CN113789350A

CN113789350A - 哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法、构建的细胞系及其类器官

Info

Publication number: CN113789350A
Application number: CN202111051199.7A
Authority: CN
Inventors: 姜伟; 余茜颖; 袁徽; 杨亚男; 徐蕾
Original assignee: Hamde Ningbo Intelligent Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Hamde Ningbo Intelligent Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2021-12-14

Abstract

本申请属于细胞工程技术领域，具体公开了一种哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法、构建的细胞系及其培养的类器官。所述构建方法以原代食管鳞状上皮细胞作为宿主细胞，经含有hTERT基因的cDNA（hTERT cDNA）逆转录病毒感染后，通过选择培养基进行筛选，获得永生化“正常的”细胞系。同时，该细胞系能够培养成正常食管鳞状上皮类器官，为研究哺乳类食管的发育生长、干细胞维持、上皮增殖分化稳态以及食管疾病，特别是食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的发病机理和治疗药物研发提供了研究基础。

Description

哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法、构建的细胞系及其类器官

技术领域

本申请属于细胞工程技术领域，更具体地说，它涉及一种食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法，构建的食管鳞状上皮永生化细胞系以及由该细胞系形成的食管类器官。

背景技术

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。食管癌分食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）和食管腺癌（esophagealadenocarcinoma，EAC），其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，食管鳞癌（ESCC）占90%以上，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。食管鳞癌的发病与环境和遗传因素有关，但确切病因和发病机制还不很清楚，因此加强食管鳞癌的发病机理研究和治疗药物研发有非常重大的现实意义。

类器官（organoids），顾名思义是“类似于器官的结构”，最早用于描述囊性畸胎瘤。目前，科学界对“类器官”的定义是：由具有干性的细胞在体内或体外生长形成的自我组织的三维结构，它模拟了动物和人体内结构和原始组织的谱系分化。类器官可以来源于两种类型的干细胞：一是多能干细胞，包括胚胎干细胞和诱导的多能干细胞，可进行多谱系分化；二是器官特异性成体干细胞，进行特定谱系的分化，因此不论是何种类型干细胞培养出的类器官都具有多个异质性亚群。

在类器官研究的早期，多能干细胞的类器官培养应用较多，但是随着三维立体培养条件的优化，近年来多家实验室成功应用器官特异性成体干细胞进行类器官组织培养，已成功建成了多种人类组织的类器官生物样本库，包括结肠、胰腺、前列腺、肝、乳腺、肺、膀胱和食管等。例如，由人正常食管鳞状上皮细胞，通过转染或感染SV40病毒，表达其大T和小t抗原，使细胞得到永生化而获得。但是通过转染或感染SV40病毒获得的永生化细胞，其RB和P53被大T抗原蛋白结合而失活，并非正常的永生化细胞。大T抗原可以与P53结合而灭活其转录功能，也可以与低磷酸化的RB结合释放E2F，促进细胞周期进程。因此通过表达SV40的大T抗原获得的永生化细胞，其细胞周期、细胞凋亡和基因组的稳定性都存在缺陷，不利于后续研究。同时，转染或感染SV40病毒获得的永生化细胞，不仅含有大T抗原，还有小t抗原等，可以激活细胞内c-myc等原癌基因的转录，可进一步加速细胞周期进程。

发明内容

基于此，为了获得正常的永生化细胞，本申请提供一种哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法，通过该方法建立正常的哺乳类永生化食管鳞状上皮细胞系。

本申请是通过以下技术方案实现的：

本申请一方面提供一种哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法，其以原代食管鳞状上皮细胞作为宿主细胞，经含有hTERT cDNA的逆转录病毒感染后，通过选择培养基进行筛选。

本申请中，通过基因重组质粒产生含有hTERT cDNA的逆转录病毒感染食管鳞状上皮细胞构建食管鳞状上皮永生化细胞系，所构建的细胞系能够表达hTERT，是二倍体“正常的”永生化细胞，无致癌性，尤其是该细胞的RB和P53具有正常的活性。

在本申请的一个具体实施方式中，所述原代食管鳞状上皮细胞来源于大鼠。

在本申请的一个具体实施方式中，所述hTERT cDNA存在于pBABE-puro-hTERT质粒上。

在本申请的一个具体实施方式中，所述感染的具体步骤为：

将原代食管鳞状上皮细胞接种于含有聚凝胺的DMEM/F12培养基中培养；向原代食管鳞状上皮细胞中加入含有hTERT cDNA的逆转录病毒进行感染；将感染后的细胞接种于上皮完全培养基中培养。

在本申请的一个具体实施方式中，在逆转录病毒转染前一天，将原代食管鳞状上皮细胞消化、培养，使感染时原代食管上皮细胞密度达到30%-50%左右。

在本申请的一个具体实施方式中，所述DMEM/F12培养基中，DMEM培养基与F12培养基的重量比为2:1~4:1。例如，DMEM培养基与F12培养基的重量比为2:1、3:1或4:1等。

在本申请的一个具体实施方式中，所述DMEM培养基与F12培养基的重量比为3:1。

在本申请的一个具体实施方式中，所述上皮完全培养基包括DMEM/F12完全培养基，以及胰岛素，霍乱毒素，氢化可的松，EGF，Y27632，两性霉素B，青霉素和链霉素中的一种或多种。

在本申请的一个具体实施方式中，所述上皮完全培养基包括DMEM/F12完全培养基，EGF，Y27632，两性霉素B，青霉素和链霉素。

在本申请的一个具体实施方式中，所述上皮完全培养基包括DMEM/F12完全培养基，胰岛素，霍乱毒素，氢化可的松，EGF，Y27632，两性霉素B，青霉素和链霉素。

本申请另一方面提供由上述构建方法构建的大鼠食管鳞状上皮永生化细胞系。

在本申请的一个具体实施方式中，所述细胞系的分类命名为大鼠永生化食管鳞状细胞，保藏号为CGMCC23017，于2021年7月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址北京市朝阳区北辰西路1号院。

本申请另一方面提供一种食管鳞状上皮永生化细胞系，所述细胞系的分类命名为大鼠永生化食管鳞状细胞，保藏号为CGMCC23017，于2021年7月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址北京市朝阳区北辰西路1号院。

在本申请的一个具体实施方式中，上述所述的食管鳞状上皮永生化细胞系为正常细胞，无致癌性。

本申请另一方面提供上述大鼠食管鳞状上皮永生化细胞系在制备类器官中的应用。

本申请又一方面提供一种类器官，所述类器官由上述所述的大鼠食管鳞状上皮永生化细胞系培养获得。

本申请提供的大鼠食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法至少具有以下有益效果之一：

本申请提供的大鼠食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法，以大鼠原代食管鳞状上皮细胞作为宿主细胞，经含有hTERT cDNA的逆转录病毒感染后，通过选择培养基进行筛选，可以获得二倍体“正常的”永生化细胞系，该细胞系能够培养成正常食管鳞状上皮类器官，无致癌性，为食管组织器官形成，食管疾病特别是食管鳞癌的发病机理研究和治疗药物研发提供了研究基础。

附图说明

图1为本申请实施例中质粒pBABE-puro的载体图谱。

图2为本申请实施例中细胞系D3、F3和A1的PCR扩增产物凝胶电泳结果图。

图3为本申请实施例中细胞系D3、F3和A1的Western Blot检测结果图。

图4为本申请实施例中细胞系D3、F3和A1的光学显微镜（10X）观察图片。

图5为本申请实施例中细胞系D3、F3和A1的核型分析图。

图6为本申请实施例中正常食管组织中CK13和CK14的免疫荧光染色结果图，其中左侧图为CK14/DAPI图，即CK14染色与核染色融合图；右侧图为CK13/DAPI图，即CK13染色与核染色融合图。

图7为本申请实施例中D3、F3和A1细胞系中CK13和CK14的免疫荧光染色结果图，其中DAPI为核染色，Merge为CK13、CK14和DAPI三通道融合图。

图8为本申请实施例中D3、F3和A1细胞系体内成瘤实验结果的照片。

图9为本申请实施例中D3、F3和A1细胞系体内成瘤实验的统计结果图。

图10为本申请实施例中D3、F3和A1细胞系体外软琼脂克隆实验结果图。

图11为本申请实施例中D3细胞中与肿瘤发生相关蛋白的Westen blot鉴定结果图。

图12为本申请实施例中D3细胞对外界损伤应答反应实验的免疫荧光染色结果图，其中，箭头所指为表达的rH2A.X。

图13为本申请实施例中D3细胞对外界损伤应答反应实验的Westen blot鉴定结果图。

图14为本申请实施例中显微镜观察食管组织和类器官封片的HE染色结果图，其中，primary tissue为正常的大鼠原始组织，organoid为由D3细胞培养获得的类器官。

图15为本申请实施例中类器官特异性分析标志物表达的免疫荧光染色结果图，其中，primary tissue为正常的大鼠原始组织，organoid为由D3细胞培养获得的类器官。

具体实施方式

以下是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请实施例中以大鼠食管鳞状上皮细胞系为例介绍本申请的技术方案。

本申请中涉及的材料及其来源如下：

DMEM完全培养基：在DMEM培养基（高糖）中加入10％FBS（胎牛血清）、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。

DMEM/F12培养基：DMEM培养基与F12培养基以3:1的比例混合（不含FBS）。

DMEM/F12完全培养基：含有10% FBS（胎牛血清）的DMEM培养基与F12培养基以3:1的比例混合。

上皮完全培养基：在DMEM/F12完全培养基的基础上添加5μg/ml胰岛素，8.6ng/ml霍乱毒素，25ng/ml氢化可的松，0.125ng/ml EGF（EGF因子），10μM Y27632（Rock1抑制剂），250ng/ml两性霉素B，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素。

类器官培养基：DMEM/F12培养基中加入终浓度为：1×GlutaMAX（GlutaMAX添加剂，L-谷氨酰胺替代品，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）、1×HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲剂）、1×B27（B27无血清添加剂）、1×N2（N2无血清添加剂）、10μM Y27632（Rcok1抑制剂）、10mM N-Acetylcysteine（N-乙酰半胱氨酸）、50ng/mL EGF（EGF因子）、100ng/mLNoggin（Noggin因子）、100ng/mL R-spondin2（R-spondin2因子）、100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素。

实施例1 食管鳞状上皮永生化细胞系的建立

一、大鼠原代鳞状上皮细胞制备

用10％水合氯醛麻醉剂按照0.3ml/100g的剂量腹腔给药麻醉大鼠，常规手术消毒，准备器械；处死大鼠后取下食管，于PBS中冲洗以除去血污，后沿食管长轴将食管剪开；用镊子将食管肌层与食管粘膜层撕开，保留食管上皮组织；在超净工作台中，用无菌PBS漂洗食管上皮组织，而后将其转移至含有5×双抗（终浓度500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素）的DMEM培养基中杀菌10min，而后用无菌 PBS 冲洗；将食管上皮组织置于培养皿中，加入3ml 2.4U/ml Dispase II消化液，消化30min，将食管上皮层与粘膜下层分离；将食管上皮层剪成小块，转移至15ml离心管中，补入5ml TrypLE消化液重悬，置于37℃恒温摇床中，40rpm，消化20-30min；消化后用70μm细胞滤网过滤，将滤液移入15ml离心管中，1200rpm离心3min，去上清后，用上皮完全培养基重悬细胞；按照1×10⁵个细胞/孔接种于预铺好NIH-3T3细胞饲养层的培养板中，于细胞培养箱中培养，隔天换液，获得大鼠原代食管鳞状上皮细胞，备用。

二、逆转录病毒的制备

pBABE-puro的质粒图谱如图1所示。将pBABE-puro质粒和pCI-htert-neo质粒分别采用EcoRI和SalI双酶切后进行连接，构建pBABE-puro-htert质粒，备用。

取对数生长期的293T细胞，经TrypLE消化后，离心接种到六孔板中培养，细胞生长至汇合度为30-50％左右，备用。

取1.5ml EP管，加入1.5μg的病毒包装混合质粒，0.5μg的pBABE-puro-htert质粒以及250μL不含抗生素的DMEM培养基（A液），轻柔混匀，室温放置孵育5min。

取5μL Lipofectamine 2000和250μL不含抗生素的DMEM培养基混合（B液），室温放置孵育5min。

取一新的EP管，加入250μL的A液和250μL的B液，轻柔混匀，室温放置孵育20-30min，形成DNA-脂质体复合物溶液。

在培养293T细胞的六孔板中每孔加入1mL的DMEM完全培养基，再加入DNA-脂质体复合物溶液，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中培养8~12小时。

次日去除含有DNA-脂质体复合物的转染培养基，更换为含有血清的完全DMEM培养基继续培养48-72小时后收获含病毒的上清液，3000rpm，离心20min，获得含有重组逆转录病毒的上清液，备用。

三、病毒感染、阳性细胞筛选

在逆转录病毒感染的前一天，将步骤一中分离得到的原代大鼠食管上皮细胞经TrypLE消化后，接种于6孔板中，使感染时病毒细胞密度达到30%-50%左右。

第二天，将病毒细胞培养基更换为含有5μg/ml polybrene（聚凝胺）的2ml DMEM/F12培养基，在细胞培养箱中孵育2h后，每孔加入步骤二中获得的重组逆转录病毒上清液（MOI=10），放入细胞培养箱中继续培养8h后，用PBS轻轻冲洗以除去残余的转染复合物，更换为上皮完全培养基，继续培养72h后，利用含1μg/mL嘌呤霉素的上皮完全培养基筛选转染阳性细胞并扩增培养。

四、单细胞克隆筛选

扩增培养的阳性细胞，经TrypLE消化后，利用有限稀释法将细胞稀释至1个细胞/200μL，按照每孔100μL接种至96孔板中培养7天左右，期间定期更换培养基，选择具有单细胞克隆生长的孔，消化传代至细胞培养皿中扩增培养，记录单克隆编号，避免混合污染；培养至15-20代左右的细胞，利用PCR和Western Blot法检测目的基因hTERT的表达，筛选含有目的基因hTERT的单细胞系。通过PCR和Western Blot法检测筛选出多种含有目的基因hTERT并且生长状态良好的单细胞系，以部分细胞系例如D3、F3和A1为例进行说明，其PCR扩增产物凝胶电泳结果图如图2所示，Western Blot结果图如图3所示。从图2和图3中可知，筛选到的单细胞系D3、F3和A1均有hTERT的表达，而原代细胞（primary cell）中，均没有检测到hTERT，可见，在单细胞系D3、F3和A1中，均成功转入目的基因hTERT基因。将D3细胞系于2021年7月28日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院）保藏，保藏号为CGMCC23017，建议的分类命名为大鼠永生化食管鳞状细胞。

实施例2 永生化食管鳞状细胞系特性

1. 细胞形态及来源

将D3、F3和A1单细胞克隆分别进一步培养，建立“正常的”永生化大鼠食管上皮细胞系，利用光学显微镜观察D3、F3和A1形成的细胞系，其实验结果如图4所示；核型分析如图5所示；基底上层标志物CK13和基底层标志物CK14的免疫荧光染色结果如图6和图7所示，图6为正常食管组织中CK13和CK14的免疫荧光染色结果图，图7为D3、F3和A1细胞中CK13和CK14的免疫荧光染色结果图。从图4中可以看出，D3、F3和A1细胞系均为典型的多角石阶形鳞状细胞，与正常的食管鳞状上皮细胞的形状相同。

从图5可以看出，D3细胞和F3细胞均是二倍体，而A1细胞为四倍体，说明D3和F3是染色体核型正常的细胞，而A1细胞中的染色体进行了加倍。

从图6和图7对比可以看出，D3、F3和A1细胞中，CK14阳性率为100%，而几乎不表达CK13，说明D3、F3和A1细胞均来源于大鼠鳞状上皮基底层细胞。

由上可知，D3、F3和A1细胞为大鼠鳞状上皮基底层细胞。

2. 永生化食管鳞状细胞系体内成瘤实验

将D3、F3和A1细胞系分别以2×10⁶个细胞接种到6周龄的裸鼠腋下进行体内成瘤实验。每组各3只裸鼠，双侧接种，以食管鳞癌细胞系KYSE 410作为阳性对照，6周后处死观察，其实验结果如图8和图9所示。从图8和图9可以看出，阳性对照组食管鳞癌细胞系KYSE410的成瘤率为100%，而接种D3、F3和A1细胞的裸鼠均未形成肿瘤，说明D3、F3和A1细胞系均为正常的永生化细胞系，无致癌性。

3. 永生化食管鳞状细胞系软琼脂克隆实验

将传代50次以上的D3、F3和A1细胞系分别进行体外软琼脂克隆实验，以食管鳞癌细胞系KYSE 510为阳性对照，其实验结果如图10所示。

从图10中可以看出，D3、F3和A1细胞系均没有形成克隆，而阳性对照食管鳞癌细胞系KYSE 510组有明显的克隆。说明在体外培养条件下D3、F3和A1均属于“正常”的食管鳞状上皮细胞系，可应用于食管相关研究的模型。

4. 与肿瘤发生相关蛋白的鉴定

已知的肿瘤发生发展过程中发生改变的驱动基因涵盖了细胞增殖，细胞周期，细胞分化，细胞干性和细胞对于DNA损伤的应答等多个方面，涉及多条通路。如细胞周期蛋白cyclin D1，P21（CDKN1A基因编码），磷酸化RB（p-RB），CDK4，CDK6等；与细胞分化相关蛋白NOTCH1，CK13和CK14等；细胞干性相关蛋白P63，SOX2和β-catenin等；与P53通路相关的蛋白P53和MCM3；以及RAS、Actin等重要蛋白。这些蛋白的基因在食管鳞癌病人的测序结果中突变率极高，被认为是人类食管鳞癌发生的驱动基因。本申请的发明人采用Westen blot法实验了上述重要蛋白的表达水平，其实验结果如图11所示。

从图11可知，与原代细胞（primary cell）相比，D3、F3和A1细胞中，与细胞周期相关的蛋白cyclin D1，P21，p-RB，CDK4和CDK6；与细胞分化相关蛋白NOTCH1，CK13和CK14；与细胞干性相关的蛋白P63，SOX2和β-catenin；与P53通路相关的蛋白P53和MCM3；以及RAS、Actin蛋白的表达均未发生改变，可见，筛选到的D3、F3和A1细胞均为正常细胞，即无致癌性。

5. 对外界损伤应答反应实验

细胞对于外界损伤信号的应答是细胞正常信号通路的重要部分。本申请的发明人实验了D3、F3和A1细胞对于外源性DNA损伤的应答反应。以下以D3为例进行说明。

分别用0.15uM和0.3uM阿霉素处理D3细胞，作用12h后进行免疫荧光染色和Western blot，以不处理作为对照（control）。通过免疫荧光染色观察DNA损伤修复标志物γ-H2A.x的表达状况，其实验结果如图12所示。通过Western blot检测DNA损伤修复通路蛋白p-chk1，p-chk2，γH2A.x的表达状况，以actin蛋白为对照，其实验结果如图13所示。

从图12中可知，分别用0.15uM和0.3uM阿霉素处理D3细胞，DNA损伤修复标志物γH2A.x表达均上升，并且呈现为浓度依赖性。

从图13中可知，分别用0.15uM和0.3uM阿霉素处理D3细胞，DNA损伤修复通路蛋白p-chk1，p-chk2，γH2A.x的表达也上调，与正常细胞中DNA损伤修复应答过程一致。

其他两个细胞F3和A1细胞也具有类似的结果。

综上所述，通过上述构建方法成功建立了D3、F3和A1三种正常的永生化细胞系，它们均来源于大鼠正常食管鳞状上皮基底层，D3和F3细胞系为二倍体细胞，而A1细胞为四倍体细胞。D3、F3和A1细胞均被hTERT永生化，其重要通路蛋白表达均未发生改变，对于DNA损伤等外界刺激均能产生相应的反应，体内、外实验显示D3、F3和A1细胞均为正常的永生化细胞，无致癌性。

实施例3 类器官

D3、F3和A1细胞均可培养成类器官，其中以D3细胞为例进行说明。

将D3细胞经TrypLE消化成单细胞悬液，每5000个细胞与55ul基质胶混合成悬液加入24孔培养板，待凝固后加入类器官培养基。每两天更换新鲜的类器官培养基，培养12～15天，期间记录球体生长情况。类器官成熟后，弃掉类器官培养基，加入500μl预冷的细胞回收液，冰上孵育45min~1h后，1000g离心5min，弃上清。之后加入PBS清洗一次，离心弃掉PBS洗液，加入4%多聚甲醛溶液室温固定1h。之后离心弃掉上清液，依次加入浓度为20%蔗糖溶液脱水1天、30%蔗糖溶液脱水2天，移除蔗糖溶液，在O.C.T（常温）中孵育15分钟。将类器官转移至组织模具中，置于-80℃冰箱中，继续在O.C.T中进行包埋。包埋之后制成冷冻切片。

随后冰冻切片进行HE染色：苏木素染液染色3-5min，盐酸水溶液分化30s，氨水溶液返蓝1min，自来水冲洗。伊红染色液中染色5min，自来水冲洗并浸泡1-2min。切片依次放入95％乙醇（I）5min-95％乙醇（Ⅱ）5min-100％乙醇（I）5min-100％乙醇（Ⅱ）5min-二甲苯（I）5min-二甲苯（Ⅱ）5min，中性树胶封片，其实验结果如图14所示。

图14中，primary tissue为正常的大鼠食管原始组织，3D organoid为由D3细胞培养获得的食管类器官。从图14可知，D3食管类器官体外缘是与细胞外基质接触的食管鳞状上皮基底细胞，内部是较大的扁平基底上层细胞，中心是角质层细胞。HE染色呈现出的D3食管类器官横截面组织结构为复层鳞状上皮结构，与大鼠食管组织结构一致。

实施例4 类器官特异性分析标志物的表达

采用免疫荧光染色检测与食管鳞状上皮细胞表达相关的分子标志物在类器官（实施例3）中的表达情况。免疫荧光染色过程如下：将实施例3中的冷冻切片置于阴凉处风干，PBS（pH=7.4）洗涤3次，每次5min。柠檬酸抗原修复缓冲液（pH=6.0）（或者Tris-EDTA抗原修复液（pH=9.0））加热修复10min，自然冷却后，PBS（pH=7.4）洗涤3次，每次5min。用免疫组化笔画出组织范围，在画圈内滴加10%山羊血清封闭工作液均匀覆盖组织，室温封闭1h。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加适量的一抗，4℃孵育过夜。PB洗涤3次，每次5min。在画圈内滴加与一抗相应种属的荧光二抗全部覆盖组织，室温孵育1h。PBS洗涤3次，每次5min。之后滴加DAPI染液，避光室温孵育5min。PBS洗涤3次，每次5min，之后用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下采集图像，其实验结果如图15所示。

从图15中可以看出：

①食管类器官组织的最外层细胞表达基底层标志物角蛋白CK14，中间细胞表达分化的标志物CK13，这与食管组织中这两个分子的表达模式是一致的。

②与增殖相关的核抗原PCNA主要在最外层细胞中表达，这表明最外层基底细胞是增殖活跃的，与食管组织中相一致。

③食管干细胞标志物整合素α6（integrin α6）、整合素β4（integrin β4）和P75主要在D3细胞形成的食管类器官的最外层基底细胞中表达，在中间的基底上层细胞中不表达，这些分子标志物在类器官中的表达模式与大鼠食管上皮中是一致的。

④干性相关转录因子Sox2、Bmi1和Oct4主要在D3细胞形成的类器官的基底层细胞核中有定位，同时在紧邻基底层细胞的基底上层细胞中也看到有弱的阳性染色。同样，这些分子标志物在类器官中的表达模式与大鼠食管上皮中是一致的。

上述实验结果表明，使用上述实施例筛选出的D3细胞成功建立了模拟体内食管上皮结构的类器官。

终上所述，本申请实施例中利用大鼠原代食管鳞状上皮细胞作为宿主细胞，经含有hTERT cDNA逆转录病毒转染后，通过选择培养基进行筛选可以获得“正常的”食管鳞状上皮永生化细胞系。该细胞系能够体外被培养成正常的类器官，可为食管组织器官形成，食管疾病特别是食管鳞癌的发病机理研究和治疗药物研发提供了基础材料。

具体实施案例仅仅是对本申请的解释，不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法，其特征在于，以原代食管鳞状上皮细胞作为宿主细胞，经含有hTERT cDNA逆转录病毒感染后，通过选择培养基进行筛选。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述原代食管鳞状上皮细胞来源于大鼠。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述hTERT cDNA存在于pBABE-puro-hTERT质粒上。

4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述感染的具体步骤为：

将原代食管鳞状上皮细胞接种于含有聚凝胺的DMEM/F12培养基中培养；

向原代食管鳞状上皮细胞中加入含有hTERT cDNA的逆转录病毒进行感染；

将感染后的细胞接种于上皮完全培养基中培养。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述上皮完全培养基包括DMEM/F12完全培养基，以及胰岛素，霍乱毒素，氢化可的松，EGF，Y27632，两性霉素B，青霉素和链霉素中的一种或多种。

6.一种食管鳞状上皮永生化细胞系，其特征在于，所述细胞系通过权利要求1-5任一项所述的食管鳞状上皮永生化细胞系的构建方法获得。

7.一种食管鳞状上皮永生化细胞系，其特征在于，所述细胞系的分类命名为大鼠永生化食管鳞状细胞，保藏号为CGMCC23017。

8.根据权利要求6或7所述的食管鳞状上皮永生化细胞系，其特征在于，所述细胞系为正常细胞。

9.权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建的哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系或权利要求6-8中任一项所述的哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系在制备类器官中的应用。

10.一种类器官，其特征在于，所述食管类器官由权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建的哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系或权利要求6-8中任一项所述的哺乳类食管鳞状上皮永生化细胞系培养获得。