KR102339712B1

KR102339712B1 - Wisp-1를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102339712B1
Application number: KR1020210011531A
Authority: KR
Inventors: 김성열; 윤병분; 윤태홍; 이세영; 지민재; 송설화; 이상수
Original assignee: 주식회사 지앤지셀
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2021-12-16

Abstract

본 발명은 Wisp-1을 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다. 상기 Wisp-1은 줄기세포에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성을 촉진시키는 효과가 있다. 이에 따라, 본 발명의 조성물 및 세포외 소포체의 생산방법을 이용하여 고순도의 엑소좀과 세포외 소포체를 대량으로 생산하고 분리 및 정제가 가능하다.

Description

Wisp-1를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물{Composition For Promoting Production of Stem Cell-derived Extracellular Vesicles Comprising Wisp-1}

본 발명은 Wisp-1를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)는 세포바깥의 소포체로 세포가 세포외부로 방출하는 소낭을 말한다. 세포외 소포체는 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 ㎛의 크기를 갖는 막 구조 소낭체로서, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로베지클(microvesicle), 마이크로입자(microparticle), 세포자멸체(apoptotic body) 등을 포함한다.

세포외 소포체 중에서 엑소좀(Exosome)은 약 50-200nm 정도로 가장 작은 직경을 갖는 소낭성 입자이다. "Stem Cell Research, vol. 1, no. 2, pp. 129-137, 2008."에는, 줄기세포 배양액 성분 중 50-200 nm 크기의 물질(엑소좀)이 심근경색 후 흉터를 줄이는데 효과가 있다고 개시하고 있다.

엑소좀의 경우, 단백질 및 RNA의 교환을 통한 세포 간 의사소통의 수단으로, 세포 내 불필요한 물질의 배출 기능도 담당하고 있으며, 마이크로RNA(microRNA, miRNA)를 포함하고 있어 암 등의 질병 조기진단과 같은 분자 진단에 있어서 유용한 마커로 그 활용이 기대되고 있다. 엑소좀은 세포간 정보의 교환을 위해 물질이동에 기여하는 매개체로서 거의 모든 세포에서 분비되며, 면역조절, 암전이, 신경세포와 신경교세포 사이의 신호 전달 매개체로서 작용한다.

엑소좀 또는 세포외 소포체의 중요성 및 가치가 밝혀지고 있지만 엑소좀 또는 세포외 소포체를 다량 생성하고 이를 분리 및 수집하는 데는 많은 어려움이 따른다. 엑소좀 또는 세포외 소포체는 세포를 통해서만 생산이 가능하고, 세포의 분비량이 극미량에 불과하다는 한계가 있어 엑소좀 또는 세포외 소포체를 대량 생산하는 방법에 대한 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생산을 촉진할 수 있는 물질을 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0047289호

본 발명자들은 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성을 촉진하는 물질을 개발하고자 예의노력한 결과, Wisp-1이 줄기세포에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성을 촉진하고, 줄기세포 유래 엑소좀의 수(농도)와 엑소좀 유래 단백질 함량, 특히 CD81 단백질 함량을 증가시키는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Wisp-1(WNT1 유도성 신호전달 단백질1)을 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Wisp-1으로 전처리된, 줄기세포 유래 세포외 소포체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Wisp-1을 포함하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 배지를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Wisp-1(WNT1 유도성 신호전달 단백질1)을 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "Wisp-1"은 WNT1 유도성 신호전달 단백질1( WNT1-inducible-signaling pathway protein 1)로, WNT1 유도성 신호전달 단백질1의 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_018865.3, NP_061353.1 등).

본 발명의 용어, "세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)"은 세포바깥의 소포체로 세포가 세포외부로 방출하는 소낭을 말한다. 모든 세포들은 세포외 소포체를 분비하며, 이는 박테리아로부터 인간과 식물에 이르기까지 진화적으로 보존된 현상이다. 세포외 소포체는 단백질, 지질, 유전물질 등 세포 간의 물질 교환을 가능하게 하며, 생리적/병리적으로 신호를 전달하는 매개체로서 작용한다.

세포외 소포체는 크게 엑소좀(exosomes)과 마이크로베지클(microvesicles)로 분류된다. 엑소좀은 크기가 약 50-200 nm로, 다중 소포 엔도좀(multi-vesicular endosomes)이 성숙하는 과정에서 엔도좀 막이 안쪽으로 들어와 생성된 내강 소낭(intraluminal vesicles)으로, 다중 소포 엔도좀이 세포 표면과 결합할 때 분비된다. 마이크로베지클은 크기가 50-1000 nm로, 원형질막(plasma membrane)이 바깥으로 솟아나와 분리되어 세포 밖으로 분비되는 소낭이다.

세포들은 생리적 상태에 따라 세포외 소포체를 다르게 생성하고, 특정한 지질/단백질/핵산 조성을 갖는 세포외 소포체를 분비한다. 세포외 소포체의 특정한 조성은 세포외 소포체의 기능과 운명을 결정하게 된다.

본 발명의 용어, "엑소좀(Exosome)"은 세포에서 유래된 지질 이중층으로 구성된 소낭(vesicle)으로 세포외 소포체를 구성한다. 엑소좀은 세포 특유의 단백질, RNA 등을 포함한 상태로 세포 밖으로 분비되어 다른 세포에게 단백질과 RNA 등을 전달한다. 엑소좀에 포함되어 있는 단백질들은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 단백질 분해효소 등에 의해 활성을 쉽게 잃지 않아 가용성 형태의 단순 단백질(soluble protein)보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다. 또한, 지질 이중층의 구조는 세포막과 쉽게 융합되므로 엑소좀 내의 물질들은 세포에 효율적으로 전달될 수 있다.

상기 세포외 소포체 또는 엑소좀은 세포를 배양한 후 수득된 배양액에서 수득할 수 있다. 세포외 소포체 또는 엑소좀은 해당 세포외 소포체 또는 엑소좀이 유래된 세포 타입을 반영하는 RNA, 단백질, 지질 및 대사물질들을 함유한다. 세포외 소포체 또는 엑소좀은 해당 엑소좀이 유래된 세포의 다양한 분자 구성성분들(예, 단백질들 및 RNA)을 함유한다.

본 발명에서 용어 "줄기세포"는 미분화된 세포로서 뛰어난 증식력을 가지며, 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다.

상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 용어 "배아 줄기세포(embryonic stem cell)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)인 세포를 의미한다.

본 발명의 배아줄기세포는 인간 또는 동물로부터 유래할 수 있으며, 구체적으로, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아 줄기세포를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "성체 줄기세포(adult stem cell)"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 지칭한다. 성체 줄기세포는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 예를 들어, 골수세포는 혈구세포로, 피부 줄기세포는 피부로, 후각 신경세포는 후각 신경세포로만 분화되도록 정해진 세포이다. 이러한 성체줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 담당한다.

상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물로부터 유래할 수 있으며, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 동물 유래의 성체 줄기세포를 포함한다.

상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원 또는 유래로, 상기 인간 또는 동물 조직은 뇌, 이빨, 간, 난소, 말초 혈액, 모낭, 심장, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 또는인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 포함한다.

상기 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포는 간충직 줄기세포, 내상피 줄기세포, 모낭 줄기세포, 근육 줄기세포, 난소 줄기세포, 심장 줄기세포, 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및 정소 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 구체적으로 심장 줄기세포일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포"란, 지방, 연골, 뼈, 근육, 피부, 신경 등의 세포로 분화할 수 있는 다능성(multipotent)을 갖는 줄기세포를 의미한다. 상기 중간엽 줄기세포는 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 지방, 양수 등 기타 조직 등에도 존재한다. 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포로, 골수, 지방조직, 제대조직, 제대혈, 골격근, 말초혈액, 윤활막, 양수, 또는 양막 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포는 유도만능줄기세포로부터 분화될 수도 있다.

본 발명의 용어, "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 체세포와 같이 이미 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 의미하며, "역분화줄기세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 분화된 세포에 역분화를 유도하여 초기의 미분화된 상태로 돌아가서 전분화능(pluripotency)을 가지게 된다. 상기 역분화는 Sox2, c-Myc, Klf4, Oct-4 등의 특정 유전자를 도입하여 발현시키거나 상기 특정 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 주입하여 유도될 수 있다.

본 발명의 용어, "전분화능"은 생체를 구성하는 3가지 배엽, 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm) 및 외배엽(ectoderm) 기원의 조직 또는 기관으로 분화할 수 있는 능력을 의미한다.

상기 유도만능줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원으로, 구체적으로 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등 모든 포유동물 유래의 유도만능줄기세포를 포함한다.

본 발명에서, "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)로부터 유래된 중간엽 줄기세포"는 유도만능 줄기세포로부터 분화된 중간엽 줄기세포(iMSC)를 의미한다.

본 발명의 일실시예에서, 성체 줄기세포에 해당하는 인간 심장 유래 줄기세포를 세포배양 배지에서 배양한 후, Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 2일간 추가 배양한 경우, Wisp-1이 무처리된 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 경우에 비해, 세포외 소포체에 포함된 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성이 촉진되는 것을 확인하였다. 구체적으로 엑소좀 또는 세포외 소포체의 수(농도) 그리고 엑소좀 또는 세포외 소포체 유래 단백질의 함량, 구체적으로 CD81 단백질의 함량이 증가하는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 Wisp-1을 포함하는 조성물은 엑소좀 또는 세포외 소포체의 수 또는 엑소좀 또는 세포외 소포체 유래 단백질 함량을 증가시키고, 구체적으로 CD81의 함량을 증가시킬 수 있다. 상기 CD81은 엑소좀에 과발현되는 엑소좀 마커 단백질로, 엑소좀 또는 세포외 소포체의 지표로 활용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 Wisp-1으로 전처리된, 줄기세포 유래 세포외 소포체를 제공한다.

본 발명의 용어, "Wisp-1", "줄기세포", "엑소좀", 및 "세포외 소포체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "전처리"는 줄기세포를 Wisp-1로 미리 처리하여 줄기세포에 자극을 가하여 엑소좀 또는 세포외 소포체 생성을 증가시키도록 하는 과정이다. Wisp-1 전처리에 의해 Wisp-1으로 전처리 되지 않은 줄기세포에 비하여 엑소좀 또는 세포외 소포체 생산량과 엑소좀 또는 세포외 소포체 내 단백질 함량이 증가된다.

본 발명의 일실시예에서, Wisp-1을 무혈청 배지에 전처리하여 줄기세포를 배양한 경우, Wisp-1으로 전처리되지 않은 줄기세포에 비해 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성이 촉진되는 것을 확인하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "Wisp-1", "줄기세포", "엑소좀" 및 "세포외 소포체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

구체적으로, 본 발명의 생산방법은 a) 줄기세포를 세포배양 배지에서 배양하는 단계; b) Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계 및 c) 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리하는 단계를 포함한다.

먼저, a) 줄기세포를 세포배양 배지에서 배양한다.

상기 용어 "세포배양 배지"는 시험관(in vitro) 상에서 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하며, 세포 배양에 적절한 당해 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 상기 배지의 예로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12) 등일 수 있으며, 당해 분야에서 줄기세포 배양을 위해 사용되는 통상의 배지를 포함한다. 상기 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.

다음으로 b) 세포배양 배지를 무혈청 배지로 교체한 후 Wisp-1을 첨가하여 Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한다.

본 단계의 용어 "무혈청 배지"는 통상의 세포배양 배지에서 혈청이 제거된 배지이다. 우태아혈청(Fetal bovine serum) 등을 비롯하여 통상 세포배양에 사용되는 혈청에는 엑소좀 또는 세포외 소포체가 다량 포함되어 있다. 이에 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지를 사용하여 혈청 유래의 엑소좀 또는 세포외 소포체가 혼입되지 않도록 한다. 따라서, Wisp-1에 의해 줄기세포에서 생성되는 엑소좀 또는 세포외 소포체만이 배양액에 포함되게 된다.

본 발명에서, 무혈청 배지에 Wisp-1을 첨가하여 Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포의 배양은 12 내지 78 시간, 구체적으로 48 시간 배양할 수 있다. 48시간(이틀) 정도 배양하게 되면, 줄기세포에서 Wisp-1 자극에 의해 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성이 증가하게 된다.

다음은 c) Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양한 후에서, 이의 배양액을 회수하고 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 단계이다.

상기 용어 "배양액"은 분리된 줄기세포를 시험관 내에서 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 액체 배지에 일정기간 배양하여 수득한 배양물 또는 상기 배양물로부터 줄기세포를 제거한 배양 상등액 등을 의미한다.

본 발명에서는 엑소좀을 분리 및 정제하기 위하여, 5단계의 원심분리를 진행할 수 있다.

먼저, 1) 회수한 배양액으로부터 줄기세포를 제거하기 위하여, 500 ×rpm 내지 1500 ×rpm에서 5 내지 20분 동안, 구체적으로 1000 ×rpm에서 10분 동안 원심분리를 하여 1차 상층액을 취하는 단계; 2) 상기 1차 상층액에서 세포 잔해물을 제거하기 위하여, 2000 ×rpm 내지 4000 ×rpm에서 10 내지 30분 동안, 구체적으로 3,000×rpm에서 20분 동안 원심분리를 후 2차 상층액을 취하는 단계; 3) 상기 2차 상층액으로부터 마이크로베지클(Microvesicles)을 제거하기 위해 15,500×g 내지 17,500×g에서 5 내지 20분 동안, 구체적으로 16,500×g에서 10분 동안 원심분리를 한 후 3차 상층액을 취하는 단계; 4) 상기 3차 상층액을 110,000 ×g 내지 130,000×g에서 100 내지 150분 동안, 구체적으로 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 한 후 4차 상층액을 제거하고 하층에 남아있는 1차 펠렛을 취하는 단계; 5) 상기 1차 펠렛을 세척한 후 110,000 ×g 내지 130,000×g에서 100 내지 150분 동안, 구체적으로 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 하여 5차 상층액을 제거하고 하층에 남아있는 2차 펠렛을 취하는 단계; 및 6) 상기 2차 펠렛을 인산염 완충용액에 부유시키는 단계에 의해 줄기세포의 배양액으로부터 엑소좀을 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 회수한 배양액으로부터 세포를 제거하기 위하여, 1000 ×rpm에서 10분 동안 원심분리를 하여 1차 상층액을 취하였고, 상기 1차 상층액에서 세포 잔해물을 제거하기 위하여, 3,000×rpm에서 20분 동안 원심분리를 후 2차 상층액을 취하였다. 또한, 상기 2차 상층액으로부터 마이크로베지클(Microvesicles)을 제거하기 위해 16,500×g에서 10분 동안 원심분리를 한 후 3차 상층액을 취하였고, 상기 3차 상층액을 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 한 후 4차 상층액을 제거하고 하층에 남아있는 1차 펠렛을 취하였다. 상기 1차 펠렛을 세척한 후 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 하여 5차 상층액을 제거하고 하층에 남아있는 2차 펠렛을 취하였다. 상기 2차 펠렛을 인산염 완충용액에 부유시키는 단계에 의해 줄기세포의 배양액으로부터 엑소좀을 분리 및 정제하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 Wisp-1을 포함하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 배지를 제공한다.

본 발명에서 용어, "배지"는 무혈청 배지일 수 있다. 상기 "무혈청 배지"는 통상의 세포배양 배지에서 혈청이 제거된 배지로, 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지를 사용하여 혈청 유래의 엑소좀 또는 세포외 소포체가 혼입되지 않게 된다. 이에 의해, Wisp-1 자극에 의해 줄기세포로부터 생성되는 엑소좀 또는 세포외 소포체만을 줄기세포의 배양액으로부터 분리가 가능하다.

상기 배지에 포함되는 Wisp-1 농도는 0.3 μg/mL 내지 3 μg/mL이고, 구체적으로 1 μg/mL일 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에서는 1 μg/mL 농도의 Wisp-1을 줄기세포에 처리하여, 줄기세포에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성을 증가시켰다.

본 발명은 Wisp-1을 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다. 상기 Wisp-1 처리에 의해 줄기세포에서 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생성을 촉진시키는 효과가 있다. 이에 따라, 본 발명의 Wisp-1을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물을 이용하여 엑소좀을 대량으로 생산할 수 있다.

도 1은 Wisp-1을 포함하지 않는 배지(대조군), 또는 Wisp-1을 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후 수득된 엑소좀 각각에 대해 NTA (nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 얻은 입자 크기 분포와 입자 수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 Wisp-1을 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후, 단위 mL 당 생성된 엑소좀 입자수를 Wisp-1 무처리 대조군과 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 Wisp-1을 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후, 단위 mL 당 생성된 엑소좀 함량(CD81 함량)을 Wisp-1 무처리 대조군과 비교한 그래프이다.
도 4는 Flow Cytometry를 이용하여, 분리된 엑소좀에서 CD81의 발현을 측정한 결과이다.
도 5는 Wisp-1의 비교예로 Omentin-1을 이용하여 줄기세포를 배양한 후 생성된 엑소좀 입자 수를 비교한 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1: Wisp-1을 포함하는 줄기세포 배양액에서 엑소좀 분리

1-1. 줄기세포의 배양

인간 심장 유래 줄기세포를 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS), 100 유닛(Units)/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 배양 배지에 현탁시킨 후, T75 플라스크에 5,000 세포/cm² 밀도로 접종하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 접종 24시간 후, DMEM/F12 무혈청 배지로 교체하고, Wisp-1 처리군의 경우 배양 배지에 1μg/mL의 Wisp-1을 첨가하였으며, Wisp-1 처리 2일 후, 배양액(배지)를 수거하였다. 대조군의 경우 무혈청 배지에서 Wisp-1을 처리하지 않은 상태로 2일 동안 배양한 후, 배양액(배지)를 수거하였다.

1-2. 엑소좀의 분리 및 정제

실시예 1-1에서 회수한 배양액으로부터 엑소좀의 분리를 위해 초원심분리법(ultracentrifugation)을 사용하였다. 회수한 배양액은 4℃에서 다음과 같이 순차적으로 원심분리하여 엑소좀을 분리하였다.

우선, 회수한 배양액으로부터 세포를 제거하기 위하여, 1,000 ×rpm에서 10분 동안 원심분리를 한 후 1차 상층액을 취하였다. 그리고, 상기 1차 상층액으로부터 세포 잔해물(debris)을 제거하기 위해 3,000×rpm에서 20분 동안 원심분리를 후 2차 상층액을 취하였다. 또한, 상기 2차 상층액으로부터 마이크로베지클(Microvesicles)을 제거하기 위해 16,500×g에서 10분 동안 원심분리를 한 후 3차 상층액을 취하였다. 상기 3차 상층액을 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 한 후 4차 상층액을 제거하고 하층에 남아있는 1차 펠렛을 취하였다. 상기 얻어진 1차 펠렛을 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)으로 세척한 후, 이를 다시 120,000×g에서 120분 동안 원심분리를 하여 5차 상층액을 제거하였으며, 남은 2차 펠렛을 인산염 완충용액에 부유시켜 실시예 1-1에서 회수한 배양액으로부터 최종적으로 엑소좀을 분리 및 정제하였다.

비교예 1: Omentin-1을 포함하는 줄기세포 배양액에서 엑소좀 분리

Wisp-1 대신 Omentin-1을 처리하는 것을 제외하고 실시예 1-1과 동일하게 줄기세포를 배양하였으며, 상기 줄기세포의 배양액으로부터 실시예 1-2와 동일한 방법으로 엑소좀을 분리 및 정제하였다.

실험예 1: 분리된 엑소좀의 특성 분석 및 생산성 평가

1-1. 엑소좀의 입자 크기 및 농도 측정

상기 실시예 1에서 분리된 엑소좀의 특성을 분석하기 위하여, 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis,　NTA: Malvern에서 구입) 방법을 이용하여 입자의 크기를 측정하였다.

상기 엑소좀의 나노입자 트랙킹 분석(NTA) 결과는 도 1에 도시하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, Wisp-1을 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후 수득된 엑소좀(실시예 1)과 Wisp-1을 포함하지 않는 배지에서 수득된 엑소좀(대조군)의 평균 크기는 각각 163.9 ± 1.2 nm, 171.4 ± 0.7 nm 로 유사하였다. 그러나, Wisp-1을 포함하는 배지에서 줄기세포를 전처리 및 배양한 후 수득된 실시예 1의 엑소좀의 수(농도)는 대조군에 비해 훨씬 많았다(도 1).

1-2. 엑소좀의 수 측정

다음으로, 나노입자 트랙킹 분석을 이용하여 실시예 1과 대조군에서 생성된 엑소좀의 수를 비교하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, Wisp-1을 포함하는 배지에서 전처리 및 배양한 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 1)의 생산성(즉, 단위 mL 당 엑소좀 입자수)이 Wisp-1 무처리 대조군에 비해 대략 4배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

1-3. CD81 단백질 함량 측정

CD81은 엑소좀의 대표적인 표지자이므로 CD81의 함량과 엑소좀의 함량은 서로 선형성을 갖고 CD81 함량의 증가는 엑소좀 함량의 비례적인 증가를 의미한다. 이러한 원리에 따라, 농도를 알고 있는 인간 CD81 단백질을 연속 희석(serial dilution)하여 농도별 인간 CD81 단백질을 준비하고, 농도별 인간 CD81 단백질과 엑소좀-휴먼 CD81 항원 검출 시약(Human CD81 antigen ELISA kit, CUSABIO)을 2시간 동안 반응시킨 후 발색을 측정하였다.

그 결과, Wisp-1을 포함하는 배지에서 전처리 및 배양한 줄기세포 유래의 엑소좀 함량(CD81 함량)이 무처리 대조군에 비해 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 3 참조).

또한, Flow Cytometry를 이용하여 분리된 엑소좀에서 CD81의 발현을 측정하였다. 그 결과 엑소좀 수가 증가할수록 CD81의 발현이 증가되는 것을 확인하여, CD81이 엑소좀의 지표가 되는 것을 확인하였다(도 4 참조).

이러한 결과로부터 본 발명은 Wisp-1을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 세포(또는 세포배양액) 당 분비되거나 방출되는 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있는 것을 확인하였다.

실험예 2: Wisp-1과 Omentin-1의 엑소좀 생성 효과 비교

다음으로 Wisp-1과 마찬가지로 Omentin-1 역시 줄기세포에서 엑소좀의 생성을 증가시키는 지를 확인하고자 하였다.

비교예 1에서 Omentin-1을 첨가하여 배양한 줄기세포의 배양액으로부터 분리 및 정제된 엑소좀을 대상으로 나노입자 트랙킹 분석을 이용하여 엑소좀 수를 측정하였다. 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, Wisp-1과 달리 Omentin-1을 첨가하여 줄기세포를 배양한 경우에는 엑소좀의 생성이 증가되지 않는 것을 확인하였다.

이와 같이, Wisp-1이 세포(또는 세포배양액) 당 분비 내지는 방출되는 엑소좀 또는 세포외 소포체의 생산성을 향상시키는 것을 확인하였는 바, Wisp-1를 줄기세포에 처리하여 엑소좀 또는 세포외 소포체를 대량 생산할 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

Wisp-1(WNT1 유도성 신호전달 단백질1)을 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포, 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 또는 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 인간 또는 동물 조직은 뇌, 이빨, 간, 난소, 말초 혈액, 모낭, 심장, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 인간 또는 동물 조직 기원의 성체 줄기세포는 간충직 줄기세포, 내상피 줄기세포, 모낭 줄기세포, 근육 줄기세포, 난소 줄기세포, 심장 줄기세포, 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포, 및 정소 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포외 소포체에 포함된 엑소좀의 수 또는 엑소좀 유래 단백질 함량을 증가시키는 것인, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 엑소좀 유래 단백질은 CD81인 것인, 조성물.
Wisp-1으로 전처리된, 줄기세포 유래 세포외 소포체.
Wisp-1을 포함하는 무혈청 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 생산방법.
제9항에 있어서,
엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인, 줄기세포 유래 세포외 소포체의 생산방법.
Wisp-1을 포함하는, 줄기세포 유래 세포외 소포체 생성 촉진용 배지.
제11항에 있어서, 상기 Wisp-1 농도는 0.3 μg/mL 내지 3 μg/mL인, 세포외 소포체의 생성 촉진용 배지.