KR101223396B1 - 배아줄기세포의 추출물을 이용한 맞춤형 전분화능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배아줄기세포의 추출물을 사용하여 성체의 분화된 세포를 재프로그램화 및 역분화를 일으킴으로써 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 만능 줄기세포 및 상기 만능 줄기세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법을 이용하는 경우 성체의 분화된 체세포로부터 만능 줄기세포를 유도하는데 매우 유용할 것이며, 각 개체에 맞추어진 면역적합성 확보된 세포 치료제를 개발하는데 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 또한 질병을 가진 개체로부터 만능줄기세포를 유도함으로써 질환의 원인 규명 및 치료방법을 연구하는데 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

맞춤형 만능줄기세포, 배아 줄기세포, 면역적합성, 세포 치료제

Description

배아줄기세포의 추출물을 이용한 맞춤형 전분화능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포 {Method for derivation of pluripotent stem cells using embryonic stem cell extract and pluripotent stem cells produced by the method}

본 발명은 배아줄기세포의 추출물을 사용하여 성체의 분화된 세포를 재프로그램화 및 역분화를 일으킴으로써 맞춤형 전분화능줄기세포를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포 및 상기 전분화능 줄기세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 여러 가지 줄기세포 분류 중 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)라 함은 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭한다.

줄기세포를 분류함에 있어, 해부학적인 존재부위에 따라, 세포의 기능에 따라, 세포표면에 표현된 항원의 종류에 따라, 전사인자에 따라, 세포가 생성하는 단 백질에 따라, 그리고 그 줄기세포가 만들어 낼 수 있는 특정 세포종류에 따라 분류할 수 있다.

이러한 여러 가지 분류 중 가장 흔히 이용되고 비교적 명확한 분류는 줄기세포가 분리된 개체에 따른 것이다. 배아(embryo)에서 분리된 경우 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 성체에서 분리된 경우 성체줄기세포(adult stem cell)로 나눌 수 있다.

또 다른 흔한 분류는 하나의 줄기세포로부터 몇 종류의 분화된 세포를 만들어 낼 수 있는가에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotent) 줄기세포로 나눌 수 있으며, 일반적으로 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 전분화능 줄기세포로, 성체줄기세포(adult stem cell)는 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotent) 줄기세포로 구분할 수 있다.

수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyt)의 내부세포덩어리(세포내괴, inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 내부세포덩어리로부터 형성된 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)라 할 수 있다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.

이와 같은 전분화능 줄기세포인 배아줄기세포는 세포 제조과정에서 배아의 파괴라는 심각한 종교적 그리고 윤리적 문제점이 존재하며, 제한된 배아로부터 유래하기에 각 개체간의 면역 적합성 부재로 인하여 세포 치료제로 개발 시 이식거부반응을 피할 수 없다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 성체에서 유래한 세포를 이용하여 맞춤형 배아줄기세포 또는 배아줄기세포와 매우 유사한 세포를 인위적으로 제조하기 위한 여러 가지 방법들이 시도되어 왔다.

대표적인 방법으로 체세포 핵치환법(somatic cell nuclear transfer, SCNT), 세포 융합법(fusion with ES cell), 특정인자주입법(reprogramming by defined factor)이 있다. 체세포 핵치환법은 그 효율이 매우 낮고, 난자가 대량으로 필요하다는 점에서 큰 제한점이 있다. 세포융합법은 유도된 세포는 2쌍의 유전자를 더 가지고 있어 세포의 안정성 측면에서 큰 문제점이 있다. 가장 최근에 발표된 기술인 특정인자주입법은 발암유전자를 포함하는 바이러스를 이용한 방법으로 암세포 형성이라는 심각한 문제점이 있다.

세포 치료제 개발을 위한 맞춤형 전분화능 줄기세포를 확보하기 위하여 윤리적 문제가 없고 안정성, 안전성이 확보된 제조방법 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 인출된 것으로서, 윤리적 문제가 없고 안정성, 안전성이 확보된 제조방법을 제시하고자 한다. 본 발명에서는 성체에서 유래한 세포를 이용하여 세포를 분리한 성체와 동일한 유전적 배경을 가지는 전분화능 줄기세포를 유도할 수 있는 방법을 개발하게 되었으며, 여러 다양한 유전적 배경을 가진 성체유래 세포로부터 동일한 결과를 만들어내서 본 발명의 방법이 맞춤형 전분화능 줄기세포를 만들어 낼 수 있는 적합한 발명임을 제시하고자 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 성체에서 유래한 세포에서 전분화능 줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 배아줄기세포와 매우 흡사한 전분화능 줄기세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전분화능 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.

본 발명에 따르면, 맞춤형 줄기세포 제작의 가장 좋은 방법으로 배아줄기세포의 추출물을 이용할 수 있으며, 또한 이 방법은 다양한 유전적 배경을 가진 성체유래 세포에 모두 적용될 수 있는 광범위한 제작방법이 될 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

a) 배아줄기세포에서 단백질을 분리하는 추출물 제조 단계;

b) 상기 추출물을 성체 유래 세포에 주입하는 단계; 및

c) 추출물이 주입된 세포를 배양 과정을 거쳐, 배아 줄기세포와 매우 유사한 세포를 제작하는 단계를 포함하는 맞춤형 전분화능 줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 전분화능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.

본 발명에서 사용된 용어 '배아줄기세포'는 수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyt)의 내부세포덩어리(세포내괴, inner cell mass)에서 분리 후 배양한 세포로 전분화능성(pluripotency)을 지니는 세포를 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 '배아줄기세포 추출물'은 시험관 내에서 배양한 배아줄기세포를 물리-화학적 방법을 통하여 잘게 부순 후 원심분리 등의 방법으로 분리한 물질을 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 '전분화능 줄기세포'는 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer), 즉 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm) 모두로 분화할 수 있는 다기능성(전분화능성)을 지닌 줄기세포를 지칭한다. 전통적으로 배아줄기세포가 이 범주에 속하는 줄기세포라 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '맞춤형 전분화능 줄기세포'는 전분화능 줄기세포를 만들기 위해 사용한 공여세포와 유도된 전분화능 줄기세포가 유전적으로 동일함을 지칭하며, 이는 맞춤형 전분화능 줄기세포가 공여세포로부터 기원하여 유도된 세포임을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 용어 '성체 유래 세포'는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명의 방법은 배아줄기세포 추출물 제조, 세포에 추출물 주입 및 추출물이 주입된 세포의 배양과정으로 이루어져 있다.

본 발명의 방법은 배아줄기세포를 배양하고 이로부터 추출물을 제조하는 단계를 포함하는데, 이는 당업계에 공지된 일반적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 배양 중인 배아줄기세포를 단백질 분해 효소 처리 후 부유액을 수합한 후, 각각의 세포로부터 유래하는 단백질을 추출할 수 있다. 추출물 제조 단계에서 이용된 기술은 기존의 단백질 추출 방법을 응용하여 고농도의 단백질 추출물을 제조할 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다. 상기 단백질 추출물의 농도는 20-30 mg/ml의 범위가 바람직한데, 이는 상기 단백질 추출물의 농도가 상기 범위를 벗어나면 맞춤형 전분화능 줄기세포의 유도 효율이 저하되기 때문이다.

본 발명의 방법은 배아줄기세포에서 분리한 단백질 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계를 포함한다. 주입을 위하여 세포막 투과효소(예를 들면, streptolysin O)를 세포에 처리하여 가역적인 조그만한 구멍을 뚫어(투과화, permeabilization) 추출물이 세포내로 유입될 수 있도록 처치한다. 투과화 과정을 거친 후 추출물과 함께 배양(incubation)하는 과정을 거쳐, 성체유래 세포 내로 배아줄기세포에서 분리한 단백질 추출물을 주입하는 과정을 수행한다.

본 발명은 추출물이 주입된 세포를 배양과정을 거쳐, 배아 줄기세포와 매우 유사한 세포를 제작하는 단계를 포함한다. 상기의 추출물 주입 과정 후 배아줄기세포 배양액을 사용하여 추출물이 주입된 성체 유래 세포를 배양한 후, 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 추가로 배양하는 과정을 수행할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 상기의 추출물 주입 과정 후 7일간 배아줄기세포 배양액을 사용하여 추출물이 주입된 성체유래 세포를 배양한 후, 이후에는 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 14일간 배양하는 과정을 수행한다.

상기 추출물이 주입된 성체유래 세포는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 0.1mM MEM (Minimum Essential Medium) 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 첨가된 배양액에서 배양할 수 있다. 상기 DMEM에 첨가되는 화합물의 농도는 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 변할 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.

본 발명의 방법은 더욱 구체적으로

a) 배아줄기세포에서 20-30 mg/ml의 단백질을 분리하는 추출물 제조 단계;

b) 세포막 투과효소를 성체 유래 세포에 처리함으로써 상기 추출물을 성체 유래 세포에 주입하는 단계; 및

c) 추출물이 주입된 세포를 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 0.1mM MEM (Minimum Essential Medium) 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 첨가된 배양액에서 배양한 후, 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 추가로 배양하는 과정을 거쳐, 배아 줄기세포와 매우 유사한 세포를 제작하는 단계를 포함하는 맞춤형 전분화능 줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특징적인 것은 1) 지지세포 위에서 추가 배양을 한 점과 2) 배아줄기세포와 구분이 안될 만큼 유사한 세포를 성체세포로부터 만들었다는 것이다. 상기의 과정을 통해 맞춤형 전분화능 줄기세포가 유도됨을 확인하였다 (도 1).

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 유도된 맞춤형 전분화능 줄기세포를 제공한다. 맞춤형 줄기세포는 모양이 배아줄기세포와 동일하며(도 1), 전분화능세포의 특징적인 유전자 및 단백질을 발현하며(도 2), 시험관내에서 다양한 분화가 가능하고(도 3), 면역결핍 생쥐에 주입한 경우 기형종(teratoma)을 형성함을(도 4) 증명함으로써 전분화능 줄기세포임을 확인하였다. 상기 방법을 통해 각기 다른 성체로부터 분리한 세포를 이용하여 5번의 독립된 시도에서도 동일한 결과를 도출하여 재현성을 확인하였다(도 5).

본 발명은 또한, 본 발명의 맞춤형 전분화능 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포 치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 등의 형성에 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '세포 치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포 치료제, 줄기세포 치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

이하, 하기 실시예를 들어 본 발명의 실시 형태를 구체적으로 설명 하겠으나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 맞춤형 전분화능 줄기세포의 제조

1. 배아줄기세포에서 단백질을 분리하는 추출물 제조 단계

시험관 내에서 배양한 마우스 배아줄기세포(ES cells)를 트립신-EDTA를 이용하여 수확한 후, phosphate-buffered saline(PBS)로 세정한다. 세포 펠렛을 차가운 세포 용균 완충액 (100 mM HEPES, pH 8.2, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol, 및 프로테아제 저해제) 1ml로 재현탁하고 얼음 위에서 30~45분 동 안 두며 5분에 한번씩 볼텍싱한다. 20-게이지 바늘을 꼽은 주사기로 3~5번 통과시켜 균질화(homogenization)시키고 15,000rpm으로 30분 동안, 4℃에서 원심분리한다. 상등액을 새로운 튜브에 옮기고 -80℃에서 보관한다. 추출한 단백질의 농도는 대개 20~30 mg/ml 범위로 고농도의 추출물을 사용한다.

2. 추출물을 성체 유래 세포에 주입하는 단계

역분화를 통한 맞춤형 줄기세포를 유도하기 위하여 사용하는 성체 유래 섬유아세포(fibroblast cell)를 트립신-EDTA를 이용하여 띄고, cold PBS로 세정한다. 세포 펠렛을 cold Ca2- 및 Mg2-free Hank's balanced salt solution (HBSS) 100㎕/100,000 세포로 재현탁하고 1.5ml 튜브로 옮긴다. 120g, 5분간, 4℃로 swing-out rotor에서 원심분리하고 상등액은 버리고 세포 펠렛을 다시 cold HBSS 97.7㎕로 재현탁하여 37℃ 수조(water bath)에서 2분간 반응시킨다. Streptolysin O(SLO, cold HBSS 중에 1:10 희석된 100 g/ml 스톡) 2.3㎕를 첨가한다 (최종 SLO 농도: 230 ng/ml). 샘플을 37℃ 수조에서 50분간 반응시키는데, 10분에 한 번씩 위아래로 섞어준다. 반응이 끝난 샘플을 얼음 위에 올려놓고 cold HBSS 200㎕를 첨가한 후, 120 g, 5분간, 4℃로 swing-out rotor에서 원심분리한다. 이러한 세포투과(permeabilization) 과정을 거친 후에, 세포 펠렛을 1㎕/1000 세포가 되도록 200㎕의 배아줄기세포 추출물로 재현탁한다. 그리고, ATP-재생 시스템 (10 mM 크레아틴 포스페이트, 및 25g/ml 크레아틴 키나아제), 각각 1mM 뉴클레오티드 트리포스페이트를 첨가하고 37℃ 수조에서 1시간 반응시키는데, 10분에 한번씩 위아래로 섞어 준다. 반응이 끝난 후, 원형질막을 재봉합하기 위하여 2 mM CaCl₂가 함유된 ES 세포 배지 1㎖을 첨가하여 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시킨다. PBS 세정 후, 세포 펠렛을 배아줄기세포 배양 배지로 재현탁시킨후 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 seeding한다.

3. 추출물이 주입된 세포를 배양과정을 거쳐, 배아 줄기세포와 매우 유사한 세포를 제작하는 단계

DMEM(high glucose)에 10% FBS, 0.1mM MEM (Minimum Essential Medium) 비필수 아미노산(Gibco BRL), 0.1mM β-머캅토에탄올(Sigma), 100U/ml 페니실린(Sigma), 100㎍/ml 스트렙토마이신(Sigma), 20 ng/ml LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 첨가된 배양액에서, 37℃를 유지하며 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양한다. 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 배아줄기세포 추출물을 주입한 성체유래세포를 상기의 배지로 배양하여 첫 2일 후 배지를 교환해 준다. 10일 동안 매일 배지를 교환해주며 배양한 후, mitomycin C(MMC)가 처리된 지지세포 (feeder cell, STO cell) 위에 1:2의 비율로 옮긴다. 이후 매일 배지를 교환해주며 5일에 한번 주기로 새로운 지지세포 위로 옮긴다. 평균적으로 약 30일 째 분석에 필요한 맞춤형 줄기세포를 배양할 수 있다.

도 1은 성체 유래 세포에 본 발명의 방법을 적용할 결과 전분화능 줄기세포가 유도되는 과정을 보여주는 그림이다 (a). 유도된 전분화능 줄기세포 (b)는 추출물 제작에 사용한 배아줄기세포 (c)와 비교시 서로 모양의 구분이 불가능할 정도의 유사성을 보임을 알 수 있다. 또한, 유도된 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포의 특징인 Alkaline phosphatase 염색 양성 소견(보라색)을 보임을 알 수 있다 (d). 염색 음성 부분(회색)은 배아줄기세포 배양에 사용되는 지지세포(feeder cell, STO cell)이다.

실시예 2: 맞춤형 전분화능 줄기세포의 특성 분석

1. 유전자 발현분석

배양된 세포를 회수한 후, TRIzol reagent (Invitrogen)를 사용하여 total RNA를 분리한다. 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Nanog, Oct-3/4, Sox-2, Klf-4, cMyc, ERas 및 대조유전자인 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 진행한다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 이들 유전자의 발현을 확인한다.

도 2의 a)는 본 발명의 방법으로 유도된 전분화능 줄기세포의 유전자 발현을 보여주는 그림이다. 본 발명의 방법으로 유도된 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포의 특징적인 Nanog, Oct-3/4, Sox-2, E-Ras의 유전자 발현을 보임을 알 수 있다. 유도과정을 거치기 전의 성체 유래 세포 및 지지세포(STO 세포)는 배아줄기세포에서 보이는 특징적 유전자 발현을 보이지 않고 있다. Klf-4, c-Myc 유전자는 배아줄기세포 및 성체 유래 세포 모두에서 양성으로 보일 수 있는 비특이적인 유전자이다.

2. 단백질 발현분석

Alkaline phosphatase 염색은 통상의 염색 키트를 이용하여 확인한다. SSEA1과 OCT3/4의 발현은 이에 대한 항체를 이용하여 염색성을 확인하여 단백질 발현여부를 분석한다. 염색 과정은 우선 100% 메탄올을 이용하여 세포를 고정한 후, PBS로 세정을 하고 1% BSA 용액으로 블로킹(blocking)을 한다. SSEA1과 OCT3/4에 대한 1차 항체를 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, PBS로 세정을 하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. PBS로 세정을 하고, 마운팅(mounting) 용액으로 마운팅을 하고 공초점현미경(confocal microscopy)을 이용하여 발현 여부를 분석한다.

도 2의 b)는 본 발명의 방법으로 유도된 전분화능 줄기세포의 단백질 발현을 보여주는 그림이다. 항원-항체 반응 결과를 공초점현미경을 사용하여 분석한 결과, 유도된 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포 특이 단백질인 SSEA1과 Oct-3/4가 발현됨을 알 수 있다.

3. 시험관내 분화유도

지지세포 위에서 배양하던 미분화 맞춤형 줄기세포 콜로니를 기계적 방법을 이용하여 띄어낸 후, 피펫팅을 통해 단일 세포로 만든다. 박테리아 페트리 디쉬에서 분화 배지(LIF를 뺀 배아줄기세포 배양액)로 7일 동안 배양하여 현탁액 상태의 배아체(EB, embryoid body)를 형성하였다. 형성된 EB를 10% FBS와 1x 항생제가 첨가된 배지로 바꾸고 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 옮겨 7일 동안 배양한다. EB가 디쉬에 부착하여 다양한 종류의 세포들로 분화를 하며, 수축(beating)하는 심근세 포(cardiomyocyte)와 유사한 세포로 분화함을 관찰한다.

도 3은 본 발명의 방법으로 유도된 세포의 시험관 내 분화능을 분석한 결과이다. 한 개체를 구성하는 3가지 계열의 배엽으로 모두 분화될 수 있는 잠재력을 가지고 있는 전분화능 줄기세포의 특징인 전분화능성(pluripotency)을 시험한 결과로, 분화유도 18일경에 수축(beating)하는 심근세포(cardiomyocyte)와 유사한 세포로 분화함을 알 수 있다.

4. 생체 내 분화 유도

지지세포 위에서 배양하던 맞춤형 줄기세포 콜로니를 트립신-EDTA를 처리하여 띄어낸 후, 지지세포 제거를 위해 배양 디쉬에 넣어 배양기에서 30분간 둔다. 붙지 않은 미분화 맞춤형 줄기세포를 회수하여 세포수를 확인하여 1x10^7 세포를 severe combined immune deficiency(SCID) 마우스에 피하주사(subcutaneous injection)한다. 4주 후 형성된 종괴를 수확하여 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정을 한 후 통상적인 파라핀 포매(embedding)를 실시한다. 10㎛ 두께로 조직을 잘라 Hematoxylin 및 Eosin 염색을 하였다.

도 4는 본 발명의 방법으로 유도된 전분화능 줄기세포의 생체 내 분화능을 분석한 결과이다. 유도된 세포를 주입한 곳과 배아줄기세포를 주입한 곳 모두에서 육안적으로 종양이 형성되었음을 보여준다 (a). 조직학적으로 내배엽(b), 중배엽(c), 외배엽(d), 신경외배엽(e) 등으로 이루어진 기형종(teratoma)이 형성되었음을 보여준다. 배아줄기세포는 실험대조군으로 사용하였다. 이를 통해 본 발명의 방법으로 유도된 세포가 실제로 생체 내에서 배아줄기세포와 동일한 전분화능성(pluripotency)을 지니고 있음을 알 수 있었다.

5. 유전형 분석을 통한 맞춤형 세포 검증

배양중인 세포를 트립신-EDTA를 이용하여 띄고, cold PBS로 세정한다. 세포 펠렛을 PBS 200㎕로 재현탁하고 1.5ml 튜브로 옮긴다. 통상의 DNeasy Blood & Tissue Kit 와 DNeasy Mini spin column을 사용하여, 게놈 DNA를 추출한다. 개체간의 유전적 다형성을 검증할 수 있는 특정 MIT 마커 (예, D2Mit285)에 대한 프라이머를 이용하여 추출한 게놈 DNA에 대한 PCR을 진행한다. PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동하고, EtBr로 염색하여 크기를 확인한다.

도 6은 전분화능 줄기세포가 성체 유래 세포에서 기원함을 증명하기 위하여 microsatellite(D2Mit285) 부위에 대하여 유전자 PCR을 수행한 결과이다. C57 마우스에서 유래한 성체세포와 FVB 마우스에서 유래한 성체세포 간에는 유전형이 일치하지 않으며, C57 마우스유래 배아줄기세포는 C57 마우스 성체세포와 동일한 유전형을 보여준다. C57 유래 배아줄기세포의 추출물을 사용하여 FVB 유래 성체세포에 주입하여 전분화능 줄기세포를 유도한 결과 FVB 유래 세포와 유전형이 일치하며, 추출물을 얻은 배아줄기세포와는 유전형이 일치하지 않아, 이는 본 발명의 방법으로 유도된 세포가 성체 맞춤형 세포임을 증명하는 결과이다.

도 1은 성체 유래 세포에 본 발명의 방법을 적용할 결과 전분화능 줄기세포가 유도되는 과정 (a), 유도된 전분화능 줄기세포 (b), 추출물 제작에 사용한 배아줄기세포 (c), 및 유도된 전분화능 줄기세포의 Alkaline phosphatase 염색 결과를 나타내는 그림이다.

도 2는 본 발명의 방법으로 유도된 전분화능 줄기세포의 유전자 발현 및 단백질 발현을 보여주는 그림이다.

도 3은 본 발명의 방법으로 유도된 세포의 시험관 내 분화능을 분석한 결과이다.

도 4는 본 발명의 방법으로 유도된 전분화능 줄기세포의 생체 내 분화능을 분석한 결과이다.

도 5는 각기 다른 성체로부터 분리한 세포와 다른 종류의 배아줄기세포의 추출물을 이용하여 본 발명의 방법의 재현성을 시험한 결과이다. 5번의 독립된 시도에서도 동일한 결과를 도출하였다.

도 6은 전분화능 줄기세포가 성체유래세포에서 기원함을 증명하기 위하여 microsatellite(D2Mit285) 부위에 대하여 유전자 PCR을 수행한 결과이다.

Claims (8)

1. a) 배아줄기세포에서 단백질을 포함하는 추출물을 제조하는 단계;

   b) 상기 추출물을 성체 유래 세포에 주입하는 단계; 및

   c) 추출물이 주입된 성체 유래 세포를 배아줄기세포 배양액을 이용하여 배양한 후 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 추가로 배양함으로써 배아 줄기세포 특이 단백질 SSEA1 및 Oct3/4를 발현하는 세포를 제작하는 단계를 포함하는 맞춤형 전분화능 줄기세포의 유도 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 단백질 추출물의 농도는 20-30 mg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 세포막 투과효소를 성체 유래 세포에 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 배아줄기세포 배양액은 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 0.1mM MEM (Minimum Essential Medium) 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 첨가된 것임을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서,

   a) 배아줄기세포에서 20-30 mg/ml의 단백질을 포함하는 추출물을 제조하는 단계;

   b) 세포막 투과효소를 성체 유래 세포에 처리함으로써 상기 추출물을 성체 유래 세포에 주입하는 단계; 및

   c) 추출물이 주입된 세포를 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 0.1mM MEM (Minimum Essential Medium) 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml LIF (Leukemia Inhibitory Factor)가 첨가된 배양액에서 배양한 후, 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 추가로 배양하는 과정을 거쳐, 배아 줄기세포 특이 단백질 SSEA1 및 Oct3/4를 발현하는 세포를 제작하는 단계를 포함하는 맞춤형 전분화능 줄기세포의 유도 방법.
7. 삭제
8. 삭제

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