CN109402045A - 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法 - Google Patents

一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109402045A
CN109402045A CN201811197258.XA CN201811197258A CN109402045A CN 109402045 A CN109402045 A CN 109402045A CN 201811197258 A CN201811197258 A CN 201811197258A CN 109402045 A CN109402045 A CN 109402045A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
buffalo
culture
stem
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811197258.XA
Other languages
English (en)
Inventor
卢克焕
李婷婷
陆阳清
杨小淦
梁兴伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi University
Original Assignee
Guangxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi University filed Critical Guangxi University
Priority to CN201811197258.XA priority Critical patent/CN109402045A/zh
Publication of CN109402045A publication Critical patent/CN109402045A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，将原代水牛精原干细胞样细胞放入含有水牛支持细胞的培养皿上，培养60‑120h，完成体外培养；在体外培养得到的的水牛精原干细胞样细胞中加入PBS缓冲液，收集表层细胞，在该表层细胞中加入胰酶细胞消化液消化10‑60s，再加入IMDM培养液终止酶消化反应，收集表层细胞，将第二次收集的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，培养1.5‑4h，取上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；本发明的体外培养及传代方法操作简便，安全可靠，重复性高，对于哺乳类动物的不孕不育治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义。

Description

一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法
技术领域
本发明涉及基因工程、珍稀物种保存及细胞工程等领域，更具体的涉及一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法。
背景技术
精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是形成精子的前体细胞，在雄性哺乳动物体内，精原干细胞的增殖、分化为精子的发生提供着源源不断的动力，同时也保证了遗传物质在亲子代之间的有效传递。自1994年成功开展精原干细胞移植技术以来，精原干细胞的研究成为了一个热点，且近年来又成功建立了精原干细胞的体外培养方法。2011年，又在体外成功开展了小鼠的无血清无饲养层的培养体系，使小鼠的精原干细胞的体外培养迈上新台阶。
水牛作为华南地区的特有物种，以传统役用为主，其产奶、产肉等生产性能较低，已难以满足当前人们对畜牧产品的需求。因此，若能将水牛精原干细胞在体外分离纯化并成功进行的体外培养，再结合移植技术和相应的遗传育种技术，将能够得到大规模的优良水牛品系。目前尚未看到有关水牛精原干细胞的体外培养及传代方法。
由于确定某种细胞是否为起始干细胞十分困难，因此本申请人将具有水牛精原干细胞属性的细胞称为水牛精原干细胞样细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，所述的体外培养方法包括如下步骤：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，制成水牛睾丸单细胞悬液，再采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液，得到原代水牛精原干细胞样细胞；将原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每36-60h更换一次干细胞培养液，培养60-120h后，获得体外培养的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养。
优选地，所述水牛睾丸单细胞悬液的制备方法如下：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液。
优选地，采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液的步骤为：将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养9-12h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养25-60min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞。
所述的传代方法包括如下步骤：将在体外培养的水牛精原干细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为2-4的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入胰酶质量分数为0.01-0.1％的胰酶细胞消化液消化10-60s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养1.5-4h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养。
优选地，所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:5-20。
优选地，所述含有胎牛血清的IMDM培养液中，胎牛血清和IMDM培养液的体积比为0.5-1.5:8.5-9.5。
优选地，所述采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化的步骤为：采用胶原酶消化液和DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的水牛睾丸组织进行消化50-120min，离心，弃上清，得到沉淀，再使用胰酶细胞消化液和DNA酶对沉淀进行消化10-30min，即得；
所述胶原酶消化液中胶原酶的浓度为10-30mg/ml；所述DNA酶消化液中DNA酶的浓度为0.5-2mg/ml；所述胰酶细胞消化液中胰酶的质量分数为0.1-0.5％；
优选地，所述胶原酶消化液的添加量为0.5-2ml/g水牛睾丸组织；所述每次DNA酶消化液的添加量为100-800μl/g水牛睾丸组织；所述胰酶细胞消化液的添加量为1-3ml/g水牛睾丸组织。
优选地，所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipidmixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成。
优选地，所述的干细胞培养液中，KSR的体积分数为5-15％，Fetuin的体积分数为5-15％，NEAA的浓度为5-15μl/ml，Lipid mixture 1,Chemically Defined的浓度为5-15μl/ml，B-27的浓度为15-25μl/ml，GDNF的浓度为10-30ng/ml，GFRα1的浓度为50-150ng/ml，bFGF的浓度为5-15ng/ml，LIF的浓度为5-15U/ml，β-ME的浓度为0.05-0.15mmol/L。
所述干细胞培养液中各组分表示：
IMDM基础培养液：Iscove's Modified Dulbecco's Medium基础培养液；
Fetuin：胎球蛋白；
NEAA：非必需氨基酸；
Lipidmixture 1,Chemically：脂质混合物；
KSR：KnockOut Serum Replacement，血清替代物；
B-27：Supplement(50X)，serum free；
GDNF：Glialcellline-DerivedNeurotrophic Factor，胶质细胞源性神经营养因子；
GFRα1：GDNF familyreceptor alpha-1，胶质细胞源性神经营养因子家族受体α-1；
bFGF：basic fibroblast growth factor，碱性成纤维细胞生长因子-2；
LIF：leukemia inhibitory factor，白血病抑制因子；
β-ME：2-mercapto-Ethanol，β-琉基乙醇。
本发明得到的体外培养的水牛精原干细胞样细胞为串状增殖的水牛精原干细胞样细胞。
本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
1、本发明使用差异贴壁法对水牛精原干细胞样细胞进行纯化，大大减小水牛精原干细胞样的培养时间，维持细胞活性，差异贴壁前的DDX4阳性细胞比例为18.1％，差异贴壁后的DDX4阳性细胞比例为58.2％；差异贴壁前的PGP9.5阳性细胞比例为11.3％，差异贴壁后的PGP9.5阳性细胞比例为49.8％，大大提高水牛精原干细胞样细胞的纯度和数量，为提高后续体外培养及传代提供了很好的供体细胞，为获得大规模的优良水牛品系提供了实践基础，有利于后续生殖发育研究。
2、本发明可以在体外对水牛精原干细胞进行一定时间的培养，使其大量扩增，获得大量的呈串状增殖的细胞，节约细胞培养成本，由此培养所得的水牛精原干细胞样细胞可以用于基因编辑、体外自我更新增殖和分化的机理的研究。
3、本发明使用的干细胞培养液中，以KSR替代FBS(胎牛血清)，培养体系成分组成明确，进行水牛精原干细胞样细胞的体外培养时，使用含有FBS的干细胞培养液，精原干细胞样细胞随着培养的持续会逐渐消失，而使用KSR代替FBS的干细胞培养液，可以在短时间内培养即可获得大量的水牛精原干细胞样细胞，且本发明还提供所述体外培养的水牛精原干细胞样细胞的传代方法，使其能够在体外长期培养并增殖，能够建立长期维持稳定的精原干细胞系，并维持其精子发生的功能。
本发明的体外培养及传代方法操作简便，安全可靠，重复性高，成本低廉，能满足利用水牛精原干细胞进行一般体外操作的要求，对于哺乳类动物的不孕不育治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义，具有良好的推广应用前景。
附图说明
图1为水牛睾丸组织石蜡切片免疫荧光染色图；
图2为水牛睾丸细胞纯化前后，水牛睾丸细胞中水牛精原干细胞样细胞的荧光染色图；
图3为水牛睾丸细胞纯化前后，水牛睾丸细胞中水牛精原干细胞样细胞的比例对比；
图4为水牛睾丸单细胞悬液纯化过程中各部分细胞类型分子水平的验证图；
图5为分别含有胎牛血清和血清替代物的干细胞培养液进行水牛精原干细胞样细胞体外培养的增殖效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
实施例1
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，包括如下步骤：
(1)采用胶原酶浓度为10mg/ml的胶原酶消化液和DNA酶浓度为0.5mg/ml的DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的3月龄水牛睾丸组织进行消化50min，离心，弃上清，得到沉淀；胶原酶消化液的添加量为0.5ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为100μl/g水牛睾丸组织；
(2)在步骤(1)的沉淀中加入质量分数为0.1％的胰酶细胞消化液和DNA酶浓度为2mg/ml的DNA酶对沉淀进行消化10min，得到消化液；胰酶细胞消化液的添加量为1ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为800μl/g水牛睾丸组织；
(3)使用移液器将步骤(2)的消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液；
(4)将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养9h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养25min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞；
(5)将步骤(4)的原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每36h更换一次干细胞培养液，培养60h后，获得串状增殖的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养；
(6)将步骤(5)的水牛精原干细胞细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为2的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入质量分数为0.01％的胰酶细胞消化液消化60s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养1.5h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:5；所述胎牛血清和IMDM培养液的体积比为0.5:9.5。
所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成；其中KSR的体积分数为5％，Fetuin的体积分数为5％，NEAA的浓度为5μl/ml，Lipidmixture 1,Chemically Defined的浓度为5μl/ml，B-27的浓度为15μl/ml，GDNF的浓度为10ng/ml，GFRα1的浓度为50ng/ml，bFGF的浓
度为5ng/ml，LIF的浓度为5U/ml，β-ME的浓度为0.05mmol/L。
实施例2
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，包括如下步骤：
(1)采用胶原酶浓度为13mg/ml的胶原酶消化液和DNA酶浓度为0.7mg/ml的DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的4月龄水牛睾丸组织进行消化60min，离心，弃上清，得到沉淀；胶原酶消化液的添加量为0.8ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为200μl/g水牛睾丸组织；
(2)在步骤(1)的沉淀中加入质量分数为0.2％的胰酶细胞消化液和DNA酶浓度为1.7mg/ml的DNA酶对沉淀进行消化14min，得到消化液；胰酶细胞消化液的添加量为3ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为750μl/g水牛睾丸组织；
(3)使用移液器将步骤(2)的消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液；
(4)将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养9.3h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养30min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞；
(5)将步骤(4)的原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每40h更换一次干细胞培养液，培养70h后，获得串状增殖的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养；
(6)将步骤(5)的水牛精原干细胞细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为2.3的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入质量分数为0.02％的胰酶细胞消化液消化52s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养1.9h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:8；所述胎牛血清和IMDM培养液的体积比为1.5:8.5。
所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成；其中KSR的体积分数为15％，Fetuin的体积分数为15％，NEAA的浓度为6μl/ml，Lipid mixture 1,ChemicallyDefined的浓度为7μl/ml，B-27的浓度为18μl/ml，GDNF的浓度为14ng/ml，GFRα1的浓度为150ng/ml，bFGF的浓度为15ng/ml，LIF的浓度为7U/ml，β-ME的浓度为0.08mmol/L。
实施例3
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，包括如下步骤：
(1)采用胶原酶浓度为15mg/ml的胶原酶消化液和DNA酶浓度为0.9mg/ml的DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的5月龄水牛睾丸组织进行消化70min，离心，弃上清，得到沉淀；胶原酶消化液的添加量为0.9ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为300μl/g水牛睾丸组织；
(2)在步骤(1)的沉淀中加入质量分数为0.25％的胰酶细胞消化液和DNA酶浓度为1.5mg/ml的DNA酶对沉淀进行消化16min，得到消化液；胰酶细胞消化液的添加量为2.5ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为680μl/g水牛睾丸组织；
(3)使用移液器将步骤(2)的消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液；
(4)将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养9.6h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养37min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞；
(5)将步骤(4)的原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每43h更换一次干细胞培养液，培养80h后，获得串状增殖的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养；
(6)将步骤(5)的水牛精原干细胞细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为2.6的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入质量分数为0.03％的胰酶细胞消化液消化45s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养2.5h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:10；所述胎牛血清和IMDM培养液的体积比为1.5:9.5。
所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成；其中KSR的体积分数为12％，Fetuin的体积分数为9％，NEAA的浓度为15μl/ml，Lipid mixture 1,ChemicallyDefined的浓度为15μl/ml，B-27的浓度为20μl/ml，GDNF的浓度为18ng/ml，GFRα1的浓度为135ng/ml，bFGF的浓度为12ng/ml，LIF的浓度为9U/ml，β-ME的浓度为0.10mmol/L。
实施例4
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，包括如下步骤：
(1)采用胶原酶浓度为30mg/ml的胶原酶消化液和DNA酶浓度为1.2mg/ml的DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的6月龄水牛睾丸组织进行消化80min，离心，弃上清，得到沉淀；胶原酶消化液的添加量为1.2ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为450μl/g水牛睾丸组织；
(2)在步骤(1)的沉淀中加入质量分数为0.3％的胰酶细胞消化液和DNA酶浓度为1.1mg/ml的DNA酶对沉淀进行消化20min，得到消化液；胰酶细胞消化液的添加量为2.2ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为245μl/g水牛睾丸组织；
(3)使用移液器将步骤(2)的消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液；
(4)将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养10.5h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养45min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞；
(5)将步骤(4)的原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每48h更换一次干细胞培养液，培养92h后，获得串状增殖的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养；
(6)将步骤(5)的水牛精原干细胞细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为2.9的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入质量分数为0.05％的胰酶细胞消化液消化36s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养2.8h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:12；所述胎牛血清和IMDM培养液的体积比为0.5:8.5。
所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成；其中KSR的体积分数为10％，Fetuin的体积分数为12％，NEAA的浓度为11μl/ml，Lipid mixture 1,ChemicallyDefined的浓度为14μl/ml，B-27的浓度为22μl/ml，GDNF的浓度为21ng/ml，GFRα1的浓度为110ng/ml，bFGF的浓度为10ng/ml，LIF的浓度为11U/ml，β-ME的浓度为0.12mmol/L。
实施例5
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，包括如下步骤：
(1)采用胶原酶浓度为27mg/ml的胶原酶消化液和DNA酶浓度为1.4mg/ml的DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的7月龄水牛睾丸组织进行消化95min，离心，弃上清，得到沉淀；胶原酶消化液的添加量为1.5ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为660μl/g水牛睾丸组织；
(2)在步骤(1)的沉淀中加入质量分数为0.36％的胰酶细胞消化液和DNA酶浓度为1mg/ml的DNA酶对沉淀进行消化23min，得到消化液；胰酶细胞消化液的添加量为2.5ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为168μl/g水牛睾丸组织；
(3)使用移液器将步骤(2)的消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液；
(4)将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养11.2h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养50min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞；
(5)将步骤(4)的原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每52h更换一次干细胞培养液，培养100h后，获得串状增殖的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养；
(6)将步骤(5)的水牛精原干细胞细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为3.3的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入质量分数为0.07％的胰酶细胞消化液消化27s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养3.4h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:15；所述胎牛血清和IMDM培养液的体积比为0.7:9。
所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成；其中KSR的体积分数为9％，Fetuin的体积分数为8％，NEAA的浓度为10μl/ml，Lipid mixture 1,Chemically Defined的浓度为12μl/ml，B-27的浓度为24μl/ml，GDNF的浓度为25ng/ml，GFRα1的浓度为96ng/ml，bFGF的浓度为8ng/ml，LIF的浓度为12U/ml，β-ME的浓度为0.14mmol/L。
实施例6
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，包括如下步骤：
(1)采用胶原酶浓度为20mg/ml的胶原酶消化液和DNA酶浓度为1.1mg/ml的DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的6月龄水牛睾丸组织进行消化106min，离心，弃上清，得到沉淀；胶原酶消化液的添加量为1.8ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为720μl/g水牛睾丸组织；
(2)在步骤(1)的沉淀中加入质量分数为0.42％的胰酶细胞消化液和DNA酶浓度为0.9mg/ml的DNA酶对沉淀进行消化26min，得到消化液；胰酶细胞消化液的添加量为2.2ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为360μl/g水牛睾丸组织；
(3)使用移液器将步骤(2)的消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液；
(4)将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养11.7h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养55min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞；
(5)将步骤(4)的原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每56h更换一次干细胞培养液，培养112h后，获得串状增殖的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养；
(6)将步骤(5)的水牛精原干细胞细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为3.6的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入质量分数为0.08％的胰酶细胞消化液消化15s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养3.7h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:18；所述胎牛血清和IMDM培养液的体积比为1.2:9.2。
所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成；其中KSR的体积分数为8％，Fetuin的体积分数为13％，NEAA的浓度为6μl/ml，Lipid mixture 1,Chemically Defined的浓度为10μl/ml，B-27的浓度为25μl/ml，GDNF的浓度为27ng/ml，GFRα1的浓度为80ng/ml，bFGF的浓度为14ng/ml，LIF的浓度为15U/ml，β-ME的浓度为0.15mmol/L。
实施例7
本发明的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，包括如下步骤：
(1)采用胶原酶浓度为18mg/ml的胶原酶消化液和DNA酶浓度为1.9mg/ml的DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的5月龄水牛睾丸组织进行消化120min，离心，弃上清，得到沉淀；胶原酶消化液的添加量为2ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为480μl/g水牛睾丸组织；
(2)在步骤(1)的沉淀中加入质量分数为0.5％的胰酶细胞消化液和DNA酶浓度为1.7mg/ml的DNA酶对沉淀进行消化30min，得到消化液；胰酶细胞消化液的添加量为1.6ml/g水牛睾丸组织；DNA酶消化液的添加量为500μl/g水牛睾丸组织；
(3)使用移液器将步骤(2)的消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液；
(4)将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养12h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养60min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞；
(5)将步骤(4)的原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每60h更换一次干细胞培养液，培养120h后，获得串状增殖的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养；
(6)将步骤(5)的水牛精原干细胞细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为4的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入质量分数为0.1％的胰酶细胞消化液消化10s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养4h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养；所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:20；所述胎牛血清和IMDM培养液的体积比为0.8:8.9。
所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成；其中KSR的体积分数为13％，Fetuin的体积分数为10％，NEAA的浓度为9μl/ml，Lipid mixture 1,ChemicallyDefined的浓度为8μl/ml，B-27的浓度为19μl/ml，GDNF的浓度为30ng/ml，GFRα1的浓度为68ng/ml，bFGF的浓度为10ng/ml，LIF的浓度为12U/ml，β-ME的浓度为0.09mmol/L。
精原干细胞样细胞的检测鉴定
1、形态学观察
将消毒、清洗、去白膜后的水牛睾丸组织剪成块状，加入4％的多聚甲醛溶液中固定72h，脱水，用石蜡包埋。将石蜡组织切成5μm的切片，脱蜡、水化，将切片放入含有1％过氧化氢的甲醇中静置10min，使用含有0.2％Triton X-100的PBST洗5min，再将切片放入抗原修复液中保持100℃进行20min的抗原修复，然后自然冷却至室温。使用含2.5％马血清的封闭液封闭1h之后，分别加入适量稀释的DDX4，PGP9.5，THY1和OCT4抗体，在室温下静置孵育1h，用PBST洗3次切片，每次5min；再分别加入对应的二抗Goat anti-Rabbit IgG H&L(FITC)，Goat anti-RatIgG H&L(Alexa594)，Goat anti-Mouse IgG(H+L)和AlexaFluor 405(Liftechnologies，A-31553，1:500)。结果见图1，其中图1(A)是DDX4抗体染色，图1(B)是PGP9.5抗体染色，图1(C)是PLZF抗体染色，1(D)是THY1抗体染色，1(E)是OCT4抗体染色。
如图1所示，精原干细胞的典型特征是链状分布，圆球形、细胞核较大。图1(A)中，经DDX4抗体染色后细胞呈绿色；图1(B)中，经PGP9.5抗体染色后细胞呈绿色；图1(C)中，经PLZF抗体染色后细胞呈绿色，图1(D)中，经THY1抗体染色后细胞呈红色，图1(E)中，经OCT4抗体染色后细胞呈绿色；而图1(A)-图1(E)的切片经DAPI染色后细胞核为蓝色，结合2种染色结果可清晰看到切片中细胞的细胞核较大，且细胞呈链状分布，为水牛的精原干细胞样细胞。
2、水牛精原干细胞样细胞纯化前后对比
按照本发明实施例7所提供的水牛精原干细胞样细胞的纯化方法，对水牛睾丸单细胞悬液进行纯化，结果如图2所示，其中图2(A)为差异贴壁前的DDX4阳性细胞，图2(B)是差异贴壁后的DDX4阳性细胞，图2(C)是差异贴壁前的PGP9.5阳性细胞，图2(D)是差异贴壁后的PGP9.5阳性细胞，图3是差异贴壁前后DDX4阳性细胞和PGP9.5阳性细胞所占比例的汇总。
如图2(A)-图2(D)，以及图3所示，差异贴壁前的DDX4阳性细胞比例为18.1％，差异贴壁后的DDX4阳性细胞比例为58.2％；差异贴壁前的PGP9.5阳性细胞比例为11.3％，差异贴壁后的PGP9.5阳性细胞比例为49.8％，可见本发明的水牛精原干细胞样细胞纯化方法可大大提高水牛精原干细胞样细胞的纯度，为提高后续体外培养及传代提供了很好的供体细胞，有利于后续生殖发育研究。
3、水牛睾丸单细胞悬液纯化过程中各部分细胞类型分子水平验证
图4(A)为OCT4基因在三类细胞(多能性细胞G-cell、精原干细胞样细胞L-cell、生殖细胞C-cell)中的分布情况，图4(B)为NANOS2基因在三类细胞中的分布情况，图4(C)为DDX4基因在三类细胞中的分布情况，图4(D)为β1-integrin基因在三类细胞中的分布情况，其中图4(E)为GDNF基因在三类细胞中的分布情况。图4(A)-图4(C)使用的细胞为纯化后的水牛精原干细胞样细胞，图4(D)-图4(E)使用的细胞为纯化过程未收集纯化的细胞。
如图4(A)-图4(E)所述，使用不同类型细胞的标记对给部分细胞进行鉴定，图4(A)中OCT4是多能性细胞的标记，图4(B)中NANOS2是水牛精原干细胞样细胞的标记，图2(C)中DDX4的生殖细胞的标记。图4(A)-(E)的纵坐标为三类细胞中上述5个基因的表达量，图4(A)-图4(C)中每个图中的3个柱状图表明，L-cell中的细胞具有很强的多能性，同时又具有精原干细胞特性，还具有生殖细胞特性，说明纯化得到的细胞即为水牛精原干细胞样细胞。图4(D)-图4(E)中，β1-integrin和GDNF两个基因是支持细胞的标记，即为体细胞，而β1-integrin和GDNF在C-cell和G-cell中的表达量比较高，说明纯化时大部分的体细胞都已经去除。
4、水牛精原干细胞样细胞体外培养效果对比
采用本发明实施例6所提供的水牛精原干细胞样细胞的并按照实施例6的体外培养方法，结果如图5所示，其中图5(A)-图5(C)中，将干细胞培养液中的KSR替换为FBS，图5(A)为P1代水牛精原干细胞样细胞培养1天的增殖情况；图5(B)为P2代水牛精原干细胞样细胞培养2天的增殖情况；图5(C)为P2代水牛精原干细胞样细胞培养4天的增殖情况；图5(D)为P1代水牛精原干细胞样细胞培养1天的增殖情况；图5(E)为P2代水牛精原干细胞样细胞培养2天的增殖情况；图5(F)为P2代水牛精原干细胞样细胞培养4天的增殖情况。
如图5(A)-图5(F)所示，进行水牛精原干细胞样细胞的体外培养时，使用含有FBS的干细胞培养液，精原干细胞样细胞随着培养的持续会逐渐消失。而使用KSR代替FBS的干细胞培养液，水牛精原干细胞样细胞的增殖较快，可以在短时间内培养即可获得大量的水牛精原干细胞样细胞，节约细胞培养成本，从而降低研究成本。且本发明还提供所述体外培养的水牛精原干细胞样细胞的传代方法，使其能够在体外长期培养并增殖，能够建立长期维持稳定的精原干细胞系，并维持其精子发生的功能。同时，本发明的体外培养及传代方法操作简便，安全可靠，成本低廉，对于哺乳类动物的不孕不育治疗以及濒临灭绝物种资源的保护具有重要意义，具有良好的推广应用前景。

Claims (10)

1.一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述的体外培养方法包括如下步骤：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，制成水牛睾丸单细胞悬液，再采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液，得到原代水牛精原干细胞样细胞；将原代水牛精原干细胞样细胞移至含有经丝裂霉素C处理过的水牛支持细胞的培养皿上，并加入干细胞培养液进行培养，每36-60h更换一次干细胞培养液，培养60-120h后，获得体外培养的水牛精原干细胞样细胞，完成体外培养。
2.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述水牛睾丸单细胞悬液的制备方法如下：采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化后，使用移液器将消化液中团聚在一起的细胞吹成单个细胞，收集消化液中的单个细胞并离心处理，弃上清，得到沉淀物，使用干细胞培养液对沉淀物进行重悬，得到悬浮液；再依次采用粒径为70μm和40μm的细胞网对该悬浮液进行过滤，得到水牛睾丸单细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，采用差异贴壁法处理水牛睾丸单细胞悬液的步骤为：将水牛睾丸单细胞悬液接种于铺有明胶的培养皿中，并加入干细胞培养液，将培养皿放在37℃的培养箱中培养9-12h，收集上清细胞，将上清细胞转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中，将此培养皿放在37℃培养箱中培养25-60min，然后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的原代水牛精原干细胞样细胞。
4.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法其特征在于，所述的传代方法包括如下步骤：将在体外培养的水牛精原干细胞样细胞放入培养皿中，在培养皿中加入pH值为2-4的PBS缓冲液，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将该表层细胞移至新的培养皿，并加入胰酶质量分数为0.01-0.1％的胰酶细胞消化液消化10-60s，然后加入含有胎牛血清的IMDM培养液终止酶消化反应，使用移液器轻轻吹打并收集表层细胞，将第二次收集得到的表层细胞移至铺有明胶的培养皿中，加入干细胞培养液进行培养1.5-4h，取上清细胞，将上清细胞转移至含有水牛支持细胞的饲养层，完成传代培养。
5.根据权利要求4所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法其特征在于，所述水牛精原干细胞样细胞和胰酶细胞消化液的固液比为1:5-20。
6.根据权利要求4所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法其特征在于，所述含有胎牛血清的IMDM培养液中，胎牛血清和IMDM培养液的体积比为0.5-1.5:8.5-9.5。
7.根据权利要求1所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述采用两步酶消化法对3-7月龄水牛的睾丸组织进行消化的步骤为：采用胶原酶消化液和DNA酶消化液对去除白膜、附睾，剪碎的水牛睾丸组织进行消化50-120min，离心，弃上清，得到沉淀，再使用胰酶细胞消化液和DNA酶对沉淀进行消化10-30min，即得；
所述胶原酶消化液中胶原酶的浓度为10-30mg/ml；所述DNA酶消化液中DNA酶的浓度为0.5-2mg/ml；所述胰酶细胞消化液中胰酶的质量分数为0.1-0.5％。
8.根据权利要求7所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述胶原酶消化液的添加量为0.5-2ml/g水牛睾丸组织；所述每次DNA酶消化液的添加量为100-800μl/g水牛睾丸组织；所述胰酶细胞消化液的添加量为1-3ml/g水牛睾丸组织。
9.根据权利要求1-4任一项所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述的干细胞培养液由IMDM基础培养液、KSR、Fetuin、NEAA、Lipid mixture 1,Chemically Defined、B-27、GDNF、GFRα1、bFGF、LIF和β-ME组成。
10.根据权利要求9所述的水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法，其特征在于，所述的干细胞培养液中，KSR的体积分数为5-15％，Fetuin的体积分数为5-15％，NEAA的浓度为5-15μl/ml，Lipid mixture 1,Chemically Defined的浓度为5-15μl/ml，B-27的浓度为15-25μl/ml，GDNF的浓度为10-30ng/ml，GFRα1的浓度为50-150ng/ml，bFGF的浓度为5-15ng/ml，LIF的浓度为5-15U/ml，β-ME的浓度为0.05-0.15mmol/L。
CN201811197258.XA 2018-10-15 2018-10-15 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法 Pending CN109402045A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811197258.XA CN109402045A (zh) 2018-10-15 2018-10-15 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811197258.XA CN109402045A (zh) 2018-10-15 2018-10-15 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109402045A true CN109402045A (zh) 2019-03-01

Family

ID=65467950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811197258.XA Pending CN109402045A (zh) 2018-10-15 2018-10-15 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109402045A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113186221A (zh) * 2021-05-24 2021-07-30 广西大学 水牛源lif的制备及其在水牛精原干细胞体外培养的应用
CN114717184A (zh) * 2022-05-05 2022-07-08 中国水产科学研究院北戴河中心实验站 一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070192881A1 (en) * 2004-04-12 2007-08-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Culture conditions and growth factors affecting fate determination, self-renewal and expansion of rat spermatogonial stem cells
CN102643779A (zh) * 2012-04-23 2012-08-22 西北农林科技大学 一种用于动物精原干细胞体外增殖的培养体系和使用方法
CN103805560A (zh) * 2014-01-20 2014-05-21 广西大学 一种猪精原干细胞的分离方法
CN104004708A (zh) * 2014-06-16 2014-08-27 内蒙古大学 一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法
US20150175957A1 (en) * 2012-02-14 2015-06-25 Washington State University Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells
CN106754724A (zh) * 2016-12-09 2017-05-31 西北农林科技大学 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070192881A1 (en) * 2004-04-12 2007-08-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Culture conditions and growth factors affecting fate determination, self-renewal and expansion of rat spermatogonial stem cells
US20150175957A1 (en) * 2012-02-14 2015-06-25 Washington State University Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells
CN102643779A (zh) * 2012-04-23 2012-08-22 西北农林科技大学 一种用于动物精原干细胞体外增殖的培养体系和使用方法
CN103805560A (zh) * 2014-01-20 2014-05-21 广西大学 一种猪精原干细胞的分离方法
CN104004708A (zh) * 2014-06-16 2014-08-27 内蒙古大学 一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法
CN106754724A (zh) * 2016-12-09 2017-05-31 西北农林科技大学 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于雪: "水牛精原干细胞的体外培养与鉴定及转基因干细胞的异种移植", 《中国博士学位论文全文数据库》 *
李婷婷等: "水牛精原干细胞研究进展", 《基因组学与应用生物学》 *
陈施蓓: "水牛类精原干细胞体外分离培养的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113186221A (zh) * 2021-05-24 2021-07-30 广西大学 水牛源lif的制备及其在水牛精原干细胞体外培养的应用
CN114717184A (zh) * 2022-05-05 2022-07-08 中国水产科学研究院北戴河中心实验站 一种牙鲆精原干细胞培养液及建立牙鲆精原干细胞系的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101818127B (zh) 一种小鼠精原干细胞分离培养方法
CN106801032B (zh) 人羊膜上皮干细胞库的构建方法
CN108795850B (zh) 一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法
CN112048470A (zh) 一种利用人诱导多能干细胞制备临床级别间充质干细胞制剂的方法
CN105543164A (zh) 一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法
CN112553148A (zh) 一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用
CN114292816A (zh) 肺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法
US20130059378A1 (en) Human epidermis-derived mesenchymal stem cell-like pluripotent cells and preparation method thereof
CN109402045A (zh) 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法
CN104726401A (zh) 一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法
CN106754657A (zh) 一种猴胚胎干细胞的无血清培养基
CN104894054B (zh) 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc‑145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用
CN106834214B (zh) 一种诱导多能干细胞形成角质形成细胞的诱导培养基及诱导方法
CN110592001B (zh) 一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系
CN113088482A (zh) 一种犊牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法
CN100540659C (zh) 一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基
Zhou et al. Establishment and identification of a Debao pony ear marginal tissue fibroblast cell line
CN107858322B (zh) 一种海马原代细胞培养体系的建立方法
CN107460166A (zh) 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法
CN104830752A (zh) 一种猪胎儿成纤维细胞的单细胞培养方法
CN105624115B (zh) 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基及其诱导方法
CN104195100A (zh) 一种乳腺上皮细胞的体外培养方法
CN109385395A (zh) 一种用于体外培养的水牛精原干细胞样细胞的纯化方法
CN106754660A (zh) 一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法
CN102268404B (zh) 猪卵丘干细胞的分离方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190301