎児、または成体動物の全体または一部の脱凝集した調製物から得てもよい。本発明の一実施形態において、細胞は、これらに限定されないが、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞（cardiac muscle cell）、他の筋肉細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、血液細胞、血液前駆体細胞、骨細胞、骨前駆体細胞、ニューロン幹細胞、始原幹細胞、成体幹細胞、間葉幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍帯静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞（cardiac myocytes）、ニューロン、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュヴァン細胞、および上皮細胞、赤血球（erythrocytes）、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球（red blood cells）、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、棒細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、メモリー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、管周細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳房細胞、濾胞細胞、粘液細胞、線毛細胞、非角質化上皮細胞、角質化上皮細胞、肺細胞、杯状細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、および破骨細胞からなる群から選択してもよい。１つの代替の実施形態において、胚性幹細胞を使用してもよい。胚性幹細胞株が採用されてもよいし、または胚性幹細胞は、宿主、例えば豚動物から新たに得てもよい。細胞は、適切な線維芽細胞－フィーダー層上で成長させてもよいし、または白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で成長させてもよい。
胚性幹細胞は、好ましい生殖細胞型であり、胚性幹細胞株が採用されてもよいし、または胚性幹細胞は宿主、例えば豚動物から新たに得てもよい。細胞は、適切な線維芽細胞－フィーダー層上で成長させてもよいし、または白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で成長させてもよい。
特に興味深い細胞としては、他の系統のなかでも特に、幹細胞、例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞、間葉幹細胞など、ランゲルハンス島、ドーパミンを分泌することができる副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血球、例えばＢおよびＴリンパ球、骨髄単球性細胞など、ニューロン、グリア細胞、神経節細胞、網膜細胞、肝臓細胞、例えば肝細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、毛包細胞、および筋原細胞（筋肉細胞）が挙げられる。
特定の実施形態において、細胞は、線維芽細胞であってもよいし、あるいは線維芽細胞と区別できない形態もしくは表現型を有するか、または少なくとも１０日、もしくは少なくとも１２日、もしくは少なくとも１４日、もしくは少なくとも１８日、もしくは少なくとも２０日の老化前の寿命を有するか、または老化していない核の相同組換えおよび核移植を可能にするのに十分な寿命を有する線維芽細胞様細胞であってもよい；具体的な一実施形態において、細胞は、胎児線維芽細胞であってもよい。線維芽細胞は、発達中の胎児や成体動物から大量に得ることができるため、好適な体細胞型である。これらの細胞は、インビトロにおいて迅速な倍化時間で容易に増殖させることができ、遺伝子標的化手順で使用するためにクローン的に増殖させることができる。使用される細胞は、胎児動物からのものであってもよいし、または新生児細胞であってもよいし、または成体動物に由来するものであってもよい。細胞は、成熟であってもよいし、または未成熟であってもよく、分化または未分化のいずれでもよい。
１．相同組換え
相同組換えは、内因性遺伝子における部位特異的な改変を許容し、したがって新規の変更をゲノムに組み込むことができる。相同組換えにおける一次的なステップは、ＤＮＡ鎖交換であり、ＤＮＡ二重鎖と相補配列を含有する少なくとも１つのＤＮＡ鎖とが対合して、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを含有する中間組換え構造を形成することを含む（例えばRadding, C. M. (1982) Ann. Rev. Genet. 16 : 405；米国特許第４，８８８，２７４号明細書を参照）。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、単一の相補鎖がＤＮＡ二重鎖に侵入する三重鎖形態を含有する３本のＤＮＡ鎖（Hsieh et al.(1990) Genes and Development 4: 1951；Rao et al., (1991) PNAS 88:2984）などの数々の形態をとることができ、２本の相補的ＤＮＡ鎖がＤＮＡ二重鎖と対合する場合、古典的なホリデイ組換えジョイントまたはカイ構造（Holliday, R. (1964) Genet. Res. 5: 282）は、ダブル－Ｄループを形成することができる（１９９１年９月４日に出願された米国特許出願第０７／７５５，４６２号明細書「ダブルＤループ形成の診断応用（Diagnostic Applications of Double-D Loop Formation）」）。ヘテロ二重鎖構造は、一旦形成されたら、鎖の切断および交換によって分解されてもよく、それにより、侵入しているＤＮＡ鎖の全部または一部がレシピエントＤＮＡ二重鎖にスプライシングされ、レシピエントＤＮＡ二重鎖のセグメントに付加されるかまたはそれを置き換える。
代替として、ヘテロ二重鎖構造は、遺伝子変換をもたらすことができ、この場合、侵入している鎖の配列は、侵入している鎖をテンプレートとして使用したミスマッチ塩基の修復によってレシピエントのＤＮＡ二重鎖に移される（Genes, 3rd Ed. (1987) Lewin, B., John Wiley, New York, N.Y.；Lopez et al.(1987) Nucleic Acids Res. 15: 5643）。切断および再連結のメカニズムによるかまたは遺伝子変換のメカニズムによるかにかかわらず、相同的に対になったジョイントにおけるヘテロ二重鎖ＤＮＡの形成は、遺伝子配列情報を１つのＤＮＡ分子から別のものに移すのに役立つ可能性がある。遺伝子配列情報をＤＮＡ分子間で移す相同組換え（遺伝子変換および古典的な鎖切断／再連結）の能力は、遺伝子工学および遺伝子操作における標的化された相同組換えを強力な方法にしている。
相同組換えにおいて、入ってきたＤＮＡは、ゲノム中の実質的に相同なＤＮＡ配列を含有する部位と相互作用し、そこに組み込まれる。非相同の（「ランダムな」または「不正な」）組込みにおいて、入ってきたＤＮＡは、ゲノム中の相同配列に見出されないが、他の多数の可能性がある位置の１つで組み込まれる。一般的に、高等真核細胞を用いた研究から、相同組換えの頻度がランダムな組込みの頻度よりはるかに低いことが解明されている。これらの頻度の比率は、相同組換え（すなわち、外因性「標的化ＤＮＡ」とゲノム中の対応する「標的ＤＮＡ」との組換え）を介した組込みに依存する「遺伝子標的化」の直接の関与を示す。本開示は、相同組換えを使用して、遺伝子またはインサートを不活性化したり、細胞、例えば上述した細胞中で遺伝子を上方調節または活性化したりすることができる。ＤＮＡは、機能的な遺伝子産物の発現を防止するように、ネイティブの遺伝子の少なくとも１つのコピーに、任意選択で両方のコピーに変更が導入された特定の遺伝子座における遺伝子の少なくとも一部を含んでいてもよい。変更は、挿入、欠失、置き換え、突然変異またはそれらの組合せであってもよい。変更が不活性化されている遺伝子の１つのコピーのみに導入される場合、標的遺伝子の単一の突然変異していないコピーを有する細胞が増幅し、第２の標的化ステップに供することができ、この場合、変更は、第１の変更と同一でもよいし、または異なっていてもよく、通常は異なっており、欠失、または置き換えが含まれる場合、元々導入された変更の少なくとも一部とオーバーラップしていてもよい。この第２の標的化ステップにおいて、同じ相同性のアームを有するが、異なる哺乳類の選択可能なマーカーを含有する標的化ベクターを使用することができる。結果的に得られた形質転換体は、機能的な標的抗原の非存在に関してスクリーニングされ、さらに細胞のＤＮＡをスクリーニングして、野生型標的遺伝子の非存在を確認してもよい。代替として、表現型に関するホモ接合性は、突然変異に関してヘテロ接合型の宿主を繁殖させることによって達成することができる。
いくつかの論文が、哺乳類細胞における相同組換えの使用を記載している。これらの論文の実例は、Kucherlapati et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3153- 3157；Kucherlapati et al.(1985) Mol. Cell. Bio. 5:714-720；Smithies et al.(1985) Nature 317:230-234；Wake et al.(1985) Mol. Cell. Bio. 8:2080-2089；Ayares et al.(1985) Genetics 111:375-388；Ayares et al.(1986) Mol. Cell. Bio. 7:1656-1662；Song et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6820-6824；Thomas et al.(1986) Cell 44:419-428；Thomas and Capecchi, (1987) Cell 51: 503-512；Nandi et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3845-3849；およびMansour et al.(1988) Nature 336:348-352；Evans and Kaufman, (1981) Nature 294:146-154；Doetschman et al.(1987) Nature 330:576-578；Thoma and Capecchi, (1987) Cell 51:503-512；Thompson et al.(1989) Cell 56:316-321である。
一実施形態において、本開示のトランスジェニック動物に取り込まれ、発現される少なくとも４つの導入遺伝子は、相同組換えによって導入される。別の実施形態において、本開示のトランスジェニック動物に取り込まれ、発現される４つの導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、相同組換えによって導入される。
２．ランダム挿入
一実施形態において、導入遺伝子配列をコードするＤＮＡは、細胞の染色体にランダムに挿入されてもよい。ランダムな組込みは、当業者に公知の細胞にＤＮＡを導入する任意の方法の結果であってもよい。この例としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ジーンガンの使用、リポトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターの使用、ならびにグループＩＩリボザイムを挙げることができる。一実施形態において、コードするＤＮＡは、導入遺伝子またはその発現生成物の存在がレポーター遺伝子の活性化を介して検出できるように、レポーター遺伝子を含むように設計することができる。上記で開示されたものなどの当業界において公知の任意のレポーター遺伝子を使用することができる。またレポーター遺伝子が、細胞に添加される導入遺伝子の１つであってもよく、そうすることで、その導入遺伝子（例えば、ＤＡＦまたはＣＤ４６またはＥＰＣＲまたはＣＤ４７）の細胞表面発現が、導入遺伝子（および同時挿入された導入遺伝子組合せ）の遺伝子移入および部分配列発現のために富化する手段として、フローサイトメトリー（および前記導入遺伝子に特異的な蛍光（florescent）抗体）と共に使用が可能になる。細胞培養中でレポーター遺伝子が活性化された細胞を選択することによって、導入遺伝子を含有する細胞を選択することができる。他の実施形態において、導入遺伝子をコードするＤＮＡは、エレクトロポレーションを介して細胞に導入することができる。他の実施形態において、ＤＮＡは、リポフェクション、感染、または形質転換を介して細胞に導入することができる。一実施形態において、エレクトロポレーションおよび／またはリポフェクションは、線維芽細胞にトランスフェクトするのに使用することができる。特定の実施形態において、トランスフェクトされた線維芽細胞は、当業界で公知の、さらに後述されるトランスジェニック動物を生成するための核移植のための核ドナーとして使用することができる。
次いで、目的の導入遺伝子をコードするＤＮＡを含有する細胞より高いパーセンテージが得られるように、レポーター遺伝子の存在に関して染色された細胞をＦＡＣＳによってソートして、細胞集団を富化することができる。他の実施形態において、ＦＡＣＳによってソートされた細胞は次いで、例えば１２、２４、３６、４８、７２、９６時間もしくはそれより長い時間にわたり、またはＤＮＡが組み込まれて安定なトランスフェクトされた細胞集団が得られるような期間にわたり、培養することができる。
一実施形態において、本開示のトランスジェニック動物に取り込まれ、発現される少なくとも４つの導入遺伝子は、ランダムな組込みによって導入される。別の実施形態において、本開示のトランスジェニック動物に取り込まれ、発現される４つの導入遺伝子のうちの少なくとも１つは、ランダムな組込みによって導入される。例えば、少なくとも２つの導入遺伝子を含むバイシストロン性ベクターは、ランダムな組込みによってゲノムに取り込まれる。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する。一部の実施形態において、４つの導入遺伝子のうち２つは、第１のプロモーターによって制御されたポリシストロンとして発現され、４つの導入遺伝子のうち２つは、第２のプロモーターによって制御されたポリシストロンとして発現される。
一部の実施形態において、第１または第２のポリシストロンのいずれかで発現される４つの導入遺伝子のうち２つは、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＯＩ、Ａ２０、およびＣＤ４７からなる群から選択される。一部の実施形態において、導入遺伝子の少なくとも１つの対は、ＴＢＭおよびＣＤ３９；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；Ａ２０およびＣＤ４７；ＴＦＰＩおよびＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＡ２０；ＴＢＭおよびＡ２０；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；ＴＢＭおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡおよびＴＦＰＩ；ＥＰＣＲおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩ；ＴＢＭおよびＥＰＣＲ；ＣＤ４７およびＨＯ－１；ＣＤ４６およびＣＤ４７；ＣＤ４６およびＨＯ－１；ならびにＣＤ４６およびＴＢＭからなる群から選択される。
３．標的化されたゲノム編集：
例示的な実施形態において、導入遺伝子は、ゲノム編集ツールを利用して動物に取り込まれる。これらのツールとしては、これらに限定されないが、ヌクレアーゼおよび部位特異的リコンビナーゼが挙げられる。例示的な実施形態において、挿入の方法は、遺伝学的編集ツール、例えば、これらに限定されないが、インテグラーゼ（リコンビナーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＡＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼを利用するゲノム編集方法によって促進される。
導入遺伝子は、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座またはトランスジェニック遺伝子座（例えば、ランディングパッド）から選択される単一の遺伝子座に標的化され得る。ネイティブの遺伝子座は、例えば、ＧＧＴＡ１、β４ＧａｌＮＴ２、ＧＲＨ、ＣＭＡＨ、ＲＯＳＡ２６、ＡＡＶＳ１であってもよい。ネイティブの遺伝子座は、改変されていてもよく、すなわち、改変されたネイティブの遺伝子座、例えば改変された（ＧＧＴＡ１、β４ＧａｌＮＴ２、ＧＲＨ、またはＣＭＡＨ）であってもよい。
例示的な実施形態において、導入遺伝子は、ランディングパッドおよび／またはドッキング部位もしくは他の安定な発現部位に標的化され得る。一実施形態において、ランディングパッドまたはドッキングベクターは、いずれの目的の遺伝子座、例えばＧＧＴＡ１、ＧＲＨ、ＣＭＡＨ、β４Ｇａｌ、ＲＯＳＡ２６、ＡＡＶＳ１に挿入されてもよいし、または導入遺伝子は、任意の公知の「セーフハーバー」遺伝子座、もしくは有益な遺伝子発現プロファイルを提供する可能性がある任意の予め決定された遺伝子座に標的化されてもよいし、または予め決定された遺伝子座が好ましい遺伝子も不活性化することがあり得る場合、同時の挿入およびノックアウトが、移植の結果にとって有益である。別の実施形態において、遺伝子編集は、二重鎖切断を生じさせるのに利用でき、この切断が、ＤＮＡ修復機構を開始させて、小さい挿入、欠失、または核酸の置換（インデル）を生じ、標的部位における遺伝子の活性化またはノックアウトをもたらす；このような場合において、１つの予め決定された遺伝子座（例えば、ＧＧＴＡ１、ＧＲＨ、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２）におけるインデルは、別の遺伝子座における多シストロン性ベクターの遺伝子編集によって強化されたノックインと同時に、細胞または結果的に得られたクローニングされたブタにおいて生じてもよい。
特定の実施形態において、遺伝子編集は、同時に（複数のＣｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮ（またはそれらの組合せ）を使用して）豚ゲノムにおける１、２または３つの内因性遺伝子座（例えば、ＧＧＴＡ１、ＧＲＨ、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２のうち１つまたは全て）を不活性化するのに使用され、これらの遺伝子編集によって強化された改変のうち１つまたは複数はまた、このようなネイティブの、または改変されたネイティブの遺伝子座のうち１つまたは複数における、少なくとも２つのプロモーターの制御下における少なくとも４つの導入遺伝子を有する多シストロン性ベクターの標的化された挿入ももたらす。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、少なくとも４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現する。一部の実施形態において、４つの導入遺伝子のうち２つは、第１のプロモーターによって制御されたポリシストロンとして発現され、４つの導入遺伝子のうち２つは、第２のプロモーターによって制御されたポリシストロンとして発現される。
一部の実施形態において、第１または第２のポリシストロンのいずれかで発現される４つの導入遺伝子のうち２つは、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＯＩ、Ａ２０、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ４７からなる群から選択される。一部の実施形態において、導入遺伝子の少なくとも１つの対は、ＴＢＭおよびＣＤ３９；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；Ａ２０およびＣＤ４７；ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＡ２０；ＴＢＭおよびＡ２０；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；ＴＢＭおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡおよびＴＦＰＩ；ＥＰＣＲおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩ；ＴＢＭおよびＥＰＣＲ；ＣＤ４７およびＨＯ－１；ＣＤ４６およびＣＤ４７；ＣＤ４６およびＨＯ－１；ＣＤ４６およびＴＢＭ；ならびにＨＬＡ－ＥおよびＣＤ４７からなる群から選択される。
４．ジンクフィンガーヌクレアーゼ／ＴＡＬＥＮ
一実施形態において、導入遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用して取り込まれる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、非特異的なＤＮＡ切断モチーフと配列特異的なジンクフィンガータンパク質との融合体である。ヌクレアーゼ活性は、一本鎖切断を生じることが可能なＦｏｋＩ細菌性制限エンドヌクレアーゼから誘導される。ＺＦＮは、２種のＦｏｋＩ酵素を用いて２つのＤＮＡ結合ドメインを二量体化して、１８ｂｐの特異性で二本鎖切断を生じさせることによって作動する。別の実施形態において、導入遺伝子は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して取り込まれる。
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮのように機能して、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼをＤＮＡ結合ドメインに結合させることによって二本鎖切断を生じる。このプロセスにおいて、ＴＡＬＥＮ指向性変異誘発の標的化効率が報告されており、効率は７３．１％に達し、二対立遺伝子ノックアウトは２７．８％の割合であった。ＴＡＬＥＮは、その遺伝子設計の容易さ、低いコスト、およびわずかに改善された標的化頻度によってＺＦＮと区別することができる。
一実施形態において、本開示は、豚接合体へのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの直接注射を利用し、これは、内因性遺伝子または小さい挿入もしくは欠失もしくはヌクレオチド置換を導入し、所望の遺伝学的改変を有する子豚を生産することができる。
５．ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ヌクレアーゼ
別の実施形態において、導入遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ヌクレアーゼを利用して取り込まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＲＮＡガイド標的化によって外因性ＤＮＡを切断する細菌の防御機構から誘導される。細菌において、外来ＤＮＡは、消化され、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に挿入され、それからＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が作製される。次いでこれらの短いＲＮＡ配列は、ゲノム中の相同な、恐らく外来の配列と会合する。相同なゲノム配列の後に３’末端で適切な「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）が続く場合、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、二本鎖切断を生じる。ＰＡＭスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ－遺伝子座それ自体が標的化されるのを防ぐのに役立つ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、細菌以外でも有用であることが証明されており、２０１３年に、最初に豚ゲノムからのアルファＧａｌを除去するのに使用した。加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、豚成長ホルモン受容体を除去した（Yu et al., J Transl. Med. (2018)）。最も一般的に使用されるシステムは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）が起源であり、ＮＧＧの３’ＰＡＭ配列を有し、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドを表す。このシステムは、ＧＮ１９ＮＧＧからなる任意の豚ゲノム配列における突然変異事象の発生を可能にする。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはまた、ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）の存在によって開始される天然に存在する核酸修復システムである相同組換え修復（ＨＤＲ）と共に使用することができる（Liang et al. 1998）。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的化された二本鎖切断を生じるのに使用でき、それは、ＨＤＲゲノム操作技術の特異性を制御するのに使用でき（Findlay et al. 2014；Mali et al. February 2014；Ran et al. 2013）、さらに、哺乳動物やヒトを含む多くの生物においてゲノムを改変するのに有用であり得る（Sander and Joung, 2014）。
ＤＮＡの特異的な部位をＲＮＡガイド切断し、二本鎖切断を生じた後、目的のＤＮＡ断片またはＤＮＡ構築物を挿入してもよい。このドナーテンプレート、断片または構築物は、切断されたＤＮＡの平滑末端に相同なＤＮＡのセグメントが隣接する所望の挿入または改変を有する。したがって、所望の遺伝物質を挿入するのに、天然の細胞のＤＮＡ修復メカニズムを使用してもよく、高度に標的化された二本鎖切断を生じさせることが公知の任意のゲノム編集技術と組み合わせて相同性駆動組換えを利用することによって、高い精度で標的細胞のゲノムを編集することができる。この方法で行われたゲノム改変は、ＤＮＡの挿入として記載される「強化された相同性によって駆動する挿入またはノックイン」と称される新規の遺伝子の挿入、および既存の遺伝子の同時ノックアウトに使用することができる（Mali et al. Feb 2013）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、以前の部位特異的なヌクレアーゼを超える数々の利点を提供する。第一に、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、最初のＤＮＡ切断の非結合方法（ｕｎｔｅｔｈｅｒｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）である。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは複数のガイドＲＮＡと自由に会合し、それによって単一のトランスフェクション内で数々の遺伝子座の同時の標的化を可能にする。これは、単一の細胞での複数の遺伝学的ノックアウトの効率的な組合せを可能にしている。２０１３年に、単一の反応で、ＧＧＴＡ１、ＧＨＲ、ＧＧＴＡ１／ｉＧｂ３Ｓ、ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ、およびＧＧＴＡ１／ｉＧｂ３Ｓ／ＣＭＡＨホモ接合型ノックアウト細胞の作製が達成された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ゼブラフィッシュ、サル、マウス、ラット、およびブタを含む様々な脊椎動物でトランスジェニック動物を生成するのにうまく使用されてきたWithworth et al., Biol. Reprod. 91(3):78, pp. 1-13 (2014)およびLi et al., Xenotransplantation 22(1), pp. 20-31 (2015)を参照されたい。
達成された所望の突然変異の標的化効率、またはパーセンテージは、それによりゲノム編集ツールを評価するための最も重要なパラメーターの１つである。Ｃａｓ９の標的化効率は、ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮなどのより確立された方法に引けを取らない。例えば、ヒト細胞において、カスタム設計されたＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、１％～５０％の範囲の効率しか達成できなかった。対照的に、Ｃａｓ９システムは、ゼブラフィッシュおよび植物では最大＞７０％の効率を有し、誘導多能性幹細胞では２～５％の範囲であったことが報告されている。
一実施形態において、本開示は、「インビトロ」で得られた接合体への目的の標的遺伝子（例えば、ＧＧＴＡ１、ＧＨＲ、ＣＭＡＨ、およびβ４ＧａｌＮＴ２）に対して具体的に設計されたＣＲＩＳＰＲのマイクロインジェクションによってトランスジェニックブタ（例えば、有蹄動物、豚動物）を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用することができる。別の実施形態において、本開示は、目的の標的遺伝子に対して具体的に設計されたＣＲＩＳＰＲでの体細胞のドナー細胞の改変、それに続いてＳＣＮＴによって、トランスジェニックブタ（例えば、有蹄動物、豚動物）を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用することができる。別の実施形態において、本開示は、既存の遺伝学的改変の特異的な領域／配列を標的化することによってトランスジェニックブタ（例えば、有蹄動物、豚動物）を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用することができる。より具体的な実施形態、ネオマイシン遺伝子配列の配列を標的化すること。
別の実施形態において、本開示は、既存の遺伝学的改変の特異的な領域／配列を標的化することによってトランスジェニックブタ（例えば、有蹄動物、豚動物）を生成するために、ゲノム編集システム、例えばＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用することができる。より具体的な実施形態、ネイティブの遺伝子座、改変されたネイティブの遺伝子座、またはトランスジェニック遺伝子座（例えば、ランディングパッド）であってもよい単一の遺伝子座を標的化すること。
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、相同性駆動組換えを利用した二本鎖切断に相同なＤＮＡのアームまたはセグメントが隣接する大きいＤＮＡ断片または構築物の挿入を介して、既存の遺伝学的改変の特異的な領域／配列を標的化することによって、トランスジェニックブタ（例えば、有蹄動物、豚動物）を生成するために、使用することができる。
６．部位特異的リコンビナーゼ
例示的な実施形態において、導入遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼを利用して取り込まれる。特異的なリコンビナーゼ技術は、細胞のＤＮＡ中の特異的な部位における欠失、挿入、転移および転位を行うために広く使用される。ＤＮＡ改変を、特異的な細胞型に標的化したり、または特異的な外部の刺激によって開始させたりすることが可能になる。これは、真核生物および原核生物のシステムの両方で実行される。遺伝子工学戦略のために効率的に働く数々の組換えシステムがあり、Ｆｌｐ－ＦＲＴおよびＣｒｅ－ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムは可逆的であり、したがって、部位特異的な組込みと切り出しの両方を容易にする。インテグラーゼは、ＤＮＡの正確な組込み、切り出しおよび／または転位をもたらす高度に部位特異的な組換え反応を触媒するゲノム組込みプロセスを媒介する。セリン（ФＣ３１、Ｂｘｂ１、Ｒ４）およびチロシンインテグラーゼ（Λ、Ｐ２２、ＨＰ１）は、現在ゲノム工学に適用されるインテグラーゼの２つの主要なファミリーである。広義には、部位特異的な組換えのプロセスは、リコンビナーゼをリコンビナーゼ基質に結合させて、タンパク質－タンパク質相互作用を介してそれらを近接させることを含む。プロセス中、基質は切断され、ＤＮＡ末端は、ＤＮＡ主鎖の再連結が組換え生成物を生じるように鎖交換反応で再編成される。ほとんどの場合、セリンインテグラーゼは、単純なａｔｔ部位を使用して、高度に効率的な不可逆的な組換えを触媒する。
高効率の部位特異的リコンビナーゼを利用するために、ドッキング部位またはランディングパッドは、リコンビナーゼ基質結合部位のための付着部位、例えばａｔｔ部位を含むか；または組換えシステム、例えばＦｌｐ－ＦＲＴおよびＣｒｅ－ｌｏｘＰが、細胞株および／もしくは動物株（anima line）の所望の遺伝子座に導入されていてもよい。このドッキングベクターの標的ゲノムへの挿入は、ランダムに、または相同組換えを介してのいずれかである。これは、連続したラウンドのプラスミド組込みを可能にし、この場合、プラスミドまたはベクターは、異なる導入遺伝子および／または追加のＤＮＡ配列を含有していてもよい。その代わりに、組換えシステム、例えばＦｌｐ／ＦＲＴを使用して、不要なベクターおよびマーカー配列を除去することができる。
７．トランスジェニック動物を生産するためのベクター
核酸標的化ベクター構築物は、細胞において相同組換えが達成されるように設計することができる。一実施形態において、標的化ベクターは、プロモータートラップを使用して設計され、その場合、標的化された遺伝子座における組込みは、導入遺伝子の挿入されたオープンリーディングフレームが、挿入された遺伝子（または挿入された選択可能なマーカー；例えば、ＮｅｏもしくはＰｕｒｏ）の発現を駆動させるために内因性またはネイティブのプロモーターを利用することを可能にする。特定の実施形態において、標的化ベクターは、「ポリ（Ａ）トラップ」を使用して設計される。プロモータートラップとは異なり、ポリ（Ａ）トラップベクターは、標的細胞（すなわち、線維芽細胞またはＥＳ細胞）で発現されないものも含めてより広い範囲の遺伝子を捕捉する。ポリＡトラップベクターは、ポリＡシグナルが欠如した選択可能なマーカー遺伝子の発現を駆動させる構成的プロモーターを含む。ポリＡシグナルの置き換えは、下流のエクソンにスプライシングされるように設計されたスプライスドナー部位である。この戦略において、選択可能なマーカー遺伝子のｍＲＮＡは、標的細胞におけるその発現ステータスに関係なく、内因性遺伝子のポリＡシグナルがトラップされたときに安定化され得る。一実施形態において、ポリアデニル化のためのシグナルが欠乏した選択可能なマーカーを含む標的化ベクターが構築される。これらの標的化ベクターは、これらに限定されないが、トランスフェクション、形質転換、ウイルス媒介形質導入、またはウイルスベクターでの感染を含む任意の好適な方法によって哺乳類細胞に導入することができる。
一実施形態において、標的化ベクターは、目的のゲノム配列に相同な３’組換えアームおよび５’組換えアーム（すなわち隣接配列）を含有していてもよい。３’および５’組換えアームは、それらがゲノム配列の少なくとも１つの機能的な領域の３’および５’末端に隣接するように設計することができる。機能的な領域の標的化は、それを不活性にすることができ、それにより、細胞が機能性タンパク質を生産できなくなる。別の実施形態において、相同なＤＮＡ配列は、１つまたは複数のイントロンおよび／またはエクソン配列を含んでいてもよい。核酸配列に加えて、発現ベクターは、選択可能なマーカー配列、例えば、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子配列、開始および／もしくはエンハンサー配列、ポリＡ－テール配列、ならびに／または原核および／もしくは真核宿主細胞における構築物の発現をもたらす核酸配列などを含有していてもよい。選択可能なマーカーは、５’および３’組換えアーム配列間に配置されていてもよい。細胞の標的化された遺伝子座の改変は、細胞にＤＮＡを導入することによって生産することができ、この場合、ＤＮＡは、標的遺伝子座に相同性を有し、組み込まれた構築物を含む細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含む。標的ベクター中の相同なＤＮＡは、標的遺伝子座において染色体ＤＮＡと組換えられることになる。マーカー遺伝子は、両方の側において、相同なＤＮＡ配列、３’組換えアームおよび５’組換えアームが隣接していてもよい。標的化ベクターの構築のための方法が当業界において記載されており、例えば、Dai et al., Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002；国際公開第００／５１４２４号パンフレットを参照されたい。このような例において、選択可能なマーカー遺伝子は、プロモーターがないネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（phosphtransferase）（Ｎｅｏ）遺伝子であってもよく、これは、標的化された挿入およびＮｅｏの発現（内因性豚アルファＧａｌ遺伝子プロモーター、または内因性豚ＧＨＲプロモーターをトラップし、それを利用することによって）だけでなく、前記標的化された挿入からの標的遺伝子座（例えば、ＧＧＴＡ１またはＧＨＲ）の機能的な不活性化およびＧＧＴＡ１触媒ドメインまたはＧＨＲの中断ももたらす。
様々な酵素が、宿主ゲノムへの外来ＤＮＡの挿入を触媒できる。ウイルスのインテグラーゼ、トランスポゼースおよび部位特異的リコンビナーゼは、宿主ゲノムへのウイルスゲノム、トランスポゾンまたはバクテリオファージの組込みを媒介する。これらの特性を有する酵素の大規模な集合体は、様々な供給源から得ることができる。レトロウイルスは、それらのゲノムの相対的な簡素さ、それらの使いやすさおよび宿主細胞ゲノムに組み込まれる能力、形質導入された細胞またはその後代における長期の導入遺伝子発現を可能にすることなどの数々の有用な特徴を兼ね備える。それゆえに、レトロウイルスは、多数の遺伝子治療プロトコールで使用されてきた。哺乳類細胞でアデノウイルス、単純疱疹ウイルスまたはヒトサイトメガロウイルスなどのヘルパーウイルスと共に同時複製される小さいＤＮＡウイルス（パルボウイルス）であるアデノ随伴ウイルスと同様に、レンチウイルスベクターに基づくベクターは、遺伝子治療とトランスジェニック用途の両方にとって魅力的な候補であり続けている。ウイルスゲノムは、２つのみのＯＲＦ（ｒｅｐ、非構造タンパク質、およびｃａｐ、構造タンパク質）から本質的になり、それからオルタナティブスプライシングおよび代替プロモーターの使用によって（少なくとも）７つの異なるポリペプチドが得られる。ヘルパーウイルスの存在下で、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶゲノムの複製を媒介する。組込み、したがって潜在性ウイルス感染は、ヘルパーウイルスの非存在下で起こる。トランスポゾンもまた興味深い。これらは、様々な生物で見出すことができる可動性ＤＮＡのセグメントである。多くの原核生物システムや昆虫で活性なトランスポゾンが見出されるが、脊椎動物では機能的な天然トランスポゾンは存在しない。ゲノム工学ツールとして、ショウジョウバエのＰエレメントトランスポゾンが長年にわたり使用されてきた。スリーピングビューティートランスポゾンは、サケ科の魚で見出される非機能性トランスポゾンコピーから確立され、哺乳類細胞において、原核生物または昆虫トランスポゾンより有意に高い活性を有する。部位特異的リコンビナーゼは、限定された配列相同性の程度しか有さないＤＮＡセグメント間のＤＮＡ鎖交換を触媒する酵素である。それらは、３０～２００ヌクレオチドの長さの認識配列に結合し、ＤＮＡ主鎖を切断し、関与する２つのＤＮＡダブルヘリックスを交換し、ＤＮＡを再びライゲートする。一部の部位特異的な組換えシステムにおいて、単一のポリペプチドは、これらの反応の全てを実行するのに十分であり、それに対して他のリコンビナーゼは、これらのタスクを成し遂げるのに様々な数のアクセサリータンパク質を必要とする。部位特異的リコンビナーゼは、別個の生化学的特性を有する２つのタンパク質ファミリー、すなわちチロシンリコンビナーゼ（ＤＮＡがチロシン残基に共有結合される）およびセリンリコンビナーゼ（共有結合がセリン残基で起こる）に分けることができる。ゲノム改変アプローチに使用される最も一般的な酵素は、Ｃｒｅ（大腸菌（E.coli）バクテリオファージＰ１から得られたチロシンリコンビナーゼ）およびｐｈｉＣ３１インテグラーゼ（ストレプトマイセスファージｐｈｉＣ３１から得られたセリンリコンビナーゼ）である。
数々の他のバクテリオファージ由来の部位特異的リコンビナーゼ（Ｆｌｐ、ラムダインテグラーゼ、バクテリオファージＨＫ０２２リコンビナーゼ、バクテリオファージＲ４インテグラーゼおよびファージＴＰ９０１－１インテグラーゼ、ならびにｂｘｂ１インテグラーゼを含む）は、哺乳類ゲノムへの安定な遺伝子挿入を媒介するのにうまく使用されてきた。近年、ストレプトマイセスバクテリオファージから部位特異的リコンビナーゼが精製された。ｐｈｉＣ３１リコンビナーゼは、レゾルバーゼファミリーのメンバーである、ファージ組込みを媒介する。このプロセスにおいて、バクテリオファージａｔｔＰ部位は、細菌ゲノム中の対応するａｔｔＢ部位と組み換えられる。交差により２つの部位、ａｔｔＬおよびａｔｔＲが生成し、これはもはや、アクセサリータンパク質の非存在下におけるリコンビナーゼ作用のための標的ではなくなる。この反応は哺乳類細胞でも起こり、それゆえに、治療用遺伝子の部位特異的な組込みを媒介するのに使用することができる。触媒ドメインとＤＮＡ認識ドメインとは密接に織り交ざっているため、チロシン－リコンビナーゼの部位特異性は、直接のタンパク質工学によって改変することが難しかった。それゆえに、特異性の変化は、活性の喪失を伴うことが多い。セリンリコンビナーゼは、より操作に適している可能性があり、Ｔｎ３レゾルバーゼの高活性誘導体は、天然ＤＢＤの、ヒトジンクフィンガー転写因子Ｚｉｆ２６８のジンクフィンガードメインでの交換によって改変された。得られたキメラタンパク質はＺ－レゾルバーゼと呼ばれ、そのＤＮＡ部位特異性は、Ｚｉｆ２６８のＤＮＡ部位特異性にスイッチしていた。ジンクフィンガータンパク質は、いずれかのＤＮＡ配列を認識するようにインビトロにおけるタンパク質進化によって改変されてもよく、それゆえに、このアプローチは、治療用遺伝子を正確なゲノム位置に組み込むことができるキメラリコンビナーゼの開発を可能にする。組換えを強化または媒介するための方法としては、部位特異的な組換えおよび相同組換えの組合せ、ＡＡＶベクター媒介、ならびにジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組換えが挙げられる（参考：Geurts et. al., Science, 325: 433, 2009）。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、挿入された核酸に有用な生物学的または生化学的特性を提供する核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を指す。本発明による「発現ベクター」は、細胞へのベクターの形質転換のときにベクターに挿入またはクローニングされた１つまたは複数の分子の発現を強化することが可能なベクターを含む。このような発現ベクターの例は、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、および複製が可能な、またはインビトロもしくは細胞中で複製できる、または動物の細胞内の所望の位置に所望の核酸セグメントを運搬することができる他の配列を含む。本開示において有用な発現ベクターとしては、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドもしくはバクテリオファージから得られたベクター、ならびにそれらの組合せから得られたベクター、例えば、コスミドおよびファージミド、またはウイルスベースのベクター、例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスが挙げられる。ベクターは、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有していてもよく、このような認識部位は、ベクターの必須の生物学的機能を損なうことなく配列を決定可能な様式で切断できるものであり、さらに、その複製およびクローニングを実行するために核酸断片をスプライシングできるものである。
ベクターはさらに、プライマー部位、例えばＰＣＲのためのプライマー部位、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択可能なマーカーなどを提供することができる。明らかに、相同組換えの使用、転位または制限酵素を必要としない所望の核酸断片を挿入する方法（例えば、これらに限定されないが、ＰＣＲ断片のＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号明細書）、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ．ＲＴ－ＰＣＲ、クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．））も、本開示に従って使用しようとするベクターに核酸をクローニングするために適用することができる。
標的化された遺伝子座においてホモ接合型の細胞は、細胞にＤＮＡを導入することによって生産でき、この場合、ＤＮＡは、標的遺伝子座に対して相同性を有し、組み込まれた構築物を含む細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含む。標的ベクター中の相同なＤＮＡは、標的遺伝子座で染色体ＤＮＡと組換えられることになる。マーカー遺伝子は、両方の側に相同なＤＮＡ配列、３’組換えアームおよび５’組換えアームが隣接していてもよい。標的化ベクターの構築のための方法が当業界において記載されており、例えば、Dai et al.(2002) Nature Biotechnology 20: 251-255；国際公開第００／５１４２４号パンフレット、図６；およびGene Targeting: A Practical Approach. Joyner, A. Oxford University Press, USA; 2.sup.nd ed. Feb. 15, 2000を参照されたい。標的遺伝子座における相同組換えのための様々な構築物を調製することができる。一般的に、構築物は、標的遺伝子座と相同な、少なくとも２５ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、ｌｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、または５０ｋｂｐの配列を含んでいてもよい。
標的ＤＮＡ配列の相同性の程度の決定には、例えば、標的遺伝子座のサイズ、配列の利用可能性、標的遺伝子座における二重の交差現象の相対的な効率、および標的配列の他の配列との類似性などの様々な考察が含まれる場合がある。標的化ＤＮＡは、実質的に同質遺伝子型のＤＮＡが、改変しようとするゲノム中の対応する標的配列を含む所望の配列改変に隣接する配列を含み得る。実質的に同質遺伝子型の配列は、対応する標的配列（ただし所望の配列改変を除く）に、少なくとも約９５％、９７～９８％、９９．０～９９．５％、９９．６～９９．９％、または１００％同一であってもよい。標的化ＤＮＡおよび標的ＤＮＡは、好ましくは、１００％同一な、少なくとも約７５、１５０または５００塩基対のＤＮＡのストレッチを有していてもよい。したがって、標的化ＤＮＡは、標的化される細胞株と密接に関連する細胞から得てもよいし；または標的化ＤＮＡは、標的化される細胞と同じ細胞株もしくは動物の細胞から得てもよい。
好適な選択可能なマーカー遺伝子としては、これらに限定されないが、ある特定の培地基質上で成長する能力を付与する遺伝子、例えばｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）またはｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）上で成長する能力を付与する遺伝子；細菌のｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸、アデニン、およびキサンチン）上での成長を可能にする遺伝子が挙げられる。Song et al.(1987) Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 84:6820-6824を参照されたい。Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., see chapter 16も参照されたい。選択可能なマーカーの他の例としては、抗生物質などの化合物に対する抵抗を付与する遺伝子、選択された基質で成長する能力を付与する遺伝子、発光などの検出可能なシグナルを生じるタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子が挙げられる。様々なこのようなマーカーが公知であり、利用可能であり、その例としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン抵抗性遺伝子（ｎｅｏ）（Southern, P., and P. Berg, (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341）；およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ｈｙｇ）（Nucleic Acids Research 11:6895-6911 (1983)、およびTe Riele et al.(1990) Nature 348:649-651）が挙げられる。
本開示の方法において有用な追加のレポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（glucoronidase）（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、ブラスチシジン、ゼオシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する抵抗を付与する複数の選択可能なマーカーが利用可能である。レポーター遺伝子の抑制を決定するための方法は当業界において周知であり、その例としては、これらに限定されないが、蛍光による方法（例えば蛍光分光法、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡法）、抗生物質耐性決定が挙げられる。
選択可能なマーカーの組合せも使用することができる。マーカーの組合せを使用するために、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、それが標的化するＤＮＡの外側になるようにクローニングすることができる（必要に応じて、別の選択可能なマーカーを逆の端部に設置してもよい）。標的化しようとする細胞にＤＮＡ構築物を導入した後、適切な抗生物質で細胞を選択することができる。陰性選択のために選択可能なマーカーも使用することができる。陰性選択マーカー（markets）は、一般的に、それが発現される細胞を殺滅するが、これは、発現それ自体が毒性であるか、または単純疱疹ウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）もしくはジフテリア毒素Ａなどの毒性代謝産物を生じさせる触媒を生産するかのいずれかのためである。
一般的に、陰性選択マーカーは、正確な組換え事象後にそれが失われるように標的化ベクターに取り込まれる。同様に、ＧＦＰなどの従来の選択可能なマーカーは、例えば、細胞表面上で有意なレベルで発現される場合、選択された導入遺伝子の挿入をソートするＦＡＣＳを使用する陰性選択のために使用することができ、機能の獲得または喪失に関する「選択可能なマーカー」として役立つ可能性がある。選択ツールとしての挿入または標的化された導入遺伝子の使用は、添加される蛍光（florescent）マーカー（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ）、または抗生物質選択遺伝子の使用なしで陽性選択を可能にする。ある特定の場合において、導入遺伝子の標的化された挿入は、機能の喪失をモニターまたは選択できるように、標的遺伝子座を不活性化することができる。例えば、ＧＧＴＡ１遺伝子座の不活性化は、標的化された細胞のレクチン（ＩＢ４）への結合を排除するかもしくは低減させると予想され、またはＢ４ＧａｌＮＴ２の不活性化は、ＤＢＡレクチンによって標的化された細胞の結合を排除するかもしくは低減させると予想され、それぞれの場合において、標的化された組込みは、このようなレクチン結合を欠如している細胞に関してソートしてもよいし、またはそれを富化してもよい。
欠失は、少なくとも約５０ｂｐ、より一般的には少なくとも１００ｂｐ、一般的には約２０ｋｂｐ以下であってもよく、欠失は、通常、１つもしくは複数のエクソンの一部、１つもしくは複数のイントロンの一部を含むコード領域の少なくとも一部を含んでいてもよく、隣接する非コード領域、特に５－非コード領域（転写調節領域）の一部を含んでいてもよいし、あるいは含んでいなくてもよい。したがって、相同領域は、コード領域を超えて、５’－非コード領域または代替として３－非コード領域に及んでいてもよい。挿入は、一般的に、１０ｋｂｐを超えていてもよく、通常、５ｋｂｐを超えず、一般的には、少なくとも５０ｂｐ、より一般的には少なくとも２００ｂｐである。
相同性を有する領域は、突然変異を含んでいてもよく、その場合、突然変異はさらに、フレームシフトの提供もしくは主要なアミノ酸の変更において標的遺伝子を不活性化してもよいし、または突然変異は、機能不全性の対立遺伝子などを修正してもよい。通常、突然変異は、相同な隣接配列の約５％を超えない軽微な変化であってもよいし、またはエクソンの活性部位における点突然変異などの単一のヌクレオチド変化であってもよい。遺伝子の突然変異が望ましい場合、マーカー遺伝子は、転写のときに標的遺伝子から切り出せるように、イントロンに挿入されてもよい。
標的ＤＮＡ配列の相同性の程度の決定には、例えば、標的遺伝子座のサイズ、配列の利用可能性、標的遺伝子座における二重の交差現象の相対的な効率、および標的配列の他の配列との類似性などの様々な考察が含まれる場合がある。標的化ＤＮＡは、実質的に同質遺伝子型のＤＮＡが、改変しようとするゲノム中の対応する標的配列を含む所望の配列改変に隣接する配列を含み得る。実質的に同質遺伝子型の配列は、対応する標的配列（ただし所望の配列改変を除く）に、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または９５～１００％、９７～９８％、９９．０～９９．５％、９９．６～９９．９％、もしくは１００％同一であってもよい。特定の実施形態において、標的化ＤＮＡおよび標的ＤＮＡは、１００％同一な、少なくとも約７５、１５０または５００塩基対のＤＮＡのストレッチを有していてもよい。したがって、標的化ＤＮＡは、標的化される細胞株と密接に関連する細胞から得てもよいし；または標的化ＤＮＡは、標的化される細胞と同じ細胞株もしくは動物の細胞から得てもよい。構築物は、当業界において公知の方法に従って調製することができ、様々な断片は、一緒に適切なベクターに導入し、クローニングし、分析し、次いで所望の構築物が達成されるまでさらに操作されてもよい。制限分析、切り出し、プローブの同定などを可能にするために様々な改変を配列になすことができる。要求に応じて、サイレント突然変異を導入してもよい。様々な段階で、制限分析、シーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応での増幅、プライマー修復、インビトロでの変異誘発などを採用してもよい。
構築物は、原核生物複製システム、例えば大腸菌（E.coli）によって認識可能なオリジンを含む細菌ベクターを使用して調製することができ、各段階で、構築物をクローニングおよび分析してもよい。マーカーを採用してもよく、これは、挿入のために使用されるマーカーと同じかまたは異なり、標的細胞に導入する前に除去することができる。構築物を含有するベクターが完成したら、例えば細菌の配列の欠失、線形化、相同配列における短い欠失の導入によってそれをさらに操作してもよい。最終的な操作の後、構築物を細胞に導入することができる。
ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を宿主細胞に侵入させるのに使用することができる技術としては、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、ＤＮＡの核へのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細菌プロトプラストと無傷細胞との融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染、粒子衝撃、または当業者に公知の他の任意の技術が挙げられる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、単鎖または二本鎖、直鎖状または環状、弛緩型またはスーパーコイルＤＮＡであってもよい。哺乳類細胞にトランスフェクトするための様々な技術に関して、例えば、Keown et al., Methods in Enzymology Vol. 185, pp. 527-537 (1990)を参照されたい。
一例として以下のベクターが提供される。細菌性：ｐＢｓ、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４Ｏ、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）。また他の任意のプラスミドおよびベクターも、それらが宿主中で複製可能および生存可能である限り、使用することができる。当業界において公知のベクターおよび商業的に入手可能なもの（およびそれらのバリアントまたは誘導体）は、本発明の方法における使用のための１つまたは複数の組換え部位を含むように、本発明に従って操作することができる。
このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから得てもよい。目的の他のベクターとしては、真核生物発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ－Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ－Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、およびｐＫＫ２３２－８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）、およびｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃｌｌｌ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３ ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が挙げられる。
他のベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ’ｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ’ｓ（細菌人工染色体）、Ｐ１（大腸菌（Escherichia coli）ファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ－５、ｐＥＴ－９、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０およびｐＳＹ－－ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにそれらのバリアントまたは誘導体が挙げられる。例えばレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターも使用することができる（例えば、国際公開第０３／０５９９２３号パンフレット；Tiscornia et al. PNAS 100 : 1844-1848 (2003)を参照）。
目的の追加のベクターとしては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（－）／Ｍｙｃ－Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１Ｓ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ－２．１、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１－Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ；Ｐｈａｒｍａｃｉａからの、λＥｘＣｅｌｌ、λｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＧＥＸ－１λＴ、ｐＧＥＸ－２Ｔ、ｐＧＥＸ－２ＴＫ、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＧＥＸ－４Ｔ－２、ｐＧＥＸ－４Ｔ－３、ｐＧＥＸ－３Ｘ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－５Ｘ－２、ｐＧＥＸ－５Ｘ－３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２－８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ；Ｎｏｖａｇｅｎからの、ｐＳＣＲＥＥＮ－１ｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－２、ｐＣＩＴＥ－４－ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ－２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ－３２Ｌ１Ｃ、ｐＥＴ－３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ－２ｃｐＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ－２ｃｐＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－２ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ－２、λＳＣＲＥＥＮ－１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ－３ａｂｃｄ、ｐＥＴ－７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＥＴ－１６ｂ、ｐＥＴ－１７ｂ－ｐＥＴ－１７ｘｂ、ｐＥＴ－１９ｂ、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ－２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ－３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ－１、ｐＢＡＣｇｕｓ－１、ｐＢＡＣ４ｘ－１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ－１、ｐＢＡＣ－３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ－２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ－１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ－Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ－Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ－Ｇｐｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの、ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２－１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ ＧＬ、ｐＧＡＤ ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ－１、ｐＥＧＦＰ－－Ｎ、ｐＥＧＦＰ－Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ－ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２－Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２－Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２－プロモーター、ｐＳＥＡＰ２－エンハンサー、ｐβｇａｌ－Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ－対照、ｐβｇａｌ－プロモーター、ｐβｇａｌ－エンハンサー、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ－Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ－Ｏｎ、ｐＴＫ－Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ－ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ－ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ－１／２／３、ｐＹＥＸ－Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ－Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐ１Ｅｘ、２．ｌａｍｄａ．ｇｔ１０、．ｌａｍｄａ．ｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびλＴｒｉｐ１Ｅｘ；４１６Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅからの、ラムダＺＡＰＩＩ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋／－、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／－、ｐＡＤ－ＧＡＬ４、ｐＢＤ－ＧＡＬ４ Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、ラムダＦＩＸ ＩＩ、ラムダＤＡＳＨ、ラムダＥＭＢＬ３、ラムダＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｇｔ Ａｍｐ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／－、ｐＢＣ ＫＳ＋／－、ｐＢＣ ＳＫ＋／－、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＣＡＬ－ｎ、ｐＣＡＬ－ｃ、ｐＣＡＬ－ｋｃ、ｐＥＴ－３ａｂｃｄ、ｐＥＴ－１１ａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３ ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏポリＡ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳが挙げられる。
追加のベクターとしては、例えば、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１－３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２－１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ－ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ－ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ－１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４－５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐおよびそれらのバリアントまたは誘導体が挙げられる。
例示的な実施形態において、ベクターは、バイシストロン性ベクターである。バイシストロン性ベクターは、プロモーターおよび２つの導入遺伝子を含む。特定の実施形態において、バイシストロン性ベクターは、プロモーターおよび２Ａ配列によって連結された２つの導入遺伝子を含む。この実施形態は、単一のプロモーターからの複数の機能的な導入遺伝子の共発現を可能にする。より具体的には、この実施形態は、短い（１８～２４ａａ）切断ペプチドである「２Ａ」を利用し、これは、連結されたオープンリーディングフレームを共発現させて、単一の転写２Ａベクターシステムから機能的な導入遺伝子を発現させるものである。
例示的な実施形態において、ベクターは、多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）である。一実施形態において、ＭＣＶは、プロモーターおよび少なくとも４つの導入遺伝子を含む。特定の実施形態において、ＭＣＶは、少なくとも２つのプロモーターの制御下に、２Ａペプチド配列によって連結された４つの導入遺伝子を含む。この実施形態は、単一の転写物からの複数の機能的な導入遺伝子の共発現を可能にする。より具体的には、この実施形態は、短い（１８～２４ａａ）切断ペプチドの「２Ａ」を利用し、これは、連結されたオープンリーディングフレームを共発現させて、単一の転写２Ａベクターシステムから機能的な導入遺伝子を発現させるものである。
例示的な実施形態において、ベクターは、少なくとも２つのバイシストロン性単位を含む２Ａ－ペプチドＭＣＶベクターであり、各バイシストロン性単位は、２つの導入遺伝子を含有する。特定の実施形態において、１つのバイシストロン性単位は、構成的または偏在的なプロモーター（例えばＣＡＧ）によって制御され、第２のバイシストロン性単位は、内皮もしくは他の組織特異的な、または誘導性プロモーターシステムによって制御される。ある特定の実施形態において、少なくとも４つの導入遺伝子のみが単一の遺伝子座に挿入されるが、その場合、それぞれが、それ自体のプロモーター、または単一の遺伝子座の挿入当たり合計で少なくとも２つのプロモーターによって制御される。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、４つの導入遺伝子を取り込んでおり、それらを発現し、４つの導入遺伝子のうち２つは、第１のプロモーターによって制御されたポリシストロン（バイシストロン性単位）として発現され、４つの導入遺伝子のうち２つは、第２のプロモーターによって制御されたポリシストロン（バイシストロン性単位）として発現される。
一部の実施形態において、第１または第２のポリシストロンのいずれかで発現される４つの導入遺伝子のうち２つ（バイシストロン性単位）は、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＯＩ、Ａ２０、およびＣＤ４７からなる群から選択される。一部の実施形態において、ポリシストロン（バイシストロン性単位）における導入遺伝子の少なくとも１つの対は、ＴＢＭおよびＣＤ３９；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；Ａ２０およびＣＤ４７；ＴＦＰＩおよびＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤおよびＡ２０；ＴＢＭおよびＡ２０；ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；ＴＢＭおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡおよびＴＦＰＩ；ＥＰＣＲおよびＨＯ－１；ＴＢＭおよびＣＤ４７；ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩ；ＴＢＭおよびＥＰＣＲ；ＣＤ４７およびＨＯ－１；ＣＤ４６およびＣＤ４７；ＣＤ４６およびＨＯ－１；ならびにＣＤ４６およびＴＢＭからなる群から選択される。
例示的な実施形態において、ベクターは、少なくとも２つの抗凝血剤、より詳細には、少なくとも３つの抗凝血剤を含む４遺伝子ＭＣＶである。例示的な実施形態において、ベクターは、少なくとも２つの抗凝血剤および補体阻害剤、より詳細には、３つの抗凝血剤および補体阻害剤を含む４遺伝子ＭＣＶベクターである。例示的な実施形態において、ベクターは、２つの抗凝血剤、補体阻害剤および免疫抑制剤を含む４遺伝子ＭＣＶベクターである。
８．プロモーター
本発明の動物を生産するのに使用されるベクター構築物は、これらに限定されないが、以下の配列、「２Ａ」ペプチド技術およびドッキングベクターに作動可能に連結したプロモーター－エンハンサー配列などの調節配列を含んでいてもよい。膨大な数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、商業的に入手可能である。
具体的な実施形態において、本開示は、内皮細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現する動物、組織および細胞（第２の同一または異なるプロモーターの制御下の少なくとも１つの導入遺伝子と組み合わせて）、より詳細には、内皮細胞において少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの導入遺伝子を発現する動物、組織および細胞を提供する。発現を特定の組織に標的化するために、動物は、内皮細胞発現に特異的なプロモーターを含むベクターを使用して開発される。特定の実施形態において、発現は、主として内皮で活性なプロモーターによって制御される。一実施形態において、核酸構築物は、発現させようとする導入遺伝子配列に作動可能に連結した調節配列を含有する。
一実施形態において、調節配列は、プロモーター配列であってもよい。一実施形態において、プロモーターは、調節可能プロモーターであってもよい。このようなシステムにおいて、例えば、ペプチドが動物、組織または臓器で発現されるかどうかを調節するために、薬物を使用してもよい。例えば、臓器または組織がブタの一部である間、発現は抑制できるが、細胞性免疫応答を克服する期間にわたり、ブタがヒトに移植されたら、発現は誘導される。加えて、発現のレベルは、レシピエントの免疫系の免疫抑制が確実に起こらないようにするために、調節可能プロモーターシステムによって制御することができる。
調節可能プロモーターシステムは、これらに限定されないが、以下の遺伝子システム：銅などの金属によって誘導可能なメタロチオネインプロモーター（Lichtlen and Schaffner, Swiss Med. Wkly., 2001, 131 (45-46):647-52を参照）；テトラサイクリンによって調節されるシステム（Imhof et al., J Gene Med., 2000, 2(2):107-16を参照）；エクジソンによって調節されるシステム（Saez et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000, 97(26):14512-7を参照）；シトクロムＰ４５０誘導性プロモーター、例えばＣＹＰ１Ａ１プロモーター（Fujii-Kuriyama et al., FASEB J., 1992, 6(2):706-10を参照）；ミフェプリストン誘導性システム（Sirin and Park, Gene., 2003, 323:67-77を参照）；クマリンによって活性化されるシステム（Zhao et al., Hum Gene Ther., 2003, 14(17): 1619- 29を参照）；マクロライド誘導性システム（マクロライド系抗生物質、例えばラパマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、およびロキシスロマイシン（roxitiromycin）に応答する）（Weber et al., Nat Biotechnol., 2002, 20(9):901-7；Wang et al., Mol Ther., 2003, 7(6):790-800を参照）；エタノールによって調節されるシステム（Garoosi et al., J Exp Bot., 2005, 56(416):163542；Roberts et al., Plant Physiol., 2005, 138(3):1259-67を参照）；ストレプトグラミン誘導性システム（Fussenegger et al., Nat Biotechnol., 2000 18(11):1203-8を参照）；求電子物質誘導性システム（Zhu and Fahl, Biochem Biophys Res Commun., 2001, 289(1):212-9を参照）；ニコチン誘導性システム（Malphettes et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(12):e107を参照）、免疫誘導性プロモーター、サイトカイン応答プロモーター（例えばＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１、ＩＬ－６またはＴＧＦ－ベータによって誘導されるプロモーター（または他の二次経路）から選択することができ、したがって、免疫もしくは炎症性応答に関連して、またはそれに応答して、オンにしたりまたは上方調節したりできる。
特定の実施形態において、バイシストロン性ベクターは、２つの導入遺伝子、ならびに主に内皮細胞で活性なプロモーター、または全ての臓器、組織および細胞において導入遺伝子を普遍的に発現する構成的プロモーターを含む。他の実施形態において、多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）における少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下にある。プロモーターは、外因性、ネイティブ、または外因性およびネイティブの両方の組合せであってもよい。一部の実施形態において、第１および第２のプロモーターは、異なる。
特定の実施形態において、バイシストロン性ベクターは、２つの導入遺伝子、ならびに全ての臓器、組織および細胞において導入遺伝子を普遍的に発現する構成的プロモーターを含む。特定の実施形態において、バイシストロン性ベクターは、２つの導入遺伝子、ならびに臓器、組織および細胞における発現を制御する組織特異的プロモーターを含む。例示的な実施形態において、ベクターは、内皮特異的なプロモーターの制御下に少なくとも２つの抗凝血剤を含む４遺伝子ＭＣＶである。例示的な実施形態において、ベクターは、構成的プロモーターの制御下に少なくとも１つの補体阻害剤導入遺伝子、および内皮細胞特異的なプロモーターの制御下に少なくとも１つの抗凝血剤導入遺伝子を含む４遺伝子ＭＣＶである。例示的な実施形態において、ベクターは、構成的プロモーターの制御下に少なくとも１つの補体阻害剤導入遺伝子、および第２の構成的プロモーターの制御下に少なくとも１つの抗凝血剤遺伝子を含む４遺伝子ＭＣＶである。例示的な実施形態において、ベクターは、内皮細胞プロモーターの制御下に抗凝血剤導入遺伝子および免疫抑制剤導入遺伝子を含む４遺伝子ＭＣＶベクターである。その他の例示的な実施形態において、ベクターは、内皮細胞プロモーターの制御下に抗凝血剤導入遺伝子、構成的プロモーターの制御下に免疫抑制剤導入遺伝子、構成的（consitutive）プロモーターの制御下に補体調節導入遺伝子、および構成的プロモーターの制御下に細胞保護的導入遺伝子を含む６遺伝子ＭＣＶベクターである。
例示的な実施形態において、ベクターは、少なくとも２つの別個のプロモーターの制御下に合計２つの遺伝子を含む２遺伝子ＭＣＶベクターであるか；または選択された実施形態において、鎖中に複数の導入遺伝子を有し、それぞれそれら自体のプロモーターを有し、全て単一の遺伝子座に組み込まれている、ベクターである。
他の実施形態において、エンハンサーエレメントは、核酸構築物中で、組織特異的な方式で導入遺伝子の発現の増加を促進するために使用される。エンハンサーは、エレメントの外側にあり、遺伝子転写の効率を劇的に変更する（Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, pp. 708-710, Benjamin Cummings Publishing Company, Menlo Park, Calif.. COPYRGT.1987）。特定の実施形態において、ｐｄｘ－１エンハンサー（ＩＰＦ－１、ＳＴＦ－１、およびＩＤＸ１としても公知（Gerrish K et al., Mol. Endocrinol., 2004, 18(3): 533；Ohlsson et al., EMBO J. 1993 Nov., 12(11):4251-9；Leonard et al., Mol. Endocrinol., 1993, 7(10):1275-83；Miller et al., EMBO J., 1994, 13(5):1145-56；Serup et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996, 93(17):9015-20；Melloul et al., Diabetes, 2002, 51 Suppl 3:S320-5；Glick et al., J Biol Chem., 2000, 275(3):2199-204；GenBank AF334615.））は、導入遺伝子の膵臓特異的な発現のために、ｉｎｓ２プロモーターと組み合わせて使用される。
ある特定の実施形態において、動物は、エンハンサーエレメントと組み合わせたプロモーターの制御下で導入遺伝子を発現する。特定の実施形態において、動物は、ＴＢＭプロモーター、ＥＰＣＲプロモーター、ＩＣＡＭ－２、および／またはＴｉｅ－２から選択される内皮特異的なプロモーターの制御下で導入遺伝子を発現する。特定の実施形態において、動物は、豚ＴＢＭ（ｐＴＢＭｐｒ）プロモーター、豚ＥＰＣＲプロモーター（ｐＥＰＣＲｐｒ）、豚ＩＣＡＭ－２、および／またはマウスＴｉｅ－２プロモーターから選択される内皮特異的なプロモーターの制御下で導入遺伝子を発現する。一部の実施形態において、内皮プロモーターは、エンハンサーエレメント（例えば、マウスのＴｉｅ－２エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサー）をさらに含む。他の実施形態において、プロモーターは、エンハンサーエレメントをさらに含む偏在的なプロモーターエレメントであってもよい。特定のエレメントにおいて、偏在的なプロモーターは、内皮特異的な豚ＴＢＭプロモーター（ｐＴＢＭｐｒ）および／または内皮特異的なＴｉｅ－２エンハンサーエレメント（Ｔｉｅ２－ＣＡＧ）と組み合わせて使用されるＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ウサギベータ－グロビンイントロン）である。Ｔｉｅ２－ＣＡＧの場合、導入遺伝子は、構成的および偏在的な方式の両方で発現されると予想されるが、内皮細胞では、他の体細胞と比べてより一層高いレベルで発現されると予想される。一部の実施形態において、プロモーターは、エンハンサーエレメントと組み合わせて使用され、エンハンサーエレメントは、本質的にプロモーターと会合しているかまたはそれと共存するＤＮＡの非コードまたはイントロン領域である。別の具体的な実施形態において、エンハンサーエレメントは、ＩＣＡＭ－２プロモーターと組み合わせて使用されるＩＣＡＭ－２である。他の偏在的なプロモーターとしては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ＣＭＶおよびＳＶ４０のようなウイルスプロモーター、さらに、ニワトリベータアクチンおよびガンマ－アクチンプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、Ｈ２Ｋ、ＣＤ４６プロモーター、ＧＧＴＡ１、ユビキチンおよびＲＯＳＡプロモーター。
９．遺伝子改変された細胞の選択
一部の場合で、トランスジェニック細胞は、細胞ゲノムへの標的化された導入遺伝子の挿入または組込みの結果である（すなわち相同組換えを介した）遺伝学的改変を有する。一部の場合で、トランスジェニック細胞は、細胞ゲノムへの非標的化（ランダム）組込みの結果である遺伝学的改変を有する。細胞は、適切に選択された培地中で成長させて、適切な組込みを提供する細胞を同定することができる。次いで所望の表現型を示す細胞は、制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応、または当業界において公知の別の技術によってさらに分析することができる。標的遺伝子部位における適切な挿入を示す断片を同定することによって（または非標的化用途では、ランダムな組込み技術が所望の結果をもたらした場合）、標的遺伝子を不活性化するかまたはそれ以外の方法で改変するように相同組換え（または所望の非標的化組込み事象）が起こった細胞を同定することができる。
選択可能なマーカー遺伝子または他の陽性選択剤または導入遺伝子（trangene）の存在は、標的構築物の宿主ゲノムへの組込みを確立する。次いで所望の表現型を示す細胞は、制限酵素消化分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによってさらに分析することができる。相同または非相同組換えが起こったかどうかを確立するために、ＤＮＡを分析する。これは、インサートのためのプローブを採用すること、次いで、構築物の隣接領域を超えて伸長する遺伝子の存在に関して、インサートに隣接する５’および３’領域をシーケンシングすること、または欠失が導入される場合、このよう欠失の存在を同定することによって決定することができる。また、構築物内の配列に相補的であり、構築物の外側および標的遺伝子座にある配列に相補的であるプライマーも使用することができる。この方法において、相同組換えが起こった場合、相補的な鎖に存在する両方のプライマーを有するＤＮＡ二重鎖のみを得ることができる。例えば、プライマー配列または予測されたサイズの配列の存在を実証することによって、相同組換えの出現が裏付けられる。
スクリーニング相同組換え事象のために使用されるポリメラーゼ連鎖反応は、Kim and Smithies, (1988) Nucleic Acids Res. 16:8887-8903；およびJoyner et al.(1989) Nature 338:153-156に記載されている。標的化の第１のラウンドから（またはゲノムへの非標的化（ランダム）組込みから）得られた細胞株は、組み込まれた対立遺伝子に関してヘテロ接合型である可能性が高い。両方の対立遺伝子が改変されているホモ接合性は、多数の方法で達成することができる。１つのアプローチは、１つのコピーが改変された多数の細胞を増殖させ、次いで異なる選択可能なマーカーを使用して、これらの細胞を、標的化（または非標的化（ランダム）組込み）の別のラウンドに供することである。代替として、ホモ接合体は、改変された対立遺伝子に関してヘテロ接合型の動物を繁殖させることによって得ることができる。いくつかの状況において、２つの異なる改変された対立遺伝子を有することが望ましい場合がある。これは、遺伝子標的化（またはランダムな組込み）の連続したラウンドによって、またはそれぞれが所望の改変された対立遺伝子のうちの１つを有するヘテロ接合体を繁殖させることによって達成することができる。効率的な標的化二本鎖切断を用いたゲノム編集の事象は、単一のトランスフェクション（または胎児もしくは接合体標的化戦略）でホモ接合型（homozygousys）ノックアウトまたはノックイン事象が高頻度で達成できるように、高頻度の二対立遺伝子の遺伝子標的化事象を可能にする。このような遺伝子編集によって強化された（例えばＣｒｉｓｐｒ－ＣＡＳ９ヌクレアーゼ）遺伝子標的化または相同性依存性修復事象は、単一対立遺伝子またはヘテロ接合型、および二対立遺伝子またはホモ接合型ノックアウトの両方を（小さいヌクレオチドの挿入、欠失、置換を介して、それ以外のインデルと記載される方法で）含んでいてもよく、さらに、単一の導入遺伝子の単一対立遺伝子（monallelic）および二対立遺伝子の挿入／ノックインの両方、多重導入遺伝子鎖（それら自体のプロモーターまたはバイシストロン性もしくは多シストロン性プロモーター下の導入遺伝子の鎖）、または多シストロン性ベクター（少なくとも２つのプロモーターの制御下の４導入遺伝子多シストロン性（multicistonic）ベクターを含み、前記プロモーターは、構成的または組織特異的であってもよく、例えば、ＣＡＧおよびＩｃａｍ－２である）を含む遺伝子挿入も含んでいてもよい。
代替として、複数の遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えばＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９）の使用を介して、基礎的な遺伝子型の組合せ（すなわち、ＧＨＲノックアウト、ＧＧＴＡ１ノックアウト、ＧＨＲ／ＣＤ４６ノックアウト、ＧＧＴＡ１／ＣＤ４６、またはＧＧＴＡ１／ＧＨＲ／ＣＤ４６）を用いて、細胞（トランスフェクションまたは感染を介して）または接合体（同時にマイクロインジェクションを介して）を効率的に生産することが期待でき、その場合、１つの遺伝学的改変は、４遺伝子ＭＣＶ（少なくとも２つのプロモーターの制御下の）のノックイン（例えば、ＧＧＴＡ１；ＧＨＲにおける）、またはランダム挿入と、同時に、別の遺伝子座（単一または二対立遺伝子であり、例えば、ＧＧＴＡ１、ＧＨＲ、ＣＭＡＨ、またはＢ４ＧａｌＮＴ２における単一または二対立遺伝子）におけるヌクレアーゼ媒介インデルのいずれかを含んでいてもよい。好ましい実施形態において、２つの異なる遺伝子座（例えば、ランディングパッド、セーフハーバー、またはＧＧＴＡ１、ＧＨＲ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、ＲＯＳＡ２６、ＡＡＶＳ１、またはネイティブの、もしくは改変されたネイティブの遺伝子座を含む他の予め決定された遺伝子座）における多重導入遺伝子ベクター（バイシストロン性または４遺伝子ＭＣＶ）の標的化された挿入。一部の実施形態において、第２の遺伝子座（例えば、ＣＭＡＨ、ＧＨＲ、またはＢ４ＧａｌＮＴ２）における、バイシストロン性または４遺伝子ＭＣＶの標的化された相同組換えによる（または遺伝子編集によって強化された）挿入を伴う、ＧＧＴＡ１における４遺伝子ＭＣＶの標的化された挿入。ある特定の実施形態において、選択技術は、非常に高いレベルの選択薬剤への曝露によって、ヘテロ接合型細胞から相同なノックアウト細胞を得るのに使用される。このような選択は、例えば、ゲネチシン（Ｇ４１８）などの抗生物質の使用によってなされてもよい。
次いで適切なベクターをトランスフェクトされた、またはそれ以外の方法でそれを受けた細胞は、遺伝子型または表現型分析を介して選択または同定することができる。一実施形態において、細胞はトランスフェクトされ、適切に選択された培地で成長させて、組み込まれたベクターを含有する細胞を同定する。選択可能なマーカー遺伝子の存在は、トランスフェクトされた細胞における導入遺伝子構築物の存在を示す。次いで所望の表現型を示す細胞は、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子の組込みを検証するために、制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによってさらに分析することができる。導入遺伝子配列に相補的なプライマーも使用することができる。相同組換えおよびランダムな組込み事象をスクリーニングするために使用されるポリメラーゼ連鎖反応は、当業界において公知であり、例えば、Kim and Smithies, Nucleic Acids Res. 16:8887-8903, 1988；およびJoyner et al., Nature 338:153-156, 1989を参照されたい。ネオマイシン遺伝子を駆動させるための突然変異ポリオーマエンハンサーおよびチミジンキナーゼプロモーターの具体的な組合せが、胚性幹細胞とＥＣ細胞の両方において活性であることが、Thomas and Capecchi, supra, 1987；Nicholas and Berg (1983) in Teratocarcinoma Stem Cell, eds. Siver, Martin and Strikland (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y. (pp. 469-497)；およびLinney and Donerly, Cell 35:693-699, 1983によって示されている。
相同組換えを受けた細胞は、多数の方法によって同定することができる。一実施形態において、選択方法は、例えばヒト抗ｇａｌ抗体によって、細胞に対する免疫応答の非存在を検出することができる。好ましい実施形態において、選択方法は、挿入または標的化された導入遺伝子を選択ツールとして利用することができ、添加された蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ）、または抗生物質選択遺伝子の使用なしで陽性選択を可能にする。ある特定の場合において、導入遺伝子の標的化された挿入は、細胞表面タンパク質を生産することができ、これは、適切な導入遺伝子特異的な蛍光でマークした（florescence-marked）細胞を用いて、所望の導入遺伝子の陽性発現に関してソートすることができる。代替として、機能の喪失をモニターまたは選択できるように、標的遺伝子座を不活性化することができる。例えば、ＧＧＴＡ１遺伝子座の不活性化は、標的化された細胞のレクチン（ＩＢ４）への結合を排除するかもしくは低減させると予想され、またはＢ４ＧａｌＮＴ２の不活性化は、ＤＢＡレクチンによって標的化された細胞の結合を排除するかもしくは低減させると予想され、それぞれの場合において、標的化された組込みは、このようなレクチン結合を欠如している細胞に関してソートしてもよいし、またはそれを富化してもよい。それぞれの場合において、細胞表面上での導入遺伝子の発現は、さらなる分析のために使用しようとする細胞の選択を可能にする。
他の実施形態において、選択方法は、細胞または組織に曝露された場合のヒト血液中における凝固のレベルを評価することを含んでいてもよい。抗生物質耐性を介した選択は、スクリーニングに最も一般的に使用される。この方法は、標的化ベクターにおける抵抗性遺伝子の存在を検出することができるが、組込みが標的化された組換え事象かまたはランダムな組込みかを直接的に示さない。代替として、マーカーは、ＧＦＰもしくはＲＦＰなどの蛍光マーカー遺伝子であってもよいし、またはセルソーティングもしくはＦＡＣｓ分析を介して細胞表面上で検出可能な遺伝子であってもよい。ポリＡおよびプロモータートラップ技術などのある特定の技術が、標的化された事象の確率を増加させるが、この場合も、所望の表現型が達成されたという直接の証拠をもたらさない。加えて、選択の陰性型は、標的化された組込みに関して選択するのに使用することができ；これらの場合において、標的化された事象のみが細胞に死を回避させられるように、細胞にとって致死性の因子（例えばＴｋまたはジフテリア（diptheria）Ａ毒素）に関する遺伝子が挿入される。次いでこれらの方法によって選択された細胞は、遺伝子の崩壊、ベクター組込み、および最終的に遺伝子の枯渇に関してアッセイすることができる。これらの場合において、選択は、変更された表現型ではなく標的化ベクター組込みの検出に基づくため、点突然変異、遺伝子再配列もしくは短縮化または他のそのような改変ではなく、標的化されたノックアウトのみを検出することができる。
特徴付けはさらに、以下の技術、これらに限定されないが、ＰＣＲ分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、特異的なレクチン結合アッセイ、および／またはシーケンシング分析などによって完成させることができる。表現型の特徴付けはまた、免疫蛍光法（immunofluoroescence）、免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡアッセイ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、例えばＲＴ－ＰＣＲによる細胞におけるＲＮＡの転写に関する試験を含む様々なアッセイにおける抗マウス抗体の結合などによっても完成させることができる。遺伝子型は、サザン分析およびＰＣＲによって決定することができる。遺伝子発現は、ＰＢＭＣおよび内皮細胞のフローサイトメトリーによってモニターされ、細胞および臓器中においては、免疫組織化学、Ｑ－ＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）およびウェスタンブロット分析によってモニターされる。導入遺伝子に特異的な生物活性アッセイは、補体阻害、血小板凝集、活性化プロテインＣ形成、ＡＴＰアーゼ活性、第Ｘａ因子切断、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）およびアポトーシスを定量化し、特徴付けると予想される。
他の実施形態において、アルファＧａｌ（ＧＴＫＯ）および／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲＫＯ）トランスジェニック動物または細胞は、追加の遺伝学的改変を含有する。遺伝学的改変としては、相同標的化だけでなく、外因性遺伝子のランダムな組込み、単一の遺伝子座への遺伝子の群または鎖の共組込み、任意の種類の遺伝子の突然変異、欠失および挿入も挙げることができる。追加の遺伝学的改変は、本明細書に記載されるトランスジェニック細胞および動物から得られた細胞をさらに遺伝学的に改変することによって、または本明細書に記載される動物を、さらに遺伝子改変された動物と交配することによってなすことができる。このような動物は、アルファＧＴ遺伝子、成長ホルモン受容体遺伝子（Yu et al., J Transl. Med. (2018)）、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子（例えば、米国特許第７，３６８，２８４号明細書を参照）、ｉＧｂ３シンターゼ遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１５５０９５号明細書を参照）、β１，４Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＴ２；例えばEstrada JL et al., Xenotransplantation 22:194-202 [2015]を参照）、および／またはフォルスマンシンターゼ遺伝子（例えば、米国特許出願公開第２００６／００６８４７９号明細書を参照）のうちの少なくとも１つの対立遺伝子の発現が排除されるように改変してもよい。
追加の実施形態において、本明細書に記載される動物はまた、目的の導入遺伝子、より具体的には、イムノモジュレーター、抗凝血剤および細胞保護的導入遺伝子からなる群からのものであるヒト導入遺伝子を発現させるための遺伝学的改変を含有していてもよい。好ましい実施形態において、多重導入遺伝子の組込みに加えて（標的化された、またはランダムであるが、少なくとも４つを超える遺伝子であり、その場合、このような少なくとも４つの遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターによって制御される）、ゲノムにおけるノックアウト（機能の欠如）、インデル、および豚ｖＷＦ配列の同時のノックアウトを含む豚ｖＷＦ遺伝子座の遺伝学的改変を達成することができる。一部の実施形態において、遺伝学的改変は、標的化されたノックイン、および既定された豚ｖＷＦエクソン（例えばエクソン２２～２８）の、ヒトｖＷＦ遺伝子配列からのそれらのヒトエクソン２２～２８カウンターパートでの一部または全ての置き換えを含む。
これらの追加の遺伝学的改変を達成するために、一実施形態において、細胞は、複数の遺伝学的改変を含有するように改変してもよい。他の実施形態において、動物は、複数の遺伝学的改変を達成するために一緒に交配してもよい。具体的な一実施形態において、本明細書に記載されるプロセス、配列および／または構築物に従って生産された動物、例えばブタは、アルファＧａｌ（例えば、国際公開第０４／０２８２４３号パンフレットに記載された通り）および／または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現が欠如した動物、例えばブタと交配することができる。別の実施形態において、異種移植片拒絶反応に関与する追加の遺伝子の発現は、排除または低減されてもよい。このような遺伝子としては、これらに限定されないが、ＣＭＰ－ＮＥＵＡｃヒドロキシラーゼ遺伝子（ＣＭＡＨ）、ベータ－４ＧａｌＮＴ２、ｉｓｏＧｌｏｂｏｓｉｄｅ３（ｉＧｂ３）シンターゼ遺伝子、およびフォルスマンシンターゼ遺伝子が挙げられる。
加えて、補体媒介溶解の抑制に関与する補体関連タンパク質をコードする遺伝子またはｃＤＮＡも、本開示の動物および組織で発現させることができる。このような遺伝子としては、これらに限定されないが、ＣＤ５９、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、およびＣＤ４６が挙げられる（例えば、国際公開第９９／５３０４２号パンフレット；ＣＤ５９／ＤＡＦ導入遺伝子を発現するブタを記載している、Chen et al. Xenotransplantation, Volume 6 Issue 3 Page 194- August 1999；ヒトＣＤ５９およびＨ－トランスフェラーゼを発現するトランスジェニックブタを記載している、Costa C et al, Xenotransplantation. 2002 January; 9(1):45-57；ヒトＣＤ４６トランスジェニックブタを記載している、Zhao L et al.; Diamond L E et al. Transplantation. 2001 Jan. 15; 71(1):132-42を参照）。
追加の改変としては、細胞による細胞接着分子の発現を下方調節する抗体などの化合物、例えば「細胞接着分子の下方調節による異種移植片拒絶反応の抑制（Suppression of xenograft rejection by down regulation of a cell adhesion molecules）」というタイトルの国際公開第００／３１１２６号パンフレットに記載されたもの、および例えば、異種ドナー生物からのＣＴＬＡ－４の可溶性形態の臓器レシピエントへの投与による、シグナル２による共刺激を抑制する化合物、例えば、「Ｔ細胞共刺激シグナル２（Ｂ７／ＣＤ２８相互作用）をブロックすることによる免疫抑制（Immunosuppression by blocking T cell co-stimulation signal 2 (B7/CD28 interaction)）」というタイトルの国際公開第９９／５７２６６号パンフレットに記載されたものの発現を挙げることができる。
１０．核移植
本明細書に記載される遺伝子改変された動物またはトランスジェニック動物、例えば有蹄動物またはブタは、当業界において公知の任意の好適な技術を使用して生産することができる。これらの技術としては、これらに限定されないが、マイクロインジェクション（例えば、前核の、および／または細胞質内の）、卵子もしくは接合体のエレクトロポレーション、および／または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）が挙げられる。
導入遺伝子、または多シストロン性（multi-cisrtonic）ベクター（ＭＣＶ）を動物に導入するために、当業界において公知の任意の追加の技術を使用することができる。このような技術としては、これらに限定されないが、前核マイクロインジェクション（例えば、Hoppe, P. C. and Wagner, T. E., 1989、米国特許第４，８７３，１９１号明細書を参照）；細胞質マイクロインジェクション（例えばWhitworth et al., 2014を参照）：生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（例えば、Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152を参照）；胚性幹細胞における遺伝子標的化（例えば、Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321；Wheeler, M. B., 1994、国際公開第９４／２６８８４号パンフレットを参照）；胎児のエレクトロポレーション（例えば、Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814を参照）；トランスフェクション；形質導入；レトロウイルス感染；アデノウイルス感染；アデノウイルス関連感染；リポソーム媒介遺伝子移入；裸のＤＮＡの移入；および精液によって媒介される遺伝子移入（例えば、Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723を参照）などが挙げられる。このような技術の総論に関して、例えば、Gordon, 1989, Transgenic Anithals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229を参照されたい。特定の実施形態において、有蹄動物におけるＣＴＬＡ４および／またはＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合遺伝子の発現は、これらの技術を介して達成することができる。
一実施形態において、トランスジェニック動物を生産するために、導入遺伝子をコードする構築物のマイクロインジェクションを使用することができる。一実施形態において、核酸構築物またはベクターは、接合体の前核にマイクロインジェクションすることができる。一実施形態において、構築物またはベクターは、接合体の雄性前核に注射することができる。別の実施形態において、構築物またはベクターは、接合体の雌性前核に注射することができる。さらなる実施形態において、構築物またはベクター、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、受精させた卵母細胞の細胞質に注射して、このような遺伝子編集ヌクレアーゼでの処置後に修復エラーの結果生じる遺伝子ノックアウトもしくは遺伝子不活性化（挿入、欠失、置換）のいずれかを達成してもよいし、または遺伝学的改変の安定な伝達をもたらす、このような接合体における導入遺伝子もしくは多重遺伝子ベクターの標的化されたノックインを達成するのに使用してもよい（参考文献、Whitworth 2014?）。別の実施形態において、核移植は、既存のトランスジェニック体細胞を用いて開始させることができ、胚の再構成および融合後、遺伝子編集ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９）を、導入遺伝子ベクターもしくは多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）を用いて、またはそれを用いないで、再構成された核移植胚の細胞質に注射して、核移植後の二倍体胚において、さらに後代のトランスジェニックブタにおいて遺伝子編集事象が起こるようにすることができる。
導入遺伝子構築物またはベクターのマイクロインジェクションは、以下のステップを含んでいてもよい：ドナー雌の過剰排卵；卵の外科的除去、卵の受精；受精後の、受精させた卵母細胞（例えば受精後およそ１４時間における仮の接合体）の細胞質への導入遺伝子の転写単位の注射、および通常は同じ種の偽妊娠の宿主母親の生殖器官へのトランスジェニック胎児の導入。例えば、米国特許第４，８７３，１９１号明細書、Brinster, et al. 1985. PNAS 82:4438；Hogan, et al., in “Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual”. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986. Robertson, 1987, in Robertson, ed. “Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells a Practical Approach” IRL Press, Evnsham. Oxford, England. Pedersen, et al., 1990. “Transgenic Techniques in Mice--A Video Guide”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Yを参照されたい。トランスジェニックブタは、慣例的に、ブタ胎児への導入遺伝子構築物またはベクターのマイクロインジェクションによって生産される。Withworth et al., Biol. Reprod. 91(3):78, 1-13 [2014]を参照されたい。一実施形態において、導入遺伝子の存在は、各子豚の尾部からの組織からゲノムＤＮＡを単離すること、および約５マイクログラムのこのゲノムＤＮＡを、導入遺伝子特異的なプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション分析に供することによって検出することができる。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、当業者に公知のいずれかの方法に従って、例えば、Bleck et al., J. Anim. Sci., 76:3072[1998]に開示されたように生産してもよいし；また米国特許第６，８７２，８６８号明細書；６，０６６，７２５号明細書；５，５２３，２２６号明細書；５，４５３，４５７号明細書；４，８７３，１９１号明細書；４，７３６，８６６号明細書；および／もしくはＰＣＴ国際公開第／９９０７８２９号パンフレットに記載されたように生産してもよい。
一実施形態において、前核マイクロインジェクション方法は、本開示の導入遺伝子を含有する構築物またはベクターの、少なくともおよそ５０、１００、２００、３００、４００または５００コピーを、選択されたプロモーター、例えば、本明細書で開示されるプロモーターに連結することを含んでいてもよく、次いで外来ＤＮＡは、微細なガラス針を介して受精卵に注射してもよい。一実施形態において、ＤＮＡが接合体の雄性前核に注射されてもよい。ブタ接合体は不透明であり、核構造の可視化は難しい場合がある。一実施形態において、ブタ接合体の前核または核は、例えば１５０００ｇで３ｍｍの遠心分離後に可視化することができる。前核の注射は、標準的なマイクロインジェクション装置の倍率および使用のもと行うことができる。接合体は、先端が丸い保持ピペットによって保持することができ、透明帯、原形質膜および前核のエンベロープは、注射ピペットによって貫通させることができる。先端が丸い保持ピペットは、小さい直径を有していてもよく、例えば、およそ５０ｕｍであってもよい。注射ピペットは、保持ピペットより小さい直径を有していてもよく、例えば、およそ１５ｕｍであってもよい。ＤＮＡ組込みは、宿主ＤＮＡの修復機能としての複製中に起こる。これらの卵は、外来ＤＮＡを含有し、次いで、当業者に公知の任意の技術に従って、胎児妊娠のための代理母に埋め込むことができる。
一部の実施形態において、前核マイクロインジェクションは、受精後１２時間に接合体に実行することができる。このような遺伝子の取り込みは、数回の細胞周期分遅くてもよい。その結果、取り込みの細胞周期に応じて、一部のみの細胞系統に導入遺伝子が入り、モザイク子孫がもたらされ得る。必要に応じて、モザイク動物を交配して、真の生殖細胞系トランスジェニック動物を形成することもできる。
例示的な実施形態において、細胞質マイクロインジェクション方法は、少なくとも１つ、またはそれより多くの標的化されたネイティブの遺伝子、または改変されたネイティブの遺伝子座を標的化するＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ、およびｇＲＮＡを、微細なガラス針を介して受精卵に注射することができる。特定の実施形態において、少なくとも１つ、またはそれより多くの標的化された遺伝子（例えばＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ）を標的化し、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡと共に複数のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲを、接合体の細胞質に注射することができる。
１１．体細胞核移植
一部の実施形態において、導入遺伝子を含有する有蹄動物細胞、例えば豚細胞は、除核した卵母細胞に核移植してクローニングされたトランスジェニック動物を生産するための核を提供するためのドナー細胞として使用することができる。一実施形態において、有蹄動物細胞は、核移植のためにドナー細胞として有用であるために、導入遺伝子タンパク質を発現することを必要としない。一実施形態において、豚細胞は、プロモーターを含有する核酸構築物またはベクターから導入遺伝子を発現するように操作することができる。代替として、豚細胞は、相同組換えを介して内因性プロモーターの制御下で導入遺伝子を発現するように操作することができる。一実施形態において、導入遺伝子の核酸配列は、組織特異的プロモーター、組織特異的なエンハンサーまたはその両方の制御下で、ゲノムに挿入されてもよい。別の実施形態において、導入遺伝子の核酸配列は、構成的プロモーターの制御下で、ゲノムに挿入されてもよい。ある特定の実施形態において、体細胞での標的化された相同組換えを可能にするように設計された標的化ベクターが提供される。これらの標的化ベクターは、相同組換えを介して、目的の内因性遺伝子を標的化するように哺乳類細胞に形質転換することができる。一実施形態において、標的化構築物は、上流配列と共にリーディングフレーム中に入れられ、活性な融合タンパク質を生じるように、導入遺伝子ヌクレオチド配列と選択可能なマーカー遺伝子の両方を内因性遺伝子に挿入する。細胞は、本発明の方法を使用して、構築物で形質転換することができ、選択可能なマーカーによって選択され、次いで組換え体の存在に関してスクリーニングされる。
一態様において、本開示は、ＳＣＮＴを介して、ある特定の導入遺伝子を含有する有蹄動物、例えばブタをクローニングするための方法を提供する。一般的に、ブタは、以下のステップを含む核移植プロセスによって生産することができる：ドナー核の供給源として使用するための、所望の分化したブタ細胞を得ること；ブタから卵母細胞を得るステップ；前記卵母細胞を除核するステップ；所望の分化細胞または細胞核を、例えば融合または注射によって、除核した卵母細胞に移入して、ＳＣＮＴ単位を形成するステップ；結果生じるＳＣＮＴ単位を活性化するステップ；およびＳＣＮＴ単位が胎児に発達するように、培養した前記ＳＣＮＴ単位を宿主ブタに移入するステップ。
核移植技術または核移植技術は、当業界において公知である（例えば、Dai et al. Nature Biotechnology 20:251-255；Polejaeva et al Nature 407:86-90 (2000)；Campbell, et al., Theriogenology 68 Suppl 1:S214-3 1 (2007)；Vajta, et al., Reprod Fertil Dev 19(2): 403-23 (2007)；Campbell et al.(1995) Theriogenology, 43:181；Collas et al.(1994) Mol. Report Dev., 38:264-267；Keefer et al.(1994) Biol. Reprod., 50:935-939；Sims et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147；国際公開第９４／２６８８４号パンフレット；国際公開第９４／２４２７４号パンフレット、および国際公開第９０／０３４３２号パンフレット、米国特許第４，９４４，３８４号明細書、第５，０５７，４２０号明細書、国際公開第９７／０７６６９号パンフレット、国際公開第９７／０７６６８号パンフレット、国際公開第９８／３０６８３号パンフレット、国際公開第００／２２０９８号パンフレット、国際公開第００４２１７号パンフレット、国際公開第００／５１４２４号パンフレット、国際公開第０３／０５５３０２号パンフレット、国際公開第０３／００５８１０号パンフレット、明細書第６，１４７，２７６号、第６，２１５，０４１号明細書、第６，２３５，９６９号明細書、第６，２５２，１３３号明細書、第６，２５８，９９８号明細書、第５，９４５，５７７号明細書、第６，５２５，２４３号明細書、第６，５４８，７４１号明細書、ならびにPhelps et al.(Science 299 : 411-414 (2003)）を参照。
ドナー細胞核は、本開示の導入遺伝子を含有するように改変され、レシピエント豚の卵母細胞に移入される。この方法の使用は、特定のドナー細胞型に限定されない。ドナー細胞は、Wilmut et al.(1997) Nature 385:810；Campbell et al.(1996) Nature 380:64-66；またはCibelli et al.(1998) Science 280:1256-1258に記載された通りであってもよい。原則的に、核移植でうまく使用することができる胎芽、胎児および成体の体細胞を含む正常な核型の全ての細胞を採用することができる。胎児線維芽細胞は、ドナー細胞の特に有用なクラスである。核移植の一般的に好適な方法は、Campbell et al.(1995) Theriogenology 43:181, Collas et al.(1994) Mol. Reprod. Dev. 38:264- 267, Keefer et al.(1994) Biol. Reprod. 50:935-939, Sims et al.(1993) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:6143-6147、国際公開第９４２６８８４号パンフレット、国際公開第９４２４２７４号パンフレット、国際公開第９８０７８４１号パンフレット、国際公開第９００３４３２号パンフレット、米国特許第４，９９４，３８４号明細書および米国特許第５，０５７，４２０号明細書、Campbell et al., (2007) Theriogenology 68 Suppl 1, S214-231、Vatja et al., (2007) Reprod Fertil Dev 19, 403-423）に記載されている。
分化した、または少なくとも部分的に分化したドナー細胞も使用することができる。ドナー細胞はまた、必ずしもそうでなくてもよいが、培養物の形態であってもよいし、休眠状態であってもよい。休眠状態の核ドナー細胞は、休眠に入るように誘導されていてもよい細胞またはインビボで休眠状態で存在する細胞である。先行技術の方法は、クローニング手順で胚細胞型も使用してきた（例えば、Campbell et al.(1996) Nature, 380:64-68)およびStice et al.(1996) Biol. Reprod., 20 54:100-110を参照）。特定の実施形態において、線維芽細胞、例えば豚線維芽細胞は、目的の導入遺伝子を含有するように遺伝子改変されていてもよい。
卵母細胞の単離のための方法は当業界において周知である。本質的にこれは、ブタの卵巣または生殖器官から卵母細胞を単離することを含んでいてもよい。ブタ卵母細胞の容易に入手可能な供給源は、屠殺場の材料である。豚ＩＶＦ（体外受精）、ＳＣＮＴなどの技術の組合せのために、卵母細胞は、これらの細胞が核移植のためのレシピエント細胞として使用できるようになる前に、さらに、それらが精細胞によって受精して胎児に発達できるようになる前に、一般的に、インビトロで成熟していなければならない。このプロセスは、一般的に、哺乳類卵巣、例えば屠殺場で得られたウシ卵巣からの未成熟（前期Ｉ）卵母細胞を収集すること、および受精または除核の前、卵母細胞が分裂中期ＩＩ段階に達するまで、成熟培地中で卵母細胞を成熟させることを必要とし、これは、ウシ卵母細胞の場合では、一般的に、吸引後約１８～２４時間行われ、豚の場合では、一般的に、約３５～５５時間行われる。この期間は、成熟期間として公知である。
分裂中期ＩＩ段階の卵母細胞は、レシピエント卵母細胞であってもよく、この段階で、卵母細胞は、受精する精液と同様に、導入された核を処置するのに十分に活性化されている可能性があるか、または十分に活性化されていると考えられる。分裂中期ＩＩ段階の卵母細胞は、インビボで成熟した状態であり、核移植技術でうまく使用された。本質的に、成熟した分裂中期ＩＩの卵母細胞は、発情の発症、もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）または類似のホルモンの注射後の３５～４８、または３９～４１時間に、過剰排卵していない、または過剰排卵した豚のいずれかから外科的に収集することができる。
固定した時間の成熟期間の後、卵母細胞を除核してもよい。除核の前、卵母細胞を取り出し、卵丘細胞の除去の前に、１ミリグラム／ミリリットルのヒアルロニダーゼを含有するＨＥＣＭまたはＴＣＭ１９９などの適切な培地中に入れてもよい。次いで取り外した卵母細胞を極体に関してスクリーニングしてもよく、次いで、極体の存在によって決定した場合、選択された分裂中期ＩＩの卵母細胞は、核移植のために使用される。その後、除核を行う。
除核は、公知の方法によって、例えば米国特許第４，９９４，３８４号明細書に記載されたように実行することができる。例えば、分裂中期ＩＩの卵母細胞は、ＨＥＣＭもしくはＴＣＭ１９９のいずれかに入れてもよく、これらは、任意選択で即時の除核のために７～１０マイクログラム／ミリリットルのサイトカラシンＢを含有していてもよく、または好適な培地、例えば胎児培養培地、例えば１０％の発情したウシの血清を添加したＰＺＭもしくはＣＲｌａａ中に入れてもよく、次いで、その後、例えば、２４時間以内に、または１６～１８時間以内に、除核してもよい。
除核は、極体と隣接する細胞質を除去するために、顕微手術でマイクロピペットを使用して達成することができる。次いで卵母細胞をスクリーニングして、うまく除核されたものを同定することができる。卵母細胞をスクリーニングする１つの方法は、好適な保持培地中で、３～１０マイクログラム／ミリリットルの３３３４２ヘキスト色素で卵母細胞を染色し、次いで、１０秒未満の紫外線照射下で卵母細胞を可視化することである。次いで、うまく除核された卵母細胞は、好適な保持培地、例えば、ＨＥＣＭまたはＴＣＭ１９９中に入れることができる。
次いで、除核した卵母細胞と同じ種の単一の哺乳類細胞を、ＮＴ単位を生産するのに使用される除核した卵母細胞の囲卵腔に移入することができる。哺乳類細胞および除核した卵母細胞は、当業界において公知の方法に従って、ＮＴ単位を生産するのに使用することができる。例えば、細胞は、電気融合によって融合させてもよい。電気融合は、原形質膜の一時的な破壊を引き起こすのに十分な電気のパルスを提供することによって達成される。膜は急速に再形成するため、この原形質膜の破壊は非常に短い。したがって、２つの隣接する膜の破壊が誘発される場合、再形成したとき、脂質二重層が入り混ざって、２つの細胞間に小さいチャネルが開く場合がある。このような小さい開口部の熱力学的な不安定のために、チャネルは、２つの細胞が１つになるまで拡大する。例えば、Prather et alによる米国特許第４，９９７，３８４号明細書を参照されたい。例えば、スクロース、マンニトール、ソルビトールおよびリン酸緩衝化溶液を含む様々な電気融合培地を使用することができる。例えば、融合培地は、０．０５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．００１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２８０ミリモル濃度（ｍＭ）のマンニトール溶液を含んでいてもよい（Walker et al., Cloning and Stem Cells. 2002; 4(2):105-12）。融合はまた、融合誘発剤としてセンダイウイルスを使用しても達成することができる（Graham, Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 19, 1969）。また核は、エレクトロポレーション融合を使用するよりも、卵母細胞に直接注射してもよい。例えば、Collas and Barnes, (1994) Mol. Reprod. Dev., 38:264-267を参照されたい。融合の後、得られた融合したＮＴ単位は次いで、活性化（activiation）まで、好適な培地に入れられ、例えば、１～４時間後の活性化まで、ＨＥＣＭまたはＴＣＭ１９９に入れられる。活性化は、典型的には、その後短時間で、例えば２４時間未満の後、またはウシＮＴの場合、約４～９時間後、豚ＮＴの場合、１～４時間後に実行することができる。
ＮＴ単位は、公知の方法によって活性化することができる。このような方法としては、例えば、生理学的な温度未満でＮＴ単位を培養すること、実質的には、ＮＴ単位に、低温、または実際に低い温度の衝撃を適用することによって培養することが挙げられる。これは、最も都合のよい形態として、胚が通常晒されている生理学的な温度条件に比べて低温である室温で、ＮＴ単位を培養することによって行うことができる。代替として、活性化は、公知の活性化剤の適用によって達成することができる。例えば、受精中に精液が卵母細胞に浸透することが、融合前（prelusion）卵母細胞を活性化して、より多くの数の生存可能な妊娠と核移植後に複数の遺伝学的に同一な子牛をもたらすことが示されている。電気的および化学的衝撃などの処置も、融合後にＮＴ胚を活性化するのに使用することができる。例えば、Susko-Parrish et alの米国特許第５，４９６，７２０号明細書を参照されたい。加えて、活性化は、卵母細胞中の２価カチオンのレベルを増加させること、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化を低減させることによって、同時に、または逐次的に実行することもできる。これは、一般的に、卵母細胞の細胞質に、例えば、マグネシウム、ストロンチウム、バリウムまたはカルシウムなどの２価カチオンを、例えばイオノフォアの形態で導入することによって実行することができる。２価カチオンレベルを増加させる他の方法としては、電気衝撃の使用、エタノールでの処置、およびケージドキレーター（caged chelator）での処置が挙げられる。リン酸化は、公知の方法によって低減させることができ、例えば、キナーゼ阻害剤、例えば、セリン－スレオニンキナーゼ阻害剤、例えば６－ジメチル－アミノプリン、スタウロスポリン、２－アミノプリン、およびスフィンゴシンの添加によって低減させることができる。代替として、細胞タンパク質のリン酸化は、卵母細胞へのホスファターゼの導入、例えば、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂの導入によって阻害することができる。次いで活性化されたＮＴ単位は、レシピエントである雌に移入するのに好適なサイズにそれらが到達するまで培養してもよいし、または代替として（alternately）、ＮＴ単位は、即座にレシピエントである雌に移入してもよい。
胚の培養および成熟に好適な培養培地は当業界において周知である。胚の培養および維持に使用できる公知の培地の例としては、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１０＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、組織培養培地－１９９（ＴＣＭ－１９９）＋１０％ウシ胎児血清、タイロード（Tyrodes）－アルブミン－乳酸－ピルビン酸（Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate；ＴＡＬＰ）、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地、ＰＺＭ、ＮＣＳＵ２３およびＮＣＳＵ３７が挙げられる。Yoshioka K, Suzuki C, Tanaka A, Anas I M, Iwamura S. Biol Reprod. (2002) January; 66(1):112-9およびPetters R M, Wells K D. J Reprod Fertil Suppl. 1993; 48:61-73を参照されたい。
その後、培養した１つまたは複数のＮＴ単位を洗浄し、次いでウェルプレートに含有される好適な培地中に入れてもよく、ウェルプレートは、任意選択で好適なコンフルエントなフィーダー層を含有していてもよい。好適なフィーダー層としては、一例として、線維芽細胞および上皮細胞が挙げられる。ＮＴ単位がレシピエントである雌に移入するのに、または細胞コロニーを生産するのに使用できる細胞を得るのに好適なサイズに到達するまで、ＮＴ単位はフィーダー層上で培養される。ＮＴ単位は、少なくとも約２～４００個の細胞、約４～１２８個の細胞、または少なくとも約５０個の細胞まで、培養してもよい。代替として、ＮＴ単位は、即座にレシピエントである雌に移入してもよい。
本開示における胚移植およびレシピエント動物の管理のための方法は、胚移植産業に使用される標準的手順である。同期移植（synchronous transfer）は、本開示の成功にとって重要であり、すなわちＮＴ胚の段階は、レシピエントである雌の発情サイクルと同期的になされる。例えば、Siedel, G. E., Jr. (1981) “Critical review of embryo transfer procedures with cattle in Fertilization and Embryonic Development in Vitro, L. Mastroianni, Jr. and J. D. Biggers, ed., Plenum Press, New York, N.Y., page 323を参照されたい。豚胚移植は、当業界において公知の方法に従って実行することができる。参考として、Youngs et al. “Factors Influencing the Success of Embryo Transfer in the Pig,” Theriogenology (2002) 56: 1311-1320を参照されたい。
ＶＩＩ．多重トランスジェニック動物繁殖群
本開示の動物（または胎児）は、これらに限定されないが、核ドナーとして既存の細胞株、胎児、または動物からの細胞を使用する、ＳＣＮＴ、天然の繁殖、ＳＣＮＴを介した再誘導（rederivation）、任意選択で、ＮＴの前にこれらの細胞に追加の導入遺伝子を追加すること、逐次的な核移植、人工生殖技術（ＡＲＴ）またはこれらの方法もしくは他の当業界において公知の方法の任意の組合せから選択される群を含む手段に従って繁殖させることができる。一般的に、「繁殖させる」または「交配した」は、天然および人工の手段の両方を含む任意の生殖の手段を指す。さらに、本開示は、本明細書で開示された方法によって生産された動物の全ての後代を提供する。ある特定の実施形態において、このような後代は、本明細書に記載される遺伝子に関してホモ接合型になる可能性があることが理解される。
一実施形態において、多シストロン性ベクター設計によって生産された遺伝子改変された動物は、異なる多シストロン性ベクターによって生産された動物と交配させてもよい。特には、各多シストロン性ベクターは、４つの異なる導入遺伝子および２つの異なるプロモーター／エンハンサーシステムで構成されると予想される。
別の実施形態において、異なる多シストロン性ベクターを有する、したがって異なる導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、一緒に交配することができる、８つの異なる導入遺伝子に等しい遺伝子レパートリーを有していてもよく、この場合、これらの遺伝子の発現は、それらの異なるプロモーター／エンハンサーシステムの制御下にある。
ＶＩＩＩ．遺伝子改変された臓器、臓器断片、組織または細胞
一態様において、本開示は、本明細書で開示されたトランスジェニック動物（例えば、豚動物）から得られた臓器、臓器組織または細胞を提供する。一部の実施形態において、臓器は、肺、腎臓、または心臓である。一部の実施形態において、組織は、肺組織、腎臓組織、または心臓組織である。
選択された実施形態において、臓器は、腎臓、心臓、または肝臓である。一部の実施形態において、組織は、生存可能な、または生存不可能な、肝臓、脂肪、心臓、皮膚、真皮、結合組織、骨、骨誘導体、整形外科用の組織、硬膜、血管、または他の臓器からのものを含む他の任意の組織から誘導される。一部の実施形態において、肝臓から誘導される組織は、単離された肝細胞、または肝臓由来の幹細胞から選択される。一部の実施形態において、脂肪から得られた組織は、脂肪細胞または間葉幹細胞から選択される。一部の実施形態において、心臓組織から得られた組織は、心臓弁、心膜、心臓血管または他の誘導体（生存可能な、または生存不可能な）から選択される。
肺は、哺乳動物において血液と空気と間のガス交換のために最適化された大きいスポンジ状の臓器である。哺乳動物やより複雑な生命体において、２つの肺は、心臓の両側で背骨の近くに配置されている。各肺は、肺葉と呼ばれるセクションで構成されている。ヒトは、右の肺に３つの肺葉および左の肺に２つの肺葉を有する。ブタは、左の肺に２つの肺葉および右の肺に４つの肺葉を有する。ヒトの肺を含む哺乳動物の肺は、上皮とハニカム状になっており、肺それ自体の外表面積より合計でより一層大きい表面積を有する。豚肺は、ヒト肺に類似した細胞系統および組成を有する。
本開示のドナー動物（例えば、豚動物）は、これらに限定されないが、胎児、新生児、若年および成体などの発達のいずれの段階にあってもよい。一部の実施形態において、臓器または組織は、成体豚トランスジェニック動物から単離される。代替の実施形態において、臓器または組織は、胎児または新生児のトランスジェニック動物から単離される（例えば、Mandel (1999) J. Mol. Med. 77:155-60；Cardona, et al.(2006) Nat. Med. 12:304-6を参照）。
例示的な実施形態において、ドナー動物は、１０歳より下、９歳より下、８歳より下、７歳より下、６歳より下、５歳より下、４歳より下、３歳より下、２歳より下、または１歳より下であってもよい。一実施形態において、臓器または組織は、６歳より下のトランスジェニック動物から単離される。別の実施形態において、臓器または組織は、３歳より下のトランスジェニック動物から単離される。ドナー動物は、０～２歳、２～４歳、４～６歳、６～８歳、または８～１０歳の任意の年齢であってもよい。別の実施形態において、臓器または組織は、胎児のまたは新生児段階から単離される。別の実施形態において、臓器または組織は、新生児から６ヶ月の月齢のトランスジェニックブタから単離される。一実施形態において、臓器または組織は、胎児から２歳のトランスジェニック動物から単離される。特定の実施形態において、臓器または組織は、６ヶ月の月齢から２歳のトランスジェニック動物から単離され、さらに特定の実施形態において、７ヶ月の月齢から１歳のトランスジェニック動物から単離される。一実施形態において、臓器または組織は、２～３歳のトランスジェニック動物から単離される。別の実施形態において、臓器または組織は、ヒト移植レシピエントにとって最適なサイズを有する臓器または組織を提供するように体重（年齢ではなく）を一致させたトランスジェニック動物から単離され、そのようにして、前記ブタ臓器または組織は、レシピエント／患者の年齢、体重、および／または性別に応じてカスタマイズされたドナー動物から調達される。
ある特定の実施形態において、ドナーのトランスジェニック肺、心臓、腎臓または肝臓組織は、外科的に取り出される。外科的に取り出した後、ドナーの肺、心臓、腎臓または肝臓を、移植の前に、さらに処理または評価してもよい。
１．「異種肺のプレコンディショニング」または免疫コンディショニング
移植された肺の長期生存は、心臓、腎臓および肝臓などの他の臓器より劣っている。この肺移植後の劣った転帰は、多数の要因に関連する可能性があり、そのような要因はなかでも、主としてドナーが心停止後に脳死状態であることに起因する、虚血および再灌流（ＩＲＩ）傷害、虚血によって開始される炎症性の発作であるが、調達中の臓器修復の期間、低温での臓器保存などの要因も挙げられる。
その後、血流が再開されて肺組織に再び酸素供給されると、ＩＲＩは悪化する。それにさらに追い打ちをかけるように、新たに移植した肺は、他の移植した臓器と比較して、外科手術後に環境抗原に曝露され続け、これが部分的に生存率の低下の原因になり得る。移植した肺の環境抗原へのほぼ連続的な曝露は、免疫認識経路が活性化される固有の状況を作り出すことが提唱されており、そこで拒絶反応を引き起こし、おそらく炎症、組織の傷害およびＩＲＩの結果に対する感受性を増加させることから、生存率の増加に取り組むべきである。例示的な実施形態において、肺移植の寛容誘導のための戦略が考慮され、エクスビボの肺灌流を介した肺のリコンディショニングの非限定的な例は、より具体的には、移植した肺の長期生存を強化するための遺伝子療法剤としてＡｄｈＩＬ－１０が補充されたＳＴＥＥＮ溶液での肺の灌流である。１つのさらなる実施形態において、寛容は、ＣＤ４７と共に、またはそれなしで、「混合キメリズム」、胸骨から収集した骨髄、胸腺を介して誘導され得る。
２．エクスビボでの肺灌流
エクスビボでの肺灌流（ＥＶＬＰ）は、辺縁／傷害を受けた肺の機能が改善され、レシピエントへの埋め込み前重大な持続的な機能不全が確認できるように、ドナーから取り出した後、肺を評価およびリコンディショニングするために使用することができる。肺をエクスビボの回路（Ｔｏｒｏｎｔｏ ＸＶＩＶＯＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ）に入れ、生理学的な再評価のためにＳｔｅｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）を用いて正常温度で２～４時間灌流する。肺利用の決定に関して、エクスビボでの灌流評価中のデルタｐＯ２（ｐＯ２肺静脈ｐＯ２－肺動脈ｐＯ２）が＞４００ｍｍＨｇの肺が移植可能とみなされる。肺は、ｐＯ２＜４００ｍｍＨｇの場合、または以下の機能的なパラメーター：肺血管抵抗（ＰＶＲ）、動的コンプライアンスもしくは気道圧のいずれかにおいて＞１０％の悪化であることが実証された場合、移植に関して除外される。また、肺が、肺移植の外科医の臨床的な判断に基づき不適切とみなされる場合、それも移植に関して除外される。
一実施形態において、肺を高張性の無細胞血清で灌流することで、血管外区画から流体を引き出し浮腫性の肺を脱水し、そのようにして、ガス交換を改善することができ、最初のうちは移植に不適切と判断された肺を、使用に適するようにすることができる。
加えて、抗炎症性サイトカインを肺に注入して、炎症促進性サイトカイン生産を減少させるのに利用されるインターロイキン（ＩＬ）－１０の傷害修復およびベクターによって媒介される移入を促進する、細胞間肺胞上皮の密着結合の回復を促進する、酸素供給を改善する、ならびに血管抵抗を減少させることができる。感染を抑制する／排除するために、抗生物質を注入してもよい。
３．エクスビボでの肺灌流ベースの遺伝子治療－インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）
加えて、抗炎症性サイトカインを肺に注入して、炎症促進性サイトカイン生産を減少させるのに利用されるインターロイキン（ＩＬ）－１０の傷害修復およびベクターによって媒介される移入を促進する、細胞間肺胞上皮の密着結合の修復を促進する、酸素供給を改善する、ならびに血管抵抗を減少させることができる。
一実施形態において、エクスビボでの肺灌流は、一貫して発現されるアデノ－ＩＬ１０ベクターからＩＬ－１０を異種肺に送達するための送達メカニズムとして利用することができる。この実施形態は、従来の免疫抑制へのより低い曝露下での早期の炎症の優れた制御を提供することによって、トランスジェニック動物からの肺の移植を容易にする。加えて、抗ＩＬ６ｒ（抗生物質）は、従来の免疫抑制と共に肺移植部位に与え、従来の免疫抑制中止の成功を可能にする方法として寛容コンディショニングレジメンを用いて所定期間（約４ヶ月）後に繰り返してもよい。
４．寛容
異種肺および寛容：混合キメリズムの誘導は、移植前の５～７日間にわたる集中的な骨髄非破壊的なコンディショニングレジメンを使用する；死亡したドナーの状況における必要性に応じるためにこれを短くする試みは過度に毒性であり、寛容は不十分であった。まだ臨床的に実証されていないにもかかわらず、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞を枯渇させ、次いで炎症促進性サイトカインが最小化されるように骨髄移植のタイミングを計ることによる「遅延型の」寛容誘導が非ヒト霊長類腎臓移植実験で使用されてきた。
ＩＸ．処置方法
一態様において、本開示は、本明細書に記載される臓器、臓器断片、組織または細胞の異種間移植の方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、これらに限定されないが、本明細書に記載されるドナー動物の臓器、臓器断片、組織または細胞を対象に投与することを含む。ドナー動物は、豚であってもよい。対象または宿主は、霊長類、例えば、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）であってもよく、その例としては、これに限定されないが、ヒヒなどが挙げられる。宿主は、ヒトであってもよく、特に、移植によって治療的に影響を受ける可能性がある疾患または障害に罹っているヒトであってもよい。
例示的な実施形態において、本方法は、これらに限定されないが、本明細書に記載されるドナー動物からの肺または肺組織を宿主に投与することを含む。ドナー動物は、豚であってもよい。宿主は、霊長類、例えば、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）であってもよく、その例としては、これに限定されないが、ヒヒなどが挙げられる。宿主は、ヒトであってもよく、特に、肺疾患または障害に罹っているヒトであってもよい。
有利には、本開示によって提供されるトランスジェニック肺および肺組織は、当業界において公知の異種間移植に関連して改善された機能性を有する。一実施形態において、トランスジェニック肺は、ブタからヒトへの異種間移植のエクスビボモデルにおける生存を改善した。特定の実施形態において、トランスジェニック肺は、少なくとも約９０分、少なくとも約１２０分、もしくは少なくとも約１５０分、少なくとも約１８０分、少なくとも約２１０分、少なくとも約２４０分、少なくとも約２７０分、少なくとも約３００分、少なくとも約３３０分、少なくとも約３６０分またはそれより多く生存する。他の特定の実施形態において、トランスジェニック肺は、改変されていない豚肺より、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍長く、または少なくとも約２０倍長く生存する。
別の実施形態において、トランスジェニック肺は、生命を維持するインビボモデルにおいて機能および生存可能性を改善した。特定の実施形態において、本明細書で提供される肺または肺組織は、生命維持モデルで、少なくとも約１０時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、もしくは約３０時間またはそれより長くヒヒの生命を維持する。他の特定の実施形態において、トランスジェニック肺は、改変されていない豚肺より、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍長く、または少なくとも約２０倍長く生存する。
本発明の別の方法は、異種間移植の方法であって、本明細書で提供されるトランスジェニック肺または肺組織は、霊長類に移植され、移植した肺または組織は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間もしくは少なくとも約１２週間またはそれより長く生存する、方法である。
本発明のさらなる方法は、異種間移植の方法であって、本明細書で提供されるトランスジェニック肺または肺組織は、霊長類に移植され、移植した肺または組織は、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月の、少なくとも約１１ヶ月もしくは少なくとも約１２ヶ月、またはそれより多く生存する、方法である。
本発明の追加の方法は、異種間移植の方法であって、本明細書で提供されるトランスジェニック肺または肺組織は、霊長類に移植され、移植した肺または組織は、上述した通りの期間にわたり生存する、方法である。一実施形態において、肺異種間移植の生命維持モデルは、肺機能を評価するのに使用される。一実施形態において、生命維持モデルは、霊長類から片肺を取り出すこと、および本開示の豚ドナーからの片肺を霊長類レシピエントに移植することを含む。別の実施形態において、生命維持モデルは、霊長類から両肺を取り出すこと、および本開示の豚ドナーからの両肺を霊長類レシピエントに移植することを含む。さらなる実施形態において、両肺および心臓を霊長類から取り出し、本開示の豚の肺および心臓で置き換えることができる。本開示の実施形態において、生命を維持する肺機能の持続時間は、霊長類において評価することができる。
生命を維持する肺の機能の持続時間を評価するために、ブタから本開示の遺伝子改変された豚肺を回収してもよい。心臓－肺ブロックを切り出し、どちらか一方の肺、２つの肺または２つの肺と心臓を、霊長類への移植のために調製することができる。
霊長類レシピエントは、鎮静化され、全身麻酔下で維持される。次いで、当業界において公知の方法を使用して、片肺、両肺または心臓と両肺を霊長類から取り出し（例えば、Nguyen et al The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery May 2007; 133: 1354-63、およびKubicki et al International Journal of Surgery 2015: 1-8を参照）、霊長類に移植することができ、次いで霊長類を再灌流してもよい。移植片再灌流の前および後に、インビトロでの分析のために、予め決定されたタイムポイントで、血液および組織生検試料を連続的に収集してもよい。大動脈および左肺動脈の血管流量プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）は、それぞれ心拍出量および移植した臓器への流量を連続的に測定することができる。片肺のみが移植され、第２の肺は本来の霊長類肺のままであるモデルにおいて、本来の肺への血流は、移植した肺の生命を維持する能力を評価するために徐々に遮断してもよい。移植片生存は、生命を維持する肺の機能の持続時間と定義することができる。長期間の生存実験のために、大動脈および片肺の動脈に設置した流量プローブは、肺移植を通る血流のモニターを可能にする。国際心臓肺移植学会（The International Society for Heart and Lung Transplantation）は、ヒト治験を考察するために、例えばこのモデルなどのモデルにおける生命を維持する機能の３ヶ月の継続的な達成を推奨している（Kubicki et al International Journal of Surgery 2015: 1-8）。
本発明の１つの方法は、異種間移植の方法であり、本明細書で提供されるトランスジェニック肺または肺組織が霊長類に移植され、移植の後、霊長類は、免疫抑制療法を低減させるかまたはそれを必要としない。免疫抑制療法の低減または不要としては、これらに限定されないが、他の方法で必要とされる用量と比較した、免疫抑制薬／免疫抑制剤の用量の低減（またはその完全な排除）；他の方法で必要とされる数と比較した、免疫抑制薬／免疫抑制剤のタイプの数の低減（またはその完全な排除）；他の方法で必要とされる持続時間と比較した、免疫抑制処置の持続時間の低減（またはその完全な排除）；および／または他の方法で必要とされる維持免疫抑制剤と比較した、維持免疫抑制剤の低減（またはその完全な排除）が挙げられる。
本発明の方法はまた、肺疾患を処置または防止する方法も含み、本明細書で提供されるトランスジェニック肺または肺組織が霊長類に移植され、移植の後、霊長類は肺機能を改善する。移植した霊長類は、移植前のレベルと比較して、または他の方法を使用して達成されたレベルと比較して、改善した肺機能を有し得る。
本発明の方法はまた、トランスジェニック肺または肺組織の移植後に疾患を処置または防止する方法も含み、移植術、免疫抑制レジメン、および／または寛容を誘導するレジメンに関連する多数の、または重篤な生命を脅かす合併症はない。
一部の実施形態において、本方法は、宿主への抗炎症薬の投与の必要性を低減する。他の実施形態において、本方法は、宿主への抗凝血剤の投与の必要性を低減する。ある特定の実施形態において、本方法は、宿主への免疫抑制剤の投与の必要性を低減する。一部の実施形態において、宿主は、臓器（例えば、肺）、組織または細胞の投与の後、３０日未満、または２０日未満、または１０日未満、または５日未満、または４日未満、または３日未満、または２日未満、または１日未満にわたり、抗炎症剤を投与される。一部の実施形態において、宿主は、臓器（例えば、肺）、組織または細胞の投与の後、３０日未満、または２０日未満、または１０日未満、または５日未満、または４日未満、または３日未満、または２日未満、または１日未満にわたり、抗凝血剤を投与される。一部の実施形態において、宿主は、臓器（例えば、肺）、組織または細胞の投与の後、３０日未満、または２０日未満、または１０日未満、または５日未満、または４日未満、または３日未満、または２日未満、または１日未満にわたり、免疫抑制剤を投与される。
レシピエント（宿主）は、移植のときに、部分的もしくは完全に免疫抑制されていてもよいし、またはまったく免疫抑制されていなくてもよい。移植のときの前、その間および／またはその後に使用することができる免疫抑制剤／免疫抑制薬は、任意の当業者に公知のものであり、その例としては、これらに限定されないが、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０（２Ｃ１０Ｒ４抗体療法）、Mohiuddin MM. et al., Apr 5;7:11138. [2016]を参照、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ（アバタセプト／オレンシア）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（ゼナパックス）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（レミケード）、シクロスポリン、デオキシスペルグアリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、抗ＣＤ１５４－Ａｂ、レフルノミド、抗ＩＬ－２Ｒ－Ａｂ、ラパマイシン、およびヒト抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体が挙げられる。１種または１種より多くの免疫抑制剤／免疫抑制薬が、一緒に、または逐次的に使用されてもよい。１種または１種より多くの免疫抑制剤／免疫抑制薬が、導入療法または維持療法のために使用されてもよい。同一または異なる薬物が、誘導および維持段階の間に使用されてもよい。一実施形態において、ダクリズマブ（ゼナパックス）が、導入療法のために使用され、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）が、維持療法のために使用される。別の実施形態において、ダクリズマブ（ゼナパックス）が、導入療法のために使用され、低用量のタクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量のシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）が、維持療法のために使用される。
一実施形態において、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）が導入療法のために使用される。Teuteberg et al., Am J Transplantation, 10(2):382-388. 2010；van der Windt et al., 2009, Am. J. Transplantation 9(12):2716-2726. 2009；Shapiro, The Scientist, 20(5):43. 2006；Shapiro et al., N Engl J. Med. 355:1318-1330. 2006を参照されたい。免疫抑制はまた、これらに限定されないが、全身放射線照射、胸腺放射線照射、ならびに完全および／または部分的な脾臓切除術、「混合キメリズム」、胸骨から収集される骨髄、胸腺（Sachs, 2014）などの非薬物レジメンを使用して達成してもよい。これらの技術は、１種または複数の免疫抑制薬／免疫抑制剤と組み合わせて使用してもよい。
一部の実施形態において、ヒトは、その肺が酸素と二酸化炭素を交換するその生体機能を果たせなくなったとき、肺移植が必要になる。肺移植候補は、末期肺疾患を有し、余命が２年未満と予測されている。そのような候補は、連続的な酸素を必要とすることが多く、酸欠のために極度に疲れる。彼らの肺は、医学的に管理するには病状が重く、どのような外科手術も彼らを救えないであろう。
１．片肺移植
レシピエントが片肺移植を受けている場合、彼／彼女は、どの肺が置き換えられるかに応じて右側または左側のいずれかの開胸切開術を受けることになる。手術室にドナー肺が到着した後、外科医は、罹患した肺を取り出すことになる。レシピエントは、他方の肺を使用して肺呼吸することになる。残りの肺が十分な酸素を交換できない場合、外科医は、レシピエントに心肺バイパスを設置してもよい。彼らの血液は、体外の装置に通過させてろ過し、それにより、酸素が彼らの血液に入り、二酸化炭素が除去されることになる。
新しい肺を取り付けるのに３つの接続が使用されることになる。これらの接続は、吻合と呼ばれる。最初に、ドナー肺からの主要な気管支を、レシピエントの気管支に取り付ける。次いで血管を、最初に肺動脈、次いで肺静脈に取り付けた。最後に、切開部を閉じ、レシピエントは集中治療室に運ばれ、そこで彼／彼女は、およそ１２～２４時間眠ることになる。
２．両側肺または両肺移植
両肺を移植した場合（両肺移植）、外科医は、各乳房の下を切開し、これは前方開胸と呼ばれ、または乳房の付け根の右側から左側に切開する。これは、胸骨横断切開（transverse sternotomy incision）と呼ばれる。両肺移植において、それぞれの肺は別々に置き換えられる。外科医は、最も機能が劣っている肺を取り出すことから始める。レシピエントは、部分的な心肺バイパスが必要でない限り、彼らの残りの肺を使用して肺呼吸することになる。第１の肺が取り出されたら、ドナー肺を、３つの接続を使用して取り付けることになる。ドナー気管支をレシピエントの主要な気管支に取り付け、次いで血管を、最初に肺動脈、次いで肺静脈に取り付ける。レシピエントの第２の罹患した肺を除去し、他の新しい肺を同じようにして取り付ける。第２の肺が完全に連結されたら、血流を回復させる。トランスジェニック肺の肺組織または心臓－肺移植は、当業界において公知の任意の手段を使用して移植することができる。生着を可能にするのに十分な時間（例えば、１週間、３週間など）が提供され、成功した生着は、当業者に公知の任意の技術を使用して決定される。
これらの技術としては、これらに限定されないが、ドナーのＣペプチドレベルの評価、組織学的な研究、静脈内グルコース負荷試験、外因性インスリン要求試験、アルギニン刺激試験、グルカゴン刺激試験、ＩＥＱ／ｋｇ（膵島等量／ｋｇ）要求の試験、レシピエントにおける正常血糖の持久性に関する試験免疫抑制要求の試験、および移植した膵島の機能性に関する試験が挙げられる（Rood et al., Cell Transplantation, 15:89-104. 2006；Rood et al., Transplantation, 83:202-210. 2007；Dufrane and Gianello, Transplantation, 86:753-760. 2008；van der Windt et al., 2009, Am. J. Transplantation, 9(12):2716-2726. 2009を参照）。
１つまたは複数の技術を使用して、生着が成功しているかどうかを決定することができる。成功した生着は、処置なしの場合と比較して、または一部の実施形態において、移植のための他のアプローチと比較して成功した生着を指す場合もある（すなわち、生着は、移植のための他の方法／組織を使用した場合より成功している）。一部の場合で、成功した生着は、免疫抑制を追加せずに生命を維持する機能を含むドナーＣペプチドレベルの評価によって決定される。一実施形態において、本開示は、それを必要とする対象における肺疾患または障害を処置する方法であって、本開示のトランスジェニックブタから得られた肺またはその一部を対象に埋め込むことを含む方法を提供する。
肺疾患は、進行した肺疾患であってもよい。一実施形態において、進行した肺疾患は、原発性肺高血圧症（ＰＡＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、サルコイドーシス、気管支拡張症、特発性肺線維症（ＩＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、アルファ１－アンチトリプシン欠損症疾患に関連する。当業者によって理解されると予想されるように、原発性肺高血圧症（ＰＡＨ）は、肺の動脈における高血圧を指す。
当業者によって理解されると予想されるように、嚢胞性線維症は、両方の親が欠陥のある遺伝子を有する必要があることを意味する劣性遺伝する遺伝病を指す。およそ３０，０００人の米国人がＣＦを有し、約１２００万人が遺伝子を有するが、その影響を受けていない。ＣＦ患者は、気管支炎、気管支拡張症、肺炎、副鼻腔炎（副鼻腔の炎症）、鼻ポリープ（鼻の内部での成長）、または気胸（肺の虚脱）などの呼吸器の問題を有することが多い。ＣＦの症状としては、頻繁な喘鳴または肺炎、濃厚な粘液を伴う慢性の咳、持続的の下痢、塩気のある味がする皮膚、および不十分な成長が挙げられる。
当業者によって理解されると予想されるように、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、喘息、慢性気管支炎または肺気腫によって引き起こされる可能性があるものを指す。長期にわたり、ＣＯＰＤを有する個体はゆっくり自らの呼吸する能力を喪失する。ＣＯＰＤの症状は、慢性的な咳および痰の発生から、重度の生活に支障をきたす息切れまで及ぶ。
当業者によって理解されると予想されるように、アルファ１－アンチトリプシン疾患／アルファ－１アンチトリプシン欠損症は、肺を保護するアルファ－１アンチトリプシン－ａタンパク質の欠如が早発性の肺疾患をもたらす遺伝性の状態である。喫煙がこのリスクを大きく増加させる。アルファ－１関連の肺気腫の第１の症状は、２０歳～４０歳の間に出現することが多く、としては、活動後の息切れ、運動能力の減少、および喘鳴が挙げられる。
当業者によって理解されると予想されるように、間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、特発性肺線維症、サルコイドーシス、好酸球性肉芽腫、グッドパスチャー症候群、特発性肺ヘモジデリン沈着、およびヴェグナー肉芽腫症などの様々な慢性肺障害を含む一般用語である。ヒトがＩＬＤを有する場合、肺は、４つの方式で影響を受ける：１）肺組織が損傷を受けた状態になる、２）肺における肺胞嚢の壁が炎症を起こした状態になる、３）間質（肺胞嚢間の組織）において瘢痕化が始まる、および４）肺が硬くなる。
当業者によって理解されると予想されるように、サルコイドーシスは、複数の臓器で結節として形成され得る炎症細胞の異常な集合（肉芽腫）を含む疾患を指す。肉芽腫は、ほとんどの場合、肺またはそれに関連するリンパ節で生じる。当業者によって理解されると予想されるように、気管支拡張症は、気道の不可逆的な広がりを指す。気道が広くなると、気道はそれほど硬くなくなり、より崩壊しやすくなる。分泌物を除去することもより難しくなる。気管支拡張症は、生まれたときに存在する場合もあり、または傷害もしくは他の疾患（ほとんどの場合、嚢胞性線維症）の結果として後で発症する場合もある。気管支拡張症は、任意の年齢で発生するが、ほとんどの場合幼児期に始まる。気管支拡張症の症状としては、咳、発熱、衰弱、体重の減少、および疲労が挙げられる。
一実施形態において、本方法は、１種または複数の治療剤を対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、１種または複数の治療剤は、拒絶反応抑制剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗微生物剤、抗ウイルス物質、およびそれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、移植は、片肺または両肺（両側肺）移植を含んでいてもよい。
移植はまた、末期の心臓および肺疾患を有する患者における心臓と肺の同時の外科的置き換えである心肺移植または心臓－肺移植を含み得る。この手順は未だに、特定の病的状態にある患者にとって見込みのある代替治療法である。心肺移植を必要とする末期の心肺不全の原因は、先天性心疾患から特発性の原因に及び、その例としては、以下：肺高血圧症（アイゼンメンゲル症候群）を伴う回復不能な先天性心奇形、不可逆的な右心不全を伴う原発性肺高血圧症；心臓および肺のみが関与するサルコイドーシスが挙げられる。
[実施例１]
ベクター構築およびバイシストロン性ベクターを使用したブタの生成
ベクターの構築
単一のプロモーターを共有する２Ａペプチド配列によって連結された２つの導入遺伝子からなる複数のバイシストロン性単位を合成した。２Ａ配列の２つの形態、Ｐ２Ａ（６６ｂｐ）およびＴ２Ａ（５５ｂｐ）を利用して、導入遺伝子の対を連結して、１つのプロモーターから両方の遺伝子を共発現させた。導入遺伝子とプロモーターの異なる組合せを使用して多数の２つの導入遺伝子単位（バイシストロン）を作製した。プロモーターは、構成的ＣＡＧプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、ニワトリアクチンプロモーター、ウサギβ－グロビンイントロン１プロモーター；豚ＩＣＡＭ－２（ｐＩＣＡＭ２）および豚トロンボモジュリンのための内皮特異的プロモーター；またはＴｉｅ２内皮特異的なエンハンサーとＣＡＧプロモーターの組合せのいずれかであった。ある特定のバイシストロン性ベクターに、トロンボモジュリン（ＴＢＭ）、ＣＤ３９、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、Ａ２０、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＩＩＴＡ、ＨＯ１、ＴＦＰＩを含むヒト導入遺伝子の対を構築し（２Ａ配列によって連結された）、豚ＣＴＬＡ４－Ｉｇも含めた。
多シストロン性ベクターを、ａ）豚ＩＣＡＭ－２エンハンサー／プロモーターおよびｂ）構成的ＣＡＧプロモーターの後ろのクローニング部位で操作した。図１を参照されたい。このベクターは、２つのバイシストロン性単位の挿入を可能にし、これらの単位の間と端部に絶縁物を設けた。数々の多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）を構築し、それにおいて、各バイシストロン性は、２Ａペプチド配列と対合し、それにより連結された機構的に関連する遺伝子のレパートリーから引き出されたそれ自体のプロモーターによって調節された。
バイシストロン性ベクターを使用したブタの生成
遺伝子型：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇＥＰＣＲ．ＤＡＦ．ｃａｇＴＦＰＩ．ＣＤ４７。バイシストロン性ベクター（ＣＡＧプロモーターの制御下に）を有するブタを生産した。ある特定の系列において、２つのバイシストロンを、同様にヒトＣＤ４６補体阻害剤遺伝子（ＧＴＫＯ．ＣＤ４６）に関してトランスジェニックのアルファＧａｌノックアウト（ＧＴＫＯ）ブタ線維芽細胞に取り込ませた（トランスフェクションおよびランダムな組込みによって）。このような多重遺伝子線維芽細胞を、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）に使用して、クローニングしたトランスジェニックブタを生産した。ＣＡＧプロモーターの制御下で２つのバイシストロン（ＣＡＧ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦおよびＣＡＧ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７）として４つ全てのＭＣＶ遺伝子をロバストに発現するトランスジェニックブタの単一の系列を使用して、非ヒト霊長類（ヒヒ）での臓器移植実験における使用のための数種のブタを生産した。
遺伝子型「ＣＡＧ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦおよびＣＡＧ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７」を有する多重トランスジェニックブタは、腎臓、心臓、および肺移植において効能を実証した。インビボでの肺処置モデルで、複数のブタが＞３０時間の生命維持を提供した。遺伝子型「ＧＴＫＯ．ｈＣＤ４６．ｈＤＡＦ．ｈＥＰＣＲ．ｈＣＤ４７．ｈＴＦＰＩ」を有するブタからの肺を受けたヒヒは、軽度の体液貯留（浮腫）および変力物質の必要のみを提示し、これは、３つの遺伝学的改変（ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＴＢＭ）を有するブタを用いた過去の実験で高頻度で見られた進行性異種移植片傷害および生理学的な逸脱（腹水、体積の増大および変力物質の必要、本来の（ヒヒ）肺の浮腫）とは対照的であった。これらの最長の生存実験からのブタ肺は、拒絶反応の兆候がなく肉眼的にも顕微鏡でも著しく正常のように見えた。
他のブタ臓器のヒヒへの移植研究において、この６ＧＥ遺伝子型は、心移植の生存時間を延長し（異所性Ｔｘにおいて＞６ヶ月の生存）、各臓器モデルの２つの連続した移植（心臓および腎臓）において、同所性の腎臓Ｔｘは＞８ヶ月の生存を示した。比較において、生命を維持する同所性腎臓Ｔｘモデルの場合、３遺伝子ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＴＢＭブタ（３ＧＥ）からの腎臓を使用した場合、わずか＜３ヶ月の生存しか達成されなかった。
この６遺伝子系列（６ＧＥ）は、大動脈内皮細胞のフローサイトメトリー（図２）、または各ヒトトランスジェニックタンパク質に特異的な抗体を使用して別々に染色された免疫組織化学（図３）の両方によれば、全てのＭＣＶ導入遺伝子を強く発現した。近年、この系列の成熟期までの生存率は、成熟した健康な１歳のイノシシで実証されており、このイノシシは現在、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６雌と交配されている。
さらなる系列の拡大のために、この系列を、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＴＢＭ、またはＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＣＩＩＴＡ、またはＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＣＭＡＨ－ＫＯである３種のＧＥブタと交配して、このような遺伝子型の複数の組合せ、ならびに雄および雌から７種のＧＥブタ（７ＧＥ）の群を生産した。
[実施例２]
遺伝子改変されたブタの生産のための多シストロン性ベクターの構築。
６ＧＥブタの生産のために多シストロン性「２Ａ」ベクター（ＭＣＶ）を使用し、４遺伝子ベクター（２つのバイシストロン、それにおいて、それぞれの発現は別個のプロモーターの制御下であった）を採用することによって、よく特徴付けられたＧＴＫＯ．ｈＣＤ４６細胞にトランスフェクトし、次いでこれを、体細胞核移植のために使用した。遺伝子型をサザン分析によって決定した。遺伝子発現を、ＰＢＭＣおよび内皮細胞のフローサイトメトリーによってモニターし、細胞および臓器においては、免疫組織化学、Ｑ－ＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）およびウェスタンブロット分析によってモニターした。補体阻害、血小板凝集、活性化プロテインＣ形成、ＡＴＰアーゼ活性、第Ｘａ因子切断、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）およびアポトーシスを定量化し、それらを特徴付けるために、導入遺伝子に特異的な生物活性アッセイを開発した。これらのアッセイで、予測された遺伝子型および全ての導入遺伝子のロバストな発現を有するブタを同定し、異種間移植のエクスビボおよびインビボモデルの両方で使用した。
多シストロン性ベクターのタイプ：
１８種の多シストロン性ベクターを生成し、これらの生物活性導入遺伝子の異なる組合せを有するブタを生産するのに使用した（図４を参照）。ほとんどの場合、遺伝子の１つの対が、末端特異的なｐＩＣＡＭ－２プロモーターの制御下で、発現され、同じベクターで、構成的ＣＡＧプロモーターを介して２つの他の遺伝子（第二のバイシストロン性）が発現された。しかしながら、ＭＣＶベクターｐＲＥＶ９９９では、利用された両方のプロモーターはＣＡＧであった。バイシストロンを分離し、ゲノム組込み部位に関する全ての作用を最小化するために、さらに、各バイシストロンに存在する調節配列間のクロストークを制限するためにも、インシュレーター配列を隣接させた（図４では、二重矢印で表される）。
図４は、ＧＴＫＯ、補体調節遺伝子ｈＣＤ４６またはＣＤ５５を含む６つの遺伝学的改変を、抗凝血剤遺伝子であるトロンボモジュリン（ＴＢＭ）、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ３９、および組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、免疫抑制遺伝子である豚細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４（ｐＣＴＬＡ４Ｉｇ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体ドミナントネガティブ（ＣＩＩＴＡ－ＤＮ）、および／または抗炎症導入遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ１）、Ａ２０、ＣＤ４７の内皮特異的もしくは偏在的な発現と組み合わせて有するブタの生産のために使用される発現カセットを示す。
[実施例３]
６つの遺伝学的改変を有する豚動物（６ＧＥ）の生産
直鎖状ＭＣＶ４遺伝子断片（図４）を、ＧＴＫＯ（アルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト）またはＧＴＫＯ．ＣＤ４６（アルファ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトおよびＣＤ４６の偏在的な発現）プラットフォーム遺伝学を有する豚胎児線維芽細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクトされた細胞を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって、ＣＡＧプロモーターの後に発現された両方の遺伝子に関して選択し、これらのソートされた細胞を、体細胞核移植（ＳＣＮＴまたはクローニング）のための核ドナーとして使用した。融合した胎児を複数のレシピエント未経産雌ブタに移入し（１つのＭＣＶ当たり８～１０匹の未経産雌ブタ）、妊娠を分娩までモニターした。
これらのＭＣＶエレメントを発現するブタを、遺伝子組合せのうち数種から生産した。生存可能なブタにおけるロバストな発現を提供した４遺伝子ＭＣＶ組合せのうち４つは、以下が含まれた：ｐＲＥＶ９４１：ＥＰＣＲ－ＣＤ５５－ＴＢＭ－ＣＤ３９；ｐＲＥＶ９７１：ＥＰＣＲ－ＨＯ－１－ＴＢＭ－ＣＤ４７；ｐＲＥＶ９６７：ＥＰＣＲ－ＨＯ－１－ＴＢＭ－ＴＦＰＩ；ｐＲＥＶ９５８：ＥＰＣＲ－ＣＤ５５－ＴＦＰＩ－ＣＤ４７。
ベクター構造に応じて、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９およびＣＤ４７、ＨＯ－１の発現を、内皮特異的なプロモーターである豚Ｉｃａｍ－２によって駆動させた。ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、およびＨＯ－１の発現を、構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動させた。
これらの６ＧＥブタの遺伝学は以下の通りであった：
ｐＲＥＶ９４１：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＣＤ５５．ＴＢＭ．ＣＤ３９
ｐＲＥＶ９７１：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＨＯ－１．ＴＢＭ．ＣＤ４７
ｐＲＥＶ９６７：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＨＯ－１．ＴＢＭ．ＴＦＰＩ
ｐＲＥＶ９５８：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＣＤ５５．ＴＦＰＩ．ＣＤ４７。
以下の遺伝子型を有する追加の６ＧＥブタを生成した：
ｐＲＥＶ９４４：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７
ｐＲＥＶ９４９：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７
ｐＲＥＶ９５０：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１
ｐＲＥＶ９５１：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１
ｐＲＥＶ９５２：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１
ｐＲＥＶ９５３：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５
ｐＲＥＶ９５４：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ
ｐＲＥＶ９５５：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ
ｐＲＥＶ９５６：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ
ｐＲＥＶ９５７：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ
ｐＲＥＶ９５８：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ
ｐＲＥＶ９６６：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１
ｐＲＥＶ９６８：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７
ｐＲＥＶ９７２：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ
ｐＲＥＶ９７３：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７
ｐＲＥＶ９８７：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１
ｐＲＥＶ９９９：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７。
[実施例４]
６ＧＥブタからの臓器の生存および機能
ｐＲＥＶ９４１：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＣＤ５５．ＴＢＭ．ＣＤ３９。この６遺伝子の遺伝子型の数々のファウンダーブタを生産し、肺、心臓、および腎臓移植に使用した。１つのファウンダーは、ブタから非ヒト霊長類（ＮＨＰ）へのインビボ肺モデルにおいて、１２時間の生命維持を提供した。第２のファウンダーは、インビボ肺Ｔｘモデルにおいて、７時間の生命維持を提供した。第３のファウンダーは、非ヒト霊長類において５ヶ月より長く継続する心臓を提供した。全ての６つの遺伝子を優れて発現するファウンダーの１つ（図４を参照）を再クローニングし、後代のいくつかを、ヒヒモデルでのインビボにおける移植（Ｔｘ）のための臓器ドナーとして使用したところ、１０ヶ月継続する異所性心移植が含まれていた。この系列をインビボでの肺移植に使用したところ、７時間の生命維持機能が示された。
ｐＲＥＶ９７１：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＨＯ－１．ＴＢＭ．ＣＤ４７。３つのファウンダーブタ、加えてこの遺伝子型を有する３つの再クローニングしたブタを生産した。この遺伝子型を有する追加のブタは子宮内であった。６つ全ての遺伝子を発現するファウンダーのうちの１つは、肺移植（Ｔｘ）のインビボモデルにおいて、およそ２４時間の生命維持を提供した。浮腫または血栓は報告されなかった。この高発現系列の再クローンを、ファウンダー動物から調達した腎臓細胞からのＳＣＮＴによって生産した。移植研究を実行して、Ｔｘ前および移植の経過中における免疫抑制療法を試験する。追加の処置を、免疫抑制薬、例えばヒトアルファ－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）の投与と共に使用して、炎症およびクロドロン酸内包リポソームを低減して、ヒヒモデルへの移植の前にドナー肺から常在マクロファージを枯渇させる。
ｐＲＥＶ９６７：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＨＯ－１．ＴＢＭ．ＴＦＰＩ。８つの生存可能なファウンダーブタを生産した。これらのブタのうちの１つの再クローンを用いて、２つの追加の妊娠を確立した。
ｐＲＥＶ９５８：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＥＰＣＲ．ＣＤ５５．ＴＦＰＩ．ＣＤ４７。ＴＦＰＩ＋ＣＤ４７の発現を駆動させるのにｐＩＣＡＭ－２プロモーターを利用し、ＥＰＣＲ＋ＤＡＦの発現を駆動させるのにＣＡＧプロモーターを利用した遺伝子型「ｐＲＥＶ９５８」の４遺伝子ＭＣＶバージョン（図４）を構築し、これを利用して、類似の、ただし単一の遺伝子座に４つ全ての遺伝子が組み込まれた４遺伝子ＭＣＶとして遺伝子型を生産した。２匹のレシピエントヒヒは、ｐＲＥＶ９５８遺伝子型を有するブタから得られた豚肺を受け、移植後に回復させ、抜管し、経過観察したところ、最大８日間の生存が実証された。これは、非ヒト霊長類におけるインビボの異種肺の最長の生存の記録である。
また、４つ全ての遺伝子が単一の遺伝子座に組み込まれた以下の４遺伝子ＭＣＶ、ｐＲＥＶ９４４：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ｐＲＥＶ９４９：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；ｐＲＥＶ９５０：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ｐＲＥＶ９５１：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１；ｐＲＥＶ９５２：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；ｐＲＥＶ９５３：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５；ｐＲＥＶ９５４：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ｐＲＥＶ９５５：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ｐＲＥＶ９５６：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ｐＲＥＶ９５７：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ｐＲＥＶ９５８：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；ｐＲＥＶ９６６：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１；ｐＲＥＶ９６８：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７；ｐＲＥＶ９７２：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ；ｐＲＥＶ９７３：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７；ｐＲＥＶ９８７：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１；ｐＲＥＶ９９９：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７のいずれかを含むトランスジェニック動物も生成し、試験した。ｐＲＥＶ９５８に関して示した通り、これらの６ＧＥトランスジェニックブタから得られた豚肺を受けたレシピエントヒヒは、異種間移植後、最大８日間生き残った。
[実施例５]
オリゴヌクレオチド「ランディングパッド」のＧａｌ遺伝子座への標的化された挿入
アルファＧａｌ遺伝子座へのＣＲＩＳＰＲによって強化された標的化された組込みを意図した合成されたＤＮＡ断片を、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６トランスジェニックブタのこの系列内の改変されたネイティブのアルファＧａｌ遺伝子座に埋め込まれたＮｅｏｒ選択可能なマーカー遺伝子を標的化するために操作により作製された（Dai et.al. 2002. Nature Biotechnologyを参照）。この「ランディングパッド」断片は１００ｂｐであり、リコンビナーゼ／インテグラーゼ媒介部位特異的組換えのための２つの部位、すなわちｐｈｉ－Ｃ３１およびＢｘｂＩａｔｔＰ部位を含有しており、改変されたアルファＧａｌでの標的化された組込みに特異的な５０ｂｐの相同アームが隣接していた。特定のＭＣＶ（このようなａｔｔ部位が隣接する）に含まれ、その後、アルファＧａｌ遺伝子座に組み込まれた複数の導入遺伝子は、繁殖中に、ＭＣＶ内の他の導入遺伝子だけでなく、アルファＧａｌノックアウト遺伝子型とも共分離する。このランディングパッドオリゴヌクレオチドを、改変されたＧａｌ遺伝子座内に二本鎖切断を導入するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＤＮＡベクターと組み合わせて、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６線維芽細胞にトランスフェクトした。
アルファＧａｌにおいてこのリコンビナーゼ／インテグラーゼ「ランディングパッド」断片のＣＲＩＳＰＲ支援標的化組込みを有する２つのＧＴＫＯ．ＣＤ４６胎児線維芽細胞クローンが、ロングレンジＰＣＲ分析によって同定され、二対立遺伝子の標的化された組込みを有することが確認された。胎児収集およびこの約２００ｂｐ断片の正確な組込みの確認のために、これらのクローンのうちの１つを用いて６つのレシピエントへの核移植を行った。
この小さいランディングパッド断片がＧａｌ遺伝子座に挿入された細胞株を使用して、１つの妊娠から得られた２つの胎児を生産した。両側の挿入された断片および隣接配列を表すアンプライマーを生産したＤＮＡを、胎児およびロングレンジＰＣＲの両方から単離し、両方の胎児が、Ｇａｌ遺伝子座におけるランディングパッド（ｐｈｉＣ３１およびＢｘｂＩ ａｔｔＰ部位のホモ接合型ノックイン）の二対立遺伝子の組込みを有していたことを確認した。
[実施例６]
Ｇａｌ相同アームを有するＧＴＫＯ．ＣＤ４６ｈｏｍ＋ＴＢＭ．ＣＤ３９．ＥＰＣＲ．ＤＡＦ（９４１ＨＤＲ）
改変されたアルファＧａｌ遺伝子座内に配置されたｎｅｏ遺伝子を、ランディングパッドとして使用した。アルファＧａｌ遺伝子座は、ブタ中のほとんどの細胞系統ならびに全ての臓器および組織において強く発現されることが公知である。４つの導入遺伝子の安定で一貫した発現のために、ＣＲＩＳＰＲ支援相同組換えを使用して、４遺伝子ＭＣＶベクターをＧａｌ遺伝子座にうまく標的化した。
このような組換えはまた、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）としても公知である。この断片は、約５００ｂｐのＮｅｏｒ遺伝子相同アームが隣接するｐＲＥＶ９４１ ＭＣＶからなり（改変されたＧａｌ遺伝子座内に配置される）、ΦＣ３１およびＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位もこのベクターに含まれており、将来の改変のためのＭＣＶからのリコンビナーゼ媒介交換を可能になった（図７）。この９４１ｈｄｒベクターを、Ｎｅｏ－Ｇａｌ ＣＲＩＳＰＲガイドＤＮＡベクターと共に、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６胎児線維芽細胞にトランスフェクトした。２つの細胞クローンを、５’および３’ジャンクションＰＣＲ、ならびにジャンクションのＤＮＡシーケンシングによって同定し、ＭＣＶ９４１断片の正確な組込みを確認した。１つの遺伝子編集される細胞株は、単一対立遺伝子を有し、第２の細胞クローンは、アルファＧａｌ遺伝子座への、１４ｋｂのｐＲＥＶ９４１ ＭＣＶの二対立遺伝子の標的化された挿入を有していた。両方の細胞クローンを混合し、ＳＣＮＴのために使用し、９つの胚移入を実行した。９匹の生きたブタを、３つの妊娠から生産したところ、二対立遺伝子の組込みが、アルファＧａｌ遺伝子座におけるｐＲＥＶ９４１ ＭＣＶのＤＮＡ配列によって確認された。単一対立遺伝子の組込みから得られた標的化されたブタは生産されなかった。
ブタを安楽死させ、このブタからの試料を、肺における免疫組織化学（ＩＨＣ）による（図９）、さらに、複数の臓器におけるウェスタンブロット分析による（図１０）導入遺伝子発現の特徴付けのために使用した。アルファＧａｌ遺伝子座におけるこのｐＲＥＶ９４１ ＭＣＶの標的化された組込みを有する残りの８匹のブタを繁殖させた。
[実施例７]
Ｇａｌ相同アームを有するＧＴＫＯ．ＣＤ４６ｈｏｍ＋ＥＰＣＲ．ＨＯ－１．ＴＢＭ．ＣＤ４７（ｐＲＥＶ９７１ＨＤＲ）
ｐＲＥＶ９５８、ｐＲＥＶ９４１、ｐＲＥＶ９７１、およびｐＲＥＶ９５４などの複数のＭＣＶベクターを、隣接する相同アームを有するように改変して、遺伝子編集ツールの利用を可能にした。ＬＲ－ＰＣＲ、ジャンクションＰＣＲ（アルファＧａｌ遺伝子座への）、およびＤＮＡシーケンシングによって示されるように、ｐＲＥＶ９７１の標的化された挿入を有する２つの細胞クローンを同定した。標的化された９７１ＨＤＲコロニー（Ｉｃａｍ－ＴＢＭ．２Ａ．ＣＤ４７－ＣＡＧ．ＥＰＣＲ．２Ａ．ＨＯ１）のプールをＳＣＮＴのために使用し、再構成した胎児を１２個のレシピエントに導入した。この努力から６つの妊娠が生じ、そのうちの１つを胎児単離に使用した。１つの妊娠からの８つ全ての胎児をロングレンジＰＣＲによって分析し、ｐＲＥＶ９７１ＭＣＶベクターに関して単一対立遺伝子の標的化されたノックインであることを決定した。
加えて、新生児ブタにおける発現に関する予測として、未熟児ブタにおけるＭＣＶ遺伝子の胎児発現を調べる能力に基づいて、収集した胎児をこのような推定のノックイン事象に用いた。フローサイトメトリーによる肺微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ）における発現は、ｐＲＥＶ９７１－ＨＤＲ標的化胎児において、ＴＢＭおよびＣＤ４７に関して確認され、ＨＯ１およびＥＰＣＲでは陰性対照と比較してより高いレベルであった（図１１Ｂ）。さらにＥＬＩＳＡアッセイも実行して、ランダムな組込みＭＣＶブタ（ｐＲＥＶ９４１を有するブタ７５６．１およびｐＲＥＶ９７１を有するブタ８３０－３）、それに対するｐＲＥＶ９４１－ＨＤＲ（ブタ８７５－５）におけるＴＢＭ発現を比較したところ、ｗｈｅｒｅ場合７５６－１を除く全てが、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるこれらの遺伝子これらの遺伝子の発現と同等であった。
[実施例８]
ｖＷＦ改変
豚ｖＷＦの改変を実行して、豚ｖＷＦによる自発的なヒト血小板活性化に関与する特異的な領域に「ヒト化」をもたらした。ｈｖＷＦにおけるＧＰ１ｂ結合部位のフォールディングおよび捕捉に関連する豚ｖＷＦ領域（Ｄ３ドメイン）、加えて、ＧＰ１ｂ受容体（Ａ１ドメイン）、およびＡＤＡＭＴＳ１３切断部位（Ａ２ドメイン）とのコラーゲン結合（２つの領域のうち１つ）に関連する領域を改変するために、Ｄ３（部分的）、Ａ１、Ａ２、Ａ３（部分的）ドメイン内の領域を選択した。エクソン２２～２８は、これらの領域を包含し、したがって、これらの７つのヒトエクソンは、ｃＤＮＡ断片（ヒトイントロンを含まない）として提供され、同時に遺伝子標的化によって等価な豚ゲノム領域は除去された。得られた遺伝子の置き換え戦略により、豚ｖＷＦ遺伝子座を他の状態に改変することなく、ｖＷＦのキメラヒト－ブタエクソン２２～２８領域が作り出された。（図１７）
ヒトエクソン２２～２８をコードするＤＮＡ断片を合成し、５’末端に豚ｖＷＦイントロン２１に相同なゲノムＤＮＡ相同アームを、３’末端に豚ｖＷＦイントロン２８を隣接させた。この標的化ベクターはまた、標的化ベクターの組込みを選択し、それを富化するためのＧＦＰおよびピューロマイシン抵抗性遺伝子の両方も含有していた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを、交換され置き換えられるべき断片の末端の両方に直接隣接した豚ゲノム配列と結合してそれを切断することで、二本鎖切断が生じるように設計した。ＣＲＩＳＰＲ支援相同組換えを使用して、豚ＧＴＫＯ．ＣＤ４６線維芽細胞における、ｖＷＦ標的化ベクターと共に、２つのＣＲＩＳＰＲベクターと同時トランスフェクションすることによって豚ｖＷＦ遺伝子座にヒトエクソン２２～２８ｖＷＦ断片を組み込んだ（図１２）。ピューロマイシン耐性コロニーを、ジャンクションＰＣＲ、ロングレンジＰＣＲによってスクリーニングし、５’および３’標的化ジャンクション領域をシーケンシングして、適した標的化を確認した。二倍体線維芽細胞における豚ｖＷＦのうちの一方のみへのヒトｖＷＦ領域の単一対立遺伝子ノックインは予想された結果であったが、本発明者らは驚いたことに、２２～２８領域の二対立遺伝子置き換えを有する１つの細胞株（豚ゲノムＤＮＡの欠失およびヒト領域での置き換え）を得た。上述した自発的な血小板凝集に関与するこのヒト断片で置き換えられた領域、およびヒト化エクソンは、ゲノム断片というよりはｃＤＮＡの形態であった。二対立遺伝子ノックイン細胞株（エクソン２２～２８遺伝子置き換えについてホモ接合型）をＳＣＮＴに使用し、妊娠が生じ、ｄ３５胎児を収集して、胎児細胞を得た。
適した二対立遺伝子標的化置き換えが胎児細胞株で確認され、これを後続のステップのために預けた。フレーム内でヒト－ブタＤＮＡを正確に融合させるために、ｈｖＷＦノックイン細胞をトランスポゼースで処置し、標的化ベクター中に埋め込まれた選択因子（ＧＦＰおよびｐｕｒｏ）を正確に切り出した。豚－ヒトキメラｖＷＦ領域の切り出しおよび適したフレーム内融合を、蛍光（florescence）活性化セルソーティングを介してＧＦＰ遺伝子の喪失によってモニターした。切り出した線維芽細胞のプールをＳＣＮＴに使用したところ、５つの妊娠が生じた。２つの妊娠を堕胎させ、これを使用して、さらなる遺伝子型解析分析および再クローニングのための胎児細胞を調製した。得られた８つの胎児のうち、４つは切り出し事象に関して単一対立遺伝子であり、４つは二対立遺伝子であり、シーケンシングされた全ての切り出し事象は、隣接する豚ｖＷＦゲノム配列を有するヒト配列の完全なフレーム内アライメント（図１３を参照）、加えて選択因子の完全な切り出しを示した。２つの妊娠は臨月になり、３匹の生きた健康なブタが生まれた。遺伝子型解析から、そのブタのうち２匹は、単一対立遺伝子の切り出しを有し、そのブタのうち１匹は、二対立遺伝子の切り出しを有し、両方の対立遺伝子は、エクソン２２～２８におけるヒトブタ融合体であったことが示された。
遺伝子型的にヒト化されたキメラｖＷＦは設計通りであった。単量体の切り出されたブタに関して、ＧＦＰ－ピューロマイシン選択カセットを用いた豚ｖＷＦ遺伝子の中断によって１つの対立遺伝子はヌルであったが、それでもなおエクソン２２（５２のエクソンを有する遺伝子のうち）で組み込まれ、一方で他の対立遺伝子は、改変されたキメラｖＷＦ対立遺伝子を有していた。ヒトおよび豚ｖＷＦの両方と交差反応する抗体を用いたウェスタンブロット分析は、単一対立遺伝子および二対立遺伝子が切り出されたブタの両方の血液中で全長ｖＷＦタンパク質が生成したが、単一対立遺伝子が切り出されたブタのみ、切り出されていない対立遺伝子の不活性化のためにｖＷＦの５０％のレベルになったことを示した。
ＶＷＦ編集（ヒト化キメラｖＷＦ）および対照ＧＴＫＯ．ｈＣＤ４６動物からの新たに引き出したクエン酸添加豚全血を、Ｃｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ全血アグリゴメーターを使用して試験した。コラーゲンアゴニスト（２ｕｇ／ｍＬ）での処置は、ｖＷＦ編集血液の凝集を引き起こしたことから、コラーゲンと結合し、血小板凝集を刺激するｖＷＦタンパク質を生産するその能力において、ＶＷＦ編集遺伝子型が機能的であることが確認された（ｎ＝３）。同時に、ＧＴＫＯ．ｈＣＤ４６全血（正常なｖＷＦ）を試験したところ、単一対立遺伝子のｖＷＦ編集血液より５０％高い凝集を示した（ｎ＝２）。図１４を参照されたい。
加えて、ヒト血小板の自発的な凝集を同定した。曝露されたｖＷＦ編集豚乏血小板血漿豚乏血小板血漿（ＰＰＰ）を、２ステップの遠心分離プロトコールを使用して、クエン酸抗凝血処理された豚血液試料から調製した。ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）を、新たに採取したヒト血液試料（クエン酸抗凝血処理された）から調製した。ヒトＰＲＰを、チューブ中で豚ＰＰＰと１：１で混合し、血小板の凝集を、Ｃｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ全血アグリゴメーターを使用して即座に記録した。ｖＷＦ編集遺伝子型の動物８７１．２からのＰＰＰをヒトＰＲＰと混合したところ、自発的な血小板凝集はなかった（ｎ＝１）。対照的に、ＧＫＯ．ｈＣＤ４６遺伝子型を有する動物（改変されていない豚ｖＷＦ）からのＰＰＰをヒトＰＲＰと混合したところ、ヒト血小板の自発的な凝集が起こった（ｎ＝２）。ヒト化キメラｖＷＦ編集ブタからの血漿と共に使用される場合のヒト血小板の自発的な凝集の明確な欠如は、意図した表現型の直接の機能的な証拠を提供した。ヒト化キメラｖＷＦ編集ブタは、エクスビボでの肺灌流（ヒト血液での）、およびインビボでのヒヒにおける非ヒト霊長類の移植の両方において、ブタからの臓器（肺および他の臓器）を使用して試験することができる。
ＶｖＷＦ編集遺伝子型の動物８７１．２からのＰＰＰをヒトＰＲＰと混合したところ、自発的な血小板凝集はなかった（ｎ＝１）。対照的に、ＧＫＯ．ｈＣＤ４６遺伝子型を有する動物（改変されていない豚ｖＷＦ）からのＰＰＰをヒトＰＲＰと混合したところ、ヒト血小板の自発的な凝集が起こった（ｎ＝２）。このようなヒト化キメラｖＷＦ編集ブタからの血漿と共に使用される場合のヒト血小板の自発的な凝集の明確な欠如は、意図した表現型の直接の機能的な証拠を提供し、前臨床モデルにおける改変の効能を決定するために、このようなエクスビボでの肺灌流（ヒト血液での）、およびインビボでのヒヒにおける非ヒト霊長類の移植の両方におけるヒト化ブタからの臓器（肺および他の臓器）を使用して試験することができる。
ＧＴＫＯ．ＣＤ４６のバックグラウンドにｐＲＥＶ９７１のランダムな組込みを有する、６つのＧＥ系列を高発現する再クローンを使用して、これらのより進歩した遺伝学において、ヒトエクソン２２～２８の標的化ノックインのための同じ方法を使用して、ｖＷＦ遺伝子座のヒト化を繰り返すことができる。加えて、上記で例示された３ＧＥ ｖＷＦノックイン系列（ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｖＷＦノックイン）に関して、キメラヒト－ブタｖＷＦ遺伝子型（および所望の表現型）が実証され、異なるＭＣＶベクター（例えばｐＲＥＶ９５４、ｐＲＥＶ９７１またはｐＲＥＶ９９９）を利用して、ｃｒｉｓｐｒ強化されたＧａｌランディングパッドによる４導入遺伝子の別の挿入手段として、これらの系列における、さらに既存のｖＷＦ改変系列における、改変されたＧａｌ遺伝子座への標的化された挿入を実行することができる。
[実施例９]
β４ｇａｌＮＴ２ＫＯ（ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＨＬＡ－Ｅバックグラウンドに対する）
ヒトＨＬＡ－Ｅの発現のためにＧＴＫＯ．ＣＤ４６およびゲノム導入遺伝子を用いて、３遺伝子ブタ（３ＧＥ）を生成した（異種間移植に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答を防ぐために、三量体としてヒトベータ－２－ミクログロブリンと組み合わせて。ＨＬＡ－Ｅ３遺伝子ブタは、エクスビボの肺移植モデルにおいて効能を示し、ＮＫ細胞の活性化が防がれた。豚β４ｇａｌＮＴ２遺伝子の追加のノックアウトを有するＨＬＡＥブタを試験して、異種肺移植中に宿主ＮＨＰで生じた異種抗体応答からの追加の保護を提供することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを生成して、ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＨＬＡＥトランスジェニック線維芽細胞細胞においてβ４ｇａｌＮＴ２遺伝子をノックアウトした。ＨＬＡＥバックグラウンドに対して二対立遺伝子β４ｇａｌＮＴ２ＫＯ（Ｂ４ＫＯ）を有するように見える細胞クローンのプールを核移植に使用した。
発生した７つの妊娠のうちの１つから８つの胎児を得て、これらのうち４つは、ＤＢＡレクチン（ＦＬ－１０３１、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）染色の完全な欠如によって確認される通り、β４ｇａｌＮＴ２遺伝子座における二対立遺伝子挿入または欠失（インデル）だけでなく、β４ｇａｌＮＴ２の機能的なノックアウト（Ｂ４ＫＯ）も有していた。Ｂ４ＫＯを有する３遺伝子ＨＬＡＥ系列は、エクスビボおよびインビボのＴｘモデルで試験することができる。
加えて、アルファＧａｌ遺伝子座に特異的な相同アーム（各末端に５００ｂｐ）を有するＭＣＶベクターを構築して、これらのＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ＨＬＡＥ．Ｂ４ＫＯ細胞株がさらに、ＥＰＣＲ．ＨＯ－１．ＴＢＭ．ＣＤ４７（９７１ＨＤＲ、実施例７を参照）などのＭＣＶのＣＲＩＳＰＲ支援標的化挿入を介して改変されるようにした。
[実施例１０]
ｐＲＥＶ９９９：ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇＥＰＣＲ．ＤＡＦｃａｇＴＦＰＩ．ＣＤ４７
不死豚内皮細胞において全ての遺伝子を発現することが示された別のＭＣＶ構築物は、インビボ肺Ｔｘモデルにおいて優れた生命維持を提供したが、ゲノム中の独立した位置に２つのバイシストロンとして導入遺伝子がランダムに組み込まれた遺伝子のセットの偏在的でロバストな発現を提供する。アルファＧａｌまたは豚β４ｇａｌＮＴ２相同アームのいずれかを有するｐＲＥＶ９９９ＭＣＶを用いてベクターを生成した（図２）。このＧＴＫＯおよびＣＤ４６のバックグラウンドに対してＢ４ＧＡＬＮＴ２ＫＯが追加されたＭＣＶは、肺Ｔｘにおいて強化された生命維持を提供するように生成することができる。Ｇａｌ遺伝子座標的化アームを有するｐＲＥＶ９９９ベクターを、ＧＴＫＯ線維芽細胞にトランスフェクトし、ＬＲＰＣＲおよび組込み部位ジャンクションのシーケンシングによって、標的化したコロニーを同定した。標的化された細胞を、ＳＣＮＴのために６匹のレシピエントに使用し、妊娠を生じさせた。
[実施例１１]
アルファＧａｌ相同アームを有するｐＲＥＶ９５４ＭＣＶ（ＥＰＣＲ．ＤＡＦ．ＴＢＭ．Ａ２０）の標的化されたノックインは、ＧＴＫＯ線維芽細胞で達成され、アルファＧａｌ遺伝子座に９５４ＭＣＶの単一対立遺伝子のノックインを有する細胞株はＳＣＮＴに使用された。
Ｂ４ＧＡＬＮＴ２アームを有するｐＲＥＶ９５４のためのベクターも生成した。これらのアームは、ＣＭＡＨ遺伝子座、豚ＲＯＳＡ２６またはＡＡＶＳ１に標的化された相同アームと置換されていてもよい。ＧＴＫＯおよびＣＤ４６のバックグラウンドに対するＭＣＶのノックインとＢ４ＧＡＬＮＴ２ＫＯとの組合せを有する第２のランディングパッド（Ｇａｌ遺伝子座とは逆側）へのこのＭＣＶの挿入は、肺Ｔｘにおける大幅に強化された生命維持を提供することができる。
[実施例１２]
アルファＧａｌ遺伝子座における２つの補体阻害剤遺伝子（ＣＤ４６＋ＤＡＦ／ＣＤ５５）の標的化された挿入を有するＧＴＫＯブタの生成。
導入遺伝子発現能力に関して追加のゲノムランディングパッドを試験するために、ベクターを構築した。追加のゲノムランディングパッドは、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２であり、それにより同時の遺伝子ノックアウトおよび導入遺伝子組込みが達成される。
事前に挿入されたＮｅｏＲ選択可能なマーカー遺伝子を有するブタのＧＧＴＡ１遺伝子座への標的化された挿入のための、バイシストロン性ＣＡＧ－ＣＤ４６．ＣＤ５５（ＤＡＦ）ベクターを構築し、挿入変異誘発によってＧＧＴＡ１をノックアウトするのに使用した。この場合において、ＮｅｏＲを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって促進される相同組換え修復を使用して、ＣＡＧ－ＣＤ４６．ＣＤ５５（ＤＡＦ）ベクターのための「ランディングパッド」として標的化した。このベクターをＮｅｏＲに標的化するために、ベクターに、ＮｅｏＲに相補的な相同アームを隣接させた。この戦略は、ＧＧＴＡ１／ＮｅｏＲランディングパッド遺伝子座におけるベクターの標的化されたノックインを確実にするように設計された。このアプローチの例は、図１９Ａ（ベクターＢ１１８）に見ることができる。このアプローチは、不特定のゲノム遺伝子座へのランダムな非標的化組込みを超える、以下の数々の利点を有する：１）導入遺伝子発現のために複製可能であることが証明されている遺伝子座（すなわち、ＮｅｏＲ）への組込みを確実にしたこと；２）その一部は導入遺伝子発現を許容しない可能性があるランダムなゲノム遺伝子座への組込みの可能性を低減したこと；３）ランダムまたは標的化のいずれかで、単一の遺伝子座で組み込まれるベクターの複数のコピーの可能性を低減したこと；および４）単一の遺伝子座における２つの導入遺伝子の組込みが、両方の導入遺伝子を、予測可能な様式で（すなわちメンデルの法則で）後続の世代に伝達できるようにすること。メンデルの法則での伝達は、臨床的な異種間移植のための臓器を供給するために、効率的な繁殖およびトランスジェニック生産群の拡張を容易にする。加えて、ＮｅｏＲの配列は固有であり、豚ゲノム中の他のいずれの配列または遺伝子座とも無関係であるため、ランディングパッドとしてのＮｅｏＲの使用は、組込みを標的化する可能性を増加させた。
このバイシストロン性を、ＧＴＫＯブタにおけるＧａｌ部位に標的化して、Ｔｘの間に非ｇａｌ抗体関連の補体結合からのロバストな保護を提供した。この改変を有する細胞株（ＧＧＴＡ１／ＮｅｏＲランディングパッドに組み込まれたＣＡＧ－ＣＤ４６．ＤＡＦバイシストロン性）は、例えばＭＣＶの挿入によって、例えば、４遺伝子Ｂ１６７ベクター（ｐＴＢＭ－ＴＢＭ－Ｔ２Ａ－ＥＰＣＲ．ＣＡＧ－ＣＤ４７－Ｐ２Ａ－ＨＯ１；図１９Ａを参照）の挿入によってさらに改変され、これはさらに、ランディングパッドとしてＣＭＡＨ遺伝子座における挿入に標的化された相同アームを端部に有する。この場合において、ＣＭＡＨは、ランディングパッドとノックアウト標的の両方として同時に役立つ。したがってこのアプローチは、２つの遺伝子ノックアウト（ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨ）および６つノックイン導入遺伝子を有する８遺伝子ブタ（８ＧＥ）を作り出すための、同じ細胞株における多重遺伝子編集のための２つのランディングパッドを利用する。
[実施例１３]
成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）が欠如したトランスジェニック動物の生成
この実施例は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を欠如しているトランスジェニック動物の生成を記載する。
図２０Ａは、豚ＧＨＲ遺伝子のエクソン３を標的化する４ＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ）の概略図を示す。図２０Ｂおよび２０Ｃは、４ＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ単独の、または互いに組み合わせたものの切断効率を示す。ｇＲＮＡ３は、単独で使用した場合、約７８％の切断効率を示し、ｇＲＮＡ４は、単独で使用した場合、約５５％の切断効率を示した。ｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、単独で使用した場合、それほど効率的ではなかった。しかしながら、ｇＲＮＡ１とｇＲＮＡ３の組合せは、９８％の切断効率を提示した。加えて、ｇＲＮＡ１および２の組合せによって約９０％の切断効率が示された。ｇＲＮＡ１および４の組合せは、８５％の切断効率を示した。全てのｇＲＮＡの組合せを試験したところ、各ｇＲＮＡと比較して、強い相乗的な切断効率作用が示された。
ＧＨＲノックアウト動物を生成するのに使用されたＧＨＲ標的配列および対応するＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲガイド配列を以下に示す：
ＤＮＡ標的配列：５’ＴＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＣＴ－ＴＧＧ（配列番号１）
ＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ１：５’ＵＡＧＵＵＣＡＧＧＵＧＡＡＣＧＧＣＡＣＵ（配列番号２）
ＤＮＡ標的配列：５’ＧＡＣＧＧＡＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣＡＧ－ＴＧＧ（配列番号３）
ＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ３：５’ＧＡＣＧＧＡＣＣＣＣＡＵＣＵＧＵＣＣＡＧ（配列番号４）
ＤＮＡ標的配列：５’ＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡ－ＣＧＧ（配列番号１０）
ＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ２：５’ＡＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＵＣＡＧＧＵＧＡＡ（配列番号１１）
ＤＮＡ標的配列：５’ＴＴＣＡＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＧ－ＧＧＧ（配列番号１２）
ＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ４：５’ＵＵＣＡＵＧＣＣＡＣＵＧＧＡＣＡＧＡＵＧ（配列番号１３）。
ＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ３およびＧＨＲ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ４を、当業界で教示された通りに設計した。Yu et al., J Transl. Med. (2018), and Hinrichs et al., Mo.l Metab. (2018)を参照されたい。ＤＮＡ標的配列における「－ＴＧＧ」－「－ＣＧＧ」および「－ＧＧＧ」は、ＰＡＭ配列に相当する。
上述した、図２０Ｂに提示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断効率に基づいて、ブタにおけるＧＨＲの慣例的なノックアウトのためにｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ３を選択した。このｓｇＲＮＡ対は、３７塩基対（ｂｐ）離れて配置された塩基でＤＮＡを切断する（図２３Ａ）。したがって、「クリーンな」切断は、３７ｂｐを生じ、ＧＨＲエクソン３内に未成熟停止コドンを生じるフレームシフト欠失が起こる。これらの３７ｂｐの欠失は、このｓｇＲＮＡ対によって生じた改変の約６０％を構成していた（図２０Ｂ）。ＧＨＲ ＫＯブタを生成するために、ｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ３を組換えＣａｓ９と混合して、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）を形成し、ヌクレオフェクションを使用して豚線維芽細胞にトランスフェクトした。これらの線維芽細胞は、９つの事前に導入された遺伝子編集／改変（６つの導入遺伝子：ＣＤ４６．ＤＡＦ．ＴＢＭ．ＥＰＣＲ．ＣＤ４７．ＨＯ－１、ならびに３つの遺伝子ノックアウト：ＧＴＫＯ、ＣＭＡＨＫＯ、およびβ４ＧａｌＮＴ２））を含んでいた。
ヌクレオフェクションの後、線維芽細胞を２日間培養し、次いでＳＣＮＴで使用してブタを生成した。誕生後数日、ＤＮＡを尾部生検から抽出し、ＮｅｘｔＧｅｎシーケンシング（ＭｉＳｅｑ）およびＲＴ－ＰＣＲによって分析して、ＧＨＲ遺伝子への改変を検出した。図２３Ｂは、エクソン３における標的化された配列のちょうど外側に配置されたプライマーを使用した、野生型ブタからのバンドと比較して低減したサイズのＧＨＲノックアウトバンドを示すＰＣＲ電気泳動図を示す。総合すると、１２匹中１１匹のブタ（９２％）が、ＧＨＲ遺伝子に欠失を有していた。９匹のブタ（７５％）が、各ＣＲＩＳＰＲ切断部位で切断する「クリーンな」切断に一致する－３７ｂｐの欠失を有していた。２匹のブタ（１７％）が、－３７ｂｐおよび－３６ｂｐの欠失を有していた。しかしながら３６ｂｐの欠失はフレームシフトではなく、したがって未成熟停止コドンを生じると予測されないことから、これらのブタは、成長の遅れ（図２４、図２５、図２６、および図２７）および低減した循環中のＩＧＦ－１レベル（図２８）に関して、それらの－３７ｂｐ同腹子と区別できない表現型を有していた。これは、ＧＨＲタンパク質の重要なＧＨ結合ドメインから１２アミノ酸を排除するであろう－３６ｂｐもの大きさのサイズの欠失に起因するかもしれないと考えられる。１匹のブタ（８％）が、ＧＨＲ遺伝子座において完全に改変されていない対立遺伝子を有し、野生型ブタに類似した表現型を示した。
[実施例１４]
成長ホルモンノックアウトおよび複数のヒト導入遺伝子を有する遺伝子改変されたブタからの心臓異種間移植は、拡張期の移植片の失敗の促進を防止する
目的：遺伝子改変されたブタは、適時の同種移植片を受けることができない末期臓器不全患者にとって、将来性のある臓器源と考えられている。しかしながら、非ヒト霊長類モデルにおいて、心臓異種移植片は、最終的に、１ヶ月未満で早期の肥大性心筋症および拡張期心不全で死亡する。これらの異種移植片における生命を維持する機能は、６ヶ月まで実証されたが、テムシロリムスや後負荷軽減剤を投与した後のみであった。他の添加物の使用なしで固有の移植片成長による心臓肥大症を防止し、移植片生存を改善するための成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）ノックアウト異種移植片の使用を調査した。
方法：遺伝子操作されたブタ心臓を、体重を１５～３０ｋｇに一致させたヒヒに、埋め込み前に連続的な灌流保存を利用して、同所性移植した（ｎ＝４）。遺伝学的改変は、優勢な炭水化物抗原（例えば、ＧＴＫＯ、ＣＭＡＨＫＯ、β４ＧａｌＮＴ２ＫＯ）のノックアウト、および血栓調節（例えば、抗凝血剤遺伝子、例えばトロンボモジュリン（ＴＢＭ）、内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ＣＤ３９、および／または組織因子経路阻害剤（ＴＦＰ））、補体調節（例えば、補体阻害剤、例えばＣＤ４６（またはＭＣＰ）、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＲＩ、またはそれらの組合せ）、免疫抑制（例えば、免疫抑制剤、例えばＣＬＴＡ４－ＩＧ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、腫瘍壊死因子－α関連誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、および／またはＨＬＡ－ＤＲ）、および炎症低減（例えば、細胞保護的導入遺伝子は、例えばＨＯ－１、および／またはＡ２０である）のためのヒト導入遺伝子のノックインを含んでいた。試験した移植片のうち２つを、野生型ＧＨＲを発現するトランスジェニックブタ（非ＧＨＲＫＯ、ｎ＝２）から得た；２つの移植片を、ＧＨＲ遺伝子のノックアウトを含有するトランスジェニックブタ（ＧＨＲＫＯ、ｎ＝２）から得た。経胸壁心エコー図（ＴＴＥ）を毎月２回得た。いずれのコホートにも、テムシロリムスおよび後負荷軽減剤を術後に投与しなかった。抗ＣＤ４０ベースの免疫抑制レジメンを、これまでに記載されたようにして使用した。
結果：移植の２４時間以内に全てのヒヒレシピエントから抜管し、必要に応じて変力薬のサポートからの急速に離脱させた。１匹のヒヒレシピエントは、２２７日間（７．６ヶ月）生存し、原因不明の体重の減少のために安楽死させた。このヒヒの安楽死時、心臓機能は正常であった。検死検査から、ＧＨＲＫＯ移植片の肥大の証拠がないことが解明された。非ＧＨＲＫＯまたはＧＨＲＫＯ移植片のいずれかの全てのレシピエントは、申し分ない両室の機能、ならびに正常な範囲内のクレアチニンおよびＬＦＴでの末端臓器灌流を実証する。全てのレシピエントにおいて、血清トロポニンレベルは、低いかまたは検出不能なままであった。ＧＨＲＫＯまたは非ＧＨＲＫＯ移植片のいずれかにおいても１ヶ月までのＴＴＥにおいて中隔および後壁厚さによって測定した場合の固有の成長において差はない（図２２Ａ～２２Ｂ）。図２２Ａ～２２Ｂで示されるように、Ｂ３３１３０およびＢ３２８６３は、ＧＨＲＫＯ移植片を受けたヒヒを指し、Ｂ３３１２１およびＢ３２９８８は、非ＧＨＲＫＯ移植片を受けたヒヒを指す。しかしながら、非ＧＨＲＫＯ移植片のうちの１つにおいて、中隔および後壁両方の肥大が、５４日に著しく上昇している（他方は、まだこのタイムポイントに到達していなかった）。両方のＧＨＲＫＯ移植片において、４．５ヶ月までに最小の肥大がみられ、これは以前の心臓異種移植片をはるかに上回っている。
結論：本発明者らは、ＧＨＲＫＯを含有する遺伝子操作されたブタからの多重遺伝子異種移植片が肥大を防止し、この要約の提出時に生存し続けていることを実証する。非ＧＨＲＫＯを含有する多重遺伝子異種移植片は、肥大の遅延を示す。全てのＧＨＲＫＯ移植片は、後負荷軽減またはテムシロリムスを必要とせずに、移植後４．５ヶ月まで心筋症または末端臓器機能不全を起こすことなく優れた移植片機能を示す。非ＧＨＲＫＯ移植片は、固有の成長の証拠なく、１ヶ月の限界を超えたが、５４日までに壁肥厚における著しい増加を示した。
[実施例１５]
１０個の遺伝学的改変を含む多重トランスジェニック動物を生成するための１ステップアプローチ
この実施例は、少なくとも１０個の遺伝学的改変を含む多重トランスジェニック動物の生成を記載している。少なくとも１０個の遺伝学的改変を含む多重トランスジェニック動物を生成するために、２つの一般的なアプローチを使用した：１ステップアプローチは、図１９Ｂに開示され、２ステップアプローチは、図２１に開示される。図１９Ａ～１９Ｂは、単一のステップで多重トランスジェニック動物の生産のためのベクターを生成するための一般的な戦略を概説する。
６遺伝子ベクターの生成
ベクターの構築。複数のバイシストロン性単位を合成した。この単位は、単一のプロモーターを共有する２Ａペプチド配列によって連結された２つの導入遺伝子からなり、実施例１で開示した通りに生成された。本開示のベクターの追加の例示的な実施形態は、図１９Ａおよび１９Ｂに示される。
Ｂ２００ベクター（配列番号５）は、３つのバイシストロン単位を含む多シストロン性ベクター（ＭＣＶ）であり、ｐＴＢＭｐｒ［ｈＴＢＭ－２Ａ－ｈＥＰＣＲ］／ＣＡＧｐｒ［ｈＣＤ４７－２Ａ－ｈＨＯ１］／ＣＡＧｐｒ［ｈＣＤ４６－２Ａ－ｈＤＡＦ］と名付けられ、ＣＭＡＨにＨＤＲのための標的化アームが隣接している（図１９Ｂ）。第１のバイシストロン性単位（ｐＴＢＭｐｒ［ｈＴＢＭ－２Ａ－ｈＥＰＣＲ］）は、２Ａペプチドを介してヒト内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）ｃＤＮＡに連結されたヒトトロンボモジュリン（ＴＢＭ）ｃＤＮＡを含有しており、両方の導入遺伝子が、内皮特異的な豚トロンボモジュリンプロモーター（ｐＴＢＭｐｒ）によって駆動される。第２のバイシストロン単位（ＣＡＧｐｒ［ｈＣＤ４７－２Ａ－ｈＨＯ１］）は、２Ａペプチドを介してヒトヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）ｃＤＮＡに連結されたヒト表面抗原分類４７（ＣＤ４７）ｃＤＮＡを含有しており、両方の導入遺伝子が、ＣＡＧプロモーター（ＣＡＧｐｒ）によって駆動される。第３のバイシストロン単位（ＣＡＧｐｒ［ｈＣＤ４６－２Ａ－ｈＤＡＦ］）は、２Ａペプチドを介してヒト表面抗原分類５５（ＣＤ５５またはＤＡＦ）ｃＤＮＡに連結されたヒト表面抗原分類４６（ＣＤ４６）ｃＤＮＡを含有しており、両方の導入遺伝子が、ＣＡＧプロモーター（ＣＡＧｐｒ）によって駆動される。Ｂ２００ベクターは、ＣＭＡＨ遺伝子座における相同組換え修復（ＨＤＲ）のために標的化アームを隣接させた。
Ｂ２００ベクター（配列番号５）を生成するために、豚ＴＢＭプロモーターを２ステップでクローニングした。最初に（ステップ１）、豚ＴＢＭプロモーター領域の４２６６ｂｐのゲノム断片を、プライマーＴＢＭｐｒ ４７７４Ｆ－ＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴ（配列番号６）、ＴＢＭｐｒ ９１５７Ｒ－ＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＧ（配列番号７）を使用して豚ゲノムから増幅し、ｈＴＢＭ－２Ａ－ｈＥＰＣＲ；ＣＡＧｐｒ［ｈＣＤ４７－２Ａ－ｈＨＯ１］を含有するベクター中のＰｓｈＡＩ／ＦｓｅＩ制限断片としてクローニングし、ＣＭＡＨ遺伝子座のためのＨＤＲ標的化アームを隣接させた。ステップ２において、ｐＴＢＭプロモーターの３２６７ｂｐのゲノム断片（ステップ１でクローニングした断片の上流）を、プライマーＴＢＭｐｒ ７３８Ｆ－ＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡ（配列番号８）、ＴＢＭｐｒ ４３１１Ｒ－ＧＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＣＴＣＴＴ（配列番号９）を使用してブタゲノムから増幅し、ステップ１で生成した構築物にＰｓｈＡＩ断片としてクローニングした。ステップ２からのベクターのＳｗａＩ部位にＣＡＧｐｒ［ｈＣＤ４６－２Ａ－ｈＤＡＦ］断片を挿入することによって、６遺伝子を含有する最終的なベクターを生成した。この設計は、本発明者らに、同時にＣＭＡＨ遺伝子を不活性化し、許容される遺伝子座から導入遺伝子を発現させること可能にした。
プラスミド精製。本開示の６遺伝子ベクターは、非常に大きいプラスミドである（それぞれ、約３０Ｋｂまたはそれより大きい）。６遺伝子ベクターのサイズは、細菌形質転換、プラスミド増幅および精製にとって問題があった。導入遺伝子を発現するベクターは標準的なプラスミドであったため（すなわちＢＡＣまたはＹＡＣではない）、このサイズのために、１．０～２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．５～１ｍｇの収量の高品質のＤＮＡ（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０：１．８～２．０）を達成するには、標準的なプラスミド精製プロトコールに数々の固有な変更をなす必要があった。これらの変更なしでトランスフェクションのためのＤＮＡ断片を調製することは不可能であった。したがって本発明者らは、培養するための慣例的ではない新しいプロトコールを作成し、本開示の６遺伝子ベクターを精製した。少なくとも３０Ｋｂを有する標準的なプラスミドの精製のための新しい改善された方法は、以下のステップを含んでいた。
ステップ１。標準的手順を使用した大きいプラスミドの形質転換効率を改善するために、エレクトロコンピテントなＳｔｂｌ４大腸菌（E.coli）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてプラスミド構築を実行した。ここから、トランスフェクションのための高濃度のＤＮＡを達成するための新しい非標準的なプロトコールを開発した。シングルコロニーで構成されるミニプレップ培養物を一晩増殖させた。標準的なプロトコールに従って、培養したコロニーを、より大きいスケールで（２００～５００ｍｌ）液体培養物に接種した。しかしながら、この標準的なプロトコールは一貫して大きいプラスミドを増幅できなかった。したがって、新規の代替アプローチを開発した。このアプローチでは、その代わりに、単一のミニプレップコロニーのプラスミドＤＮＡを大腸菌（E.coli）に再び形質転換し、それから１２個の陽性コロニーを使用して、６時間にわたり４ｍｌのスターター培養物に接種した。
ステップ２。２ｍｌのスターター培養物を使用して、１６時間にわたり２リットルの培養物に接種した。カルベニシリンは、より安定なアンピシリンアナログであり、これを一晩の培養中に選択のために使用して、標準的な培養条件下で頻繁に起こる液体培養培地中における大きいプラスミドの不安定さを最小化した。
ステップ３。細菌を回収し、細菌ペレットの重量を決定した。以前の経験に基づいて、後続のステップにおける優れたプラスミド収量には、８グラムのペレット重量が必要であった。
ステップ４。標準的なプロトコール（Qiagen Plasmid Purification Handbook 02/2021、Ｍｅｇａ Ｋｉｔ）に記載された通りにアルカリ溶解を、５０ｍｌのＰ１、Ｐ２およびＰ３溶液を用いて、以下の通り改変して実行した：溶解、遠心分離およびろ過による死細胞片の分離の後、０．７倍量のイソプロパノールで溶解物を沈殿させ、ペレットをＴＥに再懸濁した。次いでＤＮＡ溶液を、ＱＩＡＧＥＮ－チップ５００カラム（極めて低いコピー数のプラスミド精製のためのＱｉａｇｅｎのプロトコール）に通過させた。制限酵素消化パターン分析および次世代シーケンシングによって、それぞれの精製したプラスミドのための品質管理を実行した。
断片の単離。標的化アームが隣接する６つのヒト導入遺伝子を含有する直鎖状断片を単離するために、およそ２００ｍｇの精製したプラスミドＤＮＡをそれぞれ９００単位の制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩおよびＡｓｉＳＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で、１．９ｍｌの総体積で５時間消化した。３００ｕｌのＴＥ中での沈殿および再懸濁の後、消化したプラスミドを、１％の低融解温度アガロースゲル（ゲル寸法：幅１１フィート×長さ１４フィート×高さ０．８フィート）の８ウェルにローディングし、電気泳動によって、３５ボルトで１８～２０時間分離した。その後、少なくとも約２６Ｋｂの直鎖状断片をゲルから切り出し、アガロースからＤＮＡをベータ－アガラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して精製した。この方法は、典型的には、０．５～１．０ｍｇ／ｕｌの濃度で３５～７０ｍｇの直鎖状断片をもたらした。制限パターン分析、アガロース電気泳動でのサイズ決定、および次世代シーケンシングによって、精製した断片の完全性を確認した。全ての品質管理標準に合格した断片を、後続のトランスフェクション実験に使用した。
遺伝子改変された線維芽細胞の生成
一般的な方法。全ての改変を、ＮｅｏＲでの挿入変異誘発によってＧＧＴＡ１がノックアウトされた動物（例えばブタ）の系列から得られたＧＧＴＡ１ＫＯ豚胎児線維芽細胞に導入した。Dai et al., Nat Biotechnol. 2002; 20:251-5 (2002)を参照されたい。トランスフェクションを、Ｌｏｎｚａの２Ｂまたは４Ｄシステムを使用したエレクトロポレーションによって実行した。ＤＮＡベクター断片を、相同組換え修復（ＨＤＲ）を容易にするために意図したベクター組込み部位でゲノムＤＮＡを切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）とコトランスフェクトした。非Ｇａｌ異種抗原（ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２）をコードする遺伝子のノックアウトのためのインデルを生成するように設計された他のＲＮＰを、後述するように、ベクター断片と高頻度でコトランスフェクトした。ＣＭＡＨの場合において、一方の対立遺伝子でのＨＤＲを促進し、他方の対立遺伝子にノックアウトインデルを生成するようにＲＮＰを使用した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＰもまた、成長ホルモン受容体遺伝子（ＧＨｒ）をノックアウトするのに使用された。一部の場合で、大量のトランスフェクトされたＤＮＡおよびＲＮＰによる細胞のストレスおよび死を最小化するために、細胞を回収できるようにするために、３～４日の間隔を開けた２回の別個のトランスフェクションで試薬を導入した。追加の３～４日間培養して、ベクターから導入遺伝子発現させた後、ｈＣＤ４６に対する抗体での染色によって、断片取り込みのために細胞を富化した。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを使用してｈＣＤ４６染色陽性の細胞を収集し、限界希釈で１０ｃｍのプレートに植え付け、１０～１４日間培養した。次いで、単一細胞クローン（ＳＣＣ）で構成されるコロニーを、拡大増殖およびＤＮＡ分析のために選択した。意図した設計の遺伝学的改変が確認されたコロニーを、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によってブタを作製するのに使用した。
Ｂ２００ベクターのトランスフェクション。胎児線維芽細胞に、Ｌｏｎｚａの２Ｂシステムを使用してＧＨＲおよびβ４ＧａｌＮＴ２ＲＮＰをトランスフェクトして、それぞれＧＨＲおよびＢ４ＧａｌＮＴ２遺伝子をノックアウトした。３日後、細胞に、Ｌｏｎｚａの２ｂシステムを使用して再びトランスフェクトし、この時は、Ｂ２００ベクター断片およびＣＭＡＨ ＲＮＰを用いた（図１９Ａおよび１９Ｂ）。さらに３日後、細胞をｈＣＤ４６抗体で染色し、ｈＣＤ４６陽性細胞をＦＡＣＳによって収集し、ＳＣＣに供し、スクリーニングして、意図した改変を確認し、ＳＣＮＴに使用した。
遺伝子型に関する細胞コロニーのスクリーニング
単一細胞クローンのコロニーの特徴付けを、標的化および導入遺伝子分析のためのＰＣＲ、ベクターコピー数を推測するためのデジタルドロップＰＣＲ、ならびに遺伝子ノックアウトのためのインデル分析のためのゲノムシーケンシングによって達成した。９６ウェルプレート中で細胞約２０００個の単一細胞クローンのコロニーを拡大増殖した。標的化、導入遺伝子およびデジタルドロップＰＣＲのための、加えて、ＮｅｘｔＧｅｎ（ＭｉＳｅｑ）シーケンシング分析のためのＤＮＡを、各ウェル／試料に５μｌの溶解溶液を添加することによって得た。サーモサイクラーで、プレートを、６５℃で１０分、および９５℃で１０分サイクル化した。標的化ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、およびシーケンシングアッセイのそれぞれのために１μｌの溶解物を取り出した。
標的化（５’および３’）ＰＣＲは、それぞれの特定された、または標的化された遺伝子座におけるＨＤＲベクター標的化部位にわたる配列を増幅する。標的化ＰＣＲアッセイ設計は、隣接するゲノム配列中の、標的化ベクターの外側のゲノム配列に相同な一方のＰＣＲプライマーと、標的化ベクター中の配列に相同な他方のＰＣＲプライマーとを利用する。この設計のアッセイは、電気泳動後にＰＣＲ増幅したＤＮＡのバンドがアガロースゲル上で可視化される場合、標的化されたコロニーを同定する。次いで正確に標的化されたコロニーをデジタルドロップＰＣＲによって分析して、ベクター中のそれぞれ個々の導入遺伝子のコピー数を推測した。次いで意図した導入遺伝子コピー数を有する標的化されたコロニーを、必要に応じてＭｉＳｅｑ分析に供して、インデルを同定し、特定されたノックアウト（ＫＯ）編集を確認した。
少なくとも６つの導入遺伝子を含む多重トランスジェニック動物の生成
体細胞核移植。生きたブタを、Giraldo et al. Methods Mol Biol. 885:105-23 (2012)で詳細に説明された方法に従って、ＳＣＮＴによって遺伝子改変した線維芽細胞から生成した。
遺伝子型に関する子豚のスクリーニング。トランスジェニック動物の遺伝子型特徴付けを、ブタ尾部生検から抽出されるＤＮＡを使用して、細胞コロニーに関して上で記載した通りに、標的化および導入遺伝子ＰＣＲ分析、デジタルコピー数のＰＣＲ分析、およびゲノムシーケンシング分析によって実行した。加えて、サザンブロットを行って、無傷のベクターの標的化およびランダムな組込みの非存在を確認した。総合すると、これらの方法は、標的化ベクターが標的化された対立遺伝子に組み込まれたこと、ベクターが無傷であること、および構築物がゲノムにランダムに組み込まれなかったことを同定および確認する。
豚組織におけるヒト導入遺伝子の発現。各ベクターからの全てのヒト導入遺伝子の発現が、ウェスタンブロット（図２９）、および免疫組織化学的染色（図３１）によって、心臓、肺、および腎臓試料で確認された。試験された全ての組織は、各アッセイにおいて発現の適切なレベルを示した。
豚組織で発現されたヒトタンパク質の機能分析
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを使用したｈＣＤ４６／ｈＤＡＦ機能の特徴付け。超急性拒絶反応（ＨＡＲ）は、保護されていない臓器の異種間移植のほぼ直後に起こる。ＨＡＲは、異種抗原への異種抗体結合、それに続く補体タンパク質および細胞溶解物の結合および活性化に起因する。補体阻害剤ｈＣＤ４６およびｈＤＡＦの発現は、異種間移植された臓器においてＨＡＲをブロックする有力で有効な手段である。したがって、本開示の多シストロン性ベクターシステムの有効性を評価するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを実行して、豚大動脈内皮細胞（ｐＡＥＣ）におけるヒト補体カスケードを阻害するトランスジェニックｈＣＤ４６およびｈＤＡＦの能力を評価した。ヒト血清（３人のドナーからプールされた）を培地で希釈し、培養したｐＡＥＣに適用した。１時間後、ウサギ補体と、補体によって溶解した細胞に侵入することが可能であり、そこで赤色蛍光を放出するＣｙｔｏｔｏｘ Ｒｅｄ試薬とを培養物に添加した。細胞を画像化し、ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標）５リーダーを使用して計数した。細胞傷害性パーセントを、赤色蛍光細胞の数／計数された総細胞×１００として読んだ。表１で示されるように、トランスジェニックｈＣＤ４６およびｈＤＡＦの発現は補体によって誘導された細胞傷害性をほぼ排除した。
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）アッセイを使用したｈＴＢＭ／ｈＥＰＣＲ機能の特徴付け。トロンボモジュリンおよびＥＰＣＲは、血管内皮細胞の管腔表面上の膜タンパク質である。止血条件下で、ＴＢＭは、循環するトロンビンと結合して、ＴＢＭ：トロンビン複合体を形成し、これがプロテインＣを活性化して、抗凝血状態を維持する。豚ＴＢＭはヒトトロンビンと結合できるが、ｐＴＢＭ：ヒトトロンビン複合体は、ヒトプロテインＣの活性化因子としては弱い。豚臓器におけるｈＴＢＭのトランスジェニック発現は、この不適合性を克服し、異種間移植された臓器における移植後の血栓症を防止する。ｈＥＰＣＲの発現は、プロテインＣ活性化をさらに増大させて、抗血栓性状態を維持する。
したがって、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）アッセイを実行して、ヒトプロテインＣを活性化するトランスジェニックｈＴＢＭおよびｈＥＰＣＲの能力を評価した。初代豚大動脈内皮細胞（ｐＡＥＣ）を、Ｂ２００トランスジェニックブタおよびＧＴＫＯ（ＧＧＴＡ１ ＫＯ）対照ブタから単離した。ヒト内皮細胞株を、陽性対照として利用した。ヒト活性化プロテインＣを使用した標準曲線をアッセイ日に新たに作成した。各試験ウェルにヒトトロンビンおよびヒトプロテインＣを添加し、１時間インキュベートし、ヒルジンで反応を止めた。次いでアリコートをＡＰＣ標準曲線プレートに移し、各ウェルにＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｓ－２３６６基質を添加し、即座に４０５ｎｍでその吸光度を読んだ。アッセイ結果を、最終的な分析のためにＡＰＣのｎＭ／タンパク質のｍｇに正規化した。Ｂ２００ベクターからのｈＴＢＭおよびｈＥＰＣＲを発現するトランスジェニックブタからのｐＡＥＣは、ＧＴＫＯトランスジェニックブタ対照と比較して有意に上昇したＡＰＣレベルを示した。
[実施例１６]
１０個の遺伝学的改変を含む多重トランスジェニック動物を生成するための２ステップアプローチ
図２１に、多重トランスジェニック動物を２ステップで生産するための方法を描写する。「ステップ」は、ＳＣＮＴのラウンドを指す。ステップ１において、遺伝子改変された細胞をＳＣＮＴのラウンドに供し、妊娠約３２日目に胎児を生じさせ、それから追加の遺伝学的改変の導入のために胎児線維芽細胞を得た。ステップ２において、追加の改変を有する線維芽細胞を、ＳＣＮＴの第２のラウンドに供して、ブタを生成した。前もって導入されたＧＧＴＡ１ノックアウトを有する胎児ブタから線維芽細胞を得て、これは、ＮｅｏＲ選択可能なマーカー遺伝子の挿入突然変異によって前もってなされた。
ステップ１において、細胞に、ＮｅｏＲへの挿入のために標的化された導入遺伝子構築物（Ｂ１１８；図１９Ａ）をトランスフェクトした。このバイシストロン性構築物は、両方ともＣＡＧプロモーターによって発現できるように、２Ａ配列によって連結されたｈＣＤ４６およびｈＤＡＦを含有しており、ＮｅｏＲに標的化された相同アームに隣接していた。このトランスフェクションにおいて、ＮｅｏＲ以内で切断するように設計されたｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ ＲＮＰも添加して、ＨＤＲによるＢ１１８の挿入、加えて、β４ＧａｌＮＴ２をノックアウトするように設計されたｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ ＲＮＰの対合が容易になるようにした（図１９Ａ）。２～３日後、細胞を蛍光性ｈＣＤ４６抗体で染色し、形質転換体をソートし、ＦＡＣＳによって選択した。ｈＣＤ４６陽性細胞を、１０ｃｍの培養プレートに限界希釈で植え付けた。１０～１４日後、ベクターＢ２００に関して上述したように、単一の細胞コロニーを９６－ウェルプレートに移し、拡大増殖させ、その後、各コロニーからの細胞の一部を、それぞれＰＣＲおよびＭｉＳｅｑによって、標的化されたＢ１１８挿入およびβ４ＧａｌＮＴ２ノックアウトに関してスクリーニングした。正確に改変されたクローンからの細胞（ここでは４ＧＥ）をＳＣＮＴに使用した。再構成された胎児をレシピエントブタの生殖器官に移した。妊娠３０～３２日目に、妊娠したレシピエントを致死させて、胎児を収集し、これを使用して、４ＧＥ胎児線維芽細胞を生成した。
ステップ２において、ｐＴＢＭプロモーターによって駆動する２つのヒト抗凝血剤導入遺伝子（ｈＴＢＭおよびｈＥＰＣＲ）、ならびに２Ａ配列によって連結され、両方ともＣＡＧプロモーターによって駆動するイムノモジュレーター（ｈＣＤ４７）および抗アポトーシス（ｈＨＯ－１）導入遺伝子を含有する第２の導入遺伝子構築物（Ｂ１６７；図１９Ａ）を、ＣＭＡＨ遺伝子座に導入した。このトランスフェクションでは、１）ＣＭＡＨを切断して、一方の対立遺伝子へのＢ１６７のＨＤＲおよび他方へのノックアウトインデルを容易にし、２）ＧＨＲをノックアウトするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ対も含まれた（図１９Ａ）。トランスフェクトされた細胞を、ステップ１と同様にして加工し、培養し、スクリーニングし、これをＳＣＮＴで使用して胎児を生産し、これをレシピエントである雌に移植して、生きたトランスジェニックブタ（１０ＧＥ）を生産した。ステップ１およびステップ２で逐次的に導入された改変により、６つの導入遺伝子：ｈＣＤ４６、ｈＤＡＦ、ｈＴＢＭ、ｈＥＰＣＲ、ｈＣＤ４７、およびＨＯ１を発現し、４つのノックアウト：ＧＴＫＯ、ＣＭＡＨＫＯ、β４ＧａｌＮＴ２ＫＯ、およびＧＨＲＫＯを有する生きた１０ＧＥブタが生まれた。
豚組織におけるヒト導入遺伝子の発現。各ベクターからの全てのヒト導入遺伝子の発現が、ウェスタンブロットによって尾部（図２９Ａ）および耳（図２９Ｂ）生検において、フローサイトメトリーによって有核血液細胞（末梢血単核細胞；ＰＢＭＣ）において（図３０Ａ～Ｂ３０）、ならびに免疫組織化学的染色によって心臓、肺、および腎臓組織において（図３１Ａ－Ｂ）確認された。試験した全ての組織は、両方のアッセイにおける発現の適切なレベルを示した。
[実施例１７]
脳死ヒトレシピエントにおける多重遺伝子で編集された豚腎臓異種間移植。
インビボの異種間移植モデルを使用して、脳死のヒト死亡者における、したがって生きた人間へのリスクがないブタからＮＨＰへのモデルの中心となる原理を試験した。１０個の遺伝学的改変を有するブタ（１０ＧＥブタ、実施例１６に記載された通り）を使用し、これは、２つのヒト補体阻害剤遺伝子（ｈＤＡＦ、ｈＣＤ４６）、２つのヒト抗凝血剤遺伝子（ｈＴＢＭ、ｈＥＰＣＲ）、および２つの免疫調節遺伝子（ｈＣＤ４７、ｈＨＯ１）、加えて、３つのブタ炭水化物抗原（アルファ－Ｇａｌ、ベータ－４－ｇａｌ ＮＴ２、ＣＭＡＨ／ｎｅｕ５Ｇｃ）の欠失（ノックアウト）、およびブタ成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）遺伝子の標的化された挿入からなっていた。
１０ＧＥブタを高度な獣群の健康的なブタ施設に格納し、特定された感染因子（例えば、ｐＣＭＶおよび豚内因性レトロウイルスＣ）を排除した。移植の前に、ドナーブタとヒト死亡者との間の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）適合性を評価したところ、陰性の適正検査が実証された。１０ＧＥブタドナー腎臓を一括調達し、次いで従来の異所性同種間移植技術を使用して別々に移植した。腎臓は尿をつくり、７７時間にわたり生命を維持した。超急性拒絶反応は観察されず、内皮傷害、フィブリン血栓、またはＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ４ｄの染色の証拠はなかった。加えて、３日間にわたり皮質壊死または間質性出血への進行の証拠はなかった。図３２Ａおよび３２Ｂで示されるように、豚腎臓で６つ全てのヒト導入遺伝子が発現された。死亡者の血液試料を、豚内因性レトロウイルスの存在に関して毎日試験した。全ての試験が陰性のままであった（図３３）。加えて、ブタ細胞の腎臓へのキメリズムは、豚特異的なｐＲＰＬ４の存在によって測定した場合、観察されなかった（図３３）。このようなインビボでのヒト脳死死亡者モデルにおける多重遺伝子編集豚腎臓の移植は、史上初であった。短い持続時間のみであるが、ヒト死亡者モデルは、異種間移植のＮＨＰモデルでは不可能な、重要な安全性および実行可能性研究に取り組む機会を提供した。
均等物
本発明の技術は、本出願に記載される特定の実施形態に限定されないものとし、本技術の個々の態様の一つの例示であると意図される。この本発明の技術の多くの改変およびバリエーションは、当業者には明らかであるように、その本質および範囲から逸脱することなく行うことができる。本発明の技術に加えて本明細書において列挙されたものの範囲内の機能的に同等な方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような改変およびバリエーションは、本発明の技術の範囲内であると意図される。この本発明の技術は、特定の方法、試薬、化合物組成または生物系に限定されず、当然ながら様々であってもよいことが理解されるであろう。また、本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解されるであろう。
加えて、本開示の特徴または態様が、マーカッシュ群の形式で記載される場合、当業者は、本開示がそれによりマーカッシュ群のいずれか個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの形式でも記載されることを認識しているであろう。
当業者には理解されるように、ありとあらゆる目的のために、特に、記載された説明を提供するという観点で、本明細書で開示される全ての範囲は、ありとあらゆる可能性のある部分範囲およびそれらの部分範囲の組合せも包含する。全ての列挙した範囲は、同じ範囲を、少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割することを十分に記載しており、それを可能にするものであると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられたそれぞれの範囲は、下３分の１、中央の３分の１、および上の３分の１などに容易に分割することができる。当業者には同様に理解されると予想されるが、「まで（最大）」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい（未満）」などの全ての言語は、列挙された数を含み、上記で論じられたように後で部分範囲に分割できる範囲を指す。最後に、当業者には理解されると予想されるが、範囲は、それぞれ個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞を有する群を指し、以降同様である。
本明細書において参照または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および公報は、全ての図面および表を含めて、本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度に参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。

Claims (69)

  1. （ａ）成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化；または
    （ｂ）前記ＧＨＲ遺伝子のうちの少なくとも１つの対立遺伝子における、前記ＧＨＲの機能を損なう突然変異を引き起こす遺伝子変化
    を含むトランスジェニックブタ。
  2. 前記遺伝子変化が、ＧＨＲノックアウト遺伝子変化である、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。
  3. 前記トランスジェニックブタが、前記遺伝子変化がないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％またはそれを超えてＧＨＲの発現を減少させる、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。
  4. 前記トランスジェニックブタが、前記遺伝子変化がないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％少ないインスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）を生産する、請求項１から３のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ。
  5. １つまたは複数の追加の遺伝子変化をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ。
  6. １つまたは複数の追加の遺伝子変化が、（ｉ）１つもしくは複数の遺伝子の発現の減少、（ｉｉ）１つもしくは複数の遺伝子の機能の低下、および／または（ｉｉｉ）１つもしくは複数の導入遺伝子の発現をもたらす、請求項５に記載のトランスジェニックブタ。
  7. 前記１つまたは複数の導入遺伝子が、独立して、抗凝血剤、補体調節因子、イムノモジュレーター、および細胞保護的導入遺伝子から選択される、請求項６に記載のトランスジェニックブタ。
  8. 前記抗凝血剤が、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、およびＣＤ３９から選択される、請求項７に記載のトランスジェニックブタ。
  9. 前記補体調節因子が、補体阻害剤である、請求項７に記載のトランスジェニックブタ。
  10. 前記補体阻害剤が、ＣＤ４６、ＣＤ５５またはＣＤ５９から選択される、請求項９に記載のトランスジェニックブタ。
  11. 前記イムノモジュレーターが、免疫抑制剤である、請求項７に記載のトランスジェニックブタ。
  12. 前記免疫抑制剤が、豚ＣＬＴＡ４－ＩｇおよびＣＩＩＴＡ－ＤＮから選択される、請求項１１に記載のトランスジェニックブタ。
  13. 前記１つまたは複数の導入遺伝子が、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＤＡＦ／ＣＤ５５、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＨＬＡ－Ｅ、およびＨＯ１から選択される、請求項６から１２のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ。
  14. 前記１つまたは複数の遺伝子変化が、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧａｌＮＴ２）およびシチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）の発現の減少を含む、請求項５から１３のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ。
  15. インスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）遺伝子の発現の減少をもたらす遺伝子変化を含むトランスジェニックブタ。
  16. 前記トランスジェニックブタが、前記遺伝子変化がないブタと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％少ないインスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）を生産する、請求項１５に記載のトランスジェニックブタ。
  17. 少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニックブタであって、前記少なくとも４つの導入遺伝子は、少なくとも２つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座に取り込まれ、発現され、前記ブタは、アルファ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼおよび成長ホルモン受容体の発現を欠如しているか；または
    前記ブタは、アルファ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、成長ホルモン受容体、β－１，４－Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（β４ＧａｌＮＴ２）およびシチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）の発現を欠如している、トランスジェニックブタ。
  18. 前記単一の遺伝子座が、
    （ｉ）ネイティブの遺伝子座であるか；
    （ｉｉ）改変されたネイティブの遺伝子座であるか；
    （ｉｉｉ）ＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２、およびＧＧＴＡ１からなる群から選択されるか；
    （ｉｖ）ネイティブのＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；
    （ｖ）改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；
    （ｖｉ）トランスジェニックＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；
    （ｖｉｉ）ネイティブのＣＭＡＨ遺伝子座であるか；
    （ｖｉｉｉ）改変されたＣＭＡＨ遺伝子座であるか；
    （ｉｘ）トランスジェニックＣＭＡＨ遺伝子座であるか；
    （ｘ）ＧＧＴＡ１遺伝子座ではないか；
    （ｘｉ）ネイティブのβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；
    （ｘｉｉ）改変されたβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；または
    （ｘｉｉｉ）トランスジェニックβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座である、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。
  19. 前記改変されたネイティブの遺伝子座が、遺伝子編集が媒介する挿入、欠失もしくは置換を含むか；またはトランスジェニックＤＮＡを含む、請求項１８に記載のトランスジェニックブタ。
  20. 前記トランスジェニックＤＮＡが、（ｉ）選択可能なマーカー遺伝子；（ｉｉ）ランディングパッドを含む、請求項１９に記載のトランスジェニックブタ。
  21. 前記プロモーターの少なくとも１つが、外因性プロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  22. 前記調節可能プロモーターが、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項２１に記載のトランスジェニックブタ。
  23. 前記少なくとも４つの導入遺伝子が、第１のポリシストロンおよび第２のポリシストロンとして発現され、前記少なくとも２つのプロモーターが、前記第１のポリシストロンの発現を制御する第１のプロモーターおよび前記第２のポリシストロンの発現を制御する第２のプロモーターを含む、請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  24. 前記トランスジェニックブタが、少なくとも４つのプロモーターを含み、前記少なくとも４つの導入遺伝子のそれぞれが、専用のプロモーターによって制御される、請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  25. （ｉ）前記第１のプロモーターが、前記第２のプロモーターと異なっているか；
    （ｉｉ）前記第１のプロモーターが、構成的プロモーターであり、前記第２のプロモーターが、組織特異的プロモーターであるか；
    （ｉｉｉ）前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、構成的プロモーターであるか；または
    （ｉｖ）前記少なくとも２つのプロモーターが、ＣＡＧおよびｐＴＢＭプロモーターを含む、
    請求項２３に記載のトランスジェニックブタ。
  26. 前記組織特異的プロモーターが、内皮細胞特異的なプロモーターであるか；または前記組織特異的プロモーターが、ＴＢＭプロモーター、ＥＰＣＲプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、および／もしくはＴｉｅ－２プロモーターから選択される内皮細胞特異的なプロモーターである、請求項１８に記載のトランスジェニックブタ。
  27. 前記少なくとも４つの導入遺伝子が、抗凝血剤、補体阻害剤、イムノモジュレーター、細胞保護的導入遺伝子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  28. （ｉ）前記抗凝血剤が、ＴＢＭ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、ＣＤ３９およびそれらの組合せからなる群から選択され；
    （ｉｉ）前記補体阻害剤が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびそれらの組合せからなる群から選択され；
    （ｉｉｉ）前記イムノモジュレーターが、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＬＴＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮおよびそれらの組合せからなる群から選択される免疫抑制剤であり；
    （ｉｖ）前記イムノモジュレーターが、ＣＤ４７であり；
    （ｖ）前記細胞保護的導入遺伝子が、ＨＯ－１、Ａ２０およびそれらの組合せからなる群から選択される、
    請求項２７に記載のトランスジェニックブタ。
  29. （ｉ）前記導入遺伝子のうちの少なくとも２つが、抗凝血剤であるか；
    （ｉｉ）前記導入遺伝子のうちの少なくとも１つが、細胞保護的導入遺伝子であるか；
    （ｉｉｉ）前記導入遺伝子のうちの少なくとも１つが、イムノモジュレーターであるか；または
    （ｉｖ）前記導入遺伝子のうちの少なくとも１つが、補体阻害剤である、
    請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  30. 少なくとも１つの追加の遺伝学的改変をさらに含む、請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  31. 前記少なくとも１つの追加の遺伝学的改変が、
    （ｉ）遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入；またはそれらの組合せからなる群から選択されるか；
    （ｉｉ）ヒトＣＤ４６の取り込みおよび発現を含むか；
    （ｉｉｉ）ヒトＨＬＡ－Ｅの取り込みおよび発現を含むか；
    （ｉｖ）β４ＧａｌＮＴ２遺伝子のノックアウトを含むか；
    （ｖ）ＣＭＡＨ遺伝子のノックアウトを含むか；あるいは
    （ｖｉ）少なくとも１つのネイティブの遺伝子の発現の排除または低減をもたらす、
    請求項３０に記載のトランスジェニックブタ。
  32. 前記少なくとも１つの追加の遺伝学的改変が、少なくとも、
    （ｉ）少なくとも２つの追加の導入遺伝子；
    （ｉｉ）第２の単一の遺伝子座における２つの追加の導入遺伝子；または
    （ｉｉｉ）第２の単一の遺伝子座における４つの追加の導入遺伝子
    の取り込みおよび発現を含む、請求項３０に記載のトランスジェニックブタ。
  33. （ｉ）前記単一の遺伝子座が、ＧＧＴＡ１であり、前記第２の単一の遺伝子座が、ＣＭＡＨであるか；
    （ｉｉ）前記単一の遺伝子座が、β４ＧａｌＮＴ２であり、前記第２の単一の遺伝子座が、ＣＭＡＨであるか；
    （ｉｉｉ）前記単一の遺伝子座が、ＣＭＡＨであり、前記第２の単一の遺伝子座が、β４ＧａｌＮＴ２であるか；または
    （ｉｖ）前記単一の遺伝子座が、ＧＧＴＡ１であり、前記第２の単一の遺伝子座が、β４ＧａｌＮＴ２である、
    請求項３２に記載のトランスジェニックブタ。
  34. 前記少なくとも１つのネイティブの遺伝子が、ＣＭＡＨ、ｉｓｏＧｌｏｂｏｓｉｄｅ ３シンターゼ、β４ＧａｌＮＴ２、フォルスマンシンターゼ、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３１に記載のトランスジェニックブタ。
  35. 前記トランスジェニックブタが、
    （ａ）ＣＤ４６と；
    （ｂ）
    （ｉ）ＥＰＣＲ、ＨＯ－１、ＴＢＭ、およびＣＤ４７；
    （ｉｉ）ＥＰＣＲ、ＨＯ１、ＴＢＭ、およびＴＦＰＩ；
    （ｉｉｉ）ＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；
    （ｉｖ）ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＴＦＰＩ、およびＣＤ４７；または
    （ｖ）ＥＰＣＲ、ＣＤ５５、ＴＢＭ、およびＣＤ３９
    から選択される少なくとも４つの導入遺伝子の組合せと
    を発現する、請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  36. 前記第１または第２のポリシストロンのいずれかで発現される前記４つの導入遺伝子のうち２つが、ＴＢＭ、ＥＰＣＲ、ＤＡＦ、ＣＤ３９、ＴＦＰＩ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、ＨＯＩ、Ａ２０、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ４７からなる群から選択される、請求項２３に記載のトランスジェニックブタ。
  37. 導入遺伝子の少なくとも１つの対が、
    （ａ）ＴＢＭおよびＣＤ３９；
    （ｂ）ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；
    （ｃ）Ａ２０およびＣＤ４７；
    （ｄ）ＴＦＰＩおよびＣＤ４７；
    （ｅ）ＣＩＩＴＡＫＤおよびＨＯ－１
    （ｆ）ＴＢＭおよびＣＤ４７；
    （ｇ）ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＴＦＰＩ；
    （ｈ）ＣＩＩＴＡＫＤおよびＡ２０；
    （ｉ）ＴＢＭおよびＡ２０；
    （ｊ）ＥＰＣＲおよびＤＡＦ；
    （ｋ）ＴＢＭおよびＨＯ－１；
    （ｌ）ＴＢＭおよびＴＦＰＩ；
    （ｍ）ＣＢＴＡおよびＴＦＰＩ；
    （ｎ）ＥＰＣＲおよびＨＯ－１；
    （ｏ）ＴＢＭおよびＣＤ４７；
    （ｐ）ＥＰＣＲおよびＴＦＰＩ；
    （ｑ）ＴＢＭおよびＥＰＣＲ；
    （ｒ）ＣＤ４７およびＨＯ－１；
    （ｓ）ＣＤ４６およびＣＤ４７；
    （ｔ）ＣＤ４６およびＨＯ－１；
    （ｕ）ＣＤ４６およびＴＢＭ；ならびに
    （ｖ）ＨＬＡ－ＥおよびＣＤ４７
    からなる群から選択される、請求項２３に記載のトランスジェニックブタ。
  38. 前記トランスジェニックブタが、前記成長ホルモン受容体の発現を欠如しており、
    （ｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；
    （ｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｔｉｅｃａｇ－Ａ２０．ＣＤ４７；
    （ｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；
    （ｉｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．Ａ２０－１；
    （ｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＴＬＡ４Ｉｇ．ＴＦＰＩ－ｔｉｅｃａｇ－ＣＩＩＴＡＫＤ．ＨＯ－１；
    （ｖｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ３９－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ５５；
    （ｖｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．Ａ２０－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；
    （ｖｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；
    （ｉｘ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；
    （ｘ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＣＩＩＴＡ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；
    （ｘｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ；
    （ｘｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．Ｉｃａｍ－２－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＨＯ－１；
    （ｘｉｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＨＯ－１－ｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７；
    （ｘｉｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＣＤ４７－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＴＦＰＩ；
    （ｘｖ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＴＦＰＩ－ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＣＤ４７；
    （ｘｖｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｐＴＢＭｐｒ－ＴＢＭ．ＥＰＣＲ－ｃａｇ－ＣＤ４７．ＨＯ－１；または
    （ｘｖｉｉ）ＧＴＫＯ．ＣＤ４６．ｃａｇ－ＥＰＣＲ．ＤＡＦ－ｔｉｅｃａｇ－ＴＦＰＩ．ＣＤ４７
    から選択される遺伝子型を含む、請求項１７に記載のトランスジェニックブタ。
  39. 請求項１から３８に記載のトランスジェニックブタから得られた臓器。
  40. 請求項１から３８に記載のトランスジェニックブタから得られた肺または肺断片、心臓または心臓断片、腎臓または腎臓断片、肝臓または肝臓断片。
  41. 請求項１から３８に記載のトランスジェニックブタから得られた組織。
  42. 請求項１から３８に記載のトランスジェニックブタから得られた細胞。
  43. 少なくとも４つの導入遺伝子を発現するが、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／または成長ホルモン受容体の発現が欠如したトランスジェニックブタを作製する方法であって、（ｉ）ブタゲノム内の単一の遺伝子座に、少なくとも２つのプロモーターの制御下に少なくとも４つの導入遺伝子を取り込ませて、多遺伝子性ブタゲノムを提供すること；（ｉｉ）前記多遺伝子性ブタゲノムを含む細胞をトランスジェニックブタに成熟させることを含む方法。
  44. 前記ブタゲノムが、体細胞ブタゲノムであり、前記細胞は、ブタ接合体であり、前記ブタ接合体は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、および前記多遺伝子性ブタゲノムを、マイクロインジェクションによって再構築されたＳＣＮＴ接合体に移入することによって提供される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記体細胞ブタゲノムが、少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を含む、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つの追加の遺伝学的改変が、遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入；またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記多遺伝子性ブタゲノムに少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を導入することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記少なくとも１つの追加の遺伝学的改変が、遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入；またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４５または４７に記載の方法。
  49. 前記ブタゲノムが、
    （ｉ）配偶子ブタゲノム、接合体ブタゲノム、胎児ブタゲノムもしくは胚盤胞ブタゲノムからなる群から選択されるか；または
    （ｉｉ）少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を含む、
    請求項４３に記載の方法。
  50. 前記少なくとも１つの追加の遺伝学的改変が、遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入；またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記多遺伝子性ブタゲノムに少なくとも１つの追加の遺伝学的改変を導入することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記少なくとも１つの遺伝学的改変が、遺伝子ノックアウト；遺伝子ノックイン；遺伝子置き換え；点突然変異；遺伝子、遺伝子断片もしくはヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換；大きいゲノムの挿入またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４９または５１に記載の方法。
  53. 前記取り込むことが、
    （ｉ）生物学的なトランスフェクション、化学的なトランスフェクション、物理的なトランスフェクション、ウイルス媒介形質導入もしくは形質転換、またはそれらの組合せからなる群から選択される方法を含むか；あるいは
    （ｉｉ）細胞質マイクロインジェクションおよび前核マイクロインジェクションを含む、
    請求項４３に記載の方法。
  54. 前記単一の遺伝子座が、
    （ｉ）ネイティブの遺伝子座であるか；
    （ｉｉ）改変されたネイティブの遺伝子座であるか；
    （ｉｉｉ）遺伝子編集が媒介する挿入もしくは欠失もしくは置換を含む改変されたネイティブの遺伝子座であるか；
    （ｉｖ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはランディングパッドから選択されるトランスジェニックＤＮＡを含む改変されたネイティブの遺伝子座であるか；
    （ｖ）ネイティブのＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；
    （ｖｉ）改変されたＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；
    （ｖｉｉ）トランスジェニックＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；
    （ｖｉｉｉ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはトランスジェニックパッドを含むトランスジェニックＧＧＴＡ１遺伝子座であるか；
    （ｘｉｘ）ネイティブのＣＭＡＨ遺伝子座であるか；
    （ｘ）改変されたＣＭＡＨ遺伝子座であるか；
    （ｘｉ）トランスジェニックＣＭＡＨ遺伝子座であるか；
    （ｘｉｉ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはトランスジェニックパッドを含むトランスジェニックＣＭＡＨ遺伝子座であるか；
    （ｘｉｉｉ）単一の遺伝子座が、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２、ＡＡＶＳ１遺伝子座およびＲｏｓａ２６からなる群から選択されるネイティブの遺伝子座であるか；
    （ｘｉｖ）ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２、ＡＡＶＳ１遺伝子座およびＲｏｓａ２６からなる群から選択される改変された遺伝子座であるか；
    （ｘｖ）ＧＧＴＡ１遺伝子座ではないか；
    （ｘｖｉ）ネイティブのβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；
    （ｘｖｉｉ）改変されたβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；
    （ｘｖｉｉｉ）トランスジェニックβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座であるか；または
    （ｘｉｘ）選択可能なマーカー遺伝子もしくはトランスジェニックパッドを含むトランスジェニックβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子座である、
    請求項４３に記載の方法。
  55. 前記トランスジェニックＤＮＡが、ポリヌクレオチド改変酵素のための１つまたは複数の認識配列を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ポリヌクレオチド改変酵素が、操作されたエンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. （ｉ）前記操作されたエンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、およびクラスター化された等間隔にスペーサーが入った短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼからなる群から選択されるか；または
    （ｉｉ）前記部位特異的リコンビナーゼが、ラムダインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ガンマ－デルタレゾルバーゼ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ＯＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂｌ－インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼまたはそれらの組合せからなる群から選択される、
    請求項５６に記載の方法。
  58. 前記少なくとも１つの追加の遺伝学的改変が、
    （ｉ）ＣＤ４６の取り込みおよび発現；
    （ｉｉ）ヒトＨＬＡ－Ｅの取り込みおよび発現；または
    （ｉｉｉ）β４ＧａｌＮＴ２遺伝子、ＣＭＡＨ遺伝子、およびＧＧＴＡ１遺伝子からなる群から選択される遺伝子のノックアウト
    を含む、請求項４５から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 請求項４３から５８のいずれか一項に記載の方法によって生産されたトランスジェニック動物または生産群。
  60. 前記トランスジェニックブタを第２のトランスジェニックブタと交配させることをさらに含み、前記第２のトランスジェニックブタは、少なくとも１つの遺伝学的改変を含む、請求項４３から５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記少なくとも１つの遺伝学的改変が、
    （ｉ）抗凝血剤、補体阻害剤、イムノモジュレーター、細胞保護的導入遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの導入遺伝子の取り込みおよび発現；または
    （ｉｉ）少なくとも１つの豚遺伝子のノックアウト
    を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 請求項４３から６１のいずれか一項に記載の方法によって生産されたトランスジェニック動物または生産群。
  63. それを必要とする対象を処置するための方法であって、請求項１から３８に記載のトランスジェニックブタから得られた少なくとも１つの臓器、臓器断片、組織または細胞を、前記それを必要とする対象に埋め込むことを含む方法。
  64. 前記少なくとも１つの臓器または臓器断片が、
    （ｉ）肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、もしくはそれらの組合せからなる群から選択されるか；または
    （ｉｉ）肺
    である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記それを必要とする対象が、進行した肺疾患を有し、肺または肺断片が埋め込まれる、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記進行した肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、アルファ１－アンチトリプシン疾患、または原発性肺高血圧症に関連する、請求項６５に記載の方法。
  67. 拒絶反応抑制剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗微生物剤、および抗ウイルス物質ならびにそれらの組合せから選択される１種または複数の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記遺伝子編集が媒介する挿入もしくは欠失もしくは置換が、定義された配列の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含むか；または前記遺伝子編集が媒介する挿入もしくは欠失もしくは置換が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって媒介される、請求項５６に記載の方法。
  69. 前記臓器が、それを必要とする対象における罹患した臓器または機能不全の臓器を、前記対象に前記臓器を埋め込むことによって置き換えるかまたは補うために使用され、
    前記臓器の移植は、ｉ）腎臓移植；ｉｉ）肺移植、ｉｉｉ）心移植；ｉｖ）肝臓移植；またはｖ）膵臓移植であり；
    前記対象は、哺乳動物、非ヒト霊長類、またはヒトである、請求項３９に記載の臓器。
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Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6872868B1 (en) 1981-06-12 2005-03-29 Ohio University Transgenic mammals
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
US4888274A (en) 1985-09-18 1989-12-19 Yale University RecA nucleoprotein filament and methods
US4994384A (en) 1986-12-31 1991-02-19 W. R. Grace & Co.-Conn. Multiplying bovine embryos
US5057420A (en) 1987-06-05 1991-10-15 Granada Biosciences, Inc. Bovine nuclear transplantation
BR8907666A (pt) 1988-09-21 1991-07-30 Cambridge Animal Biotech Derivacao de linhas de celulas embrionarias pluripotenciais de animais domesticos
US4944384A (en) 1989-01-30 1990-07-31 Hay & Forage Industries Trash discharge apparatus for crop transferring conveyor mechanism
US4997384A (en) 1989-04-17 1991-03-05 Otis Engineering Corporation Wet connector
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5859307A (en) 1992-02-04 1999-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Mutant RAG-1 deficient animals having no mature B and T lymphocytes
US5334575A (en) 1992-12-17 1994-08-02 Eastman Kodak Company Dye-containing beads for laser-induced thermal dye transfer
US5496720A (en) 1993-02-10 1996-03-05 Susko-Parrish; Joan L. Parthenogenic oocyte activation
CA2157659C (en) 1993-03-16 2003-10-21 Mauro S. Sandrin Use of porcine gal .alpha. (1,3) galactosyl transferase in xenograft therapies
GB9308271D0 (en) 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US5453457A (en) 1993-11-12 1995-09-26 Bayer Corporation Gamma-radiation-resistant polycarbonate composition
WO1995020661A1 (en) 1994-01-27 1995-08-03 Bresatec Ltd. Materials and methods for management of hyperacute rejection in human xenotransplantation
AU2233295A (en) 1994-04-13 1995-11-10 Biotransplant Incorporated Alpha(1,3) galactosyltransferase negative swine
WO1996039154A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
GB9517779D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517780D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
US5730403A (en) 1995-10-26 1998-03-24 Johnson; Mark C. Arched panel wrist support
JP2001500725A (ja) 1996-08-19 2001-01-23 ユニヴァーシティー オヴ マサチューセッツ 種間核移植により製造される胚性または幹細胞様細胞株
US6215041B1 (en) 1997-01-10 2001-04-10 University Of Mmassachusetts Cloning using donor nuclei from a non-quiesecent somatic cells
US5945577A (en) 1997-01-10 1999-08-31 University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells
US6235969B1 (en) 1997-01-10 2001-05-22 University Of Massachusetts Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells
US6498285B1 (en) 1997-08-06 2002-12-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for producing transgenic pigs by microinjecting a blastomere
GB9807520D0 (en) 1998-04-09 1998-06-10 Univ Wales Medicine Modified biological material
GB9809280D0 (en) 1998-04-30 1998-07-01 Rpms Technology Ltd Immunosupression
DE29812617U1 (de) 1998-07-15 1999-11-25 Lear Corp Gmbh & Co Kg Vorrichtung zur Herstellung einer Faserkompaktschicht
WO2000022098A1 (en) 1998-10-12 2000-04-20 Geron Bio-Med Limited Porcine oocytes with improved developmental competence
GB9825555D0 (en) 1998-11-20 1999-01-13 Imp College Innovations Ltd Suppression of xenotransplant rejection
US6258998B1 (en) 1998-11-24 2001-07-10 Infigen, Inc. Method of cloning porcine animals
WO2000051424A2 (en) 1999-03-04 2000-09-08 Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. Genetic modification of somatic cells and uses thereof
EP1165752A4 (en) 1999-10-22 2003-02-05 Alexion Pharma Inc MODIFIED RECOMBINATION MOLECULE REGULATING HUMOR AND CELLULAR EFFECTOR FUNCTIONS OF THE IMMUNE SYSTEM
US6639122B1 (en) 2000-09-19 2003-10-28 Animal Technology Institute Taiwan Transgenic swine having HLA-D gene, swine cells thereof and xenografts therefrom
AU2002326353A1 (en) 2001-07-09 2003-01-29 Alexion Pharmaceuticals Inc. Cloned non-human mammals from contact inhibited donor cells
AU2002364596A1 (en) 2001-12-21 2003-07-15 Immerge Biotherapeutics, Inc. Knockout swine and methods for making the same
US20030167500A1 (en) 2001-12-21 2003-09-04 Ram Ramabhadran Methods and compositions for generating a genetically modified animal using lentiviral vectors
JP2005535343A (ja) 2002-08-14 2005-11-24 イマージ バイオセラピューティクス，インコーポレーテッド α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損細胞、選択する方法、およびそれらから作製されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ欠損ブタ
JP2005536228A (ja) 2002-08-21 2005-12-02 レビビコア， インコーポレイテッド 機能的α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのいかなる発現をも欠くブタ動物
JP2007525955A (ja) 2003-06-06 2007-09-13 ユニバーシティー オブ ピッツバーグ ブタｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子
EP1685148A2 (en) 2003-11-05 2006-08-02 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education PORCINE ISOGLOBOSIDE 3 SYNTHASE PROTEIN, cDNA, GENOMIC ORGANIZATION, AND REGULATORY REGION
CA2565986A1 (en) 2004-05-07 2005-11-24 University Of Pittsburgh Of The Commnonwealth System Of Higher Education Porcine forssman synthetase protein, cdna, genomic organization, and regulatory region
US7378569B2 (en) 2004-06-01 2008-05-27 Animal Technology Institute Taiwan Transgenic pigs carrying both hHO-1 and hDAF transgenes for xenotransplantation
WO2007035213A2 (en) 2005-08-09 2007-03-29 Revivicor, Inc. Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof
ES2696825T3 (es) 2009-12-10 2019-01-18 Univ Minnesota Modificación del ADN inducida por el efector TAL
ES2680636T3 (es) 2011-02-14 2018-09-10 Revivicor Inc. Cerdos genéticamente modificados para xenotrasplante de xenoinjertos vascularizados y derivados de los mismos
CA2998187A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 Revivicor, Inc. Multi-transgenic pig for xenotransplantation
CN112367992A (zh) * 2018-03-29 2021-02-12 布鲁诺·瑞卡特 原位和异位异种心脏、肾脏、肺或肝脏移植后延长存活的组合物
CN108949832A (zh) * 2018-07-13 2018-12-07 中国农业大学 一种用于敲除猪ghr基因的打靶载体及其应用
EP3872183A4 (en) * 2018-10-24 2022-08-03 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology ANIMAL MODEL WITH IGF-1 GENE MUTATION FOR DWARFING AND METHODS FOR ITS PRODUCTION

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