CN114717184B - 一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法 - Google Patents

一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法，涉及生物技术领域。所述培养液包含以下成分：10％‑18％的FBS、0.8％‑1.2％的牙鲆血清和40‑60μmol/L的β‑巯基乙醇(β‑ME)。本发明通过摸索牙鲆精原细胞的体外培养及纯化方法，提供了适于精原干细胞的培养液并建立了适宜精原干细胞稳定传代的培养条件，最终获得了比例较高的精原干细胞，并提供了全方面鉴定精原干细胞的方法。

Description

一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法。
背景技术
鱼类精原干细胞(Spermatogonia stem cells，SSCs)具有自我更新和分化成精子的能力，承载着将父本遗传物质传给下一代的任务。建立精原干细胞系，不仅为脊椎动物生殖系的遗传操作提供一个研究平台，还将以生殖干细胞的形式半永久性的保存鱼类的基因资源，并可通过“借腹生子”即生殖干细胞移植技术产生子代。
自从Takeuchi等于2003年建立虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的原始生殖干细胞(Primordial germ cells,PGCs)移植技术以来，生殖干细胞移植技术广泛应用于鱼类种质资源保护和育种领域。一般生殖干细胞移植研究所用的供体来源细胞大部分为新鲜分离纯化的生殖干细胞，鲜少使用体外培养的生殖干细胞进行移植，主要是由于鱼类生殖干细胞体外培养较为困难。目前，相关学者仅在斑马鱼(Brachydanio rerio var)、暗色颌须鮈(Gnathopogon caerulescens)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)、胡子鲶(Clariasbatrachus)等鱼类中开展了精原干细胞体外培养和诱导精子发生研究，在斑马鱼(Brachydanio rerio var)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)中开展了将体外培养一个月左右精原干细胞移植研究，以上研究均没有建立完全稳定的精原干细胞系。目前，仅青鳉鱼建立了稳定的精原干细胞系，培养至150代后依然具有分化成精子的能力。
虽然从1962年首个鱼类细胞系建立以来，鱼类细胞体外培养研究发展迅猛，近十年就陆续建立了280余种，但是海水鱼性腺细胞系研究较少，也仅在日本鳗鲡(Anguillajaponica)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、黄姑鱼(Larimichthys crocea)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、条斑星鲽(Veraspermoseri)中有相关报道，但除了日本鳗鲡(Anguilla japonica)以外，其他鱼类仅通过分子鉴定多为性腺支持细胞系。造成这种现象的原因在于精原干细胞纯化不到位，导致建立的性腺细胞系以支持细胞为主；或者，现有的培养条件不适合建立稳定的精原干细胞系，出现分化无法维持自我更新以及体外精原干细胞鉴定方法不系统等。因此，对于特定的鱼类品种，有必要研发一种体外培养获得精原干细胞系的方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供牙鲆精原细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法。本发明通过摸索精原细胞的体外培养及纯化方法，建立了适宜精原干细胞稳定传代的培养条件，最终获得了比例较高的精原干细胞。此外，本发明利用体外形态学特征、免疫荧光、特异分子标记、核型分析、碱性磷酸酶活性鉴定、体外诱导分化以及干细胞移植后具有可塑性等特点构建了全方面的精原干细胞体外鉴定方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
在一个方面，本发明提供了一种牙鲆精原细胞培养液，所述培养液包括以下成分：10％-18％(v/v)的胎牛血清(FBS)、0.8％-1.2％(v/v)的牙鲆血清、40-60μmol/L的β-巯基乙醇(β-ME)。
在一个实施方案中，所述培养液还包含青霉素、链霉素、两性霉素B和生长因子；优选地，所述青霉素在所述培养液中的终浓度(即工作浓度)为80-120U/mL，所述链霉素在所述培养液中的终浓度(即工作浓度)为0.08-0.12mg/mL，所述两性霉素B在所述培养液中的终浓度(即工作浓度)为0.15-0.35μg/mL，所述生长因子优选为人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)，所述生长因子在所述培养液中的终浓度(即工作浓度)均为1.5-2.5ng/mL。
在一个实施方案中，所述培养液还包含缓冲液，所述缓冲液选自HEPES、NaHCO3缓冲液，优选HEPES缓冲液；所述缓冲液浓度为8-11mmol/L。
在进一步实施方案中，所述培养液所用基础培养基包括L15、MEM、DMEM、DMEM/F12，优选DMEM/F12。
本发明摸索优化了精原干细胞的体外培养液，通过在L15或MEM、DMEM或DMEM/F12基础培养基中添加10％-18％胎牛血清、0.8％-1.2％牙鲆血清、40-60μmol/Lβ-ME、1.5-2.5ng/mL生长因子bFGF和LIF，使得本发明的培养液更加适合用于进行精原干细胞的培养和传代，有助于成功分离出牙鲆精原干细胞，且精原干细胞占比较高，达到了比现有技术更高的水平。
在另一个方面，本发明提供了一种建立精原干细胞系的方法，所述方法包括：
(a)精原干细胞的原代培养：将牙鲆精巢组织小块接种于前述的培养液的培养瓶中进行原代培养，培养温度优选16-25℃，进一步优选23℃；
(b)精原干细胞的传代培养及纯化：当所述培养瓶中出现精原细胞簇时，将其刮入新瓶后加入所述培养液继续培养；待细胞长满全瓶后，吸弃旧培养液，每瓶加入PBS缓冲液或L15、MEM、DMEM、DMEM/F12中任一种基础培养基漂洗一次后，然后进行胰酶差速消化纯化精原干细胞或贴壁差速纯化精原干细胞；
(c)分离获得纯化的精原干细胞系并进行鉴定。
在一个实施方案中，所述胰酶差速消化纯化精原干细胞包括：每次传代时，加入胰酶消化0.5-2min后，精原细胞变圆掉下时，加入等量所述细胞培养液终止反应，将掉下来的精原细胞转移至另一瓶中加所述培养液继续培养。
在一个实施方案中，所述贴壁差速纯化精原干细胞包括：每次传代时，加入胰酶消化3-5min后细胞开始呈雾状之后加入等量所述细胞培养液，轻轻吹打分散细胞，并在培养瓶中加入所述细胞培养液至原来培养体积的2-3倍，并以1：2-3体积比分瓶后在培养箱孵育30-80min(优选孵育40-50min)后，将含有精原干细胞的细胞悬液移入新瓶继续培养。
本发明纯化方法(1)胰酶差速消化纯化精原干细胞，利用胰酶对不同细胞消化速度不同，生殖细胞最先消化变圆，其次是支持细胞，最后是较大的间质细胞；每次传代时采用胰酶短暂消化后及时传代的方法，经过几次传代后，培养的细胞大部分为生殖细胞，少数支持细胞等其他体细胞，而精母细胞随着传代不断分化或者凋亡消失。本发明纯化方法(2)贴壁差速纯化精原干细胞，在孵育30-80min(优选孵育40-50min)后，待包括支持细胞在内的大部分体细胞贴壁后，将含有精原干细胞的细胞悬液移入新瓶继续培养，传代时经过多次上述操作，培养的细胞以精原干细胞为主，支持细胞等其他细胞占比较少。
在一个实施方案中，建立细胞系的过程包括：根据本发明纯化方法(1)根据胰酶消化性腺不同细胞的速率差异进行纯化传代，一般传代5-10次之后，细胞主要以精原干细胞为主；根据本发明纯化方法(2)根据不同细胞贴壁时长的差异纯化精原干细胞，待加入胰酶将所有细胞消化下来后，将细胞悬液移入新瓶放入培养箱孵育30-80min(优选孵育40-50min)后，以支持细胞为主的细胞先行贴壁，部分精原干细胞尚未贴壁时，将细胞悬液转入新瓶继续培养，一般培养5-10代之后的细胞以精原干细胞为主。然后进行精原干细胞系的生物学指标检测，验证与鉴定。
在一个实施方案中，所述方法包括选取精巢发育处于Ⅰ-Ⅲ期初，年龄为4月至1龄+尚未性成熟的雄鱼的精巢组织进行原代培养。
在一个实施方案中，原代培养过程包括将实验鱼体消毒后，在超净台处理为约1mm3的小块，使用本发明的培养液润湿组织后，接种于25cm2培养瓶中，接种20-30小块为宜，然后加入培养液盖好瓶塞，在培养箱中进行原代培养，培养温度设置23℃。
在一个实施方案中，每20-30cm2的细胞培养面积添加1mL的酶液进行消化；优选地，所述酶液为0.20％～0.30％的胰蛋白酶，更优选0.25％的胰蛋白酶。具体地，25cm2的培养瓶中，每瓶加入2mL PBS或无血清L15基础培养基漂洗一次后，加入1mL的0.20％～0.30％(m/m)的胰酶(胰蛋白酶)消化细胞。所述消化的条件为：20℃～25℃消化。
在一个实施方案中，原代培养至发现培养瓶中有精原细胞簇(精原干细胞团)时(一般用时一个多月至2个月之间，观察发现最上层长有大量清晰可见的精原干细胞团)，将其刮下来移入新瓶继续培养。
在一个实施方案中，本发明提供的建立精原干细胞系的方法还包括精原干细胞的鉴定方法，所述鉴定方法包括对获得的细胞进行HE染色(体外形态学特征)和Vasa免疫荧光、精原干细胞分子鉴定分析(特异分子标记)、精原干细胞染色体核型分析、碱性磷酸酶染色、体外诱导分化结果分析以及精原干细胞移植后可塑性分析中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明可结合用体外形态学特征、免疫荧光、特异分子标记、核型分析、碱性磷酸酶活性鉴定、体外诱导分化以及干细胞移植后具有可塑性等特点构建全方面的精原干细胞体外鉴定方法，进行全面的准确的精原干细胞的鉴定。
进一步地，本发明对获得的精原干细胞进行了冷冻保存与复苏以及体外生长研究，结果表明，液氮冻存的精原干细胞细胞复苏成活率为70％以上，一星期内即可长满全瓶，并可以正常传代，目前冻存5个月复苏后的精原干细胞已经由18代传至46代，细胞冻存前后无明显的形态差异。本发明培养获得的精原干细胞的生长特性良好，可以在L15、MEM、DMEM、DMEM/F12培养基上生长，可选择的培养基范围大，易于其体外培养。本发明的牙鲆精原干细胞在10％-18％(v/v)浓度FBS培养条件下，具有较好的生长趋势，FBS浓度20％或者更高时包括支持细胞在内的体细胞比例逐渐提高，FBS低于10％时，细胞生长缓慢。本发明的牙鲆精原干细胞培养适应的温度范围较广，可在17℃-29℃温度下有较快的生长速率，最适温度为23℃。在FBS、鱼血清、β-ME、生长因子bFGF和LIF等成分组合下，精原干细胞占比较高，且生长速度较快。
经对体外培养的精原干细胞进行鉴定，本发明体外培养获得的精原干细胞形态特征与体内精原干细胞类似，细胞核直径较其他细胞(性腺中其他体细胞)的细胞核大许多，平均直径均大于6μm，且有1-2个致密核仁，且Vasa蛋白显著表达，碱性磷酸酶试剂盒染色呈现深蓝色；出现了不同程度的生殖干细胞或者生殖细胞特异基因的表达。将培养的精原干细胞进行PKH26荧光染色并移植入受体性腺中46天后，组织切片荧光观察发现携带大量PKH26的精原干细胞，说明在受体性腺中进行了嵌合和增殖，证明培养的细胞主要为精原干细胞。本发明从细胞形态、生殖细胞特异基因表达、碱性磷酸酶活性检测、染色体核型、体外分化实验和移植实验的结果分析得出，该细胞系为稳定传代，维持自我更新的精原干细胞系。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明优化了精原细胞的体外培养及纯化方法，本发明的牙鲆培养条件适合建立稳定的精原干细胞系，精原干细胞能够维持自我更新和分化的功能；本发明的纯化方法能够使得建立的性腺细胞系以精原干细胞为主，最终获得了比例较高的精原干细胞；
本发明建立可持续传代的牙鲆精原干细胞系的方法，所获得的精原干细胞能够完全稳定的进行传代，能够连续稳定传代达110代以上；
本发明所提供的方法可操作强，可重复，能够提供大量的牙鲆精原干细胞用于牙鲆功能基因的研究，细胞水平理论研究，繁殖生物学研究，应用前景好；本发明的精原干细胞系鉴定方法更加系统，构建了全方面的精原干细胞体外鉴定方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为精原干细胞原代与传代培养光学观察，其中(A)1龄+精巢组织切片；蓝色箭头表示A型精原干细胞，黄色箭头表示A型分化精原细胞，星号表示B型精原细胞；(B)原代培养5天精巢组织贴壁增殖；箭头表示精原细胞；(C)培养48天后扩增的精原干细胞团；箭头表示精原细胞；(D)移入新瓶后精原干细胞团贴壁并克隆增殖；(E)细胞增殖后新长出来的精原细胞簇，曲线圈起来的区域为精原干细胞簇；(F)精原干细胞3代光学观察；标尺为50μm；
图2为胰酶差速消化纯化精原干细胞，其中(A)胰酶消化进行0.5-2min时精原干细胞变圆即将脱落；(B)胰酶消化0.5-2min中，精原细胞簇脱落移走后剩余贴壁细胞，主要是以支持细胞为主的体细胞；(C)纯化4次后7代精原干细胞；标尺为50μm；
图3为贴壁差速纯化精原干细胞，其中(A)胰酶消化5min左右脱落的细胞；(B)转入新瓶78min后，细胞贴壁状态；箭头表示尚未贴壁的精原干细胞；(C)纯化2次后9代精原干细胞；标尺为50μm；
图4为不同浓度血清培养基、不同基础培养基、不同温度以及不同组成成分处理的示意图；
图5为不同培养条件下精原干细胞生长特征，其中(A)为不同培养基细胞生长曲线；(B)为不同FBS浓度细胞生长曲线；(C)为不同温度细胞生长曲线；(D)不同组成成分培养基细胞生长曲线；
图6为不同组成成分培养基细胞培养状态，其中(A)培养4天后细胞培养状态；(B)培养17天后细胞状态；(C)培养29天后细胞状态；Ⅰ，Ⅳ，Ⅴ分别为未传代，传2代后，传3代后细胞，培养基为FM；Ⅱ，Ⅴ，Ⅵ分别为未传代，传2代后，传3代后细胞，培养基为FMBL；III，Ⅵ，Ⅷ分别为未传代，传3代后，传6代后细胞，培养基为FMBLS；(a)、(b)分别为Ⅳ，Ⅴ图中方框放大图；A-SG，A型精原干细胞；标尺为50μm；以L15为基础培养基，不同培养基组成成分分别为：
①FM：15％FBS，50μmol/Lβ-ME；
②FMBL:15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，50μmol/Lβ-ME；
③FMBLS：15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，50μmol/Lβ-ME，1％(v/v)鱼血清(牙鲆血清)；
图7为精原干细胞鉴定分析，其中(A)精原干细胞普通光学观察；(B)精原干细胞苏木素-伊红染色观察；(C)Vasa免疫荧光分析；(D)碱性磷酸酶活性检测；(E)不同特异分子标记在细胞内的表达情况，egr3、etv5、itgb1、dazl、dnd、vasa为生殖细胞或者生殖干细胞特异分子标记，dmrt1为支持细胞特异分子标记，M为Marker，P7-8为7-8代的精原干细胞系，P63-66为63-66代的精原干细胞系；>P110为110代以上的精原干细胞系，N为阴性对照；(F)细胞分裂中期染色体形态；(G)细胞染色体数目统计分析；(H)停止换液半个月细胞分化状态；曲线圈出来的区域为分化的精细胞；(I)分化后获得的具有动能的精子；(J)精原干细胞移植后在受体性腺出现增殖现象，箭头表示携带PKH26荧光标记的精原干细胞。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.精原干细胞稳定细胞系的建立
1.1精原干细胞原代培养
1.1.1培养液配制
首先准备2瓶100ml的L15粉末(Gibco)自配的培养基。
1瓶L-15漂洗液：青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml，两性霉素B工作浓度为0.25μg/ml；
1瓶培养液：含15％FBS，1％牙鲆血清，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml，两性霉素B工作浓度为0.25μg/ml，HEPES缓冲液5mol/L，β-巯基乙醇50μmol/L。
1.1.2实验鱼
来自中国水产科学研究院北戴河中心实验站核心种质群体2龄雄鱼，体重550g，体长38.6cm。
1.1.3原代培养
将实验鱼体用酒精喷洒消毒，再移入超净台操作，采用组织块培养法，将精巢组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入自配的培养液进行组织湿润，25cm2培养瓶接种20-30小块为宜，然后加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶放置细胞培养箱进行原代培养。
1.2精原干细胞纯化及传代培养
待原代培养1个多月后，发现培养瓶中有精原细胞簇，用细胞刮将其刮下来移入新瓶继续培养。
纯化方法一：待长满全瓶后，将旧的培养液吸弃，以25cm2培养瓶为例，每瓶加入2ml PBS或无血清基础培养基漂洗一次后，加入1ml胰酶消化细胞。胰酶对不同细胞消化速度不同，生殖细胞最先消化变圆，其次是支持细胞，最后是较大的间质细胞。0.5-2min后，待加入胰酶，生殖细胞开始变圆掉下来时，加入等量的含有FBS的培养液终止反应，将其转移至另一瓶，补足培养液继续培养。每次传代时采用上述方法，经过几次传代后，培养的细胞大部分为生殖细胞，少数支持细胞等其他体细胞，而精母细胞随着传代不断分化或者凋亡消失。
纯化方法二：待加入胰酶3-5min后细胞开始呈雾状之后加入等量含有FBS的细胞培养液，轻轻吹打分散细胞。最后，在培养瓶中加入10-15ml细胞培养液，按照5ml分成2-3瓶后在培养箱孵育。孵育40-50min后，待包括支持细胞在内的大部分体细胞贴壁后，将含有精原干细胞的细胞悬液移入新瓶继续培养，传代时经过多次上述操作，培养的细胞以精原干细胞为主，支持细胞等其他细胞占比较少。
1.3精原干细胞冷冻保存及复苏
用胰酶消化方法进行消化和分散，消化后加入含有10％的二甲基亚砜(DMSO)、20％胎牛血清的细胞培养液2ml，然后移入冻存管经程序降温后放入液氮保藏。待保存5个月后，从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化，5min内用培养液稀释至原体积的10倍以上，低速离心10min，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。观察细胞复苏情况。
实施例2.精原干细胞生长条件比较
2.1酶标仪细胞浓度标曲的制定
1)取对数生长期的精原干细胞，用0.25％胰酶消化计数后制备成细胞悬液，使用血球计数板计数为2×104/ml后，将2×104/ml、4×104/ml、6×104/ml细胞分别接种于96孔板中；
2)待细胞铺在孔板上不会轻易掉落后(大概2h)，每孔加入10μl的CCK-8检测试剂，在细胞培养箱内继续孵育4h后，用酶标仪测定在450nm的吸光值；
3)通过第一步骤得到的细胞浓度与第二步骤的吸光值对比，制作标准曲线。
2.2CCK-8法测定细胞浓度
1)取对数生长期的牙鲆精原干细胞，用0.25％胰酶消化计数后制备成细胞悬液，待传入96孔板；
2)在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，密度为2×104/ml，待细胞铺在孔板上不会轻易掉落后(大概2h)，完全吸除培养基；
3)进行不同浓度血清培养基、不同温度、不同培养基、不同组成成分处理(见图4)；
4)分别培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d时，每孔加入10μl CCK-8检测试剂，在细胞培养箱内继续孵育4h后，用酶标仪测定在450nm的吸光值。通过吸光值的大小，按照标准曲线转换为细胞数后，比对不同处理方法下的细胞增长率。
2.3不同组成成分细胞生长状态定性分析
设定三组不同组成分的培养基，不同培养基组成成分如下：
①FM：15％FBS，50μmol/Lβ-ME；
②FMBL:15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，50μmol/Lβ-ME；
③FMBLS：15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，50μmol/Lβ-ME，1％(v/v)鱼血清(牙鲆血清)。
按照44×104/瓶细胞量将稳定传代的120代精原干细胞分别加入到不同组成成分25cm2培养瓶中，长满进行正常传代，并定期观察细胞生长状态。
实施例3：精原干细胞鉴定
3.1HE染色和Vasa免疫荧光
将精原干细胞和对照组(脑细胞)移入含有爬片的六孔板中进行爬片培养，第二天去除培养基，用4％多聚甲醛固定20min后，用PBS清洗3次，其中两个爬片进行苏木素-伊红染色并显微观察，另两个爬片进行Vasa免疫荧光分析。对细胞破膜，加入制备的牙鲆Vasa兔多克隆抗体(制备方法如专利号：201810283741.3中所示)，4℃孵育过夜，第2天洗涤甩干切片加入羊抗兔荧光二抗(1:300，阳性绿光)，DAPI染液(谷歌生物，G1012，1：500)复染细胞核，最后脱水封片，细胞爬片扫描观察。
3.2精原干细胞分子鉴定分析
用精原干细胞细胞特异基因Egr3、Etv5、Itgb1以及生殖细胞特异基因dnd、dazl、vasa对精原干细胞系进行分子鉴定。
(1)SSC细胞RNA的提取与cDNA的合成
收集SSC细胞，利用Trizol试剂提取总RNA；琼脂糖凝胶电泳检测所提取总RNA质量，微量紫外分光光度计(Pultton P100+)测定RNA浓度。经检测合格后的RNA，使用
Figure BDA0003628495200000112
RT-for-PCR Kit试剂盒对总RNA进行逆转录扩增获得cDNA；
(2)细胞系的分子鉴定
根据牙鲆全基因组和GenBank数据库中登记的牙鲆Egr3、Etv5、Itgb1、dazl、dnd1、vasa、dmrt1基因序列，利用Primer Premier 6.0设计引物(表1)，以逆转录cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：上下游引物各1μl，模板cDNA 1μl，PCR Mix 10μl，加ddH2O至20μl。PCR反应程序为：95℃，预变性3min；94℃，30s，60℃退火，30s，72℃延伸30s，为40个循环；72℃延伸1min。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测。
表1.牙鲆相关基因序列扩增引物信息
Figure BDA0003628495200000121
3.3精原干细胞染色体核型分析
参考GB/T 18654.12-2002——养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析，进行适当调整，对牙鲆27代SSC细胞进行染色体核型分析。具体步骤如下：
(1)将传代1天的细胞放置4℃条件下刺激30min后，放回培养箱继续培养；
(2)第2天加入终浓度0.5μg/m L的秋水仙素，培养箱中孵育4h；
(3)收集细胞：洗掉培养液，用无血清的L-15漂洗一次，加入胰蛋白酶消化5-10min直至细胞全部消化下来，用含有15％胎牛血清的L-15终止胰蛋白酶消化反应，1500rpm离心5min；
(4)低渗：将收集有细胞离心，去除上清液，往细胞沉淀中加入5mL的0.075mol/LKCl溶液，轻轻吹散细胞，37℃低渗处理40min；
(5)固定：1500rpm离心5min后，去除上清，加入预冷的卡诺氏液，4℃下固定15min；
(6)重复步骤(5)两次；
(7)冷滴片法滴片，并用酒精灯小火烤一下，让染色体分散开；
(8)待载玻片干后，用5％吉姆萨染液染色25min，并用自来水冲洗无细胞的一面，晾干，观察。
3.4碱性磷酸酶显色试剂盒染色
利用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206)按照使用说明对培养的细胞进行检测。
3.5体外分化
停止换液传代半个月以上，观察细胞变化。待出现精细胞后，胰酶消化收集细胞，用含有10％FBS的L-15培养液清洗2次，最终定容至1.5ml，用吸管吸取1滴放入载玻片，加入少量海水刺激观察是否有活动的精子。
3.6精原干细胞移植
参考本课题组之前的授权专利(专利申请号201910366369.7、201910352333.3)中的方法制备性腺枯竭受体。受体性腺枯竭完成后，将从培育水温28℃逐渐降至适宜水温20℃时，将携带有PKH26荧光标记(红色荧光)细胞进行移植实验。精原干细胞移植46天后，采集嵌合体受体性腺样品，进行冰冻切片荧光观察。
实验结果：
1.精原干细胞系建立
1.1精原干细胞原代及纯化培养
选取精巢发育处于Ⅰ-Ⅲ期初，年龄为4月至1龄+尚未性成熟的鱼最好。
图1为精原干细胞原代与传代培养光学观察结果。
本实验采集1龄+雄鱼尚未性成熟的牙鲆精巢组织进行原代培养，性腺指数为0.2，性腺发育处于Ⅱ期末、Ⅲ期初，精巢组织主要以精原细胞为主(见图1中A)。组织培养3-5天后，有细胞迁出，且迁出的细胞以体细胞为主，可见精原干细胞紧密长在体细胞之上(图1中B)。待培养48天后，多层细胞叠加，放大至400倍镜下发现最上层长有大量直径约10μm且清晰可见的精原干细胞团，此细胞团向外迁移扩增(图1中C)，用细胞刮将此细胞团刮下移入新瓶继续培养，1天后精原干细胞团贴壁，并向外迁移增殖(图1中D)，待细胞长满一瓶后，用0.25％胰酶消化进行1:2-3传代培养。
纯化传代方法一：图2为胰酶差速消化纯化精原干细胞。根据胰酶消化性腺不同细胞的速率差异，加入胰酶0.5-2min后，精原干细胞簇首先变圆脱落(图2中A)，而以支持细胞为主的体细胞还未来及消化脱落(图2中B)时，将精原干细胞悬液移入新的培养瓶进行培养。几次纯化传代后，细胞主要以精原干细胞为主(图2中C)。
纯化传代方法二：根据不同细胞贴壁时长的差异纯化精原干细胞。待加入胰酶将所有细胞消化下来后(图3中A)，将细胞悬液移入新瓶放入培养箱孵育30-80min后，以支持细胞为主的细胞先行贴壁，部分精原干细胞尚未贴壁时，将细胞悬液转入新瓶继续培养(图3中B)。重复几次纯化传代后，培养9代的细胞以精原干细胞为主(图3中C)。
1.2精原干细胞系的冻存和复苏
秉承“慢冻速融”的原则，液氮冻存的精原干细胞细胞复苏成活率为70％以上，一星期内即可长满全瓶，并可以正常传代，目前冻存5个月复苏后的精原干细胞已经由18代传至46代，细胞冻存前后无明显的形态差异。
1.3精原干细胞生长特征分析
图4为不同培养基、不同FBS浓度、不同温度、不同组成成分培养基处理的示意图；图5为不同培养条件下精原干细胞生长特征；图6为不同组成成分培养基细胞培养状态。
不同培养基培养条件下，前3天精原干细胞呈快速生长趋势，处于对数期，而第3-4天生长进入一个平台期，随后几天细胞数量呈现出稍下降趋势(图5中A)。比较不同培养基细胞生长状况发现，除了M199在培养3天后细胞数量出现相对明显的下降趋势，而其他培养基相对表现良好，由此推测适合精原干细胞培养对不同培养基均有不同程度的适应，可选择的培养基范围大，易于其体外培养。
10％-20％浓度FBS培养条件下，前三天生长处于对数生长期，生长速度快，且精原干细胞比例较高(图5中B)，但FBS浓度高于20％时，精原干细胞比例降低。而FBS浓度为5％条件下，细胞生长缓慢。具体地，10％FBS条件下，细胞虽然较其他高浓度组增长慢，但在5天前一直处于生长状态；15％FBS生长速度与20％条件下细胞生长速度相差不大，25％、30％FBS浓度条件下细胞生长速度高于其他组别，但培养4天后与15％、20％FBS条件下差距逐渐缩小，但精原干细胞比例下降。综合分析，牙鲆精原干细胞适宜培养的FBS浓度为10％-20％。
不同温度条件下细胞生长特征分析发现：11℃细胞培养条件下，精原干细胞在起始的前3天出现负生长状况，之后缓慢出现正生长状况，但是生长速度远远落后于其他温度培养下的细胞(图5中C)。最适宜精原干细胞培养的温度为23℃，表现出比较快的生长速率，17℃其次。
不同组成成分培养基下细胞生长状态定量分析发现：随着时间的延长，三种不同组成成分培养基下细胞生长速度逐渐拉开，FBMLS培养基下细胞的生长最快，前4天为对数生长期，4-7天速度稍微下降但一直处于细胞量增加的状态，且从3天后与FM、FBML的生长速度距离开始拉大；FBML培养基中细胞生长速度低于FBMLS，显著高于FM；FM培养基下细胞数量从第3天后开始下降，说明每天细胞的死亡数量高于增殖的数量，细胞出现了衰老。综合说明，FBMLS培养基最适合精原干细胞培养。
不同组成成分培养基细胞生长定性分析发现：FMBLS培养基中细胞生长最快，且精原干细胞比例也明显高于FM和FMBL培养基，FM培养基中细胞生长最慢，且支持细胞为主的体细胞比例较高(图6中A)。培养17天后，FMBLS中精原干细胞状态显著与FM和FMBL培养基细胞状态不同，细胞生长旺盛，而后两者细胞不仅生长变慢，且精原干细胞出现了分化、凋亡现象，成纤维样的体细胞比例升高(图6中B)。待细胞培养29天后，FMBLS培养基与FM和FMBL培养基中细胞生长速度进一步拉大。FMBLS培养基细胞已经传6代，细胞以精原干细胞为主，而FM和FMBL培养基细胞仅传了3代，且随着精原干细胞的分化或者凋亡，其比例也显著下降(图6中C)。该实验结果与定量分析结果基本一致。
综合分析，牙鲆精原干细胞适宜3天进行传代，基础培养基包括L15、MEM、DMEM、DMEM/F12，适宜FBS浓度范围为：10％-20％；适宜温度范围为：17℃-23℃，最适温度23℃，适宜的成分主要为15％FBS，2ng/ml bFGF，2ng/ml LIF，50μmol/Lβ-ME，1％(v/v)鱼血清。
2.精原干细胞鉴定分析
参考Schulz等(2009)对A型精原细胞的形态学鉴定方法，A型精原细胞与原始生殖细胞形态学上十分相似，是精巢中最大的生殖细胞，呈圆形或者椭圆形，要显著大于周围的细胞；细胞直径约为10-12μm，细胞核直径约为6-10μm，有1-2个致密核仁，并且具有特征性的亚细胞结构-生殖质颗粒。而体外培养的精原干细胞与体内精原干细胞有十分相似的地方，细胞核直径较其他细胞核大许多，平均直径均大于6μm，且有1-2个致密核仁(图7中A、B)，且Vasa蛋白显著表达(图7中C)，碱性磷酸酶试剂盒染色呈现深蓝色(图7中D)。
为了鉴定细胞系，对7-8代、63-66代和110代以上的细胞开展了生殖干细胞或者生殖细胞特异基因egr3、etv5、itgb1、dazl、dnd、vasa以及支持细胞特异基因dmrt1基因表达分析。除了vasa在110代以上和egr3在7-8代无表达以外，其余均出现了不同程度的生殖干细胞或者生殖细胞特异基因的表达。支持细胞特异基因在不同代间有弱表达，与光学观察的结果相符(见图7中E)。精原干细胞系存在的少量的支持细胞主要起到滋养精原干细胞的作用。对27代精原干细胞进行染色体核型分析，统计104个分裂项细胞，发现染色体数目为48条的细胞数目占比高达54.8％(图7中F、G)，表现为正常的牙鲆二倍体核型，说明该细胞系并未出现分化。停止换液半个月以上后，出现分化的精细胞(图7中H)，用海水刺激后产生具有动能的精子(图7中I)，间接说明培养的细胞为精原干细胞。
将培养的精原干细胞移植入受体性腺中46天后，组织切片荧光观察发现携带大量PKH26的精原干细胞(图7中J)，在受体性腺中进行了嵌合和增殖。由于移植后，分化的生殖细胞和支持细胞不能在性腺中增殖，只有具有自我更新能力的生殖干细胞具有增殖能力，故进一步证明培养的细胞主要为精原干细胞。综上所述，从细胞形态、生殖细胞特异基因表达、碱性磷酸酶活性检测、染色体核型、体外分化实验和移植实验的结果分析，此细胞系为稳定传代，维持自我更新的精原干细胞系。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院北戴河中心实验站
<120> 一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法
<130> PA21037281
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtccaccac tgcctgccta t 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgggtgaat ttgttgcttg tcttt 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccccgtgact actgctttga tt 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacctcctct ggctctatga gttta 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caatgagcca ctattatgac tatcc 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagcacttgc gtccactttc g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcactgtttg tcggtgggat a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gttgaggatg ggtgaaggtt g 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caagaagatg ctggttgaag tgt 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgggtgaatg atgggcgaga t 21
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatgacggaa tgtgtgtggg tttag 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccataaacaa ccactggacg c 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcttctgcaa ctggagggac tg 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaggatgatg ccgagcgact 20

Claims (13)

1.一种培养液在牙鲆精原干细胞的原代培养中的应用，其特征在于，所述培养液由以下成分组成：10%-18%的FBS、0.8%-1.2%的牙鲆血清、40-60 μmol/L的β-ME、青霉素、链霉素、两性霉素B、生长因子、缓冲液和基础培养基；
所述青霉素的终浓度为80-120 U/mL，所述链霉素的终浓度为0.08-0.12 mg/mL，所述两性霉素B的终浓度为0.15-0.35 µg/mL，所述生长因子为人重组碱性成纤维细胞生长因子和白血病抑制因子，所述生长因子终浓度范围均为1.5-2.5 ng/mL；
所述培养液中的基础培养基选自L15、MEM、DMEM/F12。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述缓冲液选自HEPES、NaHCO3缓冲液。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述缓冲液的浓度为8-11 mmol/L。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述培养液中的基础培养基为DMEM/F12。
6.一种建立牙鲆精原干细胞系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（a）精原干细胞的原代培养：将牙鲆精巢组织小块接种于含权利要求1-5中任一项所述应用到的培养液的培养瓶中进行原代培养；
（b）精原干细胞的传代培养及纯化：当所述培养瓶中出现精原细胞簇时，将其刮入新瓶后加入所述培养液继续培养；待细胞长满全瓶后，吸弃旧培养液，每瓶加入PBS缓冲液或L15、MEM、DMEM、DMEM/F12中任一种基础培养基漂洗一次后，然后进行胰酶差速消化纯化精原干细胞或贴壁差速纯化精原干细胞；
（c）分离获得纯化的精原干细胞系并进行鉴定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胰酶差速消化纯化精原干细胞包括：每次传代时，加入胰酶消化0.5-2 min后，精原细胞变圆掉下时，加入等量所述培养液终止反应，将掉下来的精原细胞转移至另一瓶中加所述培养液继续培养。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述贴壁差速纯化精原干细胞包括：每次传代时，加入胰酶消化3-5 min且细胞开始呈雾状之后加入等量所述细胞培养液，轻轻吹打分散细胞，并在培养瓶中加入所述细胞培养液至原来培养体积的2-3倍，然后以1：2-3体积比分瓶，在培养箱孵育30-80 min后，将含有精原干细胞的细胞悬液移入新瓶继续培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在培养箱孵育40-50 min后，将所述含有精原干细胞的细胞悬液移入新瓶继续培养。
10.根据权利要求7~9任一项所述的方法，其特征在于，每20-30 cm2的细胞培养面积添加1 mL的酶液进行消化。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酶液为0.20%~0.30%的胰蛋白酶。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，选取精巢发育处于Ⅰ-Ⅲ期初，年龄为4月至1龄多尚未性成熟的雄鱼精巢组织进行原代培养。
13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述鉴定包括对获得的细胞进行HE染色分析、Vasa免疫荧光分析、精原干细胞分子鉴定分析、精原干细胞染色体核型分析、碱性磷酸酶染色分析、体外诱导分化结果分析以及精原干细胞移植后可塑性分析中的一种或多种。
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孙思宇 ; 魏彩霞 ; 李碧春 ; .精原干细胞体外培养及影响因素.中国畜牧杂志.2007,(第05期),全文. *
陈秋宇 ; 安立龙 ; .鱼类精原干细胞的研究进展.广东农业科学.2015,(第06期),全文. *

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