KR102461488B1

KR102461488B1 - 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102461488B1
Application number: KR1020220032135A
Authority: KR
Inventors: 김봉준; 오승익; 김은지
Original assignee: 주식회사 다산씨엔텍
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2022-11-03

Abstract

본 발명은 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엑소좀 유래 miRNA-29a-3p를 함유하는 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 통해 모유두세포 활성을 촉진시켜 탈모 예방 또는 발모를 촉진하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물 {Composition for Activating Hair Follicle Dermal Papilla Cells}

모낭 (Hair follicle)은 진피속 모근 (Hair root)이 잘 자랄 수 있도록 영양을 공급하고 보호막 역할을 하는 피부기관 (Organ) 으로 모낭 속에는 모유두세포 (Hair follicle dermal papilla cells), 모모세포 (Hair follicular keratinocytes), 신경세포 및 모세혈관 등 20여가지 서로 다른 세포 유형으로 구성되어 있다.

모발 (Hair)의 성장은 혈액 속에 존재하는 영양소가 모세혈관을 통해 모유두세포로 전달되어, 모유두세포에서 영양 (Cytokines 및 Growth factors)을 받아 끊임없이 모모세포의 세포분열과 지속적인 세포분화 (Keratinization)가 일어나는 과정을 통해 머리털이 자란다. 모발의 굵기에 따라 1) 취모/배냇머리 (Lanugo hair), 2) 연모 (Vellus hair), 3) 중간모 (Intermediate hair) 및 4) 경모/종모 (Terminal hair)로 구분하며, 표피에 연결된 모낭의 각도에 따라 1) 직모 (Straight hair), 2) 파상모 (Cury hair) 및 3) 축모 (Kinky hair)가 결정된다. 일반적으로 각 모낭은 일생 동안 10~20회의 모낭성장주기 (Hair follicle growth cycle)를 가지며, 머리털의 경우에는 26년 정도의 생장기 (Anagen/growh phase)와 2~4주간의 퇴행기 (Catagen/regression phase)를 거쳐서 3~4개월 정도의 휴지기 (Telogen/quiescence phase)를 반복하는 주기 (Turn over)를 갖는다.

정상인의 경우에도 나이가 들어갈수록 성장기 모낭의 수가 감소하여 탈모 (Hair loss)가 발생되나, 유전적 및 환경적 요인, 정신적 스트레스, 자가 면역 및 내분비 장애 등으로도 탈모가 발생된다. 탈모는 모낭이 파괴되어 모발이 다시 나지 않는 반흔성 탈모 (Cicatrical alopecia)와 모발만 빠지는 비 반흔성 탈모 (Noncicatrical alopecia)로 구분할 수 있으며, 모발이 빠지는 시기에 따라 성장기 탈모 (Anagen effluvium)와 휴지기 탈모 (Telogen effluvium)로도 구분할 수 있다.

성장기 탈모의 경우, 모낭의 세포분열이 억제되어 모섬유 생성이 멈추는 경우로 유전질환으로 호르몬 생성 결함, 비오틴, 필수 지방산, 비타민 C, 구리, 철 및 아연 등의 영양소 부족 또는 중금속 오염, 일부 항암제, 방사선 등의 강한 자극에 세포에 가해지면 성장기가 중단되어 모발이 빠지게 된다. 휴지기에 들어간 모낭의 증가로 발생되는 휴지기 탈모 (Telogen hair loss)의 경우는 모유두세포의 활동이 정지되어 모발이 빠지게 되는 시기로, 영양부족, 미네랄, 비타민 결핍, 출산 전후의 호르몬 이상, 혈액 감소, 감염성 만성질환, 자외선 영향, 급성질환, 만성질환, 콜레스테롤 저하제, 항고혈압제, 항혈액응고제, 항경련제 및 관절염약 등의 효능과 부작용이 원인이 되기도 한다.

유전적인 요인 및 남성호르몬이 주요원인으로 작용하는 남성형 탈모증 (Androgenic alopecia)인 대머리 (Baldness)의 경우, 모낭의 성장기간 (Anagen phase)이 단축되어 휴지기 (Telogen phase) 상태에 있는 모낭 수와, 그에 대한 성장기 모낭 수의 비율이 감소하여 시간이 지날수록 모낭이 축소되는 현상이 나타난다 (Miniaturization of hair follicle).

남성호르몬인 안드로겐 (Androgen: ex, Testosterone)의 과분비는 모유두세포 내 5α-환원효소 (5α-reductase)에 의해 DHT (Dihydrotestosterone)로 변환되어 세포 내 수용체인 AR (Androgen receptor) 및 ARE (Androgen response element)와 결합하여 AR 타깃 유전자들 (DKK1, TGF-β1, IL-6)의 발현을 촉진시킨다. 특히, DKK1 (Antagonist of the Wnt/β-catenin signaling pathway)은 모유두세포 및 모모세포의 증식과 분열을 억제하여 결국, 모발이 자라는 기간을 단축시키고 모낭을 소형화 시켜 굵고 튼튼한 성모의 수를 감소시킴으로써 탈모를 유발시킨다.

모낭에서의 Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 모발성장과 모유두세포증식에 중요하다. Wnt (Wingless and Int-1) 신호전달의 활성화는 Cysteine-rich glycoprotein인 Wnt (Canonical Wnts: Wnt1a, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt7b 및 Wnt10a/b) 단백질들과 그들의 세포 표면 수용체 (Cell surface receptors)인 Fz (Frizzled) 및 LRP5/6 (G-protein coupled receptor 및 Low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)와 결합하여, Dvl/Axin/CK1α/β-catenin/GSK3β/APC/β-TrCP (Dishevelled sedment polarity protein 1/Axis inhibition protein 1/Casein kinase 1α/β-cantenin/Glycogen synthase kinase 3 β/Adenomatous polyposis coli protein/β-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase)의 복합체로부터 스캐폴드 단백질 (Scaffold protein)인 Axin및 GSK3β를 유리시켜 축적된 β-catenin (Unphosphorylated β-cantenin)이 핵으로 이동하여, 전사인자 TCF/LEFs (T-cell specific transcription factors/Lymphoid enhancer binding factors)와 결합 및 활성화됨으로써 모낭 형태형성 및 재생 (Hair follicle morphogenesis or regeneration)과 관련된 타깃유전자들의 발현을 통해서 모발성장과 증식이 촉진된다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀을 이용한 모유두세포 활성 효과 및 기전 연구를 진행하던 중, 최근 개발 완료된 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM) 유래 엑소좀 내 miRNA-29a-3p의 발현이 유의미적으로 높다는 사실을 NGS 분석방법을 통해서 확인하였고, DHT (Dihydrotestosterone)에 의해 세포활성이 억제된 모유두세포에 miR-29a-3p를 과발현시킴으로써 모유두세포 활성을 억제하는 유전자들 (DKK1, TGFβ-1, p27, p21 및 TNF-α)의 발현을 억제하고 모유두세포 활성을 촉진하는 유전자 (CCND1)의 발현이 유의미적으로 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

1. 한국등록특허공보 등록번호 10-2284517 (2021.07.27) 2. 대한민국 등록특허공보 제 10-2136172호 (2020.07.15)

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공함에 있다.

상술한 기술적 과제를 해결하기 위하여 miRNA-29a-3p를 함유하는 엑소좀의 생성이 촉진된 인간 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem cells; MSCs) 배양액을 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해서 연구한 결과, 대한민국등록특허 제10-2284517호에 명시된 방법으로 제조 [지방유래 줄기세포를 소디움 피루베이트 (Sodium pyruvate), 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin) 및 소디윰셀레나이트 (Sodium selenite)가 사용된]한 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)은 인간 모유두세포 (HDPC) 에서 세포활성 유전자의 발현이 증가되었음을 검증하였다. STEMAUTRE-Exosome^TM에 함유된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 확보한 후, 그 내부에 존재하는 후성유전학적 조절인자 (Epigenetic regulatory gene)인 hsa-miRNA-29a-3p가 대조구 대비, 과발현 (296-fold) 되었음을 차세대염기서열분석법 (Next Generation Sequencing, NGS)으로 확인하였다. 뿐만 아니라, DHT (Dihydrotestosterone)에 의해 세포활성이 억제된 모유두세포에 miR-29a-3p를 과발현시킴으로써 모유두세포 활성을 억제하는 유전자들 (DKK1, TGFβ-1, p27, p21 및 TNF-α)의 발현이 억제되고 모유두세포 활성을 촉진하는 유전자 (CCND1)의 발현이 유의미적으로 증가됨을 확인하였다. 따라서, 본 출원의 발명자들은 STEMAUTRE-Exosome^TM 및 STEMAUTRE-Exosome^TM 에 포함된 엑소좀 유래 miRNA-29a-3p가 인간모유두세포에서 모유두세포활성을 증가시킴을 검증하여, 엑소좀 유래 miR-29a-3p를 포함하는 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)을 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공할 수 있게 되었다.

본 발명의 기술적 효과들은 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 인간모유두세포 (HDPC)에 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)을 농도별로 24 시간 처리하였을 때 주요 성장인자 유전자들 (TGFβ-2, VEGF, HGF, KGF)의 발현을 확인한 실시간 PCR (real-time PCR) 결과의 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 인간모유두세포에 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)을 농도별로 48 시간 처리하였을 때 세포의 증식 및 이동이 증가되는 정도를 나타낸 도면이다.
도 3은 인간모유두세포에 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)을 농도별로 3시간 전처리하고, UVB (40 mJ/㎠) 처리한 후 21 시간 배양하였을 때 활성산소 (ROS)의 생성이 억제되는 정도를 나타낸 도면이다. 세포의 핵은 DAPI 시약으로 염색하였으며, UVB 처리로 발생된 활성산소는 H₂DCF-DA (Invitrogen, USA)로 염색하여 형광현미경을 통해 관찰하였다.
도 4a는 모유두세포에 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)을 농도별로 3시간 처리하고, DHT (100 nM)를 6시간 처리하였을 때 세포의 모양을 확인한 위상차현미경의 이미지이다.
도 4b는 모유두세포에 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)을 농도별로 3시간 처리하고, DHT (100 nM)를 6시간 처리하였을 때 유전자들의 발현 (TGFβ-1, DKK1, IL-6) 이 억제되는 실시간 PCR (real-time PCR) 결과의 도면이다.
도 5a는 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM) 유래 엑소좀을 PKH67로 라벨링한 후, 이미징 유세포분석기 (Amnis Image Stream MK II, Luminex, USA)로 확인한 도면이다.
도 5b는 PKH67로 라벨링된 엑소좀을 인간 모유두세포에 처리한 후 세포내부에서 발현되는 모습을 현광현미경을 통해 확인한 결과의 이미지이다.
도 6a는 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)에 함유된 엑소좀 유래 hsa-miR-29a-3p가 타겟 유전자들 중 하나인 DKK1 (Dickkopf WNT Signaling Pathway Inhibitor 1)의 3'-UTR 부위에 결합되는 영역을 표시한 모식도이다.
도 6b는 인간 모유두세포 (HDPC)에 miR-29a-3p를 24시간동안 형질감염 (Transfection)한 후, 모유두세포 성장억제물질인 DHT (100 nM)를 사용하여 성장억제를 6시간 유도하여, miR-29a-3p의 타겟 유전자인 DKK1을 포함한 모유두세포 증식 억제성 유전자 (TGFb-1, p27^kip1, p21^CIP1/WAF1, p16^INK4a, NF-kB1, NF-kB2 및 TNF-α)와 모유두세포 증식 촉진성 유전자 (CTNNB1, LEF1 및 CCND1)의 발현을 확인한 실시간 PCR (real-time PCR) 결과의 도면이다.

본 발명이 여러 가지 수정 및 변형을 허용하면서도, 그 특정 실시예들이 도면들로 예시되어 나타내어지며, 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나 본 발명을 개시된 특별한 형태로 한정하려는 의도는 아니며, 오히려 본 발명은 청구항들에 의해 정의된 본 발명의 사상과 합치되는 모든 수정, 균등 및 대용을 포함한다.

비록 제1, 제2 등의 용어가 여러 가지 요소들, 성분들, 영역들, 층들 및/또는 지역들을 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 요소들, 성분들, 영역들, 층들 및/또는 지역들은 이러한 용어에 의해 한정되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다.

본 발명은 miRNA-29a-3p를 함유하는 엑소좀의 생성이 촉진된 인간 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem cells; MSCs) 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

상기 "엑소좀"은 입자 형태로, 인간 중간엽 줄기세포의 분화가 허용되는 환경에서 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 유래할 수 있다. 본 발명에 따른 엑소좀은 예를 들어, 전자현미경법으로 측정시 50 내지 200nm의 직경, 구체적으로 약 100nm의 직경을 가질 수 있다.

상기 "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포를 포함한다. 상기 "성체 줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.

"중간엽 줄기세포"는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경 조직, 섬유아세포 및 근육 세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 중간엽 유래의 만능 전구 세포를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 인간 탯줄(cord), 와튼 젤리(wharton's jelly), 제대혈, 태반, 지방 조직, 골수, 편도, 인간의 배낭(embryonic yolk sac), 제대, 피부, 말초혈액, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주 골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등에서 유래할 수 있다. 구체적으로, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다.

상기 인간 중간엽 줄기세포는 지방줄기세포일 수 있으며, 인간 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 지방줄기세포는 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방 유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방 유래 성체 줄기세포(adipose derived adult stem cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 '줄기세포 배양액'이란 체외배양 조건에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지 중에서 줄기세포가 배양된 것으로, 본 발명은 엑소좀 생성 촉진된 인간 중간엽 줄기세포의 배양액을 포함한다.

상기 엑소좀 생성 촉진된 인간 중간엽 줄기세포의 배양액은 예를 들어, 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 배지를 포함할 수 있다. 상기 엑소좀 생성 촉진된 인간 중간엽 줄기세포를 제조하기 위한 배양액은 한국등록특허 제10-2284517호에 구체적으로 기재되어 있으며 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 소듐 피루베이트의 농도는 500 내지 2000μM, 바람직하게는 700 내지 1600μM, 보다 바람직하게는 900 내지 1300μM의 범위, 가장 바람직하게는 1000μM일 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 인슐린의 농도는 0.86 내지 3.44μM, 바람직하게는 0.96 내지 2.44μM, 보다 바람직하게는 1.06 내지 2.08μM의 범위, 가장 바람직하게는 1.72μM일 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 트랜스페린의 농도는 0.03 내지 0.14μM 바람직하게는 0.04 내지 0.13μM, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.12μM의 범위, 가장 바람직하게는 0.07μM일 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 소듐 셀레나이트의 농도는 0.01 내지 0.08μM, 바람직하게는 0.02 내지 0.07μM, 보다 바람직하게는 0.03 내지 0.06μM의 범위, 가장 바람직하게는 0.04μM일 수 있다.

상기 인간 중간엽 줄기세포 배양액은 조성물 전체 중량을 기준으로 15-25%(w/w), 구체적으로 18-22%(w/w), 더욱 구체적으로 20%(w/w)로 포함될 수 있다.

대한민국등록특허 제10-2284517호에 명시된 방법으로 제조 [지방유래 줄기세포를 소디움 피루베이트 (Sodium pyruvate), 인슐린 (Insulin), 트랜스페린 (Transferrin) 및 소디윰셀레나이트 (Sodium selenite)가 사용된]한 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)은 DHT가 처리된 인간모유두세포 (HDPC) 에서 세포활성의 증가를 검증하였다. STEMAUTRE-Exosome^TM에 함유된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 확보한 후, 그 내부에 존재하는 후성유전학적 조절인자 (Epigenetic regulatory gene)인 hsa-miRNA-29a-3p가 대조구 대비, 과발현 (296-fold) 되었음을 차세대염기서열분석법 (Next Generation Sequencing, NGS)으로 확인하였다. 상기 miRNA-29a-3p은 예를 들어, 5'- UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA -3'의 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물로, 상기 조성물은 모유두세포 활성을 촉진시켜 탈모를 예방하거나, 발모를 촉진시킬 수 있다. 탈모 예방은 부분적 또는 완전 탈모의 방지, 억제, 저지 및 감소시키는 것을 의미한다.

상기 탈모는 모발 성장의 결손 및 부분적이거나 전체적인 모발의 상실을 의미하며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 남성 호르몬성 탈모증 또는 남성형 탈모증, 독성 탈모증, 원형 탈모증, 휴지기 탈모증, 내분비이상, 대사 장애, 영양장애에 의한 탈모증, 약제성 탈모증, 기계적 탈모증, 피부질환에 의해 수반한 탈모증, 반흔성 탈모증, 선천성 탈모증, 모발 발거증이 포함된다. 탈모는 모발주기(hair cycle)가 붕괴될 때 발생한다. 빈도가 가장 높은 현상은 세포 증식의 중지로 인한 모발 성장 또는 성장기의 단축이다. 이것은 퇴행기의 이른 개시 결과로 나타나며, 궁극적으로는 다수의 모발이 휴지기에 들게 된다. 휴지기 동안에는 모낭이 진피유두로부터 탈리되고 모발이 빠진다. 탈모증은 유전요인, 노화, 국소 및 전신 질환, 발열 증상, 정신적 스트레스, 호르몬 문제 및 약물의 부작용 등을 포함한 많은 병인을 갖는다. 탈모는 예를 들어, 안드로젠성 탈모, 원형 탈모, 휴지기 탈모를 모두 포함할 수 있다.

상기 발모는 모발 발생의 유지, 유도, 자극, 촉진 및 재생; 결손 모발의 성장; 모발 주기에서 성장기의 연장; 또는 연모를 성모로 전환시키는 것을 모두 포함할 수 있다.

발모 촉진은 모발 성장을 촉진하거나, 모발 주기의 성장기를 연장시키거나, 모낭근이 진피의 표면에 자리하고 있는 얇고, 매끈하며, 짧은 탈색된 모발인 연모를 모낭근이 진피 내에 깊이 착상해 있는 굵고, 착색된, 긴 모발인 성모로 전환시키는 것을 의미할 수 있다.

상기 조성물은 예를 들어, 에센스, 샴푸, 크림, 로션, 토닉, 스프레이, 에어로졸, 오일, 용액, 현탁액, 겔 또는 연고 등의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 국소 형태로 투여될 수 있고, 국소 투여에 적합한 제형으로는 로션, 에멀젼, 크림, 연고, 찰제, 스프레이, 에어로졸, 오일, 페이스트, 겔, 토닉, 용액 또는 현탁액과 같은 액상 또는 반액상 제제를 포함할 수 있다.

경우에 따라서, 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 또는 냉감제 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물의 용량은 성별, 연령, 탈모 증세, 모발 상태 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 줄기세포로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생성량이 증대된 줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome ^TM ) 제조

줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)은 대한민국등록특허 제10-2284517호에 명시된 방법으로 제조되어 본 발명에 사용되었다. ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입한 인간지방유래 중간엽 줄기세포를 페놀 레드 (Phenol Red)와 콜린 클로라이드(Choline chloride)가 제외된 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mixture), 1% 페니실린 스트렙토마이신(Penicillin streptomycin), 5% 인간 혈소판 용해물 (human Platelet Lysate, hPL)을 포함하는 계대배양용 배지에서 37℃, 5% CO₂의 배양 조건으로 배양하였다.

배양된 줄기세포 (약 70% Confluency)는 계대배양용 배지를 제거한 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 세포는 a-MEM (Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification, Welgene, Korea), 혈청 대체제 (10%), 소듐 피루베이트 (1,000 μM), 인슐린 (1.72 μM), 트랜스페린 (0.07 μM) 및 소듐 셀레나이트 (0.04 μM)를 포함하는 복합 조성물을 처리 후, 24 h 동안 배양하였고, 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리를 수행하여 불순물을 제거한 후, 얻어진 상등액을 0.22 ㎛ 주사식 여과기로 여과하여 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)을 수득하였다.

실시예 2: 줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome ^TM )의 인간 모유두세포내 주요 성장인자 유전자들의 발현 증가 효과

인간 모유두세포 (Human Dermal Papilla Cells)는 보충 믹스 (Supplement mix)가 첨가된 HFDPC (Follicle Dermal Papilla Cell Growth medium : PromoCell, Germany)에서 37℃, 5% CO₂의 배양조건으로 배양하였다. 2x10⁵개의 세포를 6 웰 플레이트의 각 웰당 시딩(seeding) 하여 24시간 배양한 후, STEMAUTRE-Exosome^TM 시료를 도 1의 농도로 희석한 무혈청 배지 2 mL씩을 24 시간 동안 처리한 후, 세포를 회수하여 총 RNA (total RNA)를 분리한 후 다음 표 1의 프라이머를 사용하여 RT-qPCR을 통해 주요 성장인자 유전자들의 발현을 측정한 결과, 대조군과 비교시, 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)이 포함된 처리군에서, 농도 의존적으로 모유두세포 주요 성장인자 유전자들의 발현 (TGFβ-2, VEGF, HGF, KGF)이 증가됨이 확인되어, STEMAUTRE-Exosome^TM가 모유두세포 성장에 효과가 있음이 확인되었다.

[표 1]

실시예 3: 줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome ^TM )의 인간 모유두세포의 증식 및 이동의 증가

1x10⁵개의 인간 모유두세포를 취하여 스카블록 디쉬 (ScarBlock dish : SPL, Korea)내의 양쪽 웰에 첨가한 후 24 시간 동안 37℃에서 배양하여 바닥에 부착시켰다. 세포가 부착된 후 스카블록 (Scar block)을 제거하고 STEMAUTRE-Exosome^TM 시료를 도 2의 농도로 희석한 무혈청 배지 2 mL씩을 48시간동안 처리한 후, 37℃에서 배양하면서 세포의 이동을 관찰한 결과 도 2a 및 도 2b와 같이 STEMAUTRE-Exosome^TM가 첨가됨에 따라 농도 의존적으로 세포의 증식 및 이동이 촉진되는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome ^TM )에 의한 인간모유두 세포내 활성산소 생성 억제

인간 모유두세포에 STEMAUTRE-Exosome^TM 시료를 도 3의 농도로 희석한 무혈청 배지 2 mL씩을 3 시간 전처리 한 후, 40 mJ/cm²의 UVB를 조사하고 21 시간 후에 활성산소의 생성량을 H₂DCF-DA (Abcam, USA) 시약으로 측정하였다. UVB에 의해 생성된 활성산소의 양 (DCF, Fluorescent)은 처리된 줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)에 따라 농도의존적으로 감소하는 것이 형광현미경을 통해서 확인되었다.

실시예 5: 줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome ^TM )에 의한 인간모유두세포 활성 억제 유전자 발현 감소

인간 모유두세포에 STEMAUTRE-Exosome^TM 시료를 도 2의 농도로 희석한 무혈청 배지 2 mL씩을 3 시간 전처리 한 후, DHT를 6 시간 동안 처리한 후 세포를 현미경으로 관찰한 결과 (도 4a), 대조군과 비교시, 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)이 포함된 처리군에서, 농도 의존적으로 모유두세포의 세포사멸 베시클 (Apoptotic vesicles)이 감소됨이 확인되어, STEMAUTRE-Exosome^TM가 모유두세포 성장에 효과가 있음이 확인되었고, 세포를 관찰한 후 총 RNA (total RNA)를 분리하여 다음 표 2의 프라이머를 통해 RT-qPCR을 수행하였고 도 4b에 나타나 있는 것처럼 농도 의존적으로 모유두세포의 세포사멸 (Apoptosis) 촉진성 사이토카인의 유전자 발현 (TGFβ-1, IL-6)과 Wnt/β-catenin 신호전달 경로 (signaling pathway)의 길항제 (Antagonist)인 DKK1 유전자의 발현이 억제되는 것을 관찰하였다 (도 4b).

[표 2]

실시예 6: 형광라벨 이미지 유세포 분석 (Fluorescent label Imaging flow cytometry)

실시예 1에서 수득된 배양액 (100 ㎕)에 세포외 소포체의 세포표면 표식인자 (Surface marker antibody)인 PKH67-FITC (Sigma, USA)용 항체 10 ㎕를 각각 첨가하여 40분 동안 암실에서 반응시켰다. 이후 PBS 200 ㎕를 첨가한 후, FACS (Amnis ImageStream Mk ll, Luminex, USA)를 이용하여 세포외 소포체의 이미지를 확인하였다 (도 5a). 도 5b는 인간모유두세포에 PKH67-labelled exosomes을 20 h 처리하여, 인간모유두세포내에서 존재함을 확인한 형광현미경 이미지이다.

실시예 7: Small RNA 시퀀싱 및 데이터 분석

실시예 1와 같이 배양된 줄기세포 (약 70% Confluency)는 계대배양용 배지를 제거한 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 세포는 a-MEM (Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification, Welgene, Korea), 혈청 대체제 (10%), 소듐 피루베이트 (1,000 μM), 인슐린 (1.72 μM), 트랜스페린 (0.07 μM) 및 소듐 셀레나이트 (0.04 μM)를 포함하는 복합 조성물을 처리하였고, 대조구의 경우는 복합 조성물 처리 없이 a-MEM 만으로, 24 시간동안 배양하였다. 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리를 수행하여 불순물을 제거한 후, 얻어진 상등액을 0.22 ㎛ 주사식 여과기로 여과한 후 Amicon-15 Centrifugal Filter unit (30 kD MWCO, Millipore, USA)로 농축하였다. miRNA 분리와 라이브러리 제작은 mirVana^TM miRNA isolation kit (ThemoFisher Scientific, USA) 그리고, TruSeq^ㅢ Small RNA library preparation kit (Illumina, USA)의 제조사의 지시에 따라 완성되었다. 제작된 cDNA 라이브러리 (library)는 PCR로 증폭된 후, 프라이머 다이머 (Primer dimer)및 기타 부산물을 제거하기 위해 PAGE로 분리하여 약 147 nucleotide 길이의 PCR 산물 (products)을 회수하고 Illumina NextSeq500 sequencing platform을 사용하여 75 nucleotide 길이의 단말단 주형 (Single-end reads)이 시퀀싱 되었다. 전처리 데이터 (Preprocessing data) 처리를 위해서 미가공 주형 (Raw reads)은 FastQC (ver 0.11.5)와 Skewer (ver 0.2.2)를 사용하여 미가공 주형 상태를 점검 (Raw read quality check)하고, 어뎁터 서열 (Adapter sequence)을 제거하였고 가공된 주형 (Clean reads)의 얼라인먼트 (Alignment)와 정량화(Quantification)에 QuickMIRSeq pipeline (hg19 RefSeq)이 사용되었다. 다르게 발현된 miRNA 분석 (Differentially expressed miRNA analysis)에 NOISeq (ver 2.16.0)가 사용되었다.

대조구에 비해 처리구에서의 발현율이 높은 (296-fold) hsa-miR-29a-3p의 표적유전자 (표 3)는 RNAhybrid, miRanda 및 TargetScan program를 사용하여 예측하였다.

[표 3]

도 6a는 줄기세포 배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM)에 함유된 엑소좀 유래 hsa-miR-29a-3p가 타겟 유전자들 중 하나인 DKK1 (Dickkopf WNT Signaling Pathway Inhibitor 1)의 3'-UTR 부위에 결합되는 영역을 표시한 모식도이다.

실시예 8. hsa-miR-29a-3p에 의한 인간모유두세포 증식 억제 유전자 발현 감소 및 증식 촉진 유전자의 발현 증가 확인

miRNAseq를 통해 가장 유의적으로 차이를 보이는 miRNA 리스트를 조사한 결과 표 3과 같이 hsa-miR-29a-3p가 높은 증가율 (296-fold)을 보였다. 줄기세포배양액 (STEMAUTRE-Exosome^TM) 유래 hsa-miR-29a-3p의 기능을 인간모유두세포에서 알아보고자 합성 miRNA 모사체 (Synthetic miRNA mimics, 5'-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3')를 합성 (IDT, USA)하였다. 2x10⁵개의 인간 모유두세포를 6 웰 플레이트의 각 웰에 시딩 (seeding)한 후, 24 시간 동안 37℃에서 배양한 후, INTERFERin (Polyplus, France) 제제 (reagent)를 이용하여 합성된 miR-29a-3p mimics를 24 시간 동안 형질감염 (transfection) 하였다. 추가적으로 DHT를 6시간 동안 처리하였다. 세포를 회수하여 총 RNA (total RNA)를 추출한 후 다음 표 4의 프라이머로 RT-qPCR을 수행한 결과, 도 6b에 나타나 있는 바와 같이 miR-29a-3p의 타겟 유전자인 DKK1을 포함한 모유두세포 증식 억제성 유전자 (TGFb-1, p27^kip1, p21^CIP1/WAF1, p16^INK4a, NF-kB1, NF-kB2 및 TNF-α)의 발현이 현저하게 감소되는 반면, 모유두세포 증식 촉진성 유전자 (CTNNB1, LEF1 및 CCND1)의 발현이 증가됨을 확인하였다.

[표 4]

실시예 9. 통계분석

본 실험에서 시행된 실험은 총 2회 이상 반복하였으며, 실험 군에 따른 데이터 사이의 통계적 유의성 검정은 Student's t-test 양측검정 (Two-tailed)으로 시행하였다. 결과 값들은 Mean value ± standard deviation (SD)으로 나타내었다. p값이 0.05 이하일 경우 * 그리고 0.01 이하일 경우 **로 통계적 유의성을 표시하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

miRNA-29a-3p를 과발현시킨 엑소좀을 함유하는 인간 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem cells; MSCs) 배양액을 포함하는, 모유두세포 활성 촉진에 의한 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 지방 줄기세포인, 모유두세포 활성 촉진에 의한 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 miRNA-29a-3p은 5'- UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA -3'의 서열을 포함하는, 모유두세포 활성 촉진에 의한 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀의 생성이 촉진된 인간 중간엽 줄기세포 배양액은 소듐 피루베이트, 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트를 포함하는 배지를 포함하는, 모유두세포 활성 촉진에 의한 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.