CN105101965B - 用于干细胞活动化、归巢、扩增和分化的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供增加干细胞的活动化、归巢、扩增，和/或分化的组合物，以及使用所述组合物用于哺乳动物治疗的方法。

Description

用于干细胞活动化、归巢、扩增和分化的组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求根据35U.S.C.§119(e)的2013年3月15日提交的美国临时专利申请系列流水号61/791,623；2013年6月7日提交的美国临时专利申请系列流水号61/832,713；和2013年10月30日提交的美国临时专利申请系列流水号61/897,449的优先权；其各自公开通过提述并入本文。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域。更具体的，本发明描述了用于干细胞的移动化、归巢、扩增，和/或分化的组合物和使用它们的方法。

技术背景

干细胞具有在培养物分裂无限周期和成为多种多样的特化细胞和组织种类的能力，其接着能够用于多种疾病的基础研究，药物开发，以及治疗(或预防)。干细胞通常分为两大类：成体干细胞和胚胎干细胞。

成体干细胞是未分化的，但存在于分化的组织中，并能够分化为所述成体干细胞起源的组织中的细胞类型。已从多种来源分离成体干细胞，例如神经系统、骨髓；脂肪组织、真皮、胰腺和肝。也已经从脐带和胎盘分离干细胞。据信成体种类的干细胞也存在于平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨海绵组织、软骨组织、胰腺导管组织、脾组织、胸腺组织、扁桃体组织、派伊尔氏淋巴集结组织(Peyer's patch tissue)、淋巴结组织、甲状腺组织、表皮组织、真皮组织、皮下组织、心脏组织、肺组织、血管组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、脂肪组织、子宫组织、眼组织(包括视网膜组织)、肺组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、结缔组织、内分泌组织，以及肠系膜组织。

胚胎干细胞是来自于胚胎的未分化细胞。通常来说，这些细胞从囊胚的内细胞团提取，当在独特的培养条件下独自或与各种滋养细胞联合培养时，所述胚胎干细胞保持整倍体核型，不经历衰老，并且保留了分化为内胚层、外胚层和中胚层系的细胞的能力。

间充质干细胞(MSC)指代具有自我更新的潜力并能分化为多种间充质系的细胞。这些细胞可能具有产生其它胚层细胞类型例如神经元细胞的能力。MSC的主要来源是从骨髓和其它组织分离，例如脂肪组织。由于其在成体组织中的稀缺，MSC通常仅以少量分离，然而，其具有广泛的增殖能力，并能够在培养物中容易地扩增(expand)来通过多次传代产生临床相关数量的细胞。这些细胞已显示支持组织修复和再生，使得它们成为用于各种治疗应用的有前途的工具。

干细胞最早的临床用途中的一个是在患有血液恶性肿瘤的患者中进行骨髓移植，其中在用不仅去除血液恶性肿瘤而且去除非恶性造血作用的辐射和/或化学疗法的剂量治疗受体后，将源自供体骨髓的造血干细胞施用到受体中。非恶性造血干细胞的施用导致供体特异性的造血，以及在一些患者中恶性肿瘤的治愈。这一方法首次描述于1957年在患有急性白血病的患者中骨髓去除后。在施用高剂量的化学疗法和/或放射疗法用于实体瘤治疗的患者中，干细胞还被用作自体骨髓移植来恢复骨髓。对于乳腺癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌，以及其它种类的癌症，自体造血干细胞移植和用于实体瘤的高剂量化/放疗的组合已被广泛研究。

对于各种自身免疫迹象包括风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮，以及系统性硬化症，也已经进行了自体干细胞的临床应用。

通过这些细胞在广泛的疾病治疗中的用途，阐明了用来扩增干细胞(成体和/或胚胎衍生化两者)的技术的重要性。用于这些治疗中的细胞培养系统(例如液体静置培养、半固体培养和长期骨髓培养)似乎具有其独特的要求，在能够培养人类或其它哺乳动物物种的干细胞之前，必须满足这些要求。然而，迄今为止，干细胞培养系统的一个共同要求和缺点是要求动物血清(例如胎牛血清或马血清)中含有的不确定组分用于干细胞的最优生长或扩增。

由于几个原因，血清在造血干细胞培养中的使用是不利的。血清是不确定的分化因子的主要来源，因此倾向于促进造血干细胞分化而不是扩增。血清批次之间的血清效率是不同的。已发现一些批次的血清对于细胞是有毒性的。此外，血清可能被感染源污染，例如支原体、噬菌体，以及病毒。这些问题导致了培养基生长支持特性的不一致性，使得干细胞生产方法的标准化困难以及对在含有血清的培养基中实施的实验的解释困难。因此，对于干细胞相关的疗法的临床实施，血清的使用代表了一种主要的障碍。

因此，研究者尝试使用不同程度化学限定的无血清培养基在取代动物血清或条件化培养基。这些尝试已取得了不同程度的成功，取决于所试图扩增的细胞类型。无血清培养基的开发已有综述(Sandstrom,E.E.等,Biotech.&Bioengin.43:706-733(1994)；Collins,P.C.等,Curr.Opin.Biotech.7:223-230(1996)；McAdams,T.A.等,TIBTECH 14:341-349(1996))。一种更具吸引力的选择是确定的无血清培养基。因此，理想的情况是开发确定的无血清培养基和用于(i)分离干细胞和(ii)在延长的时段内通过多次传代扩增这些细胞同时保持其多系分化潜能的方法。确定的无血清培养基的创造和方法将提供强大的平台，其有助于实现基于干细胞的疗法的临床实施。

发明概述

本发明的一个实施方案是在受试者中引起选自下组效果的方法：干细胞活动化(stem cell mobilization)、干细胞归巢、干细胞扩增(expansion)，以及干细胞的分化。所述方法包括将DA-DKP施用到有此需要的受试者中。在本文所述的这一实施方案以及所有其它实施方案中，DA-DKP可以以各种剂型施用，以各种施用途径使用，以及通过各种方法生产。例如，所述DA-DKP可以作为包括DA-DKP的药物组合物施用。这种药物组合物还可以包括N-乙酰色氨酸、辛酸盐(酯)(caprylate)和/或辛酸。这种药物组合物可以包括人类血清白蛋白的级分，其中白蛋白的基本上所有已经从所述级分移除，或可以包括人类血清白蛋白的低分子量级分，例如少于5000分子量级分。这种人类血清白蛋白部分可以通过过滤产生。另外，所述药物组合物可以通过在有效地导致DA-DKP形成的条件下加热人类血清白蛋白来制备，或通过包括在有效地产生DA-DKP的条件下将人类血清白蛋白与酶接触的方法制备，所述酶剪切(cleave)人白蛋白N末端的两个氨基酸。所述DA-DKP可以是合成的DA-DKP。

在本发明的所有实施方案中，所述DA-DKP可以局部(locally)施用到受试者。例如，局部施用的部位可以选自关节、手术部位、分段骨架间隙(segmented skeletal gap)或未愈合骨折(non-union fracture)的部位、伤口、溃疡、和炎症性皮疹。另外，所述DA-DKP可以作为肠胃外制剂施用，可以系统性施用到受试者，或者可以作为口服剂量制剂施用。此外，所述DA-DKP可以作为可植入装置的部分配制，所述装置例如选自海绵、生物相容性聚合物、生物可腐蚀性聚合物、油灰(putty)、凝胶、骨基质、人工骨基质、螺栓(bolt)、螺钉(screw)、气管内导管、支架、隐形眼镜、心脏起搏器(pacemaker)、中央IV管(central IVtube)、弗利(foley)导管和颅内装置的一种。

在本发明的所有实施方案中，DA-DKP的施用可以增加CXCR4的生产，减少CXCL12的生产，增加MMP14或MMP13的生产，增加聚集蛋白聚糖(aggrecan)的生产，增加SDF1的生产，增加胶原蛋白2A1的生产，或前述任意组合。另外，DA-DKP的施用可以减少选自下组的蛋白的生产：MAPK-活化的蛋白激酶3，β-肾上腺素能受体激酶1，带有血小板反应蛋白I类基序的ADAM金属肽酶，MAPK-活化的蛋白激酶2，C-Src激酶、巨噬细胞清道夫受体(MacrophageScavenger Receptor)，Noggin，Bruton酪氨酸激酶，糖原合酶激酶-3α/β，糖原合酶激酶-3α/β，HSP 90α/β，HSP 90α/β，磷酸肌醇-3-激酶，催化亚基α，以及真核翻译起始因子4A，成纤维细胞生长因子17，以及其组合。此外，DA-DKP的施用可以减少选自下组的蛋白的生产：MAPK-活化的蛋白激酶3，Noggin，磷酸肌醇-3-激酶，催化亚基α，及其组合。DA-DKP的施用还可以增加选自下组的蛋白的生产：丛生蛋白(Clusterin)(载脂蛋白J)，凝血酶原，C1QBP(透明质酸结合蛋白1)，TNFSF15(VEGF抑制剂)，乳腺珠蛋白(Mammaglobin)2，MIP3b(CCL 19)，MCP1(CCL 2)，PTHrP，脊椎蛋白(Spondin)1，Elafin(弹性蛋白酶抑制剂)，IL 11，NPS-PLA2，CFC 1(隐性(cryptic)蛋白)，睾丸蛋白聚糖(Testican)(SPOCK 1)，血管生成素，URB，MMP-3，IP10(cxcl 10)，BSSP 4，IL-8(cxcl 8)，RSPO2，半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)C，bFGF，H因子，凝固因子IX，SDF-11(cxcl 12)，CATC(二肽基肽酶1)，PIGR，ck-b-8-1(MPIF 1剪接变体)，C1s，EMR2，ART，DPP 2，SAA，TIMP-1，脑信号蛋白(Semaphorin)3A，及其组合。DA-DKP的施用还可以增加选自下组的蛋白的产生：丛生蛋白(载脂蛋白J)，C1QBP(透明质酸结合蛋白1)，MCP1(CCL 2)，PTHrP，Elafin(弹性蛋白酶抑制剂)，IL 11，MMP-3，bFGF，SAA，TIMP-1，脑信号蛋白3A及其组合。DA-DKP的施用还可以减少选自下组的蛋白的产生：MAPK-活化的蛋白激酶3，Noggin，磷酸肌醇-3-激酶，催化亚基α，及其组合并增加选自下组的蛋白的产生：丛生蛋白(载脂蛋白J)，C1QBP(透明质酸结合蛋白1)，MCP1(CCL 2)，PTHrP，Elafin(弹性蛋白酶抑制剂)，IL 11，MMP-3，bFGF，SAA，TIMP-1，脑信号蛋白3A，及其组合。此外，DA-DKP的施用可以下调受试者中的Akt途径。

本发明的另一个实施方案是通过将包含DA-DKP以及可选的选自N-乙酰色氨酸、辛酸盐(酯)、辛酸，及其组合的组分的药物组合物施用到有此需要的受试者以在受试者中刺激软骨形成的方法。在这一实施方案中，可以在干细胞，例如选自祖细胞和间充质干细胞(MSC)的干细胞中刺激软骨形成。在这一实施方案中，对软骨形成的刺激可以在受试者中促进软骨、骨，和/或韧带修复，或诱导软骨组织的修复或再生。此外，所述软骨形成可以在受试者中治疗或改善软骨疾病，而所述软骨疾病可以是先天软骨疾病，退行性或纤维变性关节，类风湿性关节炎或骨关节炎。在这一实施方案中，所述软骨形成可以治疗或修复选自下组的病症：软骨缺陷、骨骼缺陷，或由外伤或手术引起的骨折。另外，DA-DKP施用可以刺激新的骨或软骨组织的形成。

在刺激软骨形成的方法中，所述施用可以包括离体刺激干细胞，接着将经刺激的干细胞施用到受试者。例如，可以通过使用DA-DKP或包含DA-DKP的组合物以足够刺激软骨形成的时间来培养软骨细胞系的干细胞群体，来离体刺激所述干细胞，而施用步骤包括将经刺激的细胞移植到受试者中的期望部位中。在这一实施方案中，软骨形成可以导致胶原蛋白、2A1类胶原蛋白、1A1类胶原蛋白的产生增加，或胶原蛋白产生的2倍、4倍、10倍、20倍，或25倍增加。

本发明进一步的实施方案包括DA-DKP或包括DA-DKP的组合物在制备用于在哺乳动物中刺激软骨形成的药物中的用途，以及DA-DKP或包括DA-DKP的组合物用于在哺乳动物中软骨形成的刺激中的用途。

本发明的另一个实施方案是在受试者中刺激神经组织发育的方法，所述方法通过将包括DA-DKP的药物组合物以及可选的选自N-乙酰色氨酸，辛酸盐(酯)，辛酸及其组合的组分的药物组合物施用到有此需要的受试者。在这一实施方案中，神经组织的发育可以在干细胞，例如祖细胞或间充质干细胞(MSC)中刺激。对神经组织发育的刺激可以在受试者中促进脑、脊髓，和/或外周神经修复，或诱导神经元、神经胶质，和/或星型胶质细胞的修复和再生。神经组织的发育可以在受试者中治疗或改善中枢神经系统疾病和/或外周神经系统疾病，例如神经退行性疾病。另外，神经组织的发育可以治疗或修复以下疾患，其选自外伤或手术引起的损伤。

在刺激神经组织发育的方法中，所述施用可以包括离体刺激干细胞，接着将经刺激的干细胞施用到所述受试者。例如，可以通过将神经元、神经胶质，和/或星型胶质细胞系的干细胞群体与DA-DKP或包括DA-DKP的组合物培养足够达足以刺激神经组织的发育的时间来离体刺激干细胞，而施用步骤包括将经刺激的细胞移植到受试者中的期望部位中。

本发明进一步的实施方案包括DA-DKP或包括DA-DKP的组合物在制备用于在受试者中刺激神经组织发育的药物中的用途，以及DA-DKP或包括DA-DKP的组合物用于受试者中神经组织发育的刺激中的用途。

本发明进一步的实施方案是通过是将DA-DKP施用到有此需要的受试者来在受试者中刺激组织发育的方法。在这一实施方案中，所述组织可以选自神经系统组织、脂肪组织、肝组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨海绵组织、软骨组织、胰腺导管组织、脾组织、胸腺组织、扁桃体组织、派伊尔氏淋巴集结组织、淋巴结组织、甲状腺组织、表皮组织、真皮组织、皮下组织、心脏组织、肺组织、血管组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、脂肪组织、子宫组织、眼组织、肺组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、结缔组织、内分泌组织，以及肠系膜组织。

本发明进一步的实施方案是不含血清的真核细胞培养基补充物，其包含DA-DKP，其中使用所述补充物补充的细胞培养基可以支持干细胞的扩增，以及一种组合物，其包含使用所述培养基补充物补充的不含血清的培养基中的干细胞。

本发明的另一个实施方案是扩增干细胞的方法，其包括使干细胞与DA-DKP接触，以及在适合促进干细胞的扩增的条件下培养所述干细胞。

本发明的进一步的实施方案是向哺乳动物提供干细胞的方法，所述方法通过使干细胞与DA-DKP接触，在适合促进细胞扩增的条件下培养所述干细胞；以及将扩增的细胞引入受试者中。

本发明再进一步的实施方案是导致干细胞分化为具体细胞类型的方法，所述方法通过使干细胞与DA-DKP接触，在适合促进干细胞扩增的条件下培养所述干细胞，以及加入一种或多种分化因子或改变培养条件来诱导干细胞的分化，来形成不同类型的细胞。

本发明的另一个实施方案是向受试者提供分化的干细胞的方法。所述方法包括使干细胞与DA-DKP接触，在适合促进干细胞扩增的条件下培养所述干细胞，以及加入一种或多种分化因子或改变培养条件来诱导干细胞的分化，来形成不同类型的细胞。所述方法进一步包括将分化的细胞引入到所述受试者中。

本发明概述不意图限制，也不应被解释为代表本发明的全部范围。此外，本文中做出的引用“本发明”，或其方面，应理解为表示本发明的某些实施方案，而不必要解释为将所有实施方案限制为具体的描述。本发明在发明简述以及附图和发明详述中以不同的详细程度陈述，而不通过本发明概述中要素，组分等的包含或不包含对本发明的范围限制。本发明另外的方面将从发明详述变得更为显而易见，特别是当与附图一同考虑时。

附图简述

图1阐明了接受Ampion^TM的骨关节炎患者与接受生理盐水(saline)的患者相比，疼痛评分的均值变化。

图2是使用生理盐水、地塞米松、DA-DKP和Ampion^TM处理的干细胞的细胞聚集照片。

图3阐明了与生理盐水相比，使用DA-DKP处理的干细胞胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的转录增加。

图4阐明了与生理盐水相比，通过Ampion^TM在3D培养中生长的间充质干细胞产生的CXCR4的增加。

图5阐明了与生理盐水相比，通过Ampion^TM在3D培养中生长的间充质干细胞产生的CXCL12的减少。

图6阐明了Ampion^TM对体外干细胞迁移的影响。

图7揭示了Ampion^TM对骨髓来源的人间充质干细胞胶原蛋白2A1的转录的影响。

图8揭示了Ampion^TM对骨髓来源的人间充质干细胞聚集蛋白聚糖的转录的影响。

图9揭示了Ampion^TM对骨髓来源的人间充质干细胞GAPDH的转录的影响。

图10阐明了实施例8中描述的临床试验的患者处置。

图11阐明了与媒介物对照相比，接受LMWF-5A注射的骨关节炎患者疼痛的减少。

发明详述

本发明描述了用于在有此需要的受试者中引起干细胞活动化、归巢和/或分化的方法。本发明进一步要求保护安全并高效地促进干细胞扩增的组合物，以及使用此类组合物和扩增的细胞在治疗适合使用干细胞治疗的疾病状态中的用途。

定义

术语“白蛋白替代物”指代在本发明的组合物中，可以用于取代人血清白带白来产生与人血清白蛋白基本相同或更好的结果的任意化合物。优选的，所述白蛋白是人来源的。最优选的，所述白蛋白是人血清白蛋白。

术语“扩增(expansion)”指代培养中的干细胞的生长和分裂，而不是分化。术语“分化”指代特定类型的细胞形成另一种类型的细胞。多能造血干细胞形成为髓样前体细胞是分化的一个例子。同样的，前体细胞形成另一种类型的细胞也是分化的例子。

术语“干细胞”通常指代具有分裂无限周期和产生特化细胞能力的任意细胞。在“干细胞”的定义中，包括以下项：a)全能细胞例如胚胎干细胞、胚外干细胞(extra-embryonic stem cell)、克隆干细胞、单性生殖(parthenogenesis)来源的细胞、重新程序化来具有全能特性的细胞、或原生殖细胞；b)多能细胞例如造血干细胞、脂肪来源的干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、胎盘来源的干细胞、脱落的牙齿来源的干细胞、毛囊干细胞或神经干细胞；和c)组织特异性祖细胞例如神经元、肝、肾、成脂、成骨、破骨、肺泡、心脏、肠道，或内皮系的前体细胞。所述细胞可以衍生于，例如组织例如胰腺组织、肝组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨髓组织、骨海绵组织、软骨组织、肝组织、胰腺组织、胰腺导管组织、脾组织、胸腺组织、派伊尔氏淋巴集结组织、淋巴结组织、甲状腺组织、表皮组织、真皮组织、皮下组织、心脏组织、肺组织、血管组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、脂肪组织、子宫组织、眼组织(包括视网膜组织)、肺组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、结缔组织、内分泌组织，以及肠系膜组织。特异性的干细胞在下面标题为“离体处理方法”的小节中描述。

术语“全能细胞”指代具有成为成体中任意细胞类型和胚外膜(例如胎盘)的任意细胞类型的潜能的哺乳动物细胞。全能细胞是受精卵和由它分裂产生的约头4个细胞。

术语“多能干细胞(pluripotent stem cells)”指代具有产生机体中任意分化细胞的潜能，但不能有助于衍生于滋养层的胚外膜组分的产生的真正的干细胞。羊膜从外胚层发育而非滋养层。已确定了三种类型的多能干细胞：胚胎干(ES)细胞(在灵长类中也可以是全能的)，胚胎生殖(EG)细胞，以及胚胎癌(EC)细胞。这些EC细胞可以从畸胎癌分离，其为偶尔发生在胎儿性腺中的肿瘤。与另外两个不同，EC细胞通常是非整倍体。

术语“多能干细胞(multipotent stem cells)”指代仅能够分化为数量有限类型的真正的干细胞。例如，含有多能干细胞的骨髓产生血液中的所有细胞，但不能分化为其它的细胞类型。

术语“间充质干细胞”指代能够分化为各种细胞类型的多能基质细胞，所述细胞类型包括成骨细胞、软骨细胞，和脂肪细胞(脂细胞)。

术语“造血干细胞”或“HSC”指代能够分化为髓系(例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜曙红细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和一些树突细胞)和淋巴系(例如T细胞、B细胞、NK细胞和一些树突细胞)两者的干细胞。

术语“成分”指代任意化合物，不论是化学或生物来源的，其能够用于细胞培养基来维持或促进细胞的生长或增殖。术语“组分”、“营养物”和“成分”可以替换使用，并都指代这样的化合物。用于细胞培养基的典型成分包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维他命、脂肪酸、蛋白等。本领域的技术人员可以根据具体的需要，选择促进或维持离体细胞生长的其它成分。

通过“细胞培养”表示在人工、体外的环境中维持、培养或生长的细胞或组织。

术语“培养容器”指代各种大小的玻璃容器、塑料容器，或其它容器，其能够提供无菌环境用于生长细胞。例如，可以使用长颈瓶、单或多孔板、单或多孔皿，或多孔微板。此外，可以使用生物反应器来培养细胞。

术语“细胞培养基”，“培养基”和“培养基配方”指代用于培养或生长细胞的营养液。

术语“接触”指代使用一种或多种化合物、溶液、培养基等混合、加入、接种、或搅拌一个或多个细胞。

术语“无血清”培养基是不含有完全血清(例如人血清、胎牛血清、马血清、山羊血清等)的培养基。

术语“缓冲剂”指代作用是通过在一定范围内中和酸和碱作来稳定溶液的氢离子浓度和因此pH的试剂。可以用于本发明的补充物和培养基中的适合的缓冲剂包括N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES)、β-甘油-磷酸，和碳酸氢盐缓冲液。

术语“受试者”指代任意动物，包括哺乳动物、鸟类、爬行类和两栖类，在优选的实施方案中指代哺乳动物，包括人类、陪伴动物、食品生产动物和野生动物。

组合物

本发明提供有用于本发明的方法的组合物，这些方法包括通过施用这些组合物，在受试者中引起干细胞活动化、归巢，和/或分化的体内方法，以及扩增干细胞，向受试者提供干细胞，引起干细胞分化的离体方法。因此，这些组合物在施用到受试者和间接接触干细胞，或作为细胞培养基的添加物或补充物中是有用的。本发明的组合物特别适用于支持间充质干细胞(MSCs)的扩增。这些细胞包括但不限于，软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞，以及皮肤和血管组织的上皮细胞。本发明的组合物也适用于支持大部分或全部胚胎起源(例如，外胚层衍生物、中胚层衍生物，和内胚层衍生物)的原代和永生化细胞的扩增。这些细胞包括中枢和外周神经系统的细胞(神经元、胶质细胞，和星型胶质细胞)，上皮细胞(感觉上皮细胞，表皮细胞(皮肤、乳腺、毛发、指甲、脑下垂体、皮脂腺))，结缔组织细胞(软骨、骨、横纹肌和平滑肌细胞、造血细胞、淋巴样细胞、肾、性腺细胞、肾上腺细胞)和肝、胰腺、甲状腺、胸腺的实质细胞(parenchymal cell)，以及膀胱、尿道、鼓室和咽鼓管的上皮层。这些细胞可以是人或其它哺乳动物或真核来源的。

本发明的组合物包括天冬氨酰-丙氨酰二酮哌嗪(例如“Asp-Ala DKP”或“DA-DKP”)。二酮哌嗪(DKP)是一种环状有机化合物，其来自两个氨基酸之间的肽键形成内酰胺。它们是可能的最小环状肽。本发明也提供包含DA-DKP组合物的药物组合物。

制造二酮哌嗪，例如DA-DKP的方法在本领域中是公知的，可以采用这些方法来合成本发明的二酮哌嗪。见，例如美国专利号4,694,081,5,817,751,5,990,112,5,932,579和6,555,543，美国专利申请公布号2004/0024180，PCT申请WO 96/00391和WO 97/48685，以及Smith等，Bioorg.Med.Chem.Letters,8,2369-2374(1998)，其完整公开通过提述并入本文。

例如，二酮哌嗪，例如DA-DKP，可以通过首先合成二肽来制备。所述二肽可以通过本领域中公知的方法，使用L-氨基酸、D-氨基酸，或D-和L-氨基酸的组合合成。例如，可以使用固相肽合成方法。当然，二肽也可以从多种来源商购，包括英国加的夫的DMI SynthesisLtd.(定制合成)，密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich(主要定制合成)，加利福利亚州贝尔蒙特的Phoenix Pharmaceuticals,Inc(定制合成)，Fisher Scientific(定制合成)和肯塔基州路易斯维尔的Advanced ChemTech。

一旦合成或购买了所述二肽，使其环化形成二酮哌嗪。这一过程可以通过各种技术完成。例如，美国专利申请公开号2004/0024180描述了一种环化二肽的方法。简单的说，所述二肽在有机溶剂中加热，并通过蒸馏去除水。优选的，所述有机溶剂是与水的低沸点共沸物，例如乙腈、烯丙醇、苯、苯甲醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇、乙酸丁酯、四氯化碳、氯苯氯仿、环己烷、1,2-二氯乙烷、二乙基缩醛(diethylacetal)、二甲基缩醛、乙酸乙基酯、庚烷、甲基异丁基酮、3-戊醇、甲苯和二甲苯。温度依赖于环化发生的反应速度和使用的共沸剂类型。所述反应优选的在50-200℃实施，更优选的在80-150℃实施。本领域的技术人员可以容易地确定环化发生的pH范围。2-9是有利的，优选3-7。

当所述二肽的一个氨基酸在其侧链上具有，或经衍生化而具有羧基时(例如天冬氨酸)，所述二肽优选的如描述于美国专利号6,555,543环化。简单的说，所述二肽，其侧链羧基仍受到保护，在中性条件下加热。通常来说，所述二肽将在约80℃至约180℃加热，优选的在约120℃。所述溶剂将是中性溶剂。例如，所述溶剂可以包含醇(例如丁醇、甲醇、乙醇，以及高级醇，但不是苯酚)以及共沸点的共溶剂(例如甲苯、苯，或二甲苯)。优选的，所述醇是丁-2-醇，而所述共沸点的工溶剂是甲苯。持续加热直到反应完成，而时间可以根据经验来确定。通常来说，所述二肽将通过回流约8-24小时环化，优选的18小时。最后，所述保护基团从二酮哌嗪移除。为了保证最终化合物的手性，在这样做时，应当避免使用强酸(无机酸，例如硫酸或盐酸)，强碱(碱性碱，例如氢氧化钾或氢氧化钠)，以及强还原剂(例如氢化铝锂)。

在固相树脂上制成的二肽可以在一个步骤中环化和从树脂释放。见，例如美国专利号5,817,751。例如，附有N-烷基化二肽的树脂在乙酸(例如，1％)或三乙胺(例如，4％)的存在下悬于甲苯或甲苯/乙醇中。通常来说，优选碱性的环化条件用于它们较快的环化时间。

环化二肽和制造二酮哌嗪的其它方法是本领域公知的，并可以用于制备本发明实施中有用的二酮哌嗪。见，例如上面列出的那些引用。另外，多种适合用于本发明的二酮哌嗪可以如下文所描述的从蛋白和肽制成。此外，用于本发明实施的二酮哌嗪可以商购获得，例如从英国加的夫的DMI Synthesis Ltd.(定制合成)。

本发明的DA-DKP组合物和/或产品可以从含有DA-DKP的溶液制备，包括从含有白蛋白，例如人血清白蛋白的市售药物组合物。已发现在一些市售的含有白蛋白的静脉药物组合物中存在DA-DKP。在这些药物制剂中存在的DA-DKP通过在这些药物组合物制造中通常使用的加热步骤中形成。所述加热导致蛋白的两个N末端氨基酸裂解和环化，形成DA-DKP。

相应的，DA-DKP可以通过加热白蛋白的溶液以及其它蛋白和肽来制备。例如，制备白蛋白在中性pH溶于磷酸缓冲液的溶液。优选的，所述溶液是浓缩液(例如，约100-500mM)来达到N末端氨基酸的质子化。所述溶液在60℃加热约2小时至几天，优选的约4天，来引起DA-DKP的形成。优选的，应当避免蛋白的变性。这可以通过使用较短时间和/或通过各加入约0.02M辛酸或N-乙酰色氨酸来完成。

还可以通过将白蛋白溶液与能够从蛋白或肽剪切两个N末端氨基酸的酶(例如，二肽基肽酶，特别是DPP IV)接触来制备。适合的二肽基肽酶可以购自，例如Sigma。所述反应应该在pH 6-8进行，优选的在缓冲液中，例如磷酸缓冲液，在足够高来加速所述反应但没有高到蛋白变性的温度(例如，37℃)。

可以通过公知的方法制备DA-DKP组合物，例如超滤、层析法(例如大小排阻层析)、亲和层析法(例如，使用具有附于其上的针对期望的二酮哌嗪的一种或多种抗体或针对截短蛋白或肽的一种或多种抗体的珠粒的柱)、阴离子交换或阳离子交换、蔗糖梯度离心、层析法、盐沉淀，或超声处理，其将移除溶液中的一些或所有白蛋白。所得的含有DA-DKP的组合物和/或产品可以使用或纳入如上所述的药物组合物中。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物通过切向流动过滤处理含有白蛋白的原料流来制备。如本文所使用的，术语“切向流动”指代含有白蛋白的原料流相对于滤料的流动方向。该流动方向可以是切向的(通常也被称为“交叉流动”)，或“正交流(normalflow)”，或两者的组合。切向流动指代含有白蛋白的原料流，其特征为大部分的原料流流经滤料表面，而正交流指代以下原料流，其特征为大部分的原料流以相对于滤料表面90°角流过滤料表面。

在另一个实施方案中，本发明的组合物通过层析法处理含有白蛋白的原料流来产生。本文引用的层析法是通过在固定相使用降压来将含有白蛋白的原料流中的一个级分从剩余级分分离的机械和/或物理操作。术语“机械层析法”用于本文指代但不限于，大小排阻层析法。术语“物理层析法”用于本文指代但不限于，亲和层析法、离子交换层析法，快速蛋白液相层析法和免疫亲和层析法。

层析法步骤的固定相可以包括，但不限于，树脂(例如，聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯和聚丙烯酰胺)，离子交换树脂(例如磺化的、季铵、羧酸和二乙铵官能团)，交联琼脂糖、交联葡聚糖、磷酸纤维素、多孔玻璃和二氧化硅、氧化铝和氧化锆基质。此外，所述固定相可以通过物理吸引、化学键合，和或包被后原位聚合固定在固体支持颗粒上，或圆筒的内壁上。所述固定化的固定相可以包被所述颗粒和圆筒的外壁，和/或填充所述固体颗粒中任意可用的孔。所述固定相可以使用双特异性配体功能化，其包括但不限于，抗体、蛋白受体、类固醇激素、维他命和酶抑制剂。

使用超滤分离方法，可以将人血清白蛋白组合物通过超滤膜，其具有保留白蛋白而DA-DKP进入所得滤液或部分中的分子量截留(cut-off)。该滤液可能包含具有分子量少于约50kDA，少于约40kDA，少于30kDA，少于约20kDA，少于约10kDA，少于约5kDA，少于约3kDA的组分。优选的，所述滤液包含具有分子量少于约5kDA(也称为“<5000MW”)的组分。该<5000MW级分或滤液含有DA-DKP，其在二肽天冬氨酸-丙氨酸从白蛋白剪切后形成，并随后环化为二酮哌嗪。

本发明的DA-DKP的生理学上可接受的盐可以用于本发明的实施。生理学上可接受的盐包括常规的无毒性盐，例如衍生于无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸，以及等等)，有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、抗坏血酸，以及等等)和碱(例如药学上可接受的金属阳离子或衍生于N,N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺，或乙二胺的有机阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)的盐。所述盐以常规方法制备，例如，通过使用酸中和所述化合物的游离碱形式。

本发明的组合物可以是具有DA-DKP的浓度范围下端点为约10μM,约20μM,约30μM,约40μM,约50μM,约60μM,约70μM,约80μM,约90μM,约100μM,约110μM,约120μM,约130μM,约140μM,约150μM,约160μM,约170μM,约180μM,约190μM,约200μM,约210μM,约220μM,约230μM,约240μM,约240,约250μM,约260μM,约270μM,约280μM,约290μM,约300μM,约310μM,约320μM,约330μM,约340μM,约350μM,360μM,约370μM,约380μM,约390μM,或约400μM的药物溶液。本发明的组合物可以是具有DA-DKP的浓度范围上端点为约600μM,约580μM,约570μM,约560μM,约550μM,约540μM,约530μM,约520μM,约510μM,约500μM,约490μM,约480μM,约470μM,约460μM,约450μM,约440μM,约430μM,约420μM,约410μM,约400μM,约390μM,约380μM,约370μM,约360μM,约350,约340μM,约330μM,约320μM,约310μM,约300μM,约290μM,约280,约270μM,约260μM,约250μM,约240μM,约230μM,约220μM,约210μM,或约200μM的药物溶液。

在用于治疗本文所述的疾患的本发明的组合物中，DA-DKP的有效量可以是下端点为约10μg,约15μg,约20μg,约25μg,约30μg,约35μg,约40μg,约45μg,约50μg,约55μg,约60μg,约65μg,约70μg,约75μg,约80μg,约85μg,约90μg,约95μg,约100μg,约110μg,约120μg,约130μg,约140μg,约150μg,约160μg,约170μg,约180μg,约190μg,约200μg,约210μg,约220μg,约230μg,约240μg,约250μg,约260μg,约270μg,约280μg,约290μg,约300μg,约310μg,约320μg,约330μg,约340μg,约350μg,约360μg,约370μg,约380μg,约390μg,约400μg,约425μg,约450μg,约475μg或约500μg的范围。此外，在用于治疗本文所述的疾患的本发明的组合物中，DA-DKP的有效量可以是上端点为约500μg,约490μg,约480μg,约470μg,约460μg,约450μg,约440μg,约430μg,约420μg,约410μg,约400μg,约390μg,约380μg,约370μg,约360μg,约350μg,约340μg,约330μg,约320μg,约310μg,约300μg,约290μg,约280μg,约270μg,约260μg,约250μg,约240μg,约230μg,约220μg,约210μg,约200μg,约190μg,约180μg,约170μg,约160μg,约150μg,约140μg,约130μg,约120μg,约110μg,约100μg,约90μg,约80μg,约70μg,约60μg,约50μg,约40μg,约30μg,或约20μg的范围。

本发明的化合物的局部或皮下施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和滴剂。可以在无菌条件下将活性成分与药学上可接受的载体，以及任何缓冲剂，或可能需要的推进剂混合。

所述软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶除了活性成分之外可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。

粉剂和喷雾剂除了活性成分之外可以含有赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常规的推进剂(propellant)例如氯氟烃类和挥发性未取代烃例如丁烷和丙烷。

透皮贴剂具有提供向身体可控的递送本发明的化合物的额外优点。这种剂型可以通过溶解、分散或其它整合一种或多种本发明的化合物到适当的媒介例如弹性体基质材料中来制造。也可以使用吸收促进剂来增加穿过皮肤的化合物的通量。这种通量的速率可以通过提供速率控制膜或将所述化合物分散到多聚物基质或凝胶中来控制。

适用于肠胃外投药的本发明的组合物包含本发明的一种或多种化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗的水或非水溶液、分散液、悬浮液或乳状液，或无菌粉末的混合，所述无菌粉末可以在使用前重建于无菌可注射溶液或分散液中，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、使制剂与预期接收者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。

适合的可以采用于本发明的药物组合物的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，以及其适合的混合物、植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。可以通过，例如使用包被材料例如卵磷脂，对于分散液通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物还可以含有佐剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。在所述组合物中，还可能需要包括等渗剂例如糖、氯化钠，和等等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶带来可注射药物形式的吸收延长。

在一些情况下，为了延长药物的效果，需要减慢从皮下或肌肉内注射的药物的吸收。这可以通过使用结晶悬浮液或水溶性差的无定形材料来完成。药物的吸收速率由此依赖于其溶解的速率，其相应地可能依赖于晶体粒度以及晶体形式。或者，可以通过将这些药溶解或悬浮到油媒介物中来完成肠胃外施用药物的延迟吸收。

通过形成药物在可生物降解聚合物例如聚乳酸-聚乙醇酸中的微胶囊基质来制造可注射的长效形式(depot form)。取决于药物和多聚物的比率，以及所采用的具体多聚物的本性，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)(orthoester)和聚(酸酐)。长效可注射制剂还可以通过将药物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可注射材料可以通过，例如穿过细菌截留过滤器来除菌。

所述制剂可以呈现在单位剂量或多剂量的密封容器，例如，安瓿和小瓶中，并可以在冻干条件储存，仅在马上要使用前要求加入无菌液体载体，例如用于注射的水。可以从上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

还提供包含本发明的药物产品的试剂盒。所述试剂盒可以包含DA-DKP组合物，其配制用于通过注射施用。可以如本文所述的制备DA-DKP，例如通过从人白蛋白组合物的溶液中移除白蛋白。所述试剂盒可以含有单位剂量或多剂量的密封容器，例如安瓿或小瓶，并可以在冻干条件储存，仅在马上要使用前要求加入无菌液体载体，例如用于注射的水。所述试剂盒也可以储存于其所容物已准备好用于直接使用或注射的条件中。

尽管本发明的化合物有可能单独施用，但优选将所述化合物作为药物制剂(组合物)施用。本发明的药物组合物包含本发明的一种或多种化合物作为活性成分，其与一种或多种药学上可接受的载体以及可选的，一种或多种其它化合物、药物或其它材料混合。就与制剂的其它成分相容而言，每种载体必须是“可接受”的，并对于动物无害。药学上可接受的载体是本领域中公知的。不论选择的施用途径，本发明的的化合物通过本领域技术人员已知的传统方法配置为药学上可接受的剂量形式。见，例如Remington’s PharmaceuticalSciences。

本发明的组合物可以进一步包含N-乙酰-色氨酸(NAT)、辛酸、辛酸盐/酯或其组合。优选的，所述组合物可以包含NAT。含有NAT、辛酸、辛酸盐/酯或其组合的本发明的组合物可以是药物组合物，其含有NAT、辛酸、辛酸盐/酯或其组合的浓度范围下端点为约1mM,约2mM,约3mM,约4mM,约5mM,约6mM,约7mM,约8mM,约9mM,约10mM,约11mM,约12mM,约13mM,约14mM,约15mM,约16mM,约17mM,约18mM,约19mM,或约20mM。另外，含有NAT、辛酸、辛酸盐/酯或其组合的本发明的组合物可以是药物组合物，其含有NAT、辛酸、辛酸盐/酯或其组合的浓度范围上端点为约40mM,约39mM,约38mM,约37mM,约36mM,约35mM,约34mM,约33mM,约32mM,约31mM,约30mM,约29mM,约28mM,约27mM,约26mM,约25mM,约24mM,约23mM,约22,或约21mM。优选的，所述浓度范围为约4mM至约20mM。

另外，本发明的组合物可以还包含第二种药物如止疼剂(例如利多卡因或扑热息痛)、抗炎药(例如倍他米松(bethamethasone)、非类固醇抗炎药(NSAID)、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生)，和/或其它适合的药物。

取代纯化DA-DKP，可以施用以下药物组合物来在哺乳动物中刺激干细胞扩增，所述药物组合物含有存在于本公开的治疗的哺乳动物接收者中的白蛋白。虽然如果其含有二酮哌嗪特别是DA-DKP，可以使用含有这些蛋白和/或肽的组合物(其目前在市场上可获得)，但优选的在施用改进的组合物之前，如上所述处理白蛋白来增加DA-DKP的含量。所述哺乳动物优选是人，而所述蛋白和/或肽优选是人蛋白和/或肽。优选肠胃外施用途径。

使用本发明的组合物，或用所述组合物补充的细胞培养基，可以通过加入确定的生长因子或其它细胞因子来调节干细胞的生长、扩增以及分化。这种对干细胞的影响在典型的含有血清的培养基中是不可能的，因为血清中不确定的成分掩盖了细胞对确定因子的响应。因此，使用本发明的组合物，干细胞可以在不存在基质细胞、胶原蛋白或支持基质时，在悬浮培养中扩增和分化。

本发明的补充物和组合物，或使用所述组合物补充的培养基，提供多能干细胞群体及分化的后代两者的生长和扩增。

本发明的组合物或使用所述组合物补充的细胞培养基可以用于培养衍生于一些动物的干细胞，包括人类、猴、猿、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、牛、猪、狗、马、猫、山羊和绵羊。优选的，培养人干细胞。另一个具体方面的实施方案中一个或两个是其中的干细胞是全能、多潜能(pluripotent)或多能(multipotent)干细胞。在具体的实施方案中，所述干细胞是胚胎干细胞、胎儿干细胞、胚外干细胞或成体干细胞。

本发明的组合物或使用所述组合物补充的细胞培养基还可以包括一种或多种选自下组的成分：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代物、一种或多种脂剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代物，一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种或多种微量元素、一种或多种糖皮质激素、N-乙酰-L半胱氨酸、人

乙醇胺、人锌胰岛素、人铁饱和转铁蛋白、硒、氢化可的松、D,L-生育酚醋酸盐，和2-巯基乙醇。例如，N-乙酰-L半胱氨酸可以溶于双蒸水。此时，N-乙酰-L-半胱氨酸的pH为2.0。为了防止蛋白变性，使用5N氢氧化钠将N-乙酰-L-半胱氨酸的pH调整至7.0，然后加到混合物。然后，完整的混合物通过0.2微米的低蛋白结合滤器过滤。

本发明的补充物或培养基可以以液体形式，或者可以以干燥形式保持。将所述成分溶解到溶液中的液体载体的类型和使用的方法各不相同，并且本领域的普通技术人员不超出常规实验即可以确定。通常来说，所述液体载体是水。

本发明的补充物或培养基或浓缩的制剂(液体或固体形式)通常经灭菌来防止不想要的污染。可以通过，例如紫外线、过滤或加热来完成灭菌。

本发明的补充物的所有人来源的成分(例如人血清白蛋白、转铁蛋白)使用前通过在60℃加热10小时进行热处理。

本领域的普通技术人员熟悉培养造血细胞的方法。例如，造血细胞的培养指导概述于Freshney,R.I.等，Eds.,Culture of Hematopoietic Cells,Wiley-Liss,New York,1994,pp.81-98。

本发明还提供包含载体装置的试剂盒，例如盒子或纸箱，其经分隔来接收其封闭限制中的一个或多个容器装置例如小瓶、管、安瓿、罐，和等等，其中第一个容器装置含有本发明的组合物或使用所述组合物补充的细胞培养基。可选的，第二个容器装置含有基础培养基。优选的，含有本发明的补充物的容器可以储存于从约-135至约4℃，优选的从约-5至约-80℃，最优选的从约-5至约-20℃，还更优选的在约-20℃。含有本发明的培养基的容器优选的储存于约2至约8℃，最优选的在约4℃。

本发明还提供包含无血清培养基中的干细胞的组合物，其中所述无血清培养基使用本发明的组合物补充，能够支持干细胞在无血清培养中的生长。该组合物的等分试样可以在约-80℃及以下冻存。该组合物的等分试样可以在小于或等于约-135℃无限期储存。所述组合物的等分试样解冻并打开后，使用无菌细胞培养基技术，可以在无血清培养基中培养干细胞。

另一个实施方案是本发明的组合物在干细胞的储存和运输中，为了维持存活力、移动性和干细胞功能的用途。本发明的组合物可以单独使用或加到本领域已知的各种试剂中，以允许干细胞的运输。这对于骨髓干细胞的运输尤其重要，其中在许多情况下不进行细胞的冻融。在运输期间充分储存干细胞的能力将允许在不同的物理位置从干细胞处理设施提取组织。

本发明的另一个实施方案是药物制剂，其包含本发明的组合物，其产生于良好生产规范/良好组织实施环境(Good Manufacturing Practices/Good Tissue Practicesenvironment)，使得其适合用于临床用途。在浓缩和量化活性单位之后，本发明的组合物可以稀释于赋形剂或载体中。将组合物配置为剂量单位形式来简化施用和剂量的一致性可能是有利的。本文使用的剂量单位形式指代适合作为单一剂量用于待治疗个体的物理分散单位；每个单位含有本发明组合物的活性化合物的已确定的量，其计算为与所需的药物载体联合产生期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式依赖于刺激相应干细胞增殖必要的组合物的量，所述干细胞的增殖和/或分化是所寻求的。刺激所需干细胞增殖和/或分化必要的组合物的量可以配制于单个剂量中，或者可以配制到多个剂量单位中。治疗可以要求一次性剂量，或可以要求重复剂量。

本发明的组合物的实际配制将与本领域的技术人员已知的标准实践一致来进行。这些是本领域公知的，并且其选择基于将要使用的施用途径，以及所需的特定药物动力学特性。例如，使用本发明组合物的优选治疗实施方案为可注射剂量，更优选的，配制用于施用到要求干细胞再生的特定区域中的注射。然而，一些实施方案是可能的。例如，施用途径可以包括肠胃外，例如关节内注射、静脉内、皮内、脊柱内、腹膜内、皮下或肌肉内、口服(例如摄入或吸入)、透皮(局部)、经粘膜，和直肠施用。用于配制本发明的治疗组合物的溶液或悬浮液包括：无菌稀释剂如注射用水，盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，UPS))，不挥发油，甘油，或其它合成溶剂；抗菌剂和抗真菌试剂如对羟基苯甲酸酯，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇等)，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐和用于张力调节的试剂例如氯化钠或右旋糖。可以维持所需的流动性，例如，通过使用包被例如卵磷脂，对于分散液，通过维持要求的颗粒尺寸以及使用表面活性剂。在许多情况下，包括等渗剂将是优选的，例如，糖、氯化钠、多元醇例如甘露醇或山梨糖醇，并在组合物中。可以通过包括延缓吸收的试剂带来可注射组合物的延长施用。此类试剂包括，例如单硬脂酸铝和明胶。肠胃外制剂可以封装玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器，或多剂量小瓶中。在本领域中已知，用于口服组合物的习惯作法一般包括惰性稀释剂或可食用载体。口服组合物可以是液体，或可以封装于明胶胶囊，或压缩为片剂。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任意以下成分或性质类似的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂例如藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)、或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；胶体二氧化硅。可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂完成粘膜使用。对于透皮施用，所述活性化合物如本领域通常已知的配制为软膏、药膏、凝胶，或乳膏。

体内治疗方法

本发明的实施方案包括本发明的组合物引起干细胞在活体中活动化、归巢、分化和/或扩增的用途。期望本发明的组合物的施用的临床情况包括由于疾病或内源性干细胞的老化寻求干细胞数量增加的病症，或者受益于周围组织或生物体中其它位置的修复功能的状况。这些干细胞可以存在于，胰腺组织、肝组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨髓组织、骨海绵组织、软骨组织、肝组织、胰腺组织、胰腺导管组织、脾组织、胸腺组织、派伊尔淋巴集结组织、淋巴结组织、甲状腺组织、表皮组织、真皮组织、皮下组织、心脏组织、肺组织、血管组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、脂肪组织、子宫组织、眼组织(包括视网膜组织)、肺组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、结缔组织、内分泌组织，以及肠系膜组织中。

本发明的组合物的施用可以在受试者中系统地或在局部环境中进行。例如，局部施用的部位可以是身体中的任意部位，其中组织的发育是可取的或有益的，例如关节、手术部位、分段的骨架间隙或未愈合骨折，伤口、溃疡，或炎性皮疹。本发明的组合物也可以系统使用，例如通过口服剂量制剂。此外，本发明的组合物可以在可移植设备中、可移植设备上，或作为可移植设备的一部分施用到受试者。例如，此类设备可以是海绵、生物相容性聚合物、生物可腐蚀性聚合物、油灰、凝胶、骨基质、人工骨基质、螺栓、螺钉、气管内导管、支架、隐形眼镜、心脏起搏器、中央IV管、弗利导管，和颅内装置。

本发明包括通过向有此需要的受试者施用DA-DKP，在受试者中引起选自下组的效果的方法：干细胞活动化、干细胞归巢、干细胞扩增，和干细胞分化。在该方法中，施用DA-DKP的步骤能够具有增加CXCR4、CXCL12、MMP13、MMP14、聚集蛋白聚糖、SDF1，以及胶原蛋白2A1中的一种或多种的产生的效果。另外，施用DA-DKP的步骤能够具有减少选自下组的一种或多种蛋白的产生的效果：MAPK-活化蛋白激酶3、β-肾上腺素能受体激酶1，带有血小板反应蛋白I类基序的ADAM金属肽酶，MAPK-活化的蛋白激酶2，C-Src激酶、巨噬细胞清道夫受体、Noggin、Bruton酪氨酸激酶、糖原合酶激酶-3α/β、糖原合酶激酶-3α/β、HSP 90α/β、HSP90α/β、磷酸肌醇-3-激酶、催化亚基α，和真核翻译起始因子4A，以及成纤维细胞生长因子17，尤其是选自下组的一种或多种蛋白：MAPK-活化蛋白激酶3、Noggin，以及磷酸肌醇-3-激酶，催化亚基α。此外，施用DA-DKP的步骤能够具有增加选自下组的一种或多种蛋白的产生的效果：丛生蛋白(载脂蛋白J)，凝血酶原，C1QBP(透明质酸结合蛋白1)，TNFSF15(VEGF抑制剂)，乳腺珠蛋白2，MIP3b(CCL 19)，MCP1(CCL 2)，PTHrP，脊椎蛋白1，Elafin(弹性蛋白酶抑制剂)，IL 11，NPS-PLA2，CFC 1(隐性蛋白)，睾丸蛋白聚糖(SPOCK 1)，血管生成素，URB，MMP-3，IP10(cxcl 10)，BSSP 4，IL-8(cxcl 8)，RSPO2，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，bFGF，H因子，凝固因子IX，SDF-11(cxcl 12)，CATC(二肽基肽酶1)，PIGR，ck-b-8-1(MPIF 1剪接变体)，C1s，EMR2，ART，DPP 2，SAA，TIMP-1，以及脑信号蛋白3A，尤其是，一种或多种选自下组的蛋白：丛生蛋白(载脂蛋白J)，C1QBP(透明质酸结合蛋白1)，MCP1(CCL 2)，PTHrP，Elafin(弹性蛋白酶抑制剂)，IL 11，MMP-3，bFGF，SAA，TIMP-1，脑信号蛋白3A，及其组合。在更具体的实施方案中，DA-DKP的施用可以减少选自下组的蛋白的产生：MAPK-活化的蛋白激酶3，Noggin，磷酸肌醇-3-激酶，催化亚基α，及其组合并增加选自下组的蛋白的产生：丛生蛋白(载脂蛋白J)，C1QBP(透明质酸结合蛋白1)，MCP1(CCL 2)，PTHrP，Elafin(弹性蛋白酶抑制剂)，IL 11，MMP-3，bFGF，SAA，TIMP-1，以及脑信号蛋白3A，及其组合。DA-DKP的施用还可以下调受试者中的Akt通路。本发明的方法包括通过向受试者施用DA-DKP在受试者中刺激组织发育的方法。这些方法适用于所述受试者中任意组织的发育，包括以下一种或多种组织：神经系统组织、脂肪组织、肝组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨海绵组织、软骨组织、胰腺导管组织、脾组织、胸腺组织、扁桃体组织、派伊尔淋巴集结组织、淋巴结组织、甲状腺组织、表皮组织、真皮组织、皮下组织、心脏组织、肺组织、血管组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、脂肪组织、子宫组织、眼组织、肺组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、结缔组织、内分泌组织，以及肠系膜组织。

一种具体的体内治疗方法包括以下病症，其中在医疗程序后，受试者中需要更高数量的干细胞和/或干细胞更快速的恢复。例如，在骨髓移植后，为了患者不屈服于细菌或病毒感染，造血干细胞的扩增是可取的。这种粒细胞和单核细胞前体的扩增在骨髓移植后提高免疫防御将是有用的。相应的，本发明提供可以施用于已经经历骨髓移植的患者的方法和组合物。

体内方法的另一个实施方案是在损伤发生后，内源性干细胞活动化并开始分化，但没有在足够高的水平这样做来刺激有益反应时，支持内源性干细胞的扩增。因此，本发明进一步的实施方案是向组织中具有损伤的患者施用本发明的组合物，所述组织选自：胰腺组织、肝组织、平滑肌组织、横纹肌组织、心肌组织、骨组织、骨髓组织、骨海绵组织、软骨组织、肝组织、胰腺组织、胰腺导管组织、脾组织、胸腺组织、淋巴集结组织、淋巴结组织、甲状腺组织、表皮组织、真皮组织、皮下组织、心脏组织、肺组织、血管组织、内皮组织、血细胞、膀胱组织、肾组织、消化道组织、食管组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、脂肪组织、子宫组织、眼组织(包括视网膜组织)、肺组织、睾丸组织、卵巢组织、前列腺组织、结缔组织、内分泌组织，以及肠系膜组织。

本发明的另一个实施方案是单独或与生长因子联合施用本发明的组合物，来促进愈合。

本发明的另一个实施方案是治疗糖尿病的方法，所述方法通过向具有糖尿病的受试者施用本发明的组合物，来诱导胰岛再生。这一方法可以进一步包括施用其它能够诱导胰岛再生的因子。这些因子可以是，例如，可溶性蛋白、膜结合蛋白，或细胞内作用的转录因子。例如，已知向小鼠中施用GLP-1、EGF和胃泌素的组合导致在如NOD或链脲佐菌素(streptozocin)诱导的糖尿病模型中有效的胰岛或胰岛样细胞的再生。本发明的组合物可以在体外加到分化的胰岛培养物，来扩增干细胞的数量，还可以在体内直接施用到患者的胰腺来恢复胰岛细胞的功能或放大施用的激素的效果。

本发明的体内方法的另一个实施方案是多发性硬化症的治疗，所述治疗通过向具有多发性硬化症的患者施用本发明的组合物用于扩增神经祖细胞。或者，本发明的组合物可以单独或与能够抑制自身免疫过程的试剂一同施用到遭受多发性硬化症的患者。通过同时诱导组织愈合和免疫系统修复，预期治疗效果的协同。

本发明的另一个实施方案是免疫病症的治疗，例如自身免疫性病症，所述治疗通过从患者自体提取干细胞，使用本发明的组合物和/或干细胞扩增化合物的其它组合处理所述细胞，消免所述患者的免疫系统，以及后续干细胞再引入宿主中用于重建。本发明的组合物可以后续直接提供到宿主来加速造血作用的重建。可以通过这些方法治疗的自身免疫疾病包括，但不限于，1型糖尿病，多发性硬化症，类风湿关节炎，系统性硬化症，桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)，重症肌无力，硬皮病，系统性红斑狼疮(systemic lupuserythromatosis)，移植物抗宿主疾病，等等。

本发明的另一个实施方案是自身免疫病症的治疗，例如1型糖尿病，多发性硬化症，类风湿关节炎，桥本甲状腺炎，重症肌无力，硬皮病等，包括将本发明的组合物施用到需要例如治疗来提高干细胞的生产的生物体中的相关位置，例如施用到生物体关节中或胰腺中来增强软骨形成或胰岛细胞生产。

本发明的另一个实施方案包括本发明的组合物用于在生物体中扩增抗原特异性和/或非抗原特异性免疫调节细胞的用途。这些细胞的扩增用于控制病理性免疫应答。例如，已知Th2细胞、TR1细胞、CD4+CD25+FoxP3+细胞，以及CD3+双阴性细胞能够抑制抗原特异性方式的免疫应答，而NKT细胞、髓系抑制性细胞、M2细胞，以及未成熟的树突状细胞能够抑制非抗原特异性方式的免疫应答。本发明的组合物可以用于衍生于有此需要的患者的免疫调节细胞的离体培养和扩增。本发明的组合物可以单独使用，或与已知涉及所述细胞发育的因子联合，用于施用到生物体来提高这些细胞的增殖而不损失功能。

本发明的另一个实施方案是中风的治疗，所述治疗通过向中风患者施用本发明的组合物来引起内源性神经细胞的活动化、归巢、扩增和/或分化。该方法可以进一步包括施用本发明的组合物与本领域已知扩增神经细胞的多肽或蛋白的联合。

本发明的另一个实施方案是本发明的组合物作为佐剂来治疗退行性疾患的用途，所述用途通过应用本发明的组合物与已知疗法的联合来提高已知疗法的有益效果。

本发明的另一个实施方案涉及本文所述的本发明组合物在制备用于在体内或离体提高干细胞扩增的药物中的用途。

本发明进一步的实施方案是用于治疗退行性关节疾病的体内方法，所述方法通过施用本发明的组合物引起受试者中干细胞活动化、归巢、扩增和/或分化。退行性关节疾病是覆盖关节的关节软骨的逐渐恶化。退行性关节疾病(骨关节炎)是负重关节的一种非感染性进行性病症。正常的关节软骨是光滑，白色和半透明的。其由软骨细胞(chondrocytes)嵌入海绵样基质组成，所述基质由胶原蛋白、蛋白多糖，和水构成。对于早期原发关节炎，软骨变为黄色和不透明的，伴随表面局部区域的软化和粗糙化。随着退化进行，所述软化区域变得破裂和磨损，暴露软骨下的骨。接着骨开始重塑和增加密度，而所有剩下的骨开始磨损。最终，由软骨覆盖的骨赘(新骨的刺(spur))在关节边缘形成。由于机械磨损增加，软骨需要修复。软骨细胞无法不能产生足够的海绵样基质，因此损伤的软骨不能自我修复。软骨没有血液供应来提高治愈。大多数退行性关节疾病是机械不稳定或关节内老化变化的结果。这包括老年退行性关节炎，以及在较年轻个体中，可能是损伤、擦伤、异常关节构型(例如髋关节发育不良)，或来自例如前十字韧带断裂、膝盖骨脱位，或剥脱性骨软骨炎(osteochondritis dissecans)的机械磨损。退行性关节疾病可以在身体中的任何关节发生，包括并不限于，膝，髋，肩，手和脊柱。

用于退行性关节疾病的传统医药疗法包括施用对乙酰氨基酚、非固醇类抗炎药(NSAIDS)、麻醉剂，和皮质类固醇。

本发明的一个具体实施方案是通过施用包括DA-DKP的药物组合物在受试者中刺激软骨形成的方法。所述药物组合物可以包括本文所描述的任意药物组合物，因此也可以包括选自N-乙酰色氨酸、辛酸盐(酯)、辛酸，以及组合的组分。在该方法中，可以在干细胞中刺激软骨形成，所述干细胞可以是祖细胞或间充质干细胞(MSC)。本方法中的软骨形成可以在受试者中促进软骨、骨、和/或韧带修复，或诱导软骨组织的修复或再生。因此，所述方法对于治疗或改善受试者中的软骨疾病是有用的，例如先天软骨疾病，退行性或纤维性变性关节，类风湿性关节炎，或骨关节炎。而且，软骨形成对于治疗或修复选自下组的疾患可以是有用的：软骨缺陷、骨骼缺陷，以及创伤或手术引起的骨折。例如，骨骼缺陷可以是大段骨骼缺口，而软骨缺陷可以是关节软骨撕裂、先天性软骨缺陷，或骨折引起的软骨损伤。

该方法可以通过离体刺激干细胞并接着将刺激的干细胞施用到受试者来进行。例如，可以通过使用DA-DKP或包含DA-DKP的组合物培养一群软骨细胞系的干细胞达一段足以刺激软骨形成的时间来离体刺激所述干细胞，接着移植到受试者中所希望的部位。

该方法可以导致胶原蛋白的产生增加，包括2A1型胶原蛋白和/或1A1型胶原蛋白。具体的，软骨形成能够导致胶原蛋白的产生至少2倍、4倍、10倍、20倍、25倍增加。本发明进一步的实施方案包括通过施用包括DA-DKP的药物组合物，在受试者中刺激神经组织发育的方法。所述药物组合物可以包括本文所述的任意药物组合物，因此也可以包括选自N-乙酰色氨酸、辛酸盐(酯)、辛酸，及其组合至受试者。在该方法中，神经组织的发育可以在干细胞中刺激，其可以选自祖细胞或间充质干细胞(MSC)。对神经系统发育的刺激可以促进受试者中脑、脊髓，和/或外周神经的修复或诱导神经元、神经胶质，和/或星形胶质细胞的修复或再生。此外，神经组织的发育可以治疗或改善受试者中中枢神经系统的疾病和/或外周神经系统的疾病。这些疾病可以选自神经退行性疾病。神经组织的发育还可以治疗或修复选自以下的疾患：由外伤或手术引起的损伤。

该方法可以通过离体刺激干细胞并接着将经刺激的干细胞施用到受试者来进行。例如，可以通过使用所述药组合物培养神经元、神经胶质，和/或星型胶质细胞系的干细胞群体达一段足以刺激神经组织发育的时间来离体刺激所述干细胞，接着移植到受试者中所希望的部位。

离体治疗方法

用于系统性施用的干细胞的离体扩增代表了一种用于对干细胞治疗敏感的病症或疾病的有效治疗模式。例如，在骨髓移植后肝和肠中遭受严重的IV级移植物抗宿主病的患者中，体外扩增的间充质干细胞减少急性和慢性的移植物抗宿主病两者。在骨髓移植后73天施用2百万个细胞/kg导致移植物抗宿主并的长期缓解(Le Blanc,等,2004,Lancet363:1439-1441)，揭示

本发明进一步提供增加干细胞离体扩增的方法。所述方法涉及将干细胞与本发明的组合物接触，或将干细胞与包括本发明的组合物的培养基混合或孵育，来扩增干细胞群，用于后续在需要部位的局部或系统施用。这些方法使扩增相对慢并因此对于广泛的临床使用通常是不实际的干细胞群例如间充质干细胞的使用变成可能。

本发明的组合物，除了增加干细胞增殖的速率，还可以将干细胞维持在未分化的状态。干细胞驻留在独特的生理龛(nich)中，虽然已经进行了在这些龛的模拟物中生长细胞，但在临床情况下，这些干细胞龛模拟物通常不可用。一个例子是早期的造血干细胞需要饲养细胞系来高量扩增的事实，或者胚胎干细胞的最佳生长仍然主要使用鼠饲养细胞来达到的事实。本发明提供用于提高干细胞扩增的组合物，使用可转移到临床情况中的方法建立与干细胞龛相似的条件。

如上文所讨论的，提取、扩增和鉴定特定表型的干细胞的方法对于临床实施是重要的。例如，通常使用骨髓作为治疗性干细胞的来源，用于心肌病、心绞痛，和造血细胞移植。然而，除了标准、公知的造血CD34+干细胞外，骨髓通常含有大量不同的干细胞。除了T细胞、B细胞，以及相对高水平的CD4+CD25+调节性T细胞外，已在骨髓中发现CD34-造血干细胞、间充质干细胞，以及生肌前体细胞。考虑到骨髓作为干细胞疗法的起始材料的异质性，显然理解具体的细胞群体，以及分离并扩增它们的能力，将大大推进干细胞治疗领域。

相应的，不论干细胞群体衍生于成体或胚胎来源，所述干细胞可以在含有本发明的组合物的培养基中生长，来增加细胞的异质性混合物群体，或纯化的干细胞群体，以增加当在培养中生长时干细胞的扩增或生长速率。

已发展了几种在机体外生长干细胞的方法，并在本领域中已知。最初，干细胞生长和扩增领域的主要工作使用骨髓细胞在造血系统中进行。新鲜分离或培养的骨髓细胞在甲基纤维素或琼脂上形成集落的能力用作输出。

干细胞扩增技术的发展开始于目的在于增加半固体培养基上集落数量的工作。早期的实验使用各种未鉴定的血清和条件化培养基。例如，使用了滋养层细胞系条件化培养基，异种基质细胞条件化培养基，来自肿瘤细胞的上清、和健康的淋巴细胞。也进行了为了设计无血清系统的工作，使用成分例如人转铁蛋白和牛胰岛素。这些系统的具体优点是可以扩增造血干细胞而不同时分化。最初的长期培养系统要求使用鼠饲养(基质)细胞，因为人系在促进造血活性方面具有一定的缺点。使用鼠饲养细胞来维持干细胞生存能力和增殖潜能存在许多缺点。由于这一原因，已作出努力来克服人来源饲养细胞生长中的困难，以及开发了各种此类细胞。

待通过本发明的方法扩增的干细胞可以从任意哺乳生物的任意器官，通过任意本领域技术人员已知的方法分离。所述干细胞可以从胚胎或成体组织衍生。本领域的技术人员能够确定如何使用本领域已知的方法，从具体的感兴趣的器官或组织分离干细胞。干细胞群也可以使用针对其它干细胞表面标志物的抗体来富集。这些标志物包括但不限于，FLK-1,AC133,CD34,c-kit,CXCR-4,Oct-4,Rex-1,CD9,CD13,CD29,CD44,CD166,CD90,CD105,SH-3,SH-4,TRA-1-60,TRA-1-81,SSEA-4,Sox-2等。本领域的技术人员将能够确定对于从所需组织分离干细胞有用的特定的细胞标志物。

本领域的技术人员将能够确定适合的培养基用于干细胞的初始制备。通常用于干细胞的培养基包括，但不限于，Iscove改良的Dulbecco's Media(IMDM)培养基,DMEM,KO-DMEM,DMEM/F12,RPMI 1640培养基,McCoy's 5A培养基,基本培养基α培养基(α-MEM),F-12K营养混合培养基(Kaighn's modification,F-12K),X-vivo 20,Stemline,CC100,H2000,Stemspan,MCDB 131Medium,Basal Media Eagle(BME),Glasgow Minimum EssentialMedia,Modified Eagle Medium(MEM),Opti-MEM I Reduced Serum Media,Waymouth's MB752/1Media,Williams Media E,Medium NCTC-109,neuroplasma培养基,BGJb Medium,Brinster's BMOC-3Medium,CMRL Medium,CO₂-Independent Medium,Leibovitz's L-15Media,等等。

如果需要，可以如所需添加其它组分，例如生长因子。示例性的可以添加的生长因子和其它组分包括但不限于血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、IL-1、IL-3、IL-7、flt-3配体(flt-3L)、G-CSF、GM-CSF、Epo、FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-20、IGF、EGF、NGF、LIF、PDGF、骨形态发生蛋白(BMP)、激活素A、VEGF、福斯高林(forskolin)、糖皮质激素，等等。此外，初始分离培养基可以含有血清例如胎牛、马，或人血清，或者更有选的，血清替代物成分。已将多种试剂引入培养基中来减轻对血清的需要。例如，血清替代物包括牛血清白蛋白(BSA)、胰岛素、2-巯基乙醇和转铁蛋白(TF)。

如果需要，接着将所述干细胞储存一段所需时间。干细胞储存方法对于本领域技术人员是已知的。典型的，使用抗冻剂处理细胞，接着储存直到需要。

所述干细胞在与本发明的组合物接触之前，可以使用本领域已知的方法纯化，例如抗体技术例如细胞淘选，在与本发明的组合物接触之前通过使用荧光激活细胞分选(FACS)方法，或磁激活细胞分选方法例如MACS仪器，来分离具有所需干细胞标志物的细胞，或移除不想要的具有不想要的细胞标记物的污染性细胞类型。其它的干细胞纯化或浓缩方法可以包括使用例如对流离心洗脱，平衡密度离心，在单位重力的速度沉降，免疫花环(immune rosetting)和免疫粘附，T淋巴细胞耗竭。可以用于纯化中的干细胞标志物的例子包括但不限于，FLK-1、AC133、CD34、c-kit、CXCR-4、Oct-4、Rex-1、CD9、CD13、CD29、CD44、CD166、CD90、CD105、SH-3、SH-4、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-4、Sox-2，等等。可以用作污染性不想要的细胞类型的标记物的表面标记物的例子依赖于寻求的干细胞表型。例如，如果需要收集多能造血干细胞，污染细胞将拥有定向分化的造血干细胞的标志物例如CD38或CD33。另外，非造血细胞污染可以通过CD45表达的缺乏来检测。如果需要选择基质间充质细胞，则污染细胞将通过造血标志物例如CD45的表达来检测。另外，可以基于特性来纯化干细胞，例如尺寸、密度、与特定底物的粘附，或外排某些染料例如Hoechst 33342或Rhodamine123的能力。

干细胞可以在制备的任意阶段遗传修饰。例如，可以将编码可选择标志物的基因或其它感兴趣的基因引入到制备的干细胞。

为了增加干细胞的生长，所述干细胞与本发明的组合物接触，或与含有本发明的组合物的培养基混合或孵育。

如果需要，可以将抗生素、抗真菌剂，或其它预防污染的化合物加到孵育培养基。示例性的化合物包括但不限于盘尼西林、链霉素、庆大霉素、两性霉素B以及其它本领域已知的。

与本发明的组合物接触的干细胞可以通过使用本领域技术人员已知的多次传代技术扩增。例如，从受试者分离的干细胞计数，并使用台盼蓝染料拒染方法确定活细胞的密度。为了传代培养(或传代)细胞，将其以5000个细胞/cm²的密度重铺到使用蛋白例如明胶或纤连蛋白包被的新的组织培养瓶中含有本发明的组合物的培养基中，并允许在湿润的培养基中在37℃和5％CO₂生长。如果需要，重新装满培养基。当达到亚覆盖(subconfluence)(约90％)，移除培养基并将附着的细胞使用0.25％的胰蛋白酶和1mM EDTA在37℃胰酶消化3-5分钟。在胰酶消化前，附着的细胞使用PBS漂洗两次。中和胰酶，并通过在300g离心10分钟将细胞沉淀，并重悬于热的培养基中，所述培养基也可以含有本发明的组合物。通过在300g离心10分钟并重悬于也含有本发明的组合物的热培养基来漂洗细胞。可以通过多次传代使用相同的传代方案来传代培养干细胞。

干细胞可以与本发明的组合物接触，例如，通过简单的将所述组合物与干细胞培养物混合。可以在过量的适合容器中进行混合，所述容器能够保持干细胞的生存能力。所述容器可以包括但不限于组织培养瓶、锥形管、培养袋、生物反应器，或者连续混合的培养物。如果需要，接着允许所述干细胞生长。在一些情况下，使用组合培养系统是可取的，其中细胞首先在一种培养条件下生长，然后接着使用另一种培养条件。例如，当需要造血干细胞的快速扩增而不分化时，最初细胞可以在高浓度的本发明的组合物中培养48小时或诱导干细胞的周期变化所需要的时间段。随后，可以将含有细胞因子的培养基加到培养物中，用于第一个48小时后的传代。本领域的技术人员将理解依赖于干细胞类型和所需的分化水平，可以将不同浓度的本发明的组合物在不同的时间点加到培养物。例如，在一个具体的培养环境中，在培养的开始添加本发明的组合物可能不是最佳的。

本领域的技术人员可以确定所需的干细胞对本发明的组合物的比率。例如，可以使用少于约1:1000至1000:1或更多的比率(干细胞制备物对本发明的组合物)。例如，可以使用干细胞制备物对本发明的组合物的比率从约1:750、1:500、1:250，或1:100至约100:1、250:1、500:1，或750:1。这一比率可以变化，例如，依赖于温度，孵育时间，干细胞数量，在干细胞中寻求的所需活性，干细胞类型，干细胞纯度，用作起点的胎盘组织的量，等等。在与本发明的组合物接触之前，所述干细胞可以从它们的生长培养基分离，或者所述干细胞可以保持在它们的生长培养基中并添加有本发明的组合物。

本领域的技术人员可以确定干细胞与本发明的组合物接触的时间长度。通常来说，接触步骤可以从少于约1秒、30秒，或60秒至约2或3周或更多。优选的，所述接触步骤在约2、5、10、30，或45分钟至约12、14、16、18，或20天。更优选的，所述接触步骤在约1、3、5、8，或24小时至约3、5、7、或10天。

此外，在培养期间，可以使用促进细胞增殖或分化的条件。这些条件包括但不限于，温度的改变、氧/二氧化碳含量的改变，所述培养基中浊度的改变，或将细胞培养物暴露于小分子修饰物例如营养物、特定酶的抑制剂、特定酶的刺激物、组蛋白脱乙酰酶活性的抑制剂例如丙戊酸、曲古抑菌素-A、trapoxin-A，或缩酚酸肽(depsipeptide)，DNA甲基转移酶活性的抑制剂例如5-氮杂胞苷，酶GSK-3的抑制剂，等等。

氧含量在干细胞自我更新和生存能力中的角色也是本发明意图涉及的一个重要问题。已知造血干细胞倾向于驻留在骨髓的低氧龛中，而当细胞分化为更成熟的后代，它们逐渐迁移到较高氧含量的骨髓区域中(Ivanovic,等,2002,Exp Hematol 30:67-73，其通过提述完整并入本文)。在研究中利用了这一组织培养中的重要变量，表明在使用低至1.5％的氧含量的低氧条件下，获得了人CD34细胞的优越扩增，所述细胞有NOD-SCID小鼠完全造血重建的能力。另外，其它干细胞例如神经干细胞也表现出定位于低氧龛中，并且与正常氧含量对比，优选在低氧的体外条件下扩增。此外，胚胎干细胞，其在常氧和低氧之间以相似的增殖速率生长，当在低氧条件下生长时，保留了在体内形成畸胎瘤和在体外形成胚状体的优越能力。相应的，本发明的一个实施方案是干细胞在特定的恒温箱中一些或全部孵育期间使用低氧条件，氧张力(tension)从0.1％至7.5％，优选的0.5％至5％，更优选的3％至5％。另外，本发明的另一个实施方案是使用低氧条件与本发明的组合物联合，来提高在培养中生长的干细胞的增殖而不分化。

在提高本发明的组合物刺激干细胞的增殖而不分化的能力方面，考虑一种佐剂方法，本发明的一个实施方案是使用与本发明的组合物缀合的酶抑制剂。例如，组蛋白脱乙酰基酶是一类涉及表观遗传地向转录因子开放染色质部分的酶，因此允许在正常的成体条件下将不表达的基因表达。例如，端粒酶基因(催化亚基hTERT)涉及细胞永生化的过程，在生理条件下仅在胚胎干细胞中表达，以及异常地，在一些骨髓造血细胞中表达。端粒酶的功能角色是修复染色体缩短的端粒末端，使得细胞能够逃离复制性衰老。病理下，端粒酶是负责癌细胞在细胞培养中无限增殖能力的酶。在正常生理条件下，成纤维细胞不表达端粒酶，并经历复制性衰老。已发表各种报道，描述了使用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂例如曲古菌素A处理成纤维细胞再诱导了功能性端粒酶的表达(Mukhopadhyay,等,2005,J Cell Mol Med 9:662-669；Hou,等,2002,Exp Cell Res 274:25-34；Cong,等,2000,J Biol Chem275:35665-35668，其各自通过提述完整并入本文)。这提示操作组蛋白脱乙酰基酶途径可以用作细胞的去分化方法，或提供“复壮(rejuvenating)”即将复制耗尽的祖细胞的可能性。的确，证明了由于热量限制观察到的寿命延长效果与组蛋白脱乙酰基酶途径相关(Howitz,等,2003,Nature 425:191-196,其通过提述完整并入本文)。操作这一途径的临床相关性已在使用丙戊酸的实验中阐明，丙戊酸是一种临床使用的抗抑郁剂，是一种在一些模型中与曲古菌素A具有相似效力的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。已证明使用丙戊酸处理骨髓来源的造血干细胞通过加速细胞周期过程，增加增殖和自我更新(Bug,见上文)。所述加速伴随着抑制因子p21(cip-1/waf-1)的下调。此外，丙戊酸处理抑制GSK2的活性并激活Wnt信号通路，其两者都与造血(Gotoh,等,1997,Cell Growth Differ 8:721-729；Baba,等,2005,Immunity 23:599-609，其各自通过提述完整并入本文)和胚胎干细胞的自我更新相关(Sato,等,2004,NatMed 10:55-63；He,等,2005,Clin Lung Cancer 7:54-60，其各自通过提述完整并入本文)。证明了丙戊酸与已知造血干细胞刺激性细胞因子例如Flt3L、TPO、SCF和IL-3协同的效力(De Felice,等,2005,Cancer Res65:1505-1513，其通过提述完整并入本文)。

通过与本发明的组合物接触，干细胞能够增加它们的生长速率并快速扩增。当需要时，使用允许本发明的组合物增加干细胞的增殖而不诱导分化的培养条件。可以使用任意适合确定干细胞生长速率和分化的方法来确定生长速率和因此产生的干细胞细胞数目。例如，流式细胞术分析与干细胞保持相关的标志物，半固体培养基试验用于量化早期和定向祖细胞，以及体内NOD-SCID再生活性试验(Repopulation Activity Assay)来量化具有重建活性的体内干细胞的数量。这些试验可以经改良或改变来允许特定干细胞亚型的检测。还可以在免疫缺陷小鼠例如NOD-SCID品系中开发试验，其通过诱导人干细胞预期对其为治疗性的病理。例如，已证明人干细胞在NOD-SCID以及NUDE小鼠中各种非造血设置中拥有治疗活性。细胞生长速率也可以依赖于其他因子，例如，温度、干细胞类型、培养基成分，以及允许胎盘孵育步骤和接触步骤的时间。本领域的技术人员能够根据需要改变这些参数来调整生长速率。

本发明的另一个实施方案是组合物，或使用本发明的组合物补充的细胞培养基刺激干细胞增殖的用途，所述干细胞包括，例如：

人胚胎干细胞，其特征为标志物例如SSEA-4、GCTM-2抗原、TRA 1-60、Cripto、胃泌素释放肽(GRP)受体、足糖萼蛋白(podocalyxin)样蛋白(PODXL)或人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达；

人卵母细胞产生性干细胞，其特征为标志物例如Vasa、Oct-4、Dazl、Stella、Fragilis、Nobox、c-Kit和Sca-1的表达；

单性生殖生成的干细胞，其特征为标志物例如Oct-4、碱性磷酸酶、端粒酶、SSEA-4、TRA 1-60和TRA 1-81的表达；

精原干细胞重编程为多能生殖系干细胞，其特征为标志物例如Oct-4、Nanog、Dppa5和Rex1的表达；

造血干细胞，其特征为标志物例如干细胞抗原(SCA+)、系阴性(lin-)，c-kit+，CD34+，CD38-，CD33-；

间充质干细胞，其特征为标志物例如LFA-3,ICAM-1,PECAM-1,P选择素,L选择素,CD49b/CD29,CD49c/CD29,CD49d/CD29,CD61,CD18,CD29,6-19,血栓调节蛋白,端粒酶,CD10,CD13,STRO-1,STRO-2,VCAM-1,CD146,THY-1；

胎盘衍生的多潜能细胞，其特征为标志物例如Oct-4,Rex-1,CD9,CD13,CD29,CD44,CD166,CD90,CD105,SH-3,SH-4,TRA-1-60,TRA-1-81,SSEA-4和Sox-2；

脂肪衍生的干细胞，其特征为标志物例如CD13,CD29,CD44,CD63,CD73,CD90,CD166,乙醛脱氢酶(ALDH),和ABCG2；

脐带血干细胞，其特征为标志物例如CD34,c-kit,和CXCR-4；

乳牙干细胞，其特征为标志物例如STRO-1,CD146(MUC18),碱性磷酸酶,MEPE,和bFGF；

神经干细胞，其特征为标志物例如RC-2,3CB2,BLB,Sox-2hh,GLAST,Pax 6,nesting,Muashi-1,和prominin；

胃上皮干细胞，其特征为标志物例如Musashi-1,c-hairy-1和HES-5；

骨骼肌干细胞，其特征为标志物例如肌间线蛋白(desmin)阳性、SCA-1+,CD45-以及在流式细胞仪上通过染料排除拥有侧面群体分布(side population profile)；

乳腺干细胞，其特征为标志物例如SCA-1阳性、CD45-和角蛋白-6；

真皮干细胞，其特征为标志物例如SCA-1阳性、CD34+、CD45-以及α6-整联蛋白、β1-整合蛋白、角蛋白14和角蛋白19阳性；

心肌干细胞，其特征为标志物例如SCA-1阳性、c-kit阳性，以及在流式细胞仪上通过染料排除拥有侧面群体分布；

系膜干细胞，其特征为标志物例如SCA-1阳性、c-kit阳性，以及在流式细胞仪上通过染料排除拥有侧面群体分布；

肝卵圆干细胞，其特征为标志物例如SCA-1阳性、c-kit阳性，以及CD34阳性；或者

胰腺干细胞，其特征为标志物例如巢蛋白(nestin),CK-8,CK-18,Isl-1,Pdx-1,Pax-4,和Ngn-3。

本发明的组合物可以单独用作增殖的刺激物，或者作为已知对于培养所述细胞有用的培养基的添加物。这些组织培养基的一个例子是Dulbecco的改良的Eagle培养基(DMEM)。

本发明的另一个实施方案是本发明的组合物或使用本发明的组合物补充的细胞培养基刺激全能干细胞的增殖的用途，所述全能干细胞通过使用核移植技术克隆产生。

向哺乳动物施用干细胞的方法包括将干细胞与本发明的组合物接触，在适合促进干细胞扩增的条件下培养所述干细胞，并将扩增的细胞引入哺乳动物中。

因此，本发明的无血清补充物也可以用于制备感兴趣的干细胞类型，用于移植到哺乳动物中。在这一实施方案中，已离体引起分化的细胞引入到哺乳动物中。例如，已引起分化为造血干细胞、前体细胞，或祖细胞的造血细胞可以引入哺乳动物的骨髓或血流中。所述分化的细胞可以通过公知的技术引入，例如，哺乳动物的骨髓或血流中。

在一些本发明的一些实施方案中，提供用于干细胞扩增或生长的方法，其包括将干细胞与含有本发明的组合物的生长培养基接触。所述干细胞可以是

a)全能干细胞例如胚胎干细胞、胚外干细胞、克隆的干细胞、单性生殖的细胞；

b)多能干细胞例如造血干细胞、脂肪衍生的干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、胎盘衍生的干细胞、脱落的牙齿干细胞、毛囊干细胞或神经干细胞；或者

c)组织特异性祖细胞，例如神经、肝、肾、脂肪形成、成骨细胞、破骨细胞、肺泡(alveolar)、心脏、肠，或内皮系的前体细胞。

孵育步骤可以在，例如适合的温度范围发生，例如从约32℃至约40℃。

在这些方法中，所述干细胞可以在其分离或产生期间，或者在其扩增或施用到哺乳动物之前立即操作。这些操作可以是调整所述干细胞在施用到所述哺乳动物后执行治疗功能。例如，使用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷处理的间充质骨髓细胞已证明转分化为心肌组织来改善左心室射血分数并抑制心脏重塑。其它类型的干细胞已用于改善心肌活性、灌注，并减少心室重塑，包括间充质干细胞、内皮干细胞、和骨骼成肌细胞。这些研究的一个限制因素是缺乏可重复的方法用于扩增足够数量的拥有高倾向用于心脏修复的半分化祖干细胞。这一缺点部分是由于缺乏适当的培养基用于这些独特细胞群体的扩增。本发明的组合物和方法通过提供扩增和保持用于后续治疗性施用到哺乳动物的干细胞群体的可重复手段克服了这些缺点。

本文引用的每个出版物或专利通过提述完整并入本文。

作用机制

DA-DKP，特别是商业化的人血清白蛋白的低分子量级分，例如Ampion^TM(AmpioPharmaceuticals,Greenwood Village,CO)具有可以分类为抗炎症和重塑/治愈的多种活性。Ampion^TM的抗炎特性涉及通过内皮细胞细胞骨架重排(皮层肌动蛋白环的形成)抑制血管的通透性，通过抗CD3/CD28或者APC抑制记忆性T细胞(非

)，以及减少响应强的炎症刺激(LPS)由PBMC产生的促炎症细胞因子(TNFa)的量。所述重塑/治愈效果是通过干细胞活动化和分化为组织特异性细胞(例如在膝的情况下分化为软骨细胞)。

Ampion^TM激活配体激活的转录因子(TF)过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)，可能通过结合间充质干细胞和PBMC中的分子的共激活因子位点。TF试验已证明了PPAR及其结合伴侣视黄醇X受体(RXR)的活化。PPAR属于核激素受体超家族，表达于炎性和免疫细胞中。在细胞核中并在一起时，PPAR与黄醇X受体(RXR)异二聚化，所述二聚体结合目标序列的启动子中的过氧化物酶体增殖反应元件(PPRE)。涉及的基因是抗炎性的，参与干细胞的保护和分化。PPAR上鉴定了四个功能性结构域：A/B、C/D和E/F。A/B结构域的N末端含有配体非依赖性活化功能(AF-1)，其负责PPAR的磷酸化。C结构域或DNA结合结构域(DBD)促进PPAR结合到目标基因启动子区域中的PPRE。D结构域是辅助因子结合位点。E/F结构域是配体结合结构域(LBD)，其负责配体的特异性和结合到PPRE的PPAR的活化，其增加目标基因的表达。

现在一般性地描述了本发明将通过参考以下实施例变得更容易理解，其仅包括说明本发明实施方案的方面的意图。所述实施例不意图限制本发明，因为本领域的技术人员将从以上教授和以下实施例认识到其它技术和方法可以满足权利要求，并可以不脱离要求保护的本发明的范围而采用。

实施例

实施例1

在患有症状性原发性膝骨关节炎的成年人中，进行了临床试验来研究在关节内膝注射<5000MW Fraction(本文也称为“Ampion^TM”)用于改善膝骨关节炎的关节功能和减轻疼痛的效果。选择了43名可评价的受试者的随机、安慰剂对照、双盲、平行研究作为适合的设计来评估<5000MW Fraction当其注射到研究的膝中时的治疗效果和安全性。

研究药物

2组；每名受试者接受Ampion^TM或生理盐水单次4ml注射到一个膝中。

研究群体

研究群体为43名患者，40-83岁(平均63.0，标准差(SD)9.6)的男性或女性，28名男性和15名女性。所有受试者都是白种人。所述受试者的身高范围从162至192cm(平均175.3，SD 8.1)，筛选的体重范围从56至117kg(平均88.8，SD 13.89)。所述受试者具有完全步行能力，在使用Kellgren Lawrence II或III级(指示轻度或中度骨关节炎)筛选之前，患有症状性原发性膝骨关节炎超过6个月。6名受试者为II级而36名受试者为III级。一名受试者患有IV级。如果受试者的两个膝都有骨关节炎，则选择一个膝用于研究，而另一个膝接受标准治疗。

排除标准

以下是研究群体的排除标准：

1.医学检查和筛选研究的结果为不适合

2.对白蛋白的过敏反应史

3.对5％人白蛋白中赋形剂的过敏反应史

4.任意关节内或局部关节周围注射，对指标膝的注射或外科手术(前6个月)

5.关节镜手术(前3个月)

6.对指标膝的非关节镜外科手术(前12个月)

7.任意临床的膝产品(前12个月)

8.Kellgren Lawrence I级或IV级(可疑或严重)膝骨关节炎

9.炎性或结晶性关节病，急性骨折，骨密度严重流失，骨坏死

10.分离的髌骨-股骨综合症或软骨软化

11.干扰指标膝的自由使用和评估任意其他疾病或病症

12.指标膝的重大伤害(前12个月)

13.与指标膝同侧的严重髋骨关节炎

14.能干扰指标膝疼痛的评估的任意疼痛

15.任意开始或改变的药理学或非药理学治疗(前4周)

16.使用a.任意局部治疗(前48h)b.除扑热息痛外的所有镇痛药和NSAID(前48h)，c.抗凝剂疗法(前48h)d.任意系统性类固醇治疗(前14天)，e.随机分组前，在药物的半衰期5倍时间段内的所有的免疫抑制药物，f.每天糖皮质激素>10mg氢化泼尼松的当量(前30天)，g.任意白蛋白治疗(前3个月)

17.怀孕或哺乳的女性受试者

18.在治疗前的第1天具有阳性妊娠测试的有生育能力的女性受试者。

研究评估

所述研究由三周的筛选期和84天研究参与期组成。在注射后6小时、24小时和72小时进行后续评估。在第8天、第30天和第84天通过电话联系受试者来评价总体疼痛和移动能力，并监控不良反应。如果由研究者评估后认为必要，在第8天后向所述受试者提供关节内倍他米松注射到研究的膝关节用于缓解疼痛的选项。

主要结果

在给药前(注射前基线)、第1天给药后6小时、第2天给药后24小时、第4天给药后72小时，以及给药后第8天、第30天和第84天(EOS或研究终点)完成研究膝中的疼痛数字评分量表(NRS)。疼痛NRS为数字评分0-10，0为无疼痛，5为中度疼痛而10为最坏的可能疼痛。

安全终点

本研究的安全终点是不良反应的发生率，在给药前和研究第4天的生命特征，在筛选和给药后24小时的十二导联ECG读数(lead ECG readings)，以及在筛选和给药后24小时评估的临床血液安全测试(生物化学和血液学)。

次要终点

本研究的次要终点是在第30天和第84天的百分比响应者，其定义为疼痛NRS中2分或更多的改善，在关节内注射后24和72小时WOMAC骨关节炎指标3.1(完全量表，疼痛分项分数、僵硬分项分数和功能分项分数)从注射前基线的变化，在关节内注射24和72小时后援救药物(扑热息痛)的需求从注射前基线的变化，以及在给药后第8天、第30天和第84天与给药前和给药后即时相比，可动性随着时间的变化。

意向治疗(ITT)和安全人群

接受至少一个剂量的研究药物的随机分配的研究参与者。ITT指代满足纳入/排除标准的受试者。

符合方案群体

ITT组中的研究参与者，其给药前疼痛评分不违背纳入/排除标准。

效力群体

符合方案(pre-protocol)群体中的研究参与者，其在8天和30天之间不接受援救药物。

统计分析

主要：协方差分析(ANCOVA)模型来检测治疗组之间在第30天和第84天(EOS)疼痛的均值变化的均值(SD)差异，针对基线疼痛NRS调整。

附加：X²检验用于百分比响应者的差异。科克伦-阿米蒂奇趋势检验(Cochran-armitage trend test)用于临床显著改善的差异。学生t-检验：30天时疼痛NRS的均值(SD)差异。

安全性分析

由受试者列出不良反应和严重不良反应。通过MedDRA系统器官类和优选术语(System Organ Class and Preferred Term)分类的不良反应，对于总体发生率和严重程度以及与研究药物的关系，根据治疗给出总结。在治疗组之间比较治疗突发不良反应的发生率。对于每名受试者列出所有临床安全性和耐受性数据，并根据治疗总结。生命特征和ECG参数列表并根据治疗总结。列出了实验室数值，连同对实验室正常范围之外的数值的临床意义的注释。评估了从筛选的变化的临床意义。

结果：

表4群体

分析组	研究规模(n)	Ampion<sup>TM</sup>(n)	生理盐水(n)
				安全组	43	22	21
ITT组	43	22	21
				符合方案组<sup>a</sup>	41	20	21
效力可评价组<sup>b</sup>	32	17	15

^a:Ampion^TM组中的2名受试者具有基线疼痛NRS<4分

^b:Ampion^TM组中的5名受试者和生理盐水组中的6名受试者要求援救药物

援救药物的使用

倍他米松注射：在接受Ampion^TM的受试者(22名受试者中的5个，23％)与接受生理盐水的受试者(21名受试者之间的6个，29％)之间相比，倍他米松注射的使用没有明显差异。

援救援救药物(扑热息痛)：接受Ampion^TM的受试者(22名受试者中的6个)与接受生理盐水的受试者(21名受试者中的6个)相比，在相似数量的受试者中出现了注射24小时以内援救药物的使用，用于研究膝中的疼痛缓解，在每个治疗组中使用了相似的平均剂量的扑热息痛。

效力结果：

表5根据治疗的疼痛NRS，均值(SD)符合方案群体

表6疼痛NRS的最小平方(LS)均值变化：符合方案群体

量表：-10＝疼痛从基线的最大可能的改善，10＝疼痛从基线的最小可能改善(最大增加)

第1天：给药后6小时

*针对基线疼痛NRS调整

表7疼痛NRS的LS均值变化：效力可评价群体

量表：-10＝疼痛从基线的最大可能的改善，10＝疼痛从基线的最小可能改善(最大增加)

第1天：给药后6小时

*针对基线疼痛NRS调整

第84天时的百分比响应者(EOS)：符合方案群体(见表8)

响应者：在第84天疼痛NRS的减少为-2至-10分(-10分为疼痛的最大可能改善)。

非响应者：在第84天疼痛NRS的减少为-1至10分(10分为疼痛的最大可能增加)。

表8第30天疼痛从基线的趋势，根据治疗组

第84天时的百分比响应者(EOS)：效力可评价群体(见表9)

响应者：在第84天疼痛NRS的减少为-2至-10分(-10分为疼痛的最大可能改善)。

非响应者：在第84天疼痛NRS的减少为-1至10分(10分为疼痛的最大可能增加)。

表9第30天疼痛从基线的趋势，根据治疗组

调查结果总结：效力：

对于每个治疗组，在研究持续期间除了安慰剂组在第84天之外，总体疼痛(通过疼痛数字评分量表评估)和WOMAC分数在给药后降低(p＜0.05)。另外，对于接受Ampion^TM的受试者与接受生理盐水安慰剂的受试者相比，在第30天和第84天从基线处的变化之间有显著性差异中的趋势(第30天：p＝0.12；第84天：p＝0.07)。在不接受援救药物的受试者中，这一趋势变得统计上显著(p＝0.04)。对于接受Ampion^TM对安慰剂的受试者，有在研究的终点(第84天)趋向于更高的百分比响应者的趋势(p＝0.06)。直到给药后72小时，治疗E组(生理盐水)中扑热息痛援救药物的使用最高。见图1。

不良事件(AE)

43名受试者中的20个(47％)在剂量施用后报告了治疗突发AE，总共27项AE。通常发生的AE为头痛和关节肿胀以及膝僵硬。大多数受试者报告的AE仅分类为轻度(43名受试者中的16名，37％)。仅有4名受试者(9％)报告了中度严重性的AE：

-Ampion^TM：关节损伤和高血压

-生理盐水：背部疼痛和血管穿刺部位血肿

在接受Ampion^TM(2名受试者，9％)与接受生理盐水的受试者(2名受试者，10％)之间比较，中度AE的发生率没有明显差异。这些AE都被认为很可能不与研究药物相关，或明确不与研究药物相关。

不存在分类为重度的AE。

43名受试者的3名(7％)报道了认为与研究药物施用相关(可能)的AE。在接受Ampion^TM(1名受试者，5％)与接受生理盐水的受试者(2名受试者，10％)之间比较，相关AE的发生率没有明显差异：

a.在治疗施用5分钟后开始的轻度严重性的头痛，并于1.8小时后消退(Ampion^TM)

b.在治疗施用5小时后开始的轻度严重性的头痛，并于0.5小时后消退(生理盐水)

c.在治疗施用2.4天后开始的轻度严重性的右膝(研究膝)关节肿胀，并于21小时后消退(生理盐水)

总体来说，接受生理盐水(12名受试者，57％)的受试者与接受Ampion^TM的受试者(8名受试者，36％)相比，报告了较高比例的治疗突发AE。在43名受试者的3个中报告了认为与研究药物施用相关(可能)的AE，包括头疼和膝关节肿胀。没有死亡或其它严重AE。在治疗之间，如通过生物化学临床实验室测试、生命特征以及ECG评估所评估的安全性没有清楚的差异。

研究结论：

对于每个治疗组，在研究的持续期间除了安慰剂组在第84天之外，疼痛(通过疼痛数字评分分数评估)和WOMAC分数在给药后降低，在治疗组之间没有显著差异。尽管生理盐水组和Ampion^TM组相比有更高的基线疼痛，但存在趋向于研究药物的长期效果的趋势，Ampion^TM与生理盐水相比有更高百分比的受试者在第84天响应。在接受Ampion^TM的受试者中，在研究的持续期间总体疼痛在给药后减少，而在接受生理盐水的受试者中，在给药后第84天没有疼痛的减少。直到给药后72小时，扑热息痛援救药物的使用在治疗E组(生理盐水)最高。本研究中使用的剂量的Ampion^TM认为是安全并耐受良好的。本研究中在第84天的疼痛改善与Ampion^TM施用引起的组织再生是一致的。

实施例2

本实施例证明了通过DADKP和其它药物处理，干细胞软骨形成的提高。

发明人研究了DADKP直接提高软骨形成或对于软骨细胞系重要基因的转录和/或翻译具有附加或协同效应的可能性。

材料：

·干细胞：骨髓来源的人间充质干细胞：第5代骨髓来源的人间充质干细胞(HUXMA-01001,Cyagen Biosciences,Sunnyvale CA)

·间充质干细胞软骨分化培养基(GUXMX-90041,Cyagen Biosciences,SunnyvaleCA)

·TheraPEAK MSCGM化学限定干细胞培养基(190632Lonza)

·1mM溶于纯乙醇的醋酸地塞米松和米非司酮(mifepristone)(Sigma)

·生理盐水或0.9％氯化钠用于注射ZR Flush(Excelsior Medical,Neptune NJ)

·无菌过滤的溶于生理盐水的0.6mM辛酸钠(sigma)

·无菌过滤的溶于生理盐水的3mM NAT；在60℃加热30分钟接着超声处理5分钟来制备

·无菌过滤的溶于生理盐水的10mM DADKP

·0.2μM注射式过滤器

·Hepes缓冲盐水、胰蛋白酶/EDTA、胰蛋白酶中和溶液(Lonza reagent pack)

·182cm2组织培养瓶

·移液器和无菌枪头

·组织培养罩、潮湿的CO2恒温箱、水浴或珠浴

·24孔组织培养板

·Qiagen RNeasy加离心柱(Qiagen 74134)

·Qiagen RT2qPCR引物对，用于胶原蛋白2A1、MMP13、TIMP1、聚蛋白聚糖、GAPDH，和肌动蛋白B

·Roche Sybr green I预混液(master mix)和Invitrogen Superscript VILO预混液

·Roche 480lightcycler

以下储备药物治疗溶液制备于注射用生理盐水中并浴加热到37℃：

o 4μM地塞米松

o 4μM米非司酮

o 3mM的NAT

o 0.6mM辛酸盐

o 80μM的DADKP

o 3mM NAT,0.6mM辛酸盐,80μM DADKP的混合物(“Ampion”混合物)

通过制造商方案制备Cyagen软骨分化培养基，但排除地塞米松和TGFβ3补充物，并在浴中加热到37℃。

治疗方案包括在含有40mls TheraPEAK^TM MSCGM的182cm²瓶中扩增5份HUXMA干细胞至80-90％细胞覆盖。从瓶中胰蛋白酶消化细胞，并在Cyagen软骨分化培养基中加热HUXMA干细胞的1.0×10⁷细胞悬液。20μl加热的细胞悬液点在24孔组织培养板的每个孔的中间(每个点200,000个细胞)，并在37℃和5％CO₂孵育一小时。

从恒温箱移出培养板，并向每个孔加入另外720μl软骨形成培养基。以一式三样向适当孔中加入250μl生理盐水，或药物溶液(使得最终药物稀释液为储备药物处理溶液浓度的四分之一)。向每个孔中添加10μl TGFβ3溶液(由Cyagen提供)，将培养板返还到恒温箱中。

每3-4天进行培养基更换，通过从孔中吸出培养基并使用如上所述的新鲜软骨形成培养基、稀释的储液以及TGFβ3替代。

对于所有培养板在处理后第7天、第14天和22天如下所述进行RNA分离和分析(使用所述培养基更换)。从孔中移除培养基并保存用于进一步蛋白分析。向每个孔中添加Qiagen RNeasy加裂解缓冲液(含有2巯基乙醇)，并温和摇动10分钟。将每个孔的裂解细胞悬浮液转移到Qiashredder柱，并在14000rpm离心2分钟。通过RNeasy^TM加制造商方案处理RNA分离。使用25μl无RNase的水从Qiagen柱洗脱RNA。

如下进行cDNA合成和实时PCR。使用10μl分离的RNA在20μl总体积中进行所有样品的cDNA第一条链的合成。所有cDNA反应物使用30μl无核酸酶的水稀释。接着使用5μl稀释的cDNA，Roche Syber green预混液，和Qiagen RT²qPCR^TM引物对在20μl总反应体积中进行实时PCR。通过deltadeta Ct方法确定相对基因表达。

数据/结果

表10-第7天结果:

在第七天，发明人观察到2A1型胶原蛋白和MMP13升高的表达。除了DADKP处理的孔拉成松散的团粒外，所有培养物都成盘(in disc)。在处理后第8天拍摄了细胞聚集物的照片(见图2)。

表11-第14天结果

在第十四天，发明人观察到了一些培养物展现出不同的表型。将DADKP处理的孔与成团粒的对照对比，表明转录仍然提高。额外的药物处理似乎对于胶原蛋白的转录有作用。

表12-第22天结果

在第22天，发明人观察到了在DADKP处理后，胶原蛋白转录的大大提高。另外，药物处理也表现出一些活性，但远不及DADKP突出。在DADKP处理22天后，以及类似的在Ampion处理22天后，2A1胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的转录分别表现出2000倍和200倍增加(见图3)。

讨论/结论

DADKP处理表现出胶原蛋白2A1的转录增加以及聚集蛋白聚糖可能地转录增加。肉眼观察提示培养物的体系结构也可能影响胶原蛋白的转录。

实施例3

在实施例2中所描述的实验后，开发了用于测试间充质软骨形成方案的标准规程。本实施例列出了标准化的软骨形成测试方案以及预期结果。

材料/设备

材料：

·第5代骨髓来源的人间充质干细胞(HUXMA-01001,Cyagen Biosciences,Sunnyvale CA)

·间充质干细胞软骨分化培养基(GUXMX-90041,Cyagen Biosciences,SunnyvaleCA)

·TheraPEAK MSCGM化学限定干细胞培养基(190632Lonza)

·1mM溶于纯乙醇的醋酸地塞米松和米非司酮(Sigma)

·生理盐水或0.9％氯化钠用于注射ZR Flush(Excelsior Medical,Neptune NJ)

·无菌过滤的溶于生理盐水的0.6mM辛酸钠(sigma)

·无菌过滤的溶于生理盐水的3mM NAT；在60℃加热30分钟接着超声处理5分钟来制备

·无菌过滤的溶于生理盐水的10mM DADKP

·0.2μM注射式过滤器

·Hepes缓冲盐水、胰蛋白酶/EDTA、胰蛋白酶中和溶液(Lonza reagent pack)

·75和182cm2组织培养瓶

·移液器和无菌枪头

·组织培养罩、潮湿的CO2恒温箱、水浴或珠浴

·24孔组织培养板

·Qiagen RNeasy加离心柱(Qiagen 74134)

·Qiagen RT2qPCR引物对，用于胶原蛋白2A1、MMP13、TIMP1、聚蛋白聚糖、GAPDH和肌动蛋白B

·Roche Sybr green I预混液和Invitrogen Superscript VILO预混液

·Roche 480lightcycler

规程/方法学：

从冻存库存扩增细胞：

·使用标准规程冷冻保存第4代HUXMA细胞，并在使用前储存于液氮中。

·从液氮储存中移出一个小管，并置于三个每个含有15mls TheraPEAK MSCGM的75cm2组织培养瓶中

·将细胞在37℃和5％CO2湿润的恒温箱中孵育，直到达到60-70％的细胞覆盖(大约三天)。

·使用标准步骤从培养瓶中胰酶消化细胞，并将细胞从一个75cm2培养瓶中放置到一个含有40mls TheraPEAK MSCGM的182cm2培养瓶中。

·孵育细胞直到观察到80-90％的细胞覆盖(约4天)。

·再次胰酶消化细胞，并进行下一步骤。

铺板和处理细胞：

·从上文列出的储液制备以下溶于注射用生理盐水的工作稀释液，并在浴中加热至37℃(对照和溶液经设计来模仿一些已知Ampion组分的终浓度)

o 4μM地塞米松和米非司酮

o 3mM的NAT

o 0.6mM辛酸盐

o 80μM的DADKP

o 3mM NAT,0.6mM辛酸盐,80μM DADKP的混合物

·另外，将生理盐水和Ampion储液在浴中加热到37℃。

·遵循说明混合Cyagen软骨分化培养基，但排除地塞米松和TGFβ3补充物。在浴中加热到37℃。

·在加热的软骨形成培养基中制备HUXMA干细胞1.0×10⁷的细胞悬液，接着将20μl点到24孔组织培养板的每个待用孔的中间。(每个点200,000个细胞)

·在37℃和5％CO2孵育一小时。

·将培养板从恒温箱中移出，并温和地向每个孔中加入720μl软骨形成培养基。

·以一式三份向适当的孔中加入250μl生理盐水、Ampion，或对照溶液。

·接着向每个孔添加由Cyagen提供的TGFβ3溶液。

·将培养板放回恒温箱

·每3-4天进行培养基更换，通过将培养基从孔中吸出并使用如上所述新鲜的软骨形成培养基、稀释的储液以及TGFβ3替换。

RNA分离和分析：

·在处理后第7天、第14天和22天处理培养板(使用所述培养基更换)。

·从孔中移除培养基并保存用于进一步蛋白分析

·向每个孔中添加Qiagen RNeasy加裂解缓冲液(含有2ME)并温和摇动10分钟。

·将溶液转移到Qiashredder柱并在14000rpm离心2分钟。

·遵循制造商的建议使用RNeasy加方案处理。

·使用25μl无RNase的水洗脱RNA。

cDNA合成和实时PCR：

·遵循推荐的20μl总体积方案使用10μl分离的RNA从所有样品进行cDNA第一条链的合成。

·接着使用30μl无核酸酶的水稀释所有cDNA反应物。

·接着使用5μl稀释的cDNA，Roche Syber green预混液，和Qiagen RT²qPCR^TM引物对进行实时PCR(20μl总体积)。

预期结果：

使用DADKP处理骨髓间充质干细胞/基质细胞(MSC)显著增加软骨形成，至少如通过胶原蛋白2a1和聚集蛋白聚糖的转录所测量的。在使用含有N-乙酰色氨酸(NAT)、辛酸盐和DADKP的组合物处理这些细胞后，胶原蛋白2a1的转录可能观察到增加多于1000倍，并可能观察到增加多于2000倍。

使用地塞米松和米非司酮处理相同的细胞表现出软骨形成标志物轻度的增加，大大低于使用DADKP或含有N-乙酰色氨酸、辛酸盐和DADKP的组合物处理后观察到的胶原蛋白2a1转录1000倍的增加。相似的，使用N-乙酰色氨酸或辛酸盐处理也导致软骨形成标志物的中度增加。

实施例4

本实施例通过在3D培养中生长的间充质干细胞(MSC)证明了Ampion^TM对于CXCR4或CXCL12的转录的影响。几个组已证明了当培养干细胞时，CXCR4的转录和表达丢失。如果细胞直接在塑料上以2D构造生长时这一效果更加明显。在本实施例中，MSC在Ampion^TM的存在下在悬滴培养物(hanging drop culture)中培养，接着通过RTPCR评价mRNA。

材料：

·第5代骨髓来源的人间充质干细胞(HUXMA-01001,Cyagen Biosciences,Sunnyvale CA)

·间充质干细胞软骨分化培养基(GUXMX-90041,Cyagen Biosciences,SunnyvaleCA)

·TheraPEAK MSCGM化学限定干细胞培养基(190632Lonza)

·Lonza MSGM(含有血清)

·10mM溶于生理盐水的氯化钴，无菌过滤(Sigma)

·生理盐水或0.9％氯化钠用于注射ZR Flush(Excelsior Medical,Neptune NJ)

·0.2μM注射式过滤器

·Hepes缓冲盐水、胰蛋白酶/EDTA、胰蛋白酶中和溶液(Lonza reagent pack)

·182cm²组织培养瓶

·移液器和无菌枪头

·组织培养罩、潮湿的CO2恒温箱、水浴或珠浴

·10cm²培养皿

·Qiagen RNeasy加离心柱(Qiagen 74134)

·Qiagen RT2qPCR引物对，用于胶原蛋白2A1、MMP13、TIMP1、聚蛋白聚糖、GAPDH和肌动蛋白B

·Roche Sybr green I预混液和Invitrogen Superscript VILO预混液

·Roche 480lightcyc1er

细胞扩增

·从液氮存储中移出第5代HUXMA细胞，并在含有40mls TheraPEAK MSCGM的182cm²培养瓶中扩增直到80-90％细胞覆盖。

·使用标准方案胰酶消化细胞，并进行下一步骤。

制备悬滴培养物

·从上文列出的储液制备以下溶于注射用生理盐水的工作稀释液

o 生理盐水

o 800μM溶于生理盐水的氯化钴

o 纯Ampion

·在珠浴中将稀释液和Lonza MSCGM加热到37℃。

·在加热的MSCGM培养基中制备HUXMA干细胞1.0×10⁶的细胞悬液。

·在无菌试管中混合250μl适合的工作稀释液，250μl细胞悬液(250，000个细胞每个反应)，500μl加热的MSCGM。

·将所得溶液40μl的“点”小心放置到培养皿盖的表面下。(应产生总共40个点)。

·将20ml无菌PBS放置到培养皿的底储层，接着将盖倒转在PBS上。

·在37℃和5％CO₂孵育。

RNA分离和分析：

·4天后，从恒温箱移出培养板。

·使用每个培养板底部5ml的热PBS从盖洗下球状体，并转移到15ml锥形离心管中。

·在1000RPM离心细胞5分钟，并吸出溶液。

·向每个管中加入350μl Qiagen RNeasy加裂解缓冲液(含有2ME)

·将溶液转移到Qiashredder柱并在14,000rpm离心2分钟。

·遵循制造商的建议使用RNeasy加方案处理。

·使用30μl无RNase的水洗脱RNA。

cDNA合成和实时PCR：

·遵循推荐的20μl总体积方案使用10μl分离的RNA从所有样品进行cDNA第一条链的合成。

·接着使用30μl无核酸酶的水稀释所有cDNA反应物。

·接着使用5μl稀释的cDNA，Roche Syber green预混液，和Qiagen RT²qPCR^TM引物对进行实时PCR(20μl总体积)。

·通过delta deta Ct方法确定相对基因表达。

钴处理似乎大大影响了这些细胞的GAPDH表达。在非常早就推动cp调用(cp callswere pushed very early)并展现出多条条带。因此，也使用肌动蛋白B来通过delta delta方法评价相对表达。结果示于下面的表13和14中。

表13–对CXCR4的影响

表14-对CXCL12的影响

这些结果进一步示于图4和图5中。

本实验的结果证明Ampion影响CXCR4和CXCL12。更具体的，Ampion引起CXCR43-7倍的增加而将CXCL12降低19-37倍。

实施例5

本实施例将揭示Ampion^TM对干细胞体外迁移的影响。以前的数据提示，Ampion处理影响CXCR4或CXCL12两者的转录。将设计本实验来证实MSC的迁移是否也被改变。

材料：

·第5代骨髓来源的人间充质干细胞(HUXMA-01001,Cyagen Biosciences,Sunnyvale CA)

·TheraPEAK MSCGM化学限定干细胞培养基(190632Lonza)

·Lonza MSGM,Gibco RPMI,Gibco Defined胎牛血清

·10mM溶于生理盐水的氯化钴，无菌过滤(Sigma)

·生理盐水或0.9％氯化钠用于注射ZR Flush(Excelsior Medical,Neptune NJ)

·0.2μM注射式过滤器

·Hepes缓冲盐水、胰蛋白酶/EDTA、胰蛋白酶中和溶液(Lonza reagent pack)

·25和175cm2组织培养瓶

·移液器和无菌枪头

·组织培养罩、潮湿的CO2恒温箱、水浴或珠浴

·8.0um Thincert组织培养插入和24孔组织培养板(Greiner)

·50μg钙黄绿素AM小瓶(BD Biosciences)

·DMSO

细胞扩增：

·从液氮存储中移出第5代HUXMA细胞，并在含有40mls TheraPEAK MSCGM的175cm²培养瓶中扩增直到80-90％细胞覆盖。

·使用标准方案胰酶消化细胞，并进行下一步骤。

细胞处理：

·从上文列出的储液制备以下溶于注射用生理盐水的工作稀释液。

o 生理盐水

o 800μM溶于生理盐水的氯化钴

o 纯Ampion

·在珠浴中将稀释液和Lonza MSCGM加热到37℃。

·在加热的MSCGM培养基中制备HUXMA干细胞的细胞悬液。

·计数并使得从细胞悬液的250,000个细胞在4mls加热的MSCGM中。

·将稀释的细胞溶液加到25cm²组织培养瓶。

·向所述组织培养瓶中加入1ml适合的工作稀释液。

·在37℃和5％CO₂孵育72小时。

侵袭试验(Invasion assay)：

·使用胰蛋白酶从培养瓶中移出细胞并置于600μl RPMI+0.5％FBS中。

·向24孔细胞培养板中静置的thinserts(每个处理组3个插入物)的上室加入200μl所得的细胞悬液。

·向transwell系统的底室加入600μl RPMI+0.5％FBS。

·向每个处理组的底室加入66μl以下溶液中的一种。

o 550ng/ml SDF(最终50ng/ml)

o 110ng/ml TGFβ3(最终10ng/ml)

o 血清(最终10％)

·在37℃和5％CO₂孵育板24小时。

标记和细胞检测。

·取出两个钙黄绿素AM小瓶并加入20μl DMSO。

·将两个小管的内含物转移到12.5ml含有0.2％BSA的RPMI。

·将450μl钙黄绿素AM溶液(8μM)置入24孔组织培养板的每一个孔中。

·从来自上述的插入物转移到含有钙黄绿素AM的孔中并在37℃和5％CO₂孵育45分钟。

·使用钙黄绿素AM装载细胞后，将插入物转移到含有450μl胰蛋白酶EDTA的24孔组织培养板的孔中，并再孵育10分钟。

·弃去插入物，接着向每个孔加入450μl胰蛋白酶中和溶液。

·将250μl所得溶液转移到96孔黑色平底板的孔(每个反应一式三样)。

·读出在485nm激发和530nm发射的荧光。

本实验的结果示于下面的表15和图6中。

表15-迁移试验

对于所有检测的趋化信号，使用Ampion^TM预处理的MSC增加了24小时后底室中细胞的可检测数量。Ampion将FBS迁移增加了22％、SDF-1增加了31％，而TGFβ3增加了15％。

实施例6

本实施例揭示了Ampion^TM加快软骨形成。另外，Ampion^TM对于软骨细胞系的重要基因的转录和翻译具有附加或协同效应。

材料：

·第5代骨髓来源的人间充质干细胞(HUXMA-01001,Cyagen Biosciences,Sunnyvale CA)

·间充质干细胞软骨分化培养基(GUXMX-90041,Cyagen Biosciences,SunnyvaleCA)

·TheraPEAK MSCGM化学限定干细胞培养基(190632Lonza)

·1mM溶于纯乙醇的醋酸地塞米松和米非司酮(Sigma)

·生理盐水或0.9％氯化钠用于注射ZR Flush(Excelsior Medical,Neptune NJ)

·无菌过滤的溶于生理盐水的0.6mM辛酸钠(sigma)

·无菌过滤的溶于生理盐水的3mM NAT；在60℃加热30分钟接着超声处理5分钟来制备

·无菌过滤的溶于生理盐水的10mM DADKP

·0.2μM注射式过滤器

·Hepes缓冲盐水、胰蛋白酶/EDTA、胰蛋白酶中和溶液(Lonza reagent pack)

·182cm²组织培养瓶

·移液器和无菌枪头

·组织培养罩、潮湿的CO2恒温箱、水或珠浴

·24孔组织培养板

·Qiagen RNeasy加离心柱(Qiagen 74134)

·Qiagen RT²qPCR引物对，用于胶原蛋白2A1、MMP13、TIMP1、聚蛋白聚糖、GAPDH和肌动蛋白B

·Roche Sybr green I预混液和Invitrogen Superscript VILO预混液

·Roche 480lightcyc1er

细胞扩增：

·在含有40mls TheraPEAK MSCGM的175cm²培养瓶中扩增第5代HUXMA细胞直到80-90％细胞覆盖。

·使用标准方案胰蛋白酶消化细胞，并进行下一步骤。

细胞铺板和处理：

·从上文列出的储液制备以下溶于注射用生理盐水的工作稀释液，并在浴加热至37℃(对照和溶液经设计以模仿一些已知Ampion组分的终浓度)

o 4μM地塞米松和米非司酮

o 3mM的NAT

o 0.6mM辛酸盐

o 80μM的DADKP

o 3mM NAT,0.6mM辛酸盐,80μM DADKP的混合物

·另外，将生理盐水和Ampion储液在浴中加热到37℃。

·遵循说明混合Cyagen软骨分化培养基，但排除地塞米松和TGFβ3补充物。在浴中加热到37℃。

·在加热的软骨形成培养基中制备HUXMA干细胞1.0×10⁷的细胞悬液，接着将20μl点到24孔组织培养板的每个待用孔的中间。(每个点200,000个细胞)

·在37℃和5％CO2孵育一小时。

·将培养板从恒温箱中移出，并温和地向每个孔中加入720μl软骨形成培养基。

·以一式三份向适当的孔中加入250μl生理盐水、Ampion或对照溶液。

·接着向每个孔添加10μl由Cyagen提供的TGFβ3溶液。

·将培养板放回恒温箱

·每3-4天进行培养基更换，通过将培养基从孔中吸出并使用如上所述新鲜的软骨形成培养基、稀释的储液以及TGFβ3替换。

RNA分离和分析：

·在处理后第7天、第14天和22天处理培养板(使用所述培养基更换)。

·从孔中移除培养基并保存用于进一步蛋白分析

·向每个孔中添加Qiagen RNeasy加裂解缓冲液(含有2ME)并温和摇动10分钟。

·将溶液转移到Qiashredder柱并在14000rpm离心2分钟。

·遵循制造商的建议使用RNeasy加方案处理。

·使用25μl无RNase的水洗脱RNA。

cDNA合成和实时PCR：

·遵循推荐的20μl总体积方案使用10μl分离的RNA从所有样品进行cDNA第一条链的合成。

·接着使用30μl无核酸酶的水稀释所有cDNA反应物。

·接着使用5μl稀释的cDNA，Roche Syber green预混液，和Qiagen RT²qPCR^TM引物对进行实时PCR(20μl总体积)。

·通过delta deta Ct方法确定相对基因表达。

结果

本实验第7天和第22天的结果示于下面的表15-16和图7-9中。

表15-第7天的结果

在第七天，观察到了2A1型胶原蛋白和MMP13的表达升高。除了DADKP处理的孔拉成松散的团粒外，所有培养物都成盘状。

表16-第22天

在第22天，Ampion^TM大大提高了胶原蛋白转录。组分也表现出一些活性，但远不及Ampion^TM突出。也提高了聚集蛋白聚糖。

本实施例的结果表明Ampion具有增加胶原蛋白2A1和聚蛋白聚糖的转录的能力。

实施例7

接下来的实施例是对来自于Ampion^TM处理的患者的滑液与来自接受生理盐水的患者的滑液相比的蛋白组学分析。

在用Ampion^TM来治疗膝骨关节炎的临床试验中，在基线和使用10cc Ampion^TM或生理盐水治疗后12周，从患者的膝关节取出滑液。对于生理盐水和Ampion都比较基线至12周。

所述滑液样品由SomaLogic,Inc.of Boulder,Colorado,USA使用其专y有的SOMAscan^TM技术分析。

下面的表17中所示的蛋白在Ampion^TM处理的滑液中与生理盐水处理的滑液中相比下调。

表17-Ampion^TM处理的样品中下调的蛋白

·MAPK活化的蛋白激酶3
	·β-肾上腺素能受体激酶1
·具有血小板反应蛋白I型基序的ADAM金属肽酶
	·MAPK活化的蛋白激酶2
·C-Src激酶
	·巨噬细胞清道夫受体
·Noggin
	·酪氨酸激酶Bruton
·糖原合酶激酶-3α/β
	·糖原合酶激酶-3α/β
·HSP 90α/β
	·HSP 90α/β
·磷酸肌醇-3-激酶,催化亚基α
	·磷酸肌醇-3-激酶,催化亚基α

·真核翻译起始因子4A
	·成纤维细胞生长因子17

下面的表18中所示的蛋白在Ampion^TM处理的滑液中与生理盐水处理的滑液中相比上调。

表18-Ampion^TM处理的样品中上调的蛋白

丛生蛋白(载脂蛋白J)
	C1QBP(透明质酸结合蛋白1)
乳腺珠蛋白2
	MCP 1(CCL 2)
脊椎蛋白1
	IL 11
CFC 1(隐性蛋白)
	血管生成素
MMP-3
	BSSP 4
RSPO2
	bFGF
凝固因子IX
	CATC(二肽基肽酶1)
Ck-b-8-1(MPIF 1剪接变体)
	C1s
EMR2
	ART
DPP 2
	SAA
TIMP-1
	脑信号蛋白3A
凝血酶原
	TNFSF 15(VEGF抑制剂)

MIP3b(CCL 19)
	PTHrP
Elafin(弹性蛋白酶抑制剂)
	NPS-PLA2
睾丸蛋白聚糖1(SPOCK 1)
	URB
IP10(cxcl 10)
	IL 8(cxcl 8)
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C
	因子H
SDF-1(cxcl 12)
	PIGR

下面的表19中所示的蛋白在在Ampion^TM处理的滑液中与生理盐水处理的滑液中相比显著不同(上调或下调)，并已知影响软骨和滑液的产生。

表19-Ampion^TM处理的样品中上调的蛋白

本实施例的结果提示，Ampion^TM的施用下调Akt途径。Akt，也称为蛋白激酶B(PKB)，是一种在多种细胞过程例如细胞增殖、转录和细胞迁移中扮演关键角色的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。

实施例8

本实施例揭示了关节内注射5％人血清白蛋白的低分子量级分(LMWF-5A)用于治疗由于骨关节炎产生的膝疼痛的效果。

本研究是一项多中心随机、媒介物对照、双盲、平行研究，经设计来评价LMWF-5A关节内注射的两种剂量的安全性和效力。患有症状性膝骨关节炎的患者以1:1:1:1随机分配来接受单次4ml或10ml关节内膝注射LMWF-5A或媒介物对照(生理盐水)。主要疗效终点是治疗组之间从基线到12周的Western Ontario和McMaster Universities(WOMAC)疼痛变化的差异。安全性以不良事件(AE)的发生率和严重性来检查。

患有OA膝疼痛的总共329个患者随机分配为1:1:1:1的4个研究组：4ml LMWF-5A，4mL生理盐水媒介物对照，10ml LMWF-5A或10ml生理盐水媒介物对照。患者处置示于图10中。

LMWF-5A的起始材料，从OctaPharma(Lachen,Switzerland)购买的HSA，在无菌条件下经历离心/超速离心和超滤，分离含有MW少于5000Da的种类的超滤物。超滤物含有DA-DKP(约50-200mM)和赋形剂(例如，辛酸钠和乙酰色氨酸钠)。所述超滤物转移到无菌灌装来得到无菌药物产物。

在第6周和第12周的就诊期间和第2、4、8和10周的电话联系期间，使用WOMACH骨关节炎指数3.15分Likert评分，疾病严重程度的患者全球评估(PGA)使用5分Likert评分，以及关节内注射后扑热息痛的量来评价治疗对OA的临床效果。在基线以500mg的药片提供扑热息痛作为援救药物，并允许根据需要每4小时一片。通过记录不良事件(给药后直到24小时和所有的后续联系)，生命特征以及体检结果(基线、第6和12周)来评价安全性。

LMWF-5A导致了与媒介物对照相比疼痛的统计学显著改善(分别为20.93对20.72)。没有观察到注射体积效应(p＝0.64)。与对照的估算差异为20.25(95％CI:20.08–20.41),p＝0.004。与媒介物对照相比，使用LMWF-5A在早至第4周就观察到了疼痛的减少(p＝0.03)，并持续到第12周(p＝0.004)。如图11所示，LMWF-5A与媒介物对照相比，随着时间疼痛的百分比降低显著更多(第12周：分别为42.3％和31.7％)。

与媒介物对照相比，使用LMWF-5A治疗的患者表现出在以下次要终点显著的改善：PGA(20.87对20.65,p＝0.01)，生理功能(20.78对20.64,p＝0.04)；休息时疼痛(20.91对20.70,p＝0.004)；运动时疼痛(20.96对20.75,p＝0.01)，表3。治疗组之间僵硬的减少没有差异。LMWF-5A与媒介物对照相比，研究以来使用的扑热息痛药片的数量有趋向减少的趋势(中位值(IQR))：24.0(0,62)对34.0(5,85.5),p＝0.09。在本研究中，疼痛的改善与Ampion^TM的施用导致的组织再生一致。

实施例9

本实施例是实施例8中所述的临床实验的二十周延伸，证明了LMWF-5A用于治疗由于骨关节炎产生的膝疼痛的效果。

本分析是一项多中心、随机、媒介物对照、双盲、平行研究(NCT01839331)的20周延伸，其评价5％人血清白蛋白的低分子量级分(LMWF-5A)用于治疗膝的症状性OA(OAK)中炎症相关疼痛的效力和安全性。

接受4-mL关节内注射LMWF-5A或媒介物对照的九十七个患者在初始的12周研究终点以外随访另外8周。效力测量包括Western Ontario和McMaster UniversitiesOsteoarthritis(WOMAC)疼痛和功能分项分数从基线的变化。如果其WOMAC疼痛和功能达到≥40％改善，患者被认为是“响应者”。治疗组之间的差异通过chi-square检验和ANCOVA评价，针对基线值调整。

在患有中度至重度OAK(Kellgren-Lawrence等级3-4；n＝64)的患者亚组中，接受LMWF-5A的患者与接受媒介物对照相比，在20周WOMAC疼痛(均值从基线改变-0.99对-0.65)和功能评分(-0.85对-0.58)分别有统计学显著改善。在符合方案群体，也分别观察到了疼痛(-0.95对-0.77)和功能(-0.79对-0.63)的治疗-相对-安慰剂的相关差异。第20周，在中度至重度亚组中接受LMFW-5A的患者(50％)相对于接受媒介物对照的患者(25％)，疼痛响应者的百分比显著更高。在LMWF-5A和对照组中，观察到了相似的不良事件发生率和严重性。

本实施例证明了LMWF-5A的单次注射与膝疼痛的持续改善相关，并能够向患有中度至重度OAK的患者提供一种治疗选项。这些发现证明LMWF-5A对于患有具有客观证据的真正OAK和高治疗需要的患者表现出显著益处。

已经呈现本发明的上述实施例用于说明和描述。此外，这些实施例并不意图将本发明限制为本文公开的形式。因此，与本文所教导的相应的变化和修改，以及相关领域的技能或知识，都在本发明的范围之内。在本文提供的实施例中描述的具体实施方案用于进一步解释已知用于实施本发明的最佳模式，并使得其它的本领域技术人员能够以这些或其它实施方案，以及根据本发明的具体应用或用途所要求的各种修改利用本发明。意图是所附的权利要求解释为在现有技术所允许的范围内包括可选的实施方案。

Claims (10)

1.DA-DKP、辛酸盐/酯和N-乙酰色氨酸的组合物在制备用于引起间充质干细胞分化为软骨细胞的药物组合物中的用途，其中引起间充质干细胞分化为软骨细胞包括：

(a) 使间充质干细胞与包含DA-DKP、辛酸盐/酯和N-乙酰色氨酸的药物组合物接触，其中所述药物组合物包含人血清白蛋白的级分，其中基本上所有的白蛋白已从所述级分移除；

(b) 在适合促进所述间充质干细胞扩增的条件下培养所述间充质干细胞；和

(c) 添加一种或多种分化因子或改变培养条件来诱导所述间充质干细胞分化以形成软骨细胞。

2.权利要求1的用途，其中所述培养步骤包括添加一种或多种选自下组的组分：血小板生成素（TPO），干细胞因子（SCF），IL-1，IL-3，IL-7，flt-3配体（flt-3L），G-CSF，GM-CSF，Epo，FGF-1，FGF- 2，FGF-4，FGF-20，IGF，EGF，NGF，LIF，PDGF，骨形态发生蛋白（BMP），激活素A，VEGF，福斯高林（forskolin）和糖皮质激素。

3.权利要求1的用途，其中所述添加一种或多种分化因子或改变培养条件的步骤包括选自下组的步骤：温度的改变、氧/二氧化碳含量的改变，培养基浊度的改变，和选自营养物、酶抑制剂、酶刺激物、组蛋白脱乙酰酶活性抑制剂、DNA甲基转移酶活性抑制剂，和酶GSK-3抑制剂的分化因子的添加。

4.权利要求1的用途，其中所述药物组合物包含人血清白蛋白的低分子量级分。

5.权利要求4的用途，其中所述人血清白蛋白的低分子量级分是少于5000分子量的级分。

6.权利要求4-5任一项的用途，其中所述人血清白蛋白的低分子量级分是通过过滤产生的。

7.权利要求1和4-6任一项的用途，其中所述药物组合物通过包括在有效引起DA-DKP形成的条件下加热人血清白蛋白的方法制备。

8.权利要求1和4-7任一项的用途，其中所述药物组合物通过包括在有效产生DA-DKP的条件下使人血清白蛋白与剪切人白蛋白的两个N末端氨基酸的酶接触的方法制备。

9.权利要求1的用途，其中所述DA-DKP是合成的DA-DKP。

10.组合物，其含有使用包含DA-DKP、辛酸盐/酯和N-乙酰色氨酸的培养基补充物补充的无血清培养基中的间充质干细胞，其中所述无血清培养基基本上不含白蛋白，并且其中所述培养基补充物基本上不含白蛋白。

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