KR102461487B1

KR102461487B1 - 광노화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR102461487B1
Application number: KR1020220032131A
Authority: KR
Inventors: 김봉준; 오승익; 김은지
Original assignee: 주식회사 다산씨엔텍
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2022-11-03

Abstract

본 발명은 광노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엑소좀 유래 miRNA-222-3p를 함유하는 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 피부노화 예를 들어, 광노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

광노화 억제용 조성물 {Composition for Inhibiting Photoaging}

본 발명은 광노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엑소좀 유래 miRNA-222-3p를 함유하는 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 통해 UV에의한 염증성 세포노화를 억제시키는 광노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

피부 노화의 원인은 크게 두 가지로 나타나는데, 시간이 경과함에 따라 자연스럽게 일어나는 변화인 내인성 노화 (Intrinsic aging)와 자외선과 같은 환경적인 요인에 장기간 노출되어 나타나는 외인성 노화 (Extrinsic aging)가 있다.

내인성 노화의 경우 나이가 들어감에 따라 우리 몸의 대사과정에서 발생되는 활성산소가 제대로 제거되지 않아 몸에 누적되어 피부세포에 손상을 주는 것으로, 식이조절과 운동 등을 통해 체내 활성산소의 량을 최소화 시킬 필요가 있으며, 외인성 노화의 경우는 자외선, 공해, 흡연 및 음주 등을 원인으로 보고 있다. 태양에서 나오는 자외선은 피부노화(Photoaging)를 촉진시키고, 산화를 촉진하는 물질들 (공해, 흡연 및 음주)에 의한 지속적인 노출이 피부조직 내 ROS (Reactive oxygen species) 형성 및 피부조직에 손상을 줄 수 있는 생리활성 분자들을 생성할 수 있다.

자외선 (Ultraviolet)은 가시광선 (Visible light) 보다 파장이 짧으며, 세 가지 종류 (UVA, UVB 및 UVC)로 분류한다. 이중 UVC (200~290 nm)는 대기권 오존층에서 모두 흡수되어 지표면에 내려오지 않지만, 일부 UVB (2%)와 UVA (97%)는 지표면까지 도달한다. 일반적으로 UVB (290~320 nm)는 표피세포에 일광화상을 유발 시키며 색소침착을 유발하고, UVA (320~400 nm)는 진피의 90%를 구성하고 있는 콜라겐을 포함하는 세포외기질의 분해를 촉진한다.

장시간의 UV 노출은 표피세포에 산화적 스트레스를 유발하고, 지질의 산화를 촉진한다. 이렇게 산화된 지질 및 이를 갖는 세포들은 보체 활성 시스템 (Complementary system)에 인식되고 대식세포의 침윤 (Infiltration) 및 활성화를 유도하는 염증반응을 유도하게 된다. 이렇게 활성화된 대식세포는 MMPs (Calcium-dependent zinc-containing endopeptidases)를 분비하게 되고 장기적인 자외선 노출은 대식세포의 사이토카인 (Cytokine)과 ROS를 방출시켜 피부 조직 내 만성 염증과 조직적 손상을 유발한다. 손상을 받거나 사멸하며, 또다시 새로운 세포로 채워지는 과정에서 염증반응이 생기며, 비교적 강도가 약한 만성염증이 노화 과정과 관련성이 높은 것으로 보고되고 있다.

UV에 노출된 세포는 ROS를 생성하여 염증반응을 유도하고 다양한 신호체계 ERK, JNK 및 p38 (Extracellular signal-regulated kinase, cJun amino-terminal kinase 및 Mitogen-activated protein kinase 14) 또는 MAPK/AP-1 및 JAK/STAT-signaling pathway (Mitogen-activated protein kinase/Activator protein-1 및 Janus kinase/Signal transducer and activator of transcription-signaling pathway) 등을 통해서, NF-kB 및 AP-1 (Nuclear factor-kB 및 Activator protein-1) 전사인자의 활성을 유도하게 된다. NF-kB와 AP-1의 활성화는 콜라겐 생성을 저해하고 MMPs (Matrix metallopeptidases) 유전자의 전사를 증가시켜, 피부 조직 내 콜라겐 양을 감소시키고, 비정상적인 구조적 특징을 갖게 한다. 이러한 변이가 세포 내부에 축적되어 노화상태에 빠지게 되면, 1) 세포자연사 유도자극에 대한 저항성을 보이며 (Apotosis resistance senescence), 2) 정상적인 세포 외자극에 대한 반응성이 현저하게 감소되어 세포의 기능이 저하되고 (Multiple functional altercation), 3) G1 세포기 (유사분열 완료시점에서부터 새로운 DNA 합성이 일어나기 전까지 기간)에 정지되어 더 이상 생리적 성장인자들에 의해 S 세포기로의 진입을 하지 못하게 된다 (Irreversible cell cycle arrest). 특히 G1 세포기에 정지된 세포는 Cyclin-dependent kinase inhibitor protein (CDKN1A/p21, CDKN1B/p27, CDKN1C/p57, CDKN2A/p16, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18, CDKN2D/p19 or CDKN3)들의 발현이 증가되어 있다.

miRNA는 여러 세포주기 조절유전자를 표적으로 하여 세포주기의 진행 또는 정지를 조절할 수 있는데, 이러한 miRNA는 Cyclin-CDK (Cyclin-dependant kinase) 복합체와 CDK 억제제를 특이적으로 표적화하여 세포증식을 조절한다. 대표적으로 miR-16 계열은 CDK6, cyclin D1, cyclin D3, E2F3 및 WEE1을 포함한 여러 cyclin-CDK 유전자를 표적으로 하여 G1 단계에서 세포주기 정지를 유도하는 종양억제인자로서 역할을 한다고 알려져 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀을 이용한 자외선에 의한 염증성 노화억제 및 기전연구를 진행하던 중, 최근 개발 완료된 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM) 유래 엑소좀 내 has-miR-222-3p의 발현이 유의미적으로 높다는 사실을 NGS 분석방법을 통해서 확인하였고, UVB에 의해 염증성 노화가 촉진된 인간피부각질세포에 miR-222-3p를 과발현시킴으로써 인간피부각질세포 내 세포주기 정지를 유도하는 조절유전자 (p27 및 p21), 염증 촉진성 유전자 (IL-6 및 IL-8) 및 콜라겐 분해를 촉진하는 유전자 (MMP-1) 발현을 억제 하고 콜라겐 유전자 (Col-1a)의 발현을 유의미적으로 증가시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

1. 한국등록특허공보 등록번호 10-2284517 (2021.07.27) 2. 대한민국 등록특허공보 제 10-2136172호 (2020.07.15)

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 피부 노화 억제용 조성물을 제공함에 있다.

상술한 기술적 과제를 해결하기 위하여 miR-222-3p를 함유하는 엑소좀의 생성이 촉진된 인간 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem cells; MSCs) 배양액을 포함하는 피부 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해서 연구한 결과, 대한민국등록특허 제10-2284517호에 명시된 방법으로 제조 [지방유래 줄기세포를 소디움 피루베이트 (Sodium pyruvate), 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin) 및 소디윰셀레나이트 (Sodium selenite)가 사용된]한 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)은 UVB가 처리된 인간피부각질세포 (HaCaT) 에서 항염증, 세포사멸 및 세포노화 촉진관련 유전자의 발현이 감소되었음을 검증하였다. STEMATURE-Exosome^TM에 함유된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 확보한 후, 그 내부에 존재하는 후성유전학적 조절인자 (Epigenetic regulatory gene)인 hsa-miR-222-3p가 대조구 대비, 과발현 (4,639-fold) 되었음을 차세대염기서열분석법 (Next Generation Sequencing, NGS)으로 확인하였다. 뿐만 아니라, UVB에 의해 염증성 노화가 촉진된 인간피부각질세포에 miR-222-3p를 과발현시킴으로써 인간피부각질세포 내 세포주기 정지를 유도하는 조절유전자 (p27 및 p21), 염증 촉진성 유전자 (IL-6 및 IL-8) 및 콜라겐 분해를 촉진하는 유전자 (MMP-1) 발현을 억제하고 콜라겐 유전자 (Col-1a)의 발현을 유의미적으로 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 출원의 발명자들은 STEMATURE-Exosome^TM 및 STEMATURE-Exosome^TM 에 포함된 엑소좀 유래 miR-222-3p가 인간 피부세포에서 자외선에 의한 염증성 노화억제 효과를 검증하여, 엑소좀 유래 miR-222-3p를 포함하는 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)을 유효성분으로 하는 자외선에 의한 염증성 노화억제 조성물을 제공할 수 있게 되었다.

본 발명의 기술적 효과들은 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 인간피부각질세포 (HaCaT)에 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)을 농도별로 8시간 처리하고, UVB (10 mJ/㎠)를 조사하여 21시간 이후의 세포를 관찰한 위상차현미경 이미지이다.
도 2는 도 1의 세포로부터 총 RNA (Total RNA)를 분리하여, 세포주기 (p53, p21 및 p21) 그리고 노화와 관련된 유전자들 (END1, ANKRD 및 TIMP-1)의 발현을 실시간 PCR (real-time PCR)로 확인한 도면이다.
도 3은 도 1의 세포로부터 총 RNA (Total RNA)를 분리하여, 세포자멸사 관련 유전자들 (Bax 및 Bcl2)의 발현을 실시간 PCR (real-time PCR)로 확인한 도면이다.
도 4는 도 1의 세포로부터 총 RNA (Total RNA)를 분리하여, 염증 관련 유전자들 (NF-kB1, NF-kB2, TNF-α, IL-6 및 COX-2)의 발현을 실시간 PCR (real-time PCR)로 확인한 도면이다.
도 5는 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM) 유래 엑소좀을 투과전자현미경 (TEM)을 이용해 확인한 도면이다.
도 6a는 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM) 유래 엑소좀을 PKH67로 라벨링한 후, 이미징 유세포분석기 (Amnis Image Stream MK II, Luminex, USA)로 확인한 도면이다.
도 6b는 PKH67로 라벨링된 엑소좀을, 인간진피세포에 처리한 후 세포내부에서 발현되는 모습을 형광현미경을 통해 확인한 결과의 이미지이다.
도 7a는 실시예 1에 따른 대조구 및 처리구에서 엑소좀의 분리 후, 제작된 smRNA 라이브러리 (library)를 이용한 miRNAseq 데이터로부터 DEGs (Differentially expressed genes) 클러스트링을 보여주는 히트맵 (heatmap) 도면이다.
도 7b는 처리구에서 발현되는 miRNA들 중에서 발현율의 차이 (증가 또는 감소)가 있는 miRNA의 개수를 나타내는 도면이다.
도 7c는 대조구 및 처리구에서 공통적 또는 단독으로 발현의 차이를 보이는 유전자의 수를 나타낸 벤다이어그램이다.
도 7d는 처리구에서 발현의 차이를 보이는 miRNA 타겟 유전자들의 세포기작 (Biological process), 세포 내외 위치 (Cellular component) 및 분자기능 (Molecular function)에 연관되어 유의미를 가지는 유전자의 카테고리 (Gene ontology, GO)를 보여주는 도면이다.
도 8a는 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)에 함유된 엑소좀유래 hsa-miR-222-3p가 타겟 유전자들 중 하나인 CDKN1B/p27 (Cyclin dependent kinase inhibitor 1B)의 3'-UTR 부위에 결합되는 영역을 표시한 모식도이다.
도 8b는 인간표피각질세포 (HaCaT)에 miR-222-3p mimics을 형질감염 (Transfection)한 후, UVB (10 mJ/㎠) 유도성 인간표피각질세포의 조건 배지 (conditioned media : 10%)를 6시간 처리하여, 자외선에 의한 염증성 노화를 유도한 후, miR-222-3p의 타겟 유전자인 p27를 포함한 세포주기 정지를 유도하는 유전자 (p21), 염증을 유도하는 유전자들 (IL-1b, IL-6 및 IL-8), 콜라겐 유전자 (Col-1a) 및 콜라겐 분해를 촉진시키는 유전자 (MMP-1)의 발현을 확인한 실시간 PCR (real-time PCR) 결과의 도면이다.

본 발명이 여러 가지 수정 및 변형을 허용하면서도, 그 특정 실시예들이 도면들로 예시되어 나타내어지며, 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나 본 발명을 개시된 특별한 형태로 한정하려는 의도는 아니며, 오히려 본 발명은 청구항들에 의해 정의된 본 발명의 사상과 합치되는 모든 수정, 균등 및 대용을 포함한다.

비록 제1, 제2 등의 용어가 여러 가지 요소들, 성분들, 영역들, 층들 및/또는 지역들을 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 요소들, 성분들, 영역들, 층들 및/또는 지역들은 이러한 용어에 의해 한정되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다.

본 발명은 miR-222-3p를 함유하는 엑소좀의 생성이 촉진된 인간 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem cells; MSCs) 배양액을 포함하는 피부 노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

상기 "엑소좀"은 입자 형태로, 인간 중간엽 줄기세포의 분화가 허용되는 환경에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 유래할 수 있다. 본 발명에 따른 엑소좀은 예를 들어, 전자현미경법으로 측정시 50 내지 200nm의 직경, 구체적으로 약 100nm의 직경을 가질 수 있다.

상기 "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포를 포함한다. 상기 "성체 줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.

"중간엽 줄기세포"는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경 조직, 섬유아세포 및 근육 세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 중간엽 유래의 만능 전구 세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 인간 탯줄(cord), 와튼 젤리(wharton's jelly), 제대혈, 태반, 지방 조직, 골수, 편도, 인간의 배낭(embryonic yolk sac), 제대, 피부, 말초혈액, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주 골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등에서 유래할 수 있다. 구체적으로, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다.

상기 인간 중간엽 줄기세포는 지방줄기세포일 수 있으며, 인간 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 지방줄기세포는 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방 유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방 유래 성체 줄기세포(adipose derived adult stem cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 '줄기세포 배양액'이란 체외배양 조건에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지 중에서 줄기세포가 배양된 것으로, 본 발명은 엑소좀 생성 촉진된 인간 중간엽 줄기세포의 배양액을 포함한다.

상기 엑소좀 생성 촉진된 인간 중간엽 줄기세포의 배양액은 예를 들어, 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 배지를 포함할 수 있다. 상기 엑소좀 생성 촉진된 인간 중간엽 줄기세포를 제조하기 위한 배양액은 한국등록특허 제10-2284517호에 구체적으로 기재되어 있으며 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 소듐 피루베이트의 농도는 500 내지 2000μM, 바람직하게는 700 내지 1600μM, 보다 바람직하게는 900 내지 1300μM의 범위, 가장 바람직하게는 1000μM일 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 인슐린의 농도는 0.86 내지 3.44μM, 바람직하게는 0.96 내지 2.44μM, 보다 바람직하게는 1.06 내지 2.08μM의 범위, 가장 바람직하게는 1.72μM일 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 트랜스페린의 농도는 0.03 내지 0.14μM 바람직하게는 0.04 내지 0.13μM, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.12μM의 범위, 가장 바람직하게는 0.07μM일 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 소듐 셀레나이트의 농도는 0.01 내지 0.08μM, 바람직하게는 0.02 내지 0.07μM, 보다 바람직하게는 0.03 내지 0.06μM의 범위, 가장 바람직하게는 0.04μM일 수 있다.

상기 인간 중간엽 줄기세포 배양액은 조성물 전체 중량을 기준으로 15-25%(w/w), 구체적으로 18-22%(w/w), 더욱 구체적으로 20%(w/w)로 포함될 수 있다.

대한민국등록특허 제10-2284517호에 명시된 방법으로 제조 [지방유래 줄기세포를 소디움 피루베이트 (Sodium pyruvate), 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin) 및 소디윰셀레나이트 (Sodium selenite)가 사용된]한 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)은 UVB가 처리된 인간피부각질세포 (HaCaT)에서 항염증 효과가 있음을 검증하였다. STEMATURE-Exosome^TM에 함유된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 확보한 후, 그 내부에 존재하는 후성유전학적 조절인자 (Epigenetic regulatory gene)인 hsa-miR-222-3p가 대조구 대비, 과발현 (4,639-fold) 되었음을 차세대염기서열분석법 (Next Generation Sequencing, NGS)으로 확인하였다. 상기 miR-222-3p은 예를 들어, 5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3'서열 포함할 수 있다.

본 발명은 피부 노화 억제용 조성물로, 상기 조성물은 자외선에 의한 염증성 세포 노화를 억제할 수 있다. 구체적으로, 자외선에 의한 세포주기 억제 및 노화관련 유전자의 발현 억제; 자외선에 의한 세포자멸사 유전자의 발현 억제; 또는 자외선에 의한 전염증성 사이토카인 유전자의 발현 억제를 통해 피부 노화를 억제할 수 있다.

상기 조성물은 예를 들어, 에센스, 샴푸, 크림, 로션, 토닉, 스프레이, 에어로졸, 오일, 용액, 현탁액, 겔 또는 연고 등의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있고, 화장수, 스킨, 토너, 에센스, 앰플, 유액, 젤, 워터, 고체, 현탁액, 포말, 에어로졸, 폼, 팩, 패치 또는 크림 등의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경우에 따라서, 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 또는 냉감제 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 줄기세포로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성량이 증대된 줄기세포배양액 (STEMATURE-Exosome ^TM ) 제조

줄기세포배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)은 대한민국등록특허 제10-2284517호에 명시된 방법으로 제조되어 본 발명에 사용되었다. ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입한 인간지방유래 중간엽 줄기세포를 페놀 레드 (Phenol Red)와 콜린 클로라이드(Choline chloride)가 제외된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mixture), 1% 페니실린 스트렙토마이신(Penicillin streptomycin), 5% 인간 혈소판 용해물 (human Platelet Lysate, hPL)을 포함하는 계대배양용 배지에서 37℃, 5% CO₂의 배양 조건으로 배양하였다.

배양된 줄기세포 (약 70% Confluency)는 계대배양용 배지를 제거한 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 세포는 a-MEM (Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification, Welgene, Korea), 혈청 대체제 (10%), 소듐 피루베이트 (1,000 μM), 인슐린 (1.72 μM), 트랜스페린 (0.07 μM) 및 소듐 셀레나이트 (0.04 μM)를 포함하는 복합 조성물을 처리 후, 24 h 동안 배양하였고, 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리를 수행하여 불순물을 제거한 후, 얻어진 상등액을 0.22 ㎛ 주사식 여과기로 여과하여 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)을 수득하였다.

실시예 2: 줄기세포배양액 (STEMATURE-Exosome ^TM )의 UVB로 인한 세포주기 억제 및 노화관련 유전자의 발현 억제

2x10⁵개의 인간피부각질세포 (HaCaT)를 6 웰 플레이트의 각 웰당 시딩(seeding) 하여 24시간 배양한 후, STEMATURE-Exosome^TM 시료를 도 1의 농도로 희석한 무혈청 배지 2 mL씩을 8 시간동안 전처리한 후, UVB를 처리하였다 (도 1). 21 시간 동안 37℃에서 배양한 후, 세포를 회수하여 총 RNA (total RNA)를 분리한 후 다음 표 1의 프라이머를 사용하여 RT-qPCR을 통해 주요 세포주기 억제 및 노화관련 유전자들의 발현을 측정한 결과, 대조군과 비교 시, 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)이 포함된 처리군에서, 농도 의존적으로 세포주기 억제 유전자들의 발현 (p53, p27 및 p21) 감소, 그리고 노화와 관련된 유전자들 (END1, ANKRD 및 TIMP-1)의 발현이 감소됨을 확인되어, STEMATURE-Exosome^TM가 UVB로 인한 세포주기 억제 및 노화관련 유전자의 발현억제에 효과가 있음을 확인하였다 (도 2).

[표 1]

실시예 3: 줄기세포배양액 (STEMATURE-Exosome ^TM )의 UVB로 인한 세포자멸사 관련 유전자의 발현 억제

실시예 2로부터 회수된 cDNA를 사용하여 다음 표 2의 프라이머로 qPCR을 통해 주요 세포자멸사관련 유전자들의 발현을 측정한 결과, 대조군과 비교시, 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)이 포함된 처리군에서, 농도 의존적으로 Bax (Pro-apoptotic gene)의 발현 감소 및 Bcl2 (Anti-apoptotic gene)의 발현 증가됨이 확인되어, STEMATURE-Exosome^TM가 UVB로 인한 세포자멸사 관련 유전자의 발현억제에 효과가 있음을 확인하였다 (도 3).

[표 2]

실시예 4: 줄기세포배양액 (STEMATURE-Exosome ^TM )에 UVB로 인한 전염증성 사이토카인 유전자의 발현억제

실시예 2로부터 회수된 cDNA를 사용하여 다음 표 3의 프라이머로 qPCR을 통해 주요 전염증성 사이토카인 유전자들의 발현을 측정한 결과, 대조군과 비교시, 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)이 포함된 처리군에서, 농도 의존적으로 전염증성 사이토카인 유전자 (NF-kB1, NF-kB2, TNF-α, IL-6 및 COX-2)의 발현을 억제함을 확인하여, STEMATURE-Exosome^TM가 UVB로 인한 전염증성 사이토카인 유전자의 발현억제에 효과가 있음을 확인하였다 (도 4).

[표 3]

실시예 5: 줄기세포배양액 (STEMATURE-Exosome ^TM )유래 엑소좀의 특성 분석

실시예 1의 방법에 따라 분리된 엑소좀을 글로 방전 탄소코팅 구리 그리드 (Glow-discharged carbon-coated copper grid)에 3분간 흡착시킨 후, 상기 그리드를 증류수로 세척한 후, 바이오 투과전자현미경 (Bio transmission electron microscope, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다. 도 5에서 보이는 것처럼, 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM) 유래 엑소좀의 크기가 약 100 nm의 구형임을 알 수 있었다.

실시예 6: 형광라벨 이미지 유세포 분석 (Fluorescent label Imaging flow cytometry)

실시예 1에서 수득된 배양액 (100 ㎕)에 세포외 소포체의 세포표면 표식인자 (Surface marker antibody)인 PKH67-FITC (Sigma, USA)용 항체 10 ㎕를 각각 첨가하여 40분 동안 암실에서 반응시켰다. 이후 PBS 200 ㎕를 첨가한 후, FACS (Amnis ImageStream Mk ll, Luminex, USA)를 이용하여 세포외 소포체의 이미지를 확인하였다 (도 6a). 도 6b는 인간진피세포 (Normal human dermal fibroblast, NHDF)에 PKH67-라벨링된 엑소좀 (labelled exosomes)을 20 h 처리하여, 인간진피세포 내에서 존재함을 확인한 형광현미경 이미지이다.

실시예 7: Small RNA 시퀀싱 및 데이터 분석

실시예 1와 같이 배양된 줄기세포 (약 70% Confluency)는 계대배양용 배지를 제거한 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 세포는 a-MEM (Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification, Welgene, Korea), 혈청 대체제 (10%), 소듐 피루베이트 (1,000 μM), 인슐린 (1.72 μM), 트랜스페린 (0.07 μM) 및 소듐 셀레나이트 (0.04 μM)를 포함하는 복합 조성물을 처리하였고, 대조구의 경우는 복합 조성물 처리 없이 a-MEM 만으로, 24 시간동안 배양하였다. 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리를 수행하여 불순물을 제거한 후, 얻어진 상등액을 0.22 ㎛ 주사식 여과기로 여과한 후, Amicon-15 Centrifugal Filter unit (30 kD MWCO, Millipore, USA)로 농축하였다. miRNA의 분리와 라이브러리 제작은 mirVana^TM miRNA isolation kit (ThemoFisher Scientific, USA) 그리고, TruSeq^ㅢ Small RNA library preparation kit (Illumina, USA)의 제조사의 지시에 따라 완성되었다. 제작된 cDNA 라이브러리 (library)는 PCR로 증폭된 후, 프라이머 다이머 (Primer dimer) 및 기타 부산물을 제거하기 위해 PAGE로 분리하여 약 147 nucleotide 길이의 PCR 산물 (products)을 회수하고 Illumina NextSeq500 sequencing platform을 사용하여 75 nucleotide 길이의 단일말단 주형 (Single-end reads)이 시퀀싱 되었다. 전처리 데이터 (Preprocessing data) 처리를 위해서 미가공 주형 (Raw reads)은 FastQC (ver 0.11.5)와 Skewer (ver 0.2.2)를 사용하여 미가공 주형 상태를 점검 (Raw read quality check)하고, 어뎁터 서열 (Adapter sequence)을 제거하였고 가공된 주형 (Clean reads)의 얼라인먼트 (Alignment)와 정량화(Quantification)에 QuickMIRSeq pipeline (hg19 RefSeq)이 사용되었다. 다르게 발현된 miRNA 분석 (Differentially expressed miRNA analysis)에 NOISeq (ver 2.16.0)가 사용되었다.

대조구 (ctrl-1 및 ctrl-2) 와 처리구 (STEMATURE-Exosome^TM) 로부터 분리된 엑소좀유래 miRNA들의 발현량 차이 (Differentially expressed genes, DEGs)를 히트맵 (heatmap) 으로 확인하였고 (도 7a), 처리구 (STEMATURE-Exosome^TM) 에서 발현되는 miRNA들 중에서 발현율의 차이 (증가 또는 감소)가 있는 miRNA의 개수와 대조구 및 처리구에서 공통적 또는 단독으로 발현되는 miRNA의 개수를 밴다이어그램으로 각각 확인하였다 (도 7b 및 도 7c). 또한, 처리구에서 발현량의 차이를 보이는 miRNA 타겟 유전자들의 카테고리 (Gene ontology, GO)를 세포기작 (Biological process), 세포 내외 위치 (Cellular component) 및 분자기능 (Molecular function)으로 분류하였다 (도 7d).

그리고, miRNAseq 데이터로부터 대조구에 비해 처리구에서의 발현율이 높은 (4,639-fold) hsa-miR-222-3p의 표적유전자 (표 4)는 RNAhybrid, miRanda 및 TargetScan program를 사용하여 예측하였다.

[표 4]

도 8a는, 줄기세포 배양액 (STEMATURE-Exosome^TM)에 함유된 엑소좀유래 hsa-miR-222-3p가 타겟 유전자들 중 하나인 CDKN1B/p27 (Cyclin dependent kinase inhibitor 1B)의 3'-UTR부위에 결합되는 영역을 표시한 모식도이다.

실시예 8. miR-222-3p에 의한 인간피부각질세포내 세포주기 억제유전자 및 전염증성 사이토카인 유전자의 발현 감소 그리고 Collagen 유전자발현 증가 확인

miRNAseq를 통해 가장 유의적으로 차이를 보이는 miRNA 리스트를 조사한 결과 표 4와 같이 hsa-miR-222-3p가 가장 높은 증가율 (4,639-fold)을 보였다. 줄기세포배양액 (STEMATURE-Exosome^TM) 유래 hsa-miR-222-3p의 기능을 인간피부각질세포에서 알아보고자 합성 miRNA 모사체 (Synthetic miRNA mimics, 5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3)을 합성 (IDT, USA)하였다. 2x10⁵개의 인간표피각질세포를 6 웰 플레이트의 각 웰에 시딩 (seeding)한 후, 24 시간 동안 37℃에서 배양한 후, INTERFERin (Polyplus, France) 제제 (reagent)를 이용하여 합성된 miR-222-3p mimics를 24 시간 동안 형질감염 (transfection) 하였다. 추가적으로 UVB가 처리된 HaCaT의 조건 배지 (conditioned media : 10%)를 6시간 동안 처리하여, 자외선에 의한 염증성 노화를 유도하였다. 세포를 회수하여 총 RNA (total RNA)를 추출하여 다음 표 5의 프라이머로 RT-qPCR을 수행한 결과, 도 8b에 나타나 있는 바와 같이 hsa-miR-222-3p의 타겟 유전자인 CDKN1B/p27 (Cyclin dependent kinase inhibitor 1B)를 포함하여 세포주기 정지를 유도하는 유전자 (p21), 염증을 유도하는 유전자들 (IL-1b, IL-6 및 IL-8), 콜라겐 분해를 촉진시키는 유전자 (MMP-1) 발현의 억제됨 그리고 콜라겐 (Collagen) 유전자 (Col-1a)의 발현이 증가됨을 확인하였다.

[표 5]

실시예 9. 통계분석

본 실험에서 시행된 실험은 총 2회 이상 반복하였으며, 실험 군에 따른 데이터 사이의 통계적 유의성 검정은 Student's t-test 양측검정 (Two-tailed)으로 시행하였다. 결과 값들은 Mean value ± standard deviation (SD)으로 나타내었다. p값이 0.05 이하일 경우 * 그리고 0.01 이하일 경우 **로 통계적 유의성을 표시하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

miR-222-3p를 과발현시킨 엑소좀을 함유하는 인간 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem cells; MSCs) 배양액을 포함하는 자외선에 의한 피부 노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 지방줄기세포인, 자외선에 의한 피부 노화 억제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 전자현미경법으로 측정시 50 내지 200nm의 크기를 가지는, 자외선에 의한 피부 노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 miR-222-3p은 5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3'의 서열을 포함하는, 자외선에 의한 피부 노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀의 생성이 촉진된 인간 중간엽 줄기세포 배양액은 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 배지를 포함하는, 자외선에 의한 피부 노화 억제용 조성물.