CN106754724A - 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法 - Google Patents
一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106754724A CN106754724A CN201611128683.4A CN201611128683A CN106754724A CN 106754724 A CN106754724 A CN 106754724A CN 201611128683 A CN201611128683 A CN 201611128683A CN 106754724 A CN106754724 A CN 106754724A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- stem spermatogonium
- spermatogonium
- stem
- immortalization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法,是以牛精原干细胞作为宿主细胞,通过将pLOX‑Ttag‑iresTK慢病毒表达载体转染牛精原干细胞,该细胞系在体外传代35代以上仍有较好的活力,保持分裂增殖,不发生衰老和凋亡,是一种永生化的细胞系。将其经过诱导后能够具有三胚层分化的潜能及其向精子细胞分化潜能。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域,特别涉及一种永生化的牛精原干细胞系及其构建的方法。
背景技术
雄性生殖干细胞,又称作精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs),是位于睾丸曲细精管基膜上能通过自我更新维持自身群体数量的稳定,同时在体内定向分化并最终生成精子的一类成体干细胞。同时,它也能在特定条件下诱导去分化成为多能干细胞,这样就能绕过胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)治疗的理论与技术难题。与其他成体干细胞不同的是,它是雄性成年哺乳动物体内唯一能通过自然生殖过程将遗传信息传递给下一代的成体干细胞,因此,在生殖医学、干细胞生物学、物种保护等领域都将作其为重点来研究。
西北农林科技大学陕西省干细胞研究中心在精原干细胞的研究上已开展了一定的基础工作。(Wu,Song et al.2013)(Zhu,Ma et al.2014)等先后在奶山羊精原干细胞的分离纯化,培养基的筛选,以及细胞生物学,分子生物学鉴定方面做了大量的工作。并且发现了奶山羊雄性生殖干细胞表达多能性与生殖细胞的标记,具有增殖能力和向三胚层细胞分化的潜能,同时也发掘出在雄性生殖干细胞自我更新及分化机制研究中起重要作用的多个关键因子。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种永生化的牛精原干细胞系及其构建的方法,永生化后的牛精原干细胞没有丢失精原干细胞的表型特征和生物学特性,且能够向三胚层以及精子样方向分化。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种永生化的牛精原干细胞系,是以牛精原干细胞作为宿主细胞,通过 用pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体表达的慢病毒转导,转导后的牛精原干细胞表达SV40大T抗原,成为具有多向分化潜能的转化体。
其细胞为成纤维样,呈多角形和短梭状,有两个或两个以上的核仁,细胞间存在接触抑制。
牛精原干细胞系在传代培养35代以后SV40大T抗原还能够被表达。
一种永生化的牛精原干细胞系的构建方法,包括以下步骤:
1)将预处理的睾丸组织剪碎,加入10倍体积的CDD溶液中消化处理;然后等体积中和液中和,室温离心后弃上清,用DMEM+10%FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巯基乙醇的溶液重新悬浮细胞后接种于培养皿上,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,再采用免疫磁珠抗体CD90分选获取纯化的牛精原干细胞;
所述的CDD溶液包含2mg/m L胶原酶、20μg/m L DNase和2mg/m L Dispase;
所述的中和液为DMEM/F12+10%胎牛血清;
2)验证好的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表达载体和慢病毒包装组成成分质粒pVSVG、pAX共同转染293T细胞包装获得假慢病毒感染颗粒,用来转导细胞,并进一步检测。操作如下:
⑴多聚赖氨酸溶液包被处理细胞培养皿,吸除多聚赖氨酸晾干培养皿后
接种107个293T细胞。
⑵待次日细胞生长至70-90%铺满培养皿时,换取新鲜温热培养液。
⑶按照转染试剂转染体系,将目的载体、慢病毒辅助质粒共同转染进293T细胞。取质粒:pLOX-Ttag-iresTKT 14μg;pVSVG 7μg;pAX 7μg,依次将转染组分别加入一个无菌洁净的玻璃离心管,混匀室温静置15min后逐滴加到293T细胞培养液中,轻轻摇匀。在换取新鲜培养液48h 收取包含病毒颗粒的细胞上清液,0.45μm滤器过滤去除细胞碎片等杂质后,将此病毒液-80℃冻存或者用PG8000浓缩,以备后继试验。
牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿,上将牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿上,12h后将含有10μg/ml polybrene的病毒液溶液加入含有低血清培养皿中。24h后换上新鲜的培养液连续培养、传代3个月以上,直到细胞永生化,永生化后使用含血清的完全培养基。
所述的低血清培养基组成成分为:DMEM/F12+10%KSR+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/mL青霉素,100mg/mL链霉素.20ng/mLGDNF,20ng/mL bFGF,10ng/mL LIF。永生化的细胞使用的含有血清的完全培养基为DMEM/F12加入10%FBS、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素。
所述的睾丸组织的处理为:
将3月龄以上的睾丸组织经高浓度双抗(300U/mL青霉素,300mg/mL链霉素)清洗后转移到细胞培养室,经75%医用酒精浸泡1-2min;剪开白膜及睾丸组织,取出部分组织浸泡于PBS中,反复清洗3-4次后用剪刀剪碎。
所述精原干细胞的纯化是原代差速贴壁法分离收集未贴壁的精原细胞,将收集的未贴壁精原细胞按如下步骤进行细胞分选:
1)未贴壁精原细胞1200rpm室温离心5min,弃去培养液;
2)离心所得细胞用PBS重悬后计数,按1×107/管分装,1200rpm室温离心5min,弃去PBS;
3)离心沉淀所得细胞用20μL的CD90磁珠抗体加80μL的MACS Buffe重悬,4度孵育15min;
4)孵育细胞1200rpm室温离心5min,收集上层一抗稀释液;
5)细胞沉淀再用500μL MACS Buffer重悬成细胞悬液,用500μL MACS Buffer润洗MACS分选柱,待润洗的MACS Buffer将要流完时,及时缓慢滴加细胞悬液;
6)收集流过分选柱的细胞悬液,获得CD90阴性精原细胞;
待细胞悬液完全流过MACS分选柱后,再用500μL MACS Buffer缓慢润洗分选柱,然后取下分选柱,再向分选柱中滴加500μL MACS Buffer,收集用助推活塞推出的MACSBuffer,其中含有CD90阳性精原细胞,收集分选的牛精原干细胞接种到铺了Laminin的培养皿中培养,其培养基组成成分为:DMEM/F12+10%KSR+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/ml青霉素,100mg/mL链霉素.20ng/mL GDNF,20ng/mLbFGF,10ng/mLLIF。
通过pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体转导致牛精原干细胞得到连续传代3个月以上且能够表达SV40大T抗原。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
1)本发明通过将pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体转染牛精原干细胞,使得重组后的牛精原干细胞表达SV40大T抗原,以解决分离出的牛精原干细胞随着传代次数的提高活力差和难以存活的问题,得到具有多向分化潜能的永生化的牛精原干细胞系。
2)本发明筛选获得的永生化的牛精原干细胞系,其生长状况良好,细胞的生命力较之以前的大大提高,便于规模化的应用;在体外传代35代以上仍有较好的活力,保持分裂增殖,不发生凋亡,是一种永生化的细胞系,目前已能够传至45代。
3)本发明筛选获得的永生化的牛精原干细胞系,其营养要求较低,原始分离得到的牛精原干细胞的培养需要10%的胎牛血清、GDNF、bFGF等各种生长因子,而现在只要求10%的胎牛血清,降低了培养的成本。
4)将筛选获得的永生化的牛精原干细胞系,经过诱导后能够分化形成三胚层细胞,及其精子样细胞,将其移植到生精缺陷的受体小鼠睾丸中内,能在受体老鼠的睾丸中增殖形成克隆,并迁移到曲细精管基底膜。
附图说明
图1为牛精原干细胞形成的克隆及其相关标记基因和蛋白表达结果图;
图2为永生化载体鉴定及永生化后细胞生长曲线结果图;
图3为永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)系相关标记基因和蛋白表达结果图;
图4为永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)系体外诱导分化能力检测结果图;
图5为永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)系向精子细胞分化功能的检测结果图;
图6为移植检测生殖干细胞功能检测结果图;
图7为荧光显微镜检测结果图。
具体实施方式
本发明提供一种永生化的牛精原干细胞系,是以牛精原干细胞作为宿主细胞,通过将pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体转染牛精原干细胞,该细胞系在体外传代35代以上仍有较好的活力,保持分裂增殖,是一种永生化的细胞系。以下通过对永生化的牛精原干细胞系的构建、细胞形态特征、标志物的基因及免疫鉴定、诱导分化,以及移植到生精缺陷的受体小鼠睾丸中来做详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
1.牛精原干细胞(bSSCs)的分离及相关标记基因的鉴定
1.1将取到的3月龄以上的睾丸组织经高浓度双抗(300U/mL青霉素,300mg/mL链霉素)清洗后转移到细胞培养室;经75%医用酒精短暂浸泡1-2min。剪开白膜及睾丸组织,取出部分组织浸泡于PBS中,反复清洗3-4次后用剪刀剪碎;加入10倍体积的CDD(2mg/m L胶原酶+20μg/m L DNase+ 2mg/m L Dispase)37℃消化30min;然后加入等体积的DMEM/F12+10%胎牛血清(FBS)中和,2000r/min室温离心;5min后弃上清,用DMEM+10%FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巯基乙醇的溶液重新悬浮细胞后接种于90mm培养皿上,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,得到含有精原干细胞的细胞群;然后采用免疫磁珠抗体CD90分选纯化精原干细胞;
1.2 CD90磁珠抗体分选富集精原干细胞
原代差速贴壁法分离收集未贴壁的精原细胞(含有少量的精母细胞和精子细胞),将收集的未贴壁精原细胞按如下步骤进行细胞分选:
1)未贴壁精原细胞1200rpm室温离心5min,弃去培养液;
2)离心细胞用PBS重悬后计数,按1×107/管分装,1200rpm室温离心5min,弃去PBS;
3)离心沉淀细胞用20μL的CD90磁珠抗体加80μL的MACS Buffe重悬,4度孵育15min;
4)孵育细胞1200rpm室温离心5min,收集上层一抗稀释液;
5)细胞沉淀再用500μL MACS Buffer重悬成细胞悬液,用500μL MACS Buffer润洗MACS分选柱,待润洗的MACS Buffer将要流完时,及时缓慢滴加细胞悬液;
6)收集流过分选柱的细胞悬液,即为CD90阴性精原细胞;
待细胞悬液完全流过分选柱后,再用500μL MACS Buffer缓慢润洗分选柱,然后从分选磁架上取下分选柱,再向分选柱中滴加500μL MACS Buffer,收集用助推活塞推出的MACS Buffer,其中即含有CD90阳性精原细胞,收集分选的牛精原干细胞接种到铺了Laminin的培养皿中培养,其中(图1B)为培养两周形成的克隆。
1.2细胞免疫荧光检测
将牛精原干细胞用4%多聚甲醛固定后,细胞免疫荧光染色进行牛精原 干细胞特征性标志和胚胎干细胞标志的鉴定,同时以BSA为阴性对照进行染色。具体结果如图1所示。
牛精原干细胞(bSSCs)的生殖标记基因(VASA)、干性标记基因(PLZF、GFRα-1、ETV-5、LIN28、PGP 9.5)、胚胎干细胞标记基因(OCT/4、SOX-2、NANOG、KLF4)分别如图1A所示,结果表明:VASA、PLZF、GFRα-1、ETV-5、LIN28、PGP 9.5、OCT/4、SOX-2、NANOG、KLF-4均为阳性。
1.3 RT-PCR检测
以PCR扩增的第一链cDNA为模板,各个标志物相对应的引物(如表1所示)进行PCR扩增,然后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
表1牛精原干细胞和胚胎干细胞相关标志物及其相应的PCR扩增引物
标志物 | 上游引物 | 下游引物 | 扩增 | T |
PLZF | 5'-CACCGCAACAGCCAGCACTAT-3' | 5'-CGGCATACAGCAGGTCATCCAA-3' | 127bp | 60 |
β-actin | 5'-CGGCAATGAGCGGTTCC-3' | 5'-CGTGTTGGCGTAGAGGTCCT-3' | 142bp | 60 |
SOX-2 | 5'-CCCGTGGTTACCTCTTCTTCC-3' | 5'-CGCTCTGGTAGTGCTGGGAC-3' | 145bp | 60 |
Nanog | 5'-CCCGAAGCATCCAACTCTAGG-3' | 5'-GTCCGTGTCGAGGGTGTCA-3' | 93bp | 60 |
LIN28 | 5'-CTGGAATCTATCCGAGTCACCG-3' | 5'GATGCTCTGGCAGAAATGGC-3' | 192bp | 60 |
KLF-4 | 5'-TGCGGCAAAACCTACACG-3' | 5'-CCCACAACCATCCCAGTCA-3' | 96bp | 60 |
OCT-4 | 5'-AAGGGCAAACGATCAAGCA-3' | 5'-AATGGGACCGAAGAGTACAGAGT-3” | 167bp | 60 |
牛精原干细胞(bSSCs)标记基因的表达情况如图1C所示,各个标志物基因均被表达,说明其具有精原干细胞的特征。
2、pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表达载体的鉴定
pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表达载体购买于Addgene公司,pLOX-Ttag-iresTKT质粒全长12290bp(图2A),用NotI酶单酶切,用NotI酶和NotI和BamHI酶双酶切后进行电泳,及PCR鉴定所得片段长度和预期一致(图2B),电泳结果表明质粒完好,可以使用。
3、永生化的牛精原干细胞(bSSCs)系的构建
3.1牛精原干细胞(bSSCs)的永生化
1)慢病毒的包装及病毒感染。
验证好的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表达载体和慢病毒包装组成成分质粒pVSVG、pAX共同转染293T细胞包装获得假慢病毒感染颗粒,用来转导细胞,并进一步检测。操作如下:
1)多聚赖氨酸溶液包被处理细胞培养皿,吸除多聚赖氨酸晾干培养皿后接种107个293T细胞。
2)待次日细胞生长至70-90%铺满培养皿时,换取新鲜温热培养液。
3)按照转染试剂转染体系,将目的载体、慢病毒辅助质粒共同转染进293T细胞。取质粒:pLOX-Ttag-iresTKT 14μg;pVSVG 7μg;pAX 7μg,依次将转染组分别加入一个无菌洁净的玻璃离心管,混匀室温静置15min后逐滴加到293T细胞培养液中,轻轻摇匀。在换取新鲜培养液后48h收取包含病毒颗粒的细胞上清液,0.45μm滤器过滤去除细胞碎片等杂质后,将此病毒液-80℃冻存或者用PG8000浓缩,以备后继试验。
牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿,上将牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿上,12h后将含有10μg/ml polybrene的病毒液溶液加入含有低血清培养皿中。24h后换上新鲜的培养液连续培养、传代3个月以上,直到细胞永生化,永生化后使用含血清的完全培养基。
所述的低血清培养基组成成分为:DMEM/F12+10%KSR+0.1mMβ-巯基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素.20ng/ml GDNF,20ng/ml bFGF,10ng/ml LIF。永生化的细胞使用的含有血清的完全培养基为DMEM/F12加入10%FBS、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100mg/mL青霉素/链霉素。
2)细胞群体倍增时间分析(Population doubling time,PDT)
牛精原干细胞连续传代,统计起始细胞数和培养48h后的细胞数。PDT的计算参考PDT=[log2/(log Nt0-log N0)]×t,Nt=培养后的细胞数,N0=接种细胞数,t为培养时间。对细胞的群体倍增时间分析发现永生化的牛精原干细胞的群体倍增时间由50.9h缩短到了27.24h(图2C、D)说明其增殖能力显著地增强。
3.2永生化牛精原干细胞系(bSSCs-Ttag)相关标记基因的鉴定
3.2.1 western blotting鉴定牛精原干细胞相关基因的表达
将第6代、第8代、第10代的牛精原干细胞bSSCs-Ttag用蛋白提取试剂盒提取细胞的总蛋白做Western blotting。结果说明永生化后的牛精原干细胞bSSCs-Ttag能够成功的表达永生化基因(SV40)及精原干细胞标记基因(PGP9.5、OCT4)(如图3A所示)。
3.2.2 RT-PCR鉴定相关基因的表达
牛精原干细胞(bSSCs)标记基因的表达情况如图3B所示,永生化基因(SV40)、干性标记基因(PLZF、LIN28、)、胚胎干细胞标记基因(OCT4、NANOG、KLF4)、增殖标记(PCNA)、分化标记基因(C-KIT)均被表达,说明永生化基因SV40成功的整合到细胞的基因组上,且建立的永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)没有丢失其生物学特性。
3.2.3细胞免疫荧光鉴定相关基因的表达
将牛精原干细胞用4%多聚甲醛固定后,细胞免疫荧光染色进行永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)相关标志基因的鉴定,同时以BSA为阴性对照进行染色。结果显示(如图3B)永生化牛精原干细胞(bSSCs-Tag)的生殖标记基因(VASA)、干性标记基因(PLZF、ETV-5、CD49f、PGP 9.5)均能够表达。
3.2.4永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)的体外分化能力检测
将第13代的永生化的牛精原干细胞解离成单细胞悬液,用DMEMF/12+10%FBS+2mmol/L Glu+1%NEAA+100U/ml青霉素+100mg/ml链霉素的溶液按照800–1000细胞/25μL悬浮培养以形成EB(如图4A)。进一步分化时将EB接种在0.1%明胶处理的培养板上,用DMEM/F12+10%FBS+0.1mmol/Lβ-ME+2mmol/LGlu+1mmol/L丙酮酸钠+0.1mmol/L NEAA培养3–14天以探究其自发分化能力。细胞分化后免疫荧光染色检测NESTIN(外胚层)、ASM(中、内胚层)、PDX1(内胚层)均有出现部分阳性细胞,同时PCR检测结果显示NESTIN(外胚层)、ASM(中、内胚层)、PDX1(内胚层)均能够表达(如图4B、C所示)。
3.2.5永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)向精子细胞分化功能的检测
永生化牛精原干细胞形成EB后用RA诱导,诱导7d后出现精子样细胞(图5A)。细胞免疫荧光染色检测减数分裂各期细胞的表达情况,结果证实减数分裂前标记(STRA8)、减数分裂标记(DAZL)及减数分裂后标记(EXCO-2、ACR)都有表达(图5B),同时q-PCR结果显示经过RA诱导后的细胞其减数分裂前标记(STRA8)、减数分裂标记(SCP-3、DAZL)及减数分裂后标记(EXCO-2)均上调(图5C),这些结果证实了永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)具有分化为精子细胞的能力。
3.2.6永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)移植检测生殖干细胞功能
收集培养到第15代转导了GFP的永生化的牛精原干细胞(bSSCs-Ttag),用DMEM/F12+10%FBS的培养基重悬细胞,按照105细胞/睾丸的量将细胞注入生精缺陷的受体小鼠睾丸曲细精管中。2个月后收集移植后的小鼠睾丸,将曲细精管和固定、切片后的样品在荧光显微镜下镜检,照相记录结果。两个月后通过受体小鼠睾丸的切片检测,发现2个月后依然能够检测到永生化牛精原干细胞(bSSCs-Ttag)存在(如图6A,B、图7A,B所示)。证明永生化牛精原干细胞具有雄性生殖干细胞的功能。
雄性生殖干细胞在机体内担负传递遗传信息的重担,在生殖医学、干细胞生物学、畜牧生产等领域具有重要的理论价值和广阔的应用前景。在睾丸曲细精管内,雄性生殖干细胞在维持自我更新的基础上,不断分化,经减数分裂产生源源不断的精子以维持雄性个体的生育能力。
本发明将牛精原干细胞进行永生化,并且对永生化后的牛精原干细胞系bSSCs-Ttag进行相关基因的检测以及诱导分化,结果显示永生化后的牛精原干细胞系bSSCs-Ttag仍然具备雄性生殖干细胞的生物学特性。
Claims (8)
1.一种永生化的牛精原干细胞系,其特征在于,是以牛精原干细胞作为宿主细胞,通过用pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体表达的慢病毒转导,转导后的牛精原干细胞表达SV40大T抗原,成为具有多向分化潜能的转化体。
2.如权利要求1所述的永生化的牛精原干细胞系,其特征在于,其细胞为成纤维样,呈多角形和短梭状,有两个或两个以上的核仁,细胞间存在接触抑制。
3.如权利要求1所述的永生化的牛精原干细胞系,其特征在于,牛精原干细胞系在传代培养35代以后SV40大T抗原还能够被表达。
4.一种永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将预处理的睾丸组织剪碎,加入10倍体积的CDD溶液中消化处理;然后等体积中和液中和,室温离心后弃上清,用DMEM+10%FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巯基乙醇的溶液重新悬浮细胞后接种于培养皿上,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,再采用免疫磁珠抗体CD90分选获取纯化的牛精原干细胞;
所述的CDD溶液包含2mg/mL胶原酶、20μg/mL DNase和2mg/mL Dispase;
所述的中和液为DMEM/F12+10%胎牛血清;
2)将pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体与pVSVG和pPAX2的复合物作为转染液,将其转染于接种于培养板上的293T细胞;
48h后收取病毒液,过滤除去细胞碎片;将牛精原干细胞按照1×105细/35mm皿接种于培养皿上,12h后将病毒液含有10μg/mL polybrene的溶液加入皿中,24h后换上新鲜的培养液连续培养、传代3个月以上,得到永生化的牛精原干细胞系。
5.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,所述的睾丸组织的处理为:
将3月龄以上的睾丸组织经高浓度双抗清洗(300U/ml青霉素,300mg/mL链霉素)后转移到细胞培养室,经75%医用酒精浸泡1-2min;剪开白膜及睾丸组织,取出部分组织浸泡于PBS中,反复清洗3-4次后用剪刀剪碎。
6.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,所述精原干细胞的纯化是原代差速贴壁法分离收集未贴壁的精原细胞,将收集的未贴壁精原细胞按如下步骤进行细胞分选:
1)未贴壁精原细胞1200rpm室温离心5min,弃去培养液;
2)离心所得细胞用PBS重悬后计数,按1×107/管分装,1200rpm室温离心5min,弃去PBS;
3)离心沉淀所得细胞用20μL的CD90磁珠抗体加80μL的MACS Buffe重悬,4度孵育15min;
4)孵育细胞1200rpm室温离心5min,收集上层一抗稀释液;
5)细胞沉淀再用500μL MACS Buffer重悬成细胞悬液,用500μL MACS Buffer润洗MACS分选柱,待润洗的MACS Buffer将要流完时,及时缓慢滴加细胞悬液;
6)收集流过分选柱的细胞悬液,获得CD90阴性精原细胞;
待细胞悬液完全流过MACS分选柱后,再用500μL MACS Buffer缓慢润洗分选柱,然后取下分选柱,再向分选柱中滴加500μL MACS Buffer,收集用助推活塞推出的MACS Buffer,其中含有CD90阳性精原细胞,收集分选的牛精原干细胞接种到铺了Laminin上含有低血清的培养基中培养,其培养基组成成分为:DMEM/F12+10%KSR+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/mL青霉素,100mg/mL链霉素.20ng/mL GDNF,20ng/mL bFGF,10ng/mL LIF。
7.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,所述的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表达载体和慢病毒包装组成成分质粒pVSVG、pAX共同转染293T细胞包装获得假慢病毒感染颗粒,包括以下操作:
1)多聚赖氨酸溶液包被处理细胞培养皿,吸除多聚赖氨酸晾干培养皿后接种107个293T细胞;
2)待次日细胞生长至70-90%铺满培养皿时,换取新鲜温热培养液;
3)按照转染试剂转染体系,取质粒pLOX-Ttag-iresTKT 14μg;pVSVG 7μg;pAX 7μg,依次将转染组分别加入一个无菌洁净的玻璃离心管,混匀室温静置15min后逐滴加到293T细胞培养液中,轻轻摇匀;再换取新鲜培养液后48h收取包含病毒颗粒的细胞上清液,0.45μm滤器过滤去除细胞碎片等杂质;
牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿,上将牛精原干细胞按照1×105细胞/35mm皿上,12h后将含有10μg/ml polybrene的病毒液溶液加入含有低血清培养皿中,24h后换上新鲜的培养液连续培养、传代3个月以上,直到细胞永生化,永生化后使用含血清的完全培养基;
所述的低血清培养基组成成分为:DMEM/F12+10%KSR+0.1mMβ-巯基乙醇,2mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸,1%FBS,100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素.20ng/ml GDNF,20ng/mlbFGF,10ng/ml LIF。永生化的细胞使用的含有血清的完全培养基为DMEM/F12加入10%FBS、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素。
8.如权利要求4所述的永生化的牛精原干细胞系的构建方法,其特征在于,通过pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表达载体转导致牛精原干细胞得到连续传代3个月以上且能够表达SV40大T抗原。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611128683.4A CN106754724A (zh) | 2016-12-09 | 2016-12-09 | 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611128683.4A CN106754724A (zh) | 2016-12-09 | 2016-12-09 | 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106754724A true CN106754724A (zh) | 2017-05-31 |
Family
ID=58875665
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611128683.4A Pending CN106754724A (zh) | 2016-12-09 | 2016-12-09 | 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106754724A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109055306A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-12-21 | 佛山科学技术学院 | 一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法 |
CN109402045A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-03-01 | 卢克焕 | 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法 |
CN110684738A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-14 | 郭津生 | 一种慢病毒载体介导sv40 t抗原转染获得永生化细胞株的方法 |
CN113322283A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-08-31 | 上海长征医院 | 一种制备后纵韧带骨化患者永生化后纵韧带细胞方法 |
Citations (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101638633A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-03 | 西北农林科技大学 | 一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法 |
CN101818127A (zh) * | 2010-03-31 | 2010-09-01 | 安徽农业大学 | 一种小鼠精原干细胞分离培养方法 |
CN102105579A (zh) * | 2007-08-07 | 2011-06-22 | 普里梅真比奥特斯公司 | 生殖系干细胞的分离、表征和繁殖 |
CN102246745A (zh) * | 2011-05-16 | 2011-11-23 | 西北农林科技大学 | 用于动物精原干细胞冷冻保存的抗冻剂及其方法 |
WO2011057123A8 (en) * | 2009-11-05 | 2012-06-07 | Primegen Biotech, Llc Dba Reprocyte | Germline stem cell banking system |
CN102516396A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-06-27 | 武汉大学 | 诱导可逆性永生化前成牙本质细胞系及其建立方法 |
CN102643779A (zh) * | 2012-04-23 | 2012-08-22 | 西北农林科技大学 | 一种用于动物精原干细胞体外增殖的培养体系和使用方法 |
CN103849602A (zh) * | 2013-07-08 | 2014-06-11 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用 |
CN104004708A (zh) * | 2014-06-16 | 2014-08-27 | 内蒙古大学 | 一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法 |
CN104404083A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-03-11 | 西北农林科技大学 | 一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体及其应用 |
CN104630272A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-20 | 西北农林科技大学 | 一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体及其应用 |
CN105294849A (zh) * | 2015-09-29 | 2016-02-03 | 中山大学 | 小鼠精原干细胞特异性抗原4933427d06rik及其抗体和应用 |
CN105483089A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-04-13 | 张彦明 | 一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用 |
CN105647855A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-06-08 | 华南农业大学 | 一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法 |
CN105695511A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-06-22 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法 |
CN105779395A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-07-20 | 西北农林科技大学 | 一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法 |
CN103865877B (zh) * | 2014-03-11 | 2016-08-31 | 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 | 永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途 |
-
2016
- 2016-12-09 CN CN201611128683.4A patent/CN106754724A/zh active Pending
Patent Citations (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102105579A (zh) * | 2007-08-07 | 2011-06-22 | 普里梅真比奥特斯公司 | 生殖系干细胞的分离、表征和繁殖 |
CN101638633A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-03 | 西北农林科技大学 | 一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法 |
WO2011057123A8 (en) * | 2009-11-05 | 2012-06-07 | Primegen Biotech, Llc Dba Reprocyte | Germline stem cell banking system |
CN101818127A (zh) * | 2010-03-31 | 2010-09-01 | 安徽农业大学 | 一种小鼠精原干细胞分离培养方法 |
CN102246745A (zh) * | 2011-05-16 | 2011-11-23 | 西北农林科技大学 | 用于动物精原干细胞冷冻保存的抗冻剂及其方法 |
CN102516396A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-06-27 | 武汉大学 | 诱导可逆性永生化前成牙本质细胞系及其建立方法 |
CN102643779A (zh) * | 2012-04-23 | 2012-08-22 | 西北农林科技大学 | 一种用于动物精原干细胞体外增殖的培养体系和使用方法 |
CN103849602A (zh) * | 2013-07-08 | 2014-06-11 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用 |
CN103865877B (zh) * | 2014-03-11 | 2016-08-31 | 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 | 永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途 |
CN104004708A (zh) * | 2014-06-16 | 2014-08-27 | 内蒙古大学 | 一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法 |
CN104404083A (zh) * | 2014-11-27 | 2015-03-11 | 西北农林科技大学 | 一种促进奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖的载体及其应用 |
CN104630272A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-20 | 西北农林科技大学 | 一种基于去甲基化促进生殖干细胞自我更新和增殖的载体及其应用 |
CN105294849A (zh) * | 2015-09-29 | 2016-02-03 | 中山大学 | 小鼠精原干细胞特异性抗原4933427d06rik及其抗体和应用 |
CN105483089A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-04-13 | 张彦明 | 一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用 |
CN105647855A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-06-08 | 华南农业大学 | 一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法 |
CN105779395A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-07-20 | 西北农林科技大学 | 一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法 |
CN105695511A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-06-22 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CONG-MING BI ET AL.: "Immortalization of bovine germ line stem cells by c-myc and hTERT", 《ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE》 * |
毕聪明: "牛雄性生殖干细胞体外长期培养的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
辛颖 等: "小鼠精原干细胞不同转染方法效率的比较", 《中国生物化学与分子生物学报》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109055306A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-12-21 | 佛山科学技术学院 | 一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法 |
CN109402045A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-03-01 | 卢克焕 | 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法 |
CN110684738A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-14 | 郭津生 | 一种慢病毒载体介导sv40 t抗原转染获得永生化细胞株的方法 |
CN113322283A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-08-31 | 上海长征医院 | 一种制备后纵韧带骨化患者永生化后纵韧带细胞方法 |
CN113322283B (zh) * | 2021-06-07 | 2023-11-24 | 上海长征医院 | 一种制备后纵韧带骨化患者永生化后纵韧带细胞方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106754724A (zh) | 一种永生化的牛精原干细胞系及其构建方法 | |
CN105518137A (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA | |
CN105492608A (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA | |
CN105518140A (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性靶向vWF基因的sgRNA | |
McAllister et al. | Transformation of rodent cells by adenovirus 19 and other group D adenoviruses | |
CN103966159B (zh) | 人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法 | |
CN107760654A (zh) | 一种无血清、无饲养层的小鼠诱导多能干细胞的培养基及其方法 | |
Eisinger et al. | Virus-like agents from patients with Hodgkin's disease. | |
Stanners et al. | Studies on the transformation of hamster embryo cells in culture by polyoma virus: I. Properties of transformed and normal cells | |
Lamara et al. | Epithelial cells from goat oviduct are highly permissive for productive infection with caprine arthritis–encephalitis virus (CAEV) | |
CN104974977B (zh) | 一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法 | |
CN101864451A (zh) | 一种有蹄类哺乳动物可诱导多能干细胞及其制备方法 | |
CN102181399B (zh) | 一种cd133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法 | |
CN102586171A (zh) | 一种绵羊可诱导多能干细胞及其制备方法 | |
CN113789350A (zh) | 哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法、构建的细胞系及其类器官 | |
Rhim et al. | Characterization of non‐producer human cells induced by Kirsten sarcoma virus | |
CN112813031A (zh) | 一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法及应用 | |
CN103923877B (zh) | 一种建立dox调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法 | |
CN102653774B (zh) | 山羊可诱导多能干细胞的制备方法 | |
CN106119206A (zh) | 诱导性多能干细胞及其制备方法 | |
Bhatia et al. | Introduction to Pharmaceutical Biotechnology, Volume 3: Animal tissue culture and biopharmaceuticals | |
Crawford et al. | Identification of murine endogenous xenotropic retrovirus in cultured multicellular tumour spheroids from nude‐mouse‐passaged nasopharyngeal carcinoma | |
Asadi et al. | Establishment and preservation of lymphoblastoid cell lines from fresh and frozen whole blood and mononuclear cells | |
Rhim et al. | Transformation of rat liver epithelial cells by Kirsten murine sarcoma virus | |
CN109055306A (zh) | 一种无饲养层无血清培养小鼠精原干细胞的体系及方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170531 |